[go: up one dir, main page]

WO1998032862A9 - L-alanin dehydrogenase von mycobacterium marinum - Google Patents

L-alanin dehydrogenase von mycobacterium marinum

Info

Publication number
WO1998032862A9
WO1998032862A9 PCT/EP1998/000484 EP9800484W WO9832862A9 WO 1998032862 A9 WO1998032862 A9 WO 1998032862A9 EP 9800484 W EP9800484 W EP 9800484W WO 9832862 A9 WO9832862 A9 WO 9832862A9
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tuberculosis
aladh
mar3
strains
dna sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP1998/000484
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO1998032862A3 (de
WO1998032862A2 (de
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Priority to AU60979/98A priority Critical patent/AU6097998A/en
Publication of WO1998032862A2 publication Critical patent/WO1998032862A2/de
Publication of WO1998032862A3 publication Critical patent/WO1998032862A3/de
Publication of WO1998032862A9 publication Critical patent/WO1998032862A9/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Definitions

  • the 40 kD antigen treated in this paper is in many ways an interesting object for in-depth studies.
  • the antigen had already been cloned into an expression vector for Esche ⁇ chia coli (Konrad & Singh, unpublished). Therefore, the expression and purification of the recombinant protein should be optimized. With a homogeneous protein fraction then the crucial biochemical parameters of the enzyme should be determined. From such data, experience has shown that conclusions can be drawn about the physiological function of an enzyme. The question was whether the hypothetical role of the enzyme in cell wall biosynthesis can be underlined or disproved. In case of refutation, other possible functions should be identified.
  • biochemical starting points for a targeted influencing of the enzyme in vivo can result.
  • the physiological function is the key point of all efforts. If the antigen plays an essential role in the bacterium, targeted efforts to eliminate the gene or protein could provide opportunities to prevent the tuberculosis pathogen from growing at a defined point. The protein would then be an ideal drug target. If, as postulated (Delforge et al., 1993), the 40 kD antigen also represents a virulence factor, then such activities could influence the natural virulence of the bacterium. Therefore, this point should be checked by different approaches. The ability to discriminate against the strains of M.
  • tuberculosis and M.bovis BCG by means of mAb HBT-10 makes it possible to develop methods that can distinguish an infection from a vaccine. This is not possible with the conventional screening methods, the PPD or the Mantoux test (Bass Jr. et al., 1990, Huebner et al., 1993).
  • the basis should be laid for enabling rational process development for such a test.
  • the strain Escherichia coli was used to optimize the expression of the recombinant 40 kD antigen (Table 2.1). In addition, it has already overproduced cloned mycobacterial antigens (Table 2.2).
  • E. coli POP (pKA 2101) J. van Embden 70 kD antigen, Ap M. tuberculosis heat
  • E.CO./TB1 (pKAM1101) di Guan ef a /. (1987) MBP-36 kD antigen, Ap heat Maina ef a /. (1988) M.leprae Thole ef a /. (1990) Tab. 2.2 (2/2): Producers of mycobacterial antigens and their characteristics
  • E.CO./TB1 (pKAM4101) J. van Embden MBP-2nd 65kD-Ap Heat Antigen, M.leprae
  • tuberculosis H37R V H37R V M. tuberculosis H37R V , RiV
  • tuberculosis 163 Tub163
  • tuberculosis 925 patient isolate No. 32, INH> 1, StrR, RifS, EthS
  • mice were used macrophages cell line J774.
  • This cell line was originally established from a tumor of a female BALB / c mouse (Ralph & Nakoinz, 1975).
  • J774 is used for phagocytosis assays, IL-1 production, and for a variety of biochemical studies. It has receptors for immunoglobulins and complement.
  • J774 produces lysozyme in large quantities and constitutively secretes IL-1 (Ralph & Nakoinz, 1976; Snyderman et al., 1977). Bacteria are absorbed by phagocytosis. Direct cytolysis of foreign organisms is relatively rare.
  • Fig. 2.1 The plasmid pJLA604Not and its relevant functional sections
  • the translational reading frame starts with the ATG codon of the Sp ⁇ I site. Transcription starts at lambda promoters P R and P, but is effectively repressed at temperatures of 28-30 ° C by the cl ts857 gene product. Induction is achieved by raising the temperature to 42 ° C. At this temperature, the temperature-sensitive lambda repressor becomes inactive and can no longer repress transcription. Transcription ends at the fd terminator.
  • the vector has the atpE translation initiation region (TIR) of E. coli.
  • the plasmid has the ⁇ -lactamase gene coding for ampicillin resistance.
  • pJLA603 As a negative control plasmid pJLA603 was also used, which is identical to pJLA604 except for a few bases in the cloning site.
  • Fig. 2.2 The plasmid pMSK12 and its relevant functional sections This is a derivative of the plasmid pJLA604Not, in which between the Sph - and the
  • oligonucleotides (Table 2.5) were prepared by Ms. Astrid Hans (GBF, Braunschweig) on a 394 DNA / RNA synthesizer (Applied Biosystems). The oligonucleotides were purified with an oligonucleotide purification cartridge (Applied Biosystems).
  • the localization of the oligos on the AlaDH gene is schematized in Fig. 2.3.
  • Fig. 2.3 The ve i v / ended oligos and their location on the AlaDH gene
  • Antibiotics were added to the liquid media just before use from stock solutions. When making media, the addition was allowed to go until the solution was lukewarm after autoclaving. The antibiotics listed in Tab. 2.6 were used. Tab. 2.6: Antibiotics used and concentrations used
  • TAE 40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0, autoclave
  • TBE 89 mM Tris base, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0, autoclave
  • TBS 50 mM Tris base, 137 mM NaCl, 3 mM KCl, pH 7.4, autoclave
  • TBS-TWEEN TBS + 0.05% Tween-20
  • PBS 137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 , 2 mM KH 2 PO 4 , pH 7.0, autoclave 2.6.4 Alanine Dehydrogenase Assays
  • Fig. 2.4 Principle of the alanine dehydrogenase assay
  • the violet end product can be seen very well with the naked eye. This assay was used to rapidly screen FPLC fractions and to demonstrate AlaDH activity in native protein gels.
  • This assay is based on a reaction mixture consisting of 1/2 vol. 0.5 M glycine-KOH, pH 10.2 and 1/8 vol. 0.5 M L-alanine, 6.25 mM NAD + , 2.4 mM NBT and 0.64 mM PMS.
  • the substrate mix was mixed 1: 1 with the solution to be tested. Native gels were incubated directly in 10 ml of substrate mix after electrophoresis.
  • This assay was used to study AlaDH activities in mycobacteria.
  • the mycobacteria were grown on Löwenstein's medium. Using the loop, bacteria were removed from the slant agar tubes, resuspended in water, and adjusted for turbidity equivalent to a McFarland Standard # 5. For the separation of cell aggregates, the suspensions were treated for 10 min in an ultrasonic bath.
  • the cells were then mixed 1: 1 with a reaction mixture (see 2.6.4.1) and incubated at RT for 10 min. After centrifugation at 20,000 g for 2 minutes, the absorbance of the supernatant against the blank was measured.
  • the reference measurement used was an approach to which no L-alanine was added.
  • An absorbance change of one unit per minute in this test corresponds approximately to an absorbance change of three units per minute in the quantitative assay (measurement at 340 nm, see 2.6.4.3).
  • the Standardre 'action approaches had a volume of 1 ml.
  • the composition is shown in Tab. 2.7.
  • the absorbance was monitored for 10 minutes at 37 ° C and 340 nm.
  • the extinction coefficient ⁇ of NADH at 340 nm is 6.22 ⁇ 10 6 cm 2 / mol.
  • AlaDH unit is defined as the amount of enzyme that catalyses the formation of 1 ⁇ mol NADH in oxidative deamination in one minute.
  • composition of the reaction mixture for the oxidative deamination is shown on the left, which is shown for the reductive amination on the right.
  • Densitometry was used to quantify the expression level of AlaDH. Furthermore, the signals of epitope mapping were quantified and correlated with each other.
  • the implementation was carried out with a Personal Densitometer (Molecular Dynamics) with the software Image Quant (Molecular Dynamics).
  • the strains studied can be divided into three groups.
  • the first group is that of the strong positive strains (Table 3.11).
  • This group comprises the strains which have an AlaDH activity of more than 0.5 ⁇ A 5 95 units in the test system used.
  • the second group that of the moderately positive strains, comprises those with an activity between 0.1 and 0.5 ⁇ Asgs units (Table 3.3).
  • M.smegmatis In this group, except M.smegmatis, only pathogenic clinical isolates of M. tuberculosis and other mycobacteria are found. However, both M.smegmatis strains tested also show very high NAD + -reducing activities in the absence of L-alanine. It is important to mention here that the strain M. smegmatis 1-2c (a derivative of M. smegmatis mc 2 6, Zhang et al., 1991, Garbe et al., 1994, by Dr. Peadar 0 Gaora , St.Mary's Hospital, London), a strain for genetic work in mycobacteria, shows no AlaDH activity but also has high background activity. Finally, in the last group all strains are listed which were found to be negative for AlaDH-activity, ie have an activity of less than OJ ⁇ A 5S5 units (Table 3J 3).
  • FIG. 3J6 A graphical representation of the AlaDH activities is shown in Fig. 3J6 ordered by phylogenetic aspects.
  • Fig. 3.16 AlaDH activity in the kingdom of mycobacteria
  • AlaDH activity within the world of mycobacteria.
  • ⁇ M. tuberculosis can be differentiated from the vaccine strain M.bovis BCG by AlaDH activity.
  • the lack of measurable activity can be explained to some extent by the fact that not all strains were in exactly the same growth phase, as it is very difficult to attract all strains in parallel, at the same stage. But the lack of activity could also be one of the reasons why genetic changes affect the expression of the gene. These changes could have occurred in the coding or regulatory area.
  • AlaDH gene from various strains was tried to be amplified in whole or in part by PCR.
  • oligonucleotides based on the sequence of M. tuberculosis H37R V (Andersen et al., 1992, see Section 2.2.2, Table 2.5).
  • Fig. 3.17 PCR of different strains with the primer pair Annabel.
  • Lane 1 M. tuberculosis H37R V lane 6: M.bovis BCG 4 lane 2: M. tuberculosis H37R a Eahn 7: M.africanum 1 lane 3: M. tuberculosis 1 Eahn 8: M.microti 1 lane 4: M. bovis 3 Train 9: M.marinum 3 Train 5: M.bovis BCG 2 Train 10: M.chelonae 7
  • this second fragment was also part of the AlaDH gene, which was formed by attachment of the primer AlaDH-RM at a more C-terminal point.
  • this second fragment could be suppressed (see Fig. 3.18, lanes 2 and 3).
  • Fig. 3.18 PCR products of strain M.tuberculosis H37R V
  • the area amplified by all strains of the M. tuberculosis complex comprises 1260 bp. It contains the complete coding section for the AlaDH, as well as further 75 bp ⁇ pstream and 63 bp downstream. This area was completely sequenced by all strains of the M. tuberculosis complex (Fig. 3J 9). Only in the last about 20 bases inaccuracies creep in. The complete remaining region ', however, is protected by multiple sequencing.
  • H37Ra 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
  • mice 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
  • mice Micl 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
  • H37Rv 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG C-GCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
  • H37Ra 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
  • Bov3 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
  • mice 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG C-GCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
  • Fig. 3.19 (1/5): Alignment of the AlaDH gene and the flanking regions of different strains of the M.tuberculosis complex
  • Tubl 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 3C0
  • H37Rv 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
  • H37Ra 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACGGG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
  • 3CG4 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG C-GATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
  • 3ov3 2 1 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG C-GATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
  • Afrl 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
  • mice 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
  • mice Micl 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
  • mice 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
  • ECG4 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTG.ATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
  • 3ov3 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 460
  • mice 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
  • Fig. 3.19 (2/5): Alignment of the AlaDH gene and the flanking regions of different strains of the M.tuberculosis complex
  • Eov3 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CA.TCGCCAAC GGCATGGGCG CGA.CCGTTAC GGTTCTAGAC 600
  • mice 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CATCGCCAAC GGCATGGGCG CGACCGTTAC GGTTCTAGAC 600
  • 4CkD 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG C-CAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
  • Tubl 601 ATCAACATCG ACAAA.CTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
  • H37Rv 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
  • BCG4 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
  • BCG2 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
  • Bov3 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG C-CAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
  • Afrl 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGGAT CCACACTCGC 660
  • mice 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGC-AT CCACACTCGC 660
  • Tubl 651 TACTCATCGG CCTA.CGAGCT CGAGG TGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
  • H37Ra 661 TACTCATCGG CCTA.CGAGCT CGAC-GGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
  • Bov3 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAGC-GTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
  • Tubl 781 AAACCAGC-TG CGGTACTGGT C-GATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTGTTT CGAAGGCTCA 840
  • H37Rv 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT C-GATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTGTTT CGAAGGCTCA 840
  • Afrl 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT GG TATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTGTTT CGAAGGCTCA 840
  • Fig. 3.19 (3/5): Alignment of the AlaDH gene and the flanking regions of different strains of the M.tuberculosis complex
  • Bov3 6 1 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTA.CTGCGTG 900
  • mice 841 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTA.CTGCGTG 900
  • H37Ra S61 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATC-GC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
  • 3CG4 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC C-CACGAAGGG GCGTTACTGT CCG.AA.CGGGT GGCCACCGAC 1080
  • 3CG2 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC GCACGAAC-GG GCGTTACTGT CCGAACGGGT GGCCACCGAC 1080
  • Fig. 3.19 (4/5): Alignment of the AlaDH gene and the flanking regions of different strains of the M.tuberculosis complex
  • Tubl 11 1 GCCGAGCACA CNTCGGGAGT AANG-GAAGCG ATGATGTCGN C 1185
  • H37Rv 11 1 GCCGAGCA.CA CGTCGGGAGT AAC-G AAGCG ATGATGTCGG CCG 1185
  • H37Ra 11 1 GCCGAGCACA CGTCGGGAGT AAGC-G.AAGCG ATGA 11S5
  • Bov3 11 1 GCCGAGCACA CGTCGGGAGT AAC-C-GAAGCG ATGATGTCGG CC 1185
  • Fig. 3.19 Alignment of the AlaDH gene and the flanking regions of different strains of the M.tuberculosis complex
  • the third distinct site is Base 272.
  • M.bovis and two strains of M.bovis BCG this base is deleted. This deletion results in a frameshift that affects the entire following portion of the resulting protein. By this reading frame shift occurs at the bases 404 to 406 an opa / stop signal.
  • the product of this gene is only about one-third the size of the functional AlaDH of the other strains.
  • M.bovis and M.bovis BCG are the only strains of M. tuberculosis complex that show no activity. All other strains were classified as moderate or strong positive. The observed deletion is therefore the reason for the lack of a functional AlaDH.
  • HBT-10 mAb can not detect the truncated protein (the epitope of HBT-10 is in the range before the frameshift), it can be assumed that the truncated protein does not occur at all, or only in very small amounts. with the mAb HBT-10 undetectable amounts is produced.
  • H37RV TTCCGACCGAGACCA-AAAACAACGA ⁇ TTCCAATTCCGGGTGGCCATCACCCCGGCCGGCG
  • H37RV GCCGCCTGCGACACGGGCAGATCTTGTTCACGTTCTTGCATTTGGCCGCGTCACGTGCTT
  • MIIMIMI II II I MIMMMIMM II IMIIMMII II IIIMM
  • H37RV GCACCGATGCGTTGTTGGA-TTCCGGCA-CCACGTCAATTGCCTACGAGACCGTCCAGACCG
  • Fig.3.20 AlaDH gene alignment of M.marinum and M. tuberculosis H37R V
  • H37RV CAGCCCGCATCGCCAACGGCATGG3CGCGACCGTTACGGTTCTAGACATCAACATCGACA
  • Fig. 3.20 (2/2): AlaDH gene alignment of M.marinum and M. tuberculosis H37R V
  • Fig. 3.20 A total of 682 bases of this gene could be determined (Fig. 3.20), which represents about 60% of the complete gene. These 682 bases encode the N-terminal region of the protein. Only the first 35 bases after the start codon are missing.
  • the sequenced section of the AlaDH from M.marinum shows 80.4% identity with the corresponding section of M. tuberculosis H37R V.
  • the sequence differences are distributed relatively uniformly over the entire section.
  • the deduced peptide of the M.marinum gene sequence ( Figure 3.21) shows 85.3% identity and 92.0% similarity to the M. tuberculosis H37R V protein. Homologies to other proteins of the Swiss Prot database are given in Tab. 3J5 (as of 9/1996, Release 33). For comparison, it should be noted that the AlaDH of M.tuberculosis '' has 53% identity to the enzymes of B.sphaericus and B.stearothermophilus (Andersen et al., 1992).
  • Fig.3.21 AllaDH's alignment of M.marinum and M. tuberculosis H37R V
  • the Swiss Prot database was searched using the FASTA software (http: / ⁇ w ⁇ V.embl- ebi.sc.uk) (as of 9/1996, Release 33).
  • amino acid residues Gly165, Gly167, Gly170 and Asp198 are considered to be essential for the binding of the cofactor of AlaDH of M. tuberculosis H37R V. These four amino acid residues are characteristic of the ⁇ secondary structure of NAD (H) binding sites (Wierenga et al, 1986; Bork & Grunwald, 1990). In M.marinum's enzyme, as in all other AlaDH's in Table 3.14, these four residues are conserved.
  • the corresponding section of the mAb HBT-10 mAb epitope of M.marinum AlaDH has the sequence AISDADFKAAG, thus differing only in third place from the M. tuberculosis H37R V sequence. Based on the consensus epitope of the antibody determined in this work (Table 3.9), it would also have to react with the AlaDH of M.marinum. In fact, this strain is also the only one with which a cross-reaction could be observed (Andersen et al., 1992). The determined sequence is also consistent with this observation.
  • AlaDH activity in mycobacteria The measured AlaDH activities allow some interesting observations regarding the lifestyle of the organisms with positive activity.
  • strains with high activity are all pathogenic.
  • two of the four strains that belong to this group are pathogenic for fish (Austin & Austin, 1987).
  • M.marinum and M.chelonae can also be humans
  • M.chelonae is a comparatively fast-growing, non-chromogenic bacterium. Infections in humans often occur as secondary wound infections after surgery (Cooper et al, 1989). M.marinum is a slow-growing organism that forms a yellow pigment when grown in light. In more than 50 warm-blooded species (reptiles, amphibians, fish) infections with M.marinum were detected (Clark & Shepard, 1963). In humans, the bacterium usually manifests itself in the elbow or knee area.
  • the other two strains with strong-positive AlaDH activity are representatives of the M. tuberculosis complex. These are the tuberculosis reference strain M.tuberculosis H37R V , as well as the strain M.microti, which is considered to be a phylogenetic link between M.tuberculosis and M.bovis.
  • M. smegmatis Apart from M. smegmatis, all strains classified as moderately positive are also pathogenic. The majority of these strains include clinical isolates of M. tuberculosis. Pathogenic variants of tuberculosis strains thus generally have AlaDH activity. However, two isolates were found that do not have AlaDH activity. The only non-pathogenic organism with AlaDH activity is the rapidly growing M.smegmatis strain. However, M.smegmatis has an unusually strong background NAD + -reducing activity and is therefore very easily distinguishable from all other strains with AlaDH activity. Furthermore, in the strain M.smegmaits 1-2c, a mycobacterial expression strain, no AlaDH activity was found. Within the 44 strains of mycobacteria tested, and this is by far the majority of all known strains, the conclusion is therefore:
  • the AlaDH gene in mycobacteria was identified in all strains investigated in the M.tuberculosis complex and in the M.marinum strain.
  • AlaDH gene that of M.marinum, is significantly different at the DNA level from the genes of the M.tuberculosis complex. However, four out of five bases (80.4%) are on average still identical when comparing these sequences. This value is even higher at the protein level (85.3 o identity, 92.0% similarity). However, since AlaDH activity was also found in a number of other species, it can be assumed that the corresponding genes, lacking homology to the primers used, can not be amplified under the conditions used. A more detailed study on this point would have to find these genes as well. A comparison of all these sequences could allow further conclusions about the role of the enzyme.
  • assays based on AlaDH have been described for the enzymes dipeptidase (Ito et al, 1984), ⁇ -glutamyltransferase (Kondo et al, 1992), and ⁇ -glutamyl cyclotransferase (Takahashi et al, 1987). All three of these enzymes are found in various diseases in altered urine, serum or blood concentrations.
  • PCR assay would also have to be established for the M.marinum strain, which differs considerably at the gene level from the M. tuberculosis complex.
  • a PCR assay based on the amplification of a portion of the gene sequence encoding the J ⁇ S rRNA has heretofore been used (Knibb et al, 1993). This is of great importance given the increasing number of M.marinum infections in fish farms in recent years (Knibb et al., 1993). Also
  • the disclosure of the present application also includes the disclosure of the attached EP 97 101 33g. e, in particular the literature cited therein.
  • the disclosure also includes all conceivable combinations of disclosed individual features.

Abstract

Die Tuberkulose ist eine Infektionskrankheit, der jährlich über 3 Millionen Menschen zum Opfer fallen. Es gibt zwar sowohl einen Imptstoff, als auch verschiedene Diagnose- und Therapieverfahren, doch die Effektivität all dieser Maßnahmen bedarf, angesichts der wieder steigenden Zahl der Erkrankungsfälle, dringend einer Verbesserung. Ein Forschungsschwerpunkt liegt auf der Charakterisierung von Antigenen, die frühzeitig während einer Infektion sekretiert werden, da diese den ersten Kontakt des Immunsystems mit dem Erreger herstellen. Das in dieser Arbeit behandelte 40 kD-Antigen liegt in vivo als Hexamer vor, und ist trotz des hohen Molekulargewichts und des Fehlens einer Signalsequenz bereits nach wenigen Tagen des Wachstums extrazellulär zu finden. Es stellt funktionell eine L-Alanin Dehydrogenase dar und reagiert mit dem gegen dieses Protein gerichteten monoklonalen Antikörper HBT-10. HBT-10 war der erste bekannte Antikörper, der spezifisch für ein Protein von M. tuberculosis ist und nicht mit dem Impfstamm M. bovis BCG kreuzreagiert.

Description

L-ALANIN DEHYDROGENASE VON MYCOBACTERIUM MARINUM
1.5 Aufgabenstellung
Das in dieser Arbeit behandelte 40 kD-Antigen stellt in vielerlei Hinsicht ein interessantes Objekt für eingehende Studien dar.
Das Antigen war bereits in einen Expressionsvektor für Escheήchia coli kloniert worden (Konrad & Singh, unveröffentlicht). Es sollte deshalb die Expression und die Aufreinigung des rekombinanten Proteins optimiert werden. Mit einer homogenen Proteinfraktion sollten dann die entscheidenden biochemischen Parameter des Enyzms bestimmt werden. Aus solchen Daten lassen sich erfahrungsgemäß Rückschlüsse auf die physiologische Funktion eines Enzyms ziehen. Es stellte sich hierbei die Frage, ob die hypothetische Aufgabe des Enzyms bei der Zellwandbiosynthese unterstrichen oder widerlegt werden kann. Im Falle einer Widerlegung sollten andere mögliche Funktionen eruiert werden.
Zudem können sich aus der Biochemie Ansatzpunkte für eine gezielte Beeinflußung des Enzyms in vivo ergeben. In diesem Zusammenhang ist erneut die physiologische Funktion der Schlüsselpunkt aller Anstrengungen. Wenn das Antigen für das Bakterium eine essentielle Rolle spielen sollte, dann könnten sich durch gezielte Versuche das Gen oder das Protein auszuschalten Möglichkeiten ergeben, den Tuberkulose-Erreger an einem definierten Punkt am Wachstum zu hindern. Das Protein wäre dann ideales drug target. Sollte das 40 kD-Antigen zudem, wie postuliert (Delforge ef a/., 1993), einen Virulenzfaktor darstellen, dann könnte durch solche Unternehmungen Einfluß auf die natürliche Virulenz des Bakteriums genommen werden. Durch verschiedene Ansätze sollte deshalb auch dieser Punkt überprüft werden. Die Möglichkeit, mittels des mAb HBT-10 die Stämme M. tuberculosis und M.bovis BCG zu diskriminieren, ermöglicht es Verfahren zu entwickeln, die eine Infektion von einer Impfung unterscheiden können. Dies ist mit den gebräuchlichen Screeningverfahren, dem PPD- oder dem Mantoux-Test, nicht möglich (Bass Jr. et al., 1990; Huebner et al., 1993). Durch die Analyse der Verbreitung des Gens bzw. des Genprodukts sollte die Grundlage dafür geschaffen werden, eine rationelle Verfahrensentwicklung für einen solchen Test zu ermöglichen. Zudem sollte untersucht werden, ob das Vorhandensein eines funktioneilen Enzyms mit irgendwelchen anderen Parametern korreliert. Insbesondere auf taxonomische und virulente Zusammenhänge wurde hierbei Wert gelegt. Auch bestimmte natürliche Lebensweisen oder der Eintritt in bestimmte Wachstumsphasen könnten mit der Alanin Dehydrogenase in Zusammenhang stehen. Diesen Fragen sollte auf den Grund gegangen werden.
2. Materialien und Methoden
2J Lebendes Material
2ΛΛ Bakterien
2.1.1.1 E.coli Stämme
Der Stamm Escherichia coli wurde verwendet um die Expression des rekombinanten 40 kD-Antigens zu optimieren (Tab. 2.1). Zudem wurden in ihm bereits klonierte mykobakterielle Antigene überproduziert (Tab. 2.2).
Tab. 2.1 : Benutzte Expressionsstämme und deren relevante Eigenschaften
Stamm Genotyp und relevanter Phänotyp Herkunft / Referenz
E.coli CAG 629 /ac(am) pfto(am) f (am) supCls rpsL ma/(am) Ion C.Gross ΛfpR165-Tn10(TetR)
E.coli DH5α sυpEAA Δ/acU169(φ80 lac∑ ΔM15) hsdRM recA Hanahan (1983) endM gyrA96 thiA relM
E.coli TG2 sυpE hsdAδ thiA{lac-proAB) Δ(srf-recA)306::Tn10(TetR) Sambrook et al. (1989) F'{traD35 proA* lad* /acZM15)
E.coli SURE hsdR mcrA mcrB mvr endA supE44 /Λ/-1 λ- gy/Α96 Stratagene re/A1 lac recB recJ sbcC umuC uvrC (F'proAB /aclqZ ΔM15 Tn10(TetR))
E.CO// BL 321 mc105 nadB+ puή+ Studier (1975)
E.coli N 4830 suo his ilv ga/KΔ8 AchlO-pgl (λ ΔBam N+ cllsδ57 ΔHI) Gottesman et al. (1980)
E.coli 538 Genotyp unbekannt Bayer AG ~ab. 2.2 (1/2) : Produzenten mykobakterieller Antigene und deren Charakteristika Es ist angegeben, welches Antigen von den jeweiligen Stämmen produziert wird. Die beiden letzten Spalten geben die Anzuchtbedingungen wieder (siehe auch 2.5.2).
Stamm Herkunft / Referenz(en) Produkt Antibiotika Induktion
E.coli BLZ , (pKAM1301) J. van Embden GST-36 kD-Antigen, Ap IPTG M.leprae
E.coli BL21/plys5 J. van Embden 70 kD-Antigen, Ap + Cm IPTG
(pKAM3601) M.leprae
Eco// CAG629 (pMS9-2) Singh et a/. (1992) 38 kD-Antigen, Ap Hitze M.tuberculosis
E.coli CAG629 (p S14-1) Cherayil & Young (1988) 28 kD-Antigen, Ap Hitze
Daie & Patki (1990) M.leprae
Singh et al. (unveröff.)
E.co// 15 (pHISK16 Verbon ef a/. (1992) 16 kD-Antigen, Ap IPTG
+ pREP4) Vordermeier et al. (1993) M.tuberculosis
E.CO// M1697 V. Mehra His-30 kD-Antigen, Ap + Km IPTG M.tuberculosis
E.CO// 1698 V. Mehra His-30 kD-Antigen, Ap + Km IPTG M.leprae
E.coli POP (pKA 2101) J. van Embden 70 kD-Antigen, Ap Hitze M.tuberculosis
E.coli POP (pR!B1300) Thole ef a/. (1987) 65 kD-Antigen, Ap Hitze
<- van Eden et al. (1988) M.bovis BCG
E.coli POP (pZW1003) Mehra et al. (1986) 65 kD-Antigen, Ap Hitze van der Zee et al. (unveröff.) M.leprae
E.CO//TB1 (pKAM1101) di Guan ef a/. (1987) MBP-36 kD-Antigen, Ap Hitze Maina ef a/. (1988) M.leprae Thole ef a/. (1990) Tab. 2.2 (2/2) : Produzenten mykobakteπeller Antigene und deren Charakteristika
Es ist angegeben, welches Antigen von den jeweiligen Stämmen produziert wird. Die beiden letzten Spalten geben die Anzuchtbedingungen wieder (siehe auch 2.5.2).
Stamm Herkunft / Referenz(en) Produkt Antibiotika Induktion
E.CO//TB1 (pKAM4101) J. van Embden MBP-2nd 65 kD- Ap Hitze Antigen, M.leprae
E.CO//TB21-8/2 Khanolar-Young et al. (1992) MBP-10 kD-Antigen, Ap IPTG Mehra ef a/. (1992) M.tuberculosis
E.coli TG2 - 50/55 Sal C.Espitia; M. Singh 50/55 kD, large frag., Ap IPTG large M.tuberculosis
2.1.1.2 Mykobakterielle Stämme
Tab. 2.3 (1/3) : Benutzte Mykobakte en und deren Herkunft
Stamm Abkürzung Genaue Bezeichnung, Herkunft
M.africanum 1 Afr1 M.africanum nr.5544, RIV
M.asiaticum 1 Asi1 M.asiaticum 3250, Portaals
M.avium 1 Avi1 M.avium Myc 3875, Serotype 2, RIV
M.bovis 3 Bov3 M.6ows nr.8316, RIV
M.bovis BCG 2 BCG2 M.bovis Copenhagen, Serumsinstitut Copenhagen
M.fao 's BCG 4 BCG4 M.bovis BCG P3, RIV
M.chelonae 7 Che7 M.chelonei 1490, P.Dirven
M.flavescens 1 Fla1 M.flavescens ATCC 14474, RIV
M.fortuitum 11 For11 M.fortuitum ATCC 6841, RIV
M.gastή Gas1 M.gastri ATCC 25220, RIV
M.gordonae 3 Gor3 M.gordonae 8960, Portaals Tab. 2.3 (2/3) : Benutzte Mykobakterien und deren Herkunft
Stamm Abkürzung Genaue Bezeichnung, Herkunft
M.intracellulare 1 Int1 M.intracellulare 6997, ATCC 15985, Portaals
M.intracellulare 5 lnt5 M.intracellulare IWG MT3, RIV
M.kansasii 1 Kan1 M.kansasii Myc 1012, RIV
M.lufu 1 Luf1 M.lufu 2^, RIV
M.marinum 3 Mar3 M.marinum L66, Portεals
M.microti 1 id M.microti nrA 27 Q, Portaals
M.nonchromogenium 1 Non1 M.nonchromogenium ATCC 25145, RIV
M.parafortuitum 1 Paf1 M.parafortuitum nr.6999, Portaals
M.pereg num 1 Perl M.peregήnum, Patient Bakker, TB6849, Antonie Ziekenhuis
M.phlei 1 Phl1 M.phlei 258 (Ph), Portaals
M.phleiA Phl4 M.phlei Weybήάge R82, Tony Eger
M.scrofulaceum 1 Scr1 M.scrofulaceum Myc 3442, RIV
M.scrofυlaceum 8 Scrδ M.scrofulaceum Myc 6572, RIV
M.simiae 1 Sim1 M.simiae 784, Tony Eger
M.smegmatis 1 Sme1 M.smegmatis ATCC 14460, RIV
M.smegmatis 3 Sme3 M.smegmatis 8070, Poriaals
M.terrae l Ter2 M.terrae, RIV
M.thermoresistibile 1 The1 M.thermoresistibile nr.7001 , Poriaals
M. triviale 1 Tri1 M.triviale 8067, Poriaals
M.tuberculosis H37RV H37RV M.tuberculosis H37RV, RiV
M.tuberculosis H37Ra H37Ra M.tuberculosis H37Ra, nr.19529, RIV
M.tuberculosis 1 Tub1 M.f(7Öercu/os/s 4514, RIV
M.tuberculosis 49 Tub49 M.tuberculosis C3, Sang-Hae Cho, Südkorea
M.tuberculosis 60 Tub60 M.tuberculosis S2, Sang-Hae Cho, Südkorea Tab. 2.3 (3/3) : Benutzte Mykobakterien und deren Herkunft
Stamm Abkürzung Genaue Bezeichnung, Herkunft
M.tuberculosis 118 Tub118 M.tuberculosis Myc 16293, Hannoufi
M.tuberculosis 130 Tub130 M.tuberculosis, psύenl yy, Strichcode 3J265, Dr.Bijlmer. Den Haag
M.tuberculosis 132 Tub132 M.tuberculosis Myc 16770, RIV
M.tuberculosis 145 Tub145 M.tuberculosis 416138N, Patient N.Wielaart, Reg.Nr. 7.796.267, WKZ, Utrecht
M.tuberculosis 146 Tub146 M.tuberculosis, Abdi Hussein
M.tuberculosis 163 Tub163 M.tuberculosis 925, Patientenisolat Nr. 32, INH>1, StrR, RifS, EthS
M.υlcerus 1 Uld M.ulcerus 932, Portaals
M.vaccae 3 Vac3 M.vaccae ATCC 25950, RIV
M.xenopi 7 Xen7 M.xenopi code 132, Patient Alois Necas, H.Kristanpul, Prag
2.1.1.3 Andere Bakterienstämme
Tab. 2.4 : Weitere benutzte Bakterienstämme
Stamm Herkunft
Listeria monocyiogenes EGB Andreas Lignau
Listeria innocua Andreas Lignau
Nocardia asteroides 702774 Juul Bruins
Rodococcus equi nr.10P388 VMDC, Utrecht 2.1.2 Zellkultur
Benutzt wurde die Mäuse Makrophagen Zeliinie J774. Diese Zellinie war ursprünglich aus einem Tumor einer weiblichen BALB/c Maus etabliert worden (Ralph & Nakoinz, 1975). J774 wird für Phagozytose-Assays, zur Produktion von IL-1 und für vielfältige biochemische Untersuchungen benutzt. Sie besitzt Rezeptoren für Immunglobuline und Komplement. Desweiteren produziert J774 Lysozym in großen Mengen und sekretiert IL-1 konstitutiv (Ralph & Nakoinz, 1976; Snyderman et al., 1977). Die Aufnahme von Bakterien erfolgt durch Phagozytose. Direkte Zytolyse von Fremdorganismen ist relativ selten.
2.2 Nukleinsäuren
2.2.1 Plasmide
pJLA604Not
Figure imgf000010_0001
Abb. 2.1 : Das Plasmid pJLA604Not und seine relevanten funktionellen Abschnitte
Dieses 4,9 kb große Plasmid, ein Derivat von pJLA 604 (Schauder ef a/.,1987), wurde als Expressionsvektor verwendet (Abb. 2.1). Das Plasmid pJLA604Not (Konrad & Singh, unveröffentlicht) unterscheidet sich von pJLA604 dadurch, daß die Nde\- -5 -
Schnittstelle entfernt, und statt dessen eine Λ/ofl-Schnittstelle eingebaut wurde. Das Leseraster der Translation beginnt mit dem ATG-Codon der SpΛI-Schnittstelle. Die Transkription startet an den Lambda-Promotoren PR und P , wird jedoch bei Temperaturen von 28-30°C durch das clts857-Genprodukt effektiv reprimiert. Induktion wird durch Erhöhung der Temperatur auf 42°C erreicht. Bei dieser Temperatur wird der temperatursensible Lambda-Repressor inaktiv und kann die Transkription nicht mehr reprimieren. Die Transkription endet am fd-Terminator. Zudem besitzt der Vektor die atpE Translations-Initiationsregion (TIR) von E.coli. Dieser Abschnitt ist sehr nützlich für die Initiation der Translation, da er nur wenig störende Sekundärstrukturen besitzt und dadurch eine hohe Expressionsrate gewährleistet (McCarthy et al., 1986). Als Selektionsmarker verfügt das Plasmid über das ß-Lactamase-Gen, das für eine Ampicillinresistenz codiert.
Als negatives Kontrollplasmid wurde auch pJLA603 verwendet, das bis auf wenige Basen in der Klonierungsstelle mit pJLA604 identisch ist.
pMSK12
Figure imgf000011_0001
Abb. 2.2 : Das Plasmid pMSK12 und seine relevanten funktioneilen Abschnitte Dies ist ein Derivat des Plasmids pJLA604Not, bei dem zwischen die Sph\- und die
Λ/ofl-Schnittstelle das 40kD-Antigen von Mycobacterium tuberculosis kloniert wurde (Abb. 2.2; Konrad & Singh, unveröffentlicht).
2.2.2 Oligonukleotide
Sämtliche Oligonukleotide (Tab. 2.5) wurden von Frau Astrid Hans (GBF, Braunschweig) an einem 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems) hergestellt. Gereinigt wurden die Oligonukleotide mit einer Oligonucleotide Purification Cartridge (Applied Biosystems).
Tab. 2.5 : Verwendete Oligonukleotide
Bezeichnung Sequenz Orientierung
AlaDH-F1 5'-ATGCGCGTCGGTATTCCG-3' for ard
AlaDH-F1 + 5'-GCGCGTCGGTATTCCGACCG-3" forward
AlaDH-F2 5•-GAGACCAAAAACAACGAA-3, forward
AlaDH-F4 S'-GAATTCCCATCAGCAATCTTGCAGA-S' forward
AlaDH-F5 5'-GCCCCGATGAGCGAAGTC-3' forward
AlaDH-F6 5'-GGGGCCGTCCTGGTGCC-3' forward
AlaDH-F7 5'-GACGTCGACCTACGCGCTGAC-3' forward
AlaDH-RI δ'-CTCGGTGAACGGCACCCC-S' reverse
AlaDH 2 5'-GGCCAGCACGCTGGCGGG-3' reverse
AlaDH-R3 5'-CACCCGTTCGGACAGTAA-3' reverse
AlaDH-R4 5'-CGCGGCCGACATCATCGC-3' reverse
AlaDH-R5 5'-GGCCGACATCATCGCTTCCC-3' reverse
AlaDH-R6 5'-CGAGACTAATTTGGGTGCCTTGGC-3' reverse
AlaDH-R7 S'-ATTTGGGTGCCTTGGC-S' reverse
AlaDH-RM 5'-GGCGGCGAGTCGACCGGC-3' reverse - 71 -
Die Lokalisation der Oligos auf dem AlaDH-Gen ist in Abb. 2.3 schematisiert.
Figure imgf000013_0001
tcgagagggg taatcatgcg cgtcggta" ccgaccgaga ccaaaaacaa cgalttccaa 45 ttccgggtgg ccatcacccc ggccggcg« gcggaactaa cccgtcgtgg ccatgaggtg 105 ctcatccagg caggtgccgg aςagggctcg gctatcaccg acgcgςattt caaggcggca 165 ggcgcgcaac tςgtcggcac cgccgaccag gtςtgggccg acgctgattt attgctcaag 225 ςtcaaagaac cgatagc gc ggaatacggc cgcctgcgac acgggcagat cttgttcacg 285 ttcttgcatt tggccgcgtc acgtgcttgc accgatgcgt tgttggattc cggcaccacg 345 ro Ü-üüfÜT £Cgag£CCgt CC5ga CC^C ^acggcgcac tacccctgc tgecccgatg 405 agcgaag^cg cccgtcςact cgccgcccag gttggcgctt accacctgat gcgaacccaa 465 ggggccgcg gtgtgctgat g gcgggςtg cccggcgtcg aaccggccga cgtcgtggtg 525 atcggcgccg gcaccgccgg ctacaacgca gcccgcatcg ccaacggcat gggcgcgacc 585 gttacggttc tagacatcaa catcgacaaa cttcggcaac tcgacgccga gttctgcggc 645 cggatceaea ctcgctac c atccgcctac eagctcgagg g gccgtcaa acgtcccgac 705 c ggtgattg gggccgtcct ggtgccaggc gccaaggcac ccaaattagt ctcgaa tca 765 cttgtcgcgc atatgaaacc aggtgcggta ctggtcgata tagccatcga ccε ggcggc 825 tgtttcgaag gctcacgacc gaccacctac caccacccga cgttcgccgt gcacgεcacg 865 ctgttttact gcgtggcςaa catgcccgec tcggtgccga agacgtcgac ctεcccgctg 945
Figure imgf000013_0002
tcggccgctc gttacgccga gcacacgtcg ggagtaaggg aag'cga gat gtcggccgcg
Abb. 2.3 : Die veiv/endeten Oligos und ihre Lage auf dem AlaDH-Gen
2.3 Rezepturen
Alle unter diesem Punkt beschriebenen Lösungen wurden eitestgehend nach Sambrook et al. (1989) hergestellt.
2.3.1 Nährmedien
LB
10 g Bacto-Trypton (Difco), 5 g Bacto-Hefeextrakt (Difco), 10 g NaCI ad 1000 ml H20, pH 7,0, autoklavieren - 1Ä -
Iß
12 g Bacto-Trypton (Difco), 24 g Bacto-Hefeextrakt (Difco), 4 ml Glycerin (87 %), 2,31 g
KH2P04, 12,54 g K2HPO4 ad 1000 ml H20, die Phosphatlösungen werden getrennt von den anderen
Komponenten autoklaviert und hinterher zugemischt
soc
2 % Bacto-Trypton (Difco), 0,5 % Bacto-Hefeextrakt (Difco), 10 mM NaCI, 2,5 mM KCI, 10 mM MgC-2, 10 mM MgS04) 20 M Glucose ad 1000 ml H20, pH 7,0, die Glucose wird getrennt von den anderen Komponenten autoklaviert und hinterher zugegeben
LÖWENSTEIN
Benutzt wurden gebrauchsfertige Coletsos Ossein Schrägagarröhrchen (Sanofi
Diagnostics Pasteur).
FESTMEDIEN :
Zur Herstellung von Platten (90 mm, Greiner) der oben beschriebenen Nährmedien wurde der jeweiligen Rezeptur 1 ,5% Agar beigemischt.
ANTIBIOTIKA
Antibiotika wurden den Flüssigmedien kurz vor Gebrauch aus Stammlösungen zugegeben. Bei Herstellung von Fesfmedien wurde mit der Zugabe gewartet, bis die Lösung nach dem Autoklavieren handwarm war. Benutzt wurden die in Tab. 2.6 aufgeführten Antibiotika. Tab. 2.6 : Benutzte Antibiotika und eingesetzte Konzentrationen
Antibiotika Endkonzentration gelöst in
Ampicillin 100 μg/ml Wasser
Chloramphenicol 20 μg/ml Ethanol
Gentamicin 100 μg/ιnl gebrauchsfertig (Sigma)
Kanamycin 30 μg/ml Wasser
2.3.2 Pufferlösungen
L-PUFFER : 50 mM Tris base, 10 mM EDTA, pH 6,8, autoklavieren
TE : 10 mM Tris base, 1 mM EDTA, pH 7,4, autoklavieren
TAE : 40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH 8,0, autoklavieren
TBE : 89 mM Tris base, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8,0, autoklavieren
TBS : 50 mM Tris base, 137 mM NaCI, 3 mM KCI, pH 7,4, autoklavieren
TBS-TWEEN : TBS +0,05% Tween-20
PBS : 137 mM NaCI, 3 mM KCI, 8 mM Na2HP04, 2 mM KH2P04, pH 7,0, autoklavieren 2.6.4 Alanin Dehydrogenase Assays
2.6.4.1 Quantitativer Assay
Der qualitative Nachweis der AlaDH beruht auf einer Reihe von Redoxreaktionen, gemäß folgendem Reaktionsschema (Inagaki et al., 1986; Andersen et al., 1992) :
L- Alanin
AlaDH
Figure imgf000016_0001
P ruvat
Abb. 2.4 : Prinzip des Alanin Dehydrogenase - Assays
Das violette Endprodukt ist hierbei sehr gut mit dem bloßen Auge zu erkennen. Dieser Assay wurde einerseits zum schnellen Screening von FPLC-Fraktionen und andererseits zur Demonstration von AlaDH-Aktivität in nativen Proteingelen benutzt.
Basis dieses Assay ist ein Reaktionsmix bestehend aus 1/2 Vol. 0,5 M Glycin-KOH, pH 10,2 und je 1/8 Vol. 0,5 M L-Alanin, 6,25 mM NAD+, 2,4 mM NBT und 0,64 mM PMS.
Zur Analyse von Proteinfraktionen wurde der Substratmix 1 :1 mit der zu testenden Lösung versetzt. Native Gele wurden nach der Elektrophorese direkt in 10 ml Substratmix inkubiert.
Eine positive Reaktion ist nach spätestens 5 min zu erkennen. 2.6.4.2 Semiquantitativer Assay
Dieser Assay wurde zur Untersuchung von AlaDH-Aktivitäten in Mykobakterien verwendet.
Die Mykobakterien wurden auf Löwenstein-Medium angezogen. Mit der Impföse wurden Bakterien von den Schrägagar-Röhrchen abgenommen, in Wasser resuspendiert und auf eine Trübung äquivalent zu einem McFarland Standard Nr.5 eingestellt. Zur Trennung von Zellaggregaten wurden die Suspensionen für 10 min im Ultraschallbad behandelt.
Anschließend wurden die Zellen 1:1 mit Reaktionsmix (siehe 2.6.4.1) versetzt und 10 min bei RT inkubiert. Nach zweiminütiger Zentrifugation bei 20.000 g wurde die Absorption des Überstandes gegen den Blindwert gemessen.
Als Referenzmessung diente ein Ansatz, dem kein L-Alanin zugesetzt war.
Eine Absorptionsänderung von einer Einheit pro Minute in diesem Test entspricht etwa einer Absorptionsänderung von drei Einheiten pro Minute beim quantitativen Assay (Messung bei 340 nm, siehe 2.6.4.3).
2.6.4.3 Quantitativer Assay
Bei diesem Assay wurde direkt die quantitative Änderung des NADH-Gehaltes bei 340 nm gemessen.
Die Standardre'aktionsansätze hatten ein Volumen von 1 ml. Die Zusammensetzung ist in Tab. 2.7 gezeigt. Die Absorption wurde über 10 min hinweg bei 37°C und 340 nm verfolgt. Der Extinktionskoeffizient ε von NADH beträgt bei 340 nm 6,22 x 106 cm2/mol.
Die Standardansätze wurden zur Bestimmung der biochemischen Eigenschaften des Enzyms wie jeweils im Text angegeben variiert. Jeder dargestellte Meßpunkt stellt den Mittelwert aus mindestens zwei, in der Regel aber drei, unabhängigen Messungen dar. Eine AlaDH-Einheit ist als die Eπzymmenge definiert, die in einer Minute die Bildung on 1 μmol NADH in der oxidativen Desaminierung katalysiert.
Tab. 2.7 : Zusammensetzung des quantitativen AlaDH-Assays
Die Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für die oxidative Desaminierung ist links, die für die reduktive Aminierung rechts gezeigt.
Oxidative Desaminierung Reduktive Aminierung
125 mM Glycin KOH, pH 10,2 1 M NH4CI / NH4OH, pH 7,4
100 mM L-Alanin 20 mM Pyruvat
1,25 m NAD+ 0,5 mM NADH
2.6.5 Densitometrie
Densitometrie wurde benutzt um eine Quantifizierung des Expressionslevels der AlaDH zu machen. Desweiteren wurden hiermit die Signale der Epitopkartierung quantifiziert und ins Verhältnis zueinander gesetzt.
Die Durchführung erfolgte mit einem Personal Densitometer (Molecular Dynamics) mit der Software Image Quant (Molecular Dynamics).
- 1? -
3.5 Die Verbreitung der Alanin Dehydrogenase innerhalb der Mykobakterien
Sowohl auf Gen-, als auch auf Proteinebene, sollte als nächstes untersucht werden, in welchen Mykobakterien eine Alanin Dehydrogenase vorhanden ist. Ausgehend von der Virulenz war hierbei die Fragestellung, ob die AlaDH-Aktivität mit dieser Eigenschaft korreliert.
3.5.1 In vivo AlaDH-Aktivität
Da AlaDH-Aktivität in der Mikrobenwelt eher die Ausnahme als die Regel darstellt, war es interessant zu hinterfragen, ob dieses Enzym innerhalb der Mykobakterien ubiquitär ist, oder ob es auf bestimmte Spezies und Stämme beschränkt ist. Dadurch können dann wiederum Rückschlüsse auf Fragen gezogen werden wie :
"^ Haben 'aDH produzierende Stämme Gemeinsamkeiten in der Lebensweise ?
^ Induziert eine bestimmt Wachstumsweise oder - phase die AlaDH-Produktion ?
^ Wie erfolgt die Regulation der AlaDH ?
^ Können andere Stoffwechselwege die von der AlaDH katalysierte Reaktion
ersetzen ?
^ Welchen Phänotyp müssten AlaDH Mutanten zeigen ? Es wurden deshalb alle verfügbaren Stämme auf Produktion von AlaDH-Aktivität hin untersucht. Das Repertoir umfasste insgesamt 44 mykobakterielle Stämme, die 29 verschiedene Spezies repräsentieren. Zudem wurden die beiden mit den Mykobakterien eng verwandten Stämme Nocardia asteroides und Rhodococcus equi getestet.
Um die im Testsystem gemessenen Aktivitäten miteinander vergleichen zu können, wurden alle Bakteriensuspensionen auf eine Dichte eingestellt, die der Trübung eines McFarland Standards Nr.5 entspricht. Die Stämme befanden sich zum Zeitpunkt der Messung in der späten exponentiellen Phase.
Neben der AlaDH-Messung wurde auch eine Messung durchgeführt, bei der im Reaktionsansatz L-Alanin fehlte. Die Aktivität dieses Ansatzes ist ein Maß für andere parallel ablaufende NAD+-reduzierende Prozesse. Die Differenz zwischen diesem Ansatz und dem Standardansatz entspricht der Netto-AlaDH-Aktivität (ΔAsgs-Wert).
Gemäß der gemessen Aktivitäten lassen sich die untersuchten Stämme in drei Gruppen einteilen. Die erste Gruppe ist die der stark-positiven Stämme (Tab.3.11). In dieser Gruppe sind die Stämme zusammengefasst, die eine AlaDH-Aktivität von mehr als 0,5 ΔA595-Einheiten im benutzen Testsystem aufweisen.
Tab 3.11 : Stämme mit stark-positiver AlaDH-Aktivität
Die Durchführung dieses Assays ist in 2.6.4.2 beschrieben.
Stamm AlaDH-Aktivität [ΔA595]
M.marinum 3 2,327
M.chelonae 7 1 ,842
M.microti 1 0,919
M.tuberculosis H37RV 0,592 ->9-
Als stark-postiv klassifiziert wurden die beiden für Fische pathogenen Stämme M.chelonae und M.marinum, sowie die beiden ebenfalls pathogenen Stämme M.microti und M.tuberculosis H37RV, letzteres ein virulenter Tuberkulose-Referenzstamm.
Die zweite Gruppe, die der mäßig-positiven Stämme, umfasst jene mit einer Aktivität zwischen 0,1 und 0,5 ΔAsgs-Einheiten (Tab.3.12).
Tab.3.12 : Stämme mit mäßig-positiver AlaDH-Aktivität
Die Durchführung dieses Assays ist in 2.6.4.2 beschrieben.
Stamm AlaDH-Aktivität Stamm AlaDH-Aktivität IΔA595] [AA5951
M.smegmatis 3 0,375 M.tuberculosis 49 0,138
M.ulcerus i 0,369 M.tuberculosis 130 0J18
M.africanum 1 0,287 M.smegmatis 1 0,116
M.tuberculosis 118 0,210 M.tuberculosis 132 0,111
M.tuberculosis 145 0,190 M.tuberculosis 146 0,111
M.intracellulare 1 0,155 M.tuberculosis 1 0,110
In dieser Gruppe finden sich, außer M.smegmatis, nur pathogene, klinische Isolate von M.tuberculosis und anderen Mykobakterien wieder. Beide getesteten Stämme von M.smegmatis zeigen jedoch auch sehr hohe NAD+-reduzierende Aktivitäten in Abwesenheit von L-Alanin. Es ist an dieser Stelle noch wichtig zu erwähnen, daß der Stamm M.smegmatis 1-2c (ein Derivat von M.smegmatis mc26; Zhang et al., 1991 ; Garbe et al., 1994; von Dr. Peadar 0 Gaora, St.Mary's Hospital, London), ein Stamm für genetische Arbeiten in Mykobakterien, keine AlaDH-Aktivität zeigt, aber ebenfalls über eine hohe Hintergrundaktivität verfügt. In der letzten Gruppe schließlich sind alle Stämme aufgeführt, die als für AlaDH- ktivität negativ befunden wurden, d.h. die eine Aktivität von weniger als OJ ΔA5S5- inheiten aufweisen (Tab.3J 3).
Tab.3.13 : Stämme ohne AlaDH-Aktivität
Die Durchführung dieses Assays ist in 2.6.4.2 beschrieben.
Stamm AlaDH-Aktivität Stamm AlaDH-Aktivität [ΔA595] [ΔA595]
N. asteroides 1 0,048 M.bovis BCG 4 0,001
M.flavescens 1 0,042 M.terrae 2 0,001
M.tuberculosis H37Ra 0,032 M.tuberculosis 60 0
M.nonchromogenium 1 0,026 M.tuberculosis 163 0
M.fortuitum 11 0,022 M.gastπ 1 0
M.asiaticum 1 0,021 M.gordonae 3 0
M.bovis BCG 2 0,013 M.kansasii 1 0
M.lυfu 1 0,013 M.parafortuitum 1 0
R.equi 1 0,011 M.peπgrinυm 1 0
M.bovis 3 0,010 M.phlei 1 0
M.scrofulaceum 1 0,009 M.phlei 4 0
M.intracellulare 5 0,007 M.scrofulaceum 8 0
M.thermosresistibile 1 0,006 M.simiae 1 0
M.avium 1 0,002 M.vaccae 3 0
M. triviale 1 0,002 M.xenopi 7 0
Diese weitaus größte Gruppe umfaßt vor allem opportunistische und nicht-pathogene Stämme, sowie die beiden mit den Mykobakterien verwandten Stämme Nocardia asteroides und Rhodococcus equi. Ausnahme waren zwei klinische Tuberkulose- Isolate, sowie der Erreger der Rinder-Tb, M.bovis, aber auch die beiden untersuchten Impfstämme von M.bovis BCG.
Eine graphische Darstellung der AlaDH-Aktivitäten ist in Abb. 3J6 nach phylogenetischen Gesichtspunkten geordnet wiedergegeben.
Figure imgf000023_0001
MΛeπaβ verwandle IvUariυitυm verv.ε
M.tυbercjlcs!s Co-nplex MAIS comp^x Complex S-Smmθ Complex Sl---
schnell langsam wachsende S-äm-T-e
Figure imgf000023_0002
Abb. 3.16 : AlaDH-Aktivität im Reich der Mykobakterien
Die genaue Bezeichnung der einzelnen Stämme ist in Tab. 2.3 wiedergegeben. Die Angaben schnell wachsend bzw. langsam wachsend dürfen nicht streng genommen werdeij, sondern stellen vielmehr eine Tendenz innerhalb der gezeigten Gruppen dar.
Zusammenfassend läßt sich die Verbreitung von AlaDH-Aktivität innerhalb der Welt der Mykobakterien so beschreiben :
© Die mit Abstand höchste Aktivität zeigen die beiden für Fische pathogenen Stämme M.chelonae und M.marinum. D Innerhalb der Stämme von M.tuberculosis ist eine Tendenz vorhanden, nach der mit abnehmender Virulenz auch die AlaDH-Aktivität abnimmt (H37RV klinische Isolate > 37Ra).
3) Alle als positiv klassifizierten Stämme sind virulent. Einzige Ausnahme ist M.smegmatis, das aber anhand seiner hohen Hintergrundaktivität leicht zu unterscheiden ist.
© Nicht alle virulenten Stämme sind AlaDH positiv.
© M.tuberculosis läßt sich mittels AlaDH-Aktivität vom Impfstamm M.bovis BCG unterscheiden.
3.5.2 Das Gen für die Alanin Dehydrogenase
3.5.2Λ Die ersten PCR-Fragmente
Nachdem nun die AlaDH-Aktivitäten innerhalb der verschiedenen Stämme quantifiziert worden waren, stellte sich als nächstes die Frage, warum einige Stämme das Enzym produzieren, andere aber nicht. Auch das Ausmaß der Expression unterscheidet sich selbst zwischen eng verwandten Arten teilweise deutlich.
Das Fehlen meßbarer Aktivität kann bis zu einem gewissen Grad eine Erklärung darin finden, daß sich nicht alle Stämme in der exakt selben Wachstumsphase befanden, da es sehr schwer ist alle Stämme parallel, im gleichen Stadium befindlich anzuziehen. Aber das Ausbleiben von Aktivität könnte auch einen Grund darin haben, daß sich genetische Änderungen auf die Expression des Gens auswirken. Diese Änderungen könnten im kodierenden oder im regulatorischen Bereich aufgetreten sein.
Um diese Tatsache zu überprüfen wurde versucht das AlaDH-Gen aus verschiedenen Stämmen mittels PCR ganz oder teilweise zu amplifizieren. Als Primer dienten hierzu auf der Sequenz von M.tuberculosis H37RV basierende Oligonukleotide (Andersen et al., 1992; siehe Abschnitt 2.2.2, Tab. 2.5).
Die zum Nachweis der AlaDH verwendeten Primerpaare, die jeweils zu erwartende Länge der Produkte und die jev/eils benutzten Aπnea//t?g-Temperaturen der PCR sind in Tab. 3.14 zusammengefasst.
Tab.3.14 : Primerpaare zυrDetektion der AlaDH in Mykobakterien
Die Sequenzen der Primer sind in Tab. 2.5 wiedergegeben.
Bezeichnung Primer #1 Primer#2 Produkt Temperatur
Annabel AlaDH-F1 AlaDH-RM 433 bp 65°C
Beatrice AlaDH-F1 AlaDH-R2 1102 bp 45°C
Claudette AlaDH-F1 AIaDH-R3 1120 bp 55βC
Dέsirέe AlaDH-F1 AlaDH-R6 1072 bp 45βC
Eleonore AlaDH-F1 + AlsDH-R1 1099 bp 55°C
Francoise AlaDH-F1 + AlaDH-R2 1117 bp 50°C
Giselle AlaDH-F2 AIaDH-R7 757 bp 35°C
Helen AlaDH-F4 AlaDH-RM 1080 bp 55°C
Isabelle AIaDH-F4 A!aDH-R6 1050 bp 55°C
Jeanette AlaDH-F5 AlaDH-R1 507 bp 45°C
Karen AlaDH-F5 AlaDH-R4 834 bp 45°C
Laπssa AlaDH-F6 AlaDH-R4 786 bp 55°C
Melanie AlaDH-F6 AlaDH-R5 405 bp 55°C
Die ersten Versuche das Gen für die AlaDH in verschiedenen mykobakteriellen Spezies zu detektieren erfolgte mit dem Primerpaar Annabel. Das hierbei erhaltene Ergebnis war einigermaßen überraschend. Alle Stämme des M.tuberculosis Complex - a n zeigten das erwartete Fragment von 433 bp. Darüber hinaus war bei all diesen Stämmen ein zusätzliches Fragment von etwa 900 bp amplifiziert worden (Abb.3.17).
1 2 3 4 5 6 7 8 10
Figure imgf000026_0001
Abb. 3.17 : PCR verschiedener Stämme mit dem Primerpaar Annabel.
Gefahren wurden bei diesen PCR's jeweils 40 Zyklen mit der Abfolge : melting 2 min bei 96°C, annealing 2 min bei 65CC und exlension 3 min bei 72°C. Die MgCI2-Konzentration betrug 1 ,5 mM.
Bahn 1 : M.tuberculosis H37RV Bahn 6 : M.bovis BCG 4 Bahn 2 : M.tuberculosis H37Ra Eahn 7 : M.africanum 1 Bahn 3 : M.tuberculosis 1 Eahn 8 : M.microti 1 Bahn 4 : M.bovis 3 Bahn 9 : M.marinum 3 Bahn 5 : M.bovis BCG 2 Bahn 10 : M.chelonae 7
Wie sich herausstellen sollte, war dieses zweite Fragment ebenfalls ein Teil des AlaDH-Gens, das durch Anlagerung des Primers AlaDH-RM an einer weiter C-terminal gelegenen Stelle entstanden ist. Durch Erhöhung der Annealing-Temperaiur bei der PCR von 65 auf 69°C konnte dieses zweite Fragment unterdrückt werden (siehe Abb. 3.18, Bahn 2 und 3).
Das eigentlich erstaunliche war jedoch das Erscheinen des amplifizierten Fragments in allen Stämmen des M.tuberculosis Complex, unabhängig vom Vorhandensein von AlaDH-Aktivität. Auch bei einigen anderen Stämmen konnte mit dem Primerpaar Annabel eines oder mehrere Fragmente amplifiziert werden. Allerdings waren die amplifizierten Banden meist nicht besonders stark, so daß sie in Anbetracht der 40 PCR-Zyklen als Hintergrund betrachtet werden können. Es handelt sich vermutlich um schwache unspezifische Reaktionen. Jedoch ist auch nicht auszuschliessen, daß aufgrund mangelnder Homologie zwischen den verschiedenen Spezies die PCR-Primer nicht optimal an die Zielsequenz binden konnten.
Die beiden fischpathogenen Stämme mit starker AlaDH-Aktivität, M.marinum und M.chelonae, zeigten bei der PCR mit dem Primerpaar Annabel ein deutlich unterschiedliches Verhalten. Während M.marinum ein Produkt von etwa 540 bp lieferte, war bei den gewählten Bedingungen mit dem Primerpaar Annabel bei M.chelonae kein Fragment zu erhalten (Abb. 3.17, Bahn 9 und 10).
3.5.2.2 Das AlaDH-Gen des M.tuberculosis Complex
Da die Präsenz des Gens für die AlaDH nun in allen Stämmen des M.tuberculosis Complex nachgewiesen worden war, stellte sich die Frage, wie man sich die Diskrepanz zu den gemessenen Aktivitäten erklären sollte.
Aus diesem Grunde wurde damit begonnen größere Fragmente des Gens zu amplifizieren. Aus M.tuberculosis H37RV konnten alle in Tab. 3.15 aufgeführten Fragmente amplifiziert werden (ein Teil dieser Fragmente ist in Abb. 3.18 gezeigt). Von den anderen Stämmen des M.tuberculosis Complex sind ebenfalls alle PCR- Reaktionen aus Tab. 3.15 die ausprobiert wurden, positiv verlaufen. Es wurde jedoch nicht mit jedem Stamm jede Reaktion nachvollzogen.
Figure imgf000028_0001
Abb. 3.18 : PCR-Produkte des Stammes M.tuberculosis H37RV
Gefahren wurden bei diesen PCR's jeweils 40 Zyklen wie in Abb. 3J7 angegeben. Die aπnea/zog-Temperaturen sind, mit Ausnahme von Bahn 2 und 3, in Tab. 3J4 wiedergegeben. Die MgC! -Konzentration beim Primerpaar Annabel betrug 1 ,5 mM, die aller anderen Reaktionen 3 mM.
Bahn 1 : KBL Bahn 7 : Giselle Bahn 2 : Annabel, 65eC Bahn 8 : Helen Bahn 3 : Annabel, 69CC Bahn 9 : Isabelle Bahn 4 : Dέsirέe Bahn 10 : Larissa Bahn 5 : Eleonore Bahn 11 : Melanie Bahn 6 : Francoise Bahn 12 : KBL
Der von allen Stämmen des M.tuberculosis Complex amplifizierte Bereich umfasst 1260 bp. Er beinhaltet den kompletten kodierenden Abschnitt für die AlaDH, sowie weitere 75 bp υpstream und 63 bp downstream. Dieser Bereich wurde von allen Stämmen des M.tuberculosis Complex komplett durchsequenziert (Abb. 3J 9). Lediglich bei den letzten etwa 20 Basen schleichen sich Ungenauigkeiten ein. Der komplette restliche Bereich' ist jedoch durch mehrfache Sequenzierungen abgesichert.
Es ist festzustellen, daß sämtliche Sequenzen bis auf drei Stellen komplett mit der publizierten Sequenz der AlaDH des λAA65-Klons (Andersen et al, 1992) identisch sind. - *? -
40kD -60 ATCTTGCAGA TTAATCGAAC TTTCTTCACA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC - 1
Tubl -60 ATCTTGCAGA TTAATCGAAC TTTCTTCACA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC -1
K37Rv -60 ATCTTGCAGA TTAATCGAAC TTTCTTCATA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC -
H37Ra -60 ATCTTGCAGA TTAATCGAAC TTTCTTCATA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC -1
BCG4 -60 ATCTTGCAGA TTAATCGAAC TTTCTTCACA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC - τ_
BCG2 -60 ATCTTGCAGA TTAATCGAAC TTTCTTCACA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC -1
Bov3 -60 ATCTTGCAGA TTAATCGAAC TTTCTTCACA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC -1
Afrl -60 ATCTTGCAGA TTAATCGAAC TTTCTTCACA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC - 1
Kiel -60 ATCTTGCAGA TTATCGAAC TTTCTTCACA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC -1
Start ******
40 D 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACGAAT TCCAATTCCG GGTGGCCATC eo
T bl 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AA.TTCCG GGTGGCCATC 60
H37Rv 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
H37Ra 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
BCG4 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
BCG2 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
Bov3 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
Afrl 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
Micl 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
40kD 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAΛCCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
Tubl 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
K37Rv 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
H37Ra 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
BCG4 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCC-GA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
BCG2 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
Bov3 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
Afrl 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCC-GA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
Micl 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
40kD 121 GCCGGAGAGG GCTCC-GCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC GCAACTGGTC ISO
Tubl 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC GCAACTGGTC ιεo
H37Rv 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC GCAACTGGTC lεo
H37Ra 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC GCAACTGGTC lcO
BCG4 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC GCAACTGGTC iso
BCG2 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCA.GGCC-C GCAACTGGTC 160
Bov3 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC GCAACTGGTC 1E0
Afrl 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC GCAACTGGTC 180
Micl • 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC GCAACTGGTC leo
40kD 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG C-GCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGG7CAA AGAACCGATA 240
Tubl 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
H37Rv 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG C-GCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
H37Ra 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
BCG4 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG C-GCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
BCG2 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG C-GCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
Bov3 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
Afrl 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
Micl 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG C-GCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
Abb. 3.19 (1/5): Alignment des AlaDH-Gens und den flankierenden Regionen aus verschiedenen Stämmen des M.tuberculosis Complex
Siehe Legende Seite 101. 40kD 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
Tubl 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 3C0
H37Rv 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
H37Ra 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACGGG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
3CG4 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG C-GATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
BCG2 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG C-GA.TCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
3ov3 2 1 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG C-GATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
Afrl 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
Micl 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
40kD 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAA TGCCTACGAG 360
Tubl 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 3S0
H37RV 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
K37Ra 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTC-TTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
BCG4 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
BCG2 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
Bov3 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
Afrl 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
Micl 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
40kD 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CG TGAGCGA AGTCGCCGGT 420
Tubl 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
H37Rv 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
H37Ra 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
BCG4 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
BCG2 361 ACCGTCCAGA CCGCCGAAGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
Bov3 361 ACCGTCCAGA CCGCCGAAGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
Afrl 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
Micl 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
40kD 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTG.ATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
Tubl 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGA.A CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 4c0
K37Rv 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCG.AA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
H37Ra 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTG.ATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
ECG4 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTG.ATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
BCG2 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATC-CC-AA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
3ov3 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 460
Afrl 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAΛ CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
Micl 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
40kD 4SI CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
Tubl 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
H37Rv 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
H37P.a 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
BCG4 481 CTGATQGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
BCG2 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
3ov3 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
Afrl 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
Micl 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
Abb. 3.19 (2/5) : Alignment des AlaDH-Gens und den flankierenden Regionen aus verschiedenen Stämmen des M.tuberculosis Complex
Siehe Legende Seite 101. 40kD 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CA.TCGCCAAC GGCATGGGCG CGACCGTTAC GGTTCTAGAC eco
Tubl Ξ41 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CATC3CCAA.C GGCATGGGCG CGACCGTTAC GGTTCTAGAC 6C0
H37Rv 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CA.TCGCCAAC GGCATGGGCG CGACCGTTAC GGTTCTAGAC 6 C 0
K37Ra 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG GGCATGGGCG CGACCGTTAC GGTTCTAGAC eco
BCG4 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CA7CGCCAA.C GGCATGGGCG CGACCGTTAC GGTTCTAGAC 600
BCG2 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CATCGCCAAC GGCATGGGCG CGACCGTTAC GGTTCTAGAC 600
Eov3 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CA.TCGCCAAC GGCATGGGCG CGA.CCGTTAC GGTTCTAGAC 600
Afrl 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CA.TCGCCAAC GGCATGGGCG CGACCGTTAC GGTTCTAGAC 600
Micl 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CATCGCCAAC GGCATGGGCG CGACCGTTAC GGTTCTAGAC 600
4CkD 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG C-CAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
Tubl 601 ATCAACATCG ACAAA.CTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
H37Rv 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
H37Ra 601 ATCAΛCATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
BCG4 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
BCG2 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
Bov3 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG C-CAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
Afrl 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGGAT CCACACTCGC 660
Micl 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGC-AT CCACACTCGC 660
40kD 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAC-C-GTGCC GTCAAΛCGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
Tubl 651 TACTCATCGG CCTA.CGAGCT CGAGG TGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
K37Rv 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CG.AC-GGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
H37Ra 661 TACTCATCGG CCTA.CGAGCT CGAC-GGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
BCG4 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAGGGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
BCG2 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAGGGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
Bov3 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAGC-GTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
Afrl 651 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAC-C-GTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
Micl 661 TACTCATCGG CCTA.CGAGCT CGAGGGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
40kD 721 GTCCTGGTGC CAC-GCGCCAA GGCACCCAAA TTA.GTCTCGA ATTCACTTGT CGCGCATATG 750
Tubl 721 GTCCTGGTGC CAGGCGCCAA GGCACCCAAA TTAGTCTCGA ATTCACTTGT CGCGCATATG 780
K37 v 721 GTCCTGGTGC CAC-GCGCCAA GGCACCCAAA TTA.GTCTCGA ATTCACTTGT CGCGCATATG 780
K37Ra 721 GTCCTGGTGC CAGGCGCCAA GGCACCCAAA TTA.GTCTCGA ATTCACTTGT CGCGCATATG 7S0
BCC-4 721 GTCCTGGTGC CAC-GCGCCAA GGCACCCAAA TTA.GTCTCGA ATTCA.CTTGT CGCGCATATG 7S0
BCG2 721 GTCCTGGTGC CAC-GCGCCAA GGCACCCAAA TTAGTCTCGA ATTCACTTGT CGCGCATATG 780
3ov3 721 GTCCTGGTGC CAGGCGCCAA GGCACCCAAA TTAGTCTCGA ATTCACTTGT CGCGCATATG 780
Afrl 721 GTCCTGGTGC CAC-GCGCCAA GGCACCCAAA TTA.GTCTCGA ATTCACTTGT CGCGCATATG 7= 0
Micl 721 GTCCTGGTGC CAGGCGCCAA GGCACCCAAA TTAGTCTCGA ATTCACTTGT CGCGCATATG 780
40kD 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT C-GATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTGTTT CGAAGGCTCA 840
Tubl 781 AAACCAGC-TG CGGTACTGGT C-GATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTGTTT CGAAGGCTCA 840
H37Rv 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT C-GATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTGTTT CGAAGGCTCA 840
H37?.a 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT C-GATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTGTTT CGAAGGCTCA 840
BCG4 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT GG.ATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTGTTT CGAAGGCTCA 840
BCG2 761 AAACCAGGTG CGGTACTGGT C-GATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTGTTT CGAAGGCTCA 840
Bov3 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT GGATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTGTTT CGAAGGCTCA 840
Afrl 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT GG TATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTGTTT CGAAGGCTCA 840
Micl 781 AAA.CCAGG G CGGTACTGGT GG.ATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTGTTT CGAAGGCTCA 840
Abb. 3.19 (3/5) : Alignment des AlaDH-Gens und den flankierenden Regionen aus verschiedenen Stämmen des M.tuberculosis Complex
Siehe Legende Seite 101. 40kD 8 1 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGA.CGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTA.CTGCGTG 500
Tubl 8 1 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGA.CGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTACTGCGTG 500
H37Rv 841 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTACTGCGTG 900
K37Ra 6 1 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACC-TTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTA.CTGCGTG SOO
BCG4 841 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTA.CTGCGTG 900
BCG2 841 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTA.CTGCGTG 900
Bov3 6 1 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTA.CTGCGTG 900
Afrl 841 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACC-TTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTA.CTGCGTG 900
Micl 841 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTA.CTGCGTG 900
40kD SOI GCGAA.CATGC CCGCCTCGGT GCCGAJAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
Tubl SOI GCGAA.CATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
H37Rv SOI GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAA .ACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
H37Ra 90 GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
BCG4 SO GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
3CG2 SOI GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
3ov3 SOI GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
Afrl SOI GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
Micl SOI GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
40kD 561 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATC-GC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
Tubl S61 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATGGC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC G.AATCCGGCA 1020
K37Rv S61 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATGGC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
H37Ra S61 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATC-GC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
BCG4 S61 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATC-GC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
BCG2 S61 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATGGC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
Bov3 S61 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATC-GC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC G.AATCCGGCA 1020
Afrl S61 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATGGC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC G.AATCCGGCA 1020
Micl 561 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATGGC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
40kD 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC GCA.CGAAGGG GCC-TTACTGT CCG.AA.CGGGT GGCCACCGAC 1080
Tubl 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGA.C GCACGAAC-GG GCGTTACTGT CCGAACGC-GT GGCCACCGA.C 1080
H37Rv 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC GCA.CGAA.C-GG GCGTTACTGT CCG.AACC-GGT GGCCACCGAC 1080
K37Ra 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGA.C GCACGAAC-GG GCGTTACTGT CCGAACGC-GT GGCCACCGAC 1080
3CG4 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC C-CACGAAGGG GCGTTACTGT CCG.AA.CGGGT GGCCACCGAC 1080
3CG2 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC GCACGAAC-GG GCGTTACTGT CCGAACGGGT GGCCACCGAC 1080
3ov3 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC GCACGAAC-GG GCGTTACTGT CCGAACGGGT GGCCACCGAC 1080
Afrl 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGA.C GCACGAAC-GG GCGTTACTGT CCGAACGGGT GGCCACCGAC 1080
Micl 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGA.C GCACGAAC-GG GCGTTACTGT CCGAACGC-GT GGCCACCGAC 1080
Stop
40kD 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
Tubl 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
H37Rv 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
H37Ra 1081 CTGGGGG'TGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
BCG4 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
BCG2 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
Bov3 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
Afrl 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
Micl 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
Abb. 3.19 (4/5) : Alignment des AlaDH-Gens und den flankierenden Regionen aus verschiedenen Stämmen des M.tuberculosis Complex
Siehe Legende Seite 101. 40kD 1141 GCCGAGCACA CGTCGGGAGT AAC-GGAAGCG ATGATGTCGG CCGCG
Tubl 11 1 GCCGAGCACA CNTCGGGAGT AANG-GAAGCG ATGATGTCGN C 1185
H37Rv 11 1 GCCGAGCA.CA CGTCGGGAGT AAC-G AAGCG ATGATGTCGG CCG 1185
H37Ra 11 1 GCCGAGCACA CGTCGGGAGT AAGC-G.AAGCG ATGA 11S5
BCG4 1141 GCCGA CACA CGTCGGGAGT AAC-GGAAGCG ATGATGTCGG CC 11S5
BCG2 11 1 GCCGAGCACA CGTCNGGAGT AAC-GGAAGCG ATGATG 1185
Bov3 11 1 GCCGAGCACA CGTCGGGAGT AAC-C-GAAGCG ATGATGTCGG CC 1185
Afrl 1141 GCCGAGCNCA CGTCG 11S5
Micl 11 1 GCCGAGCACA CGTCGGC-AGT AAGC-GAAGCG ATGATGTCGG CC I S 5
Abb. 3.19 (5/5) : Alignment des AlaDH-Gens und den flankierenden Regionen aus verschiedenen Stämmen des M.tuberculosis Complex
Die mit "40kD" bezeichnete Zeile gibt die Sequenz von Andersen et al. (1992) wieder. Sequenzunterschiede sind jeweils mit einem "*" über der Sequenz gekennzeichnet. Das Start- und das Stopcodon sind ebenfalls über der Sequenz markiert. Bei den fett gedruckten Basen am Ende der Sequenz handelt es sich um Sequenzierungenauigkeiten.
Die erste Stelle an der sich die Sequenzen unterscheiden ist Base -32, also upstream des Translations-Startsignals. Interessanterweise unterscheiden sich an dieser Stelle die in dieser Arbeit bestimmten Sequenzen von M.tuberculosis H37RV und H37Ra von der Sequenz von Andersen und Mitarbeitern (Andersen et al., 1992). Alle anderen Sequenzen die in dieser Arbeit untersucht wurden, einschließlich die des dritten getesteten Stammes von M.tuberculosis, stimmen mit der Sequenz von Andersen überein.
Dies ist insofern verwunderlich, als daß die ursprünglich publizierte Sequenz auf dem Klon einer λgt11-Bank beruht, die aus dem Stamm M.tuberculosis H37RV hergestellt worden war. Es wurde deshalb der Frage nachgegangen, ob eventuell durch die PCR ein Fehler eingeführt worden war. Dies bestätigte sich jedoch nicht. Es könnte jedoch auch möglich sein, daß der in dieser Arbeit benutzte Stamm von M.tuberculosis H37RV einen anderen Ursprung hat als der von Andersen. Ähnliche kleine Varianzen sind auch bei verschiedenen Stämmen unterschiedlichen Ursprungs von M.bovis BCG bekannt.
An der zweiten Stelle unterscheiden sich alle Stämme des M.tuberculosis Complex von der publizierten Sequenz der AlaDH von M.tuberculosis H37RV. Es handelt sich um die Region der Basen 38 bis 49. Innerhalb dieser zwölf Basen wird die Sequenz AATTCC- wiederholt, die Basen 44 bis 49 stellen also ein direct repeat der Basen 38 bis 43 dar. In allen acht sequenzierten Stämmen ist dieses Muster jedoch jeweils nur einmal zu finden. Es ist also davon auszugehen, daß sich bei der von Andersen et al. (1992) bestimmten Sequenz ein Sequenzierungs- oder Lesefehler eingeschlichen hat. Die Gensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz ändert sich hierdurch folgendermaßen :
Andersen etal., 1992 :
Gensequenz A A C G A A T T C C A A T T C C G G G T G Proteinsequenz Asn Glu Phe Gin Phe Arg Val
Diese Arbeit :
Gensequenz A A C G A A T T C C G G G T G
Proteinsequenz Asn Glu Phe - - Arg Val
Es handelt sich also effektiv um den 'Verlust' der beiden Aminosäuren Glutamin und Phenylalanin. Nach dieser Deletion setzt sich die Sequenz wie von Andersen et al. (1992) publiziert fort.
Dieser Sachverhalt wurde durch die N-terminale Sequenzierung des Proteins bestätigt. Weder im nativen Protein von M.tuberculosis H37RV, noch im rekombinanten Protein aus E.coli, waren die beiden Aminosäuren zu finden.
Bei der dritten unterschiedlichen Stelle handelt es sich um Base 272. An dieser Stelle befindet sich, mit der Ausnahme dreier Stämmen, ein Adeninrest. Bei diesen drei Stämmen, M.bovis und zwei Stämme von M.bovis BCG, ist diese Base deletiert. Diese Deletion führt zu einer Leserasterverschiebung, die den gesamten folgenden Teil des resultierenden Proteins betrifft. Durch diese Leserasterverschiebung tritt an den Basen 404 bis 406 ein opa/-Stopsignal auf. Damit ist das Produkt dieses Gens nur etwa ein Drittel so groß wie die funktioneile AlaDH der anderen Stämme.
Das entscheidende bei dieser dritten Abweichung in der Gensequenz ist die Tatsache, daß sie genau in den drei Stämmen auftritt, die keine AlaDH-Aktivität zeigen. M.bovis und M.bovis BCG sind die einzigen Stämme des M.tuberculosis Complex, die keine Aktivität zeigen. Alle anderen Stämme wurden als mäßig oder stark positiv klassifiziert. Die beobachtete Deletion ist also der Grund für das Fehlen einer funktioneilen AlaDH. Da jedoch mit dem mAb HBT-10 auch nicht das verkürzte Protein nachgewiesen werden kann (das Epitop von HBT-10 liegt im Bereich vor der Leserasterverschiebung), ist davon auszugehen, daß das verkürzte Protein erst gar nicht, bzw. nur in sehr kleinen, mit dem mAb HBT-10 nicht detektierbaren, Mengen, produziert wird.
3.5.2.3 Das AlaDH-Gen von M.marinum
Außer den Mitgliedern des M.tuberculosis Complex, war es in erster Linie der Stamm M.marinum, bei dem bei der PCR mit dem Primerpaar Annabel ein Fragment gewonnen werden konnte (Abb. 3J7), das sich bei der späteren Sequenzierung als AlaDH erwies. Wie sich zeigen sollte war dies insofern ein Glücksfall, als daß die meisten anderen PCR's mit den Primerpaaren aus Tab. 3J5 keine, oder zumindest nicht die erwarteten, Fragmente mit diesem Stamm lieferten. Lediglich die PCR mit dem Primerpaar Giselle verlief ebenfalls positiv. Wie sich später herausstellte war der Grund hierfür die mangelnde Homologie zwischen den Genen innerhalb der verschiedenen Spezies. 50 60 70
Mar3 AATTCCGGTTAGCGATCACCCCGGCCGGCG
IIIMMI I II MIMIIIIMIIIII
H37RV TTCCGACCGAGACCA-AAAACAACGAΛTTCCAATTCCGGGTGGCCATCACCCCGGCCGGCG
80 90 100 110 120 130
Mar3 TCGCCGCCTTGACCAAGCGCGGCCACGAGGTGCTGATCCAGGCCGGTGCCGGAGAAGGCT
MM I I IM II MIM IIIMMI MUMM MM
H37RV TCGCGGÄACTA-ACCCGTCGTGGCCATGAGGTGCTCATCCAGGCAGGTGCCGGAGAGGGCT
140 150 160 170 180 190
Mar3 CCGCCATCTCCGACGCCGACTTCAAGGCCGCCGGTGCCCAGCTGATCAGCACCGCCGACC
I M IM IIIMM II MUMM II II II II III II MINI ] E II 11
H37RV CGGCTATCACCGACGCGGATTTCAAGGCGGCAGGCGCGCAACTGGTCGGCACCGCCGACC
200 210 220 230 240 250
Mar3 AGGTGTGGGCGGATGCGGACCTGCTGCTCAAGGTCAAGGAACCGATCGAGTCCGAGTACG
MIIMIMI II II II I MUMM I I I II MM
H37RV AGGTGTGGGCCGACGCTGATTTATTGCTCAAGGTCAAAGAACCGATAGCGGCGGAATACG
260 270 280 290 300 310
Mar3 GCCGGCTGCGCCGGGGCCAGACCCTGTTCA.CCTACCTGCACCTGGCCGCCTCGCGCCCCT
MM MIM I II MM I IIIMM I I MM II II I I
H37RV GCCGCCTGCGACACGGGCAGATCTTGTTCACGTTCTTGCATTTGGCCGCGTCACGTGCTT
320 330 340 350 360 370
Mar3 GCACCGATGCCCTGCTGAAGTCCGGCACCACGTCCATCGCCTACGAGACGGTGCAGACCG
MIIMIMI II II I MIMMMIMM II IMIIMMII II IIIMM
H37RV GCACCGATGCGTTGTTGGA-TTCCGGCA-CCACGTCAATTGCCTACGAGACCGTCCAGACCG
380 390 400 410 420 430
Mar3 CCGACGGCGCATTGCCGCTGCTGGCCCCCATGAGCGAGGTCGCCGGGCGCCTGTCCGCCC I II MIM MIM MUMM MUMM II II
H37RV CCGACGGCGCACTACCCCTGCTTGCCCCGATGAGCGAAGTCGCCGGTCGACTCGCCGCCC
440 450 460 470 480 490
Mar3 AAGCTGGGGCCTACCACCTGATGCGCACCCACGGCGGTCGCGGCGTGCTGATGGGCGGCG
I I IM II MMMMIIMM MIM II II MIM IMIIIMIIMM I
H37RV AGGTTGGCGCTTACCACCTGATGCGAACCCAAGGGGGCCGCGGTGTGCTGATGGGCGGGG
500 510 520 530 540 550
Mar3 TCCCCGGCGTCA-AGCCTGCCGACGTCGTGGTGATCGGCGCGGGCACGGCCGGATACAACG
I II IM II II I II MIMMMMMMIMIMM MIM IHM
H37Rv TGCCCGGCGTCGAACCGGCCGACGTCGTGGTGATCGGCGCCGGCACCGCCGGCTACAACG
Abb.3.20 (1/2): Alignment der AlaDH Gene von M.marinum und M.tuberculosis H37RV
Das Screening der Datenbank und das Alignment wurden mit der FASTA-Software {http:/λvww.embl- ebi.ac.uk durchgeführt (Sensitivität ktup=6). Ein " | " kennzeichnet ein identisches Easenpaar. - 3S -
560 570 ≡SO 590 600 610 Mar3 CCGCCCGCGTCGCCAACGGCATGC-C-CGCGATGGTCACCGTGCTGGA7GTCAACATCAACA.
I M I N I I M I I I I I I I I I I M I M I I I I I I I I I I I I I l l l l l l l l I M
H37RV CAGCCCGCATCGCCAACGGCATGG3CGCGACCGTTACGGTTCTAGACATCAACATCGACA
620 630 640 650 660 670
Mar3 AGCTCCGCCAGATCGACGCGGAGTTCGGCGGTCGCGTCCGGACCCGCTACTCGTCGACCC
I II II II MM II MI II IM II
H37RV AACTTCGGCAACTCGACGCCGAGTTCTGCGGCCGGATCCACACTCGCTACTCATCGGCCT
680 690 700 710 720 Mar3 TCGACCTCGAGGATGCGGCAGTCCACGCCGACATGGTGATCGGGGCCGTCCT
IM IM I I
H37Rv ACGAGCTCGAGGGTGCCGTCAAACGTGCCGACCTGGTGATTGGGGCCGTCCTGGTGCCAG
Abb. 3.20 (2/2): Alignment der AlaDH Gene von M.marinum und M.tuberculosis H37RV
Das Screening der Datenbank und das Alignment v/urden mit der FASTA-Sofiwεre (http://www.embl- ebi.ac.uk/) durchgeführt (Sensitivität ktup=6). Ein " | " kennzeichnet ein identisches Basenpaar.
Insgesamt konnten 682 Basen dieses Gens bestimmt werden (Abb. 3.20), was etwa 60% des kompletten Gens ausmacht. Diese 682 Basen kodieren den N-terminalen Bereich des Proteins. Es fehlen lediglich die ersten 35 Basen nach dem Startcodon.
Der sequenzierte Abschnitt der AlaDH von M.marinum zeigt 80,4% Identität mit dem entsprechenden Abschnitt von M.tuberculosis H37RV. Die Sequεnzunterschiede sind relativ gleichmäßig über den gesamten Abschnitt verteilt.
Das abgeleitete Peptid der M.marinum Gensequenz (Abb. 3.21) zeigt 85,3% Identität und 92,0% Ähnlichkeit mit dem Protein von M.tuberculosis H37RV. Homologien zu anderen Proteinen der Swiss Prot-Datenbank sind in Tab. 3J5 wiedergegeben (Stand : 9/1996, Release 33). Als Vergleich sei erwähnt, daß die AlaDH von M.tuberculosis'' 53% Identität zu den Enzymen von B.sphaericus und B.stearothermophilus aufweist (Andersen et al., 1992). Bei der AlεDH von M.marinum ist eine Identität von 51 % mit dem Enzym von B.sphaericus bzw. von 50% mit dem Enyzm von B.stearothermophilus festzustellen (Tab. 3.15). ** ******** ** ***************** t ********** * **************
Mar3 14 FRLAITPAGVA.ALTKP.GKΪVLICAGAGΞGSAISDA-DF KAAGAQLISTADQVΛADAD LK 73
H37RV 14 FRVAITPAGVAΞLTRRGHEVLIQAGAC-ΞGSAITDA-DriAAGAQ VGTADQVft"A--DADL L 73
***** _*+**** ** +**,*+***** ****** ************************ Mar3 74 VKΞPIESΞYC-Λ RHC-QTLFTY H AΛSHPCTDA LKSGTTSIAYETVQTA-DC-.ALPLLAPM 123
H37RV 74 VKEPIAA-EYGRLF-rGQI rTFLKLAASΛACTDALLDSGTTSIAYETVQTA GALPL APM 123
*******_*+ ******** ************* _**+*********+***+*_***+** Mar3 134 SEVAGR SAQAGA^ :iJ-STHGGRGVI-J-:GGVPGVKPADVA/IGAGTAGY^A-A.Vv;A--NG GA l 183 H37RV 134 SEVAGRIJAQVGA^ :U^TQGGRGVIJ-:3GV?GVE?ADVVVIGAGTAGYNA-.A-RIANGMGAT 183
***** ** _****_ ***+ ** _ ***** _** * **#*****
Mar3 184 V VLD\miΥ RQIDAΞFGGRVRTRYSST DLΞDAAVKADI>IVIGAV 229 H37Rv 184 VTVLDINIDXLRQLDAΞrCGRIKTRYESAYELΞGAVK-RA-D VIGAV 229
Abb.3.21 : Alignment derAlaDH's von M.marinum und M.tuberculosis H37RV
Ein "*" zeigt eine identische, ein "." eine funktioneil verwandte Aminosäuren an. Das Screening der Datenbank und das Alignment wurden mit der FASTA-Software (http://www.embl-ebi.ac.ulv) durchgeführt (Sensitivität ktup=2).
Tab.3.15 : Proteine mit Homologie zur AlaDH von M.marinum
Die Swiss Prot- Datenbank wurde mit der FASTA-Software (http:/ΛwΛV.embl- ebi.sc.uk) durchsucht (Stand : 9/1996, Release 33).
Protein Organismus Identität Ähnlichkeit
AlaDH M.tuberculosis 85,3 % 92,0 %
AlaDH B.sphaericus 50,9 % 69,0 %
AlaDH B.stearothermophilus 50,0 % 67,7 %
AlaDH B.subtilis 48,7 % 68,6 %
PNT Rind, mi'ochondrial 33,7 % 51,4%
PNT E.coli 30,7 % 50,0%
PNT Haemophilυs influenzae 28,8 % 43,2 %
Als essentiell für die Bindung des Cofaktors der AlaDH von M.tuberculosis H37RV werden die Aminosäurereste Gly165, Gly167, Gly170 und Asp198 betrachtet. Diese vier Aminosäurereste stellen ein Charakteristikum der ßαß-Sekundärstruktur von NAD(H)-Bindungsstellen dar (Wierenga et al, 1986; Bork & Grunwald, 1990). Im Enzym von M.marinum, genauso wie bei sämtlichen anderen AlaDH's in Tab. 3.14, sind diese vier Reste konserviert.
Der entsprechende Abschnitt des Epitops des mAb HBT-10 bei der AlaDH von M.marinum hat die Sequenz A I S D A D F K A A G, und unterscheidet sich damit lediglich an der dritten Stelle von der Sequenz von M.tuberculosis H37RV. Aufgrund des in dieser Arbeit bestimmten Konsensusepitops des Antikörpers (Tab. 3.9), müsste dieser auch mit der AlaDH von M.marinum reagieren. Tatsächlich ist dieser Stamm auch der einzige, mit dem eine Kreuzreaktion beobachtet werden konnte (Andersen et al., 1992). Die ermittelte Sequenz stimmt also auch mit dieser Beobachtung überein.
AlaDH-Aktivität in Mykobakterien. Die gemessenen AlaDH-Aktivitäten lassen einige interessante Beobachtungen bezüglich der Lebensweise der Organismen mit positiver Aktivität zu.
Die Stämme mit starker Aktivität sind allesamt pathogen. Interessant ist hierbei, daß zwei der vier in diese Gruppe fallenden Stämme pathogen für Fische sind (Austin & Austin, 1987). Alle beide, M.marinum und M.chelonae, können jedoch auch Menschen
infizieren (Wallace et al, 1983; Johnston & Izumi, 1987). Im Gegensatz zur Tuberkulose lösen sie jedoch meist krankhafte Infektionen der oberen Hautschichten aus, die meist relativ unproblematisch zu behandeln sind.
M.chelonae ist ist ein vergleichsweise schnell wachsendes, nicht-chromogenes Bakterium. Infektionen beim Menschen treten oft als sekundäre Wundinfektionen nach Operationen auf (Cooper et al, 1989). M.marinum ist ein langsam wachsender Organismus, der bei Wachstum an Licht ein gelbes Pigment bildet. In mehr als 50 wechselwarmen Spezies (Reptilien, Amphibien, Fische) wurden Infektionen mit M.marinum nachgewiesen (Clark & Shepard, 1963). Beim Menschen manifestiert sich das Bakterium meist im Ellbogen- oder Kniebereich.
Die beiden anderen Stämme mit stark-positiver AlaDH-Aktivität sind Vertreter des M.tuberculosis Complex. Es sind dies der Tuberkulose-Referenzstamm M.tuberculosis H37RV, sowie der Stamm M.microti, der als phylogenetisches Bindeglied zwischen M.tuberculosis und M.bovis betrachtet wird.
Bis auf M.smegmatis sind auch alle als mäßig-positiv klassifizierten Stämme pathogen. Der Großteil dieser Stämme umfasst klinische Isolate von M.tuberculosis. Pathogene Varianten von Tuberkulose-Stämmen scheinen also in der Regel AlaDH- Aktivität zu besitzen. Es wurden jedoch auch zwei Isolate gefunden, die keine AlaDH- Aktivität aufweisen. Der einzige nicht-pathogene Organismus mit AlaDH-Aktivität ist der schnell wachsende Stamm M.smegmatis. M.smegmatis weist sich jedoch durch eine ungewöhnlich starke NAD+-reduzierende Hintergrundaktivität aus, und ist deshalb sehr leicht von allen anderen Stämmen mit AlaDH-Aktivität zu unterscheiden. Desweiteren wurde im Stamm M.smegmaits 1-2c, ein mykobakterieller Expressionsstamm, keine AlaDH-Aktivität gefunden. Innerhalb der 44 getesteten Mykobakterien-Stämme, und dies ist bei weitem der Großteil aller bekannten Stämme, ist deshalb die Folgerung erlaubt :
πn^- Ein langsam wachsendes Mykobakterium mit positiver AlaDH-Aktivität ist virulent.
Der Umkehrschluß dieser Feststellung ist jedoch falsch. Unter den Stämmen ohne AlaDH-Aktivität sind etliche virulente. Trotzdem kommt man nicht umhin eine, wenn auch nicht feste, Tendenz festzustellen, nach der die AlaDH-Aktivität mit steigender Pathogenität eines Stammes zunimmt. Insbesondere durch die Aktivitäten der verschiedenen Stämme von M.tuberculosis wird diese These unterstrichen. Die mit Abstand höchste Aktivität hat der Stamm H37RV, der als Referenzstamm für alle Tuberkulose-Laboratorien dient, und eine bekannt hohe Infektiösität besitzt. Ganz am Ende rangiert das avirulente Derivat von H37RVl der Stamm H37Ra. Zwischen diesen beiden Polen rangieren die klinischen Tubεrkulose-Isolate, die mal etwas mehr und mal etwas weniger Aktivität zeigen.
Das AlaDH-Gen in Mykobakterien. Das Gen für die Alanin Dehydrogenase konnte in allen untersuchten Stämmen des M.tuberculosis Complex und im Stamm M.marinum identifiziert werden.
Der entscheidene Punkt beim Vergleich der Sequenzen innerhalb des M.tuberculosis Complex ist die Deletion der Base 272, die bei den untersuchten Stämmen von M.bovis und M.bovis BCG zu einer Leserasterverschiebung und letztendlich zu einem verkürzten, nicKt-funktionellen Protein führt. Bei diesen Stämmen ließ sich auch in Zellextrakten keine AlaDH-Aktivität nachweisen. Diese Daten stimmen auch mit den Ergebnissen von Andersen et al. (1992) überein, die in Southern Blots zwar Signale mit diesen Stämmen erhielten, aber in Western Blots kein Protein nachweisen konnten.
Durch die Amplifikation und Sequenzierung des Gens konnte in dieser Arbeit die Ursache hierfür gefunden werden. Es muß jedoch auch in Betracht gezogen werden, daß noch weitere Änderungen in den regulatorischen Genabschnitten für das Fehlen des verkürzten Proteins verantwortlich sein können. Dies könnte eine Maßnahme der Zelle sein, keine Energie in ein nicht funktionsfähiges Protein zu investieren. Allgemein ist über regulatorische Gensequenzen bei Mykobakterien noch nicht viel bekannt (Dale & Patki, 1990; Gupta et al. 1993). Es scheint jedoch, daß, nach dem Prinzip von Enhancern, auch weiter weg gelegene Abschnitte die Genexpression nicht unerheblich beeinflußen können. Die für eine Einstellung der Produktion des Proteins nötigen Mutationen müssen also nicht zwangsläufig auf dem in dieser Arbeit sequenzierten Bereich liegen.
Das andere identifizierte AlaDH-Gen, jenes von M.marinum, ist auf DNA-Ebene deutlich unterschiedlich von den Genen des M.tuberculosis Complex. Immerhin vier von fünf Basen (80,4%) sind beim Vergleich dieser Sequenzen jedoch durchschnittlich noch identisch. Dieser Wert ist auf Proteinebene noch höher (85,3 o Identität, 92,0% Ähnlichkeit). Da AlaDH-Aktivität jedoch auch in einer Reihe weiterer Spezies gefunden wurde, ist davon auszugehen, daß sich die entsprechenden Gene, mangels Homologie zu den benutzten Primern, bei den benutzten Bedingungen nicht ampüfizieren ließen. Eine eingehendere Studie betreffs dieses Punktes müsste auch diese Gene auffinden können. Ein Vergleich all dieser Sequenzen könnte weitere Rückschlüsse auf die Rolle des Enzyms zulassen.
Desweiteren ist denkbar, daß sich anhand eines solchen Sequenzvergleiches ein PCR-Verfahren entwickeln lassen müsste, mit dem man Mykobakterien, die ein AlaDH- Gen besitzen, voneinander unterscheiden kann. Und wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, sind es eben die für den Menschen bedeutenden Stämme, die ein AlaDH-Gen besitzen. Besonders die Möglichkeit, mit einem solchen PCR-Assay den Erreger M.tuberculosis vom Impfstamm M.bovis BCG unterscheiden zu können, lassen ein solches Vorhaben interessant erscheinen. Ausblick. Das in dieser Arbeit behandelte 40 kD-Antigen stellt in mehrererlei Hinsicht ein Iohnenswertes Objekt für weitergehende Untersuchungen dar. Ein Punkt, der in dieser Arbeit nicht weiter berücksichtigt wurde, ist die mögliche Anwendung dieses Enzyms in der medizinischen Diagnostik. So wurden bereits für die Enzyme Dipeptidase (Ito et al, 1984), γ-Glutamyltransferase (Kondo et al, 1992) und γ-Glutamyl Cyclotransferase (Takahashi et al, 1987) Assays beschrieben, die auf einer AlaDH basieren. Alle drei genannten Enzyme sind bei verschiedenen Krankheiten in veränderten Urin-, Serum- bzw. Blutkonzentrationen vorzufinden.
Das Hauptaugenmerk liegt jedoch auf dem Einsatz des 40 kD-Antigens bei der Tuberkulose. Ansatzpunkte sind hierbei an mehreren Stellen denkbar.
Allein bei der Diagnostik sind mehrere Möglichkeiten vorstellbar, wie das 40 kD- Antigen, bzw. das ihm zugrundeliegende Gen, genutzt werden könnte. Da das rekombinante Protein nun leicht aus dem überproduzierenden E.coli Stamm gewonnen werden kann, erscheint es lohnenswert, die Nützlichkeit dieses Proteins in der Serologie zu überprüfen. Zudem könnten sich diagnostische Verfahren entwickeln lassen, die auf dem direkten Nachweis von AlaDH-Aktivität oder, wie bereits erwähnt, auf der Amplifikation spezifischer Teile des Gens beruhen. Die Deletion der Base 272 in den Stämmen M.bovis und M.bovis BCG kann hierbei als Ansatzpunkt der Diskriminierung dieser beiden Stämme von M.tuberculosis dienen.
Ein PCR-Assay müsste sich auch für den Stamm M.marinum etablieren lassen, der sich ja auf Genebene nicht unerheblich vom M.tuberculosis Complex unterscheidet. Bislang wird zu diesem Zweck ein PCR-Assay, beruhend auf der Amplifikation eines Teils der für die'JδS rRNA kodierenden Gensequenz, eingesetzt (Knibb et al, 1993). Dies ist, in Anbetracht der in den letzten Jahren steigenden Zahl von Infektionen mit M.marinum in Fischfarmεn (Knibb et al, 1993), von großer Bedeutung. Auch
Infektionen beim Menschen werden in den letzten Jahren gehäuft vermeldet (Harris et al, 1991 ; Kullavanijaya et al, 1993; Siosarek et al, 1994). Die Beobachtung, daß die Virulenz eines Stammes von M.tuberculosis sehr gut mit seiner AlaDH-Aktivität korreliert, wirft erneut die Frage auf, ob das Enzym einen Virulenzfaktor darstellt. Zur Beantwortung dieser Frage sind Ansätze denkbar, wie der knock-out des Gens in M.tuberculosis oder die Überexpression des Gens in einem Stamm mit niedriger Virulenz. In beiden Fällen kann die Virulenz im Tiermodell überprüft werden.
Die Offenbarung der vorliegenden Anmeldung umfaßt auch die Offenbarung der anliegenden EP 97 101 33g. e, insbesondere die darin angeführte Literatur. Die Offenbarung umfaßt auch sämtliche denkbaren Kombinationen offenbarter Einzelmerkmale.

Claims

5. ZusammenfassungDie Tuberkulose ist eine Infektionskrankheit, der jährlich über 3 Millionen Menschen zum Opfer fallen. Es gibt zwar sowohl einen Impfstoff, als auch verschiedene Diagnose- und Therapieverfahren, doch die Effektivität all dieser Maßnahmen bedarf, angesichts der wieder steigenden Zahl der Erkrankungsfälle, dringend einer Verbesserung.Ein Forschungsschwerpunkt liegt auf der Charakterisierung von Antigenen, die frühzeitig während einer Infektion sekretiert werden, da diese den ersten Kontakt des Immunsystems mit dem Erregers herstellen. Das in dieser Arbeit behandelte 40 kD-Antigen liegt in vivo als Hexamer vor, und ist trotz des hohen Molekulargewichts und des Fehlens einer Signalsequenz bereits nach wenigen Tagen des Wachstums extrazellulär zu finden. Es stellt funktionell eine L-Alanin Dehydrogenase dar und reagiert mit dem gegen dieses Protein gerichteten monoklonalen Antikörper HBT-10. HBT-10 war der erste bekannte Antikörper, der spezifisch für ein Protein von M.tuberculosis ist und nicht mit dem Impfstamm M.bovis BCG kreuzreagiert.
1. Das für das 40 kD-Antigen kodierende Gen war bereits in einen Plasmidvektor für E.coli kloniert und die Expression des resultierenden Plasmids optimiert worden. In dieser Arbeit wurde eine komplett neue Methode etabliert, die es ermöglicht, das hexamere Protein in einem Zwei- Seh ritt- Verfahren in löslicher und aktiver Form aufzureinigen.
2. Alle wesentlichen biochemischen Parameter des rekombinanten Enzyms wurden bestimmt. Die ermittelten Eigenschaften stehen in Einklang mit denen anderer beschriebener L-Alanin Dehydrogenasen. Das Enzym von M.tuberculosis ist die Alanin Dehydrogenase mit dem niedrigsten bekannten pH-Optimum für die reduktive Aminierung.
3. Die ermittelten biochemischen Daten sprechen stark für eine Rolle des Enzyms bei einem frühen Schritt der Peptidoglycansynthese. Es stellt hierbei L-Alanin, das auch die Vorstufe von D-Alanin ist, für die Synthese der Penta- bzw. Tetrapeptidketten der Λ/-Glycolyimuraminsäure zur Verfügung. Dies ist die erste Beschreibung dieser Aufgabe für eine L-Alanin Dehydrogenase.
4. Eine postulierte Kreuzreaktion des monoklonalen Antikörpers HBT-10 mit der PNT wurde widerlegt. Der These, das 40 kD-Antigen interveniere in das kritische Gleichgewicht zwischen NADH und NADPH, wurde dadurch eine Grundlage entzogen. Auch auf die Fähigkeit des intrazellulären Überlebens in Makrophagen hat das 40kD-Antigen, zumindest in Abwesenheit anderer mykobakterieller Proteine, keinen Einfluß.
5. Über 40 mykobakterieile Stämme wurden auf das Vorhandensein von AlaDH- Aktivität hin untersucht. Alle Stämme die AlaDH-Aktivität aufweisen, sind virulent. M.bovis BCG zeigt keinerlei Aktivität. Zudem scheint das Ausmaß der Aktivität mit dem Grad der Virulenz eines M.tuberculosis-Slamτnes zu korrelieren.
6. Das Gen für die Alanin Dehydrogenase wurde aus acht Stämmen des M.tuberculosis Complex komplett sequenziert. In den Stämmen M.bovis und M.bovis BCG wurde eine Deletion gefunden, die zu einer Leserasterverschiebung führt und für das Fehlen von meßbarer Aktivität in diesen Stämmen verantwortlich ist.
7. Das AlaDH-Gen aus M.marinum wurde identifiziert und ein Großteil der Sequenz bestimmt. Das Gen besitzt etwa 80% Identität mit dem Gen von M.tuberculosis.
7. Anhänge
Abkürzungsverzeichnis
A präexponentieller Faktor oder Stoßfaktor
Axxx Absorption bei einer Wellenlänge von xxx nm
AlaDH L-Alanin Dehydrogenase (E.C. 1.4J . )
AMC Academic Medical Centre, Amsterdam, Niederlande
Ap Ampicillin
AP Alkalische Phosphatase app. apperent
AS Aminosäure
ATCC American Type Culture Collection, Rockville, USA
ATP Adenosin-Triphosphat
BCG Bacille Calmette Guerin
BCIG 5-Bromo-4-Chloro-3-lndolyl-ß-D-Ga!actopyranosid
BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-!ndolylphosphat
Boc /erf-Butoxycarbonyl bp Basenpaar(e)
cfu colony forming units
Cm Chloramphenicol
Conc Konzentration
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMF Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DTNB Dithiobisnitrobεnzoesäure
DTT Dithiothreitol
Ea Aktivierungsenergie
EDTA Ethylendiamintetraacetat
Eth Ethionamid ~4V -
F Farad
FBS Fötales Rinderserum
FCS Fötales Kalbsserum
Fmoc 9-Flourenylmethoxycarbonyl
FPLC Fast Protein Liquid Chromatography frag. Fragment
9 Fallbeschleunigung
GBF Gesellschaft für biotechnologische Forschung mbl
GIcNAc N-Acetylglucosamin
Gm Gentamicin
GOGAT Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase
GS Glutamin-Synthetase
GST Glutathion-S-Transferase
h Stunde(n)
HBSS Hank's Balanced Salt Solution
HIV Human Immunodeficiency Virus
HOBt Hydroxybenzotriazol
HRP Horseradish Peroxidase
Hsp Hitzeschockproteine
ig Immunglobuiin
IL Interleukin
INH Isonicotinsäurehydrazid, Isoniazid
IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactosid
k Umsatzrate eines Enzyms kb Kilobasen
KBL Kilobasenleiter kD, kDa Kilodalton
KIT Royal Tropical Institute, Amsterdam, Niederlande
KM Michaelis-Konstante
Km Kanamycin
MΦ Makrophage(n) mAb monoklonaler Antikörper
MAIS M.avium - M.intracellulare - M.scrofulaceum Com MBP maitose binding protein
MCAC Metallchelat-Affinitätschromatographie mesoDAP meso Diaminopimelinsäure min Minute(n) m.o.i. multiplicity of infection
MRC Medical Research Council, Tuberculosis and Related Infections Unit, London, England
MTT Thiazolylbluetetrazoliumbromid
MurNAc A/-Acetylmuraminsäure
MurNGl Λ/-Glycolylmuraminsäure
NAD+ Nicotinamidadenindinucleotid, oxidierte Form
NADH Nicotinamidadenindinucleotid, reduzierte Form
NADP+ Nicotinamidadenindinucieotidphosphat, oxidierte Form
NADPH Nicotinamidadenindinucleotidphosphat, reduzierte Form n.b. nicht bestimmt
NBT Nitrobluetetrεzoliumchlorid
Nr. Nummer
NTP beliebiges Nucleosid in Form eines Triphosphats
oD oxidative Desaminierung
ORF open reading frame, offenes Leseraster
OtBu terf-Butylester
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese pac protein antigen c, alte Bezeichnung für das 40 kD-Antigen
PCR polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion
Pfp Pentaflourphenyl
PMA Phorbolmyristatacetat
Pmc Pentamethylchroman
PMS Phena∑inmethosulfat
PNT Pyridinnukleotid-Transhydrogenase
PPD Purified protein derivative
PVDF Polyvinylidendiflourid
R Rydberg-Konstante oder Resistenz (wenn Buchstabe hochgestellt) rA reduktive Aminierung rec rekombinant Rha Rhamnose -4$-
Rif Rifampicin
RIV National Institute of Public Health and the Environment, Bilthoven, Niederlande
RNA Ribonukleinsäure
RNI reaktive nitrogen intermediates, reaktive Stickstoff-Intermediate
ROI reaktive oxygen intermediates, reaktive Sauerstoff-Intermediate rpm rounds per minute, Umdrehungen pro Minute rRNA ribosomale Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat see Sekunde(n) Str Streptomycin
Tb Tuberkulose
TEMED Λ/.Λ/.ΛT.N-Tertamethylethylendiamiπ
TIR Translations-Initiationsregion
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
TU Trityl ts temperatur-sensitiv
Tween Polyoxyethylensorbitanmonolaurat
U Unit(s) ÜN über Nacht unveröff. unveröffentlicht
vmax maximale Reaktionsgeschwindigkeit
VMDC Veterinary Microbiological Diagnostic Centre, Utrecht, Niederlande
Vol. Volumen
WHO World Health Organization, Weltgesundheitsorganisation WKZ Academisch Ziekenhuis, Utrecht, Niederlande
z.A. zur Analyse, von höchstem Reinheitsgrad Abkürzungen für Aminosäuren und Nukleotide
Aminosäure 3-Buchstab£
Alanin Ala A
Arginin Arg R
Asparagin Asn N
Aspartat Asp D
Cystein Cys C
Glutamin Gin Q
Glutamat Glu E
Glycin Gly G
Histidin His H
Isoleucin He
Leucin Leu L
Lysin Lys K
Methionin Met M
Pheny-alanin Phe F
Prolin Pro P
Serin Sεr S
Threonin Thr T
Tryptophan TΦ w
Tyrosin Tyr Y
Valin Va! V
Base Nukleosid / Nukleotid Abkürzung
Adenin Adenosin A
Cytosin Cytidin C
Guanin Guanosin G
Uracil Uridin U
Thymin Thymidin T
DNA-Seσuenz von Mycobacterium marinum und Verwendung
P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. DNA-Sequenz (I) von Mycobacterium marinum der folgenden Formel, dazu komplementäre DNA-Sequenz, doppelstrangige DNA-Sequenz aus der DNA-Sequenz (I) und ihrem komplementären Strang, deren Teilsequenzen und mit ihnen vorzugsweise bei einer Temperatur von mindestens 20 C und insbesondere bei einer Konzentration von 1 M NaCI und einer Temperatur von mindestens 25 C hybridisierbare DNA-Sequenzen:
50 60 70
Mar3 AATTCCGGTTAGCGATCACCCCGGCCGGCG
IIIIMII I II
-1137Rv- -^TGeGA€G&AGAeGA -AAA.e AeGAA-τ-τe€-AATτe ssβτGGeeAτeAeeeeGΘeeGGeα-
80 90 100 110 120 130
Mar3 TCGCCGCCTTGACCAAGCGCGGCCACGAGGTGCTGATCCAGGCCGGTGCCGGAGAAGGCT
-H^y- σ — Tee sGAA- ^AAeeeGTeGTGβeeATΘAGG βe-peATeeAGΘeAGOTGeeGGAGAΘΘΘe'--1-
140 150 160 170 180 190
Mar3 CCGCCATCTCCGACGCCGACTTCAAGGCCGCCGGTGCCCAGCTGATCAGCACCGCCGACC
II37RV GGGGTAΦ€AΘGGAeGeG&AT-T-TGAAGGGGGeAGGGGeGeA-A€-TG&T-€€GGAGGGGeGAΘ€-
200 210 220 230 240 250
Mar3 AGGTGTGGGCGGATGCGGACCTGCTGCTCAAGGTCAAGGAACCGATCGAGTCCGAGTACG II II II I I I I II MM
H37RV AGGΦ ΦG GG GAβGGΪG ^TΨA^TG TGAAGGTGAAAGAGS&AΦAGGGG^GA-^TAGG-
260 270 280 290 300 310
Mar3 GCCGGCTGCGCCGGGGCCAGACCCTGTTCACCTACCTGCACCTGGCCGCCTCGCGCCCCT
MM MIM I I! Illl I I I MM II II I I
-i&rf&v — GeGGe«FGe&AeAGGGGGAGATeT-TGTTGAGGT-TG-TTGGA-l P-TGGGCGGGTGAGGTGfrT-Φ
320 330 340 350 360 370
Mar3 GCACCGATGCCCTGCTGAAGTCCGGCACCACGTCCATCGCCTACGAGACGGTGCAGACCG II II I II II IIIMM
•H37R- — GGAGG&A-TGβGT-TGΦ5GGAT-TGGGGGAGGAGGΦGAA-T.TGGG-TAGGAGAGGG-T-CCAGACCG
380 390 400 410 420 430
Mar3 CCGACGGCGCATTGCCGCTGCTGGCCCCCATGAGCGAGGTCGCCGGGCGCCTGTCCGCCC
MIMIIMM I II MIM MIM II II in 7 R — eeGAeGQeGe eTAeeeeTGeTTG€eee&ATGAGe A GTGGeeGGT-eG -TGGGGG Ge—
440 450 460 470 480 490
Mar3 AAGCTGGGGCCTACCACCTGATGCGCACCCACGGCGGTCGCGGCGTGCTGATGGGCGGCG
-H3-3-RV — GGΦ-TGG€Ge- ϊÄeeAeeTΘA Θe&AfteeeAAGGGGGCt-GCGGTGTσCTGATGGGCGGGG"
500 510 520 530 540 550
Mar3 TCCCCGGCGTCAAGCCTGCCGACGTCGTGGTGATCGGCGCGGGCACGGCCGGATACAACG
I IIIIIMM I II MIMIMMMIMMMMII MIM MIM
-ji3"7Rv — -TΘeΘGGΘeGϊ€GAAeGGGeeG eG eG'P G GATeGGeGeeβGeAeeGeeGGεT eAAeG"
560 570 580 590 600 610 Mar3 CCGCCCGCGTCGCCAACGGCATGGGCGCGATGGTCACCGTGCTGGATGTCAACATCAACA
I 11111 II 11 II II 11 ! 11111 II II II II II MUMM IM
-Η-3-7-R«P AGe€€βeA-TeGeeAAGGΘGA1?GGGeΘeΘAeeGcF'PA S© TGT-AGAeA- AAe e A A'
Figure imgf000054_0001
680 690 700 710 720
Mar3 TCGACCTCGAGGATGCGGCAGTCCACGCCGACATGGTGATCGGGGCCGTCCT f£)
1137Rv A€GAβeiϊ^&AβGβ-rGe€β-j^-AJ^^Θ-rGe€-&Aee?eG-θAΥ-ΥβG6GgεGTCCroΘ-Tβeeftβ^
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man mit ihrer Hilfe Alanindehydrogenase herstellen oder gewinnen und
(i) zur Diagnose von Tuberkulose in Menschen und Tieren und/oder
(ii) zur Diagnose von anderen mycobakteriellen Infektionen in Menschen und Tieren verwenden kann, die insbesondere durch Mycobacterium marinum verursacht werden.
3. RNA als Transkript einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, insbesondere zur Verwendung
(i) bei Diagnose von Tuberkulose in Menschen und Tieren und/oder
(ii) bei der Diagnose von anderen mycobakteriellen Infektionen in Menschen und Tieren, die insbesondere durch Mycobacterium marinum verursacht werden.
4. Protein, das durch eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 kodiert wird und insbesondere Alanindehydrogenase entspricht und
(i) zur Diagnose von Tuberkulose in Menschen und Tieren und/oder
(ii) zur Diagnose von anderen mycobakteriellen Infektionen in Menschen und Tieren verwendet werden kann, die insbesondere durch Mycobacterium marinum verursacht werden.
5. Protein der folgenden Sequenz (II)
**_******** ** # ***************** # *********** # **************
Mar3 14 FR AITPAGVAALT RGHEV IQAGAGEGSAISDADF AAGAQ ISTADQVWADAD LLK 73 --H-57RY 14 FRVAITPAΘVASLTRRGKSV IQftgftSBΘSftg^-SJ^Pigti^AQLVGTADQVWftBftDL LK 73 ■
***** _****** ** *** ******* ****** ************************
Mar3 74 VKEPIESEYGRLRRGQTLFTY HL-AASRPCTDA LKSGTTSIAYETVQTADGALPLLAPM 123 •-K37RV 71 VKEPIAΛEYGR nHσQI PT-FLHI--ΛASftΛCTDΛ ^ 123
******* ** ******** ************* # ******************_ ******
Mar3 134 SEVAGRLSAQAGAYHLMRTHGGRGVLMGGVPGVKPADVWIGAGTAGYNAARVANGMGAM 183 1137Rv 134-CΞVAGRI-ι-^QVGAYHI-MRTQCCRCVkMGGVPGVS^^
***** ** ****,**** **, ***** #** * **_***** Mar3 184 VTV DVNINKLRQIDAΞFGGRVRTRYSST D ΞDAAVHADMVIGAV 229 «37Rv 18d"VTV PI I rJiRQI^A5gCGR lKΦR¥SSA«5^SCA, yjUPL.V.IGΛV 238.. sowie Oligopeptid, das von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die mit einer DNA-Sequenz, die das Protein der Formel (II) kodiert, vorzugsweise bei einer Temperatur von mindestens 20 C und insbesondere bei einer Konzentration von 1 M NaCI und einer Temperatur von mindestens 25 °C, hybridisierbar ist, sowie Oligopeptid, das von einer Teilsequenz der hybridisierbaren DNA-Sequenz kodiert wird.
6. Spezifisches und empfindliches Verfahren zur Identifizierung von Mycobakterien in einem Medium, dadurch gekennzeichnet , daß man
(i) Zellen, Stämme oder Spezies von Mycobakterien isoliert, (ii) rohe oder gereinigte genomische DNA oder RNA gewinnt, (iii) die genomische DNA oder RNA oder ein cDNA-Fragment identifiziert, deren Sequenz mit dem des Alanindehydrogenase- Gens von Mycobacterium tuberculosum (Fig. 3.20) identisch oder praktische identisch ist, indem man vorzugsweise mit Hilfe einer Primer-Sequenz auf Basis der Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 1 amplifiziert, (iv) wonach man die DNA mit einem Restriktionsenzym, vorzugsweise Bglll, verdaut und einer Gelelektrophorese unterwirft (v) und/oder die DNA-Sequenz der amplifizierten DNA bestimmt.
7. Verwendung von Alanindehydrogenase aus Mycobacterium marinum (Wildtyp) für die Diagnose von Tuberkulose durch Messen der
Enzymaktivität oder durch eine immunologische Methode.
8. Verf hren zur Herstellung von rekombinanter Alanindehydrogenase, dadurch gekennzeichnet , daß man mit Hilfe einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 in Bakterien, Hefe, Pilzen, höheren Eucaryoten oder Zellinien die rekombinante Alanindehydrogenase bildet und gewinnt.
9. Verwendung der gemäß Anspruch 8 gewonnenen rekombinanten Alanindehydrogenase zur Diagnose von mycobakteriellen Infektio- nen, insbesondere Tuberkulose und der Schwimmer-Krankheit (swimmer's disease) in Menschen und Tieren.
10. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 und/oder von nativer oder rekombinanter Alanindehydrogenase von Mycobacterium marinum zum direkten Nachweis und zur Diagnose von Tuberkulose und anderen mycobakteriellen Infektionen in Menschen und Tieren in klinischen Proben.
11. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 und/oder von nativer oder rekombinanter Alanindehydrogenase von Mycobacterium marinum
(i) bei der Bekämpfung von Epidemien und/oder
(ii) nach Vakzinierung (follow-up) von Menschen und Tieren.
12. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 und/oder von nativer oder rekombinanter Alanindehydrogenase von Mycobacterium marinum zur Ermittlung, zum Testen, Gewinnen und Herstellen von Substanzen, die Erreger von Tuberkulose oder anderen mycobakteriellen Erkrankungen beim Menschen und Tieren inhibieren.
13. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 und/oder nativer oder rekombinanter Alanindehydrogenase von Mycobacterium marinum für Biotransformationsreaktionen, die für L-Alanin spezifisch sind.
PCT/EP1998/000484 1997-01-29 1998-01-29 L-alanin dehydrogenase von mycobacterium marinum Ceased WO1998032862A2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU60979/98A AU6097998A (en) 1997-01-29 1998-01-29 L-alanine dehydrogenase of mycobacterium marinum

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97101339 1997-01-29
EP97101339.6 1997-01-29

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO1998032862A2 WO1998032862A2 (de) 1998-07-30
WO1998032862A3 WO1998032862A3 (de) 1998-11-12
WO1998032862A9 true WO1998032862A9 (de) 1998-12-23

Family

ID=8226418

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1998/000484 Ceased WO1998032862A2 (de) 1997-01-29 1998-01-29 L-alanin dehydrogenase von mycobacterium marinum

Country Status (2)

Country Link
AU (1) AU6097998A (de)
WO (1) WO1998032862A2 (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0966544B1 (de) * 1997-01-29 2005-03-23 Lionex GmbH Test-kit für tuberkulose-diagnose etc.
US6316205B1 (en) 2000-01-28 2001-11-13 Genelabs Diagnostics Pte Ltd. Assay devices and methods of analyte detection
GB2403477B (en) * 2002-04-16 2006-08-23 Jun Liu Recombinant BCG strains expressing alanine dehydrogenase,serine dehydratase and/or glutamine synthetase as TB vaccines

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995017511A2 (en) * 1993-12-23 1995-06-29 Agresearch New Zealand Pastoral Agriculture Research Institute, Ltd. Mycobacteria virulence factors and a method for their identification

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Keough et al. Archaeal nucleic acids in picoplankton from great lakes on three continents
Zhu et al. Mapping of picoeucaryotes in marine ecosystems with quantitative PCR of the 18S rRNA gene
DE69233522T2 (de) Für die regulation und reifung von urease notwendige helicobakter pylori-gene und ihre nutzung
Fiala et al. Flexistipes sinusarabici, a novel genus and species of eubacteria occurring in the Atlantis II Deep brines of the Red Sea
Ubaldi et al. Sequence analysis of bacterial DNA in the colon of an Andean mummy
Hori et al. Direct comparison of single-strand conformation polymorphism (SSCP) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to characterize a microbial community on the basis of 16S rRNA gene fragments
DE69839426T2 (de) Nukleotidsequenzen, die für sekretierte polypeptide aus mycobacterium kodieren, vektoren, die diese enthalten, und anwendungen zur diagnostik und verhütung von tuberkulose
Yuan et al. A novel signaling pathway connects thiamine biosynthesis, bacterial respiration, and production of the exopolysaccharide amylovoran in Erwinia amylovora
EP0966544B1 (de) Test-kit für tuberkulose-diagnose etc.
Duman et al. Pseudomonas anatoliensis sp. nov and Pseudomonas iridis sp. nov. isolated from fish
WO2018195136A1 (en) Compositions and methods for regulated gene expression
Obata et al. Association of rpoB mutations with rifampicin resistance in Mycobacterium avium
Wood et al. Development of a probe and PCR primers specific to the virulence plasmid of Salmonella enteritidis
Štenclová et al. Occurrence of aetokthonotoxin producer in natural samples–A PCR protocol for easy detection
DE10012540B4 (de) Oligonukleotide und Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen durch Polymerase-Kettenreaktion
Guo et al. Identification of seven Xanthomonas oryzae pv. oryzicola genes potentially involved in pathogenesis in rice
WO1998032862A9 (de) L-alanin dehydrogenase von mycobacterium marinum
Moreno et al. Specific detection of viable Listeria monocytogenes in Spanish wastewater treatment plants by Fluorescent In Situ Hybridization and PCR
WO1998032862A2 (de) L-alanin dehydrogenase von mycobacterium marinum
EP0460041A1 (de) Sonden, ausrüstungen und verfahren zum nachweis und zur differenzierung von mycobakterien.
Lagares Jr et al. A cultivation-independent PCR-RFLP assay targeting oprF gene for detection and identification of Pseudomonas spp. in samples from fibrocystic pediatric patients
DE69424780T2 (de) Anti-mikrobische agenzien und screening-verfahren dazu
DE69304536T2 (de) Nukleotidische sequentien von genen die für pectate-liasen kodieren und dessen verwendung für den nachweis von bakterien der gattung erwinia
WO2002024904A2 (de) Verfahren zur herstellung von ribonukleinsäure (rns)
DE69735885T2 (de) Erkennung von pyrazinamid-resistenten mycobakterien und verfahren zur behandlung von mycobakterien-infektionen