JPH0699485B2

JPH0699485B2 - 合成コンドロイチン多硫酸の製造法

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Publication number: JPH0699485B2
Application number: JP59168899A
Authority: JP
Inventors: 金蔵長沢; 英樹内山; 勝清桜井
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1984-08-14
Filing date: 1984-08-14
Publication date: 1994-12-07
Anticipated expiration: 2009-12-07
Also published as: JPS6147701A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、合成コンドロイチン多硫酸及びその製造法に
関し、更に詳しくは、N-アセチルガラクトサミン残基の
６位水酸基が選択的に高度に硫酸化されている合成コン
ドロイチン多硫酸及びその製造法に関する。

［従来技術及びその問題点］コンドロイチン硫酸Ｅ（以下「CSE」という）及びコン
ドロイチン硫酸Ｈ（以下「CSH」という）は、繰返し二
糖に対する硫酸基のモル比が１より大きいコンドロイチ
ン多硫酸であり、CSEは、瀬野ら（N.Seno,et al.;J.Bio
chem.（Tokyo），60,258（1966））によって、スルメイ
カ軟骨から発見され、CSHは、瀬野ら（N.Seno,et al.;B
iochim.Biophys.Acta,227,173（1971））によって、ヌ
タウナギ及びメクラウナギの脊索から発見されている。

CSE及びCSHは、原料の収集が困難であることや収率が低
いこと、例えば、CSEは新鮮なスルメイカ頭部軟骨100g
（約80個体）から約60mg、CSHは16匹のヌタウナギから4
5mgしか得られないように、大量に入手することが困難
なため、CSE及びCSHの有する生理的な役割や生化学的作
用について詳細に報告されていない。しかし、遺伝性ム
コ多糖代謝異常症の一つであるハーラー症候群（Hurle
r′s syndrome）の患者尿中のムコ多糖は、ヘパリチン
硫酸やデルマタン硫酸が異常に多く、その分解酵素の欠
損のためと知られているが、その他デルマタン多硫酸も
多いことが知られていて何等かの重要な生理的意義を有
していると思われる。また、コンカナバリンＡで処理さ
れた脾細胞から誘導された培養液を加えてマウスの骨髄
細胞を培養した場合、骨髄由来の肥満細胞中に産生する
グリコサミノグリカンはCSEであることがスチーブンス
ら（R.L.Stevens,et al.;The Journal of biological C
hemistry,257（12）,7229（1982））によって報告さ
れ、CSEの有する生理学的意義について検討し始められ
ている。更に、高間弘道ら（高間弘道；日本皮膚科学会
雑誌，86,363（1976）：高間弘道，大橋勝，小林敏夫，
青山久，岩田久；熱傷，１,47（1976））は、熱傷後、
瘢痕ケロイドの形成過程における重要な時期の肉芽のプ
ロテオグリカン多糖部分の研究でCSEの繰返し単位の糖
について報告している。以上のように、生体及び細胞の
ムコ多糖全体の存在意義を生理学的・生化学的に調べる
ことは非常に重要になってきている。

しかしながら、これらの天然のコンドロイチン多硫酸に
類似の、又はそれ以上の硫酸化率を有するコンドロイチ
ン多硫酸を合成により得ることは、N-アセチルガラクト
サミン残基の６位水酸基を選択的に硫酸化することが困
難なため、容易でない。

そこで、本発明者らは、N-アセチルガラクトサミン残基
の６位水酸基を選択的に硫酸化する方法を開発すべく、
鋭意研究を重ねた結果、コンドロイチン‐4-硫酸又はデ
ルマタン硫酸の塩を極性有機溶媒中、均一な溶液状態に
おいて、硫酸化剤で処理することにより、N-アセチルガ
ラクトサミン残基の６位水酸基が選択的に高度に硫酸化
された合成コンドロイチン多硫酸を得ることに成功し、
本発明を完成するに至った。

［発明の構成］即ち、本発明の方法により得られる合成コンドロイチン
多硫酸及びその塩は、次式（Ｉ）：（式中、R₁O、R₂O、R₃O及びR₄Oは、硫酸基又は水酸基を
表わし、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい
が、分子中において、R₁Oの硫酸化率が20〜100％であ
り、R₂Oの硫酸化率が20〜100％であり、R₃O及びR₄Oのそ
れぞれの硫酸化率が25％以下であり、Ｘは、カルボキシ
ル基又は水素原子を表わし、分子中におけるＸどうしは
同一であっても、異なっていてもよく、Ｙは、Ｘがカル
ボキシル基を表わすときには水素原子を表わし、Ｘが水
素原子を表わすときにはカルボキシル基を表わす。）で示される二糖単位の繰返しからなり、分子中のイオウ
含有率が7.3〜12.5％で、分子量が5000〜100000である
ことを特徴とするものである。

本発明の方法によれば、前記の合成コンドロイチン多硫
酸又はその塩は、次のようにして製造することができ
る。

即ち、コンドロイチン‐4-硫酸又はデルマタン硫酸の塩
を極性有機溶媒に予め溶解し、その溶液を極性溶媒中均
一な溶液状態において、−20℃〜20℃で硫酸化剤で処理
することにより製造することができる。

コンドロイチン‐4-硫酸の塩としては、通常、分子量10
000〜40000のものを用い、デルマタン硫酸の塩として
は、通常、分子量10000〜30000のものを用いる。塩の種
類は、用いる極性溶媒の種類によって異なり、用いる溶
媒に均一に溶解し得るものを用いることが必要である。

極性有機溶媒としては、極性を有し、コンドロイチン‐
4-硫酸又はデルマタン硫酸の塩を均一に溶解し得る有機
溶媒であれば、如何なるものでもよいが、例えば、ピリ
ジン、キノリン、ピコリン、ルチジンなどの芳香族複素
環系塩基；メチルアニリン、ジメチルアニリン、ジエチ
ルアニリンなどの芳香族塩基；ジオキサン、テトラヒド
ロフラン、ジイソプロピルエーテルなどのエーテル類；
ホルムアミド、アセトアミド、ジメチルホルムアミドな
どのカルボン酸アミド類；ジメチルスルホキシド、ニト
ロメタン及びアセトニトリル等が挙げられ、特に、ピリ
ジン、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシドが好ましい。

反応を均一系で行なうには、極性有機溶媒として、ホル
ムアミド、ジメチルスルホキシドなどを用いる場合に
は、コンドロイチン‐4-硫酸又はデルマタン硫酸は、ナ
トリウム塩、カリウム塩、トリ‐n-ブチルアミン塩、ト
リ‐n-ヘキシルアミン塩、トリ‐n-オクチルアミン塩な
どとして用いることができるが、極性有機溶媒として、
ジメチルホルムアミドなどを用いる場合には、コンドロ
イチン‐4-硫酸又はデルマタン硫酸は、トリ‐n-ブチル
アミン、トリ‐n-ヘキシルアミン、トリ‐n-オクチルア
ミンなどのトリアルキルアミン等の塩基との塩として用
いることが必要である。

硫酸化剤としては、三酸化イオウとピリジン等の第三級
アミンもしくはジメチルホルムアミドとの複合体が挙げ
られるが、用いる極性有機溶媒に応じて、反応が均一系
で行なえるものを用いることが好ましい。

硫酸化反応における反応温度は、硫酸化剤の種類、用量
によって異なるが、通常−20℃〜20℃であり、特に０〜
20℃であることが好ましい。反応時間は、硫酸化剤の種
類、用量及び反応温度によって異なるが、通常１〜24時
間であり、特に３〜８時間であることが好ましい。

反応後、反応混合物から溶媒を留去するか、又は水を加
えて希釈した後、透析することにより目的物以外の低分
子化合物を除く。而る後、例えば目的物をナトリウム塩
として単離する場合には、陽イオン交換樹脂（ナトリウ
ム型）で処理することにより目的物をナトリウム塩とし
た後、適当な温度において水溶性有機溶媒、例えばエタ
ノールを添加することにより本発明方法の生成物を得る
ことができる。

［発明の効果］本発明の方法により得られる合成コンドロイチン多硫酸
及びその塩は、N-アセチルガラクトサミン残基の６位水
酸基が選択的に高度に硫酸化されており、コンドロイチ
ン‐4-硫酸に比し、腎炎に対し優れた効果を示す。ま
た、副作用もコンドロイチン‐4-硫酸と同程度であり、
腎炎の治療に有用である。

［発明の実施例］以下、実施例及び試験例により本発明を更に詳細に説明
するが、これらは、本発明の範囲を何ら制限するもので
はない。

なお、以下の実施例等において、コンドロイチン‐4-硫
酸及びデルマタン硫酸の塩は、それぞれ、鯨軟骨及び豚
皮由来のもの（生化学工業（株）製）を用いた。

物理化学的特性の決定は、次の方法に従って行なった。
ガラクトサミン、グルクロン酸及びイズロン酸の含有率
は、それぞれ、S.Gardell（Acta Chem.Scand.,７,207
（1953））の方法、カルバゾール法（Z.Dische;J.Biol.
Chem.,167,189（1947））及びオルシノール法（A.H.Bro
wn;Arch,Biochem.Biophys.,11,269（1946））:J.X.Khy
m,et al.;J.Am.Chem.Soc.,74,3199（1952））に従って
行なった。硫酸化率は、赤外吸収スペクトルにおけるC-
O-S吸収及び電気泳動（セルロースアセテート膜,0.15M
ギ酸−ピリジン（pH3.0）,0.5mA/cm,60分）により同定
し、Dodgson-Priceの比濁法（K.S.Dodgson,et al.;Bioc
hem.J.,84,106（1962））に従い定量した。本発明の合
成コンドロイチン多硫酸及びその塩のうち、前記式
（Ｉ）のＸがカルボキシル基であるものの硫酸基の位置
は、鈴木ら（S.Suzuki,et al.;J.Biol.Chem.,243,1543
（1968））の酵素法によって、Ｙがカルボキシル基であ
るものの硫酸基の位置は、鈴木ら（S.Suzuki,et al.;Bi
ochim.Biophys.Acta,237,173（1971））の酵素法によっ
て決定した。

実施例１コンドロイチン‐4-硫酸ナトリウム（以下「CS4SNa）と
いう）（分子量20000）1gを精製水50mlに溶解し４℃に
平衡調製されたダウエックス（Dowex）50［H⁺］型カラ
ム（1.5×100cm）に流し、４℃にて精製水で溶出し、10
％トリ‐n-ブチルアミンエタノール溶液を加えてpHを5.
0に調整した。溶液をエーテル50mlで２回抽出して過剰
のトリ‐n-ブチルアミンを除去し、水層を20℃で減圧濃
縮して凍結乾燥した。その後、五酸化リン上で減圧乾燥
してコンドロイチン‐4-硫酸のトリ‐n-ブチルアミン塩
1.25gを得た。

該トリ‐n-ブチルアミン塩300mg（0.43mmol）を乾燥ジ
メチルホルムアミド（以下「DMF」という）50mlに０℃
にて溶解し、三酸化イオウ−ピリジン複合体445mg（3.0
7mmol）を含む乾燥DMF溶液10mlを加え、０℃で１時間撹
拌しながら反応した。

反応液に０℃で冷却した精製水6mlを少量ずつ加え、次
いで0.1N水酸化ナトリウム水溶液にてpHを9.0に調整
し、精製水に対して室温で透析した。これをダウエック
ス（Dowex）50［Na⁺］型カラム（1.5×60cm）に流し、
精製水で溶出した後、40℃で減圧濃縮した。凍結乾燥し
て合成コンドロイチン多硫酸ナトリウム塩（試料No.合
成CS−１）219mgを得た。

分子量 24000 ガラクトサミン含有率 24.6％グルクロン酸含有率 26.5％イオウ含有率 12.0％赤外吸収スペクトル 850cm^-1(アクシャル‐SO₄) 820cm^-1(エクアトリアル‐SO₄) また、それぞれ、前記トリ‐n-ブチルアミン塩300mg
（0.43mmol）をDMF50mlに溶解し、三酸化イオウ‐ピリ
ジン複合体137mg（0.86mmol）を加え、それぞれ０℃
で、１時間、３時間又は５時間反応した後、前述と同様
に処理して、以下に示す合成コンドロイチン多硫酸ナト
リウム塩（試料No.合成CS−１−ａ、合成CS−１−ｂ及
び合成CS−１−ｃ）を得た。

実施例２それぞれ、CS4SNa（分子量35000）1g（1.988mmol）をホ
ルムアミド20mlに溶解し、これらに、それぞれ撹拌下、
三酸化イオウ−ピリジン複合体0.865g（5.964mmol）、
1.44g（9.94mmol）又は2.88g（19.88mmol）を加え、６
℃で20時間反応した。反応液を実施例１に準じて処理し
て、合成コンドロイチン多硫酸ナトリウム塩をそれぞれ
0.92g（試料No.合成CS−２）、1.08g（試料No.合成CS−
３）及び1.15g（試料No.合成CS−４）得た。

実施例３デルマタン硫酸ナトリウム（以下「DSNa」という）（分
子量20000）1g（1.988mmol）をホルムアミド50mlに溶解
し、撹拌下、三酸化イオウ−DMF複合体1.52g（9.94mmo
l）を加えて６℃で20時間反応した。反応液を実施例１
に準じて処理して、合成デルマタン多硫酸ナトリウム塩
（試料No.合成DS−１）0.98gを得た。

試験例１電気泳動による硫酸化率の同定セルロースアセテート膜（Separax）に0.2μg/0.5μ
ずつ試料をのせ、0.5mA/cmで60分泳動した。緩衝液:0.1
5Mギ酸−ピリジン（pH3.0）染色：トルイジンブルー結果を図１に示す。図１において、CS4Sはコンドロイチ
ン‐4-硫酸（イオウ含有率6.2％）を、Hepはヘパリン
（イオウ含有率12.8％）を、DSはデルマタン硫酸ナトリ
ウム（イオウ含有率6.3％）を表わす。

試験例２酵素法による合成コンドロイチン硫酸の硫酸
基の位置決定合成CS1〜４をそれぞれ1.5mgずつ秤量し、トリス塩酸緩
衝液（pH7.2）28μに溶解し、それぞれにコンドロイ
チナーゼABC（Proteus vulgaris由来，生化学工業
（株）製）20単位を前記緩衝液400μで溶解したもの
を80μずつ加えて37℃で３時間反応した。この反応液
50μをペーパークロマトグラフィーで分離した（それ
ぞれ合成CS−1,2,3,4−ABC）。

また、コンドロイチナーゼABC消化液10μずつにコン
ドロ‐4-スルファターゼ1.2単位（proteus vulgaris由
来，生化学工業（株）製）とコンドロ‐6-スルファター
ゼ1.2単位（proteus vulgaris由来，生化学工業（株）
製）の混合物を前記緩衝液100μに溶解したものを20
μずつ加え、37℃で３時間反応した。この反応液を30
μずつペーパークロマトグラフィーで分離した。

紙は東洋紙No51A.60×60cmを使用した。展開溶媒は
n-ブタノール・酢酸・1Nアンモニア水（2:3:1）を使用
し、室温で30時間展開した。展開後、紙を乾燥させ、
暗室で260mμ付近の紫外線を照射（東芝蛍光検査灯FI-3
S型）して直接UV−吸収スポットを観察した。

結果を図２に示す。図２において、Stは標準二糖を、Δ
Di−0Sはを、ΔDi−4Sは ΔDi−6SはＡ〜Ｄは、それぞれ合成CS−1,2,3,4のコンドロイチナ
ーゼABC処理液を、Ｅ〜Ｈは、それぞれ合成CS−1,2,3,4
のコンドロイチナーゼABC処理液を更にコンドロ‐4-ス
ルファターゼ及びコンドロ‐6-スルファターゼの混合物
で処理したものを表わす。

試験例３酵素法による合成DS−１の硫酸基の位置決定合成DS−1 1.5mgをトリス塩酸緩衝液（pH7.2）20μに
溶解し、コンドロイチナーゼABC20単位を前記緩衝液400
μに溶解したものを80μ加えて37℃で３時間反応し
た。この反応液50μをペーパークロマトグラフィーで
分離した（合成DS−１−ABC）。また、残りの反応液10
μのコンドロ‐4-スルファターゼ1.2単位とコンドロ
‐6-スルファターゼ1.2単位の混合物を前記緩衝液100μ
に溶解したものを20μ加え、37℃で３時間反応し
た。この反応液30μをペーパークロマトグラフィーで
分離した（合成DS−１−4,6・Sase）。紙、展開溶
媒、展開時間、検出法は試験例２に準じた。

結果を図３に示す。図３において、Ａは合成DS−１のコ
ンドロイチナーゼABC処理液を、Ｂは該処理液を更にコ
ンドロ‐4-スルファターゼ及びコンドロ‐6-スルファタ
ーゼの混合物で処理したものを表わし、St、ΔDi−0S、
ΔDi−4S、ΔDi−6Sは前記と同義である。

試験例４酵素法による合成コンドロイチン多硫酸の硫
酸基の位置決定合成CS−１−a,b,cを試験例２及び３に準じて処理し、
展開後、各スポットをハサミで切りとり、0.01N塩酸１
〜2mlを入れた試験管に細かく刻んで入れ、50℃の温浴
中で10分間加熱後、遠心分離し、上清、即ち抽出液の23
2mμにおける吸光度を測定し、二糖単位のモル比を求め
た。結果を以下の表に示す。

試験例５「クロム酸カリ」腎炎に対する合成コンドロ
イチン多硫酸の効果黒川の方法（黒川巌；日本内科学会雑誌，10,363,507
（1921））に従い、クロム酸カリを生理食塩水に溶解
し、濃度を500mg/dlとし、クロム酸カリとして20mg/kg
又は15mg/kgずつ平均体重2.5kgの家兎の皮下に注射し
た。クロム酸カリ投与の日を第１日目として、その第３
日目より第16日目までの14日間１日１回、試料を耳静脈
より注射した。第17日目まで生存した家兎数を数え、延
命効果を検討した。結果を以下の表に示す。

試料投与群には、明らかな延命効果がみられ、その効果
は、CS4SNaに対し、合成CS−３が優れていた。また、非
投与群には、進行的な体重減少の結果、死亡する例が多
くみられたが、試料投与群では、一時的な軽度の体重減
少後、回復した。血清蛋白量は、非投与群で一時減少
後、著名な増加がみられたが、試料投与群ではそれほど
の変化はみられなかった。

【図面の簡単な説明】

図１は電気泳動の結果を示す図である。図２及び図３はペーパークロマトグラフィーの結果を示
す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭47−20117（ＪＰ，Ａ) 特公昭31−2170（ＪＰ，Ｂ１) 特公昭30−996（ＪＰ，Ｂ１) 特公昭52−35710（ＪＰ，Ｂ２) 特公昭50−17049（ＪＰ，Ｂ２) 特公昭47−30167（ＪＰ，Ｂ１) 米国特許3454560（ＵＳ，Ａ) 生化学辞典第１版，東京化学同人Ｐ. 497（1984)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コンドロイチン−４−硫酸又はデルマタン
硫酸の塩を極性有機溶媒に予め溶解し、その溶液を極性
溶媒中均一な溶液状態において、−20℃〜20℃で三酸化
イオウと第三級アミンもしくはジメチルホルムアミドと
の複合体と反応させ、コンドロイチン−４−硫酸又はデ
ルマタン硫酸のＮ−と反応させ、コンドロイチン−４−
硫酸又はデルマタン硫酸のＮ−アセチルガラクトサミン
残基の６位の水酸基を特異的に高度に硫酸化することを
特徴とする、次式：（式中、R₁O、R₂O、R₃O及びR₄Oは、硫酸基又は水酸基を
表わし、それぞれ同一であっても異なっていてもよい
が、分子中において、R₁Oの硫酸化率が20〜100％であ
り、R₂Oの硫酸化率が20〜100％であり、R₃O及びR₄Oのそ
れぞれの硫酸化率が25％以下であり、Ｘは、カルボキシ
ル基又は水素原子を表わし、分子中におけるＸ同士は同
一であっても異なっていてもよく、Ｙは、Ｘがカルボキ
シル基を表わすときには水素原子を表わし、Ｘが水素原
子を表わすときにカルボキシル基を表わす。）で示される二糖単位の繰返しからなり、分子中のイオウ
含有率が7.3〜12.5％で、分子量が5000〜100000である
合成コンドロイチン多硫酸又はその塩の製造法。
【請求項２】反応温度が０℃〜20℃である、請求項１記
載の製造法。
【請求項３】コンドロイチン−４−硫酸又はデルマタン
硫酸の塩がナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属
塩であり、極性有機溶媒がホルムアミド、ジメチルスル
ホキシドである、請求項１記載の製造法。
【請求項４】コンドロイチン−４−硫酸又はデルマタン
硫酸の塩がトリ−ｎ−ヘキシルアミン塩、トリ−ｎ−ブ
チルアミン塩、トリ−ｎ−オクチルアミン塩等のトリア
ルキルアミン塩であり、極性有機溶媒がホルムアミド、
ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドである、
請求項１記載の製造法。