WO1998001567A2 - ADN POLYMERASE THERMOSTABLE D'ARCHAEBACTERIES DU GENRE $i(PYROCOCCUS SP.) - Google Patents
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- WO1998001567A2 WO1998001567A2 PCT/FR1997/001259 FR9701259W WO9801567A2 WO 1998001567 A2 WO1998001567 A2 WO 1998001567A2 FR 9701259 W FR9701259 W FR 9701259W WO 9801567 A2 WO9801567 A2 WO 9801567A2
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- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
Definitions
- the present invention relates to new ones. Heat-stable DNA polymerases from archaebacteria of the genus Pyrococcus sp.
- DNA polymerases are enzymes involved in the replication and repair of DNA. Many DNA polymerases isolated from microorganisms such as E. coli are known today; for example DNA polymerase I from E. coli, klenow fragment from DNA polymerase I from E. coli, DNA polymerase T4. Thermostable DNA polymerases have also been identified and purified from thermophilic organisms, such as Thermus aguaticus (Chien, A. et al., J. bacteriol. 1976, 127: 1550-1557; Kaladin et al., Biokhymiyay 1980, 45 : 644-651), Thermus theirmophilus, or even Bacillus species (European Patent Application No.
- the replication process is carried out according to a well-known mechanism consisting in manufacturing, from a template, the DNA polymerase enzyme and the four nucleotide triphosphates, a strand of nucleic acid complementary to said template.
- Enzymes with DNA polymerase activity are now widely used in vitro in many molecular biology processes, such as cloning, detection, labeling and amplification of nucleic acid sequences.
- thermostable enzymes Since the temperatures used in the denaturation stage are not compatible with the conservation of the activities of many DNA polymerases, significant research work is devoted to the thermostable enzymes described above. It is in particular essential not to limit the preparation of these enzymes to the only processes of purification from the microorganism, but to seek to increase the yields of production by using the methods of genetic engineering.
- the gene coding for DNA polymerase is cloned into an expression vector, which vector is inserted into a cell host capable of expressing the enzyme, the cell host is cultured under suitable conditions and the DNA polymerase is extracted and recovered.
- This method has for example been described in PCT patent application O89 / 06691 for producing DNA polymerase from Thermus aguaticus.
- the present invention specifically aims to provide new hyperthermostable enzymes obtained from the Pyrococcus sp. which catalyze the polymerization of DNA.
- These enzymes come from isolates of samples of hyper thermophilic archaebacteria (Woese, CR, O. Kandler, and M. heelis, 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 4576-4579) taken from deep hydrothermal vents of the North Fiji basin in the South Pacific (Desbruy insomnia, D., A. -M. Alayse-Danet, and S. Ohta. 1994. Geology. 116: 227-242; Marteinsson, VT, L. atrin, D. Prior, JC Caprais, G. Raguenes, and G. Erauso. 1995.
- a DNA polymerase of the invention has a molecular weight of approximately 89,000 daltons and exhibits hyperthermostability allowing it to be used in reactions carried out at temperatures of 70 to 90 ° C.
- the invention more particularly relates to a purified thermostable DNA polymerase of archaebacteria of the genus Pyrococcus sp. having a molecular weight between about 89,000 and 90,000 daltons.
- a first purified thermostable DNA polymerase according to the invention comes from the strain of archaebacteria of the genus Pyrococcus sp. deposited at the National Culture Collection of Microorganisms (CNCM) at the Pasteur Institute, on July 3, 1996 under the
- This DNA polymerase will be referred to in the following as Pyrococcus sp. GE 23. Its sequence of 771 amino acids is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: l. A molecular weight of 89,409 daltons and a pI of 8.37 were deduced from this sequence.
- the invention therefore relates to the DNA polymerase of Pyrococcus sp. GE 23 whose amino acid sequence is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1 or any other sequence constituting an enzymatically equivalent derivative thereof.
- enzymes and proteins constituted by or comprising the amino acid sequence represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1 as soon as they exhibit the properties of the DNA polymerase of Pyrococcus ⁇ p. GE 23.
- the invention more particularly contemplates a DNA polymerase, the amino acid sequence of which is a fragment of that represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1, or alternatively an assembly of such fragments. .
- thermostable DNA polymerase also means the amino acid sequences above modified by insertion and / or deletion and / or substitution of one or more amino acids, provided that the properties of the DNA polymerase of Pyrococcus sp.
- the resulting GE 23 are not significantly changed.
- a second purified thermostable DNA polymerase according to the invention comes from the archaebacteria strain of the genus Pyrococcus sp. filed with the CNC on April 20, 1993 under No. 1-1302. This DNA polymerase will be called in this mistletoe follows Pyrococcus sp. GE 5 (aka Pyrococcus aby ⁇ i). Its sequence of 771 amino acids is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 2. A molecular weight of 89,443 daltons and a pI of 8.13 have been deduced from this sequence.
- the invention therefore relates to the DNA polymerase of Pyrococcus sp. GE 5 whose amino acid sequence is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 2 or any other sequence constituting an enzymatically equivalent derivative thereof.
- the term “enzymatically equivalent derivatives” is understood to mean the polypeptides and proteins constituted by or comprising the amino acid sequence represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 2 as soon as they exhibit the properties of the DNA polymerase of Pyrococcus s. GE 5.
- the invention envisages more particularly a DNA polymerase, the amino acid sequence of which is a fragment of that represented in the list of sequences in the annex under the number SEQ ID NO: 2, or alternatively an assembly of such fragments. .
- enzymeally equivalent derivatives also means the amino acid sequences above modified by insertion and / or deletion and / or substitution of one or more amino acids, provided that the properties of the DNA polymerase of Pyrococcus sp. The resulting GE 5 are not significantly changed.
- the DNA polymerases Pyrococcus s. GE 23 and Pyrococcu ⁇ ⁇ p. GE 5 stand out from each other with 10 amino acid residues, the positions of which are indicated in Table I below.
- the invention also relates to a DNA sequence consisting of or comprising the sequence coding for a purified thermostable DNA polymerase of the invention.
- a first DNA sequence according to the invention comprises or consists of nucleotides 1547 to 3862 of SEQ ID NO: 1 coding for the 771 amino acids of the DNA polymerase of Pyrococcus sp. GE 23.
- a second DNA sequence according to the invention comprises or consists of nucleotides 678 to 2994 of SEQ ID NO: 2 coding for the 771 amino acids of the DNA polymerase of Pyrococcus sp. GE 5.
- thermostable DNA polymerase defined previously isolated and purified from a strain of pyrococcus sp. than thermostable DNA polymerase prepared by genetic engineering methods. Consequently, the subject of the invention is also a vector comprising a DNA sequence defined above, as well as a process for the production or expression in a cellular host of the thermostable DNA polymerases of the invention.
- a method for producing a thermostable DNA polymerase according to the invention consists in: transferring a nucleic acid molecule coding for a thermostable DNA polymerase or a vector containing said molecule in a cellular host,
- the cell host used in the above methods can be chosen from prokaryotes or eukaryotes and in particular from bacteria, yeasts, mammalian, plant or insect cells.
- the vector used is chosen according to the host to which it will be transferred, it can be any vector such as a plasmid.
- thermostable DNA polymerases of the invention are useful in particular in methods of enzymatic amplification of nucleic acid sequences. Consequently, the subject of the invention is such methods using a thermostable DNA polymerase described above, as well as the amplification kits comprising, in addition to the reagents generally used, an adequate quantity of this DNA polymerase.
- thermostable DNA polymerases of the invention.
- Pyrococcus sp. G 5 was cultured anaerobically in an 8 liter fermenter in BHI medium (DIFCO) supplemented with sulfur at a pH of 6.5 and at 90 ° C, as described in the literature (Erauso, G., AL Reysenbach, A. Godfroy, J.-R. Meunier, B. Crump, F. Partensky, JA Baross, V. Marteinsson, G. Barbier, NR Pace, and D. Prieur. 1993. Archives of BHI medium (DIFCO) supplemented with sulfur at a pH of 6.5 and at 90 ° C, as described in the literature (Erauso, G., AL Reysenbach, A. Godfroy, J.-R. Meunier, B. Crump, F. Partensky, JA Baross, V. Marteinsson, G. Barbier, NR Pace, and D. Prieur. 1993. Archives of
- Pyrococcus sp. G 23 was cultured at 85 ° C in an identical fermenter in 2216S medium (DIFCO) at a pH of 6.5.
- E. coli SURE, XLl-Blue, NOVABLUE, BL2KDE3) and BL21 (DE3) pLysS were cultured in LB medium (DIFCO) or LB supplemented with appropriate antibiotics (DIFCO). 2) Isolation of DNA. hybridization and recombinant DNA.
- the high molecular weight DNA of Pyrococcus sp. G 23 and G 5 was isolated by the modified Charbonnier method (Charbonnier, F., G. Erauso, T. Barbeyron, D. Prieur, and P. Forterre. 1992. JOurnal of Ba ct eri ol ogy. 174, 19 : 6103-6109).
- the centrifuged cells were resuspended in TE-Nalx buffer, then lysed at 40 ° C for 3 hours with a mixture of 1% N-lauryl sarcosine, dodecyl sodium sulfate
- the genomic DNA was digested with a series of restriction enzymes (BamHI, Bgll, EcoRI, EcoRV, HindIII, PvuII, Sali, Sacl, Xbal and Xhol) by simple or double digestion. Then the DNA fragments migrated on 0.8% agarose gel in TBE-1x and were transferred to a Hybond-N + nylon membrane (Amersham, UK) and hybridized with prepared DNA probes by PCR with specific primers selected from the DNA polymerase genes of P. furiosus and T. li toralis, labeled with 3 P by random-priming in accordance with the manufacturer's recommendations (Magaprime, Amersham, UK). Two P probes.
- a series of restriction enzymes BamHI, Bgll, EcoRI, EcoRV, HindIII, PvuII, Sali, Sacl, Xbal and Xhol
- Furio ⁇ u ⁇ were used, pFu ⁇ and PfuF, covering respectively the regions delimited by base pairs 8 to 2316 and 819 to 1915 of the coding section of the Pfu polymerase gene, as defined by Uemori et al. (Uemori, T., Y. Ishino, H. Toh, K. Asada, and I. Kato. 1993. Nue le ic Acids Research. 21 (2): 259-265). Two T probes. li toral i ⁇ , Tl il and Tl i T, respectively covering the regions delimited by base pairs 297 to 1768 and 4631 to 5378, as defined by Hodges et al.
- the restriction fragments of the plasmids derived from pUC were purified on agarose gels by the method of GeneClean (Bio 101, La Jolla, Calif.) For later cloning. Polymer chain reactions (PCR) long fragments were carried out according to the procedure defined by Barnes (Barnes,. M. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 2216-2220) with a reaction mixture Taq Extender (Stratagene, La Jolla, Calif.). The 16S and 23S rDNAs of Pyrococcus sp. GE 23 were amplified by PCR with a Stratagene 96-gradient thermocyler using the following conditions:
- the PCR products were cloned into the vector pBluescript for sequencing.
- the DNA polymerase gene from Pyrococcus sp. GE 5 was isolated by PCR using the primers developed to express the DNA polymerase gene of Pyrococcu ⁇ sp. GE 23:
- the DNA sequences were obtained by the dideoxy chain termination method (Sanger, F., S. Nicklen, and AR Coulson. 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74: 5467-5473) using an Applied Biosystems automatic DNA analysis system.
- the two strands of genes encoding the DNA polymerase of Pyrococcus ⁇ p. G23 and G5 were sequenced while the 16S rDNA of Pyrococcus sp. G23 was sequenced on a single strand, using universal primers localized on vectors and internal primers.
- the PCR mixture contained the GOLDSTAR DNA polymerase (Eurogentec, B), the Taq extender Taq enzyme (Pfu from Stratagene), the extension buffer with the dNTP guaters (each at 0.2 mM) and the primers GE23DIR and GE23REV at 50 pmoles in a final volume of 50 ⁇ l.
- the amplification was carried out over 20 cycles: 1 min at 90 ° C, 1 min at 50 ° C and 3 min at 72 ° C, using a Stratagene 96-gradient thermocycler.
- the PCR fragments digested with NdeI and SalI were ligated to the NdeI and SalI sites of pET12a digested with the same enzymes, thus reestablishing the initiation codon.
- the constructions obtained were named pETPABl and pETGEl respectively. These constructions were both sequenced at the junction sites and entirely for pETPABl.
- the expression tests were carried out in accordance with the recommendations of the manufacturer of the pET expression system: selection of the clones in E. coli Novablue, culture of E. coli BL21 (DE3), induction (IPTG 0.2-lmM).
- the DNA polymerase was observed by SDS-PAGE after partial thermal denaturation of the host proteins (71 ° C., 20 min) and concentrated on Millipore filters (Ultrafree TM).
- reaction medium C Tris -HCl 50 mM pH 8.8; DTT lmM; MgCl 2 10 mM; KCl 10 mM; BSA 0.4 mg / ml, each dNTP at 0.4 mM.
- Pyrococcus sp. G23 and G5 belong to the same PCR-RFLP group of 16S rDNA (Meunier, JR 1994. Biodiver ⁇ i ty and sys evidenced by populations of hermophi mi microorganisms isolated from abysmal oceanic hydrothermal ecosystems. Thesis, Paris 7) indicating that it could be two different strains of the same species.
- the different RFLP profiles of the DNA polymerase genes from Pyrococcus sp. G23 and G5, obtained with the various probes (Pfu ⁇ , PfuP, Tlil) indicate that at least the DNA polymerase genes have significant differences.
- FIG. 5 shows the phylogenetic situation of Pyrococcus sp. GE23 and Pyrococcus sp. GE 5
- strain recA- Three positive recombinant clones among
- FIG. 3 shows that most of the insert has been deleted in the method and only the 3 ′ fragment of 342 bp HindIII-Xbal remains.
- GE 5 is composed of a 5 ′ HindIII-HindIII genomic part, an internal HindIII-HindIII portion of 611 bp derived from PCR products and of the 3 ′ portion of 342 bp genomic.
- sequence deduced has a length of 270 amines and the similarity searches carried out with the BLAST and FASTA programs have revealed no significant homology with the sequences available in the Swiss-Prot and PIR databases.
- the complete coding sequence for the DNA polymerase gene of Pyrococcus sp. GE 5 produced by PCR using primers prepared from the Pyrococcus sp. GE 23 was obtained by sequencing the two strands. In order to confirm the sequence of this PCR product, the fragment of Pyrococcus ⁇ p. GE 5 HindIII-HindIII of 2.9 Kb which was cloned was also sequenced on both strands, and the same results were obtained. The 3 'region of the gene was also sequenced from the remaining HindIII-Xbal insert of 342 bp resulting from the deletion of part of the 2.6 kb Xbal-Xbal fragment.
- GE 23 and GE 5 appear to be a characteristic of these two strains, the diversity being well distributed over the other sequences of genes coding for DNA polymerases.
- the comparison at the level of the polypeptide sequences shows the strong similarity of the two DNA polymerases, 98% homology with the CLUSTAL V method, and only 10 different residues.
- the amino acid substitutions are given in Table I and the alignments with the DNA polymerases of other Thermococcals are shown in Figures 6 and 7.
- FIG. 6 represents the alignment of the polypeptide sequence of the DNA polymerase of Pyrococcu ⁇ ⁇ p. GE 23 with that of DNA polymerases from: Deep Vent (intein-), Pyrococcu ⁇ ⁇ p. KODl, Pyrococcu ⁇ furio ⁇ us, Vent (Tli intein-), Pyrococcu ⁇ ⁇ p. 9 ° N.
- FIG. 7 represents the alignment of the polypeptide sequence of the DNA polymerase of Pyrococcus sp. GE 5 with that of the DNA polymerases of: Pyrococcu ⁇ ⁇ p. GB-D, Pyrococcu ⁇ ⁇ p. KODl, Pyrococcus furiosus, Thermococcus U tora ⁇ is, Pyrococcus ⁇ p. 9 ° N.
- Table II below indicates the percentage similarities between the polypeptide sequences of: (1) Pyrococcus ⁇ p. GE 23, (2) Pyrococcu ⁇ ⁇ p. GE 5, (3) Pyrococcu ⁇ ⁇ p. GB-D, (4) Pyrococcu ⁇ ⁇ p. KODl, (5) Pyrococcu ⁇ furi osus, (6) Thermococcus U tora ⁇ is, (7) Pyrococcus sp. 9 ° N. Table II
- GE 5 was cloned at the NdeI and BamHI sites of a vector to transform the strain E. coli BL21 (DE3).
- Mini-plasmid DNA preparations were carried out on about twenty transforming clones and only one was selected on the basis of the size of the DNA fragments released after digestion with the restriction enzymes NdeI and BamHI. Expression tests were then carried out at 37 ° C., in an Erlenmeyer flask, with the selected clone.
- FIG. 8 represents the results of the expression tests, in which:
- - Well No. 1 corresponds to the 10 kDA Ladder protein (Gibco BRL).
- - Well No. 4 corresponds to the induced sample without IPTG, 4 hours after induction.
- - Well No. 5 corresponds to the sample induced without IPTG, 18 hours after induction.
- - Well No. 6 corresponds to the 10 kDA Ladder protein (Gibco PRL).
- - Well No. 8 corresponds to the sample induced with 1 mM IPTG, 1 hour after induction.
- the pH is regulated to 6.8 with NaOH during the acidification phase. During the basification phase, the pH remained in free evolution.
- the bacteria were harvested after 16 to 17 hours of culture. The final optical density was approximately 10 units and the final pH of 8.
- the culture was then concentrated by filtration on hollow fibers (AMICON), until a final volume of 2 liters was obtained. This bacteria concentrate was then used for the purification of proteins. After cell concentration, the cells are continuously ground using a ball mill and the cell ground is supplemented with 1 mM PMSF.
- Buffer A 50 mM Tris-HCl, pH 8 and buffer B: 50 mM Tris-HCl, pH 8 + 0.5 M NaCl - Flow rate: 10 ml / min; gradient 0-50% B in 60 minutes.
- FIG. 9 represents the elution profile of the sample consisting of 450 ml of soluble proteins after thermal denaturation at 75 ° C.
- FIG. 10 represents the analysis by SDS-PAGE (Phast System, Pharmacia), in the presence of ⁇ -mercaptoethanol, of various fractions resulting from the purification: - Gels: Phast gel 8-15% (Phast System,
- Lines 1 and 8 molecular weight marker (10 Kda, Bio-Rad).
- Line 4 soluble proteins after thermal denaturation.
- the DNA polymerase of Pyrococcu ⁇ ⁇ p. GE 5 is soluble and thermostable. It is eluted at around 0.15 M NaCl during ion exchange chromatography.
- the fractions containing the DNA polymerase of Pyrococcu ⁇ ⁇ p. GE 5 were combined (fraction 2; 50 ml) and chromatographed on hydroxyapatite (type II, Biorad):
- FIG. 11 represents the elution profile of the sample consisting of 50 ml of fraction 2 after ion exchange chromatography.
- the different fractions were analyzed by UV spectrometer and by SDS-PAGE.
- the nonabsorbed fraction contains mainly nucleic acids while fractions 1 to 3 contain the DNA polymerase of Pyrococcu ⁇ ⁇ p. GE 5.
- 1 mM mercaptoethanol, 0.1% Tween 20 and 50% glycerol were added before storage at -20 ° C.
- Lines 1 and 5 Molecular weight marker (Bio-Rad, Broad Range).
- fraction 1 contains DNA polymerase of
- the DNA polymerase activity of the different fractions was tested in a PCR type amplification reaction. A fragment of approximately 1300 bp was amplified from target DNA and specific primers.
- the buffer used is composed of:
- FIG. 13 reports the results obtained with a reaction volume of 100 ⁇ l for quantities of DNA polymerase from Pyrococcus sp. GE 5 of 2.5 ⁇ g, 1 ⁇ g, 0.1 ⁇ g and 0.01 ⁇ g:
- Figures 14 and 15 show the PCR products deposited on 2% agarose gel in the presence of the pBR marker digested with HaelII.
- the primers chosen make it possible to amplify a 420 bp fragment.
- Pab and Ppr make it possible to obtain a PCR product of 420 bp whatever the quantity of matrix between 0.5 ng and 1 ⁇ g.
- a PCR product was also obtained under these same conditions in the presence of 10 picograms of DNA template.
- iPCR reverse PCR
- HT-iPCR High-Temperature reverse PCR
- the DNA template retained for this work is a circular fragment of DNA of 2.2 kb. This fragment is obtained by digestion of the genomic DNA of the isolate
- the oligonucleotide primers are selected from the known sequence portion of this circularized fragment so as to copy from the known region to the unknown sequence region ( Figure 16).
- the amplification cycles were carried out with a gradient thermocycler from the company Stratagene under the following conditions:
- FIG. 17 represents the comparison of the results of i-PCR and of HT-iPCR using Taq and Pab: line 1: "Raoul” marker (company Appligene-Oncor)
- FIG. 18 represents the PCR at high temperature (elongation at 85 ° C. over 30 cycles): line 1: "Raoul” marker (company Appligene-Oncor)
- ligase T4 a ligase
- the tests are incubated for 30 minutes at 70 ° C. 10 ⁇ l of each test are taken after 10 minutes, 20 minutes and 30 minutes of incubation, then are deposited on DE81 paper (hatmann). Compaction before washing is then carried out dry using the Cerenkov method. The DE81 papers are then washed three times for 5 minutes in a 0.5 mM Na 2 HP0 4 solution in order to remove the unincorporated dNTPs. Switching over to alcohol allows the papers to be quickly dried and counted. A negative control (To) is carried out without DNA polymerase and a positive control is carried out with DNA polymerase not treated at the temperature, corresponding to the time 0 hours.
- To A negative control (To) is carried out without DNA polymerase and a positive control is carried out with DNA polymerase not treated at the temperature, corresponding to the time 0 hours.
- a polymerase unit is the quantity of enzyme necessary for the incorporation of 10 nmol of nucleosides into acid-soluble products in 30 minutes at 72 ° C. under the test conditions.
- the polymerase activity is calculated by averaging the total counts before washing in 10 ⁇ l of deposit. These correspond to 4 x 5 nanomoles of each dNTP, or 20 nanomoles of total dNTP.
- the two enzymes were studied at three temperatures 92 ° C, 95 ° C and 100 ° C. All the work was carried out in parallel with the same substrates. The results are represented on the curves of FIGS. 19 to 22.
- FIGS. 21 (table V below) and 22 (table VI below) the different polymerases studied are brought back to the same base at the initial activity level, for facilitate the comparative study.
- a fourth temperature of 105 ° C has also been studied for the Pab but is not illustrated in the figures.
- Table III reports the results of 1 inactivation of Pab as a function of time at 100 ° C, 95 ° C and 92 ° C.
- Table IV reports the results of 1 inactivation of Ppr as a function of time at 100 ° C, 95 ° C and 92 ° C.
- Figure 21 Pab and Ppr activity after inactivation at 100 ° C.
- Table V below reports the activity of Pab and Ppr after inactivation at 100 ° C.
- Figure 22 Pab activity. Ppr and thermus acruaticus polymerase (Ta ⁇ ) after inactivation at 92 ° C.
- Table VI reports the activity of Pab, Ppr and Taq after inactivation at 92 ° C.
- Pab retains 90% of its activity after 5 hours treatment at 92 ° C, 70% after 5 hours at 95 ° C and 60% after 5 hours at 100 ° C. Pab retains 50% of its activity after a 90-minute treatment at 105 ° C.
- Taq pol retains 68% of its activity after 5 hours at 92 ° C, 65% after 5 hours at 95 ° C and 10% after 5 hours at 100 ° C.
- Taq pol retains 55% of its activity after 5 hours at 92 ° C, but it has only a half-life of 90 minutes at 95 ° C and 5 minutes at 100 ° C.
- the enzyme Pab is more thermostable than Ppr, despite a difference of only ten residues between their sequences.
- the Pab enzyme is the most thermostable currently described with a half-life at 95 ° C of 18 hours and more than 8 hours at 100 ° C.
- the enzyme Ppr has a thermostability comparable to that published by Vent or even better with 2 hours of half-life at 100 ° C.
- NAME / KEY coding sequence of the DNA polymerase of Pyrococcus sp. GE. 23
- B LOCATION: 1547 to 3862
- NAME / CLE coding sequence of the DNA polymerase of Pyrococcu ⁇ sp. GE 5
- GGC AAG CCG ATA ATA AGG ATA TTC AAA AAG GAA AAG GGA GAG TTT AAG 759 Gly Lys Pro Ile Arg Ile Phe Lys Lys Glu Lys Gly Glu Phe Lys 15 20 25
- AAG GGA TTG ACT CCA ATG GAG GGG AAC GAG GAG CTA ACG TTT CTA GCC 1095 Lys Gly Leu Thr Pro Met Glu Gly Asn Glu Glu Leu Thr Phe Leu Ala 125 130 135
- AAT AGC GAG CCG AAA ATG CAG AGG ATG GGG GAT TCA TTA GCC GTA GAG 1431 Asn Ser Glu Pro Lys Met Gin Arg Met Gly Asp Ser Leu Ala Val Glu 240 245 250 ATA AAG GGC AGA ATA CAC TTC GAT TTA TTC CCC GCC ATA AGA AGA ACG 1479 Ile Lys Gly Arg Ile His Phe Asp Leu Phe Pro Ala Ile Arg Arg Thr 255 260 265
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Abstract
La présente invention concerne une ADN polymérase purifiée thermostable d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. ayant un poids moléculaire compris entre environ 89 000 et 90 000 daltons.
Description
ADN POLYMERASE THERMOSTABLE D'ARCHAEBACTÉRIES DU GENRE PYROCOCCUS SP.
lia présente invention concerne de nouvelles. ADN polymérases thermo s t able s provenant d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp.
Les ADN polymérases sont des enzymes impliquées dans la réplication et la réparation de l' ADN. On connaît aujourd'hui de nombreuses ADN polymérases isolés de micro-organismes tel que E. coli ; par exemple 1 'ADN polymérase I de E. coli , le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E. coli , l 'ADN polymérase T4. Des ADN polymérases thermostables ont également identifiées et purifiées à partir d'organismes thermophiles, tels que Thermus aguaticus (Chien, A. et al., J. bacteriol . 1976, 127:1550-1557 ; Kaladin et al., Biokhymiyay 1980, 45:644-651), Thermus theirmophilus, ou encore des espèces Bacillus (Demande de Brevet Européen No. 699 760), Thermococcus (Demande de Brevet Européen No. 455 430), Sui f obus et Pyrococcus (Demande de Brevet Européen No. 547 359). Parmi celles-ci, on peut citer plus particulièrement la Pfu de Pyroccocus Furiosus (Réf. Biblio.), la Vent DNA polymérase de Thermococcus U toraïis (Kong, H. M., R. B. Kucera, and . E. Jack, 1993. J". Biol . Chem . 268 (3 ): 1965-1975 ) , la 9°-NDNA polymérase de Pyrococcus sp . 9°-N et la Deep-Vent DNA polymérase de Pyrococcus sp . GB-D.
Le processus de réplication s'effectue selon un mécanisme bien connu consistant à fabriquer, à partir d'une matrice, de l'enzyme ADN polymérase et des quatre nucléotides triphosphates, un brin d'acide nucléique complémentaire de ladite matrice . Les enzymes ayant une activité ADN polymérase sont à présent largement utilisées in vi tro dans de nombreux procédés de biologie moléculaire, tels que le clonage, la détection, le
marquage et l'amplification de séquences d'acide nucléique .
L'amplification de séquences d'acide nucléique par la méthode dite réaction de polymérisation en chaîne (PCR) , décrite dans les Brevets Européens No.
200 362 et 201 184, est basée sur la réalisation de cycles successifs d'extensions d'amorces, mettant en oeuvre une ADN polymérase et les quatre nucléotides triphosphates, suivies d'une dénaturation des acides nucléiques double brin ainsi obtenus et servant de matrices pour le cycle suivant . Les températures utilisées à l'étape de dénaturation n'étant pas compatibles avec la conservation des activités de nombreuses ADN polymérases, des travaux de recherche important sont consacrés aux enzymes thermostables décrites précédemment. Il est notamment essentiel ne pas limiter la préparation de ces enzymes aux seuls procédés de purification à partir du microorganisme, mais de chercher à augmenter les rendements de production en utilisant les méthodes du génie génétique. Selon ces méthodes bien connues de l'homme du métier (Maniatis, et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual , 1982) , le gène codant pour l'ADN polymérase est clone dans un vecteur d'expression, lequel vecteur est inséré dans un hôte cellulaire capable d'exprimer l'enzyme, l'hôte cellulaire est cultivée dans des conditions adéquates et l'ADN polymérase est extraite et récupérée. Cette méthode a par exemple été décrite dans la demande de brevet PCT O89/06691 pour produire l'ADN polymérase de Thermus aguaticus .
Le développement des technologies d'ADN recombinant tant dans le domaine de la recherche que dans celui de la production industrielle nécessite de disposer de divers types d'ADN polymérase susceptibles d'améliorer quantitativement ou qualitativement des
techniques aussi diverses que le clonage, la détection, le marquage ou l'amplification de séquences d'acide nucléique .
La présente invention vise précisément à offir de nouvelles enzymes hyperthermostables obtenues des espèces Pyrococcus sp . qui catalysent la polymérisation de l'ADN. Ces enzymes proviennent d' isolats d'échantillons d'archaebactéries hyper thermophi les (Woese, C. R., O. Kandler, and M. heelis, 1990. Proc . Natl . Acad. Sci. USA. 87:4576-4579) prélevés dans des sources hydrothermales profondes du bassin Nord-Fiji dans le Pacifique sud (Desbruyères, D., A. -M. Alayse-Danet, and S. Ohta . 1994.Geology . 116:227- 242 ; Marteinsson, V. T., L. atrin, D. Prieur, J. C. Caprais, G. Raguenes, and G. Erauso. 1995.
International Journal of Syεtematic Bacteriology . 45 (4) :623-632) . Tous ces isolats sont hyperthermostables avec des températures d'isolement de l'ordre de 80 à 100°C. Une ADN polymérase de l'invention a un poids moléculaire d'environ 89000 daltons et présente une hyperthermostabilité permettant sa mise en oeuvre dans des réactions conduites à des températures de 70 à 90°C.
Les travaux réalisés dans le cadre de l'invention ont permis d'identifier deux nouvelles ADN polymérases thermostables d'archaebactéries du genre
Pyrococcus sp . dont la relation phylogénétique a été étudiée . Les gènes codant pour ces deux ADN polymérases ont été clones et séquences et leur comparaison a mis en évidence de fortes analogies de séquence et d'organisation.
L'invention a plus particulièrement pour objet une ADN polymérase purifiée thermostable d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. ayant un poids moléculaire compris entre environ 89 000 et 90 000 daltons .
Une première ADN polymérase purifiée thermostable selon l'invention provient de la souche d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. déposée à la Collection National de Culture de Micro-organismes (CNCM) à l'Institut Pasteur, le 3 Juillet 1996 sous le
No 1-1764. Cette ADN polymérase sera dénommée dans ce qui suit Pyrococcus sp . GE 23. Sa séquence de 771 acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:l. Un poids moléculaire de 89 409 daltons et un pi de 8,37 ont été déduits de cette séquence. L'invention concerne donc l 'ADN polymérase dePyrococcus sp . GE 23 dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1 ou tout autre séquence constituant un dérivé enzymatiquement équivalent de celle-ci. On entend par dérivés enzymatiquement équivalents, les polypeptides et protéines constitués par ou comprenant la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1 dès lors qu'ils présentent les propriétés de l'ADN polymérase de Pyrococcus εp . GE 23. A ce titre l'invention envisage plus particulièrement une ADN polymérase dont la séquence en acides aminés est un fragment de celle représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1 ou encore un assemblage de tels fragments ..
On entend aussi par dérivés enzymatiquement équivalents, les séquences en acides aminés ci-dessus modifiées par insertion et/ou délétion et/ou substitution d'un ou plusieurs aminoacides, pour autant que les propriétés de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 23 qui en résultent ne soient pas signif icativement modifiées .
Une seconde ADN polymérase purifiée thermostable selon l'invention provient de la souche d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. déposée à la CNC le 20 Avril 1993 sous le No 1-1302. Cette ADN polymérase sera dénommée dans ce gui suit Pyrococcus sp . GE 5 (alias Pyrococcus abyεεi ) . Sa séquence de 771 acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2. Un poids moléculaire de 89 443 daltons et un pi de 8,13 ont été déduits de cette séquence.
L'invention concerne donc l'ADN polymérase dePyrococcus sp . GE 5 dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2 ou tout autre séquence constituant un dérivé enzymatiquement équivalent de celle-ci. On entend par dérivés enzymatiquement équivalents, les polypeptides et protéines constitués par ou comprenant la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2 dès lors qu'ils présentent les propriétés de l'ADN polymérase de Pyrococcus s . GE 5. A ce titre 1 ' invention envisage plus particulièrement une ADN polymérase dont la séquence en acides aminés est un fragment de celle représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2 ou encore un assemblage de tels fragments ..
On entend aussi par dérivés enzymatiquement équivalents, les séquences en acides aminés ci-dessus modifiées par insertion et/ou délétion et/ou substitution d'un ou plusieurs aminoacides, pour autant que les propriétés de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp . GE 5 qui en résultent ne soient pas significativement modifiées .
Les ADN polymérases Pyrococcus s . GE 23 et de Pyrococcuε εp . GE 5 se distinguent l'une de l'autre
par 10 résidus d'acides aminés dont les positions sont indiqués dans le tableau I ci-dessous.
Tableau I
L'invention concerne également une séquence d'ADN constituée par ou comprenant la séquence codant pour une ADN polymérase purifiée thermostable de 1 ' invention.
Une première séquence d'ADN selon 1 ' invention comprend ou est constituée par les nucléotides 1547 à 3862 de la SEQ ID NO:l codant pour les 771 acides aminés de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 23.
Une seconde séquence d'ADN selon l'invention comprend ou est constituée par les nucléotides 678 à 2994 de la SEQ ID NO: 2 codant pour les 771 acides aminés de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5.
L'invention concerne autant l'ADN polymérase thermostable définie précédemment isolée et purifiée d'une souche de pyrococcus sp. que l'ADN polymérase thermostable préparée par les méthodes du génie génétique. En conséquence, l'invention a aussi pour objet un vecteur comprenant une séquence d'ADN définie précédemment, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire des ADN polymérases thermostables de l'invention.
Un procédé de production d'une ADN polymérase thermostable conforme à l'invention consiste: à transférer une molécule d'acide nucléique codant pour une ADN polymérase thermostable ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire,
- à cultiver l'hôte cellulaire obtenu à l'étape précédente dans des conditions permettant la production de l'ADN polymérase, - à isoler, par tous moyens appropriés ladite ADN polymérase.
L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans les procédés précédents peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d'insectes.
Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré, il peut s'agir de tout vecteur comme un plasmide .
Les ADN polymérases thermostables de 1 ' invention sont utiles notamment dans des procédés d'amplification enzymatique de séquences d'acides nucléiques. En conséquence, l'invention a pour objet, de tels procédés mettant en oeuvre une ADN polymérase thermostable décrite précédemment, ainsi que les kits d'amplification comprenant, outre les réactifs généralement utilisés, une quantité adéquate de cette ADN polymérase .
D'autres avantages et caractéristiques de
1 ' invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent donnés à titre non limitatif et concernant le clonage, l'expression, la caracterisation et l'activité des ADN polymérases thermostables de l'invention.
I - Matériels et méthodes.
1 ) Conditions de culture, plasmides et souches utilisées. Les souches Pyrococcus furiosus (DSM 5262) et Thermococcus Utoraïis (DSM 5474) ont été obtenues auprès de la collection du Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) Braunschweig - Stocheim, Allemagne. Les souches Pyrococcus sp. G 23 et G 5 ont été isolées de cheminées de sources hydrothermales profondes découvertes lors de la campagne franco- japonaise STARMER effectuée en 1989 à 2000 mètres de profondeur dans le bassin Nord-Fiji.
Pyrococcus sp . G 5 a été cultivée anaerobiquement dans un fermenteur de 8 litres dans un milieu BHI (DIFCO) supplémenté avec du soufre à un pH de 6,5 et à 90°C, comme décrit dans la littérature (Erauso, G. , A. L. Reysenbach, A. Godfroy, J.-R. Meunier, B. Crump, F. Partensky, J. A. Baross, V. Marteinsson, G. Barbier, N. R. Pace, and D. Prieur. 1993. Archives of
Microbiology.160:338-349) .
Pyrococcus sp . G 23 a été cultivée à 85°C dans un fermenteur identique dans un milieu 2216S (DIFCO) à un pH de 6,5. La souche E. coli SURE, XLl-Blue
(Stratagene, La Jolla, Calif. USA) a été utilisée comme hôte pour les plasmides recombinants dérivés de pUC18 et pBluescript. Les souches E. coli NOVABLUE, BL2KDE3) et BL21 (DE3 )pLysS (Novagen, Madison, Wi . USA) ont été utilisées comme hôte pour les plasmides recombinants dérivés. E. coli SURE, XLl-Blue, NOVABLUE, BL2KDE3) et BL21 (DE3 )pLysS ont été cultivées dans un milieu LB (DIFCO) ou LB supplémenté avec des antibiotiques appropriés (DIFCO) .
2) Isolement de l'ADN. hybridation et ADN recombinants .
L'ADN de haut poids moléculaire de Pyrococcus sp . G 23 et G 5 a été isolé par la méthode de Charbonnier modifiée (Charbonnier, F., G. Erauso, T. Barbeyron, D. Prieur, and P. Forterre. 1992. JOurnal of Ba c t eri ol ogy . 174, 19 :6103-6109). Les cellules centrifugées ont été resuspendues dans un tampon TE-Na- lx, puis lysées à 40°C pendant 3 heures avec un mélange de N-lauryl sarcosine 1 %, sulfate de sodium de dodecyl
1% et 0,4 mg/ml de protéinase K. Après centrifugation à
5000 g pendant 10 minutes, l'ADN est extrait par PCI
(25-24-1) , puis traité par la RNAase à 5 μg/ml à 60°C pendant une heure. Ces étapes sont suivies par une extraction additionnelle par PCI et une extraction au chloroforme. L'ADN est précipité avec de l'éthanol 100 % et les pastilles sont séchées et suspendues dans du TE- lx . La concentration et la pureté de l'ADN ont été estimées par spectrophotometrie à 230, 260 et 280 nm avec un appareil GeneQuantlI (Pharmacia, Upsalla, S eden) . Pour la construction de la mini-librairie pUC18 (Sutherland, K. J., C. M. Henneke, P. Towner, and D. . Hough. 1990. European Journal of Biochemistry. 194:839- 844) de Pyrococcus sp . G 23, l'ADN génomique a été digéré par une série d'enzymes de restriction (BamHI, Bgll, EcoRI, EcoRV, HindIII, PvuII, Sali, Sacl, Xbal et Xhol) par simple ou double digestion. Puis les fragments d'ADN ont subi une migration sur gel d'agarose 0,8 % dans du TBE-lx et ont été transférés sur une membrane de nylon Hybond-N+ (Amersham, UK) et hybrides avec des sondes d'ADN préparées par PCR avec des amorces spécifiques sélectionnées à partir des gènes d'ADN polymérases de P. furiosus et T. li toralis, marqués au 3 P par random-priming conformément aux recommandations du fabriquant (Magaprime, Amersham, UK) . Deux sondes de P . Furioεuε ont été utilisées, pFuΣ et PfuF, couvrant
respectivement les régions délimitées par les paires de base 8 à 2316 et 819 à 1915 de la section codante du gène de la polymérase Pfu , comme défini par Uemori et al. (Uemori, T., Y. Ishino, H. Toh, K. Asada, and I. Kato. 1993. Nue le ic Acids Research . 21 (2 ) :259-265 ) . Deux sondes de T . li toral iε , Tl i l et Tl i T, couvrant respectivement les régions délimitées par les paires de base 297 à 1768 et 4631 à 5378, comme défini par Hodges et al. (Hodges, R. A., F. B. Perler, C. J. Noren, and W. E. Jack. 1992. Nucleic Acids Res . 20 (23 ): 6153-6157. Les fragments positifs, identifiés par hybridation ADN-ADN (Southern, E. M. 1975. Journal of molecular biol ogy . 98:503), ont été ensuite préparés par des digestions appropriées de 100 μg d'ADN génomique, purifiés dans des sacs de dialyse à partir des gels d'agarose, et précipités à 1 ' éthanol 100 . Les fragments ont été ligaturés dans pUClδ, lequel avait été coupé par les enzymes de restriction appropriés pour une digestion simple et déphosphorylé . La transformation des souches hôtes a été réalisée par électroporation (Gène Puiser, Biorad) . Le criblage des clones recombinants a été effectué par hybridation de colonie selon les techniques décrites dans la littérature (Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis . 1989. Molecular Cloning r A Laboratory Manual , 2nd éd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). La température des Southern blots et d'hybration de colonie était de 55°C dans un tampon standard sans formamide . L'ADN de plasmide a été isolé par la méthode de Birnboim et Doly (Birnboim, H. C, and J. Doly. 1979. Nucleic Acids Research. 7:1503), puis purifié par chromatographie echangeuse d'anions en phase solide (Quiagen, Chatsworth, Calif . USA). Les fragments de restriction des plasmides dérivés de pUC ont été purifiés sur gels d'agarose par la méthode de GeneClean (Bio 101, La Jolla, Calif.) pour un clonage ultérieur. Les réaction de polymérisation en chaîne
(PCR) de longs fragments ont été effectuées conformément à la procédure définie par Barnes (Barnes, . M. 1994. Proc . Natl .Acad. Sci . USA . 91:2216-2220) avec un mélange réactionnel Taq Extender (Stratagene, La Jolla, Calif.). Les ADNr de 16S et 23S de Pyrococcus sp . GE 23 ont été amplifiés par PCR avec un thermocyleur Stratagene 96- gradient en utilisant les conditions suivantes :
- amorce directe Aa (5 ' -TCCGGTTGATCCTGCCGGA-3 ' ) ,
- amorce indirecte 23Sa (5 ' -CTTTCGGTCGCCCCTACT-3 ' ) , - étape initiale 3 minutes à 94°C suivi de 30 cycles (94°C, 1 mn/49°C, lmn/72°C, 2mn) et,
- élongation finale de 5 mn à 72°C.
Les produits de PCR ont été clones dans le vecteur pBluescript pour séquençage . Le gène de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp . GE 5 a été isolé par PCR en utilisant les amorces mises au point pour exprimer le gène de l'ADN polymérase de Pyrococcuε sp . GE 23 :
- GE23DIR ( 5 ' -TGGGGCATATGATAATCGATGCTGATTAC-3 ' ) - GE23REV ( 5 ' -GACATCGTCGACTCTAGAACTTAAGCCATGGTCCG-3 ' ) .
3 ) Séσuencaαe des ADN.
Les séquences d'ADN ont été obtenues par la méthode de terminaison de chaîne didéoxy (Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson. 1977. Proc . Natl . Acad. Sci . USA . 74:5467-5473) en utilisant un système d'analyse automatique d'ADN Applied Biosystems . Les deux brins des gènes codant l'ADN polymérase de Pyrococcus εp . G23 et G5 ont été séquences alors que l'ADNr 16S de Pyrococcus sp . G23 a été séquence sur un seul brin, en utilisant des amorces universelles localisées sur des vecteurs et des amorces internes .
L'analyse de séquence a été réalisée avec un logiciel DNASTAR (Madison, is . , USA) et le programme de Genetics Computer Group (University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wis., USA) accessible en
ligne sur INFOBIOGEN. Les recherches informatisées de similitudes ont été réalisées avec le programme BLAST, les alignements multiples avec CLUSTAL V, et les arbres phylogenetiques ont été établis selon la méthode dite "Neighbour-joining (Saitou, N. , and M. Nei . 1987. Mol . Biol . Evol . 4(4) :406-425) .
4) Construction des recombinants exprimant l'ADN polymérase de Pyrococcus SΌ . G 23 et G5. Les ADN polymérases de Pyrococcus εp . G 23 et G 5 ont été exprimées dans E. coli en utilisant le système d'expression pETl2 , appartenant au système d'expression T7 (Studier, F. W., A. H. Rosenberg, F. J. Dunn, and J. W. Dubendorff. 1990. Me thods Enzymol . 185:60-89) acquis auprès de Novagen (Madison, Wi; USA). La PCR a été utilisée pour préparer les fragments de Pyrococcus εp . G 23 et G 5 contenant les sites de restriction Ndel et Sali compatibles avec 1 ' extréminté des amorces GE23DIR et GE23REV. Le mélange de PCR contenait l'ADN polymérase GOLDSTAR (Eurogentec, B), l'enzyme Taq extender Taq ( Pfu de Stratagene), le tampon d'extension avec les guatres dNTP (chacun à 0,2 mM) et les amorces GE23DIR et GE23REV à 50 pmoles dans un volume final de 50 μl . L'amplification a été effectuée sur 20 cycles : lmn à 90°C, lmn à 50°C et 3 mn à 72°C, en utilisant un thermocycleur Stratagene 96-gradient. Les fragments de PCR digérés par Ndel et Sali ont été ligaturés aux sites Ndel et Sali de pETl2a digérés avec les mêmes enzymes, réétablissant ainsi le codon d'initiation. Les constructions obtenues ont été nommées respectivement pETPABl et pETGEl . Ces constructions ont été séquencées toutes les deux aux sites de jonction et entièrement pour pETPABl . Les tests d'expression ont été réalisés conformément aux recommandations du fabriquant du système d'expression pET : sélection des clones dans
E. coli Novablue, culture of E. coli BL21(DE3) , induction (IPTG 0,2-lmM) .
750 μl de cellules de cultures induites à Dθ600=l et non induites ont été centrifuées, resuspendues dans un tampon de lyse B (Tris-HCl 10 mM pH
7,5 ; NaCl 10 mM ; MgCl2 2 mM ; Triton X-100 1% v/v) . L'ADN polymérase a été observée par SDS-PAGE après une dénaturation thermique partielle des protéine hôtes (71°C, 20 mn) et concentrée sur filtres Millipore (Ultrafree MC) . L'activité a été testée par mesure de l'incorporation de 3H-dTTP (Amersham, UK) en utilisant de l'ADN de thymus de veau activé comme substrat (Sigma- Aldrich, F) dans le milieu de réaction C (Tris-HCl 50 mM pH 8,8 ; DTT lmM ; MgCl2 lOmM ; KCl 10 mM ; BSA 0,4 mg/ml, chaque dNTP à 0,4 mM) .
II - Résultats .
1) Isolement du σène de l'ADN polymérase de P rococcus sp. GE 23.
Les ADN génomiques des souches Pyrococcus εp . GE 23 et GE 5, digérés par une série d'enzymes de restriction, ont été hybrides à l'ADN de P. furioεus et à des sondes de T. litoraliε préparées par PCR. Comme montré aux figures 1 et 2 , 1 ' analyse en Southern blots a révélé un fragment positif HindIII-HindIII de 2,9 kb avec une sonde Tlil marquée au 32P (figure 2) , alors que la sonde PfuF a révélé un fragment positif Xbal-Xbal de 8 kb (figure 1) (exposition de 24 heures) . Le fragment de 2 , 9 kb a été récupéré et purifié comme décrit précédemment dans Matériels et Méthodes et clone dans le vesteur pUC18 digéré par HindIII . Environ 600 recombinants (E. coli SURE) ont été criblés avec une sonde Tlil radiomarquée et 6 d'entre-eux ont donné un signal positif d'hybridation. Des profils de restriction identiques ont été obtenus pour ces clones indiquant
qu'ils contiennent probablement le même insert. Le séquençcage ultérieur de l'un de ces clones (désigné pGE23a) et la comparaison de séquence (FASTA) ont démontré qu'il correspond aux 1358 premières paires de base du gène de l'ADN polymérase appartenant à la famille B (Braithwaite, D. K., and J. Ito. 1993. Nucleic Acids Reεearch .21(4) :787-802) et qu'il se termine au site HindIII. L'analyse de la séquence nucléotidique montre que le site Xbal est localisé en amont du codon d'initiation et qu'en conséquence le fragment positif Xbal-Xbal de 8 kb devrait contenir la partie 3' du gène. Selon la même méthode, ce fragment de 8 kb a été clone dans le vecteur pUC18 et 3 clones recombinants positifs parmi 800 ont été identifiés par hybridation de colonie comme précédemment en utilisant une sonde homologue préparée à partir de la partie 5' du gène de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 23. Les cultures dans un milieu liquide (LB-ampicillin) de ces clones ont été systématiquement lysées bien avant
Une culture a été arrêtée à
et l'ADN plasmidique
(désigné pGE23b) a été extrait. La PCR longue distance
(avec le Taq Extender) a été effectuée sur cet ADN plasmidique en utilisant une amorce directe localisée sur la partie 5 ' de la séquence obtenue précédemment et une amorce réverse localisée en aval sur le vecteur pUC18, pour obtenir un produit d'amplification de 8 kb. La partie 3' a été séquencée ultérieurement. Puis, une nouvelle PCR longue distance a été effectuée en utilisant la même amorce directe localisée sur la partie 5 ' du gène et une amorce réverse localisée sur la partie 3' disponible. Les produits d'amplification de 10 réactions de PCR séparées ont été rassemblés, purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose et séqencés sur les deux brins en utilisant des amorces internes. Ces produits contiennent la partie 3' du gène de l'ADN polymérase de Pyrococcus εp . G23.
2) Position phyloσénétiαue de Pyrococcus sp .
G23 et GE5.
Pyrococcus sp . G23 et G5 apartiennent au même groupe de PCR-RFLP d'ADNr 16S (Meunier, J. R. 1994. Biodiverεi té et sys tématique des populations de mi croorganiεmeε hermophi l es isol éε d ' écoεyε témes hydrothermaux océaniques abyssaux . Thèse, Paris 7) indiquant qu'il pourrait s'agir de deux différentes souches de la même espèce. Toutefois, comme montré sur la figure 3, les profils RFLP différents des gènes de l'ADN polymérase de Pyrococcuε sp . G23 et G5 , obtenus avec les différentes sondes ( Pfu∑ , PfuP, Tlil) indiquent qu'au moins les gènes de l'ADN polymérase présentent des différences significatives. Des hybridations ADN-ADN en slot blots (Marteinsson, V. T., L. atrin, D. Prieur, J. C. Caprais, G. Raguenes, and G. Erauso . 1995. Interna tional Journal of Syεte atic Bacteriology . 45(4) -.623-632) ont conduits à des niveaux contradictoires de relation : 79 % entre GE 23 non marqué et GE 5 marqué, et 98 % entre GE 5 non marqué et GE 23 marqué. L'amplification des gènes des ADNr 16S-23S a été effectuée comme décrit précédemment dans Matériels et Méthodes. La bande amplifiée de 1,9 kb a été purifiée et séquencée sur un brin. La séquence complète de l'ADNr 16S a été comparée avec sa contrepartie de Pyrococcus sp . GE 5 et d'autres espèces de Pyrococcus sp . et Thermococcus . Le niveau de similitude entre Pyrococcuε sp . GE 23 et Pyrococcus εp . GE 5 est de 97,8 % et Pyrococcuε εp . GE 23 a été regroupé avec Pyrococcuε sp . GE 5 { Pyrococcus abyεεi ) dans l'arbre phylogénétique des
ADN polymérases de Thermococcales de la figure 4. De même la figure 5 représente la situation phylogénétique de Pyrococcus sp . GE23 et Pyrococcus sp . GE 5
( Pyrococcuε abyεsi ) sur la base des séquences d'ADNr 16S. Dans ces deux figures, le dendongramme a été établi
par la méthode "Neighbour- joining " et l'échelle représence la distance relative entre les séquences.
3 ) Identification du σène de l'ADN polymérase de Pyrococcus SΌ . GE 5.
Déduisant de la relation entre ces deux souches que l'isolement direct du gène de l'ADN polymérase de Pyrococcuε εp. GE 5 était possible par PCR, les deux amorces GE23DIR et GE23REV, préparées pour cloner le gène de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE
23 dans le vecteur pETl2 , ont été utilisées dans une réaction de PCR contenant l'ADN génomique de Pyrococcus sp. GE 5. Les produits d'amplification de.5 réactions de PCR ont été rassemblés, purifiés et séquences sur les deux brins . La séquence nucleotidique présente une forte homologie (97 %) avec le gène de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 23. Afin d'obtenir la séquence du gène l'ADN polymérase de Pyrococcuε εp . GE 5, différents essais de clonage ont été réalisés. Tout d'abord, un fragment HindIII-HindIII de 2,9 kb, identifié par hybridation ADN-ADN, comme montré à la figure 3 , a été clone dans le vecteur pUClδ, transformé dans E. coli SURE et séquence. Il se présente comme homologue au fragment HindIII-HindIII de 2,9 kb de Pyrococcus εp. GE 23 clone précédemment et contenant la partie 5 ' du gène cible. Deuxièmement, un fragment positif Xbal-Xbal de 2,6 kb, contenant potentiellement la totalité de la portion codante, a été identifié par hybridation ADN-ADN en utilisant le gène de 1 'ADN polymérase de Pyrococcus sp . GE 5 produit par PCR comme sonde radio-marquée. Ce fragment a été clone dans les vecteurs pUC18, pBluescript et pET12 et transformé dans E. coli Novablue
(souche recA-) . Trois clones recombinants positifs parmi
600 ont été obtenus avec pET12 et aucun avec pUC18 et pBluescript. Les profils de restriction des clones recombinants pETl2 démontrent que l'intégrité de la
construction n'a pas été préservée. La figure 3 montre que la majeure partie de 1 ' insert a été délétée dans le procédé et seul subsiste le fragment 3 ' de 342 pb HindlII-Xbal. La séquence définitive du gène de l'ADN polymérase de Pyrococcuε εp . GE 5 est composée d'une partie 5' génomique HindIII-HindIII, d'une portion interne HindIII-HindIII de 611 pb issue de produits de PCR et de la partie 3' de 342 pb génomique.
4 ) Séquences nucléotidiσue et polvpeptdiαue des ADN polymérase de Pyrococcus SΌ . GE 23 et GE 5.
a) ADN polymérase de Pyrococcuε SΌ . GE 23. Le fragment de Pyrococcuε εp . GE 23 HindlII- HindIII de 2,9 Kb qui a été clone ainsi qu'un fragment contigu dans le sens 3' de 1,6 Kb obtenu par PCR longue distance ont été séquences sur les deux brins et assemblés. La séquence de 4447 pb obtenue a été étudiée pour déterminer les régions susceptibles d'être traduites . Deux cadres de lecture ouverts ont été mis en évidence. Le premier, dans le cadre 2, s ' étendant de la paire de bases 1547 à la paire de bases 3862 correspond au gène de l'ADN polymérase codant pour une protéine de 771 acides aminés, dont le poids moléculaire déduit de la séquence est de 89 409 Daltons et le point isoélectrique théorique de 8,37. Ce poids moléculaire correspond au poids moléculaire apparent estimé par SDS- PAGE de l'ADN polymérase recombinante. Le second ORF a été localisé sur le cadre 4 entre les paires de bases 1439 et 627.
La séquence déduite a une longueur de 270 aminés et les recherches de similitude effectuées avec les programmes BLAST et FASTA n'ont révélé aucune homologie significative avec les séquences disponibles dans les bases de données Swiss-Prot et PIR.
b) ADN polymérase de Pyrococcus SΌ . GE 5.
La séquence codante complète du gène de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp . GE 5 produit par PCR en utilisant les amorces préparées à partir du gène de Pyrococcus sp . GE 23 a été obtenue par séquençage des deux brins. Afin de confirmer la séquence de ce produit de PCR, le fragment de Pyrococcus εp . GE 5 HindIII- HindIII de 2,9 Kb qui a été clone a également été séquence sur les deux brins, et les mêmes résultats ont été obtenus . La région 3 ' du gène a également été séquencée à partir de 1 ' insert HindlII-Xbal restant de 342 pb résultant de la délétion d'une partie du fragment Xbal-Xbal de 2,6 kb. Seule la région interne HindIII- HindIII de 611 pb de la séquence du gène obtenue à partir des produits de PCR n'a pas été confirmée au niveau génomique. Un cadre de lecture ouvert entre les paires de bases 679 et 2994 a été identifié dont la traduction produit une séquence polypeptidique de 771 acides aminés, longueur identique à celle de l'ADN polymérase de Pyrococcus εp . GE 23.
c) Comparaison des séσuences des deux polymérases .
L'alignement des parties codantes des deux gènes montre leur forte parenté, puisqu'ils ne diffèrent que de 64 nucléotides dispersés le long des séquences à deux exceptions près. On observe tout d'abord 14 substitutions entre les paires de bases 1541 et 1603, faisant de cette région, la plus variable de la toute séquence, puis on constate un nombre limité de substitutions dans la région 3 ' entre les paires de bases 1890 et 2316. La plupart de ces substitutions sont sans conséquence au niveau des séquences polypetidiques , notamment les 23 premières substitutions sont sans effet sur la composition des protéines . La comparaison avec d'autres gènes d'ADN polymérases de Thermococcales
disponibles dans les bases de données révèle que la région hautement variable entre les paires de bases 1541 et 1603 de Pyrococcuε εp . GE 23 et GE 5 semble être une caractéristique de ces deux souches, la diversité étant bien distribuée sur les autres séquences de gènes codant pour des ADN polymérases. La comparaison au niveau des séquences polypeptidiques montre la forte similitude des deux ADN polymérases, 98 % d'homologie avec la méthode CLUSTAL V, et seulement 10 résidus différents. Les substitutions d'acides aminés sont donnés dans le tableau I et les alignements avec les ADN polymérases d'autres Thermococcales sont représents aux figures 6 et 7.
La figure 6 représente l'alignement de la séquence polypeptidique de l'ADN polymérase de Pyrococcuε εp. GE 23 avec celle des ADN polymérases de : Deep Vent (intein-), Pyrococcuε εp . KODl, Pyrococcuε furioεus , Vent (Tli intein-), Pyrococcuε εp . 9°N.
La figure 7 représente l'alignement de la séquence polypeptidique de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp . GE 5 avec celle des ADN polymérases de : Pyrococcuε εp . GB-D, Pyrococcuε εp . KODl, Pyrococcus furiosus, Thermococcus U toraïis , Pyrococcus εp . 9°N.
Le tableau II ci-dessous indique les pourcentage de similarités entre les séquences polypeptidiques de : (1) Pyrococcus εp . GE 23 , (2) Pyrococcuε εp . GE 5, (3) Pyrococcuε εp . GB-D, (4) Pyrococcuε εp . KODl, (5) Pyrococcuε furi osus , (6) Thermococcus U toraïis, (7) Pyrococcus sp . 9°N.
Tableau II
La plupart des substitutions d'acides aminés entre les ADN polymérases de Pyrococcuε εp . GE 23 et GE 5 sont non conservatives , mais aucune n'est localisée dans les motifs connus pour être impliqués dans l'action catalytique de l'enzyme, ni dans les domaines 3'- 5' exonucléase ou polymérase. Les deux gènes ne possèdent aucune séquence intronique ( IVS ou intéines) contrairement aux gènes d'ADN polymérase de T . U toraïis , Thermococcuε sp . KODl, Pyrococcus εp . GB-D, et présentent la même organisation que les gènes d'ADN polymérase de P . furiosus et Pyrococcuε εp . 9°N.
5) Expression, caracterisation et activité de l'ADN polymérase de Pyrococcuε SΌ . GE 5.
a) Clonaσe et expression.
Un insert de 2320 pb couvrant la séquence d'ADN de 2316 pb de SEQ ID NO : I codant pour l'ADN polymérase de Pyrococcus εp . GE 5 a été clone aux sites Ndel et BamHI d'un vecteur pour transformer la souche E . coli BL21(DE3) . Des mini-préparations d'ADN plasmidien ont été réalisées sur une vingtaine de clones transformants et un seul a été sélectionné sur la base de la taille des fragments d'ADN libérés après digestion par les enzymes de restriction Ndel et BamHI .
Des essais d'expression ont ensuite été réalisés à 37°C, en erlenmeyer, avec le clone sélectioné. L'expression est induite en phase exponentielle de croissance (DO 600nm = 0,6 - 0,7) avec les concerntations en IPTG de O ; 0,5 ; l et l, 5 mM. Des échantillons sont prélevés à différents moments au cours de la culture et les protéines analysés par electrophorese sur gel de polyacrylamide et coloration au bleu de Coomassie . La figure 8 représente les résultats des essais d'expression, dans lesquels :
- Le puits No. 1 correspond à la protéine Ladder de 10 kDA (Gibco BRL) .
- Le puits No. 2 correspond à l'échantillon induit sans IPTG, temps 0 (phase exponentielle de croissance) .
- Le puits No. 3 correspond à l'échantillon induit sans IPTG, 1 heure après l'induction.
- Le puits No. 4 correspond à l'échantillon induit sans IPTG, 4 heure après l'induction. - Le puits No. 5 correspond à l'échantillon induit sans IPTG, 18 heure après l'induction.
- Le puits No. 6 correspond à la protéine Ladder de 10 kDA (Gibco PRL) .
- Le puits No. 7 correspond à l'échantillon induit avec 1 mM d'IPTG, temps 0 (phase exponentielle de croissance) .
- Le puits No. 8 correspond à l'échantillon induit avec 1 mM d'IPTG, 1 heure après l'induction.
- Le puits No. 9 correspond à l'échantillon induit avec 1 mM d'IPTG, 4 heure après l'induction.
- Le puits No. 10 correspond à l'échantillon induit avec 1 M d'IPTG, 18 heure après l'induction.
On observe que seules les cellules cultivées en l'absence d'IPTG expriment l'ADN polymérase et le taux est maximum après une nuit de culture. Le poids moléculaire de la protéine exprimée est estimé à 89 Kda .
b) Fermentation et extraction des cellules. La culture de la souche Pyrococus sp. GE 5 a été réalisée selon un protocole standard. On a ajouté le facteur de sélection du plasmide au milieu R12 choisi pour la préculture et la culture. Le transfert de la préculture vers le fermenteur a été effectué lorsque la densité optique à 600 nm de la préculture était d'environ 0,8. Le fermenteur NBS MICROS (25 litres) a été employé pour cette production, avec un volume de culture de 24 litres. Les conditions de fermentation ont été les suivantes : température = 37°C ; agitation = 300 rpm ; aération = 30 1/m ; oxygène dissous = 15 %. Le pH est régulé à 6,8 avec NaOH pendant la phase d'acidification. Lors de la phase de basification, le pH est demeuré en libre évolution. Les bactéries ont été récoltées près 16 à 17 heures de culture. La densité optique finale était d'environ 10 unités et le pH final de 8. La culture a ensuite été concentrée par filtration sur fibres creuses (AMICON) , jusqu'à obtenir un volume final de 2 litres. Ce concentré de bactéries a alors été utilisé pour la purification des protéines . Après concentration cellulaire, les cellules sont broyées en continu au moyen d'un broyeur à billes et le broyât cellulaire est additionné de PMSF 1 mM.
c ) Puri fication de l ' ADN polymérase de Pyrococcus SΌ . GE 5 .
Après centri fugation du broyât cellulaire ( 15 minutes à 10000 g ) , le surnageant ( fraction soluble ) es t récupéré et chauf fé 15 minutes à 75°C . Le précipité f ormé après dénaturation thermique es t é l iminé par centrifugation ( 15 minutes à 10000 g ) . Le surnageant est chargé sur une colonne d ' échange d ' anions :
- Matrice Q Sépharose Fas t Flo dans une colonne XK 16 /30 ( Pharmacia) .
- Système chromatographique : Bio Pilot (Pharmacia) .
- Tampon A : Tris-HCl 50 mM, pH 8 et tampon B : Tris-HCl 50 mM, pH 8 + NaCl 0,5 M. - Débit : 10 ml/mn ; gradient 0-50% B en 60 minutes .
- Fractions : 10 ml/tube.
La figure 9 représente le profil d'élution de l'échantillon constitué de 450 ml de protéines solubles après dénaturation thermique à 75°C.
La figure 10 représente l'analyse par SDS- PAGE (Phast System, Pharmacia) , en présence de β- mercaptoéthanol, de différentes fractions issues de la purification : - Gels : Phast gel 8-15% (Phast System,
Pharmacia) .
Lignes 1 et 8 : marqueur de poids moléculaire (10 Kda, Bio-Rad) .
- Ligne 2 : Protéines totales . - Ligne 3 : protéines solubles après broyage .
Ligne 4 : protéines solubles après dénaturation thermique .
- Lignes 5, 6 et 7 : fractions 1, 2 et 3 après chromatographie sur QFF de la figure 2.
Comme illustré par la figure 10, l'ADN polymérase de Pyrococcuε εp . GE 5 est soluble et thermostable. Elle est éluée vers 0,15 M NaCl lors de la chromatographie d'échange d'ions. Les fractions contenant l'ADN polymérase de Pyrococcuε εp . GE 5 ont été rassemblées (fraction 2; 50 ml) et chromatographiées sur hydroxyapatite (type II, Biorad) :
- Matrice : hydroxyapatite type II dans une colonne 10/5 (Biorad) . - Système chromatographique : FPLC
(Pharmacia) .
- Tampon A: Phosphate 50 mM pH 8; tampon B : Phosphate 500 mM pH 8.
- Débit : 10 ml/min; gradient 0-100% B en 30 minutes . La figure 11 représente le profil d'élution de l'échantillon constitué de 50 ml de la fraction 2 après chromatographie d'échange d'ions. Les différentes fractions ont été analysées par spectrométire UV et par SDS-PAGE. La fraction non absorbée contient principalement des acides nucléiques tandis que les fractions 1 à 3 contiennent l'ADN polymérase de Pyrococcuε εp . GE 5. Après chromatographie, 1 mM de mercaptoethanol, 0,1 % Tween 20 et 50 % glycerol ont été ajoutés avant conservation à -20°C.
d) Caracterisation des fractions purifiées . Les 3 fractions obtenues après chromatographie sur hydroxyapatite ont été analysées par SDS-PAGE en présence de 2-mercaptoéthanol (figure 12) : - Gels : gel 15 % (Laemli, Babygel) .
Lignes 1 et 5 : Marqueur de poids moléculaire (Bio-Rad, Broad Range) .
- Ligne 2 fraction 1 (5 μl) .
- Ligne 3 fraction 2 (5 μl) . - Ligne 4 fraction 3 (5 μl) .
- Ligne 6 fraction 1 (10 μl) .
- Ligne 7 fraction 2 (10 μl) .
- Ligne 8 fraction 3 (10 μl) .
Comme illustré par la figure 12 et a la figure 13, la fraction 1 contient de l'ADN polymérase de
Pyrococcus sp. GE 5 homogène en SDS-PAGE, alors que les fractions 2 et 3 sont contaminées par 2 protéines de 35
Kda et 65 Kda .
e) Activité des fractions purifiées.
L'activité d'ADN polymérase des différentes fractions a été testée dans une réaction d'amplification de type PCR. Un fragment de 1300 pb environ a été amplifié à partir d'un ADN cible et d'amorces spécificjues . Le tampon utilisé est composé de :
- Tris-HCl : 75 mM pH 9,0.
- (NH )2S0 : 20 M.
- 0,01 % (w/v) Tween 20.
- MgCl2 : 1,5 mM.
Trente cinq cycles ont été réalisés, chacun comprenant une étape de dénaturation de 1 minute à 94°C, une étape d ' appariement des oligonucleotides de 1 minute à la température appropriée et une étape d'élongation de 3 minutes à 72°C. La figure 13 rapporte les résultats obtenus avec un volume réactionel de 100 μl pour des quantités d'ADN polymérase de Pyrococcus sp . GE 5 de 2,5 μg, 1 μg, 0, 1 μg et 0, 01 μg :
- Puits No. 1 1 kb DNA ladder (Gibco BRL) .
- Puits No. 2 fraction 1 (2,5 μg) .
- Puits No. 3 fraction 1 (1 μg) .
- Puits No. 4 fraction 1 (0, 1 μg) .
- Puits No. 5 fraction 1 (0,01 μg) .
- Puits No. 6 fraction 2 (2,5 μg) .
- Puits No. 7 fraction 2 (1 μg) .
- Puits No. 8 fraction 2 (0,1 μg) .
- Puits No. 9 fraction 2 (0,01 μg) .
- Puits No. 10 fraction 3 (2, 5 μg) .
- Puits No. 11 fraction 3 (1 μg) .
- Puits No. 12 fraction 3 (0,1 μg) .
- Puits No. 13 fraction 3 (0, 01 μg) .
- Puits No 14 : 1 kb DNA ladder (Gibco
BRL) .
- Puits No. 15 : Contrôle positif avec la Taq polymérase.
6 ) Conditions d'optimisation de la PCR pour les polymérases de l'invention.
Afin de simplifier l'exposé des résultats ci-après et des figures qui s'y rapportent, les ADN polymérases thermostables de Pyrococcus abyssi
(Pyrococcus εp . GE 5) et Pyrococcus s . GE 23 seront désignées respectivement ci-après Pab et Ppr .
Des essais de PCR ont été effectués dans les conditions suivantes :
- 10 mM Tris HC1, pH 9,0
- 50 mM KC1
- 3 mM MgS0 - 0,1 % Tween - 0,312 mM de chaque dNTP
- 50 picomoles de chaque oligonucléotide de formule :
5 ' CACCTTAGGGTTGCCCATAA3 ' 5 ' TGGGCATAAAAGTCAGGGCAG3 ' - 1 U. de Pab (figure 14) ou de Ppr (figure
15)
- Quantité croissante d'ADN génomique humain de β-globine (de 0,5 ng à 3 μg) ; volume réactionel : 50 μl. Le programme de PCR suivant a été utilisé :
- 5 minutes à 93°C
- 37 fois (1 minute à 62°C ; 2 minutes à 72°C ; 1 minute à 91°C)
- 1 minute à 62°C - 10 minutes à 72°C.
Les figures 14 et 15 représentent les produits de PCR déposés sur gel d'agarose 2% en présence du marqueur pBR digéré par HaelII.
Les amorces choisies permettent d'amplifier un fragment de 420 pb . Pab et Ppr permettent d'obtenir un produit de PCR de 420 pb quelque soit la quantité de
matrice comprise entre 0,5 ng et 1 μg . Un produit de PCR a également été obtenu dans ces mêmes conditions en présence de 10 picogrammes de matrice d'ADN.
7) Aptitude à l'amplification de la Pab et de la Ppr à hautes températures .
Les tests d'activité des polymérases recombinantes de Pyrococcus abyεεi (Pab) et de Pyrococcuε sp . GE23 (Ppr) réalisés avec la méthode d'incorporation de dNTP marqués ont démontré, dans les conditions de tampons retenues, une activité résiduelle jusqu'à 85°C. Au delà de cette température, une possible dégradation du substrat pourrait masquer l'activité des polymérases de l'invention. Il est cependant intéressant d'apprécier si cette aptitude peut être mise à profit pour de l'amplification de gène in vi tro, sachant que certaines applications spécifiques pourraient en découler : - PCR sur des matrices possédant des structures secondaires blocantes aux températures usuelles d'élongation de 72 à 74°C,
- PCR inverse directe sur matrice circulaire double brin (chromosome) . Les principes de la PCR inverse (iPCR) et de la méthode nouvelle élaborée avec la Pab, dénommée High- Temperature inverse PCR (HT-iPCR) sont représentés dans les schémas de la figure 16. Un double brin d'ADN, de séquence partiellement connue représentée "en gras" dans la figure 16, est coupé par une enzyme de restriction RI, dilué et ligaturé pour former une molécule d'ADN circulaire double brin.
Dans la PCR inverse conventionnelle (procédure indiquée 1, 2 et 3 dans la figure 16), les molécules circulaires sont linéarisées par RII et l'amplification s'effectue sur l'ADN linéarisé. En HT-
iPCR, l'amplification est effectué sur les molécules circulaires (procédure indiquée 2' dans la figure 16).
a) Matériels et méthodes. La matrice d'ADN retenue pour ces travaux est un fragment circulaire d'ADN de 2,2 kb. Ce fragment est obtenu par digestion de l'ADN génomique de l'isolât
Thermococcuε sp . GE8 par l'enzyme Xho, purification sur gel d'agarose à 0,8% et élution de la bande 2 - 2,5 kb par la méthode de GeneClean, puis ligature des extrémités des fragments linéaires par la ligase T4.
Les amorces oligonucleotidiques sont choisies sur la partie de séquence connue de ce fragment circularise de manière à copier depuis la région connue vers la région de séquence inconnue (figure 16) .
Les cycles d'amplification ont été réalisés avec un thermocycleur à gradient de la société Stratagene dans les conditions suivantes :
HT-iPCR avec un seul cycle à 85°C : 94°C, 15s/l cycle
94°C, 15s/56°C, 45s/85°C, 4mn/lcycle 94°C, 15s/56°C, 45s/82-78°C, 4mn/l cycle 94°C, 15s/56°C, 45s/76-72°C, 4mn/lcycle 94°C, 15s/56°C, 45s/72°C, 4 mn/27 cycles HT-iPCR continue à 85°C :
94°C, 15s/l cycle
94°C, 15s/56°C, 45s/85°C, 4mn/30 cycles stockage à 4°C
Les résultats sont visualisés sur gels d'agarose à 0,8%.
La figure 17 représente la comparaison des résultats de i-PCR et de HT-iPCR en utilisant la Taq et la Pab : ligne 1 : marqueur "Raoul" (société Appligene-Oncor)
- ligne 2 : HT-iPCR avec la Pab
- ligne 3 : HT-iPCR avec la Taq
- ligne 4 : i-PCR avec la Taq.
La figure 18 représente la PCR à haute température (elongation à 85°C sur 30 cycles) : ligne 1 : marqueur "Raoul" (société Appligene-Oncor)
- ligne 2 Pab
- ligne 3 Ppr
- ligne 4 témoin sans ADN - ligne 5 Vent.
b) Résultats.
Les résultats de la PCR inverse avec un seul cycle initial d' elongation à haute température (85°C) mettent en évidence un excellent comportement de la Pab, et une inaptitude de la Taq (Perkin-Elmer ) à effectuer ce type de réaction. Le témoin de PCR inverse après linéarisation de la matrice par la Taq fournit un signal de faible amplitude dans les conditions retenues (figure 17) .
Les résultats obtenus avec 30 cycles d'amplification avec des températures d' elongation de 85°C mettent en évidence une excellente aptitude de la Pab à effectuer ce type de réaction (figurelδ) . La Ppr est également en mesure d'amplifier l'ADN cible dans ces conditions, mais la Vent polymérase en est incapable de même que la Pfu.
Les résultats rapportés ci-dessus permettent des applications remarquables des polymérases de 1 ' invention .
D'une part, l'amplification de fragments d'ADN présentant des structures secondaires rendant difficile 1 ' elongation à des températures de 72-74°C. Le fait de monter en température jusqu'à 85°C permet de résoudre ces structures secondaires qui peuvent se
former sur du simple brin lors de l'étape d'hybridation des amorces .
D'autre part, sur le chromosome lorsqu'une faible partie de séquence d'un gène est connue. La méthode exposée ci-dessus s'applique d'une manière générale comme suit :
- digestion de l'ADN génomique par plusieurs enzymes de restriction,
- ligature par un ligase, comme la ligase T4, des produits de digestion,
- HT-iPCR à partir d'amorces de sens opposé sur la partie de séquence connue en utilisant la Pab ou la Ppr,
- éventuellement séquençage des produits d'amplification.
8) Étude de la thermostabilité des enzymes recombinantes de l'invention. a) Matériels et méthodes . Pour réaliser les tests nécessaires à cette étude, les ADN polymérases Pab et Ppr sont diluées dans un tampon de conditionnement (20 mM Tris-HCl pH=8,0 ; 1 mM EDTA ; 1 mM dithiothréitol ; 50 % glycerol ; 0,5 % Tween 20 ; 0,5 % Nonidet 40 ; 0,2 mg/ml BSA), de façon à ajouter 0,01 U. de polymérase par test et à se placer dans les conditions non saturantes. Ainsi, 0,01 U. de Pab ou de Ppr sont incubés en 20 μl de tampon d'incubation (10 mM Tris HC1 pP=9,0 ; 50 mM KCl ; 3 mM MgSθ ; 0,1 % Tween) à différents temps (de 0 à 36 heures), à 92°C, à 95°C ou à 100°C. Autant de tubes que de temps différents d'incubation ont été préparés à partir d'un même mélange initial. Les différents tubes sont incubés dans un bain à sec (bloc PCR) . A la fin de l'incubation, les tubes sont mis dans la glace et l'activité résiduelle de l'enzyme sera dosée à 72°C comme décrit ci-après.
Le test d'activité est effectué dans un volume final de 100 μl de tampon d'incubation (10 mM Tris HC1 pP=9,0 ; 50 mM KC1 ; 3 mM MgS0 ; 0,1 % Tween) dans les conditions suivantes : - 13 μg d'ADN activé de thymus de veau
- 500 μM de chacun de 4 dNTP
- 10 μci de l'un des quatre dNTP marqué au 32P utilisé comm etraceur (du dATP ou dNTP ont été utilisés) - les 20 μl de la solution correspondant au test d' inactivation par la température.
Les essais sont incubés 30 minutes à 70°C. 10 μl de chaque test sont prélevés après 10 minutes, 20 minutes et 30 minutes d'incubation, puis sont déposés sur papier DE81 ( hatmann) . Un compactage avant lavage est alors réalisé à sec par la méthode de Cerenkov. Les papiers DE81 sont ensuite lavés trois fois 5 minutes dans une solution 0,5 mM de Na2HP04 afin d'éliminer les dNTP non incorporés. Un passage à l'alcool permet un séchage rapide des papiers qui sont remis à compter. Un témoin négatif (To) est réalisé sans ADN polymérase et un témoin positif est réalisé avec de l'ADN polymérase non traité à la température, correspondant au temps 0 heure. Une unité polymérase est la quantité d'enzyme nécessaire à l'incorporation de 10 nmoles de nucléosideε en produits acido-solubles en 30 minutes à 72°C dans les conditions d'essais. L'activité polymérase est calculé en faisant la moyenne des coups totaux avant lavage en 10 μl de dépôt. Ceux-ci correspondent à 4 x 5 nanomoleε de chaque dNTP, soit 20 nanomoles de dNTP totaux. A chaque valeur après lavage (Ci), il faut retrancher la valeur du témoin négatif To (sans enzyme) . Soit, U/μl =
(Ci-To) x (30min/temps d'incubation) x (lOOμl/lOμl dépôt) x dilution polymérase
(Ct pour 10 nanomoles) x μl de polymérase ajouté
b) Résultats.
Les deux enzymes ont été étudiés à trois températures 92°C, 95°C et 100°C. Tous les travaux ont été réalisés en parallèle avec les mêmes substrats. Les résultats sont représentés sur les courbes des figures 19 à 22. Pour les figures 21 (tableau V ci-après) et 22 (tableau VI ci-après) , les différentes polymérases étudiées sont ramenées à une même base au niveau activité initiale, pour en faciliter l'étude comparative. Une quatrième température de 105°C a également été étudiée pour la Pab mais n'est pas illustrée dans les figures.
Figure 19 : activité Pab.
Le tableau III ci-dessous rapporte les résultats de 1 ' inactivation de la Pab en fonction du temps à 100°C, 95°C et 92°C.
Tableau III
Le tableau IV ci-dessous rapporte les résultats de 1 ' inactivation de la Ppr en fonction du temps à 100°C , 95°C et 92°C .
Tableau IV
Figure 21 : activité Pab et Ppr après inactivation à 100°C.
Le tableau V ci-dessous rapporte l'activité de Pab et Ppr après inactivation à 100°C.
Tableau V
Figure 22 : activité Pab. Ppr et polymérase de thermus acruaticus (Taσ) après inactivation à 92°C.
Le tableau VI ci-dessous rapporte l'activité de Pab, Ppr et de la Taq après inactivation à 92°C.
Tableau VI
L'analyse des courbes des figures 19 à 22 montrent que :
- Pab conserve 90% de son activité après un traitement de 5 heures à 92°C, 70% après 5 heures à 95°C et 60% après 5 heures à 100°C. La Pab conserve 50% de son activité après un traitement de 90 minutes à 105°C.
- Ppr conserve 68% de son activité après 5 heures à 92°C, 65% après 5 heures à 95°C et 10% après 5 heures à 100°C.
En comparaison Taq pol conserve 55% de son activité après 5 heures à 92°C, mais elle n'a qu'une demi-vie de 90 minutes à 95°C et de 5 minutes à 100°C.
D'après les courbes des figures 19 à 22 et les commentaires ci-dessus, l'enzyme Pab est plus thermostable que la Ppr et ce, malgré une différence seulement dix résidus entre leur séquence. L'enzyme Pab est la plus thermostable actuellement décrite avec une demi-vie à 95°C de 18 heures et de plus de 8 heures à 100°C. L'enzyme Ppr présente une thermostabilité comparable a celle publiée par la Vent voire même meilleure avec 2 heures de demi-vie à 100°C.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GÉNÉRALES :
( i ) DEPOSANT : APPLIGENE - ONCOR ( ii ) TITRE DE L ' INVENTION : ADN POLYMERAS E
THERMOSTABLE D ' ARCHAEBACTÉRIES DU GENRE PYROCOCCUS SP. ( iii ) NOMBRE DE SEQUENCES : 2 ( 2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 1 :
( i ) CARACTRERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 4446 paires de bases
(B) TYPE : nucléotide
( C ) NOMBRE DE BRIN : double ( D) CONFIGURATION : linéaire
( ii ) TYPE DE MOLECULE : ADN ( ix ) C ARACTERI STIQUES
( A ) NOM/ CLE : séquence c odante de l ' ADN polymérase de Pyrococcus sp . GE. 23 (B) EMPLACEMENT : de 1547 à 3862
( ix ) CARACTERISTIQUES
(A) NOM/CLE: codon stop
(B) EMPLACEMENT: de 3860 à 3862
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID NO : 1 :
CGAAGATGAG AGATTTGGTG GAATGCCGAC TTACGGGCAA GAAATTTGAG AGAGATAAAA 60
TCAACGTTAA GATAGCGGTG GCCTATTCTG GAGGAAGCGA TAGCTCAGCC ACAGTAAAGA 120 TACTGAGATG GGCTGGCTTT GATGTGGTCC CAATAACGGC GAGGCTTCCC CACATAAGCA 180
AAGAGGAGTT ACGGGAAGAA ACTCTATTCG TGGAAGTTCC TGGGTACCTT GAGGAGATGG 240
AGAGGTTAAT AGAAAAGAGG GCCCCTATCT GTGGAAGGTG CCACTCTATG GTTATGAGAG 300
CTGTTGCGAG AAAAGGTTAG GGAGCTTAAA ATAAGAATAC TCGCTACTGG AGACATGCTC 360
AGCATAGGAA GCGGGTCAAT CTACGAGAAA GAAAATCTTG TGATTTTGAA CTTACCAGCT 420 TTCCTATCAC TAAACAAGGT TGACCTTCTG AGCATACTAG GCTGGGAGGA TTATGAGTTT 480
AAGTATGGAT GCCCCCTTTG GAGGGAGGCC GTGAAAAGGG CTCCAATAAT GAAGAGGTTT 540
GCAATCCAGA GGGTTCTGAG GGAATTGAGG GCAGGGGCAA TAAACGAGAA TATTGCTAAG 600
AAACTTATTT TTGATATATT AAGGGCCTAA ACGAACCTCG CCGGTCTGAG GGTTTTCACT 660
TTAATTTCCT TGTCTATCGT AACCCTGAAC CCTTCCTTGG CCACATAGGT TTTCACGCCG 720 GTAACGTTTT GGATATACTG GGCCTCCTTA TAGGGACCAG CGAAGTGCAT CTTCATGCCG 780
AGATGCGTCA TCACGAGAAC TTCAGGCCTT TGCTTCATTG CCTTTAGCAT GTAAACTATG 840
TCGTCGGTTG ATAAGTGGTA GGGAATCTTC ATGTCCCTGG GCCTCGTTAC TGAGGCTATC 900
AAAACTCTCG ACCCATCATG CCAGCTTACC AGCTCTGGAA AATACTCAGT ATCCGCTATG 960
TACGAGATAT CCCCAAGGCT GGTTTTTAAT CTAAAGCCTA TCGTTGTTGA GTCGCTGTGC 1020
TGGGATGGAG TTATTATCAT CTCCTCATTT CCTAACCTAA ACCTGTCCCC AGGATTGGGG 1080
GCATGGACTT CCTCTAATGC CTCCAAGTGG TACTTGCTCA GGGCTGGGGT ATGATCCTCG 1140
CCCCCATAAA ACACGCTTCT AGAACCTATT AGGGTTCCCC TCTTCTTAGT AACACCGTAT 1200
GTCATTCCCA CAACGAACAC CTCGGCGGCG GTGGAGTGAT CGGTGTGTCT ATGCGAAATG 1260
AAGAGAACAT CTATCTTCCT GGGGTCTAAC TTGTATCTAA TCATCCTAAC TAGCGCTCCA 1320
GGCCCAGGAT CCACAAAGAT ATTTTTGCTT GCCTTGATGA AGAATCCCCC TGTGGATCTT 1380 ACTTGAGTTA TCGTCACGAA CCTGCCCCCA CCGGCACCCA AGAACGTAAT CTCTATCATT 1440
TTTAGTCCCG AAATTAAAGT GCGAGGCTTA TGCTTTTAAG GATGTATGGC GAAAGGTGAA 1500
GTTTATTAGA AGTTAGAATC TAAAGATTTC AGATTGGGTG GGGGTA ATG ATA ATC 1555 Met lie Ile
1 3
GAT GCT GAT TAC ATA ACG GAA GAT GGC AAG CCG ATA ATA AGA ATA TTC 1603
Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Ile Ile Arg Ile Phe 5 10 15
AAA AAG GAA AAG GGA GAG TTT AAG GTA GAA TAC GAT AGG ACG TTT AGA 1651
Lys Lys Glu Lys Gly Glu Phe Lys Val Glu Tyr Asp Arg Thr Phe Arg 20 25 30 35
CCC TAC ATT TAC GCT CTT TTA AAG GAT GAT TCG GCC ATA GAT GAG GTT 1699
Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile Asp Glu Val 40 45 50 AAG AAG ATA ACC GCC GAG AGG CAC GGA AAG ATA GTC AGG ATA ACC GAA 1747
Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg Ile Thr Glu 55 60 65
GTT GAG AAA GTC CAG AAG AAA TTC CTA GGA AGG CCA ATA GAA GTC TGG 1795 Val Glu Lys Val Gin Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile Glu Val Trp 70 75 80
AAG CTG TAC CTT GAG CAT CCA CAA GAC GTT CCA GCT ATC AGA GAG AAG 1843
Lys Leu Tyr Leu Glu His Pro Gin Asp Val Pro Ala Ile Arg Glu Lys 85 90 95
ATA AGG GAA CAT CCA GCT GTA GTT GAT ATA TTC GAA TAC GAC ATA CCC 1891
Ile Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr Asp Ile Pro 100 105 110 115
TTT GCG AAA CGC TAC CTA ATA GAT AAG GGA TTG ACT CCA ATG GAG GGG 1939
Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Thr Pro Met Glu Gly 120 125 130 AAC GAG GAG CTA ACG TTT CTA GCA GTT GAC ATA GAA ACA TTG TAC CAT 1987
Asn Glu Glu Leu Thr Phe Leu Ala Val Asp Ile Glu Thr Leu Tyr His 135 140 145
GAA GGA GAG GAG TTC GGG AAA GGC CCT ATA ATC ATG ATC AGC TAC GCC 2035 Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile Ser Tyr Ala 150 155 160 GAC GAG GAA GGG GCC AAG GTG ATA ACT TGG AAG AGC ATA GAC TTA CCT 2083 Asp Glu Glu Gly Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Ser Ile Asp Leu Pro 165 170 175
TAC GTT GAA GTG GTT TCA AGC GAG AGG GAG ATG ATA AAG AGG CTC GTG 2131 Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys Arg Leu Val 180 185 190 195
AAG GTA ATT AGA GAG AAG GAT CCC GAC GTG ATA ATA ACG TAC AAT GGT 2179 Lys Val Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Ile Ile Thr Tyr Asn Gly 200 205 210
GAT AAT TTC GAC TTT CCG TAC CTC TTA AAG AGG GCT GAA AAG CTC GGA 2227 Asp Asn Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Leu Lys Arg Ala Glu Lys Leu Gly 215 220 225
ATA AAG CTC CCC CTT GGA AGG GAC AAT AGC GAG CCG AAG ATG CAG AGG 2275 Ile Lys Leu Pro Leu Gly Arg Asp Asn Ser Glu Pro Lys Met Gin Arg 230 235 240 ATG GGG GAT TCA TTA GCT GTA GAG ATA AAG GGC AGA ATA CAC TTC GAT 2323 Met Gly Asp Ser Leu Ala Val Glu Ile Lys Gly Arg Ile His Phe Asp 245 250 255
TTA TTC CCC GTC ATA AGA AGA ACG ATC AAC CTT CCA ACA TAC ACC CTC 2371 Leu Phe Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu 260 265 270 275
GAA GCG GTT TAT GAG GCT ATA TTT GGA AAG TCT AAG GAG AAA GTC TAT 2419 Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Ser Lys Glu Lys Val Tyr 280 285 290
GCC CAT GAG ATA GCT GAG GCC TGG GAA ACC GGG AAA GGG CTA GAG AGG 2467 Ala His Glu Ile Ala Glu Ala Trp Glu Thr Gly Lys Gly Leu Glu Arg 295 300 305
GTA GCT AAG TAT TCA ATG GAA GAT GCG AAG GTA ACC TTT GAG CTC GGA 2515 Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Phe Glu Leu Gly 310 315 320 AAG GAG TTC TTC CCA ATG GAA GCC CAG CTA GCT AGG CTC GTT GGC CAG 2563 Lys Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gin Leu Ala Arg Leu Val Gly Gin 325 330 335
CCA GTT TGG GAC GTT TCA AGG TCG AGC ACC GGA AAC CTC GTT GAG TGG 2611 Pro Val Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp 340 345 350 355
TTT CTC CTT AGG AAG GCC TAC GAG AGA AAT GAG CTC GCG CCC AAT AAA 2659 Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Lys 360 365 370
CCG GAC GAG AGG GAA TAC GAG AGA AGG CTA AGA GAG AGC TAT GAA GGG 2707 Pro Asp Glu Arg Glu Tyr Glu Arg Arg Leu Arg Glu Ser Tyr Glu Gly 375 380 385
GGT TAC GTT AAG GAG CCA GAG AAG GGA TTG TGG GAA GGG ATA GTC AGC 2755 Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Gly Ile Val Ser 390 395 400 TTA GAC TTT AGG TCC CTA TAT CCG TCT ATA ATT ATA ACT CAC AAC GTC 2803 Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His Asn Val 405 410 415
TCA CCA GAC ACT TTG AAT AGA GAA AAT TGC AAG GAA TAC GAC GTT GCC 2851 Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Asn Cys Lys Glu Tyr Asp Val Ala 420 425 430 435
CCC CAA GTG GGG CAC AGA TTC TGC AAG GAT TTC CCA GGA TTC ATA CCA 2899 Pro Gin Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe Ile Pro 440 445 450
AGC TTA CTG GGT AAC TTA CTG GAG GAG AGA CAA AAG ATA AAA AAG AGA 2947 Ser Leu Leu Gly Asn Leu Leu Glu Glu Arg Gin Lys Ile Lys Lys Arg 455 460 465
ATG AAA GAA AGT AAA GAT CCC GTC GAG AAG AAA CTC CTT GAT TAC AGA 2995 Met Lys Glu Ser Lys Asp Pro Val Glu Lys Lys Leu Leu Asp Tyr Arg 470 475 480 CAG AGA GCT ATA AAA ATA CTT GCA AAC AGC TAT TAT GGC TAT TAT GGA 3043 Gin Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Gly 485 490 495
TAT GCA AAG GCC AGA TGG TAC TGT AAG GAG TGT GCA GAG AGC GTA ACT 3091 Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser Val Thr 500 505 510 515
GCA TGG GGG AGG CAA TAC ATA GAT CTA GTT AGA AGA GAG CTT GAA AGC 3139 Ala Trp Gly Arg Gin Tyr Ile Asp Leu Val Arg Arg Glu Leu Glu Ser 520 525 530
AGC GGA TTC AAG GTT CTG TAC ATA GAC ACT GAT GGC CTC TAC GCG ACC 3187 Ser Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp Thr Asp Gly Leu Tyr Ala Thr 535 540 545
ATT CCT GGG GCC AAG CCA AAT GAG ATA AAA GAA AAG GCC CTT AAG TTC 3235 Ile Pro Gly Ala Lys Pro Asn Glu Ile Lys Glu Lys Ala Leu Lys Phe 550 555 560 GTC GAG TAC ATA AAC TCC AAG TTA CCT GGG CTT CTT GAA TTG GAA TAC 3283 Val Glu Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu Tyr 565 570 575
GAA GGT TTC TAC GCG AGA GGG TTC TTC GTG ACG AAG AAA AAG TAC GCA 3331 Glu Gly Phe Tyr Ala Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala 580 585 590 595
CTA ATC GAC GAG GAA GGA AAG ATA GTT ACG AGG GGG CTC GAA ATA GTA 3379 Leu Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Val Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val 600 605 610
AGG AGA GAT TGG AGT GAA ATA GCA AAG GAG ACC CAA GCT AAG GTT CTC 3427 Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gin Ala Lys Val Leu 615 620 625
GAG GCA ATA CTC AAG CAC GGT AAC GTT GAT GAG GCC GTA AAA ATA GTA 3475 Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asn Val Asp Glu Ala Val Lys Ile Val 630 635 640 AAG GAG GTT ACA GAA AAA CTC AGT AAA TAT GAA ATA CCA CCC GAA AAG 3523 Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Ile Pro Pro Glu Lys 645 650 655
CTT GTA ATT TAT GAG CAG ATA ACG AGG CCT CTG AGC GAG TAT AAA GCG 3571 Leu Val Ile Tyr Glu Gin Ile Thr Arg Pro Leu Ser Glu Tyr Lys Ala 660 665 670 675
ATA GGC CCT CAC GTT GCA GTA GCT AAA AGG CTC GCA GCG AAG GGA GTA 3619 Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala Lys Gly Val 680 685 690
AAA GTT AAG CCA GGG ATG GTT ATC GGT TAC ATA GTT TTG AGG GGA GAC 3667 Lys Val Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val Leu Arg Gly Asp 695 700 705
GGG CCA ATA AGC AAG AGG GCC ATA GCT ATA GAG GAG TTC GAT CCC AAA 3715 Gly Pro Ile Ser Lys Arg Ala Ile Ala Ile Glu Glu Phe Asp Pro Lys 710 715 720 AAG CAT AAG TAC GAT GCC GAA TAC TAC ATA GAG AAC CAA GTT CTG CCA 3763 Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gin Val Leu Pro 725 730 735
GCG GTG GAG AGG ATA TTG AGA GCA TTT GGT TAT CGC AAA GAA GAT TTG 3811 Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu 740 745 750 755
AGG TAT CAA AAA ACT AAA CAA GTG GGC CTC GGA GCA TGG CTT AAG TTC 3859 Arg Tyr Gin Lys Thr Lys Gin Val Gly Leu Gly Ala Trp Leu Lys Phe 760 765 770 771
TAG CTACCCAGAT GTCACCGTAT CTCAACAGGT ATTCCTGGAG ATCTCTTAAA 3912
TCAACTACAA GCTCTTCCTC AAGTTCCATA AAGTTTATTG ACTTTATCGG TTTAATTATG 3972
AGCTTATAGG AGCCTAGAAC CCCAGAAATC TTAACTCTAA AGACTCTTGA AGCTAGCTCT 4032
ATCAGTTCAA GAACTATGTC CTTCTTAAGG AACGAGGAAT TAATGAAAAC TATTCCTTTA 4092
CCGTTCGGAT CCTGGAGAGC CATTTTCCCA ACTAATGTGA AGAAGAGTTC GCTTTCAATG 4152
TAGTTACTCT CCCTTGTTTT TAGAAGTCTC TCTAAGCCGA CGTTTATAGT GAACCGTCTT 4212 TTCCCCGTGC TTCTCAAGGG TAGTGAAAAG TTGTTTTCTC CAAACTCCGA TATCCGAGCC 4272
TATTTCTATT CTCTTCACTA CGCTGCCCGT TTTTATAAAT CCACCAAGTT TAACGACCCT 4332
GGCACTATCT ATAACATCGG TCTTCAGACC CAATAGCCTT AAGGTGGTTT CTCAAAACTG 4392
AGACCTTCCC TTTAGAGCAT TCAAGACCAT TAGAAGATCA GGTCTATTGG CTCG 4446
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 2 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2995 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRIN: double
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( ix ) CARACTERISTIQUES
(A) NOM/CLE: séquence codante de l'ADN polymérase de Pyrococcuε sp. GE 5
(B) EMPLACEMENT: de 678 à 2994 ( ix) CARACTERISTIQUES
(A) NOM/CLE: codon stop
(B) EMPLACEMENT : de 2992 à 2994 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID NO : 2 :
TCATGTCCTG GGGCTTGGTT ACGGAGGCTA TCAAAATATT GGACCXTTCG TGCCAGCTTA 60
CCAGCTCTGG AAAATACTCA GTATCCGCTA TGTACGAGAT ATCCCCAAGG CTAGTTTTTA 120
ATCTAAAGCC TATAGTTGTT GGGTCGCTGT GCTGGGATGG AGTTATTATC ATCTCCTCAT 180
TTCCTAGCCT AAACCTGTCC CCAGGATTAG GAGCATGGAC TTCCTCTAAT GCCTCCAAGT 240 GGTACTTGCT CAGGGCTGGG GTATGATCCT CGTCCCCATA AACCACGCTT CTAGAACCTA 300
TTAGGGTTCC CCTCTTCTTA GTWACCCCAT AGGTCATCCC YTCAACGATC ACYTCGGCAT 360
CGTTGCAGTG ATCGGTGTGT CTATGCGAGA TGAAGAGAAC ATCTATCTTC CTGGGGTCTA 420
GCTTATATCT AATCATCCTA ACTAGCGCTC CAGGCCCAGG GTCCACAAAG ATATTTTTGC 480
TTGCCTTGAT GAAGAATCCA CCCGTAGATC TTACTTGAGT TATCGTCACG AACCTGCCCC 540 CACCGGCACC CAGGAACGTA ATCTCTATCA TTTTTAGTCC CGAAATTAAA GTGCGAGGCT 600
TATGCTTTTA AGGATGTATG GCGAAAGGTG AAGTTTATTA GAAGTTAGAA TCTAAAGATT 660
TCAGATTGGG TGGGGGTA ATG ATA ATC GAT GCT GAT TAC ATA ACG GAA GAT 711 Met Ile Ile Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Glu Asp
1 5 10
GGC AAG CCG ATA ATA AGG ATA TTC AAA AAG GAA AAG GGA GAG TTT AAG 759 Gly Lys Pro Ile Ile Arg Ile Phe Lys Lys Glu Lys Gly Glu Phe Lys 15 20 25
GTA GAA TAC GAT AGG ACG TTT AGA CCC TAC ATT TAT GCT CTT TTA AAG 807 Val Glu Tyr Asp Arg Thr Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys 30 35 40
GAT GAT TCG GCC ATA GAT GAG GTT AAG AAG ATA ACC GCC GAG AGG CAC 855 Asp Asp Ser Ala Ile Asp Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His 45 50 55 GGA AAG ATA GTC AGG ATA ACC GAG GTT GAG AAA GTC CAG AAG AAA TTC 903 Gly Lys Ile Val Arg Ile Thr Glu Val Glu Lys Val Gin Lys Lys Phe 60 65 70 75
CTA GGA AGG CCA ATA GAA GTC TGG AAG CTC TAT CTT GAG CAT CCC CAG 951 Leu Gly Arg Pro Ile Glu Val Trp Lys Leu Tyr Leu Glu His Pro Gin 80 85 90 GAT GTT CCA GCC ATA AGA GAG AAG ATA AGG GAA CAT CCA GCT GTA GTT 999 Asp Val Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Val 95 100 105
GAT ATA TTT GAA TAC GAC ATA CCC TTT GCG AAG CGC TAC CTC ATA GAC 1047 Asp Ile Phe Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp 110 115 120
AAG GGA TTG ACT CCA ATG GAG GGG AAC GAG GAG CTA ACG TTT CTA GCC 1095 Lys Gly Leu Thr Pro Met Glu Gly Asn Glu Glu Leu Thr Phe Leu Ala 125 130 135
GTT GAT ATA GAA ACA TTG TAC CAT GAA GGA GAG GAG TTC GGG AAA GGG 1143 Val Asp Ile Glu Thr Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly 140 145 150 155
CCA ATA ATA ATG ATC AGC TAC GCC GAC GAG GAA GGG GCC AAG GTG ATA 1191 Pro Ile Ile Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Lys Val Ile 160 165 170 ACT TGG AAG AGC ATA GAC TTA CCT TAC GTT GAA GTG GTT TCG AGC GAG 1239 Thr Trp Lys Ser Ile Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu 175 180 185
AGG GAG ATG ATA AAG AGG CTC GTG AAG GTA ATT AGA GAG AAA GAT CCC 1287 Arg Glu Met Ile Lys Arg Leu Val Lys Val Ile Arg Glu Lys Asp Pro 190 195 200
GAC GTG ATA ATA ACG TAC AAT GGT GAT AAT TTC GAC TTT CCG TAC CTC 1335 Asp Val Ile Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Pro Tyr Leu 205 210 215
TTA AAG AGG GCT GAA AAG CTC GGA ATA AAG CTC CCC CTT GGA AGG GAC 1383 Leu Lys Arg Ala Glu Lys Leu Gly Ile Lys Leu Pro Leu Gly Arg Asp 220 225 230 235
AAT AGC GAG CCG AAA ATG CAG AGG ATG GGG GAT TCA TTA GCC GTA GAG 1431 Asn Ser Glu Pro Lys Met Gin Arg Met Gly Asp Ser Leu Ala Val Glu 240 245 250 ATA AAG GGC AGA ATA CAC TTC GAT TTA TTC CCC GCC ATA AGA AGA ACG 1479 Ile Lys Gly Arg Ile His Phe Asp Leu Phe Pro Ala Ile Arg Arg Thr 255 260 265
ATC AAC CTT CCA ACA TAC ACC CTC GAA ACG GTT TAT GAG GTT ATA TTT 1527 Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Thr Val Tyr Glu Val Ile Phe 270 275 280
GGA AAG TCT AAG GAG AAA GTC TAT GCC CAT GAG ATA GCT GAG GCC TGG 1575 Gly Lys Ser Lys Glu Lys Val Tyr Ala His Glu Ile Ala Glu Ala Trp 285 290 295
GAA ACC GGG AAA GGG CTA GAG AGG GTA GCT AAG TAT TCA ATG GAA GAT 1623 Glu Thr Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp 300 305 310 315 GCG AAG GTA ACC TCT GAG CTC GGA AAG GAG TTC TTC CCG ATG GAA GCC 1671 Ala Lys Val Thr Ser Glu Leu Gly Lys Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala 320 325 330
CAG CTA GCT AGG CTC GTT GGC CAT CCA GTT TGG GAC GTT TCA AGG TCG 1719 Gin Leu Ala Arg Leu Val Gly His Pro Val Trp Asp Val Ser Arg Ser 335 340 345
AGC ACC GGA AAC CTC GTT GAG TGG TTT CTC CTT ACG AAG GCC TAC GAG 1767 Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Leu Leu Thr Lys Ala Tyr Glu 350 355 360
AGA AAT GAG CTC GCG CCC AAT AAA CCG GAC GAG AGG GAA TAC GAG AGA 1815 Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Tyr Glu Arg 365 370 375
AGG CTA AGA GAG AGC TAT GAA GGG GGT TAC GTT AAC GAG CCA GAG AAG 1863 Arg Leu Arg Glu Ser Tyr Glu Gly Gly Tyr Val Asn Glu Pro Glu Lys 380 385 390 395 GGA TTG TGG GAA GGG ATA GTC AGC TTA GAC TTT AGG TCC CTA TAT CCC 1911 Gly Leu Trp Glu Gly Ile Val Ser Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro 400 405 410
TCT ATA ATT ATA ACT CAC AAC GTC TCA CCA GAC ACT TTG AAT AGA GAA 1959 Ser Ile Ile Ile Thr His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu 415 420 425
AAT TGC AAG GAA TAT GAC GTT GCC CCC CAA GTG GGG CAC AGA TTC TGC 2007 Asn Cys Lys Glu Tyr Asp Val Ala Pro Gin Val Gly His Arg Phe Cys 430 435 440
AAG GAT TTC CCA GGA TTC ATA CCA AGC TTA CTG GGT AAC CTA CTG GAG 2055 Lys Asp Phe Pro Gly Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asn Leu Leu Glu 445 450 455
GAG AGA CAA AAG ATA AAA AAG AGG ATG AAA GAA AGT AAA GAT CCC GTC 2103
Glu Arg Gin Lys Ile Lys Lys Arg Met Lys Glu Ser Lys Asp Pro Val
460 465 470 475 GAG AAG AAA CTC CTT GAT TAC AGA CAG AGA GCT ATA AAA ATA CTT GCA 2151
Glu Lys Lys Leu Leu Asp Tyr Arg Gin Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala 480 485 490
AAC AGC TAT TAT GGC TAT TAT GGA TAT GCA AAG GCC AGA TGG TAC TGT 2199 Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys
495 500 505
AAA GAG TGT GCA GAG AGC GTA ACC GCA TGG GGA AGG CAG TAC ATA GAC 2247
Lys Glu Cys Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Gin Tyr Ile Asp 510 515 520
CTG GTT AGG AGG GAA CTT GAG AGC AGA GGA TTT AAA GTT CTC TAC ATA 2295
Leu Val Arg Arg Glu Leu Glu Ser Arg Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile 525 530 535
GAC ACA GAT GGC CTC TAC GCA ACG ATT CCT GGA GCC AAG CAT GAG GAA 2343 Asp Thr Asp Gly Leu Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Ala Lys His Glu Glu 540 545 550 555 ATA AAA GAG AAG GCA TTG AAG TTC GTC GAG TAC ATA AAC TCC AAG TTA 2391 Ile Lys Glu Lys Ala Leu Lys Phe Val Glu Tyr Ile Asn Ser Lys Leu 560 565 570
CCT GGG CTT CTT GAA TTG GAA TAC GAA GGT TTC TAC GCG AGA GGG TTC 2439 Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Ala Arg Gly Phe 575 580 585
TTC GTG ACG AAG AAA AAG TAC GCA CTA ATC GAC GAG GAA GGA AAG ATA 2487 Phe Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala Leu Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile 590 595 600
GTT ACG AGG GGG CTC GAA ATA GTA AGG AGA GAT TGG AGT GAA ATA GCA 2535
Val Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala 605 610 615
AAG GAG ACC CAG GCC AAG GTT CTC GAG GCA ATA CTC AAG CAC GGT AAC 2583 Lys Glu Thr Gin Ala Lys Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asn 620 625 630 635 GTT GAT GAG GCC GTA AAA ATA GTA AAG GAG GTT ACA GAA AAA CTC AGT 2631 Val Asp Glu Ala Val Lys Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser 640 645 650
AAA TAT GAA ATA CCA CCC GAA AAG CTT GTA ATT TAT GAG CAG ATA ACG 2679 Lys Tyr Glu Ile Pro Pro Glu Lys Leu Val Ile Tyr Glu Gin Ile Thr 655 660 665
AGG CCT CTG AGC GAG TAT AAA GCG ATA GGC CCT CAC GTT GCA GTA GCT 2727 Arg Pro Leu Ser Glu Tyr Lys Ala Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala 670 675 680
AAA AGG CTC GCA GCG AAG GGA GTA AAA GTT AAG CCA GGG ATG GTT ATC 2775 Lys Arg Leu Ala Ala Lys Gly Val Lys Val Lys Pro Gly Met Val Ile 685 690 695
GGT TAC ATA GTT TTG AGG GGA GAC GGG CCA ATA AGC AAG AGG GCC ATA 2823 Gly Tyr Ile Val Leu Arg Gly Asp Gly Pro Ile Ser Lys Arg Ala Ile 700 705 710 715 GCT ATA GAG GAG TTC GAT CCC AAA AAG CAT AAG TAC GAT GCC GAA TAC 2871 Ala Ile Glu Glu Phe Asp Pro Lys Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr 720 725 730
TAC ATA GAG AAC CAA GTT CTG CCA GCG GTG GAG AGG ATA TTG AGA GCA 2919 Tyr Ile Glu Asn Gin Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala 735 740 745
TTT GGT TAT CGC AAA GAA GAT TTG AGG TAT CAA AAA ACT AAA CAA GTG 2967 Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gin Lys Thr Lys Gin Val 750 755 760
GGC CTC GGA GCA TGG CTT AAG TTC TAG A ' 2995
Gly Leu Gly Ala Trp Leu Lys Phe 765 770 771 .
Claims
. ,.
46
REVENDICATIONS
1) ADN polymérase purifiée thermostable d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. ayant un poids moléculaire compris entre environ 89 000 et 90 000 daltons .
2) ADN polymérase selon la revendication 1 de la souche d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. GE 5 déposée à la CNCM sous le No. 1-1302
3) ADN polymérase selon la revendication 2 ayant un poids moléculaire d'environ 89 443 daltons et un pi d ' environ 8,13.
4) ADN polymérase selon la revendication 1 purifiée de la souche d'archaebactéries du genre Pyrococcuε sp . GE 23 déposée à la CNCM sous le No. I- 1764.
5) ADN polymérase selon la revendication 4 ayant un poids moléculaire d'environ 89 409 daltons et un pi ' environ 8,37.
6) Une ADN polymérase purifiée thermostable dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:l.
7) Une ADN polymérase purfiée thermostable dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:2.
8) Une séquence d'ADN constituée par ou comprenant la séquence codant pour l'ADN polymérase purifiée thermostable de l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9) Une séquence d'ADN selon la revendication 8 comprenant ou constituée par les nucléotides 1547 à 3862 de la SEQ ID N0:1.
10) Une séquence d'ADN selon la revendication 8 comprenant ou constituée par les nucléotides 678 à 2994 de la SEQ ID NO:2.
11) Un vecteur contenant la séquence d'ADN de l'une quelconque des revendications 8 à 10.
12) Un hôte transformé par un vecteur selon la revendication 11.
13) Procédé de préparation d'une ADN polymérase d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp . caractérisé en ce que l'on cultive l'hôte selon la revendication 12 dans des conditions permettant l'expression de ladite ADN polymérase et en ce que l'on extrait et récupère celle-ci par tout moyen approprié.
14) Procédé d'amplification enzymatique d'une séquence d'acide nucléique caractérisé en ce que l'on met en oeuvre une ADN polymérase thermostable selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
, -.
48
ADN POLYMERASE THERMOSTABLE
D'ARCHAEBACTÉRIES DU GENRE PYROCOCCUS SP.
La présente invention concerne une ADN polymérase purifiée thermostable d'archaebactéries du genre Pyrococcuε εp . ayant un poids moléculaire compris entre environ 89 000 et 90 000 daltons.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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