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WO1998003524A1 - Nouveaux oligosaccharides a base de lactosamine et procede de preparation - Google Patents

Nouveaux oligosaccharides a base de lactosamine et procede de preparation Download PDF

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Publication number
WO1998003524A1
WO1998003524A1 PCT/JP1997/002551 JP9702551W WO9803524A1 WO 1998003524 A1 WO1998003524 A1 WO 1998003524A1 JP 9702551 W JP9702551 W JP 9702551W WO 9803524 A1 WO9803524 A1 WO 9803524A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
residue
bond
sulfate
gal
glcnac
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1997/002551
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Akira Tawada
Keiichi Yoshida
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Seikagaku Corp
Original Assignee
Seikagaku Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seikagaku Corp filed Critical Seikagaku Corp
Priority to CA002261877A priority Critical patent/CA2261877C/en
Priority to JP50680798A priority patent/JP4179567B2/ja
Priority to US09/230,128 priority patent/US6132994A/en
Priority to DE69739750T priority patent/DE69739750D1/de
Priority to EP97932995A priority patent/EP0926154B1/en
Publication of WO1998003524A1 publication Critical patent/WO1998003524A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • C07H13/06—Fatty acids

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for producing N-acetylsilactosamin oligosaccharide, and more particularly, to a method for producing N-acetylsilactosamin oligosaccharide from keratan sulfate having adjusted sulfate group content by an enzyme reaction and a chemical reaction.
  • the present invention also relates to a novel method for producing sulfated N-acetyllactosamine oligosaccharide.
  • the present invention also relates to a novel N-acetyl-lactosamine oligosaccharide.
  • Oligosaccharides and derivatives thereof having a N-acetylsyllactosamine (LacNAc) structure as a skeleton play important physiological functions in vivo as sugar chains capable of binding to selectin families. It has been revealed that the expression of these sugar chains on the cell surface is involved in specific adhesion between heterologous cells, and functional activators and inhibitors using these sugar chains are expected to be useful drugs Have been. In other words, its central compound, sialyl Lewis X CSLe ') and its related compounds block selectin molecules and inhibit adhesion of lymphocytes to endothelial cells, thereby reducing various diseases involving inflammation. It is thought to be helpful.
  • Oligosaccharides and their derivatives having an N-acetyl lactosamine structure as a skeleton are expected to play an important role in the development of new drugs and in studies on biological activity in vivo. If a long-chain N-acetyllactosaminooligosaccharide, which is similar to the natural ligand sugar chain of the selectin family, is obtained as its basic skeleton, N-acetyllactosaminooligosaccharide, the N-acetyllactosaminooligosaccharide can be obtained.
  • sialic acid residues, fucose residues, sulfate groups, ceramides, etc. to sugars as appropriate, it is possible to synthesize selectin family ligand sugar chains that are present only in trace amounts in nature. It is thought that it can be achieved.
  • N-acetyl-lactosamine oligosaccharides especially long-chain N-acetyl-lactosamine oligosaccharides.
  • Oligosaccharides having an N-acetyl lactosamine structure as a skeleton are naturally present in only trace amounts, and the synthetic production of N-acetyl lactosamine oligosaccharides in a chain is extremely difficult.
  • a method for producing inexpensive N-acetyllactosamine oligosaccharide is desired.
  • sulfated N-acetyl-lactosamine oligosaccharides are useful as intermediates for synthesizing N-acetyl-lactosamine oligosaccharides, especially long-chain N-acetyl-lactosamine oligosaccharides.
  • this production method it is expected that it will lead to a stable supply of N-acetylsilactosaminoligosaccharide. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of the above, and has a novel N-acetylacetyltosaminooligosaccharide, a novel method for producing an N-acetylethyltosaminooligosaccharide, which is a material for synthesizing a selectin family ligand sugar chain, Another object of the present invention is to provide a novel method for producing a sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, adjusted the sulfate group content of keratan sulfate having an N-acetyl lactosamine structure as a basic skeleton, and obtained a keratan sulfate having an adjusted sulfate group content.
  • the present inventors have found that N_acetyl lactosamine oligosaccharide (particularly, long-chain N-acetyl lactosamine oligosaccharide) can be obtained by decomposing to sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide by an enzyme and then completely desulfating it, leading to the present invention.
  • N_acetyl lactosamine oligosaccharide particularly, long-chain N-acetyl lactosamine oligosaccharide
  • sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide (especially long-chain sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide) is obtained by adjusting the sulfate group content of keratan sulfate and enzymatically digesting the keratan sulfate having the adjusted sulfate group content. And found that the present invention was achieved.
  • the present invention relates to an enzyme having an action of adjusting the sulfate group content of keratan sulfate and having an action of cleaving the glycosidic bond of keratan sulfate with the adjusted sulfate group content.
  • an enzyme having an action of adjusting the sulfate group content of keratan sulfate and having an action of cleaving the glycosidic bond of keratan sulfate with the adjusted sulfate group content.
  • Oligosaccharide production method also referred to herein simply as “Method 1 of the present invention”
  • novel N-acetylacetyltosaminooligosaccharide also referred to herein simply as “oligosaccharide of the present invention”
  • oligosaccharide of the present invention novel N-acetylacetyltosaminooligosaccharide
  • the present invention provides a method for adjusting the sulfate group content of keratan sulfate, wherein the enzyme specificity of three types of keratan sulfate degrading enzymes having different substrate specificities depending on the presence or absence of a sulfate group in keratan sulfate having an adjusted sulfate group content.
  • a method for producing a sulfated N-acetylacetyltosaminooligosaccharide (which may be simply referred to as "method 2 of the present invention” in the present specification), which comprises at least a step of reacting one or more enzymes belonging to any of them.
  • the method 1 of the present invention and the method 2 of the present invention may be simply referred to as “the method of the present invention”.
  • N-acetylsilactosamine refers to a structure (Gal GlcNAc) in which a galactose residue (Ga) and an N-acetylglucosamine residue (GlcNAc) are glycosidically bonded.
  • Ga galactose residue
  • GlcNAc N-acetylglucosamine residue
  • N-acetylacetyltosamine includes a structure in which an N-acetylglycosamine residue (GlcNAc) and a galactose residue (Gal) are glycoside-linked (GlcNAc- Gal).
  • N-acetyl lactosamine oligosaccharide refers to an oligosaccharide having at least one N-acetyl lactosamine structure, such as N-acetyl lactosamine itself or N-acetyl lactosamine via a glycosidic bond. Oligosaccharides consisting of repetition of trisamine are included. A sialic acid residue may be added to the non-reducing terminal. The non-reducing end and the reducing end may be any of a galactose residue and an N-acetylglucosamine residue. These are all referred to in this specification.
  • N-acetylsacyl oligosaccharide That is, the oligosaccharides represented by the following general formulas (1) to (6) are all included in the “N-acetylsacyllactam oligosaccharide” of the present specification. (GlcNAc-Gal) n (1)
  • Gal is a galactose residue
  • Glc is an N-acetylglucosamine residue
  • SA is a sialic acid residue,-is a glycosidic bond
  • n is an integer from 1 to 6
  • m Represents an integer from 1 to ⁇
  • sulfated N-acetyl lactosamino oligosaccharide refers to an N-acetyl lactosamino oligosaccharide having a sulfate group.
  • sulfated oligosaccharide means an oligosaccharide having a sulfate group.
  • “to adjust the sulfate group content” means to increase (ie, to sulfate) or to decrease (ie, partially desulfurize) the sulfate group content so as to obtain a desired sulfate group content. Oxidizing) and without increasing or decreasing the sulphate content, but also at the desired sulphate content, without altering the sulphate content.
  • partial desulfation means partial removal of a sulfate group, and differs from “complete desulfation” in that a part of the sulfate group remains.
  • complete desulfation means removing substantially all of the sulfate groups, and is different from partially removing the sulfate groups.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the time for partial desulfation of keratan sulfate by the methanol / hydrochloric acid method and the production rate of sulfated N-acetyllactosamine oligosaccharide of 6 to 12 saccharides.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the temperature of the partial desulfation of keratan sulfate by the DMSO method and the rate of production of sulfated N-acetyl lactosamino oligosaccharides of 6 to 12 sugars.
  • Figure 3 shows keratan sulfate partially desulfated by the DMS ⁇ method at various temperatures.
  • Fig. 3 shows an elution curve obtained by subjecting a product obtained by the action of endo / 9-galactosidase or kerata 11- 11 derived from Escherichia freundi i to gel filtration.
  • a sulfated N-acetyllactosamine oligosaccharide is obtained by adjusting the sulfate group content of keratan sulfate, and allowing the keratan sulfate degrading enzyme to act on the keratan sulfate having the adjusted sulfate group content.
  • This is a method for producing N-acetylsilactosamin oligosaccharide, which comprises a step of completely desulfating sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide.
  • the method 2 of the present invention comprises adjusting the sulfate group content of keratan sulfate, and adjusting the sulfate specificity of the keratan sulfate to three types of keratan sulfate degrading enzymes having different substrate specificities depending on the presence or absence of a sulfate group.
  • a method for producing a sulfated N-acetyllactosamine oligosaccharide comprising at least a step of acting one or more enzymes belonging to a group of enzymes.
  • Keratan sulfate used in the method of the present invention
  • Keratan sulfate has a repeating disaccharide (N-acetyllactosamine; LacNAc) in which a galactose residue (Gai) and an N-acetylglucosamine residue (GlcNAc) are glycosidically bonded. It is a glycosaminoglycan having 1 to 2 mol of sulfate groups per mol of the disaccharide.
  • the sulfate group content of keratan sulfate varies depending on the animal species and organs, it is usually produced from raw materials such as cartilage fish such as sharks, cartilage of mammals such as whales and red sea lions, bone and cornea.
  • the keratan sulfate used in the method of the present invention is not particularly limited, as long as it is generally available.
  • the highly sulfated keratan sulfate (constituting disaccharide) in which a galactose residue which is a carbohydrate constituting sugar is sulfated is not particularly limited.
  • Highly sulfated keratan sulfate containing 1.5 to 2 moles of sulfate groups per mole is sometimes referred to as keratan polysulfate.
  • the galactose remaining The position of the sulfate group in the group is preferably the 6-position.
  • Such highly sulfated keratan sulfate can be obtained, for example, from cartilage proteoglycans of cartilaginous fish such as sharks. Commercially available ones can also be used.
  • the term “keratan sulfate” also includes highly sulfated keratan sulfate / keratan polysulfate unless otherwise specified.
  • Methods for adjusting the sulfate group content of keratan sulfate include sulfation to a desired sulfate group content, partial desulfation, and desired sulfate group content without increasing or decreasing the sulfate group content. If it is, it also includes not changing the sulfate group content. Which sulfate group content adjustment method is selected depends on the sulfate group content of keratan sulfate used in the method of the present invention, the type of keratan sulfate degrading enzyme used in the method of the present invention, and the size of the target oligosaccharide. Thus, those skilled in the art can appropriately select.
  • the sulfate group content is adjusted so that an oligosaccharide of a target molecular size can be obtained by the action of keratan sulfate degrading enzyme. More specifically, the average is 0.3 per mol of the constituent disaccharide. Adjust to the extent that ⁇ 1.5 moles of sulfate groups are present.
  • the ratio of 1 1 or (2) described below is used as the keratan sulfate degrading enzyme. It is preferable to use keratan sulfate whose sulfate group content is adjusted to the extent that up to 1.5 mol of sulfate groups are present.
  • an enzyme belonging to the enzyme group (2) or (3) described below is used as the keratan sulfate-decomposing enzyme, the amount of the sulfate group in the range of 0.3 to 0.8 mol per mol of the constituent disaccharide is considered. It is preferable to use keratan sulfate whose sulfate group content is adjusted.
  • the partial desulfation can be carried out by a known desulfation method for glycosaminoglycin, the temperature during the desulfation reaction, the time for the desulfation reaction, and the amount of the desulfating agent so that substantially all of the sulfate groups are not removed. It is necessary to set reaction conditions such as concentration. That is, the temperature during the desulfation reaction, the time for the desulfation reaction, the concentration of the desulfating agent, etc. are set lower than the reaction conditions under which substantially all of the sulfate groups are removed.
  • reaction conditions are: --Keratan sulfate used, type of keratan sulfate degrading enzyme used for cleavage of glycoside bond of keratan sulfate with adjusted sulfate group content, molecular size of target N-acetylacetylsamin oligosaccharide (molecular weight, number of sugar chains) Those skilled in the art can appropriately set the values according to the above.
  • Known methods for desulfating glycosaminoglycin include, for example, acid hydrolysis, alkali decomposition, and heating in an organic solvent (Method in Carbohydrate Chemist II, vol. VI II, p281-). 289, 1980). That is, acids, alkalis, organic solvents and the like can be used as desulfating agents.
  • an inorganic acid, an organic acid, a strongly acidic cation exchange resin, particularly a sulfonic acid resin or the like can be used as an acid, and water, methanol, or the like can be used as a reaction solvent. it can.
  • an anhydrous methanol solution containing acetyl chloride it is preferable to use an anhydrous methanol solution containing acetyl chloride.
  • a non-protonic solvent such as dimethyl sulfoxide (DMS 0; N, N-dimethylformamide (DMF), pyridine) can be used as the organic solvent.
  • DMS 0 dimethyl sulfoxide
  • DMF N-dimethylformamide
  • pyridine a non-protonic solvent
  • a method of heating pyridinum keratan sulfate in water or a DMSO solution containing 5 to 10% methanol at a temperature in the range of 20 to 100 ° C is widely used (Shinsei Kagaku Kenkyusho 3, Carbohydrate II, (Tokyo Kagaku Dojin, p325-326, 1989), and it is preferable to use this method also in the method of the present invention.
  • a desulfation method using a silylating agent can also be used.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-230900 discloses that an organic base salt of a sulfated saccharide is reacted with N.0-bis (trimethylsilyl) acetamide in the presence of the organic base. Accordingly, a method for producing a desulfated saccharide characterized by selectively desulfating a sulfate group bonded to a primary hydroxyl group of a sulfated saccharide has been disclosed. it can.
  • Organic base salts of keratan sulfate include aromatic amines such as pyridine, dimethylaniline and getylaniline; trimethylamine, triethylamine, tributylamine, ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine, trioctylamine,. ⁇ .
  • trimethylsilylation reagents N, 0bis (trimethylsilyl) acetamide (BTSA), N, 0bis (trimethylsilyl) trifluorase amide (BTSFA), N, 0 bis (trimethylsilinole) difluoroacetamide, N, 0 bis (trimethylsilyl.) Monofluoroacetamide, etc. are added, and the reaction is allowed to proceed at room temperature to 100 ° C to achieve desulfation. It can be carried out.
  • a process for producing a desulfated sugar which comprises subjecting to a desulfation reaction in the presence of a silylated ⁇ ⁇ ⁇ represented by the formula: This method can also be used. Also in this method, it is preferable to react the silylated ⁇ ⁇ ⁇ represented by the above general formula (A) with the organic base salt of the sulfated saccharide, and as the organic base salt, the above-mentioned JP-A-5-230900 is used. The same organic base salts as those described in the gazette can be used.
  • (R Si O is, for example, trimethylsilyloxy, triethylsilyloxy, dimethylisopropyl virsilyloxy, isopropyldimethylsilyloxy, methyl-dibutylbutylsilyloxy, t-butyldimethylsilyloxy
  • Examples of the silylating agent represented by the above general formula (A) include 2-trimethyl butyl diphenylxylsilyloxy, triisopropylsilyloxy, etc. Desulfation can be performed by reacting at a reaction temperature between room temperature and 100 ° C.
  • R 1 is the same or different and represents a hydrogen atom or a halogen atom
  • R 2 represents a lower alkyl group
  • R 3 represents the same or different and represents a lower alkyl group, an aryl group or a halogen atom.
  • R 1 in the above formula (B) is the same or different and represents a hydrogen atom or a halogen atom such as fluorine
  • R 2 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl. , Tert-butyl, pentyl, isopentyl, hexyl and the like, and represents a lower alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 3 is the same or different, and is the same as the above, such as a lower alkyl group, an aryl group such as phenyl, chlorine, fluorine, etc.
  • (R 3 ) 3 Si in the above general formula (B) includes trimethylsilyl, triethylsilyl, dimethylisopropylsilyl, isopropyldimethylsilyl, methyldi-tert-butylsilyl, t-butyldimethylsilyl, t-butyldiphenylsilyl, triisobromide
  • a bilsilyl group is exemplified.
  • the most preferred silylating agent represented by the above general formula (B) is N-methyl-N-trimethylsilyl acetate (MTMSA) or N-methyl-N-trimethylsilyl trifluoroacetate.
  • MTSTFA 1 can be used. Desulfation can be performed by reacting at room temperature to 100. Further, an enzyme having an action of desulfating keratan sulfate may be used. These glycosaminoglycans may be used. By appropriately setting the reaction conditions in the known desulfation method described in (2), keratan sulfate having an appropriately reduced number of sulfate groups can be obtained.
  • Sulfation can be performed by a known sulfation method for glycosaminoglycin, and is not particularly limited. Examples thereof include a method described in JP-A-61-47071. Is mentioned. As described above, since keratan sulfate generally has a large sulfate group content, adjustment of the sulfate group content of keratan sulfate is most often performed by partial desulfation. However, if keratan sulfate having an extremely low sulfate group content is available and can be used, the sulfate group content can be adjusted by sulfation.
  • the sulfate group content is adjusted by sulfation, it is preferable that only the sixth position of the galactose residue and / or the N-acetyl dalcosamine residue be sulfated. It is preferable to select a specific sulfation method.
  • galactose residues of keratan sulfate and / or N-acetylglucosa An enzyme (sulfotransferase) that specifically transfers a sulfate group to position 6 of the min residue may be used.
  • the sulfate group content of keratan sulfate or the sulfate group whose sulfate group content has been adjusted can be quantified by a known method, and can be evaluated based on, for example, the results obtained by the action of keratan sulfate degrading enzyme. .
  • the evaluation may be based on the number of moles of the sulfuric acid group per mole of the constituent disaccharide.
  • the number of moles of sulfate groups per mole of the constituent disaccharide can be determined by determining the number of sugar residues by quantifying galactose-N-acetylglucosamine by an anceron method and amino sugar analysis.
  • the sulfate group content can be determined by ion chromatography analysis of the hydrochloric acid decomposed product, and the content can be determined by calculating from these values. If the sulfate group content of the keratan sulfate as the raw material is the desired sulfate group content, it is not necessary to actively adjust the sulfate group content (that is, sulfation or partial desulfation), and the present invention is directly used. Can be used.
  • keratan sulfate generally has a large sulfate group content, and it is preferable to use highly sulfated keratan sulfate / keratan polysulfate as a raw material. “Adjustment of the sulfate group content” is often and preferably performed by partial desulfation. Further, it is preferable to select a keratan sulfate degrading enzyme (to be described later) to be used accordingly.
  • the keratan sulfate degrading enzyme that can be used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it has an action of cleaving the glycosidic bond of keratan sulfate, and may be any of the following enzyme groups (1) to (3). It is preferable to use one or more enzymes belonging to the group.
  • Enzymes (1) Enzymes having the following action and substrate specificity
  • the enzyme group (1) is preferably endo-galactosidase.
  • Enzymes included in the enzyme group (1) include, for example, an ent / 3 / 3-galactosidase derived from Escherichia freundii (H. Nakagawa, T. Yamada, J L. Chien, A. Gardas) , M. Kitamikado, S C. Li, Y-i. Li, J. Biol. Chem., 255, 5955 (1980); in this specification, it may be simply referred to as “GalaseJ”. .
  • Enzymes (2) Enzymes with the following action and substrate specificity
  • the galactose residue involved in the galactose residue has a sulfate group at position 6 and does not act on the —galactoside bond.
  • Enzyme group (2) is preferably endo; S-galactosidase.
  • Enzymes included in the enzyme group (2) include, for example, Endo-S—galactosidase derived from Pseudomonas sp. IFO-13309 (K. Nakazawa, N. Suzuki, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 250, 905 (1975); K. Nakazawa, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 250, 912 (1975); and Japanese Patent Publication No. 57-4121336 Endos produced by Pseudomonas reptilivora — yS —galactosidase (these are sometimes referred to simply as “Kerata eleven” or “KSase”) ) Is preferred.
  • Endo-S galactosidase derived from Pseudomonas sp. IFO-13309
  • Enzymes (3) Enzymes having the following action and substrate specificity (a) Action:
  • N-Acetylglucosamine Residue involved in N-acetylglucosamine bond has a sulfate group at the 6-position and is adjacent to the non-reducing terminal side of the N-acetylglucosamine residue It does not have a sulfate group at position 6 of the galactose residue and acts on the 3-N-acetyldarcosamide bond.
  • Enzyme group (3) is preferably L / 3-N-acetylglucosaminidase.
  • the enzymes included in the enzyme group (3) include, for example, those derived from Bacillus sp. Ks36 (Bacillus Ks36) (Shinichi Hashimoto, Kiyoshi Morikawa, Hiroshi Kikuchi, Keiichi Yoshida, Kiyochika Tokuyasu, Biochemistry, 60 , 935 (1988); herein, it may be simply referred to as “keratanase II” or “KSaseI I”), or derived from Bacillus circulans KsT202 (Bacillus circulans KsT202) (WO96). / Described in US Pat. No.
  • Enzymes (1) and (2) are both endo-yS-galactosidase enzymes, and their substrate specificities differ depending on the sulfate groups present in the sugar chains.
  • the enzyme group (3) is an end- ⁇ g-N-acetylglucosaminidase type enzyme.
  • the reducing end of the oligosaccharide obtained by enzymatic digestion is a galactose residue (Gal) when an endo-galactosidase type enzyme is used, and the endo- / 3-N-acetyl When a glucosaminidase type enzyme is used, it is an N-acetyl glucosamine residue (GicNAc).
  • Gal indicates a galactose residue
  • GlcNAc indicates an N-acetylglucosamine residue
  • (6S) indicates that the hydroxyl group at position 6 is sulfated.- and-indicate a glycosidic bond.
  • Keratan sulfate derived from cartilage has a high content of disulfated N-acetyl lactosamine (LacNAc-diS) residues, and particularly high content of shark-derived keratan sulfate. Therefore, for such keratan sulfate, the enzymes of the enzyme groups (1) and (2) (E-Galase and KSase, for example) hardly act, but on the contrary, they are almost completely degraded by enzymes of the enzyme group (3) (for example, KSase II), and are easily converted into disaccharides and tetrasaccharides.
  • the enzymes of the enzyme groups (1) and (2) E-Galase and KSase, for example
  • enzymes of the enzyme group (3) for example, KSase II
  • the molecular size of the N-acetyllactosamine oligosaccharide finally obtained by the method of the present invention can be controlled by a combination of the above substrate specificity of the enzyme and the degree of partial desulfation of keratan sulfate. That is, depending on the specificity of the enzyme used, the molecular size can be reduced by adjusting the degree of partial sulfation to increase the action of the enzyme. Conversely, adjusting the degree of partial sulfation to reduce the action of the enzyme increases the molecular size.
  • the keratan sulfate having a sulfate group-containing IS adjusted and one or more enzymes belonging to any of the above enzyme groups (1) to (3) are allowed to coexist, If a large amount of the enzyme is to be treated, an immobilized enzyme in which the enzyme is bound to an appropriate solid-phase bead, etc., or an ultrafiltration membrane, a dialysis membrane, etc. It is preferable to make the enzyme act continuously using a reactor or the like.
  • sulfated N-acetylacetylsamin oligosaccharide having a desired molecular size can be obtained.
  • the sulfated N-acetylsuctosaminooligosaccharide produced by the enzyme treatment be fractionated according to the molecular size of the oligosaccharide.
  • the method of fractionation according to the molecular size is not particularly limited, and examples thereof include gel filtration chromatography using various gel filtration carriers and a fractionation method using an organic solvent.
  • the gel filtration carrier is not particularly limited as long as it is a carrier made for the purpose of a molecular sieve, and examples thereof include crosslinked acrylamide, dextran, agarose, and crosslinked particles of a polysaccharide such as cellulose.
  • a carrier having a degree of cross-linking suitable for each oligosaccharide can be appropriately selected according to the molecular size of the target oligosaccharide.
  • oligosaccharides up to about 8 octasaccharides can be separated according to the molecular size of each oligosaccharide, but the separation ability of oligosaccharides longer than that It decreases as the size increases. In this case, it is fractionated as a mixture of oligosaccharides of several molecular sizes.
  • the oligosaccharide mixture may be fractionated in advance by anion exchange resin according to the sulfate group density, whereby the separation ability by gel filtration chromatography can be improved.
  • anion exchange resin generally, when the density of sulfate groups is the same, the larger molecular size is strongly adsorbed on the anion exchange resin. Therefore, mutual separation is possible.
  • the sugar chain skeleton of the sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide thus obtained is represented by the following general formulas (1) to (6).
  • the following general formulas (1) and (2) belong to the enzyme groups (1) and Z or the enzyme group (2) in keratan sulfate having a sulfate group content adjusted in the method of the present invention. It is a backbone of sulfated N-acetyllactosamine oligosaccharide that can be obtained by the action of an enzyme.
  • the following general formulas (3) and (4) represent sulfated N-acetyl lactides obtainable when an enzyme belonging to the enzyme group (3) is allowed to act on keratan sulfate having an adjusted sulfate group content in the method of the present invention. It is the skeleton of tosamino glycol.
  • the following general formulas (5) and (6) represent the enzymes belonging to the enzyme group (1) and / or (2) in the keratan sulfate whose sulfate group content has been adjusted in the method of the present invention, and the enzyme group (3 ) Is a skeleton of sulfated N-acetyllactosamine oligosaccharide which can be obtained when both enzymes are acted on.
  • Gai is a galactose residue
  • GlcNAc is an N-acetylglucosamine residue
  • SA is a sialic acid residue,-is a glycosidic bond
  • n is an integer of 1 to 6
  • ⁇ is Represents an integer from 1 to 10)
  • keratanase II which is an enzyme belonging to the enzyme group (3) is allowed to act on keratan sulfate having an adjusted sulfate group content, for example, a sulfate having a skeleton represented by the following formula: ⁇ -Acetyl lactosamin oligosaccharide is obtained.
  • the sulfated N-acetyllactosamine oligosaccharide having the skeleton represented by the above formulas (7) to (14) is used only for the sulfated N-acetyllactosamine oligosaccharide having the skeleton represented by the general formulas (3) and (4). — It is only a specific example of acetyl lactosamine oligosaccharide and is not limited thereto.
  • N-acetyl lactosamino oligosaccharide having a skeleton represented by any of the above general formulas (1;) to (6) by a method described below an N-acetyl laclac represented by the following general formula is obtained.
  • Tosamine oligosaccharides can be obtained.
  • GlciMAc N-acetylglycosamine residue
  • SA sialic acid residue
  • n is an integer of 1 to 6
  • m Represents an integer of 1 to 10, respectively.
  • a sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide having a skeleton represented by the above formulas (7) to (14) is completely desulfated by a method described below, and is then represented by the following formula. Can be obtained.
  • Gal-GlcNAc-Gal-Glc Ac-Gal GlcNAc (15) Gal Glc Ac-Gal -GlcNAc Gal-GlcNAc-Gal -GlcNAc (16) Gal-GlcNAc Gal ⁇ GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal -GlcNAc ( 17) Gal GlcNAc Ga GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gai GlcNAc Gal -GlcNAc (18) SA-Gal Glc Ac-GaJ -GlcNAc Gal-GlcNAc (19) SA Gal-GlcNAc-Gal-Gl cNAc -Gal Gl cNAc -Gal -GlcNAc (20) SA-Gal -GlcNAc -Gal GlcNAc Gal-GlcNAc Gal-Gl
  • N-acetyl lactosamin oligosaccharides represented by the above formulas (15) to (22) are only sulfated N-acetyl lactates having a skeleton represented by the above general formulas (3) and (4). This is only a specific example of the N-acetyl lactosamine oligosaccharide obtained from the samin oligosaccharide, but is not limited thereto.
  • n is an integer of 1 to 6, and a long-chain N-acetyl lactosamine oligosaccharide, for example, an n-type integer of 3 to 6 is preferable, and n is 5 to 6. Those which are integers of 6 are particularly preferred.
  • m is an integer of 1 to 10 and a long-chain N-acetyllactosamine oligosaccharide, for example, m is preferably an integer of 3 to 10; Those which are integers of 5 to 10 are particularly preferred.
  • a preferred sialic acid residue (SA) is N-acetylneuraminic acid residue ⁇ (NeuAc).
  • the glycosidic bond between the sialic acid residue (SA) and the galactose residue (Gal) adjacent to the reducing end of the sialic acid residue (SA) is a 1,2,3 glycosidic bond. Or, it is preferably a 1,2,6-glycosidic bond.
  • glycosidic bond between the galactose residue (Gal) and the N-acetylacetylglucosamine residue (GicNAc) adjacent to the reducing end of the galactose residue (Gal) is represented by the following formula: , 4 glycosidic bonds are preferred.
  • the glycosidic bond between the N-acetylglycosamine residue (GlcNAc) and the galactose residue (Gai) adjacent to the reducing end side of the N-acetylglycosamine residue (GlcNAc) is , 3-1, 3 glycosidic bonds are preferred.
  • the N-acetyl-lactosamine oligosaccharide having a sialic acid residue and the sulfated N-acetyl-lactosamine oligosaccharide have a sialic acid residue.
  • the desulfation conditions described above that is, the conditions for complete desulfation while retaining sialic acid residues
  • the invention also includes an invention relating to a method for completely desulfating an acetylsilactamsine oligosaccharide while retaining a sialic acid residue.
  • the method for completely desulfating a sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide includes, for example, acid hydrolysis, hydrolysis, and heating in an organic solvent in the same manner as the aforementioned partial desulfation of keratan sulfate.
  • Examples thereof include a method using a silylating agent and a method using an enzyme, but the reaction conditions are different from those for partial desulfation.
  • the dimethylsulfoxide method as a desulfating method using an organic solvent, the methanolic hydrochloric acid method as a desulfating method by acid hydrolysis, and the trisulfating method as a desulfating method using a silylating agent are described below. The method for complete desulfation is described in more detail below.
  • Sulfated N-acetyllactosamine Oligosaccharide is dissolved in water and passed through a strong thione-exchange resin (H-type) to remove free sulfate groups, and then neutralized with pyridine to give sulfated N-acetyllactide. It is a pyridinium salt of tosamine oligosaccharide.
  • Hydrogen chloride gas is passed through a dry solvent from which water has been sufficiently removed to form a methanol-hydrochloric acid solution.
  • the solution is diluted with dry methanol and adjusted to 0.01 to 1N, preferably to 0.1N.
  • Complete desulfation can be achieved by dispersing well-dried sulfated N-acetyllactosaminooligosaccharide in methanolic hydrochloric acid solution and stirring for 0.5 to 50 hours at 4 to 30 hours, preferably for 15 hours at room temperature. it can.
  • N-acetyl lactosamine oligosaccharide is dissolved in a pyridine solution, and BTSA is added at a 5- to 16-fold molar amount, preferably 10-fold molar amount, based on the sulfate group, and the BTSA is added at a concentration of 0.5 to 90 at 40 to 90 ° C.
  • Complete desulfation can be achieved by reacting for 3 hours, preferably for 1 hour at 80 ° C.
  • the desulfation rate by this method has been confirmed by the inventors to be arbitrarily adjustable by changing the temperature and the treatment time.
  • the method of complete desulfation is not limited to these.
  • N-acetyl lactosamino oligosaccharide By completely desulfating the sulfated N-acetyl lactosamino oligosaccharide, N-acetyl lactosamino oligosaccharide can be obtained.
  • N-acetyl lactosamine oligosaccharide For the fractionation of N-acetyl lactosamine oligosaccharide, the same method for separation and purification of sugar chains can be used as in the above-described method for sulphated N-acetyl lactosamine oligosaccharide.
  • adsorption chromatography, anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, gel permeation chromatography, filter paper electrophoresis, filter paper chromatography, fractionation with organic solvents, or combinations thereof It can be performed by operation, but is not limited to these.
  • the method for separating N-acetylsyllactosamine oligosaccharide having a sialic acid residue (sialyl N-acetylsyllactosamine oligosaccharide) from N-acetylsyllactosamine oligosaccharide is not particularly limited, either.
  • ion-exchange chromatography This can be done by photography.
  • the method of mutual separation of N-acetylsyllactosamine oligosaccharides having different molecular sizes is not particularly limited, but, for example, a methanol concentration of 0 to 20% is determined by chromatography using a reversed-phase column. It can be separated by raising it.
  • the oligosaccharide of the present invention N-acetyl lactosamine oligosaccharide
  • the oligosaccharide of the present invention will be described later.
  • the method of the present invention preferably comprises adjusting the sulfate group content of keratan sulfate, and converting the keratan sulfate having the adjusted sulfate group content to one of the above enzyme groups (1) to (3) or
  • the method includes a step of obtaining a sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide by treatment with two or more enzymes (step 1), and a step of completely desulfating the sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide (step 2).
  • Step 1 preferably includes a step of fractionating sulfated N-acetylsyllactosaminooligosaccharide
  • step 2 preferably includes a step of fractionating N-acetylsyllactosaminooligosaccharide.
  • the method includes a step of fractionating acetyl lactosamine oligosaccharide
  • step 1 includes a step of fractionating sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide
  • step 2 includes N-acetyl lactosamine oligosaccharide. It is particularly preferable to include a step of fractionating
  • the conditions for partial desulfation or sulfation of keranic sulfate are conditions in which an enzyme capable of cleaving the glycosidic bond of keratan sulfate does not lose its activity.
  • the partial desulfation or sulfation of keratan sulfate and the decomposition of keratan sulfate having an adjusted sulfate group content may be performed simultaneously (for example, in the same reactor).
  • keratan sulfate which can be usually obtained is partially desulfated in advance, so that the above-mentioned enzyme does not act on keratan sulfate as it is.
  • an oligosaccharide having a target molecular size can be obtained more efficiently.
  • the non-reducing terminal sugar of the N-acetyl lactosamin oligosaccharide represented by the general formulas (1;) to (6) produced by the method of the present invention is added to the N-acetyl lactosamin oligosaccharide.
  • an N-acetylsacralactosin oligosaccharide having a reduced number of sugar residues by one can be obtained. Specific examples are shown below.
  • N_acetyl lactosaminooligosaccharides of the following general formulas (23) to (24) can be obtained.
  • N-acetyl-lactosamine oligosaccharides of the following general formulas (25) to (26) can be obtained.
  • Gal represents a galactose residue
  • GlcNAc represents an N-acetylglycosamine residue
  • ⁇ represents an integer of 2 to 6, respectively.
  • N-acetyl neuraminidase for example, N-acetyl lactosamine oligosaccharide from which sialic acid has been removed can be obtained.
  • the oligosaccharide of the present invention is an oligosaccharide obtained by the following method and having the following physicochemical properties.
  • the sulfate group content of keratan sulfate is adjusted, and an enzyme having a function of cleaving the glycosidic bond of keratan sulfate is caused to act on the keratan sulfate having the adjusted sulfate group content to obtain a product, and then the product is completely desulfated.
  • a method comprising:
  • the galactose residue content measured by the anthrone method is 35 to 50% by weight.
  • the molecular weight measured by mass spectrometry is 1000 to 220. Adjustment of the sulfate group content is preferably performed by partial desulfation.
  • the above method preferably includes at least the following steps 1 and 2.
  • Step 1 The sulfate group content of keratan sulfate is adjusted, and one or more enzymes belonging to any of the following enzyme groups (1) to (3) are produced from the keratan sulfate having the adjusted sulfate group content. To obtain a sulfated oligosaccharide.
  • Enzymes (1) Enzymes having the following action and substrate specificity
  • Enzymes (2) Enzymes with the following action and substrate specificity
  • Enzymes (3) Enzymes having the following action and substrate specificity
  • a sulfate group at the 6-position of the N-acetylglycosamine residue involved in N-acetylglycosaminide binding, and a galactose adjacent to the non-reducing terminal side of the N-acetylglycosamine residue It does not have a sulfate group at position 6 of one residue and acts on the / 3-N-acetylglucosaminide bond.
  • 3-galactose residue adjacent to the 6th position of the N-acetylglycosamine residue involved in N-acetylacetylglucosaminide binding and the non-reducing terminal side of the N-acetylglucosamine residue Does not have a sulfate group at either of the 6-positions, does not act on the /? — N-acetylglucosaminide bond.
  • Step 2 A step of completely desulfating a sulfated oligosaccharide.
  • the enzyme contained in the enzyme group (1) is preferably an endo-galactosidase, for example, an endo-galactosidase derived from Escherichia freundii (scheridii ⁇ freundii). Nakaga a, T. Yatnada, J-shi Chien, A. Gardas, M. Kitamikado, S-C. Li, Y T. Li, J. Biol. Chem., 255, 5955 (1980); , Or simply “E-Galase”).
  • endo-; 9-galactosidase is preferable, and for example, an end derived from Pseudomonas sp-IFO-13309 strain — S-galactosidase ( K. Nakazawa, N. Suzuki, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 250, 905 (1975), K. Nakazawa, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 250, 912 (1975)) Japanese Patent Publication No. 57-4121236 discloses an endo- / 3-galactosidase produced by Pseudmonas reptilivora (these are referred to simply as "keratana And “KSase”), and are preferred.
  • the enzyme included in the enzyme group (3) is preferably endo-N-acetylglycosaminidase, for example, an endo-N-acetylglucosaminidase derived from Bacillus sp. S36. Ichize [Shinichi Hashimoto, Kiyoshi Morikawa, Hiroshi Kikuchi, Keiichi Yoshida, Kiyochika Tokuyasu, Biochemistry, 60, 935 (1988); In the present specification, only “Kerayuna II” or “KSaseII” And Bacillus sa —Endo / 9—N-acetyl-D-cosaminidase derived from Bacillus circulans KsT202 (described in WO 96/16166), and the like, are preferred.
  • the oligosaccharide of the present invention more preferably has a sialic acid content of 10 to 20% by weight as measured by the thiobarbituric acid method in addition to the above-mentioned physicochemical properties. Further, the present invention provides a novel N-acetyl lactosamine oligosaccharide represented by any one of the following general formulas (1) to (6).
  • Ga] is a galactose residue
  • G] cNAc is an N-acetylglucosamine residue
  • SA is a sialic acid residue
  • n is an integer of 1 to 6.
  • m represents an integer of 1 to 10.
  • ⁇ is not 1.
  • the method for producing the oligosaccharide of the present invention is not particularly limited as long as the oligosaccharide of the present invention can be obtained, but is preferably obtained by the method of the present invention.
  • the method of the present invention has been described above.
  • oligosaccharide of the present invention is produced by the method of the present invention, for example,!;
  • a galactosidase type enzyme for example, an enzyme belonging to enzyme group (1) or (2) may be used.
  • an enzyme of the end-3-N-acetylglucosaminidase type for example, belonging to the enzyme group (3) in the method of the present invention. Enzyme).
  • an endo-type; S-galactosidase type enzyme for example, enzyme group (1) or ( Enzyme belonging to 2)
  • endo-1 / 3-N-acetylglucosaminida enzymes of the enzyme type (for example, enzymes belonging to the enzyme group (3)) may be used.
  • the sialic acid residue may be an N-acetyl neuraminic acid residue or an N-glycolyl neuraminic acid residue.
  • N-acetyl neuraminic acid residue NeAc
  • n is an integer of 1 to 6 (however, in the above formulas (1) and (3), n is not 1), but a long-chain N-acetyl lactosamino oligo is used.
  • Sugars for example, those having an integer of 3 to 6 are preferred, and those having an integer of 5 to 6 are particularly preferred.
  • ⁇ is an integer of 1 to 10; however, an N-acetylacetylsamin oligosaccharide having a chain length, for example, m is preferably an integer of 3 to 10 is preferable. Those in which m is an integer of 5 to 10 are particularly preferred.
  • the glycosidic bond between the sialic acid residue (SA) and the galactose residue (Gai) adjacent to the reducing end of the sialic acid residue (SA) is an ⁇ -2,3 glycosidic bond or It is preferably an a-2, 6 glycosidic bond.
  • the glycosidic bond between the galactose residue (Gal) and the N-acetylglucosamine residue (GlcNAc) adjacent to the reducing end of the galactose residue (Gal) is represented by / 3 — It is preferably a 1,4-glycosidic bond.
  • glycosidic bond between the N-acetylglucosamine residue (GlcNAc) and the galactose residue (Gal) adjacent to the reducing end of the N-acetylglucosamine residue (GicNAc) is ⁇ -1 , 3 glycosidic bonds are preferred.
  • the conditions for complete desulfation of sulfated ⁇ -acetylacetyltosamino-oligosaccharide having a sialic acid residue have been reported. This is the first condition found by the present inventors.
  • the acetylacetyllactosamine oligosaccharide having a sialic acid residue are particularly preferable.
  • the analysis of the sugar composition of the oligosaccharide of the present invention is carried out by a method usually used in the field of sugar chain engineering, for example, an anthrone method (quantification of galactose residues), an amino sugar analysis (p-acetylglycol). Quantification of cosamine residues) and thiobarbituric acid method (TBA method; quantification of sialic acid residues) are not limited to these. Further, the sulfate group content is not limited to this method, which can be analyzed by decomposing the oligosaccharide of the present invention with hydrochloric acid and analyzing it by ion chromatography.
  • the method for analyzing the molecular size of the oligosaccharide of the present invention is not particularly limited, but it can be determined by, for example, gel filtration chromatography or analyzing the oligosaccharide after E-Galase treatment.
  • the sugar chain sequence of the oligosaccharide of the present invention can be examined by, for example, a sequential decomposition method using glycosidase.
  • the oligosaccharide of the present invention can be identified.
  • the oligosaccharide of the present invention obtained by the method of the present invention can be used for confirmation.
  • a sialic acid residue, a fucose residue, a sulfate group, a ceramide, and the like can be appropriately added to the oligosaccharide of the present invention.
  • the addition of these substances is preferably carried out by using an enzyme which can also be carried out by a chemical method.
  • the fucose residue when adding a fucose residue to the oligosaccharide of the present invention, the fucose residue may be transferred to the oligosaccharide of the present invention using fucosyltransferase.
  • the fucose residue is preferably bound to the N-acetylglycosamine residue, and more preferably to the N-acetylglucosamine residue via a 1,3 glycoside bond. Therefore, it is preferable to use fucosyltransferase having such an action.
  • the sialic acid residue is added to the oligosaccharide of the present invention represented by the above formula (1), (3), (5) or (6)
  • the sialic acid residue is added to the oligosaccharide of the present invention using sialyltransferase. Should be transferred.
  • the sialic acid residue be bound to the galactose residue, and more preferably that the non-reducing terminal galactose residue be bound by a ⁇ -2,3 glycosidic bond or an ⁇ -2,6 glycosidic bond.
  • it is attached to a residue. Therefore, it is preferable to use a sialyltransferase having such an action.
  • the sulfate group when added to the oligosaccharide of the present invention, the sulfate group may be transferred to the oligosaccharide of the present invention by using sulfotransferase.
  • Sulfotransferases include chondroitin 6-sulfotransferase (Biol. Chem., 268 (29), 21968 21974, 1993).
  • These enzymes can be appropriately selected and used according to the target oligosaccharide, may be used alone, may act on a plurality of enzymes simultaneously, or may act on a plurality of enzymes sequentially. You may. Example
  • Keratan sulfate (hereinafter also referred to as K S) was prepared from shark cartilage according to the literature (Biochemistry, 33, 746-752, 1961). The number of moles of sulfate groups per mole of the constituent disaccharide was 1.7.
  • FIG. 1 shows the relationship between the time for partial desulfation of KS by the methanol-hydrochloric acid method and the production rate of sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide of 6 to 12 saccharides.
  • the production rate of sulfated N-acetylsyllactosamine oligosaccharide of 6 to 12 sugars was calculated based on the elution curve of sulfated N-acetyllactosamine oligosaccharide obtained by gel filtration and the total area of the figure surrounded by the time axis. It was calculated as the ratio of the area occupied by the fraction corresponding to the sulfated N-acetyllactosamine oligosaccharide of 212 sugar.
  • sulfation of 6- to 12-saccharides without partial desulfation of KS was obtained for N-acetyllactosaminooligosaccharides.
  • the production rate was about 10%.
  • partial desulfation of KS by the methanol / hydrochloric acid method was performed within 40 hours at 4, the yield of sulfated 6- to 12-saccharide N-acetylacetyltosaminooligosaccharides was about 2 to 4 Doubled.
  • the production rate is about 30% or more, and when the partial desulfation time is 5 to 10 hours, the production rate is Reached about 40%. From this, when enzymatic digestion of KS with 1 U of KSase II at 37 ° C for 12 hours to obtain sulfated N-acetyl lactosamino oligosaccharide of 6 to 12 saccharides, KS is converted to 4 ° C by the methanol-hydrochloric acid method.
  • the time for partial desulfation in C is preferably 40 hours or less (excluding 0 hours), more preferably 2.5 to 20 hours, and particularly preferably 5 to 10 hours. Will be understood.
  • the freeze-dried product 800 mg of KS Pirijiniumu salt was dissolved in 80 ml of 90% DMSO (10% H 2 0), divided into 20 ml Dzu' 4 fractions, respectively 40, 50, 60, 70 or 80 ° C For 3 hours, and the reaction was stopped by adding an equal volume of water. After dialysis of each reaction solution in running water overnight, the solution was concentrated to 4 ml, divided into two equal portions of 2 ml each, and 250 mM acetate buffer (pH 6) containing 10 mM calcium acetate was added to one side. 0.5 ml each of 100 mM acetate buffer (pH 6.5) was added to the mixture.
  • the former was Escherichia freundii end- ⁇ -galactosidase (E-Galase, manufactured by Seikagaku Corporation; 1 unit (II) was pH 5.8).
  • E-Galase Escherichia freundii end- ⁇ -galactosidase
  • 1 unit (II) was pH 5.8.
  • the latter in the KSase II respectively added 1 Yuni' bets, at 37 Q C Enzymatic digestion was performed for 5 hours.
  • Fig. 2 shows the relationship between the temperature during the partial desulfation of KS by the DMSO method and the rate of production of sulfated N-acetylacetylsosamin oligosaccharides of 6 to 12 sugars.
  • the production rate of sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide of 6 to 12 sugars was calculated in the same manner as in the above-mentioned 11-11. As shown in Fig.
  • KSase II When KSase II is used in enzymatic digestion, when the temperature of the partial desulfation of KS by the DMSO method is about 65 ° C or higher, sulfation of 6- to 12-saccharide N-acetyl lactosamin oligosaccharide The production rate was about 20% or more, and reached 30% when the temperature of partial desulfation was 70, and reached about 40% when the temperature was 80 ° C. Based on these results, sulfated 6- to 12-saccharide N-acetyllactosaminooligosomes were obtained by enzymatic digestion of KS at 37 ° C for 5 hours using 1 U of Escherichia freundii endo S-galactosidase.
  • the temperature at which KS is partially desulfated for 3 hours by the DMS method is preferably about 50 to 70 ° C, and more preferably 60 ° C. You. 37 ° C using 1U KSase II
  • the temperature at which KS is partially desulfated by DMSO for 3 hours is approximately 65 ° C. It is easily understood by those skilled in the art that the above is preferable, 70 ° C or more is more preferable, and 80 ° C is extremely preferable.
  • the constituent disaccharides of the reaction product (KS with adjusted sulfate group content) at temperatures of 40, 50, 60, 70, and 80 ° C when KS is partially desulfated by the DMS method for 3 hours
  • the number of moles of sulfate groups per mole was 1.6, 1.4, 1.0, 0.8 and 0.3, respectively.
  • the anthrone-positive fraction of the flow-through solution is concentrated, and cellulofine GC is 90sf (Cellulofine GC 90sf; Seikagaku Corporation)
  • Gel filtration was carried out using a column (4 x 100 cm) manufactured by the company with water as a solvent.
  • the eluate was detected by the Anthrone method, and the peaks corresponding to 6, 8, 10, and 12 sugars were collected, concentrated, desalted, and freeze-dried (yields were 253 mg for hexasaccharide, 324 mg for octasaccharide, 185 mg for decasaccharide and 54 for decasaccharide).
  • 100 mg of 10 sugars is dissolved in 10 m of water, and applied to a 0DS column, Daisopack SP 120-25-25DS-B (manufactured by Daiso-Ichi Co., Ltd .; 2 x 50 cm) in 2 ml portions 5 times. Then, elution was performed using a concentration gradient system from water to a 20% methanol solution, and the decasaccharide fraction was concentrated and lyophilized to recover. The yield was 78 mg. Similarly, 85 mg and 82 mg of purified powder were recovered from 100 mg of each of the octasaccharide and hexasaccharide fractions.
  • the concentration of thiobarbituric acid-positive fraction adsorbed on the Dowex column and eluted by a linear concentration gradient with 2 L of 5 mM to 200 mM NaCl solution is also similar to cellulofine GCL 90sf (Cellulofine GCL-90sf) Load onto the column, perform gel filtration with 0.2 NaCl solution, collect fractions corresponding to 9-saccharide, 11-saccharide, and 13-saccharide, purify each by repeated gel filtration on the same column, desalinate, freeze-dry did.
  • sialyl N-acetyl lactosaminooligosaccharides of 9-, 11-, and 13-saccharides were added at 12 mg, 15 mg, and 15 mg, respectively. 7 m was obtained.
  • the sialic acid, galactose and nitrogen contents were measured for the fractions of hexasaccharide, octasaccharide, decasaccharide, decasaccharide, decasaccharide, eleven sugar and thirteen sugar, respectively.
  • the sialic acid content was measured by the thiobarbituric acid method
  • the galactose content was measured by the anthrone method
  • the nitrogen content was measured by elemental analysis. Table 2 shows the results.
  • “Theoretical value” in Table 3 is the molecular weight determined from the following structural formula.
  • Gal represents a galactose residue
  • GlcNAc represents an N-acetylglycosamine residue
  • NeuAc represents an N-acetyl neuraminic acid residue
  • a glycosidic bond It has been confirmed that the molecular size (molecular weight) of the N-acetylsyllactosamine oligosaccharide obtained according to the present invention almost coincides with the theoretical value. Also, It was confirmed that N-acetyl lactosaminoligosaccharides having strangely different molecular sizes (molecular weight :) can be separated according to the size and size.
  • a novel N-acetylsilactosamin oligosaccharide and a method for producing a novel N-acetylsilactosamin oligosaccharide and a method for producing a novel N-acetylsilactosamin oligosaccharide.
  • the oligosaccharide of the present invention can be used as a material for synthesizing a ligand sugar chain of a selectin family, which is present only in trace amounts in nature.
  • the ligand sugar chain of the selectin family can be used as a novel drug, especially as an anti-inflammatory agent.
  • the oligosaccharide of the present invention can be produced on an industrial scale at low cost by the method 1 of the present invention.
  • a sulfated N-acetylacetyltosamine oligosaccharide useful as an intermediate for producing the oligosaccharide of the present invention can be produced on an industrial scale at low cost.
  • the sulfated N-acetyl lactosamine oligosaccharide may have a novel physiological activity, and is expected to be used as a pharmaceutical.

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Description

- - 明 細 書
新規ラク 卜サミンオリゴ糖およびその製造方法
技術分野
本発明は N—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖の新規な製造方法に関し、 詳しく は、 硫酸基含量を調整したケラタン硫酸から酵素反応と化学反応とにより N—ァ セチルラク トサミ ンオリゴ糖を製造する方法に関する。 また本発明は硫酸化 N— ァセチルラク トサミンオリゴ糖の新規な製造方法に関する。 さらに本発明は新規 な N—ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖にも関する。
背景技術
N—ァセチルラク 卜サミン（LacNAc)構造を骨格とするオリゴ糖およびその誘導 体は、 セレクチンフアミ リーへの結合能をもつ糖鎖として、 生体内では重要な生 理的機能を果たしている。 細胞表面におけるこれらの糖鎖の発現は、 異種細胞間 の特異的な接着に関与していることが明かとなり、 これら糖鎖を利用した機能賦 活剤ゃ抑制剤は、 有用な薬物になると期待されている。 すなわち、 その中心的な 化合物であるシァリルルイス X CSLe' )およびその類縁化合物は、 セレクチン分子 をブロックし、 リ ンパ球と内皮細胞との接着を阻害することによって、 炎症を伴 う種々の疾患の軽減に役立つと考えられている。 また、 これらの糖鎖はがん細胞 が血行性転移をする場合の内皮細胞への接着や、 微生物がターゲッ 卜細胞へ感染 する際の接着に関与するとも考えられており、 これらの疾病を抑制する薬剤開発 の素材として重視されている。
N—ァセチルラク トサミ ン構造を骨格として有するオリゴ糖およびその誘導体 は、 新規な薬剤の開発や、 生体内の生理活性に関する研究において重要な役割を 果たすことが期待されている。 その基本骨格である N—ァセチルラク トサミ ンォ リゴ糖、 特にセレクチンファミ リ一の天然のリガンド糖鎖に類似した、 長鎖の N 一ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖が得られれば、 該 N—ァセチルラク 卜サミ ンォ リゴ糖にシアル酸残基、 フコース残基、 硫酸基、 セラミ ド等を適宜付加すること によって、 天然に微量しか存在しないセレクチンファミ リーのリガン ド糖鎖を合 成することができると考えられる。
さらに、 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖、 特に長鎖の N —ァセチルラク ト サミンオリゴ糖の安定した供給も望まれる。 し力、し、 N—ァセチルラク 卜サミ ン 構造を骨格とするオリゴ糖は天然に微量しか存在せず、 また 鎖の N -ァセチル ラク トサミンオリゴ糖の合成的製造は極めて困難であり、 工業的規模かつ安価な N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖の生産方法が望まれている。
また、 硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖、 特に長鎖の硫酸化 N—ァセ チルラク 卜サミンオリゴ糖は、 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖、 特に長鎖の N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖の合成中間体として有用であり、 この製造方 法が提供されれば、 N—ァセチルラク トサミ ンォリゴ糖の安定的な供給につなが ることが期待される。 発明の開示
本発明は上記観点からなされたものであり、 セレクチンファ ミ リ一のリガンド 糖鎖を合成するための素材となる新規な N —ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖、 N 一ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖の新規な製造方法、 および硫酸化 N -ァセチル ラク トサミ ンオリゴ糖の新規な製造方法を提供することを課題とする。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、 N -ァセチルラ ク トサミ ン構造を基本骨格としてもつケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、 硫酸 基含量が調整されたケラタン硫酸を酵素によって硫酸化 N —ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖に分解し、 次いで完全脱硫酸化することによって N _ァセチルラク ト サミンオリゴ糖 （特に長鎖の N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖） が得られるこ とを見出し、 本発明に至った。
また、 ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、 硫酸基含量が調整されたケラタン 硫酸を酵素消化することによって硫酸化 N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖 （特 に長鎖の硫酸化 N —ァセチルラク トサミンオリゴ糖） が得られることを見出し、 本発明に至った。
また、 新規な N —ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を得ることに成功し、 本発明 に至った。 すなわち本発明は、 ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、 硫酸基含量が調整さ れたケラタン硫酸に、 ケラタン硫酸のグリコシド結合を切断する作用を有する酵 素 （本明細書では単に 「ケラタン硫酸分解酵素」 ということもある. > を作用させ て硫酸化 N—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖を得、 次いで得られた該硫酸化 N— ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を完全脱硫酸化する工程からなる N—ァセチルラ ク トサミ ンオリゴ糖の製造方法 （本明細書中では単に 「本発明方法 1」 というこ ともある） 、 および新規な N —ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖 （本明細書中では 単に 「本発明オリゴ糖」 ということもある） を提供する。
また本発明は、 ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、 硫酸基含量が調整された ケラタン硫酸に、 硫酸基の存在の有無によって基質特異性が異なる 3種類のケラ タン硫酸分解酵素の酵素群のいずれかに属する 1種または 2種以上の酵素を作用 させる工程を少なくとも含む、 硫酸化 N —ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖の製造 方法 （本明細書中では単に 「本発明方法 2」 ということもある） を提供する。 な お、 本発明方法 1 と本発明方法 2を合わせて単に 「本発明方法」 ということもあ る。
本明細書中で 「N —ァセチルラク 卜サミン」 という用語は、 ガラク 卜一ス残基 (Ga】）と N —ァセチルグルコサミ ン残基（GlcNAc)とがグリコシ ド結合した構造 (Gal GlcNAc)を意味する。 また本明細書中では、 「N —ァセチルラク トサミ ン」 という用語には、 N —ァセチルグルコサミ ン残基（GlcNAc)とガラク ト一ス残基 (Gal)とがグリコシド結合した構造 (GlcNAc-Gal)の意味をも包含する。
本明細書中で 「N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖」 とは、 N —ァセチルラク トサミン構造を少なく とも 1つ有するオリゴ糖をいい、 例えば、 N —ァセチルラ ク トサミ ン自体や、 グリコシド結合を介した N—ァセチルラク 卜サミ ンの繰り返 しからなるオリゴ糖が包含される。 また非還元末端にシアル酸残基が付加されて いてもよい。 また非還元末端および還元末端は、 ガラク 卜一ス残基と N -ァセチ ルグルコサミ ン残基のいずれであってもよい。 これらはいずれも本明細書中の
「N—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖」 という用語に包含される。 すなわち下記 一般式（1)〜（6)で表されるオリゴ糖は、 いずれも本明細書屮の 「N—ァセチルラ ク 卜サミ ンオリゴ糖」 に包含される。 (GlcNAc-Gal) n ( 1)
SA Gal^(GlcNAc-Gal)n, (2)
(Gal Glc Ac),, (3)
SA-(GaJ GlcNAc)„, (4)
Gai (GlcNAc-Gal) n (5)
GlcNAc- (Gal -GlcNAc) n (6)
(式中、 Galはガラク ト一ス残基を、 Glc cは N -ァセチルグルコサミン残基を、 SAはシアル酸残基を、 -はグリコシド結合を、 nは 1〜6の整数を、 mは 1〜^の整数 をそれぞれ表す）
本明細書中で 「硫酸化 N—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖」 とは、 硫酸基を有 する N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を意味する。
本明細書中で 「硫酸化オリゴ糖」 とは、 硫酸基を有するオリゴ糖を意味する。 本明細書中で 「硫酸基含量を調整する」 とは、 所望の硫酸基含量となるように 硫酸基含量を増加させること （すなわち硫酸化すること） 、 減少させること （す なわち部分的脱硫酸化すること） および硫酸基含 を増加または減少させなく と も所望の硫酸基含量であるならば、 硫酸基含量を変化させないことをも意味する。 本明細書中で 「部分的脱硫酸化」 とは、 硫酸基を部分的に除去することを意味 し、 硫酸基を一部残す点において 「完全脱硫酸化」 とは異なる。
本明細書中で 「完全脱硫酸化」 とは、 硫酸基を実質的に全て除去することを意 味し、 硫酸基を部分的に除去することとは異なる。 図面の簡単な説明
図 1は、 メタノール塩酸法によるケラタン硫酸の部分的脱硫酸化の時間と、 6 〜 1 2糖の硫酸化 N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖の生成率との関係を示すグ ラフである。
図 2は、 DMSO法によるケラタン硫酸の部分的脱硫酸化の温度と、 6〜 1 2 糖の硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖の生成率との関係を示すグラフで ある。
図 3は、 種々の温度で DM S〇法により部分的脱硫酸化したケラタン硫酸に、 Escherichia freundi i由来のェンドー /9 一ガラク トシダ一ゼまたはケラタ十一ゼ 11を作用させて得られた生成物をゲル濾過に付して得られた溶出曲線を示す。 発明を実施するための最良の形態
1 . 本発明方法
本発明方法 1は、 ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、 硫酸基含量が調整され たケラタン硫酸にケラタン硫酸分解酵素を作用させて硫酸化 N—ァセチルラク ト サミンオリゴ糖を得、 次いで得られた該硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ 糖を完全脱硫酸化する工程からなる N—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖の製造方 法である。
本発明方法 2は、 ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、 硫酸基含 が調整され たケラタン硫酸に、 硫酸基の存在の有無によって基質特異性が異なる 3種類のケ ラ夕ン硫酸分解酵素の酵素群のし、ずれかに属する 1種または 2種以上の酵素を作 用させる工程を少なく とも含む、 硫酸化 N—ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖の製 造方法である。
以下に本発明方法の各工程における技術について詳述する。 なお以下に示す（1) 〜（5)については本発明方法 1および 2に共通の技術であり、 （6)および (7)は本 発明方法 1に関連する技術である。
( 1)本発明方法で用いるケラタン硫酸
ケラタン硫酸は、 ガラク ト一ス残基（Gai)と N —ァセチルグルコサミ ン残基 (GlcNAc)がグリコシド結合した二糖 （N—ァセチルラク トサミ ン ； LacNAc) を繰 り返し構造単位として有し、 その二糖 1モル当たりに 1〜 2モルの硫酸基を有す るグリコサミノグリカンである。 動物種および器官などによってケラタン硫酸の 硫酸基含有量は異なっているが、 通常はサメなどの軟骨魚類、 クジラ、 ゥシなど の哺乳動物の軟骨、 骨や角膜等の生原料から製造される。 本発明方法において使 用されるケラタン硫酸は、 通常入手できるものであればよく、 特に限定されない カ^ 構成糖であるガラク ト一ス残基が硫酸化された高硫酸化ケラタン硫酸 （構成 二糖 1モル当たり 1 . 5〜 2モルの硫酸基を含む高硫酸化ケラタン硫酸をケラタ ンポリ硫酸ということもある） を用いることが好ましい。 また、 ガラク トース残 基の硫酸基の位置としては、 6位が好ましい。 このような高硫酸化ケラタン硫酸 は、 例えば、 サメ等の軟骨魚類の軟骨のプロテオグリカンから取得できる。 また 市販されているものを使用することもできる。 なお、 本明細書中において 「ケラ タン硫酸」 という用語には、 特にことわらない限り、 高硫酸化ケラタン硫酸ゃケ ラタンポリ硫酸も包含される。
(2)ケラ夕ン硫酸の硫酸基含量の調整
ケラタン硫酸の硫酸基含量の調整方法としては、 所望の硫酸基含量となるよう に硫酸化すること、 部分的脱硫酸化すること、 および硫酸基含量を増加または減 少させなくとも所望の硫酸基含量であるならば、 硫酸基含量を変化させないこと をも包含する。 いずれの硫酸基含量の調整方法を選択するかは、 本発明方法で用 いるケラタン硫酸の硫酸基含量、 本発明方法で用いるケラタン硫酸分解酵素の種 類、 および目的とするオリゴ糖のサイズに応じて、 当業者が適宜選択できるもの である。
なお、 硫酸基含量は、 ケラタン硫酸分解酵素の作用により目的とする分子サイ ズのオリゴ糖が得られる程度に調整するものであり、 より具体的には、 構成二糖 1モル当たり平均 0 . 3〜 1 . 5モルの硫酸基が存在する程度に調整する。
なお、 ケラタン硫酸分解酵素として、 後述する酵素群（1)または（2)に属する酵 素を用いる場合には、 構成二糖 1モル当たり 1 . ：！〜 1 . 5モルの硫酸基が存在 する程度に硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸を用いることが好ましい。 また、 ケラタン硫酸分解酵素として、 後述する酵素群 (2)または (3)に属する酵素を用い る場合には、 構成二糖 1モル当たり 0 . 3〜 0 . 8モルの硫酸基が存在する程度 に硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸を用し、ることが好ましい。
以下に、 ケラタン硫酸の硫酸基含量の調整方法を説明する。
(2 - 1)部分的脱硫酸化
部分的脱硫酸化は、 グリコサミノグリ力ンの公知の脱硫酸化方法により行うこ とができる力 硫酸基が実質的に全て除去されないように脱硫酸化反応時の温度、 脱硫酸化反応の時間、 脱硫酸化剤の濃度等の反応条件を設定する必要がある。 す なわち、 硫酸基が実質的に全て除去される反応条件よりも脱硫酸化反応時の温度、 脱硫酸化反応の時間、 脱硫酸化剤の濃度等を低く設定する。 具体的な反応条件は、 - - 用いるケラタン硫酸、 硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸のグリコシド結合の 切断に用いるケラタン硫酸分解酵素のタイプ、 目的とする N —ァセチルラク 卜サ ミ ンオリゴ糖の分子サイズ （分子量、 糖鎖数） 等に応じて当業者が適宜設定する ことができる。
グリコサミノグリ力ンの公知の脱硫酸化方法としては、 例えば酸加水分解、 ァ ルカリ分解、 および有機溶媒中で加熱する方法等が挙げられる （Method in Carbo hydrate Chemistひ.'、 vol. VI I I、 p281-289、 1980年) 。 すなわち脱硫酸化 剤として酸、 アルカリ、 有機溶媒等を用いることができる。
例えば酸加水分解する場合、 酸としては無機酸、 有機酸、 強酸性陽イオン交換 樹脂、 特にスルホン酸系樹脂等を用いることができ、 反応溶媒としては水、 メタ ノ一ル等を用いることができる。 本発明方法においては塩化ァセチルを含む無水 メタノール溶液を用いることが好ましい。
例えば有機溶媒を用いる場合には、 有機溶媒としてジメチルスルホキシド （D M S 0； 、 N, N-ジメチルホルムァミ ド（DMF)、 ピリジン等の非プロ 卜ン性溶媒を 用いることができる。 D M S 0を用いる場合、 水またはメタノール 5〜10%を含 む D M S O溶液中、 ケラタン硫酸ピリジニゥム塩を 20〜100°Cの範囲で加熱する 方法が広く用いられており （新生化学実験講座 3、 糖質 I I、 東京化学同人、 p325 - 326、 1989年） 、 本発明方法においてもこの方法を用いることが好ましい。
また、 シリル化剤を用いる脱硫酸化方法を用いることもできる。
特開平 5 - 2 3 0 0 9 0号公報には、 硫酸化糖の有機塩基塩を、 該有機塩基の 存在下に、 N. 0-ビス （ 卜リメチルシリル） ァセ卜アミ ド類と反応させることによ り、 硫酸化糖の第 1級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸することを 特徴とする脱硫酸化糖の製造方法が開示されており、 この方法を用いることもで きる。
まず、 有機塩基を溶媒としてケラタン硫酸を溶解し、 ケラタン硫酸の有機塩基 塩を形成させる。 ケラタン硫酸の有機塩基塩としては、 ピリジン、 ジメチルァニ リン、 ジェチルァニリン等の芳香族ァミ ン ； 卜リメチルァミン、 トリェチルァミ ン、 卜リブチルァミ ン、 Ν，Ν-ジイソプロピルェチルァミ ン、 卜リオクチルァミ ン、 .\', Ν, Ν' , Ν' -テ 卜ラメチル 1，8-ナフタレンジアミ ン等の 3級ァミ ン ； Ν —メチル ピリ ミジン、 N—ェチルピリ ミジン、 N—メチルモルホリン、 N—ェチルモルホ リン等の N—アルキル複素環アミン等の有機塩基との塩が挙げられる。
、て無水の有機塩基の存在下、 卜リメチルシリル化試薬である N, 0 ビス （ ト リメチルシリル） ァセ卜アミ ド （BTSA) 、 N, 0 ビス （ 卜リメチルシリル） トリフ ロロァセ卜アミ ド （BTSFA ) 、 N, 0 ビス （トリメチルシリノレ） ジフロロァセ卜ァ ミ ド、 N, 0 ビス （トリメチルシリル.） モノフロロァセ卜アミ ド等を加え、 反応温 度を室温〜 1 0 0 °Cで反応させることにより脱硫酸化を行うことができる。
特開平 7 — 6 2 0 0 1号公報には、 下記一般式 (A)
CH., C[ 0Si(R) a ]=CH- C0CH3 · · · · (A)
(式中、 Rは同一または異なり、 アルキル基またはァリール基を示す） で表されるシリル化剂の存在下に脱硫酸化反応に付すことを特徴とする脱硫酸化 糖の製造方法が開示されており、 この方法を用いることもできる。 この方法でも 硫酸化糖の有機塩基塩に、 上記一般式 (A)で表されるシリル化剂を反応させるこ とが好ましく、 有機塩基塩としては上記特開平 5 - 2 3 0 0 9 0号公報に記載の ものと同様の有機塩基塩を用いることができる。 上記 -般式（A)における（R Si O としては、 卜リメチルシリルォキシ、 トリェチルシリルォキシ、 ジメチルイソプ 口ビルシリルォキシ、 イソプロピルジメチルシリルォキシ、 メチルジー tーブチ ルシリルォキシ、 tーブチルジメチルシリルォキシ、 t —ブチルジフ X二ルシリ ルォキシ、 トリイソプロビルシリルォキシ等が例示される。 上記一般式（A)で表 されるシリル化剤として最も好ましいものは、 2—トリメチルシ口キンペン卜一 2 —ェン— 4 一オンである。 反応温度を室温〜 1 0 0 °Cで反応させることにより 脱硫酸化を行うことができる。
国際公開公報 ΟΪ096/01278) には、 F記一般式 (B)
(R ' ) 3C -C(=0)N( - R2 ) -Si (R3 ) 3 · · . · (B)
(式中、 R 1は同一または異なり水素原子またはハロゲン原子を示し、 R2は低級ァ ルキル基を示し、 R3は同一または異なり低級アルキル基、 ァリール基またはハロ ゲン原子を示す） で表されるシリル化剤を反応させることにより、 第 1級水酸基 に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸化することを特徴とする脱硫酸化多糖の 方法が開示されており、 この方法も用いることができる。 この方法でも硫酸化糖 - - の有機塩基塩に、 上記式で表されるシリル化剂を反応させることが好ましく、 有 機塩基塩としては上記特開平 5— 2 3 0 0 9 0号公報に記載のものと同様の有機 塩基塩を用いることができる。 シリル化剤としては、 上記- -般式（B)において R 1 は同一または異なり水素原子またはフッ素等のハロゲン原子を示し、 R2はメチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 ブチル、 イソブチル、 s e c—ブチル、 t e r tーブチル、 ペンチル、 イソペンチル、 へキシル等の炭素数 1〜 6の低級アル キル基を示し、 R3は同一または異なり、 前記と同様の低級アルキル基、 フヱニル 等のァリール基または塩素、 フッ素等のハロゲン原子を示す。 上記一般式 (B)に おける（R3 ) 3Siとしては、 卜リメチルシリル、 卜リエチルシリル、 ジメチルイソ プロビルシリル、 イソプロピルジメチルシリル、 メチルジー t ーブチルシリル、 tーブチルジメチルシリル、 t 一ブチルジフヱニルシリル、 トリイソブロビルシ リル基等が例示される。 上記一般式 (B)で表されるシリル化剤で最も好ましいも のとしては、 N—メチルー N— 卜リメチルシリルァセ卜アミ ド （MTMSA ) または N—メチル— N— トリメチルシリルトリフルォロアセトアミ ド （ MTSTFA 1 が挙げ られる。 室温〜 1 0 0 で反応させることにより脱硫酸化を行うことができる。 さらに、 ケラタン硫酸の脱硫酸化をする作用を有する酵素を用いてもよい。 これらグリコサミノグリ力ンの公知の脱硫酸化方法における反応条件を適宜設 定することにより、 硫酸基を適度に減らしたケラタン硫酸を得ることができる。 (2 2)硫酸化
硫酸化は、 グリコサミノグリ力ンの公知の硫酸化方法により行うことができ、 特に限定されるものではないが、 例えば特開昭 6 1 - 4 7 7 0 1号公報に記載さ れている方法等が挙げられる。 前述した通り、 一般的にケラタン硫酸は硫酸基含 量が多いことから、 ケラタン硫酸の硫酸基含量の調整は、 部分的脱硫酸化による 場合が圧倒的に多い。 しかし、 硫酸基含量が極端に低いケラタン硫酸等が入手で き、 利用できる場合には、 硫酸化により硫酸基含量を調整することもできる。 な お硫酸化により硫酸基含量を調整する場合、 ガラク 卜一ス残基および/'または N ーァセチルダルコサミ ン残基の 6位のみを硫酸化することが好ましいこと力ヽら、 6位特異的な硫酸化方法を選択することが好まし 、。
また、 ケラタン硫酸のガラク トース残基および または N—ァセチルグルコサ ミ ン残基の 6位に特異的に硫酸基を転移する酵素 （スルホトランスフェラーゼ） を用いてもよい。
ケラタン硫酸や、 硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸の硫酸基含量は、 公知 の方法で定量することができ、 例えばケラタン硫酸分解酵素を作用させて得られ た結果に基づいて評価することができる。 あるいは、 構成二糖〗モル当たりの硫 酸基のモル数で評価してもよい。 構成二糖 1モル当たりの硫酸基のモル数は、 ァ ンスロン法ゃァミノ糖分析によりガラク 卜一スゃ N—ァセチルグルコサミ ンを定 量することにより糖残基数を求めるとともに、 糖の塩酸分解物のイオンクロマト グラフィ一分析により硫酸基含量を求め、 これらの値から算出することによって 決定できる。 もし原料となるケラタン硫酸の硫酸基含量が所望の硫酸基含量であ るならば、 積極的に硫酸基含量の調整 （すなわち硫酸化や部分的脱硫酸化） を行 う必要もなく、 そのまま本発明に用いることができる。
なお本発明方法においては、 ケラタン硫酸は一般的に硫酸基含量が多いこと、 さらに高硫酸化ケラ夕ン硫酸ゃケラタンポリ硫酸を原料として用いることが好ま しいこと等から、 本発明方法におけるケラタン硫酸の 「硫酸基含量の調整」 は、 部分的脱硫酸化によって行う場合が多く、 かつ好ましい。 またそれに伴って用い るケラタン硫酸分解酵素 （後述する） を選択することが好ましい。
(3)本発明方法で用いるケラタン硫酸分解酵素
本発明方法で用いることができるケラタン硫酸分解酵素は、 ケラタン硫酸のグ リコシド結合を切断する作用を有する酵素である限りにおいて特に限定されない が、 下記酵素群（1)〜（3)のいずれかに属する 1種または 2種以上の酵素を用いる ことが好ましい。
酵素群（1 )：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用 ：
ケラタン硫酸の ガラク トシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
• ;9一ガラク トシド結合に関与するガラク トース残基の 6位に硫酸基を有する当 該9一ガラク トシド結合には作用しない。
■ S—ガラク トシド結合に関与するガラク トース残基 （6位に硫酸基を有さない） - - の非還元末端側に隣接する N —ァセチルグルコサミン残基の 6位の硫酸基の有無 にかかわらず当該 /3—ガラク 卜シド結合に作用する。
酵素群（1)は、 エンド— 一ガラク 卜シダ一ゼであることが好ましい。
酵素群（1 )に含まれる酵素としては、 例えばェシェリキア ' フロインディ (Escherichia f reundii) 由来のェント— /3—ガラク トシダ一ゼ (H. Nakagawa, T. Yamada, J L. Chien, A. Gardas, M. Kitamikado, S C. Li, Y- i. Li, J. Biol. Chem. , 255, 5955( 1980) ；本明細書中において、 単に ΓΕ GalaseJ ということもある） が挙げられ、 かつ好ましい。
酵素群 (2) ： 下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用 ：
ケラ夕ン硫酸の 3—ガラク トシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
• /3—ガラク トシド結合に関与するガラク トース残基の 6位に硫酸基を有する当 該 —ガラク トシド結合には作用しない。
• β—ϋラ々 トシド結合に関与するガラク トース残基 （' 6位に硫酸基を有さない > の非還元末端側に隣接する Ν —ァセチルダルコサミ ン残基の 6位に硫酸基を有す る当該 /3—ガラク 卜シド結合には作用する。
• β— ラウ トシド結合に関与するガラク 卜一ス残基 （6位に硫酸基を有さない） の非還元末端側に隣接する Ν -ァセチルグルコサミン残基の 6位に硫酸基を有さ ない当該^ 一ガラク トシド結合には作用しない。
酵素群（2)は、 ェンドー; S—ガラク トシダ一ゼであることが好ましい。
酵素群（2)に含まれる酵素としては、 例えばシュ一ドモナス（Pseudomonas) s p . IFO- 13309株由来のェンド— S —ガラク トシダ一ゼ （K. Nakazawa, N. Suzuki, S. Suzuki, J. Biol. Chem. , 250, 905(1975)、 K. Nakazawa, S. Suzuki, J. Biol. Chem. , 250, 912(1975)； や、 特公昭 5 7 - 4 1 2 3 6号公報に開示されているシ ユー ドモナス · レフ。ティ リボーラ (Pseudomonas reptilivora)が産生するェンド — yS —ガラク トシダ一ゼ （これらは本明細書中において、 単に 「ケラタ十一ゼ」 または 「KSase」 ということもある） が挙げられ、 かつ好ましい。
酵素群（3)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群 (a)作用 ：
ケラタン硫酸の 3— N—ァセチルダルコサミニド結合を切断する。
(b)基質特異性：
- yS— N—ァセチルグルコサミニド結合に関^する N—ァセチルグルコサミ ン残 基の 6位およびその N -ァセチルグルコサミ ン残基の非還元末端側に隣接するガ ラク ト一ス残基の 6位にそれぞれ硫酸基を有する当該 /3— N—ァセチルグルコサ ミニド結合に作用する。
• ^9— N -ァセチルグルコサミニド結合に関与する N—ァセチルグルコサミン残 基の 6位に硫酸基を有し、 その N -ァセチルグルコサミ ン残基の非還元末端側に 隣接するガラク ト一ス残基の 6位には硫酸基を冇さない当該 3— N—ァセチルダ ルコサミ二ド結合に作用する。
. — N -ァセチルダルコサミ二ド結合に関与する N—ァセチルグルコサミン残 基の 6位およびその N—ァセチルグルコサミ ン残基の非還元末端側に隣接するガ ラク 卜一ス残基の 6位のどちらにも硫酸基を有さない当該S— N一ァセチルグル コサミニド結合には作用しない。
酵素群（3)は、 エンド一 /3— N—ァセチルグルコサミニダ一ゼが好まし L、。 酵素群（3 )に含まれる酵素と しては、 例えばバチルス s p . K s 3 6 (Baci l lus Ks36 ) 由来 （橋本信一、 森川清志、 菊池博、 吉田圭一、 徳安清親、 生化学、 60, 935 (1988)；本明細書中において、 単に 「ケラタナーゼ I I」 または 「KSaseI I」 ということがある） 、 またはバチルス，サ一キュランス K s T 2 0 2 (Bacillus circulans KsT202) 由来 （WO 9 6 / 1 6 1 6 6号公報に記載） の ェンド— 3— N—ァセチルグルコサミニダーゼ等が挙げられ、 かつ好ましい。 酵素群（1)および (2)はいずれもエンド—yS —ガラク 卜シダ一ゼ型の酵素である 力く、 糖鎖に存在する硫酸基によって基質特異性が異なる。 また酵素群 (3)は、 ェ ンド— ^g— N—ァセチルグルコサミニダーゼ型の酵素である。 よって、 酵素消化 によって得られるオリゴ糖の還元末端は、 エンド一 —ガラク 卜シダーゼ型の酵 素を用いた場合にはガラク ト一ス残基（Gal)であり、 エンド— /3— N—ァセチル グルコサミニダ一ゼ型の酵素を用いた場合には N -ァセチルグルコサミ ン残基 (GicNAc)である。 なお、 酵素群（1)〜（3)の基質特異性を以下にまとめた。 下記一般式 (a)〜（k)中 の 「〜」 で示されるグリコシド結合 （酵素群（1)および (2)においては /3 —ガラク トシド結合、 酵素群（3)においては /3 - N -ァセチルダルコサミ二ド結合である） を切断するか否かを示した。 表 1
酵素群（1 )
(a) · · · Gi u Ac-Gal(6S)〜GlcNAc · · · 切断しない
(b) · · · G LcNAc(6S) GaK6S)〜GlcNAc · · · 切断しない
(c) - · · GlcNAc(6S)- Ga]〜GicNAc · · · 切断する
(d) · ■ · GlcNAc Gal〜GlcMc · · · 切断する
酵素群 (2)
(e) · · · GicNAc GaK6S)〜GlcNAc · · · 切断しない
(f) - · · Glじ N'Ac(6S)- Gal (6S；)〜 GlcNAc · · · 切断しない
(g) · · · GlcMc(6S) Gal〜GlcNAc · · · 切断する
(h) · · · GlcNAc- Gai〜G I cMc · · · 切断しない
酵素群 (3)
( i) · · · Gal (6S) - GlcNAc(6S)〜Gal · · · 切断する
(j ) · · · Gaj -GlcNAc(6S)〜Ga〗 · · · 切断する
(10 · · · Ga卜 GlcNAc：〜 Gal · · · 切断しない
(ただし、 Galはガラク トース残基を、 GlcNAcは N -ァセチルグルコサミ ン残基 を、 （6S)は 6位の水酸基が硫酸化されていることを. -および〜はグリコシド結 合を、 · · 'は Gaiおよび GlcNAcが交互にグリコシ 1 '結合した構造をそれぞれ表 す）
(4)酵素作用条件
軟骨由来のケラタン硫酸は、 二硫酸化された N —ァセチルラク トサミ ン (LacNAc-diS) 残基の含量が高く、 特にサメ由来のケラタン硫酸ではその含量が 高い。 従って、 このようなケラタン硫酸に対しては酵素群（1 )および（2)の酵素 (例えば E- Galase や KSase) は殆ど作用しないが、 逆に酵素群（3)の酵素 （例え ば、 KSase I I ) によってほとんど分解され、 容易に二糖および四糖となる。 しか し、 この糖鎖を部分的に脱硫酸したケラタン硫酸は、 脱硫酸化の度合いが高まる に従って、 酵素群（1)および (2)の酵素の作用が上昇し、 これと全く対照的に酵素 群（3)の酵素の作用が低下する。 以上の酵素の基質特異性とケラタン硫酸の部分 的脱硫酸化の程度との組み合わせによって、 本発明方法により最終的に得られる N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖の分子サイズの調節が可能である。 すなわち、 使用する酵素の特異性により、 酵素の作用が上昇するように部分的硫酸化の程度 を調節すれば分子サイズが小さくなる。 逆に、 酵素の作用が低下するように部分 的硫酸化の程度を調節すれば分子サイズが大きくなる。
なお、 少量であれば、 硫酸基含 IS:が調整されたケラタン硫酸と上記酵素群（1 ) 〜（3)のいずれかに属する 1種または 2種以上の酵素とを共存させて、 該酵素を 作用させればよいが、 大量に酵素処理する場合は、 適 な固相 ぐビーズ等） に当 該酵素を結合させた固定化酵素や、 限外濾過膜、 透析膜等を用いる膜型のリアク ター等を用いて連続的に酵素を作用させることが好ましい。
このように、 ケラタン硫酸の部分的脱硫酸化の程度と、 ケラタン硫酸分解酵素 の基質特異性とを適宜組み合わせることによって、 所望の分子サイズの硫酸化 N 一ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖を得ることができる。
(5)硫酸化 N—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖の分画
上記のように酵素を作用させることによって生じた硫酸化 N—ァセチルラク 卜 サミンオリゴ糖の分画は、 通常の糖鎖の分離、 精製の手法を用いることができる。 例えば吸着クロマトグラフィー、 陰イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロ マトグラフィ一、 ゲル濾過法、 ゲル浸透ク口マトグラフィ一、 濾紙電気泳動法、 濾紙クロマトグラフィー、 有機溶媒による分画、 あるいはこれらの組合わせ等の 操作により行うことができるカ^ これらに限定されるものではない。
なお酵素処理によって生じた硫酸化 N—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖は、 ォ リゴ糖の分子サイズに応じて分画することが好ましし、。 分子サイズに応じた分画 の方法は、 特に限定されるものではないが、 例えば種々のゲル濾過担体を用いた ゲル濾過クロマ卜グラフィ一や有機溶媒を用いた分画法を挙げることができる。 ゲル濾過担体は、 分子篩を目的として作られた担体であれば特に限定されるもの ではなく、 アクリルアミ ド架橋体、 デキストラン、 ァガロース、 セルロースのよ うな多糖体の架橋粒子などを挙げることができる。 また、 目的とするオリゴ糖の 分子サイズに応じて、 それぞれにふさわしい架橋度の担体を適宜選択することが できる。 ゲル濾過クロマトグラフィーを用いることにより、 八糖程度のオリゴ糖 まではそれぞれのオリゴ糖の分子サイズに応じて分離できるが、 それ以上の長さ のオリゴ糖の分離能は、 オリゴ糖の分子サイズが大きくなるに従って低下する。 この場合は、 何種類かの分子サイズのォリゴ糖の混合物として分画される。
また、 オリゴ糖混合物を予め陰ィォン交換樹脂によつて硫酸基密度別に分画を 行なってもよく、 これによりゲル濾過クロマトグラフィーによる分離能を向上さ せることができる。 多硫酸化されたオリゴ糖は、 一般に硫酸基の密度が等しい場 合には、 分子サイズの大きい方が陰イオン交換樹脂上で強く吸着されるので、 こ の原理で塩濃度を調節することによつて相互分離が可能である。
また有機溶媒による分画の場合は、 例えばアルコールゃァセトン等を用いるこ とが好ましい。
このようにして得られる硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖の糖鎖骨格 は、 下記一般式（1)〜（6)で表される。 具体的には、 下記一般式（1)および（2)は、 本発明方法において硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸に前記酵素群（1 )およ び Zまたは前記酵素群（2)に属する酵素を作用させた時に得ることができる硫酸 化 N—ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖の骨格である。 下記一般式 (3)および (4)は、 本発明方法において硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸に前記酵素群（3)に属 する酵素を作用させた時に得ることができる硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンォ リゴ糖の骨格である。 また下記一般式（5)および（6)は、 本発明方法において硫酸 基含量が調整されたケラタン硫酸に前記酵素群（1)および/または（2)に属する酵 素と、 前記酵素群 (3)に属する酵素との両方を作用させた時に得ることができる 硫酸化 N —ァセチルラク トサミンオリゴ糖の骨格である。
(GlcNAc Gai) ,, ( 1)
SA- Gal (GlcNAc -Gal )„, (2)
(Gal GlcNAc) ,, (3) SA-(Gal-GlcNAc)„, (4)
Gal-(Glc Ac-Gal),, (5)
GlcNAc (Gal Glc Ac),, (6)
(式中、 Gaiはガラク トース残基を、 GlcNAcは N—ァセチルグルコサミ ン残基を、 SAはシアル酸残基を、 -はグリコシド結合を、 nは 1〜6の整数を、 πιは 1〜10の整数 をそれぞれ表す）
例えば本発明方法において、 前記酵素群（3)に厲する酵素であるケラタナ一ゼ IIを硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸に作用させた場合、 例えば下記の式で ¾される骨格を有する硫酸化 Ν—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖が得られる。 Gal GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal GlcNAc (7) Gal-GlcNAc Gal- GlcNAc Gal -GlcNAc-Gal GlcNAc (8) Gal GlcNAc-Gal -GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal -GlcNAc Gal-GlcNAc (9) Gal-GlcN'Ac Gal GlcNAc Gal-GlcNAc-Gal - GlcNAc Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc (10) SA-Gai-GlcNAじ Gal- GlcNAc Gal -GlcNAc (11) SA Gal -GlcNAc-Gal GlcNAc Gal GlcNAc-Gal GlcNAc (12) SA Gal- GlcNAc- Gal GlcNAc- Gal - GlcNAc Gal GJcNAc Gal GlcNAc (13) SA Ga 1 - G lcNAc Ga I G 1 cN Ac Ga 1 - G lcNAc - G 1 G IcN Ac - Ga 1 ~ G 1 cN Ac Ga 1 G lcN Ac ( 14 ) (式中、 Galはガラク 卜ース残基を、 GlcNAじは N -ァセチルグルコサミン残基を、 SAはシアル酸残基を、 -はグリコシド結合をそれぞれ表す:）
なお、 上記（7)〜（14)の式で表される骨格を有する硫酸化 N—ァセチルラク ト サミンオリゴ糖は、 あくまで前記一般式 (3)および (4)で表される骨格を有する硫 酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖の具体的例示にすぎす、 これらに限定さ れるものではない。
前記（1；)〜（6)の一般式で表される骨格を有する硫酸化 N-ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を、 後述する方法で完全脱硫酸化することによって、 下記一般式で表 される N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖を得ることができる。
(GlcNAc-Gal)„ (1)
SA- Ga卜（GlcNA Gal)„, (2)
(Gal -GlcNAc),, (3) SA (Gal-Glc Ac)n, (4)
Ga] (Glc Ac-Gal (5)
GlcNAc (Gal-GlcNAc)„ (6)
(式屮、 GaUまガラク 卜一ス残 ¾を、 GlciMAcは N—ァセチルグルコサミ ン残基を、 SAはシアル酸残基を、 はグリコシド結合を、 nは 1〜6の整数を、 mは 1〜10の整数 をそれぞれ表す）
例えば、 上記（7)〜（14)の式で表される骨格を有する硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖は、 後述する方法で完全脱硫酸化することによって下記式で表 される N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖を得ることができる。
Gal-GlcNAc-Gal-Glc Ac-Gal GlcNAc (15) Gal Glc Ac-Gal -GlcNAc Gal-GlcNAc-Gal -GlcNAc (16) Gal-GlcNAc Gal~GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal -GlcNAc (17) Gal GlcNAc Ga GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gai GlcNAc Gal -GlcNAc (18) SA-Gal Glc Ac-GaJ -GlcNAc Gal-GlcNAc (19) SA Gal-GlcNAc-Gal-Gl cNAc -Gal Gl cNAc -Gal -GlcNAc (20) SA-Gal -GlcNAc -Gal GlcNAc Gal-GlcNAc Gal-GlcNAc-Gal GlcNAc (21) SA-Gal GlcNAc-GaJ GlcNAc-Gal-GlcNAc-Ga] -GlcNAc Gal - GlcNAc Gal Glc\Ac(22) (式中、 Gaiはガラク 卜一ス残基を、 GlcNAcは N-ァセチルグルコサミ ン残基を、 SAはシアル酸残基を、 -はグリコシド結合をそれぞれ表す）
なお、 上記（15)〜（22)の式で表される N—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖は、 あくまで前記一般式 (3)および (4)で表される骨格を有する硫酸化 N-ァセチルラ ク 卜サミ ンオリゴ糖から得られる N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖の具体的例 示にすぎす、 これらに限定されるものではない。
また上記式（ 1 )〜（ 6)において nは 1〜 6の整数であるが、 長鎖の N -ァセチル ラク トサミンオリゴ糖、 例えば n力 3〜 6の整数であるものが好ましく、 nが 5 〜 6の整数であるものが特に好ましい。
また上記式（1)〜（6)において mは 1〜 1 0の整数であるカ^ 長鎖の N—ァセチ ルラク トサミンオリゴ糖、 例えば mが 3〜 1 0の整数であるものが好ましく、 m が 5〜 1 0の整数であるものが特に好ましい。 上記式（1)〜（22)において、 好ましいシアル酸残基（SA)は N—ァセチルノイラ ミ ン酸残 ^(NeuAc)である。 またシアル酸残基（SA)と、 該シアル酸残基（SA)の還 元末端側に隣接するガラク 卜一ス残基 (Gal )との間のグリコシド結合は、 ひ 一 2 , 3グリコシド結合またはひ 一 2， 6グリコシド結合であることが好まし 、。 また、 ガラク トース残基 (Gal)と、 該ガラク トース残基 (Gal )の還元末端側に隣接する N 一ァセチルグルコサミ ン残基（GicNAc)との間のグリコシド結合は、 /3— 1 ， 4グ リコシ ド結合であることが好ましい。 また、 N —ァセチルグルコサミ ン残基 (GlcNAc)と、 該 N -ァセチルグルコサミ ン残基 (GlcNAc)の還元末端側に隣接する ガラク トース残基（Gai )との間のグリコシド結合は、 3 — 1 , 3グリコシド結合 であることが好ましい。 また後述する硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖 の完全脱硫酸化において述べるように、 特にシアル酸残基を有する硫酸化 N -ァ セチルラク 卜サミ ンオリゴ糖の脱硫酸化条件については従来報告されておらず、 本発明者らによつて初めて見出された条件である。 このことから本発明方法にお ける N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖および硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ン オリゴ糖の屮でも、 シアル酸残基を有する N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖お よび硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖 （例えば上記式（1；)〜（22)中の、 (2)、 （4)、 （11)、 （12)、 （13)、 （14)、 （19)、 （20)、 （21)、 (22)； が特に好ましい。 (6)硫酸化 N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖の完全脱硫酸化
酵素消化によって得られた硫酸化 N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖の完全脱 硫酸化は、 前記したケラタン硫酸の部分的脱硫酸化の方法に従い、 実質的に全て 脱硫酸化されるように適宜脱硫酸化条件を設定することによって行うことができ るが、 硫酸基の位置、 糖の種類および結合様式によって、 その脱硫酸化の条件は 著しく異なる。 即ち、 温度および溶媒条件によっては、 糖鎖に分解が生じたり、 硫酸基が残ってしまったりする。 特にシアル酸残基を有する硫酸化 N -ァセチル ラク トサミ ンオリゴ糖を完全脱硫酸化する場合、 脱硫酸化の条件を強く設定しす ぎると、 硫酸基は実質的に全て除去されるが、 シアル酸残基も除去されてしまう。 これを防ぐためには、 シァル酸残基を保持したまま完全脱硫酸化する条件を設定 する必要があり、 この条件については従来報告されていなかった。 従って、 シァ ル酸残基を有する硫酸化 N—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖については、 以下に 述べる脱硫酸化条件 （すなわちシアル酸残基を保持したまま完全脱硫酸化する条 件） は本発明者らの検討により始めて得られたものであり、 本願は、 シアル酸残 基を有する硫酸化 N—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖を、 シアル酸残基を保持し たまま完全脱硫酸化する方法に関する発明をも包含している。
硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖の完全脱硫酸化の方法としては、 前 記したケラタン硫酸の部分的脱硫酸化方法と同様に、 例えば酸加水分解、 アル力 リ分解、 および有機溶媒中で加熱する方法、 シリル化剤を用いる方法、 酵素を用 いる方法等が挙げられるが、 その反応条件が部分的脱硫酸化の時とは異なる。 以下に有機溶媒を用いる脱硫酸化方法として 「ジメチルスルホキシド法」 、 酸 加水分解することによる脱硫酸化方法として 「メタノ一ル塩酸法」 、 シりル化剤 を用いる脱硫酸化方法として 「卜リメチルシリル化剤法」 をそれぞれ挙げて、 完 全脱硫酸化する方法についてより具体的に説明する。
(a)ジメチルスルホキシド （D M S O ) 法
硫酸化 N —ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖を水に溶解し、 強力チオン交換樹脂 ( H型） を通過させてフリーの硫酸基を除去した後、 これをピリジンで中和して、 硫酸化 N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖のピリジニゥム塩とする。 硫酸化 N— ァセチルラク トサミンオリゴ糖のピリジニゥム塩を、 5〜 2 0容量0 /0、 好ましく は 10容量％の水を含む D M S 0溶液に溶解し、 7 0〜 1 0 0 °Cで 2〜 1 0時間、 好ましくは 100°Cで 5時間加熱することにより、 糖鎖の分解を起こさずに完全脱 硫酸化することができる。
(b)メタノール塩酸法
水分を十分除去した乾燥メ夕ノ一ルに塩化水素ガスを通して、 メタノール塩酸 溶液を作る。 この液を乾燥メタノールで希釈して 0 . 0 1〜 1規定、 好ましくは 0. 1規定に調節する。 よく乾燥した硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンォリゴ糖を メタノール塩酸液に分散させ、 4〜 3 0 で 0 . 5〜 5 0時間、 好ましくは室温 で 1 5時間攪拌することにより、 完全脱硫酸化することができる。
(c)トリメチルシリル化剤 （T M S ) 法
硫酸化 N —ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を N ，0- -ビス Π、リメチルシリル〕 ァセトアミ ド （B T S A ) 類と加熱することにより脱硫酸化させる方法である。 例えば、 N —ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖をピリジン溶液に溶解し、 B T S A を硫酸基に対して 5〜 1 6倍モル、 好ましくは 10倍モル濃度加えて、 4 0〜9 0 °Cで 0 . 5〜3時間、 好ましくは 80°Cで 1時間反応させることにより完全脱硫酸 化することができる。 本方法による脱硫酸化率は、 発明者らの検討により、 温度 と処理時間の変化によつて任意に調節できることが確認された。
この他に完全脱硫酸化する方法としては、 硫酸等の酸や、 水酸化ナトリウム等 のアル力リを作用させる方法等を挙げることができる。
なお、 完全脱硫酸化の方法はこれらに限定されるものではない。
硫酸化 N —ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を完全脱硫酸化することによって、 N —ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖が得られる。
(7) N —ァセチルラク 卜サミンォリゴ糖の分画
N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖の分画は、 前記した硫酸化 N —ァセチルラ ク トサミ ンオリゴ糖の分 1—由了方法と同様、 通常の糖鎖の分離、 精製の手法を用いる ことができる。 例えば吸着クロマトグラフィー、 陰イオン交換クロマトグラフィ 一、 疎水性クロマ卜グラフィ一、 ゲル濾過法、 ゲル浸透クロマトグラフィー、 濾 紙電気泳動法、 濾紙クロマトグラフィー、 有機溶媒による分画、 あるいはこれら の組合わせ等の操作により行うことができるが、 これらに限定されるものではな い。
シアル酸残基を有する N —ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖 （シァリル N —ァセ チルラク トサミンオリゴ糖） と N—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖との分離方法 も、 特に限定されるものではないが、 例えばイオン交換クロマトグラフィーによ り行うことができる。 また、 分子サイズの異なる N—ァセチルラク 卜サミンオリ ゴ糖の相互分離の方法も特に限定されるものではないが、 例えば逆相系のカラム を用いたクロマ卜グラフィ一により、 メタノール濃度を 0から 20%まで上昇させ ることによって分離することができる。
以上の方法により、 本発明オリゴ糖である N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖 を製造することができる。 本発明オリゴ糖については後述する。
本発明方法は、 好ましくは、 ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、 硫酸基含量 が調整されたケラタン硫酸を上記酵素群（1 )〜（3)のいずれかに属する 1種または 2種以上の酵素で処理して硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を得る工程 (工程 1 ) 、 および、 硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を完全脱硫酸化 する工程 （工程 2 ) を含む。 なお、 工程 1には硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ン ォリゴ糖を分画する工程を含むことが好ましく、 また工程 2には N —ァセチルラ ク 卜サミ ンオリゴ糖を分幽 'する工程を含むことが好ましい。 これらの分画するェ 程は、 工程 1または工程 2の片方のみに含んでいても良いが、 分 (自'は硫酸基があ つた方が容易であることから、 工程 1に硫酸化 N —ァセチルラク トサミンオリゴ 糖を分画する工程を含むことがより好ましい。 また、 工程 1には硫酸化 N—ァセ チルラク トサミ ンオリゴ糖を分画する工程を含み、 かつ工程 2には N—ァセチル ラク トサミンオリゴ糖を分画する工程を含むことが特に好ましい。
また、 硫酸化 N —ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を得るにあたり、 ケラ夕ン硫 酸の部分的脱硫酸化または硫酸化の条件が、 ケラタン硫酸のグリコシド結合を切 断する作用を有する酵素が活性を失わない条件である場合には、 ケラタン硫酸の 部分的脱硫酸化または硫酸化と硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸の分解とを 同時に （例えば、 同一反応器内において） 行ってもよい。
本発明方法によれば、 ケラタン硫酸分解酵素の基質特異性に基づき、 通常に得 ることのできるケラタン硫酸をあらかじめ部分的に脱硫酸化することによって、 そのままのケラタン硫酸に上記酵素を作用させるよりも、 目的の分子サイズのォ リゴ糖を一層効率よく得ることができる。
なお、 本発明方法により製造される上記（1；)〜（6)の一般式で表される N—ァセ チルラク 卜サミ ンオリゴ糖に、 該 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖の非還元末 端糖を切り出すェキソ型グリコシダーゼを作用させることによって、 糖残基数が 1つ減少した N —ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖を得ることができる。 具体例を 次に示す。
ェキソ一 N—ァセチルグルコサミニダーゼを下記一般式（1)および（6)にそれぞ れ作用させると、 それぞれ下記一般式（23)〜（24)の N _ァセチルラク トサミ ンォ リゴ糖を得ることができる。
(GlcNAc-Gal) n ( 1) -→ Gal- (GlcNAc Gal)n - > (23)
Glc Ac- (Gal -GlcNAc) ,, (6) 一 （Gal- GlcNAc) ,, (24) (式中、 Galはガラク ト一ス残基を、 GlcNAcは N—ァセチルグルコサミン残基を、 -はグリコシド結合を、 nは 2〜6の整数をそれぞれ表す）
ェキソ一 /3—ガラク トシダーゼをド記一般式（3)および（5 )にそれぞれ作用させ ると、 それぞれ下記一般式（25)〜（26)の N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖を得 ることができる。
(Gal GlcNAc) ,, (3) 一 GlcNAc-(Gal GlcNAc) ,, - , (25)
Gal- (Glc Ac Gal) n (5) 一 (GlcNAc-Gal ) ,, (26)
(式中、 Galはガラク ト一ス残基を、 GlcNAcは N—ァセチルグルコサミン残基を、 -はグリコシド結合を、 πは 2〜6の整数をそれぞれ表す）
また、 例えば N—ァセチルノイラミニダーゼのようなシァりダーゼを適宜用い ることによって、 シアル酸が除去された N—ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖を得 ることもできる。
2 . 本発明オリゴ糖
本発明オリゴ糖は、 下記の方法によって得られ、 かつ下記の理化学的性質を有 するオリゴ糖である。
( 1) 方法：
ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、 硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸に ケラタン硫酸のグリコシド結合を切断する作用を有する酵素を作用させて生成物 を得、 次いで当該生成物を完全脱硫酸化することを特徴とする方法。
(2) 理化学的性質：
. アンスロン法により測定されるガラク 卜一ス残基含量が 3 5〜5 0重量％であ る。
•元素分析により測定される窒素含量が 3〜 4重量％である。
•マススぺク トロメ トリーにより測定される分子量が 1 0 0 0〜2 2 0 0である。 なお硫酸基含量の調整は、 部分的脱硫酸化により行うことが好ましい。
なお上記方法は、 少なくとも下記の工程 1および 2を含むことが好ましい。 工程 1 ：ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、 硫酸基含量が調整されたケラタ ン硫酸を下記酵素群（1)~ (3)のいずれかに属する 1種または 2種以上の酵素を作 用させて硫酸化オリゴ糖を得る工程。
酵素群（1) ：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用 ：
ケラタン硫酸の /9一ガラク トシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
• ^—ガラク トシド結合に関与するガラク トース残基の 6位に硫酸基を有する当 該 ーガラク トシド結合には作用しない。
• /3—ガラク トシド結合に関与するガラク トース残基 （6位に硫酸基を有さない） の非還元末端側に隣接する N -ァセチルグルコサミン残基の 6位の硫酸基の有無 にかかわらず当該 3—ガラク トシド結合に作用する。
酵素群 (2)： 下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用 ：
ケラタン硫酸の^一ガラク 卜シド結合を切断する。
(b)基質特異性：
• 一ガラク トシド結合に関与-するガラク 卜一ス残基の 6位に硫酸基を有する当 該^一ガラク トシド結合には作用しない。
• ^—ガラク トシド結合に関与するガラク 卜ース残基 （ 6位に硫酸 ¾を有さない:） の非還元末端側に隣接する N -ァセチルグルコサミン残基の 6位に硫酸基を有す る当該^一ガラク トシド結合には作用する。
• 3—ガラク トシド結合に関与するガラク トース残基 （6位に硫酸基を有さない） の非還元末端側に隣接する N -ァセチルダルコサミン残基の 6位に硫酸基を有さ ない当該 ーガラク トシド結合には作用しない。
酵素群 (3)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用 ：
ケラタン硫酸の /3— N—ァセチルグルコサミニド結合を切断する。
(b)基質特異性：
. 3— N—ァセチルグルコサミニド結合に関与する N—ァセチルグルコサミ ン残 基の 6位およびその N -ァセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガ ラク ト一ス残基の 6位にそれぞれ硫酸基を有する当該 /3— N—ァセチルダルコサ ミニド結合に作用する。
. — N—ァセチルグルコサミニド結合に関与する N—ァセチルグルコサミン残 基の 6位に硫酸基を冇し、 その N -ァセチルグルコサミ ン残基の非還元末端側に 隣接するガラク ト一ス残基の 6位には硫酸基を冇さない当該 /3— N—ァセチルグ ルコサミニド結合に作用する。
. 3— N—ァセチルグルコサミニド結合に関与する N—ァセチルグルコサミ ン残 基の 6位およびその N -ァセチルダルコサミ ン残基の非還元末端側に隣接するガ ラク トース残基の 6位のどちらにも硫酸基を有さない当該/?— N—ァセチルグル コサミニド結合には作用しない。
工程 2 ：硫酸化オリゴ糖を完全脱硫酸化する工程。
なお、 上記酵素群（1)に含まれる酵素としては、 エンド一 ^一ガラク トシダ一 ゼが好ましく、 例えばェシエリキア ' フロインディ （ scheridii§ freundii) 由 来のェンド一 —ガラク 卜シダ一ゼ （H. Nakaga a, T. Yatnada, J-し Chien, A. Gardas, M. Kitamikado, S - C. Li, Y T.Li, J. Biol.Chem. , 255, 5955(1980)；本 明細書中において、 単に 「E-Galase」 ということもある） が挙げられ、 かつ好ま しい。
上記酵素群（2)に含まれる酵素としては、 エンド—； 9—ガラク トシダーゼが好 ましく、 例えばシュ一 ドモナス（Pseudomonas) s p - IFO- 13309株由来のエン ド — S—ガラク トシダ一ゼ (K. Nakazawa, N. Suzuki, S.Suzuki, J. Biol. Chem. , 250, 905(1975)、 K. Nakazawa, S. Suzuki, J. Biol. Chem. , 250, 912(1975) ) や、 特公昭 5 7 - 4 1 2 3 6号公報に開示されているシユードモナス · レブティ リボーラ (Pseudmonas reptilivora)が産生するエンド一 /3—ガラク トシダ一ゼ （これらは、 本明細書中において、 単に 「ケラタナ一ゼ」 または 「KSase」 ということもある） が挙げられ、 かつ好ましい。
上記酵素群（3)に含まれる酵素としては、 ェンドー — N—ァセチルグルコサ ミニダ一ゼが好ましく、 例えばバチルス s p. K s 36 (Bacillus sp. s36) 由来のエンド— ー N_ァセチルグルコサミニダ一ゼ 〔橋本信一、 森川清志、 菊 池博、 吉田圭一、 徳安清親、 生化学、 60, 935 (1988) ；本明細書中において、 単 に 「ケラ夕ナ一ゼ II」 または 「KSaseII」 ということがある） や、 バチルス ·サ —キユランス K s T 202 (Bacillus circulans KsT202) 由来 （W〇 96/16 1 66号公報に記載） のェンドー /9— N -ァセチルダルコサミニダ一ゼ等が挙げ られ、 かつ好ましい。
また本発明オリゴ糖は、 前記理化学的性質に加えて、 チォバルビツール酸法に より測定されるシアル酸含量が 1 0〜20重量％であるものがより好ましい。 さらに本発明は、 下記一般式（1)〜（6)のいずれか 1つで表される新規な N—ァ セチルラク トサミ ンオリゴ糖を提供する。
(GlcNAc-Gal)„ (1)
SA Gal (GlcNAc Gal)n, (2)
(Gal-GlcNAc) n (3)
SA (Gal-GlcNAc)n, (4)
Gal-(GlcNAc-Gal) n (5)
GlcNAc-(Gal-GlcNAc)„ (6)
(式中、 Ga]はガラク ト一ス残基を、 G]cNAcは N—ァセチルグルコサミ ン残基を、 SAはシアル酸残基を、 はグリコシド結合を、 nは 1〜6の整数を、 mは 1〜10の整数 をそれぞれ表す。 ただし、 式（1)および (3)において πは 1ではない）
本発明オリゴ糖の製造方法は、 本発明オリゴ糖が得られる限りにおいて特に限 定されるものではないが、 本発明方法により得ることが好ましい。 本発明方法に ついては前述した。
例えば本発明方法によって本発明オリゴ糖を製造する場合、 例えば!;.記式（1) または（2)の N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を得たい場合には、 本発明方法 においてエンド一 /9—ガラク トシダ一ゼ型の酵素 （例えば、 酵素群（1)または（2) に属する酵素） を用いればよい。
例えば上記式（3)または（4)の N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖を得たい場合 には、 本発明方法においてェンド— 3— N—ァセチルグルコサミニダーゼ型の酵 素 （例えば、 酵素群（3)に属する酵素） を用いればよい。
また例えば上記式（5)または（6)の N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖を得たい 場合には、 本発明方法においてエンド一 ; S—ガラク トシダ一ゼ型の酵素 （例えば、 酵素群（1)または（2)に属する酵素） とエンド一 /3— N—ァセチルグルコサミニダ ーゼ型の酵素 （例えば、 酵素群（3)に属する酵素） の両方を用いればよい。
シアル酸残 ¾を含有する本発明オリゴ糖 （例えば上記式 (2)および (4) ) におい て、 シアル酸残基としては、 N—ァセチルノイラミン酸残基や N—グリコリルノ イラミ ン酸残基等が挙げられるが、 N—ァセチルノイラミ ン酸残基（NeuAc)であ ることが好ましい。
また上記式（1 )〜（6 )において nは 1〜6の整数である （ただし、 上記式（1 )お よび (3)において nは 1ではない） が、 長鎖の N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ 糖、 例えば n力 3〜 6の整数であるものが好ましく、 n力く 5〜 6の整数であるも のが特に好ましい。
また上記式（1 )〜（6)において ΙΏは 1〜 1 0の整数であるが、 畏鎖の N—ァセチ ルラク 卜サミ ンオリゴ糖、 例えば mが 3〜 1 0の整数であるものが好ましく、 m が 5〜 1 0の整数であるものが特に好ましい。
またシアル酸残基 (SA)と、 該シアル酸残基 (SA)の還元末端側に隣接するガラク 卜一ス残基（Gai )との間のグリコシド結合は、 α— 2 , 3グリコシド結合または a - 2、 6グリコシド結合であることが好ましい。 また、 ガラク 卜一ス残基 (Gal) と、 該ガラク トース残基 (Gal )の還元末端側に隣接する N—ァセチルグルコサミ ン残基（GlcNAc)との間のグリコシド結合は、 /3— 1 , 4グリコシド結合であるこ とが好ましい。 また、 N—ァセチルグルコサミン残基（GlcNAc)と、 該 N—ァセチ ルグルコサミ ン残基 (GicNAc)の還元末端側に隣接するガラク トース残基 (Gal )と の間のグリコシド結合は、 β - 1 , 3グリコシド結合であることが好ましい。 ま た前述した硫酸化 Ν—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖の完全脱硫酸化において述 ベたように、 特にシアル酸残基を有する硫酸化 Ν—ァセチルラク トサミ ンオリゴ 糖の完全脱硫酸化の条件については従来報告されておらず、 本発明者らによって 初めて見出された条件であり、 このことから本発明方法および本発明オリゴ糖に おける Ν—ァセチルラク トサミンオリゴ糖の中でも、 シアル酸残基を有する Ν— ァセチルラク トサミンオリゴ糖 （例えば上記式（1 )〜（6)中の（2)、 (4) ) が特に好 ましい。
本発明オリゴ糖の糖組成の分析は、 糖鎖工学分野で通常用いられる方法、 例え ばアンスロン法 （ガラク トース残基の定量） 、 アミノ糖分析 （Ν—ァセチルグル コサミ ン残基の定量） 、 チォバルビツール酸法 （TBA法； シアル酸残基の定量） によって行うことができるカ^ これらに限定されるものではない。 また、 硫酸基 含量は、 本発明オリゴ糖を塩酸で分解し、 イオンクロマトグラフィーにより分析 することによって分析することもできるカ^ この方法に限定されるものではない。 また、 本発明ォリゴ糖の分子サイズの分析方法も特に限定されるものではないが、 例えばゲル濾過クロマ卜グラフィ一および E-Galase処理後のォリゴ糖を分析する ことにより調べることができる。 また本発明オリゴ糖の糖鎖配列については、 例 えばグリコシダ一ゼによる逐次分解法によって調べることができる。
これらの分析方法を用いることによって本発明ォリゴ糖の同定が可能であり、 例えば本発明方法により得られる本発明オリゴ糖の確認にも用いることができる。 なお本発明オリゴ糖に、 例えばシアル酸残基、 フコース残基、 硫酸基、 セラミ ド等を適宜付加することもできる。 これらの物質の付加は化学的方法によって行 うこともできるカ 、 酵素を用いて行うことが好ましい。
例えば本発明ォリゴ糖にフコース残基を付加する場合は、 フコシルトランスフ ヱラーゼを用 、て本発明ォリゴ糖にフコース残基を転移させればよ L、。 この際、 フコース残基は N—ァセチルグルコサミン残基に結合させることが好ましく、 さ らに好ましくはひ一 1， 3グリコシド結合により N—ァセチルグルコサミ ン残基 に結合させることが好ましい。 よってこのような作用を有するフコシル卜ランス フェラーゼを用いることが好ましい。
また上記式（1)、 （3)、 （5)または（6)の本発明オリゴ糖にシアル酸残基を付加す る場合は、 シァリル卜ランスフヱラーゼを用いて本発明オリゴ糖にシアル酸残基 を転移させればよい。 この際、 シアル酸残基はガラク ト一ス残基に結合させるこ とが好ましく、 より好ましくは《— 2， 3グリコシド結合または α— 2， 6グリコ シド結合により非還元末端のガラク ト一ス残基に結合させることが好ましい。 よ つてこのような作用を有するシァリル卜ランスフェラーゼを用いることが好まし い。
また、 本発明オリゴ糖に硫酸基を付加する場合は、 スルホ卜ランスフヱラーゼ を用いて本発明オリゴ糖に硫酸基を転移させればよい。 スルホ卜ランスフヱラー ゼとしては、 コンドロイチン 6—スルホ卜ランスフェラーゼ （ Biol. Chem. , 268(29), 21968 21974, 1993) 等を挙げることができる。
また、 セラミ ドを付加する場合は、 本発明オリゴ糖の還元末端に結合させるこ とが好ましい。
これらの酵素は、 目的とするオリゴ糖に応じて適宜選択して用いることができ、 単独で用いてもよく、 また複数の酵素を同時に作用させてもよく、 また複数の酵 素を順次作用させてもよい。 実施例
以下、 本発明を実施例により説明する。
実施例 1
く 1 硫酸化 N -ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖の調製
1 一 1 . メタノール塩酸法によるケラタン硫酸の部分的脱硫酸化と、 硫酸化 N— ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖の調製
ケラタン硫酸 （以下 K Sともいう） は、 サメ軟骨から文献 （生化学， 33, 746 - 752, 1961 ) に従って調製したものを用いた。 構成二糖 1モル当たりの硫酸基の モル数は 1 . 7であった。
よく乾燥した K S 5 gを、 塩化ァセチル 5 mlを含む無水メタノール溶液 （0. 0 6N HCiに相当） 1 L中に懸濁し、 4°Cで振盪しながら反応させ、 0、 2. 5、 5、 10、 2 0 および 40時間反応時点で各 200mlを採取した。 それぞれの採取液について、 遠 心分離により不溶物を回収し、 これを蒸留水に溶解して、 0. 01規定の水酸化ナト リウムで中和し、 透析、 脱塩した後に 50 mlまで濃縮し、 エタノールを 5 倍容 加えて沈殿を冋収した。 沈殿をエタノール、 エーテルで順次洗浄して、 乾燥粉末 を回収した。 0、 2. 5、 5、 10、 20および 40時間の反応生成物の構成二糖 1モル当 たりの硫酸基のモル数は、 それぞれ、 1. 7、 1. 3、 1. 2、 1. 0、 0. 9および 0. 8であつ た。
得られた乾燥粉末各 100 mgに対して、 10 m lの 20 mM 酢酸緩衝液（pH 6. 5)を加 えて溶解し、 これに 1ュニッ 卜のケラタナ一ゼ I I (KSase I I、 生化学工業株式会 社製 ； 1ュニッ ト（U)は、 pH 6. 5、 37°Cで 1時間にケラタン硫酸 （ゥシ角膜由来 ；生化学工業株式会社製） から 1 モルの還元基 （N—ァセチルダルコサ ΐ ン） を遊離する酵素量である） を加えて、 37°Cで 12時間酵素消化した。 酵素消化後の 溶液に終濃度 0. 2Mとなるように NaClを添加し、 セル口ファイ ン GCL- 90sf rCel lulofine GCL-90si；生化学工業株式会社製） カラム （2 x 90 cm) にアブ ライして、 0. 2 M NaClを用いてゲル濾過を行い、 溶出した硫酸化 N—ァセチルラ ク トサミ ンオリゴ糖をアンスロン法 （別冊 蛋白質 核酸 酵素、 生物化学実験法 XI、 —糖質実験法一、 P15、 （1968)、 共立出版） により検出した。 メタノール塩 酸法による K Sの部分的脱硫酸化の時間と、 6〜 1 2糖の硫酸化 N—ァセチルラ ク 卜サミンオリゴ糖の生成率との関係を図 1に示す。 なお、 6〜 1 2糖の硫酸化 N—ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖の生成率は、 ゲル濾過により得られる硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖の溶出曲線と時間軸により囲まれる図形の全 面積に対する、 6〜 1 2糖の硫酸化 N—ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖に相当す る画—分が占める面積の割合として算出した。
図 1に示した通り、 K Sの部分的脱硫酸化を行わなかった場合 （すなわちメタ ノール塩酸法による反応時間が 0時間の場合） の 6〜 1 2糖の硫酸化 N—ァセチ ルラク トサミ ンオリゴ糖の生成率は約 1 0 %であった。 これに対し、 メタノール 塩酸法による K Sの部分的脱硫酸化を 4 において 4 0時間以内で行つた場合に は、 6〜 1 2糖の硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖の生成率は約 2〜4 倍増加した。
特に、 部分的脱硫酸化の時間が 2. 5〜20時間の場合には、 生成率は約 3 0 %以 上であり、 部分的脱硫酸化の時間が 5〜10時間の場合には、 生成率は約 4 0 %に も達した。 このことから、 1Uの KSase I Iを用いて 37°Cで 12時間 K Sを酵素消化 することによって 6〜 1 2糖の硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を得る 場合、 K Sをメタノール塩酸法により 4 °Cで部分的脱硫酸化する時間は、 4 0時 間以下 （0時間を除く） が好ましく、 2. 5〜20時間がより好ましく、 5〜 10時間 が特に好ましいことは、 当業者であれば容易に理解される。
1 - 2 . D M S O法による K Sの部分的脱硫酸化と、 硫酸化 N—ァセチルラク 卜 サミンオリゴ糖の調製
K S 1 gを 40 mlの水に溶解し、 Dowex 50WX(H\ 100-200 mesh； ダウケミカ ル社製） カラムを通過させた後、 ピリジンで中和してピリジニゥム塩とし、 凍結 乾燥した。 この凍結乾燥物の収量は 980 mgであった。
KSのピリジニゥム塩の凍結乾燥物 800 mg を 80 ml の 90% DMSO(10% H20) に溶解し、 20 mlづっ 4 画分に分け、 それぞれを 40、 50、 60、 70 または 80°Cで 3時間反応させ、 当容量の水を加えて反応を停止させた。 それぞれの反応溶液を 一晩流水中で透析した後、 4 mlまで濃縮し、 これを 2 mlづっ 2等分し、 一方に 10 mM 酢酸カルシウムを含む 250 mM酢酸緩衝液 (pH 6)を、 他方に 100 mM 酢酸緩衝 液（pH 6.5)をそれぞれ 0.5 ml 加え、 前者に Escherichia freundii由来のェンド _ ^一ガラク トシダーゼ （E- Galase、 生化学工業株式会社製； 1ュニッ 卜（II)は、 pH 5.8、 37°Cで 1分間にケラタン硫酸から 1 ^モルのガラク 卜一スに相当する遝 元基を遊離する酵素量である） 、 後者に KSase II をそれぞれ 1 ュニッ ト加えて、 37QCで 5 時間酵素消化した。 酵素消化後の溶液は、 前記 1一 1 と同様にゲル濾過 を行い、 生成した硫酸化 N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖を分画した （図 3) 。 DMSO法による KSの部分的脱硫酸化時の温度と、 6〜 1 2糖の硫酸化 N—ァ セチルラク トサミ ンオリゴ糖の生成率との関係を図 2に示す。 6〜 1 2糖の硫酸 化 N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖の生成率は、 前記 1一 1と同様に算出した。 図 2に示した通り、 酵素消化において Escherichia f reundii由来のェンドー /3 一ガラク トシダ一ゼを用いる場合には、 DMSO法による KSの部分的脱硫酸化 の温度が約 50〜70°Cのときには、 6〜1 2糖の硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ン オリゴ糖の生成率は約 20%以上となり、 部分的脱硫酸化の温度が 60°Cのときに は生成率が約 40 %にも達した。
また、 酵素消化において KSase IIを用いる場合には、 DMSO法による KSの 部分的脱硫酸化の温度が約 65°C以上のときには、 6〜 1 2糖の硫酸化 N -ァセチ ルラク 卜サミ ンオリゴ糖の生成率は約 20%以上となり、 部分的脱硫酸化の温度 が 70 のときには生成率が 30%、 80°Cのときには生成率が約 40%にも達した。 これらの結果から、 1Uの Escherichia freundii由来のェンドー S—ガラク 卜シダ ーゼを用し、て 37°Cで 5時間 K Sを酵素消化することによって 6〜 1 2糖の硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を得る場合、 KSを DMS◦法により 3時間 部分的脱硫酸化するときの温度は、 約 50〜70°Cが好ましく、 60°Cがより好ましい ことは、 当業者であれば容易に理解される。 また、 1Uの KSase IIを用いて 37°C で 5時間 K Sを酵素消化することによって 6〜 1 2糖の硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を得る場合、 KSを DMSO法により 3時間部分的脱硫酸化す るときの温度は、 約 65°C以上が好ましく、 70°C以上がより好ましく、 80°Cが極め て好ましいことは、 当業者であれば容易に理解される。
なお、 K Sを DMS◦法により 3時間部分的脱硫酸化する時の温度が 40、 50、 60、 70および 80°Cのときの反応生成物 （硫酸基含量が調整された KS ) の構成二 糖 1モル当たりの硫酸基のモル数は、 それぞれ、 1.6、 1.4、 1.0、 0.8および 0.3 であった。
< 2 硫酸化 N—ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖の完全脱硫酸化と、 N—ァセ チルラク トサミ ンオリゴ糖の分画
2 - 1. 硫酸化 N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖の完全脱硫酸化
乾燥 S 10 gを、 前記 1一 1 と同様に、 メタノ一ル塩酸で 10時間反応し、 KSase II消化およびゲルろ過分画で処理し、 得られた硫酸化 N—ァセチルラク 卜 サミ ンオリゴ糖の 6〜 1 2糖相当の画分を分取、 脱塩、 凍結乾燥して回収した。 収量は 3.8 gであった。
この乾燥粉末 3 gを 0.01規定の塩酸 ·メタノール溶液 100 mlに懸濁し、 室温 で 20 時間ゆつく り攪拌した。 反応後の溶液は、 0.01規定の水酸化ナトリゥムで 中和し、 溶媒を乾燥除去後、 これに水を加えてセル口フ ァイ ン GCい 25 (Cellulofine GCL- 25；生化学工業株式会社製） のカラムを用いて脱塩し、 これ を凍結乾燥して N—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖を得た。 収量は 2.5 β (ガラ ク ト一ス ； 32.4%、 シアル酸； 1.8%であった）
2 - 2. Ν—ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖の分画
上記 2— 1で得られた Ν—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖の凍結乾燥粉末 2 g を水 50 mlに加温しながら溶解し、 予め 5mM NaCl溶液で平衡化した Dow'ex 1x8 Cr, 200 400 meshカラム （3 x 50 cm； ダウケミカル社製） に通し、 同溶液 1 しで洗浄した。 その後、 5mM〜200mMの NaCl溶液 2 Lによる直線濃度勾配により溶 出し、 アンスロン法およびチォバルビツール酸法によりガラク 卜一スおよびシァ ル酸をそれぞれ検出し、 陽性画分を回収した。 素通り溶液のアンスロン陽性画分 を濃縮し、 セルロフアイン GCレ 90sf (Cellulofine GCい 90sf ；生化学工業株式 会社製） カラム （4 X 100 cm ) を用いて、 水を溶媒としてゲルろ過を行った。 溶出物をアンスロン法で検出し、 6、 8、 10、 12糖に相 ¾するピーク部分を集め、 濃縮、 脱塩し、 凍結乾燥した （収量は 6糖が 253 mg, 8糖が 324 mg, 10糖が 185 mg, 12糖が 54 であった） 。 このうち、 10糖のもの 100 mgを水 10 mに溶解して、 0DSカラム、 ダイソーパック SP 120- 25- 0DS-B (ダイソ一株式会社製； 2 x 50 cm) へ 2 mlづっ 5回アプライし、 水から 20%メタノール溶液までの濃度勾配系を用い て溶出させ、 10糖画分を濃縮し、 凍結乾燥して回収した。 収量は 78 mgであった。 同様にして、 8糖、 6糖画分それぞれ 100 mgから精製粉末をそれぞれ 85 mg, 82 mg回収した。
他方、 Dowex カラム吸着に吸着し、 5mM〜200mMの NaCl溶液 2 Lによる直線濃度 勾配によって溶出されたチォバルビツール酸陽性画分濃縮液も同様に、 セルロフ ァイン GCL 90sf ( Cel lulof ine GCL-90sf) カラムに負荷し、 0. 2 NaCl溶液でゲ ル濾過を行い、 9糖、 11糖、 13糖相当画分を集め、 それぞれを同カラムでゲル濾 過を繰り返して精製し、 脱塩、 凍結乾燥した。 その結果、 9糖、 11糖、 13糖のシ ァリル N—ァセチルラク トサミ ンォリゴ糖 （N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖 の非還元末端にシアル酸残基が付加されている） をそれぞれ 12 mg、 15 mg、 7 m 得た。
このうち、 6糖、 8糖、 10糖、 9糖、 11糖、 13糖の画分についてそれぞれシァ ル酸含量、 ガラク トース含量および窒素含量を測定した。 なおシアル酸含量はチ ォバルビツール酸法、 ガラク 卜ース含量はアンスロン法、 窒素含量は元素分析に より測定した。 結果を表 2に示す。
表 2 シアル酸含量（重量 <½) 力"ラクト -ス含量 (雷景％) 窒素含量（重量
6糖 46.2 3.53
8糖 46.8 3.51
10糖 46.9 3.54
9糖 16.8 38.5 3.75
11糖 13.4 40.1 3.72
13糖 11.8 41.3 3.70
(表 2中の 「―」 は、 検出されなかったことを示す〉 さらに、 上記の 6糖、 8糖、 10糖、 11糖の画分について、 質量分析を行った。 質量分析は、 高速原子衝撃マススぺク 卜ロメ トリー （FABマススぺク 卜ロメ ト リ 一） により行った。 ポジティブ FABマススペク トルおよびネガティブ FABマススぺ ク トルから読みとれるメインピークの m/z値を表 3に示した。 また質量分析から 得られる分子量 （表中の 「測定値」 ) 、 および構造式から求められる分子量 （表 中の 「理論値」 ) も表 3に併せて示した。
¾3 ホ°シ "ティフ" FABマス 本力" ίィフ" FABマス フ 十—，.
(m/z) (m/z) 測定値 理論値
6掂 1114 [M H]+ 1112 [M-H] 1113 1114
1136 [M+Na]'
8糖 1479.1 [MtH] 1477.3 [M-H] 1478 1480
1501 [M^Na]
10糖 1844.7 [Μ+ΗΓ 1843.0 [Μ-Η]' 1843 1845
1865.8 [M-fNa]
11糖 2136.7 [Μ+ΗΓ 2133.6 [Μ Η] 2136 2136
2158.8 [M^Na]1
2181.3 [M-H+2Na] + 表 3中の 「測定値」 は、 質量分析から得られた分子量である。
表 3中の 「理論値」 は、 下記の構造式から求めた分子量である。
6糖 ： （Ga卜 GlcNAc)3
8糖： (Gal-GlcNAc).
10糖： (Gal - GlcNAc)r,
11糖： NeuAc-(Gal-GlcNAc)r,
(式中、 Galはガラク トース残基を、 GlcNAcは N—ァセチルグルコサミン残基を、 NeuAcは N—ァセチルノイラミン酸残基を、 はグリコシド結合をそれぞれ表す） 表 3の結果から、 本発明により得られた N—ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖の 分子サイズ （分子量） が理論値にほぼ一致していることが確認された。 また、 微 妙に分子サイズ （分子量:） が異なる N—ァセチルラク 卜サミ ンォリゴ糖を、 分 f サイズに応じて分取できることが確認された。
またこの結果から、 表 2中の 9糖が NeuAc- (Gaj -G lcNAc) ,, であること、 13糖が NeuAc-(Gal -GlcNAc) (i であることが示唆された。 産業上の利用可能性
本発明により、 新規な N -ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖および新規な N—ァ セチルラク トサミ ンオリゴ糖の製造方法が提供される。 本発明オリゴ糖は、 天然 に微量しか存在しないセレクチンファミ リーのリガンド糖鎖の合成の素材として 利用することができる。 セレクチンフアミ リーのリガンド糖鎖は、 新規な医薬品、 特に抗炎症剤として利用することができる。
また本発明方法 1により、 工業的規模かつ安価に本発明オリゴ糖を生産するこ とができる。
また本発明方法 2により、 本発明オリゴ糖の製造中間体として有用な硫酸化 N —ァセチルラク トサミンオリゴ糖を、 工業的規模かつ安価に生産することができ る。 また、 この硫酸化 N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖は、 新規な生理活性を 有する可能性もあり、 医薬品としての利用も期待される。

Claims

請求の範囲
1 . ケラタン硫酸の硫酸 ¾含量を調整し、 硫酸基含量が調整されたケラ夕ン硫 酸にケラタン硫酸のグリコシド結合を切断する作用を有する酵素を作用させて硫 酸化 N -ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖を得、 次いで得られた該硫酸化 N—ァセ チルラク トサミ ンオリゴ糖を完全脱硫酸化する工程からなる N—ァセチルラク ト サミンオリゴ糖の製造方法。
2 . 少なく とも下記の工程 1および 2を含むことを特徴とする N—ァセチルラ ク トサミ ンオリゴ糖の製造方法。
工程 1 ：ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、 硫酸基含量が調整されたケラ夕 ン硫酸を下記酵素群（1)〜（3)のいずれかに属する 1種または 2種以上の酵素を作 用させて硫酸化 N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を得る工程。
酵素群（1)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用 ：
ケラタン硫酸の yS —ガラク トシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
• β— ϋラク トシド結合に関与するガラク トース残基の 6位に硫酸基を有する当 該 —ガラク 卜シド結合には作用しない。
• )S—ガラク トシド結合に関与するガラク 卜一ス残基 （6位に硫酸基を有さない） の非還元末端側に隣接する N -ァセチルグルコサミン残基の 6位の硫酸基の有無 にかかわらず当該 yS —ガラク トシド結合に作用する。
酵素群 (2) ：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用 ：
ケラタン硫酸の^ 一ガラク トシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
• ーガラク トシド結合に関与するガラク トース残基の 6位に硫酸基を有する当 該 —ガラク トシド結合には作用しない。
• /3—ガラク トシド結合に関与するガラク 卜ース残基 （6位に硫酸基を有さない:) の非還元末端側に隣接する N -ァセチルグルコサミン残基の 6位に硫酸基を有す る当該 /3—ガラク トシド結合には作用する。 • ーガラク トシド結合に関与.するガラク 卜ース残基 （6位に硫酸基を有さない） の非還元末端側に隣接する N—ァセチルダルコサミ ン残基の 6位に硫酸基を有さ ない当該/ S—ガラク トシド結合には作用しない。
酵素群（3)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用 ：
ケラタン硫酸の — N—ァセチルグルコサミ二ド結合を切断する。
(b)基質特異性：
. ；9— N—ァセチルグルコサミニド結合に関与する N—ァセチルグルコサミン残 基の 6位およびその N -ァセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガ ラク トース残基の 6位にそれぞれ硫酸基を有する当該 /5 - N—ァセチルグルコサ ミニド結合に作用する。
• /3— N—ァセチルグルコサミ二ド結合に関与する N—ァセチルグルコサミン残 基の 6位に硫酸基を有し、 その N—ァセチルグルコサミン残基の非還元末端側に 隣接するガラク トース残基の 6位には硫酸基を有さない当該/?一 N—ァセチルグ ルコサミニド結合に作用する。
. /3— N—ァセチルダルコサミニド結合に関与する N—ァセチルグルコサミン残 基の 6位およびその N -ァセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガ ラク トース残基の 6位のどちらにも硫酸基を有さない当該； 3— N—ァセチルグル コサミニド結合には作用しない。
工程 2 ：硫酸化 N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖を完全脱硫酸化して、 N— ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖を得る工程。
3 . 前記工程 1が硫酸化 N—ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖を分画する工程を 含み、 前記工程 2が N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖を分幽'する工程を含むこ とを特徴とする請求の範囲第 2項記載の N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖の製 造方法。
4 . 前記酵素群（1 )に属する酵素が、 ェシエリ キア · フ 口イ ンディ (Escherichia freundii ) 由来のエンド一 S—ガラク トシダ一ゼである嘗 求の範 囲第 2 ¾または第 3項記載の N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖の製造方法。
5 . 前記酵素群（2)に属する酵素が、 シユー ドモナス s p . (Pseudomonas sp. ) 由来のエンド一 3—ガラク トシダ一ゼである請求の範囲第 2項〜第 4項の いずれか 1項に記載の N—ァセチルラク 卜サミ ンオリゴ糖の製造方法。
6. 前記酵素群（3)に厲する酵素が、 バチルス s p. K s 36 (Bacillus sp. Ks36) 由来、 またはバチルス ' サ一キュラ ンス K s T 2 0 2 (Bacillus circulans KsT202) 由来のエンド一 S— N—ァセチルグルコサミニダーゼである 請求の範面第 2項〜第 5項のいずれか 1項に記載の N-ァセチルラク 卜サミ ンォ リゴ糖の製造方法。
7. 前記硫酸化 N—ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖の糖鎖骨格が、 下記一般式 (1)〜（6)のいずれか 1つで表される請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれか 1項に 記載の N—ァセチルラク 卜サミンオリゴ糖の製造方法。
(GlcNAc-Gal) n (1)
SA-Gal-(GlcNAc-Gal)n, (2)
(Gal -GlcNAc) n (3)
SA- (Gal-GlcNAc)m (4)
Gal (GlcNAc- Gal) n (5)
GlcNAc- (Gal- GlcNAc) n (6)
(式中、 Galはガラク トース残基を、 GlcMcは N—ァセチルグルコサミ ン残基を、 SAはシアル酸残基を、 -はグリコシド結合を、 nは 1〜6の整数を、 mは 1〜10の整数 をそれぞれ表す）
8. 前記 N -ァセチルラク トサミンオリゴ糖が、 下記一般式（1)〜（6)のいずれ か 1つで表される請求の範囲第 1項〜第 7項のいずれか 1項に記載の N—ァセチ ルラク 卜サミンオリゴ糖の製造方法。
(GlcNAc Gal) n (1)
SA-Gal (GlcNAc^Gal)m (2)
(Gal -GlcNAc) n (3)
SA (Gal^GlcNAc)„, (4)
Gal (GlcNAc-Gal)n (5)
GlcNAc- (Gal -GlcNAc)n (6)
(式中、 Galはガラク トース残基を、 GlcNAcは N—ァセチルグルコサミン残基を、 SAはシアル酸残基を、 -はグリコシド結合を、 nは 1〜6の整数を、 mは 1〜10の整数 をそれぞれ表す）
9 . 少なくとも下記の丁-程を含むことを特徴とする硫酸化 N—ァセチルラク ト サミンオリゴ糖の製造方法。
工程： ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、 硫酸基含量が調整されたケラタン 硫酸を下記酵素群（1)〜（3)のいずれかに属する 1種または 2種以上の酵素を作用 させて硫酸化 N—ァセチルラク トサミンオリゴ糖を得る工程。
酵素群（1 ) ：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用 ：
ケラタン硫酸の 一ガラク トシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
• ^一ガラク トシド結合に関与するガラク ト一ス残基の 6位に硫酸基を有する当 該 /3—ガラク 卜シド結合には作用しない。
■ 3—ガラク トシド結合に関与するガラク トース残基 （6位に硫酸基を有さない） の非還元末端側に隣接する N -ァセチルグルコサミ ン残基の 6位の硫酸基の有無 にかかわらず当該; S —ガラク トシド結合に作用する。
酵素群 (2)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用 ：
ケラタン硫酸の^一ガラク トシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
• 9一ガラク トシド結合に関与するガラク トース残基の 6位に硫酸基を有する当 該 3—ガラク トシド結合には作用しない。
• ；8—ガラク トシド結合に関与するガラク ト一ス残基 （6位に硫酸基を有さない） の非還元末端側に隣接する N -ァセチルグルコサミン残基の 6位に硫酸基を有す る当該; S —ガラク トシド結合には作用する。
• ；3—ガラク トシド結合に関与するガラク ト一ス残基 （6位に硫酸基を有さない） の非還元末端側に隣接する N -ァセチルグルコサミン残基の 6位に硫酸基を有さ ない当該 /3—ガラク トシド結合には作用しない。
酵素群 (3)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群 (a)作用 ：
ケラタン硫酸の — N—ァセチルダルコサミ二ド結合を切断する。
(b)基質特異性：
• 3— N -ァセチルグルコサミ二ド結合に関与する N—ァセチルダルコサミン残 基の 6位およびその N—ァセチルグルコサミ ン残基の非還元末端側に隣接するガ ラク 卜一ス残基の 6位にそれぞれ硫酸基を有する当該 /9— N—ァセチルグルコサ ミニド結合に作用する。
• 3— N—ァセチルダルコサミニド結合に関与する N—ァセチルグルコサミン残 基の 6位に硫酸基を有し、 その N—ァセチルグルコサミ ン残基の非還元末端側に 隣接するガラク トース残基の 6位には硫酸基を有さない当該; 5— N—ァセチルダ ルコサミニド結合に作用する。
. 3— N—ァセチルグルコサミニド結合に関与する N—ァセチルダルコサミ ン残 基の 6位およびその N—ァセチルグルコサミ ン残基の非還元末端側に隣接するガ ラク ト一ス残基の 6位のどちらにも硫酸基を有さない当該 /3— N—ァセチルグル コサミニド結合には作用しない。
1 0 . 下記の方法によって得られ、 かつ下記の理化学的性質を有するオリゴ糖。
( 1 ) 方法：
ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、 硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸に ケラタン硫酸のグリコシド結合を切断する作用を有する酵素を作用させて生成物 を得、 次いで当該生成物を完全脱硫酸化することを特徴とする方法。
(2) 理化学的性質：
アンスロン法により測定されるガラク ト一ス残基含量が 3 5〜 5 0重量％であ る。
元素分析により測定される窒素含量が 3〜 4重量％である。
マススぺク 卜ロメ トリーにより測定される分子量が 1 0 0 0〜 2 2 0 0である。
1 1 . 前記方法が、 少なく とも下記の工程 1および 2を含むことを特徴とする 請求の範囲第 1 0項記載のォリゴ糖。
て程 1 ：ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、 硫酸基含量が調整されたケラタ ン硫酸を下記酵素群（1)〜（3)のいずれかに属する 1種または 2種以上の酵素を作 用させて硫酸化オリゴ糖を得る工程。
酵素群（1)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用 ：
ケラタン硫酸の /3—ガラク トシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
• ;9一ガラク トシド結合に関与するガラク トース残基の 6位に硫酸基を有する当 該 3—ガラク 卜シド結合には作用しない。
• β—iiラウ トシド結合に関与するガラク トース残基 （6位に硫酸基を有さない） の非還元末端側に隣接する N -ァセチルグルコサミン残基の 6位の硫酸基の有無 にかかわらず当該 /3—ガラク トシド結合に作用する。
酵素群 (2)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用 ：
ケラタン硫酸の /3—ガラク トシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
• /3—ガラク トシド結合に関与するガラク ト一ス残基の 6位に硫酸基を有する当 該 3—ガラク トシド結合には作用しない。
• 一ガラク トシド結合に関与するガラク ト一ス残基 （6位に硫酸基を有さない） の非還元末端側に隣接する N -ァセチルダルコサミ ン残基の 6位に硫酸基を有す る当該 5—ガラク トシド結合には作用する。
• ーガラク トシド結合に関与するガラク トース残基 （6位に硫酸基を有さない） の非還元末端側に隣接する N -ァセチルグルコサミン残基の 6位に硫酸基を有さ ない当該 ;9—ガラク トシド結合には作用しない。
酵素群 (3) ：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用 ：
ケラタン硫酸の^— N—ァセチルダルコサミニド結合を切断する。
(b)基質特異性：
• /3— N—ァセチルダルコサミ二ド結合に関与する N—ァセチルグルコサミ ン残 基の 6位およびその N—ァセチルグルコサミ ン残基の非還元末端側に隣接するガ ラク ト一ス残基の 6位にそれぞれ硫酸基を有する当該 /3 - Nーァセチルダルコサ ミニド結合に作用する。
- /9— N—ァセチルグルコサミニド結合に関与する N—ァセチルグルコサミ ン残 基の 6位に硫酸基を有し、 その N -ァセチルグルコサミ ン残基の非還元末端側に 隣接するガラク 卜一ス残基の 6位には硫酸基を有さない当該S— N—ァセチルグ ルコサミニド結合に作用する。
• ； S— N—ァセチルグルコサミニド結合に関与する N—ァセチルグルコサミン残 基の 6位およびその N—ァセチルグルコサミ ン残基の非還元末端側に隣接するガ ラク ト一ス残基の 6位のどちらにも硫酸基を有さない当該 3 _ N—ァセチルダル コサミニド結合には作用しない。
工程 2 ：硫酸化オリゴ糖を完全脱硫酸化する工程。
1 2. 下記 -般式（1)〜（6)のいずれか 1つで表される N—ァセチルラク トサミ ンオリゴ糖。
(GlcNAc Gal)n (1)
SA-Gal (GlcNAc-Gal)m (2)
(Gal-GlcNAc)n (3)
SA-(Gal-GlcNAc)n, (4)
Gal-(GlcNAc-Gal)n (5)
GlcNAc-(Gal-GlcNAc)n (6)
(式中、 Galはガラク トース残基を、 GlcNAcは N -ァセチルダルコサミン残基を、 SAはシアル酸残基を、 -はグリコシド結合を、 nは 1〜6の整数を、 mは 1〜10の整数 をそれぞれ表す。 ただし、 式（1)および（3)において ηは 1ではない）
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