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WO1991006664A1 - Procede de synthese de derives d'adenosine phosphate et derives obtenus - Google Patents

Procede de synthese de derives d'adenosine phosphate et derives obtenus Download PDF

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Publication number
WO1991006664A1
WO1991006664A1 PCT/FR1990/000793 FR9000793W WO9106664A1 WO 1991006664 A1 WO1991006664 A1 WO 1991006664A1 FR 9000793 W FR9000793 W FR 9000793W WO 9106664 A1 WO9106664 A1 WO 9106664A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
sequence
derivatives
adenyl cyclase
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1990/000793
Other languages
English (en)
Inventor
Marie-Lise Lacombe
Michel Veron
Michèle Mock
Octavian Barzu
Robert Sarfati
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur
Original Assignee
Institut Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur filed Critical Institut Pasteur
Publication of WO1991006664A1 publication Critical patent/WO1991006664A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the invention relates to a process for the synthesis of substituted adenosine phosphate derivatives and the obtained adenosine diphosphate (ADP) and adenosine triphosphate (ATP) derivatives obtained.
  • ADP adenosine diphosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • the inventors have found that it is possible to at least partially remedy the drawbacks mentioned above by carrying out the synthesis of these derivatives by the enzymatic route.
  • the object of the invention is therefore to provide a low cost enzymatic synthesis process of adenosine phosphate derivatives, making it possible to have substituted ATP or ADP derivatives and in particular ATP derivatives in which the phosphate group includes a marker group.
  • Another subject of the invention relates to applications, more especially in the field of biology, of adenosine derivatives, enzymes and nucleotide sequences coding for these enzymes.
  • the process for the synthesis of adenosine phosphate derivatives according to the invention is characterized in that a cyclic AMP derivative, or cAMP, is subjected. substituted by the group or groups desired for the desired adenosine derivative, the 3 ′ position being blocked by cyclization, to the action of a protein with adenyl cyclase activity, and that the substituted ATP derivatives obtained are subjected , to the action of a protein with nucleoside diphosphate kinase (or NDP kinase) activity coupled to a phosphate group consuming system, such as a hexokinase, and to recover the substituted ADP derivatives formed.
  • a cyclic AMP derivative, or cAMP substituted by the group or groups desired for the desired adenosine derivative, the 3 ′ position being blocked by cyclization, to the action of a protein with adenyl cyclase activity, and that the substituted ATP
  • the substituted cAMP derivative comprises in particular a substitution in position 2 'and / or, where appropriate, other substitutions in position 2 and / or 6 and / or 8.
  • the phosphate group optionally comprises a marker group in position ⁇ . This group is chosen from the usual groups.
  • CAMP derivatives advantageous for the implementation of the invention comprise for example in position 2 ′ an alkyl, alkoxy, acyl, aryl, amino or azido group, alkyl ester and / or in position 6 an amino group and / or in position 8 and / or 6 a halogen atom, an alkyl, acyl, alkoxy, aryl group or a nitrogen function such as an azido, amino or amino alkyl group.
  • the alkyl groups to which reference is made in the description and the claims more particularly comprise 1 to 12 carbon atoms, advantageously from 1 to 4.
  • the amino groups are primary, secondary or tertiary amines and in these two latter cases are more especially substituted by alkyl radicals as defined above.
  • the substituted cAMP derivatives used in the process of the invention, more particularly the derivatives comprising in position 2 ′ an azido group, are new products and as such also come within the framework of the latter.
  • these cAMP derivatives are obtained by chemical synthesis from cAMP itself.
  • the different groups are introduced according to conventional techniques which will be easily chosen and implemented by those skilled in the art.
  • cAMP As for cAMP, it is obtained according to the most usual method, starting from ATP using adenyl cyclase as catalyst and operating at pH 8 to obtain a displacement at practically 100% in the direction of cAMP formation. .
  • the catalysis by the protein with adenyl cyclase activity is advantageously carried out at a pH between approximately 6 and 8, more particularly of the order of 6.
  • this protein is attached to a support, for example to agarose beads.
  • the protein with adenyl cyclase activity used for the enzymatic catalysis advantageously consists of a preparation of adenyl cyclase of high purity.
  • a protein with adenyl cyclase activity as expressed by the cyclone gene from Bordetella, in particular from B. pertussis, or from Bacillus anthracis.
  • the cya gene of B. pertussis and the coded protein expressing adenyl cyclase activity are described in application FR n ° 8710614 of 07/24/87 in the name of the Institut Pasteur.
  • the protein with adenyl cyclase activity used is a truncated form of adenyl cyclase.
  • This truncated adenyl cyclase which constitutes, as a new product, an object of the invention, is a deletion derivative with respect to the amino acid sequence of FIG. 1. particular of a derivative lacking an amino acid sequence in the N-terminal part, which does not play a fundamental role in the adenyl cyclase activity, more especially a sequence of 261 amino acids at the end N- terminal.
  • the adenyl cyclase derivative of the invention is characterized by a molecular mass of 62,200 daltons ⁇ 10%.
  • This protein has catalytic and calmodulin-binding properties similar to those of wild-type adenyl cyclase from culture supernatants of B. anthracis, namely: k cat from 1100 s -1 at 30 ° C pH 8, Apparent km for 0.25 mM ATP and Kd for 23 nM beef brain calmodulin.
  • This protein is advantageously obtained by expression, for example in a protease deficient strain (Ion-) of E. coli, of the cya gene of B. anthracis lacking at the N-terminal end of at least part of the codons n ' not involved in a fundamental way for the synthesis of the protein with adenyl cyclase activity above.
  • This cya gene is in particular characterized in that it lacks the 261 codons at the N-terminal end of the sequence of FIG. 1.
  • This truncated gene is included in the invention.
  • nucleotide sequence hybridizable with that of the sequence in FIG. 1, as obtained by reverse enzymatic transcription of the corresponding RNA, or also by chemical synthesis, is part of the invention.
  • the bases of the nucleotide sequence under consideration may be in a different order from that found in the genes and / or that these bases may, where appropriate, be substituted, as soon as possible.
  • a probe developed from such a sequence gives a characteristic and unequivocal response as to the ability to recognize the presence of genes coding for such a truncated adenyl cyclase. This remark also applies to the sequence given in figure 2.
  • the invention relates to a nucleotide sequence characterized in that it carries the information for the synthesis of a truncated adenyl cyclase, or of fragments thereof, capable of forming an immunological complex with antibodies directed respectively against an adenyl cyclase of B. anthracis, of B. pertussis or of rat brain or against fragments of such an adenyl cyclase.
  • the invention also relates to a recombinant sequence comprising one of the sequences defined above, optionally associated with a promoter capable of controlling the transcription of the DNA sequence coding for transcription termination sequences and signals translation and secretion.
  • It also relates to a recombinant nucleotide sequence, associated with a promoter and with an operator making it possible to control transcription, and with a signal sequence allowing the secretion of the protein in the periplasmic space (gram -) or in the external medium.
  • the nucleotide sequence of the invention is capable of hybridizing with a probe formed from the sequence presenting the nucleotide sequence of FIG. 1 corresponding to the truncated cya gene of B. anthracis.
  • the invention relates to both DNA and RNA sequences.
  • the substituted ATP derivatives obtained by the action of adenyl cyclase as described above are used as substrates by a system comprising a protein with NDP kinase activity coupled to a phosphate group consuming system, for example a hexokinase.
  • the protein with NDP kinase activity catalyzes the transfer of the ⁇ -phosphate grouping from a triphosphonucleotide to an acceptor diphosphate nucleotide according to a mechanism commonly known as
  • ping-pong comprising a stable phosphorylated intermediate.
  • the desired substituent is introduced chemically before subjecting the ATP derivative to the action of the above system.
  • the protein with NDP kinase activity used is a protein as obtained by cloning the gene coding for NDP kinase from Dictyostelium discoideum and purification of the protein.
  • This protein constitutes one of the objects of the invention as a new product.
  • the protein with NDP kinase activity of the invention is further characterized in that it is strongly basic with a calculated pI of 9.15 and that it contains a hydrophobic fragment (residues 64 to 84). Its basic properties allow it to be easily purified.
  • This protein therefore constitutes an industrial source of NDP kinase of great interest compared to NDP kinases currently obtained from extracts of tissues or organs and the purification of which requires the use of techniques expensive.
  • the invention also relates to a nucleotide sequence consisting of at least part of a sequence coding for a protein with NDP kinase activity as expressed by D. discoideum.
  • This sequence is capable of hybridizing with genes coding for a protein with NDP kinase activity.
  • the percentage of homology with regard to the sequences which hybridize is from 70 to 90%.
  • the conditions for the hybridizations mentioned in connection with the new nucleotide sequences are relatively low stringency conditions.
  • 30% formamide, 6xSSC (sodium citrate, NaCl), 0.12 M sodium pyrophosphate, 0.5% SDS and 250 ⁇ g of herring sperm DNA are used at 30 ° C.
  • the washes are carried out in the same medium at 37 ° C. and according to the importance of the background noise, by gradually decreasing the concentration of SSC and by increasing the washing temperature from 5 ° C. to 5 ° C.
  • the invention also relates to a recombinant sequence comprising one of the sequences defined above, optionally associated with a promoter capable of controlling the transcription of the DNA sequence coding for transcription termination sequences and signals translation and secretion.
  • the nucleotide sequence of the invention is capable of hybridizing with a probe formed from the sequence having the sequence of nucleotides shown in FIG. 2 or the sequence of nucleotides complementary to this sequence .
  • the sequences of the invention are DNA or RNA sequences.
  • nucleotide sequence hybridizable with that of the sequence of FIG. 2, as obtained by reverse enzymatic transcription of the corresponding RNA, or also by chemical synthesis, is part of the invention.
  • the cloning of the nucleotide sequence coding for a protein with NDP kinase activity comprises the isolation of clones of an expression library constructed in a vector, of the type of those expressing a protein interacting specifically with a compound such as [ 35 S] GTP ⁇ S, triphosphate donor.
  • a vector is constructed by inserting a nucleotide fragment containing the coding sequence.
  • the plasmid pNDK is constructed, for example, to express the protein with NDP kinase activity in a bacterium such as E. coli.
  • a bacterium such as E. coli.
  • the Haelll - EcoRI restriction fragment of the isolated clone is inserted, this fragment having advantageously been treated beforehand to obtain blunt ends.
  • the insertion is carried out in the HincII site of the plasmid pTZ18R.
  • the resulting recombinant plasmid is introduced into the bacterium for the purpose of expression, according to the usual techniques, of the enzyme under the control of the lac Z promoter.
  • IPTG inducing agent
  • the recovered enzyme is subjected to at least one purification step on a chromatography column.
  • a homogeneous enzyme preparation is obtained by contacting a centrifugation supernatant a suspension of previously broken by sonication bacteria obtained at the end of the above process, with a dextran derivative such as DEAE-Sephacel ®, and then by chromatographing the eluate collected on a resin column such as Affigel-Blue ®.
  • the protein with NDP kinase activity is not retained in the resin and is eluted in the dead volume.
  • a substituted ADP derivative as defined above, is reacted with a protein with NDP kinase activity capable of phosphorylating the ADP derivative by leading to an ATP derivative in which the phosphate group provided by the protein with NDP kinase activity is optionally labeled.
  • the NDP kinase covalently fixes the labeled phosphate group of [ ⁇ - 32 P] triphosphonucleotides.
  • the use of the enzyme attached to a support, for example coupled to agarose beads makes it possible to remove, after the labeling reaction, the donor nucleotides by successive rinsing of the beads.
  • the labeled phosphate attached to the protein is then transferred to the acceptor diphosphate nucleosides.
  • R 1 and R 2 identical or different from each other, represent a hydrogen atom, an alkyl, alkoxy, acyl, aryl, amino, azido, alkyl ester radical,
  • R 3 and R 5 are chosen from the group comprising a halogen atom, an alkyl, alkoxy or acyl group, a nitrogen function such as azido, amino or aminoalkyl,
  • R 4 is an amino group
  • R 6 is a di- or triphosphate group and optionally contains a marker group.
  • the invention also relates to the biological applications of the new products of the invention. These applications include the use of adenosine phosphate derivatives as laboratory reagents.
  • Such reagents are of particular interest as fluorescence markers, or even as affinity or photoaffinity markers, by making it possible to carry out studies of structure and active sites. These reagents are labeled for example with 32 P.
  • the adenosine phosphate derivatives thus obtained can also be used as ligands in affinity chromatography.
  • they are fixed to a support, for example to agarose. They make it possible to purify in particular the proteins which bind to ATP.
  • One or more specific substitutions make it possible to increase the affinity and the specificity of interaction for a given enzyme, for example a mammalian cyclase.
  • truncated adenyl cyclase in soluble or immobilized form can be used in particular for the synthesis of cAMP or cAMP analogs starting from ATP or corresponding analogs of ATP.
  • the cost of cAMP (about 7 to 10 times higher than that of ATP) justifies giving preference to the enzymatic process over the chemical process currently used.
  • the truncated adenyl cyclase of the invention also makes it possible to separate derivatives of adenosine phosphate substituted in 3 'obtained by chemical synthesis and often difficult to separate from derivatives substituted in other positions, in particular in 2'.
  • 3 'substituted derivatives are insensitive to action of adenyl cyclase, it suffices to subject the mixture of substituted derivatives, in particular substituted in 2 ', on the one hand and those substituted in 3' on the other hand to the action of the enzyme to then separate the nucleoside triphosphate of a cyclic nucleophide monophosphate.
  • the immobilized enzyme is used, for example according to a conventional technique on Sepharose activated by CNBr, operating according to the methods described in the literature.
  • the reaction medium buffered at pH 8 (formation of cAMP) or at pH 6 (synthesis of ATP and its derivatives) contains MgCl 2 (5-20mM), nucleotides (5-100mM), pyrophosphate (5-20mM) and glucose (10-100mM), as well as catalytic concentrations of ADP, hexokinase and nucleotide diphosphate kinase (also immobilized on Sepharose beads).
  • the nucleotides obtained are then purified according to methods described in the literature.
  • adenyl cyclase is advantageously used in soluble form.
  • concentration of the product to be dosed varies between 0.1 and 50 ⁇ M for cAMP, between 0.1 and 50 ⁇ M for PP and between 0.1 and 20 nM for calmodulin.
  • the assay is more especially carried out at a pH close to neutral, in particular greater than 7, in particular 7.4.
  • the formation of NADPH is followed by spechophotometry or fluorometry.
  • Standard concentrations are for example:
  • the applications of the products according to the invention also include the development, from fragments of the nucleotide sequence of FIG. 2, of RNA, mRNA or DNA probes, for the detection of sequences similar in other organisms or tissues.
  • This elaboration includes, in particular, the denaturation of the double-stranded sequences to obtain a single-stranded sequence usable as a probe.
  • the invention therefore relates to detection probes characterized in that they comprise at least part of a nucleotide sequence defined above, of RNA or of DNA, more especially a fragment of a sequence coding for a protein with NDP kinase activity.
  • the fragment used as probe contains a sufficient number of nucleotides to obtain the required specificity and the formation of a stable hybrid.
  • probes are advantageously labeled with a radioactive element (hot probes) or any other non-radioactive group (cold probes) allowing recognition of the probe in a hybrid state with the preparation containing the DNA to be studied.
  • a radioactive element hot probes
  • cold probes any other non-radioactive group
  • Adenosine phosphate derivatives in which the phosphate group is labeled ⁇ are particularly advantageous for the development of cold probes.
  • these probes are brought into contact with a biological sample containing bacteria, or directly with these bacteria or their nucleic acids, under conditions allowing the possible hybridization of the nucleotide sequence of the probe with a complementary sequence, possibly contained in the product tested.
  • This method comprises, after denaturing the DNA previously obtained from cells expressing a protein with adenyl cyclase or NDP kinase activity according to the invention, the deposition of an aliquot of this DNA on nitrocellulose membranes, the hybridization of each membrane under the usual conditions with the probe and the detection, in a conventional manner, of the hybrid formed.
  • clones are isolated by heterologous hybridization of the cDNA libraries constructed in phages or plasmids.
  • the invention thus provides tools making it possible to rapidly detect, with high specificity, similar sequences in the genes coding for proteins with NDP kinase activity, which makes it possible to study the origin and the mode of action of these NDPs. kinases.
  • kits or kits comprising:
  • the invention also relates to the immunological applications of truncated adenyl cyclase, more especially for the development of specific polyclonal immunums and of monoclonal antibodies.
  • the polyclonal antibodies are formed according to conventional techniques by injecting the protein into animals, recovering the antisera, then antibodies from the antisera, for example by affinity chromatography.
  • Monoclonal antibodies are produced in the usual way by fusing myeloma cells with spleen cells from animals previously immunized with the proteins of the invention.
  • mice were immunized with different doses of antigen (3 subcutaneous injections one week apart, of 250 ⁇ l of antigen in 10 mM tris buffer pH 7 containing 1 mg / ml of Am ---) .
  • the results obtained show the obtaining of a synthesis of antiAC antibodies, after immunization with the protein.
  • the invention therefore relates to immunogenic compositions based on the proteins defined above, in association with a pharmaceutical vehicle. These compositions are potentially capable of preventing infections caused in particular by B. anthracis, B. pertussis, B. parapertussis and B. bronchiseptica and their toxic effects in humans and animals.
  • the invention also relates to the immunological applications of NDP kinase as obtained according to the invention.
  • immunogenic compositions defined above are used at the usual doses and in the forms of administration, in particular in the conventional forms which can be administered by the intranasal, oral or parenteral route.
  • compositions containing the protein with adenyl cyclase activity are combined with FHA and / or PTx in the same inoculum or not.
  • FHA preparations are advantageously obtained, for example, according to the method of Sato et al. (15).
  • FIG. 1 the nucleotide sequence coding for the adenyl cyclase of B. anthracis and, in correspondence, the amino acid sequence of this enzyme
  • EXAMPLE A OBTAINING A TRUNCATED PROTEIN WITH ADENYL CYCLASE ACTIVITY:
  • Adenine nucleotides, restriction enzymes, T4 DNA ligase BOEHRINGER MANNHEIM.
  • Oligodeoxyribonucleotides used as primers in DNA sequencing PHARMACIA
  • JM105 Two strains of E. coli are used: JM105 (1) and a protease deficient strain (lon-) CAG 1139 (2).
  • the bacteria are grown on Miller LB rich medium (3).
  • An OD600nm of 24 is reached when the culture is carried out under conditions of 20 1 fermenter.
  • Ampicillin is added at a rate of 100 ⁇ g / ml, if necessary.
  • One-way deletions are generated in the cloned cya gene in M13mp19 using the "Cyclone" system (IBI) following the manufacturer's instructions.
  • the nucleotide sequence is determined by a modified dideoxynucleotide chain termination method using Sequenase as DNA polymerase (4).
  • 70g of frozen wet paste of bacteria are suspended in 500ml of 50mM Tris-HCl (pH 8) and subjected to sonication at 20 KHz and 100 watts (3 x 4 min). Cellular debris is removed by centrifugation at 12,000 g for 20 min at 4 ° C.
  • the bacterial extract is placed on a Blue-Sepharose column (5 x 20 cm) equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 8) at a flow rate of 400 ml / h.
  • the column is washed with 5 volumes of the same buffer for 5 h, then the proteins are eluted with 0.5M NaCl in 50 mM Tris-HCl (pH 8) and are precipitated with solid ammonium sulphate (80% saturation ).
  • the precipitated proteins are redissolved in 25 mM Tris-HCl (pH 9), then the salts are removed by gel filtration on a column of Sephadex G25 equilibrated with the same buffer.
  • the desalted sample is placed on a polytampon exchanger column 94 (1 x 50 cm) at the rate of 20 mg of protein / ml of swollen gel and at a flow rate of 100 ml / h.
  • the proteins are eluted with 450 ml of polytampon 96 diluted 10 times, adjusted to pH 7 with IN HCl.
  • the precipitated enzyme is redissolved in 50 mM of
  • Tris-HCl pH 7.4 and deposited on a 1.5 x 120 cm column of Ultrogel AcA 44 equilibrated with the same buffer. The enzyme is eluted at a flow rate of 15 ml / h. 3 ml fractions are recovered. Samples containing pure adenyl cyclase are collected and stored at -20 ° C or are lyophilized after extensive dialysis against 50 mM ammonium bicarbonate.
  • adenyl cyclase activity is measured as described in (5) in 100 ⁇ l of medium containing 50 mM Tris-HCl (pH 8), 6 mM MgCl 2 , 0.1 mM CaCl 2 , 0.2 ⁇ M CaM from beef brain, 0.5 mg / ml bovine serum albumin, 0.1 mM cAMP (10 4 cpm / test) and 2 mM ATP (5 x 10 5 cpm / test).
  • One unit (1 U) of adenyl cyclase activity corresponds to 1 ⁇ mol of cAMP formed in 1 min at 30 ° C. and pH 8.
  • amino acid sequence of the N-terminal part of the purified protein is determined using the automated protein sequencer from APPLIED BIOSYSTEMS. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis is carried out according to Laemmli (6).
  • a 3 kb EcoRI-BamHI fragment from pMMA86, coding for the cya site is cloned in M13mp19. Unidirectional deletions are generated from the EcoRI site to remove DNA sequences downstream of the 5 'end of the cya gene. The DNA fragments carrying the different deletions are recovered by EcoRI-PstI digestion of the replicative form of the phage. These fragments are subcloned in pUC8 thus bringing the expression of the cya gene under the control of the lac promoter. The clones carrying the recombinant plasmids are analyzed to study the expression of adenyl cyclase.
  • DNA sequencing at the EcoRI site of M13mp19 ⁇ cya 19 indicates that the first 261 codons of the adenyl cyclase gene have been eliminated, leading to a truncated product with Pro 262 as the N-terminal amino acid.
  • the N-terminal sequence of the purified enzyme is Asn-Ser-Pro-Asp-Met-Phe-Glu- Tyr-Met-Asn-Lys-Leu-Glu-Lys-Gly-Gly-Phe-Glu. The first two residues have no equivalent in the wild-type protein of B.
  • the truncated adenyl cyclase of B. anthracis expressed in E. coli represents approximately 2% of the total bacterial proteins.
  • Adenyl cyclase pure is stable at a concentration above 1 mg / ml for several weeks at -20 ° C. Lyophilization of adenyl cyclase does not alter its catalytic properties, which makes it possible to use this process for long-term storage or for other spectroscopic studies.
  • the truncated adenyl cyclase of B. anthracis is activated by CaM in the presence and in the absence of Ca 2+ .
  • the maximum activity of the recombinant adenyl cyclase at saturating concentrations of ATP and CaM, pH 8 and 30 ° C is 1100 ⁇ mol / min.mg of protein, which corresponds to a k cat of approximately 1100s - 1 . This value is close to that calculated for the purified adenyl cyclase of culture supernatants from B.
  • adenyl cyclase from B. pertussis has kcat values between 1700 and 2300 s -1 .
  • EXAMPLE B CLONING OF THE GENE ENCODING A PROTEIN WITH NDP KINASE ACTIVITY AND EXPRESSED PROTEIN:
  • nitrocellulose filters Schleicher and Schuell (for screening the DNA bank of D. discoideum with [ 35 S] GTP ⁇ S,
  • bovine serum albumin bovine serum albumin, benzamidine, PMSF, phosphoenolpyruvate, NADH, ATP and dTDP: Sigma;
  • RNAs of 0.16 to 1.77 kb used as markers in Northern fingerprints: BETHSEDA RESEARCH Laboratories,
  • the ⁇ gt11 cDNA library was constructed from poly (A + ) RNA isolated from cells of Dictyostelium discoideum of the axenic strain AX3 which was deficient for 3 hours in the presence of 1 mM of cAMP (9).
  • the E. coli XL1-Blue strain originated from Stratagene and the vectors M13mp19 RF and pTZ18R come from Pharmacia.
  • the primer oligonucleotide used for RNA sequencing and analysis of the 5 'end has the sequence: (5'-
  • the cDNA library (2.5 ⁇ 10 5 pfu)) was spread using the E. coli strain Y1090 and 2.3 ⁇ 10 4 pfu, in 90 mm petri dishes with agarose replacing the agar. in the medium L used for the upper layer. After performing the fingerprint test as described in (13), the boxes are transferred to
  • nitrocellulose filters are removed and rinsed twice briefly with 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8 used at 4 ° C. and containing 150 mM NaCl and 0.5% Tween 20. They are then incubated with gentle shaking either 30 min. at room temperature, i.e. 14 hours at 4 ° C. in petri dishes containing 1.5 ml per buffer filter
  • A 50 mM HEPES, pH 8.1 mM, EDTA, 20 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl
  • the filters are then transferred to a fried glass support of corresponding size and washed 4 times with 50 ml of buffer used at 4 ° C (20 mM Tris-HCl buffer, pH 8, containing 100 mM NaCl and 25 mM MgCl 2 ).
  • the filters are washed twice in baths by incubation for 10 min. at 4oC in 50 ml of the same buffer.
  • the template used for the synthesis of the NDP kinase cDNA probe by the multiple primer technique (10) consists of the restriction fragment XmnI-EcoRI of 399 base pairs of the recombinant phage G821, subcloned in the vector. pTZ18R. This fragment corresponds to 72% of the coding sequence for the protein with NDP kinase activity.
  • the cDNA inserts from the ⁇ gt11 clones are excised by digestion with EcoRI and ligated into the vector pTZ18R or into the replicative form of phage M13mp19.
  • RNA sequence was carried out according to the dideoxy method of SANGER et al (11) modified for use with [ 35 S] of ATP ⁇ S (12) and analysis of the RNA sequence was carried out according to the technique described by GELIEBTER et al in (13), using as an primer the oligonucleotide (5'- GCGATGATTTCACCAAC-3 ') developed to hybridize with nucleotides 91 to 107 of the cDNA sequence coding for NDP kinase.
  • a plasmid pNDK was constructed to express the recombinant protein in E.coli using the HaelII-EcoRI fragment (540 bp) of the clone obtained by screening the expression library with the [ 35 S] GTP ⁇ S. f - INCORPORATION OF [ 35 S] IN Dp17 AND MEASUREMENT OF NDP KINASE ACTIVITY
  • the NDP kinase activity was measured in the extracts of bacteria transformed by pNDK by assaying the ADP formed during the reaction by an enzymatic test coupled to the pyruvate kinaselactate dehydrogenase activities.
  • Clones were detected by direct labeling in situ with [ 35 S] GTPrS. By operating as described in 1-b, two clones were isolated: G821 and G951.
  • the two clones selected by the functional screening contain an identical EcoRI fragment of 680 nucleotides which has been sequenced on both strands after subcloning into the EcoRI site of the plasmid pTZ18R.
  • An open reading frame of 504 nucleotides was found preceded by a 5 'end of 136 nucleotides containing multiple stop codons and followed by a truncated 3' end devoid of the poly (A) tail.
  • the open reading frame starts at the ATG codon at position 137 followed by a second ATG 12 codons downstream (see Figure 2 part B).
  • the two clones can come from the same primary cDNA.
  • the sequence was confirmed on phages isolated independently by screening the library with a large Xmnl-EcoRI restriction fragment of the clone G821 which contains the majority of the coding sequence.
  • Several clones were chosen and purified (G7, G9 and G10). They all contain the complete 3 'untranslated sequence followed by a poly (A) end of variable length (25 to 70 nucleotides).
  • the sequence of the 5 'end was determined by sequencing the mRNA.
  • a single major product was obtained by extension of the primer corresponding to the size of the longest RNA fragment of the sequencing reaction.
  • NUCLEOTIDE SEQUENCE OF NDPK cDNA AND CORRESPONDING AMINO ACID SEQUENCE
  • the sequence corresponding to the oligonucleotide used for RNA sequencing and extension with a primer is underlined.
  • the potential phosphorylation sites by protein kinase C and tyrosine kinases are indicated by stars and a dotted line.
  • part B the sequence of the 5 ′ end of the primary clone G821 is represented, resulting from the artefactual fusion of two cDNAs which is used to construct the plasmid pNDK.
  • the fragment which diverges from the consensus cDNA (part A) is mentioned in italics a nucleotide upstream of the initiation codon.
  • the HaelII-EcoRI fragment of the insert of clone G821 is used to construct the expression vector pNDK.
  • the HaelII site is underlined.
  • nucleotide sequence surrounding this ATG is in agreement with the consensus sequence (ANNATGR) of eukaryotic initiation codons with an A at position-1, as generally found for the genes of Dictyostelium.
  • the open reading frame codes for a protein of 155 amino acids with a calculated Mr of 16700 ⁇ 10%.
  • This protein (NPDK) is completely devoid of cysteine residues.
  • the Dictyostelium protein expressed in E. coli is very basic (calculated pi: 9.15) and contains a hydrophobic fragment (residues 64 to 84). . IDENTIFICATION OF NUCLEOSIDE DIPHOSPHATE KINASE ACTIVITY IN BACTERIAL EXTRACTS
  • the plasmid pNDK expressing the protein was constructed in E. coli.
  • the extracts of recombinant bacteria show thiophosphate incorporation proportional to the incubation time up to 5 min at 15 ° C. while the control extracts (bacteria transformed with the plasmid containing no insert) incorporate only traces of [S 35 ].
  • the SDS-PAGE is carried out with extracts previously incubated with [ 35 S] GTP ⁇ SN as described above.
  • a single band marked with Mr corresponding to the NDP kinase is detected in the extracts of recombinant bacteria. It probably corresponds to the formation of the phospho-enzyme intermediate during the NDP kinase reaction, explaining why the clones were isolated by labeling with [ 35 S] GTP ⁇ S directly on the filter replicas of the expression library .
  • the enzyme is purified to homogeneity in two stages.
  • the bacterial suspension is washed by centrifugation.
  • the base is taken up in volume of the initial suspension of buffer A: 50 mM Tris pH 8.5 containing 20 mM MgCl 2 and 1 mM EDTA and the cells are broken by sonication.
  • the bacterial debris is removed by centrifugation and the supernatant is deposited on a column of DEAE - Sephacel (Pharmacia).
  • the eluate is collected and deposited on a column of Affigel-Blue resin (BioRad) then rinsed with 2 column volumes of buffer A.
  • the column is eluted by a continuous gradient of NaCl, from 0 to 1 M NaCl.
  • the NDP kinase activity peak corresponds to a single protein band according to analysis on 12% polyacrylamide gel - SDS stained with silver nitrate.
  • the overall amino acid composition corresponds exactly to that of the amino acid sequence shown in Figure 2.
  • EXAMPLE C PREPARATION OF 2'-ANTHRANILOYL-ADP (ANT- ADP) FROM 2'-ANTHRANILOYL-cAMP (ANT-cAMP):
  • the reaction medium contains: Na 2 pyrophosphate (pH 6.5) 10 mM, Ant-cAMP 8 mM, MgCl 2 , 8 mM, glucose 15 mM, ADP 0.1 mM, hexokinase (5U / ml), nucleoside diphosphate kinase (5U / ml), 0.1 ⁇ M calmodulin, adenylate cyclase (5U / ml).
  • the disappearance of Ant-cAMP and the formation of the corresponding nucleoside diphosphate is followed by thin layer chromatography on microcrystalline cellulose or PEI-cellulose.
  • the nucleoside diphosphate formed (Ant-ADP) is then purified by conventional methods such as precipitation with ethanol and Ba 2+ salts or chromatography on ion exchangers.
  • LAEMMLI U.K., (1970), Nature 227, 680-685.

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Abstract

Le procédé de synthèse de dérivés substitués d'adénosine phosphate est caractérisé en ce qu'il est réalisé par voie enzymatique en soumettant des dérivés de cAMP substitués à l'action d'une protéine à activité adényl cyclase, puis les dérivés d'ATP obtenus à l'action d'une protéine à activité NDP kinase, couplée à un système consommateur de groupes phosphate et qu'on récupère les dérivés d'ATP formés. Ces dérivés sont utilisables notamment comme réactifs de laboratoire.

Description

PROCEDE DE SYNTHESE DE DERIVES D'ADENOSINE PHOSPHATE ET DERIVES OBTENUS
L'invention concerne un procédé de synthèse de dérivés d'adénosine phosphate substitués et les dérivés d'adénosine diphosphate (ADP) et d'adénosine triphosphate (ATP) substitués obtenus.
La synthèse de dérivés substitués de l'ADP ou de l'ATP est réalisée à ce jour par voie chimique. Ce mode d'obtention présente l'inconvénient d'une spécificité insuffisante. Ainsi la synthèse de dérivés substitués en position 2' ou 3' conduit à l'obtention de mélanges d' isomères substitués en 2' et en 3' dont la séparation, difficile, nécessite la mise en oeuvre de techniques coûteuses.
Les Inventeurs ont constaté qu'il est possible de remédier au moins en partie aux inconvénients évoqués ci-dessus en réalisant la synthèse de ces dérivés par voie enzymatique.
L'invention a donc pour but de fournir un procédé de synthèse par voie enzymatique, de faible coût, de dérivés d'adénosine phosphate, permettant de disposer de dérivés d'ATP ou d'ADP substitués et en particulier de dérivés d'ATP dans lesquels le groupe phosphate comporte un groupe marqueur.
Elle vise également à fournir les enzymes mises en jeu dans ce procédé, sous forme pure telle qu'obtenue en mettant en oeuvre les techniques du génie génétique, et les séquences nucléotidiques codant pour ces enzymes.
Un autre objet de l'invention concerne les applications, plus spécialement dans le domaine de la biologie, des dérivés d'adénosine, des enzymes et des séquences nucléotidiques codant pour ces enzymes.
Le procédé de synthèse de dérivés d'adénosine phosphate selon l'invention est caractérisé en ce qu'on soumet un dérivé d'AMP cyclique, ou cAMP, substitué par le ou les groupes souhaités pour le dérivé d'adénosine recherché, la position 3' étant bloquée par la cyclisation, à l'action d'une protéine à activité adenyl cyclase, et qu'on soumet les dérivés d'ATP substitués obtenus, à l'action d'une protéine à activité nucléoside diphosphate kinase (ou NDP kinase) couplée à un système consommateur de groupe phosphate, tel qu'une hexokinase, et qu'on récupère les dérivés d'ADP substitués formés.
L'utilisation dans ce procédé de dérivés du cAMP permet de disposer de produits de départ ayant une grande stabilité chimique par rapport à l'ATP ou à l'ADP classiquement utilisés. Le blocage de la position 3' confère en outre une spécificité élevée à la synthèse.
Le dérivé de cAMP substitué comporte notamment une substitution en position 2' et/ou, le cas échéant, d'autres substitutions en position 2 et/ou 6 et/ou 8. Le groupe phosphate comporte le cas échéant un groupe marqueur en position α . Ce groupe est choisi parmi les groupes habituels.
Des dérivés de cAMP avantageux pour la mise en oeuvre de l'invention comprennent par exemple en position 2' un groupe alcoyle, alcoxy, acyle, aryle, amino ou azido, ester d' alcoyle et/ou en position 6 un groupe amino et/ou en position 8 et/ou 6 un atome d'halogène, un groupe alcoyle, acyle, alcoxy, aryle ou une fonction azotée telle qu'un groupe azido, amino ou amino alcoyle.
D'une manière générale les groupes alcoyle auxquels il est fait référence dans la description et les revendications comprennent plus particulièrement 1 à 12 atomes de carbone, avantageusement de 1 à 4. Les groupes amino sont des aminés primaires, secondaires ou tertiaires et dans ces deux derniers cas sont plus spécialement substitués par des radicaux alcoyle tels que définis plus haut. Les dérivés de cAMP substitués mis en oeuvre dans le procédé de l'invention, plus spécialement les dérivés comportant en position 2' un groupe azido, sont des produits nouveaux et en tant que tels entrent également dans le cadre de cette dernière.
Selon une disposition avantageuse de l'invention, ces dérivés de cAMP sont obtenus par synthèse chimique à partir de cAMP lui-même. Les différents groupes sont introduits selon les techniques classiques qui seront aisément choisies et mises en oeuvre par l'homme de l'art.
Quant au cAMP, il est obtenu selon le procédé le plus habituel, à partir d'ATP en utilisant de l'adenyl cyclase comme catalyseur et en opérant à pH 8 pour obtenir un déplacement à pratiquement 100% dans le sens de la formation de cAMP.
La catalyse par la protéine à activité adenyl cyclase est réalisée avantageusement à un pH entre environ 6 et 8, plus particulièrement de l'ordre de 6.
De préférence, cette protéine est fixée à un support, par exemple à des billes d'agarose.
La protéine à activité adenyl cyclase mise en oeuvre pour la catalyse enzymatique est avantageusement constituée par une préparation d' adenyl cyclase de pureté élevée.
Une préparation purifiée particulièrement satisfaisante est décrite dans la demande FR n° 8615963 du 17/11/86 au nom de l'Institut Pasteur.
De manière préférée, on a recours à une protéine à activité adenyl cyclase telle qu'exprimée par le gène cya clone à partir de Bordetella, notamment de B.pertussis, ou à partir de Bacillus anthracis.
Le gène cya de B.pertussis et la protéine codée exprimant une activité adenyl cyclase sont décrits dans la demande FR n° 8710614 du 24/07/87 au nom de l'Institut Pasteur.
Dans la demande FR n° 8813952 du 29/10/88 au nom de l'Institut Pasteur, on a également décrit une protéine exprimant une activité adenyl cyclase codée par un gène cya de B.anthracis. Cette séquence est également rapportée par Escuyer et al. dans Gène 71 (1988), 293-298.
La séquence nucléotidique du gène cya et la séquence d'acides aminés correspondantes codées sont rapportées sur la figure 1.
Les lettres indiquées dans l'enchaînement d'acides aminés présentent les significations conventionnelles suivantes:
D Acide aspartique
E Acide glutamique
A Alanine
R Arginine
N Asparagine
C Cystéine
Q Glutaminé
G Glycine
H Histidine
I Isoleucine
L Leucine
K Lysine
M Méthionine
F Phenylalanine
P Proline
S Serine
T Thréonine
W Tryptophane
Y Tyrosine
V Valine
Selon une disposition particulièrement avantageuse de l'invention, la protéine à activité adenyl cyclase mise en oeuvre est une forme tronquée d'adenyl cyclase.
Cette adenyl cyclase tronquée, qui constitue en tant que produit nouveau un objet de l'invention, est un dérivé de délétion par rapport à la séquence d'acides aminés de la figure 1. Il s'agit en particulier d'un dérivé dépourvu d'une séquence d'acides aminés dans la partie N-terminale, qui n'intervient pas de manière fondamentale dans l'activité adenyl cyclase, plus spécialement d'une séquence de 261 acides aminés à l'extrémité N- terminale.
Le dérivé d'adenyl cyclase de l'invention est caractérisé par une masse moléculaire de 62200 daltons ± 10%.
Cette protéine possède des propriétés catalytiques et de liaison à la calmoduline semblables à celles de l'adenyl cyclase de type sauvage provenant de surnageants de culture de B.anthracis, à savoir : kcat de 1100 s-1 à 30°C pH 8, Km apparent pour ATP de 0,25 mM et Kd pour la calmoduline de cerveau de boeuf de 23 nM.
Elle partage également des caractéristiques communes avec l'adenyl cyclase de B.pertussis.
Cette protéine est avantageusement obtenue par expression, par exemple dans une souche déficiente en protéase (Ion-) de E.coli, du gène cya de B.anthracis dépourvu à l'extrémité N-terminale d'au moins une partie des codons n'intervenant pas de manière fondamentale pour la synthèse de la protéine à activité adenyl cyclase ci-dessus. Ce gène cya est en particulier caractérisé en ce qu'il est dépourvu des 261 codons à l'extrémité N-terminale de la séquence de la figure 1.
Ce gène tronqué est compris dans l'invention.
Toute séquence de nucléotides hybridable avec celle de l'enchaînement de la figure 1, telle qu'obtenue par transcription enzymatique inverse de l'ARN correspondant, ou encore par synthèse chimique, fait partie de l'invention.
Il va de soi que les bases de la séquence de nucléotides considérée peuvent être dans un ordre différent de celui trouvé dans les gènes et/ou que ces bases peuvent être, le cas échéant, substituées, dès lors qu'une sonde élaborée à partir d'une telle séquence donne une réponse caractéristique et non équivoque quant à la capacité de reconnaître la présence de gènes codant pour une telle adenyl cyclase tronquée. Cette remarque s'applique également à la séquence donnée dans la figure 2.
D'une manière générale, l'invention concerne une séquence de nucléotides caractérisée en ce qu'elle porte l'information pour la synthèse d'une adenyl cyclase tronquée, ou de fragments de cette dernière, capables de former un complexe immunologique avec des anticorps dirigés respectivement contre une adenyl cyclase de B.anthracis, de B.pertussis ou de cerveau de rat ou contre des fragments d'une telle adenyl cyclase.
L'invention concerne également une séquence recombinante comprenant l'une des séquences définies ci-dessus, le cas échéant associée à un promoteur capable de contrôler la transcription de la séquence d'ADN codant pour des séquences de terminaison de la transcription et des signaux de traduction et de sécrétion.
Elle vise encore une séquence de nucléotides recombinante, associée à un promoteur et à un opérateur permettant de contrôler la transcription, et à une séquence signal permettant la sécrétion de la protéine dans l'espace périplasmique (gram -) ou dans le milieu extérieur.
Selon encore un autre aspect, la séquence de nucléotides de l'invention est capable de s'hybrider avec une sonde formée à partir de la séquence présentant l'enchaînement de nucléotides de la figure 1 correspondant au gène cya tronqué de B.anthracis.
L'invention vise aussi bien les séquences d'ADN que d'ARN.
Dans le procédé de l'invention, les dérivés d'ATP substitués obtenus par action de l'adenyl cyclase comme décrit ci-dessus sont utilisés comme substrats par un système, comportant une protéine à activité NDP kinase couplée à u système consommateur de groupe phosphate, par exemple à une hexokinase.
La protéine à activité NDP kinase catalyse le transfert du groupement γ-phosphate d'un triphosphonucléotide sur un nucléotide diphosphate accepteur selon un mécanisme communément appelé
"ping-pong", comportant un intermédiaire phosphorylé stable.
Lorsqu'on souhaite disposer de dérivés d'adénosine phosphate comportant une substitution en position 3', on introduit par voie chimique le substituant souhaité avant de soumettre le dérivé d'ATP à l'action du système ci-dessus.
Les substitutions introduites en position 3' correspondent avantageusement à celles indiquées pour la position 2' des dérivés de cAMP.
Conformément à une disposition préférée de l ' invention, la protéine à activité NDP kinase mise en oeuvre est une protéine telle qu'obtenue par clonage du gène codant pour la NDP kinase de Dictyostelium discoideum et purification de la protéine.
Cette protéine constitue l'un des objets de l'invention en tant que produit nouveau.
Elle est caractérisée par l'enchaînement de 155 acides aminés représenté sur la figure 2. Son poids moléculaire théorique Mr est de 16700 ± 10 %.
La protéine à activité NDP kinase de l'invention est encore caractérisée en ce qu'elle est fortement basique avec un pI calculé de 9,15 et qu'elle contient un fragment hydrophobe (résidus 64 à 84). Ses propriétés basiques permettent de la purifier aisément. Cette protéine constitue donc une source industrielle de NDP kinase présentant un grand intérêt par rapport aux NDP kinases obtenues actuellement à partir d'extraits de tissus ou d'organes et dont la purification nécessite la mise en oeuvre de techniques coûteuses. On connaît la composition en acides aminés des NDP kinases purifiées obtenues à partir de :
- levure (16),
- cerveau de boeuf (17),
- foie de rat (14).
L'invention vise également une séquence de nucléotides constituée par au moins une partie d'une séquence codant pour une protéine à activité NDP kinase telle qu'exprimée par D.discoideum.
Cette séquence est capable de s 'hybrider avec des gènes codant pour une protéine à activité NDP kinase.
Le pourcentage d'homologie en ce qui concerne les séquences qui s'hybrident est de 70 à 90 %.
Les conditions pour les hybridations évoquées en rapport avec les nouvelles séquences de nucléotides sont des conditions de stringence relativement faibles. On utilise ainsi par exemple 30 % de formamide, 6xSSC (citrate de sodium, NaCl), 0,12 M de pyrophosphate de sodium, 0,5 % de SDS et 250 μg d'ADN de sperme de hareng à 30°C. Les lavages sont effectués dans le même milieu à 37°C et suivant l'importance du bruit de fond, en diminuant progressivement la concentration de SSC et en augmentant la température de lavage de 5°C en 5°C.
L'invention concerne également une séquence recombinante comprenant l'une des séquences définies ci-dessus, le cas échéant associée à un promoteur capable de contrôler la transcription de la séquence d'ADN codant pour des séquences de terminaison de la transcription et des signaux de traduction et de sécrétion.
Selon encore un autre aspect, la séquence de nucléotides de l'invention est capable de s'hybrider avec une sonde formée à partir de la séquence présentant l'enchaînement de nucléotides représenté sur la figure 2 ou l'enchaînement des nucléotides complémentaires de cette séquence. Les séquences de l'invention sont des séquences d'ADN ou d'ARN.
Toute séquence de nucléotides hybridable avec celle de l'enchaînement de la figure 2, telle qu'obtenue par transcription enzymatique inverse de l'ARN correspondant, ou encore par synthèse chimique, fait partie de l'invention.
Conformément à l'invention, le clonage de la séquence de nucléotides codant pour une protéine à activité NDP kinase comprend l'isolement des clones d'une banque d'expression construite dans un vecteur, du type de ceux exprimant une protéine interagissant spécifiquement avec un composé tel que [35S] GTPγS, donneur de triphosphate.
Pour l'expression de la protéine dans un hôte, on construit un vecteur en insérant un fragment nucléotidique renfermant la séquence codante.
Selon un mode de réalisation avantageux, on construit par exemple le plasmide pNDK pour exprimer la protéine à activité NDP kinase dans une bactérie telle que E.coli. A cet effet, on insère le fragment de restriction Haelll - EcoRI du clone isolé, ce fragment ayant été avantageusement traité au préalable pour obtenir des extrémités franches. L'insertion est réalisée dans le site HincII du plasmide pTZ18R. Le plasmide recombinant résultant est introduit dans la bactérie aux fins d'expression, selon les techniques habituelles, de l'enzyme sous le contrôle du promoteur lac Z.
Un agent inducteur tel que l'IPTG est avantageusement ajouté pour augmenter le taux d'expression. Plusieurs mg par litre de culture peuvent être ainsi obtenus.
L'enzyme récupérée est soumise à au moins une étape de purification sur une colonne de chromatographie.
Une préparation homogène d'enzyme est obtenue en mettant en contact un surnageant de centrifugation d'une suspension de bactéries préalablement cassées par sonication, obtenue à l'issue du procédé cidessus, avec un dérivé de dextrane tel que le DEÀE- Sephacel®, puis en chromatographiant l'éluat recueilli sur une colonne de résine telle que Affigel-Blue®.
A pH 8,5, la protéine à activité NDP kinase n'est pas retenue dans la résine et est éluée dans le volume mort.
Selon un autre aspect du procédé de synthèse de dérivés d'adénosine de l'invention, on fait réagir un dérivé d'ADP substitué, tel que défini ci-dessus, avec une protéine à activité NDP kinase capable de phosphoryler le dérivé d'ADP en conduisant à un dérivé d'ATP dans lequel le groupe phosphate apporté par la protéine à activité NDP kinase est éventuellement marqué.
Ainsi, la NDP kinase fixe de façon covalente le groupement phosphate marqué des [γ-32P] triphosphonucléotides.
L'utilisation de l'enzyme fixée à un support, par exemple couplée à des billes d'agarose permet d'éliminer après la réaction de marquage, les nucléotides donneurs par rinçages successifs des billes. Le phosphate marqué fixé à la protéine est ensuite transféré aux nucléosides diphosphates accepteurs.
La mise en oeuvre des dispositions qui précèdent permet notamment d'effectuer une substitution sélective en une position donnée du dérivé recherché, par exemple en position 2' sans avoir à recourir à la séparation des isomères en positions 2' et 3' qui sont obtenus habituellement en opérant par voie chimique.
Il est également possible d'obtenir des dérivés substitués de façon sélective en 2' et en 3', alors que les procédés chimiques classiques conduisent à 6 isomères ce qui rend les opérations de séparation difficiles. En outre, selon un aspect de grand intérêt, le coût de la synthèse est réduit de manière sensible par rapport aux procédés chimiques utilisés jusqu'à présent, étant donné que la séparation d'isomères n'est plus nécessaire, les réactions de substitution sont réalisées en une seule étape, si l'on excepte l'introduction d'un groupe en position 3', lorsqu'on souhaite une substitution à cette position, avec des rendements allant jusqu'à 100 %.
Les dérivés d'adénosine phosphate substitués de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule:
Figure imgf000013_0001
dans laquelle
. R1 et R2 , identiques ou différents l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, un radical alcoyle, alcoxy, acyle, aryle, amino, azido, ester d'alcoyle,
. R3 et R5 , identiques ou différents l'un de l'autre, sont choisis dans le groupe comprenant un atome d'halogène, un groupe alcoyle, alcoxy, acyle, une fonction azotée telle qu'azido, amino ou aminoalcoyle,
. R4 est un groupe amino,
R6 est un groupe di- ou triphosphate et comporte éventuellement un groupe marqueur.
L'invention vise également les applications biologiques des produits nouveaux de l'invention. Ces applications comprennent l'utilisation des dérivés d'adénosine phosphates comme réactifs de laboratoire.
De tels réactifs présentent un intérêt tout particulier comme marqueurs de fluorescence, ou encore comme marqueurs d'affinité ou de photoaffinité, en permettant de réaliser des études de structure et de sites actifs. Ces réactifs sont marqués par exemple au 32P.
Les dérivés d'adénosine phosphate ainsi obtenus sont également utilisables comme ligands en chromatographie d'affinité. Dans cette application, ils sont fixés à un support, par exemple à de l'agarose. Ils permettent de purifier notamment les protéines qui se fixent à l'ATP.
Une ou plusieurs substitutions spécifiques permettent d'augmenter l'affinité et la spécificité d' interaction pour une enzyme donnée, par exemple une cyclase de mammifères.
En ce qui concerne les moyens nouveaux mis en oeuvre pour l'obtention de ces dérivés d'adénosine phosphates, leur utilisation couvre plusieurs aspects de la chimie préparative ou analytique des nucléotides de l'adénine.
Ainsi l'adenyl cyclase tronquée, sous forme soluble ou immobilisée est utilisable notamment pour la synthèse de cAMP ou des analogues de cAMP en partant de l'ATP ou des analogues correspondants de l'ATP. Le coût du cAMP (environ 7 à 10 fois supérieur à celui de l'ATP) justifie d'accorder la préférence au procédé enzymatique par rapport au procédé chimique utilisé actuellement.
L'adenyl cyclase tronquée de l'invention permet également de séparer des dérivés d'adénosine phosphate substitués en 3' obtenus par synthèse chimique et souvent difficilement séparables de dérivés substitués en d'autres positions, notamment en 2'. Comme les dérivés substitués en 3' sont insensibles à l'action de l'adenyl cyclase, il suffit de soumettre le mélange de dérivés substitués, notamment substitués en 2', d'une part et ceux substitués en 3' d'autre part à l'action de l'enzyme pour ensuite séparer le nucléoside triphosphate d'un nucléotide monophosphate cyclique.
Dans les applications qui précèdent, ainsi que pour la synthèse des dérivés d'adénosine phosphate de l'invention, on utilise l'enzyme immobilisée, par exemple selon une technique classique sur Sepharose activé par CNBr, en opérant selon les procédés décrits dans la littérature. Le milieu de réaction tamponné à pH 8 (formation de cAMP) ou à pH 6 (synthèse de l'ATP et de ses dérivés) contient MgCl2 (5-20mM), nucléotides (5-100mM), pyrophosphate (5-20mM) et glucose (10-100mM), ainsi que des concentrations catalytiques de l'ADP, hexokinase et nucléotide diphosphate kinase (également immobilisés sur billes de Sepharose). Les nucléotides obtenus sont ensuite purifiés selon des procédés décrits dans la littérature.
Il est en outre possible d'effectuer le dosage de cAMP, du pyrophosphate (PP) ou de la calmoduline ou dans des produits de synthèse ou milieux biologiques à l'aide de la réaction réverse. La sensibilité de cette méthode peut être augmentée par exemple soit par couplage avec d'autres enzymes comme les hexokinases et la pyruvate kinase, soit en utilisant les tests de bioluminescence.
Dans cette application, l'adenyl cyclase est utilisée avantageusement sous forme soluble. La concentration du produit à doser varie entre 0,1 et 50 μM pour cAMP, entre 0,1 et 50μM pour PP et entre 0,1 et 20 nM pour la calmoduline.
On effectue plus spécialement le dosage à un pH voisin de la neutralité notamment supérieur à 7, en particulier de 7,4. La formation de NADPH est suivie par spechophotométrie ou fluorométrie. Des concentrations standards sont par exemple:
Tris-HCl (pH 7,4) 50mM; KCl 20mM; MgCl2 5mM; glucose
ImM; NADP+ 0,7mM; cAMP 20mM; PP 5mM; calmoduline 1μM; adenyl cyclase 0,1μM; hexokinase et glucose 6- phosphate déhydrogénique, chaque 2 unités.
Les applications des produits selon l'invention comprennent également l'élaboration, à partir de fragments de l'enchaînement de nucléotides de la figure 2, de sondes d'ARN, d'ARN-m ou d'ADN, pour la détection de séquences similaires dans d'autres organismes ou tissus.
Cette élaboration comprend, notamment, la dénaturation des séquences double brin pour obtenir une séquence monobrin utilisable en tant que sonde.
L'invention vise donc des sondes de détection caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie d'une séquence de nucléotides définie cidessus, d'ARN ou d'ADN, plus spécialement un fragment d'une séquence codant pour une protéine à activité NDP kinase.
Le fragment utilisé comme sonde comporte un nombre de nucléotides suffisant pour obtenir la spécificité requise et la formation d'un hybride stable.
Des sondes appropriées sont avantageusement marquées par un élément radio-actif (sondes chaudes) ou tout autre groupe non radio-actif (sondes froides) permettant la reconnaissance de la sonde à l'état hybride avec la préparation renfermant l'ADN à étudier.
Des dérivés d'adénosine phosphate dans lesquels le groupe phosphate est marqué en α sont particulièrement avantageux pour l'élaboration de sondes froides. Pour cette élaboration, on opte avantageusement comme décrit dans les brevets FR n° 8413095 et n° 8413096 du 22 août 1984, au nom de l'Institut Pasteur. Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un échantillon biologique renfermant des bactéries, ou directement avec ces bactéries ou leurs acides nucléiques, dans des conditions autorisant l'hybridation éventuelle de la séquence de nucléotides de la sonde avec une séquence complémentaire, éventuellement contenue dans le produit testé.
Ces sondes permettent de rechercher la présence de gènes homologues chez d'autres espèces par hybridation après transfert de Southern. Pour parvenir à détecter des séquences même relativement divergentes, on fait varier, de manière en soi connue, les conditions de force ionique des milieux d'hybridation et de rinçage. Ces conditions d'hybridation ont été énoncées plus haut.
On peut mettre en oeuvre la méthode d'hybridation sur taches (dot blot). Cette méthode comporte après dénaturation de l'ADN préalablement obtenu à partir de cellules exprimant une protéine à activité adenyl cyclase ou NDP kinase selon l'invention, le dépôt d'une quantité aliquote de cet ADN sur des membranes de nitrocellulose, l'hybridation de chaque membrane dans les conditions usuelles avec la sonde et la détection, de manière classique, de l'hybride formé.
Dès lors que des séquences apparentées sont détectées, des clones sont isolés par hybridation hétérologue des banques d'ADNc construites dans des phages ou des plasmides.
L'invention fournit ainsi des outils permettant de détecter rapidement, avec une grande spécificité, des séquences similaires dans les gènes codant pour des protéines à activité NDP kinase, ce qui permet d'étudier l'origine et le mode d'action de ces NDP kinases.
Pour la mise en oeuvre des méthodes de détection considérées ci-dessus, basées sur l'utilisation de sondes nucléotidiques, on a recours avantageusement à des nécessaires ou kits comprenant:
- une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique selon l'invention,
- avantageusement, un milieu approprié respectivement à la formation d'une réaction d'hybridation entre la séquence à détecter et la sonde,
- avantageusement des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés entre la séquence de nucléotides et la sonde lors de la réaction d'hybridation.
L'invention vise également les applications immunologiques de l'adenyl cyclase tronquée, plus spécialement pour l'élaboration d' immunsérums spécifiques polyclonaux et d'anticorps monoclonaux. Les anticorps polyclonaux sont formés selon les techniques classiques par injection de la protéine à des animaux, récupération des antisérums, puis des anticorps à partir des antisérums par exemple par chromatographie d' affinité.
Les anticorps monoclonaux sont produits de manière habituelle en fusionnant des cellules de myélomes avec des cellules de rate d'animaux préalablement immunisés à l'aide des protéines de l'invention.
Les essais de toxicologie réalisés avec cette adenyl cyclase en l'absence d'antigène protecteur ont démontré son absence de toxicité.
Des souris ont été immunisées avec différentes doses d'antigène (3 injections sous-cutanées à une semaine d'intervalle, de 250 μl d'antigène dans du tampon tris 10 mM pH 7 contenant 1 mg/ml d'Am---).
Les résultats obtenus montrent l'obtention d'une synthèse d'anticorps antiAC, après immunisation avec la protéine.
L'invention vise donc des compositions immunogènes à base des protéines définies ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutique. Ces compositions sont potentiellement capables de prévenir les infections provoquées notamment par B.anthracis, B.pertussis, B.parapertussis et B.bronchiseptica et leurs effets toxiques chez l'homme et l'animal.
L'invention vise également les applications immunologiques de la NDP kinase telle qu'obtenue selon l'invention.
Ces applications comprennent comme indiqué cidessus en rapport avec l'adenyl cyclase tronquée, l'élaboration d'immunsérums spécifiques polyclonaux et d'anticorps monoclonaux.Elles comprennent également l'élaboration de compositions immunogènes.
Les essais d'immunisation rapportés ci-dessus pour la protéine à activité adenyl cyclase ont été également effectués avec la NDP kinase de l'invention et ont conduit à la formation d'anticorps.
Les compositions immunogènes définies ci-dessus sont utilisées aux doses et sous les formes d'administration habituelles, en particulier sous les formes classiques administrables par voie intranasale, orale ou parentérale.
Le cas échéant, les compositions renfermant la protéine à activité adenyl cyclase sont associées à de la FHA et/ou de la PTx dans le même inoculum ou non. Les préparations de FHA sont avantageusement obtenues, par exemple, selon la méthode de Sato et al. (15).
On indique ci-après, à titre d'exemples non limitatifs,
A) les matériels et les méthodes utilisés pour obtenir la protéine tronquée à activité adenyl cyclase,
B) les matériels et méthodes utilisés pour cloner et séquencer le gène d'une protéine à activité NDP kinase et pour exprimer cette protéine dans un hôte,
C) la synthèse de dérives d'ADP substitués.
Les figures 1 et 2 auxquelles il est fait référence représentent: - la figure 1, la séquence de nucléotides codant pour l'adenyl cyclase de B. anthracis et, en correspondance, la séquence d'acides aminés de cette enzyme,
- la figure 2, la séquence de l'ADNc codant pour une protéine à activité NDP kinase et, en correspondance, la séquence d'acides aminés de cette protéine.
Les références numériques données dans les exemples correspondent aux références bibliographiques mentionnées en fin de description.
EXEMPLE A: OBTENTION D'UNE PROTEINE TRONQUEE A ACTIVITE ADENYL CYCLASE:
I- MATERIELS ET METHODES
L'origine des produits chimiques utilisés dans les exemples est indiquée ci-après :
Nucléotides d'adénine, enzymes de restriction, ADN T4 ligase : BOEHRINGER MANNHEIM.
ADN polymérase (Sequenase) : USBC
Oligodéoxyribonucléotides utilisés comme amorces dans le séquençage d'ADN : PHARMACIA
Enzymes de couplage et CaM (calmoduline) de cerveau de boeuf: Sigma
3'dATP, 8-BrATP, (8-bromo adénosine 5' triphosphate) 8-N3ATP (8-azidoadénosine 5'-triphosphate), eATP, (1- N6-éthénoadénosine-5'-triphosphate) GTP
Bleu-Sépharose, Ultrogel AcA 44, échangeur polytampon 94 et polytampon 96 : PHARMACIA LKB
Biotechnologies
[α32P]ATP (3000 Ci/mmol), [3H] cAMP (40 Ci/mmol) et [α35S] 2'dATP (1000 Ci/mmol): Centre Amersham (GB)
[α32P] 3'dATP (5000 Ci/mmol) : NEN Research Product.
.SOUCHES BACTERIENNES ET MILIEUX DE CROISSANCE
Deux souches de E.coli sont utilisées : JM105(1) et une souche déficiente en protease (lon-) CAG 1139 (2). Les bactéries sont cultivées sur milieu riche LB de Miller (3). On atteint une DO600nm de 24 lorsque la culture est effectuée dans des conditions de fermenteur de 20 1. On ajoute de l'ampicilline à raison de 100 μg/ml, si nécessaire.
.PROCEDES D'ANALYSE D'ADN
On génère des délétions unidirectionnelles dans le gène cya clone dans M13mp19 en utilisant le système "Cyclone" (IBI) en suivant les instructions du fabricant. La séquence nucléotidique est déterminée par une méthode de terminaison de chaîne au didéoxynucléotide modifiée en utilisant la Séquénase comme ADN polymérase (4).
.PURIFICATION D'ADENYL CYCLASE
70g de pâte congelée humide de bactéries sont mis en suspension dans 500ml de 50mM Tris-HCl (pH 8) et soumis à sonication à 20 KHz et 100 watts (3 x 4 min). Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 12000 g pendant 20 min à 4°C.
. CHROMATOGRAPHIE SUR BLEU-SEPHAROSE
L'extrait bactérien est déposé sur une colonne de Bleu-Sépharose (5 x 20 cm) équilibrée avec 50mM de Tris-HCl (pH 8) à un débit de 400 ml/h. La colonne est lavée avec 5 volumes du même tampon pendant 5 h, puis les protéines sont éluées avec 0,5M de NaCl dans 50 mM de Tris-HCl (pH 8) et sont précipitées avec du sulfate d'ammonium solide (80% saturation).
.CHROMATOFOCUSING
Après centrifugation à 10000 g pendant 10 min, les protéines précipitées sont redissoutes dans 25 mM de Tris-HCl (pH 9), puis on élimine les sels par gel filtration sur une colonne de Séphadex G25 équilibrée avec le même tampon. L'échantillon désalé est déposé sur une colonne échangeur polytampon 94 (1 x 50 cm) à raison de 20 mg de protéine/ml de gel gonflé et à un débit de 100 ml/h. Après lavage avec 250 ml de Tris- HCl 25mM (pH 9) pendant une heure, on élue les protéines avec 450 ml de polytampon 96 dilué 10 fois, ajusté à pH 7 avec HC1 IN On recueille des échantillons de 5 ml à un débit de 30 ml/h. L'adenyl cyclase est éluée entre pH 8,3 et 8,1. On rassemble les échantillons contenant l'adenyl cyclase et on effectue une précipitation avec du sulfate d'ammonium solide (80%).
.CHROMATOGRAPHIE SUR ULTROGEL AcA 44
L'enzyme précipitée est redissoute dans 50 mM de
Tris-HCl (pH 7,4) et déposée sur une colonne de 1,5 x 120 cm d'Ultrogel AcA 44 équilibrée avec le même tampon. L'enzyme est éluée à un débit de 15 ml/h. On récupère des fractions de 3 ml. Les échantillons contenant de l'adenyl cyclase pure sont rassemblés et stockés à -20°C ou sont lyophilisés après une dialyse extensive contre 50 mM de bicarbonate d'ammonium.
.PROCEDURES ANALYTIQUES
A moins d'indications contraires, l'activité de l'adenyl cyclase est mesurée comme décrit dans (5) dans 100 μl de milieu contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 8), 6 mM de MgCl2, 0,1 mM de CaCl2, 0,2 μM de CaM de cerveau de boeuf, 0,5 mg/ml d'albumine de sérum bovin, 0,1 mM de cAMP (104 cpm/essai) et 2 mM d'ATP (5 x 105 cpm/essai). Une unité (1 U) d'activité adenyl cyclase correspond à 1 μmol de cAMP formé dans 1 min à 30°C et pH 8.
La séquence d'acides aminés de la partie N- terminale de la protéine purifiée est déterminée en utilisant le séquenceur de protéine automatisé de APPLIED BIOSYSTEMS. L'électrophorèse sur gel de SDS- polyacrylamide est effectuée selon Laemmli(6).
II- RESULTATS
.EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA PROTEINE CODEE PAR LE GENE CYA TRONQUE DE B.ANTHRACIS dans E.COli
Un fragment EcoRI-BamHI de 3 kb provenant de pMMA86, codant pour le site cya est clone dans M13mp19. On génère des délétions unidirectionnelles à partir du site EcoRI pour éliminer les séquences d'ADN en aval de l'extrémité 5' du gène cya. Les fragments d'ADN portant les différentes délétions sont récupérés par digestion par EcoRI-PstI de la forme réplicative du phage. Ces fragments sont sous-clonés dans pUC8 apportant ainsi l'expression du gène cya sous le contrôle du promoteur lac. Les clones portant les plasmides recombinants sont analysés pour étudier l'expression de l'adenyl cyclase.
L'un de ces clones, pMMA86, Δcya 19, exprime de manière significative de fortes quantités d'adenyl cyclase (1 U/mg de protéine). Le séquençage d'ADN au site EcoRI de M13mp19 Δcya 19 indique que les 261 premiers codons du gène de l'adenyl cyclase ont été éliminés, conduisant à un produit tronqué avec Pro 262 comme acide aminé N-terminal. La séquence N-terminale de l'enzyme purifiée est Asn-Ser-Pro-Asp-Met-Phe-Glu- Tyr-Met-Asn-Lys-Leu-Glu-Lys-Gly-Gly-Phe-Glu. Les deux premiers résidus n'ont pas d'équivalent dans la protéine de type sauvage de B.anthracis. Ils résultent de la fusion de la séquence codant pour l'adenyl cyclase à la séquence de nucléotide du polylinker M13mpl9. La transformation de pMMA86 Δcya 19 en une souche déficiente en protease, CAG 1139, et la culture des bactéries dans un fermenteur de 20 1 augmente fortement la production d'adenyl cyclase qui peut atteindre 20 U/mg de protéine.
L'adenyl cyclase tronquée de B.anthracis exprimée dans E.coli représente approximativement 2% des protéines totales bactériennes.
L'élution de l'enzyme liée au Bleu-Sépharose avec 0,5 M de NaCl conduit à une purification de l'adenyl cyclase de 8 fois avec un taux de récupération de 70%. On obtient une protéine pratiquement pure par chromatofocusing entre pH 9 et pH 7, le pic de l'enzyme éluant à pH 8,2. La chromatographie par gel perméation dans 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4) a été utilisée pour éliminer le sulfate d'ammonium, l'ampholine et quelques contaminants de faible poids moléculaire. Dans le tableau qui suit, on a résumé les étapes de purification.
Figure imgf000024_0001
L'adenyl cyclase pure est stable à une concentration supérieure à 1 mg/ml pendant plusieurs semaines à -20°C. La lyophilisation de l'adenyl cyclase n'altère pas ses propriétés catalytiques ce qui permet d'utiliser ce procédé pour un stockage à long terme ou pour d'autres études spectroscopiques.
. INTERACTION D'ADENYL CYCLASE TRONQUEE DE B.ANTHRACIS
AVEC CaM
L'adenyl cyclase tronquée de B.anthracis est activée par CaM en présence et en l'absence de Ca2+.
L'affinité de la CaM de cerveau de boeuf pour l'adenyl cyclase recombinante (Kd = 23 nM) est très proche de celle observée pour la protéine complète excrétée par B.anthracis dans les surnageants de culture (Kd = 26 nM). L'activité maximale de l'adenyl cyclase recombinante à des concentrations saturantes d'ATP et de CaM, pH 8 et 30°C est de 1100 μmol/min.mg de protéine, ce qui correspond à un kcat d'environ 1100s-1. Cette valeur est proche de celle calculée pour l'adenyl cyclase purifiée de surnageants de culture de B.anthracis si l'on fait une correction de température (23°C contre 30°C). Dans des conditions expérimentales identiques, l'adenyl cyclase de B.pertussis présente des valeurs de kcat entre 1700 et 2300 s-1.
EXEMPLE B: CLONAGE DU GENE CODANT POUR UNE PROTEINE A ACTIVITE NDP KINASE ET PROTEINE EXPRIMEE:
I- MATERIELS ET METHODES
a- Matériels, phages et souches bactériennes:
On indique ci-après la provenance des matériaux et des produits utilisés,
- filtres de nitrocellulose BA85: Schleicher et Schuell (pour le criblage de la banque d'ADN de D. discoideum avec [35S]GTPγS,
- disques colonie/plaque Screen pour le criblage avec les sondes d'ADNc, - membranes de transfert par capillarité pour l'hybridation : Gène Screen Plus (Dupont-New England Nuclear; E.U.),
- disques en fibre de verre (GF/C) et papier de chromatographie d'échange d'ions DE81 : WHATMAN,
- GTP, GTPTS 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopy- ranoside(X-Gal), isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), lactate déhydrogénase et pyruvate kinase : BOEHRINGER MANNHEIM,
albumine de sérum bovin, benzamidine, PMSF, phosphoénolpyruvate, NADH, ATP et dTDP : Sigma;
- Tween 20 : Merck,
- enzymes de restriction et enzymes modifiant l'ADN : BOEHRINGER MANNHEIM, AMERSHAM (UK) OU PROMEGA BIOTEC,
- Mung bean nucléase : PHARMACIA.
Toutes les enzymes sont utilisées selon les recommandations du fabricant.
- ARNs de 0,16 à 1,77 kb utilisés comme marqueurs dans les empreintes Northern : BETHSEDA RESEARCH Laboratories,
kit "Cyclone" utilisé pour les délétions unidirectionnelles des inserts à séquencer : IBI (New Haven Connecticut, EUA),
- [35S] GTPTS (1300 Ci/mmoles) :DUPONT-NEW ENGLAND NUCLEAR (E.U.),
- [τ-32P]GTP(10 Ci/mmoles), [τ32β]ATP(3000 Ci/mmoles), [α-32P]ATP(3000 Ci/moles), [α-32P]dCTP(3000 Ci/mmoles), la [35S]dATPαS (supérieur à 400
Ci/mmoles) : AMERSHAM,
- système de marquage d'ADN à amorces multiples utilisés pour la synthèse des sondes selon (7) et kit de séquençage M13 : AMERSHAM (GB).
λgt11 et les souches de E.coli, Y1088 et Y1090 sont décrites dans (8). La banque d'ADNc λgt11 a été construite à partir d'ARN poly(A+) isolé de cellules de Dictyostelium discoideum de la souche axénique AX3 qui a été carencee pendant 3 heures en présence de 1 mM de cAMP (9). La souche de E.coli XL1-Blue proviint de Stratagene et les vecteurs M13mp19 RF et pTZ18R proviennent de Pharmacia. L'oligonucléotide amorce utilisé pour le sequençage d'ARN et l'analyse de l'extrémité 5' présente la séquence : (5'-
GCGATGATTTCACCAAC-3').
b- CRIBLAGE DE LA BANQUE DE λGT11 PAR MARQUAGE
IN SITU AVEC [35S]GTP S
La banque d'ADNc (2,5 x 105pfu)) a été étalée en utilisant la souche de E.coli Y1090 et 2,3x104pfu, par boîtes de Pétri de 90 mm avec de l'agarose remplaçant l'agar dans le milieu L utilisé pour la couche supérieure. Après avoir effectué le test d'empreinte comme décrit dans (13), les boîtes sont transférées à
4°C pendant 30 min. Les filtres de nitrocellulose sont retirés et rincés 2 fois brièvement avec 50 mM de tampon Tris-HCl, pH 8 utilisé à 4°C et contenant 150 mM de NaCl et 0,5% de Tween 20. Ils sont ensuite incubés sous agitation ménagée soit 30 min. à température ambiante soit 14 heures à 4°C dans des boîtes de Pétri contenant 1,5 ml par filtre de tampon
A (50 mM HEPES, pH 8,1 mM, d'EDTA, 20 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl) avec 1 mM de DTT et 1 à 5 nM [35S]GTPγS 3 à 15 x 106 Cpm/ml de milieu d'essai). Les filtres sont ensuite transférés sur un support en verre frite de taille correspondante et lavés 4 fois avec 50 ml de tampon utilisé à 4°C (20 mM de tampon Tris-HCl, pH 8, contenant 100 mM de NaCl et 25 mM de MgCl2).
En variante, on lave les filtres 2 fois dans des bains par incubation 10 min. à 4ºC dans 50 ml du même tampon.
c- CRIBLAGE DE LA BANQUE DE λGT11 AVEC UNE SONDE D'ADNc
La matrice utilisée pour la synthèse de la sonde d'ADNc de NDP kinase par la technique des amorces multiples (10) est constituée par le fragment de restriction XmnI-EcoRI de 399 paires de base du phage recombinant G821, sous-cloné dans le vecteur pTZ18R. Ce fragment correspond à 72% de la séquence codante pour la protéine à activité NDP kinase.
d- SEQUENCAGE D'ADN
Les inserts d'ADNc provenant des clones de λgt11 sont excisés par digestion avec EcoRI et insérés par ligation dans le vecteur pTZ18R ou dans la forme réplicative du phage M13mp19.
L'analyse de la séquence d'ADN a été réalisée selon la méthode au didéoxy de SANGER et al (11) modifiée pour l'utilisation avec [35S] d'ATPαS (12) et l'analyse de la séquence d'ARN a été effectuée selon la technique décrite par GELIEBTER et al dans (13), en utilisant comme amorce l'oligonucléotide (5'- GCGATGATTTCACCAAC-3 ') élaboré pour s'hybrider avec les nucléotides 91 à 107 de la séquence de l'ADNc codant pour la NDP kinase.
e- CONSTRUCTION DU PLASMIDE pNDPK UTILISE POUR EXPRIMER LA NDPK DANS E.COLI
Un plasmide pNDK a été construit pour exprimer la protéine recombinante dans E.coli en utilisant le fragment HaelII-EcoRI (540 pb) du clone obtenu par criblage de la banque d'expression avec le [35S]GTPγS. f - INCORPORATION DE [35S] DANS Dp17 ET MESURE DE L'ACTIVITE NDP KINASE
L'activité NDP kinase a été mesurée dans les extraits de bactéries transformées par pNDK en dosant l'ADP formé au cours de la réaction par un test enzymatique couplé aux activités pyruvate kinaselactate déhydrogénase.
II- RESULTATS
La détection des clones a été effectuée par marquage direct in situ avec [35S]GTPrS. En opérant comme décrit dans 1-b, deux clones ont été isolés : G821 et G951.
Les deux clones sélectionnés par le criblage fonctionnel contiennent un fragment identique de EcoRI de 680 nucléotides qui a été séquence sur les deux brins après sous-clonage dans le site EcoRI du plasmide pTZ18R. Un cadre ouvert de lecture de 504 nucléotides a été trouvé précédé par une extrémité 5' de 136 nucléotides contenant de multiples codons d'arrêt et suivi par une extrémité 3' tronquée dépourvue de la queue poly (A). Le cadre ouvert de lecture démarre au codon ATG en position 137 suivi par un second ATG 12 codons en aval (voir figure 2 partie B).
Etant donné que la banque utilisée a été amplifiée une fois, les deux clones peuvent provenir du même ADNc primaire. La séquence a été confirmée sur des phages isolés indépendemment par criblage de la banque avec un large fragment de restriction Xmnl-EcoRI du clone G821 qui contient la majorité de la séquence codante. Plusieurs clones ont été choisis et purifiés (G7, G9 et G10). Ils contiennent tous la séquence complète 3' non traduite suivie par une extrémité poly (A) de longueur variable (25 à 70 nucléotides).
La détermination de la séquence de l'extrémité 5' de ces clones a montré que même les inserts les plus longs (clones G7 et G10) ne vont pas au-delà du second ATG dans la séquence G821.
La séquence de l'extrémité 5' a été déterminée par le sequençage de l'ARN-m.
Cette extrémité 5', longue de seulement 18 nucléotides, diverge de la séquence du clone G821 par un nucléotide en amont du second ATG du cadre ouvert de lecture.
Un seul produit majeur a été obtenu par extension de l'amorce correspondant à la taille du fragment d'ARN le plus long de la réaction de sequençage.
. SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DE L'ADNc DE LA NDPK ET SEQUENCE CORRESPONDANTE D'ACIDES AMINES
La séquence de l'ADNc complet est représentée sur la figure 2, partie A.
La séquence correspondant à l'oligonucléotide utilisé pour le sequençage de l'ARN et l'extension avec une amorce est soulignée. Les sites de phosphorylation potentiels par la protéine kinase C et les tyrosine kinases sont indiqués par des étoiles et un pointillé.
Dans la partie B, est représentée la séquence de l'extrémité 5' du clone primaire G821 résultant de la fusion artéfactuelle de deux ADNc et qui est utilisée pour construire le plasmide pNDK.
Le fragment qui diverge de l'ADNc consensuel (partie A) est mentionné en italique un nucléotide en amont du codon d' initiation.
Le fragment HaelII-EcoRI de l'insert du clone G821 est utilisé pour construire le vecteur d'expression pNDK. Le site HaelII est souligné.
La séquence nucléotidique entourant cet ATG. est en accord avec la séquence consensus (ANNATGR) des codons d'initiation des eucaryotes avec un A en position-1, comme trouvé généralement pour les gènes de Dictyostelium.
Les deux autres ATG du cadre ouvert de lecture en position 256 et 298 sont en désaccord avec le consensus. Le codon venant après le codon d'initiation code pour la serine comme observé chez les levures pour au moins 50% des gènes fortement exprimés.
Le cadre ouvert de lecture code pour une protéine de 155 amino acides avec une Mr calculée de 16700 ± 10%. Cette protéine (NPDK) est complètement dépourvue de résidus cystéine.
Sa taille et sa composition en acides aminés sont analogues à celles rapportées pour les monomères de NDP kinase de levures ou de foie de rat obtenus par extraction (14).
La protéine de Dictyostelium exprimée chez E.coli est très basique (pi calculé : 9,15) et contient un fragment hydrophobe (résidus 64 à 84). . IDENTIFICATION DE L'ACTIVITE NUCLEOSIDE DIPHOSPHATE KINASE DANS DES EXTRAITS BACTERIENS
Afin de caractériser les propriétés biochimiques de la protéine NDPK, on a construit le plasmide pNDK exprimant la protéine dans E.coli.
Après incubation des extraits bactériens avec lOnM de [35S] GTPγS comme décrit dans la partie expérimentale, on observe un transfert covalent de [35S] aux protéines qui est dépendant de l'induction du promoteur lac par IPTG.
Les extraits de bactéries recombinantes montrent une incorporation thiophosphate proportionnelle au temps d'incubation jusqu'à 5 min à 15°C tandis que les extraits témoins (bactéries transformées avec le plasmide ne contenant pas d' insert) incorporent seulement des traces de [S35].
La formation d'ADP résultant du transfert de phosphates de l'ATP à la dTDP démontre la présence d'une activité NDP kinase. Cette activité est fortement augmentée dans les extraits des bactéries exprimant la NDP kinase comparés aux extraits témoins. . ANALYSE SDS-PAGE DE L'INCORPORATION DE [S35]
Pour caractériser la cible du marquage avec [35S] dans les extraits bactériens, on réalise le SDS-PAGE avec des extraits préalablement incubés avec [35S] GTPγSN comme décrit plus haut. Une seule bande marquée de Mr correspondant à la NDP kinase est détectée dans les extraits de bactéries recombinantes. Elle correspond vraisemblablement à la formation de l'intermédiaire phospho-enzyme durant la réaction de la NDP kinase, expliquant pourquoi les clones ont été isolés par marquage avec [35S]GTPγS directement sur les répliques de filtre de la banque d'expression.
L'enzyme est purifiée à homogénéité en deux étapes. La suspension bactérienne est lavée par centrifugation. Le culot est repris dans du volume
Figure imgf000031_0001
de la suspension initiale de tampon A : Tris 50 mM pH 8,5 contenant 20 mM de MgCl2 et 1 mM de EDTA et les cellules sont cassées par sonication. Les débris bactériens sont éliminés par centrifugation et le surnageant est déposé sur une colonne de DEAE - Sephacel (Pharmacia). L'éluat est recueilli et déposé sur une colonne de résine Affigel-Blue (BioRad) rincée ensuite par 2 volumes de colonne de tampon A. La colonne est éluée par un gradient continu de NaCl, de 0 à 1 M NaCl. Le pic d'activité NDP kinase correspond à une seule bande protéique selon analyse sur gel de polyacrylamide à 12% - SDS coloré au nitrate d'argent.
La composition globale en acides aminés correspond exactement à celle de la séquence d'acides aminés représentée sur la figure 2.
EXEMPLE C : PREPARATION DE 2'-ANTHRANILOYL-ADP (ANT- ADP), A PARTIR DE 2'-ANTHRANILOYL-cAMP (ANT-cAMP):
Le milieu de réaction contient : Na2pyrophosphate (pH 6,5) 10 mM, Ant-cAMP 8 mM, MgCl2, 8 mM, glucose 15 mM, ADP 0.1 mM, hexokinase (5U/ml), nucléoside diphosphate kinase (5U/ml), calmoduline 0,1 μM, adénylate cyclase (5U/ml). La disparition de Ant-cAMP et la formation de nucléoside diphosphate correspondant est suivie par chromatographie en couche mince sur cellulose microcristalline ou PEI-cellulose. Le nucléoside diphosphate formé (Ant-ADP) est ensuite purifié par des méthodes conventionnelles telles que la précipitation avec éthanol et sels de Ba2+ ou la chromatographie sur échangeurs d'ions. BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de synthèse de dérivés d'adénosine phosphate, caractérisé en ce qu'on soumet un dérivé d'AMP cyclique, ou cAMP, substitué par le ou les groupes souhaités pour le dérivé d'adénosine recherché, la position 3' étant bloquée par la cyclisation, à l'action d'une protéine à activité adenyl cyclase, et qu'on soumet les dérivés d'ATP substitués obtenus, à l'action d'une protéine à activité nucléoside diphosphate kinase (ou NDP kinase) couplée à un système consommateur de groupe phosphate, tel qu'une hexokinase, et qu'on récupère les dérivés d'ADP substitués formés.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dérivé de cAMP comprend en position 2' un groupe alcoyle, alcoxy, acyle, aryle, amino ou azido, ester d'alcoyle et/ou en position 6 un groupe amino et/ou en position 8 et/ou 6 un atome d'halogène, un groupe alcoyle, acyle, alcoxy, aryle ou une fonction azotée telle qu'un groupe azido, amino ou amino alcoyle.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les dérivés de cAMP mis en oeuvre sont obtenus par synthèse chimique à partir de cAMP.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la catalyse par la protéine à activité adenyl cyclase est réalisée avantageusement à un pH entre 6 et 8, plus particulièrement de l'ordre de 6.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la protéine à activité adenyl cyclase mise en oeuvre est comprise dans la séquence d'acides aminés donnée dans la figure 1.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la protéine à activité adenyl cyclase mise en oeuvre est un dérivé de délétion par rapport à la séquence de la figure 1, et en particulier est dépourvue d'une séquence dans la partie N-terminale qui n'intervient pas de manière fondamentale dans l'activité adenyl cyclase, plus spécialement d'une séquence de 261 acides aminés à l'extrémité N-terminale.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que pour disposer de dérivés d'adénosine phosphate substitués en position 3', on introduit le groupe de substitution souhaité sur le dérivé d'ATP obtenu à l'issue de la réaction avec la protéine à activité adenyl cyclase.
8. Procédé de synthèse de dérivés d'adénosine phosphate, caractérisé en ce qu'on fait réagir un dérivé d'ADP substitué tel qu'obtenu selon le procédé de la revendication 1, avec une protéine à activité NDP kinase capable de phosphoryler le dérivé d'ADP en conduisant à un dérivé d'ATP dans lequel le groupe phosphate apporté par la protéine à activité NDP kinase est éventuellement marqué.
9. Dérivés d'adénosine phosphate caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule:
Figure imgf000035_0001
dans laquelle
. R1 et R2, identiques ou différents l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, un radical alcoyle, alcoxy, acyle, aryle, amino, azido, ester d'alcoyle,
. R3 et R5, identiques ou différents l'un de l'autre, sont choisis dans le groupe comprenant un atome d'halogène, un groupe alcoyle, alcoxy, acyle, une fonction azotée telle qu'azido, amino ou aminoalcoyle, . R4 est un groupe amino,
. R6 est un groupe di- ou triphosphate et comporte éventuellement un groupe marqueur.
10. En tant que produits nouveaux les dérivés de cAMP mis en oeuvre dans le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, en particulier les dérivés de cAMP substitués en position 2' ou 3' par un groupe azido.
11. Protéine à activité adenyl cyclase caractérisée en ce qu'elle répond à l'enchaînement d'acides aminés de la figure 1, mais est dépourvue d'une séquence dans la partie N-terminale n'intervenant pas de manière fondamentale dans l'activité adenyl cyclase, en particulier des 261 acides aminés à l'extrémité N-terminale.
12. Séquence de nucléotides, caractérisée en ce qu'elle porte l'information pour la synthèse de la protéine selon la revendication 11.
13. Protéine à activité NDP kinase telle qu'obtenue par clonage du gène codant pour la NDP kinase de Dictyostelium discoideum et purification de la protéine synthétisée.
14. Protéine selon la revendication 13, caractérisée par l'enchaînement de 155 acides aminés représenté sur la figure 2.
15. Séquence de nucléotides constituée par au moins une partie d'une séquence codant pour une protéine à activité NDP kinase telle que synthétisée par D.discoideum.
16. Séquence de nucléotides capable de s'hybrider avec des gènes codant pour une protéine à activité NDP kinase.
17. Séquence de nucléotides, caractérisée en ce qu'elle est capable de s'hybrider avec une sonde formée à partir de la séquence présentant l'enchaînement de nucléotides représenté sur la figure 2 ou l'enchaînement des nucléotides complémentaires de cette séquence.
18. Application des dérivés d'adénosine phosphate selon la revendication 9 comme réactifs de laboratoire.
19. Application de la protéine à activité adenyl cyclase selon la revendication 11, pour la synthèse de cAMP ou d'analogues de cAMP en utilisant l'ATP comme produit de départ, pour la séparation des dérivés de l'ATP substitués, de dérivés substitués en 3', pour le dosage de cAMP, du pyrophosphate ou de la calmoduline dans les produits de synthèse ou milieux biologiques.
20. Application des séquences de nucléotides codant pour une protéine à activité NDP kinase selon l'une des revendications 15 à 17, pour l'élaboration de sondes d'ARN ou d'ADN pour la détection de séquences similaires dans d'autres organismes ou tissus.
21. Application de la protéine tronquée à activité adenyl cyclase selon la revendication 11, pour l'élaboration d'immunsérums spécifiques polyclonaux et d'anticorps monoclonaux, et de compositions immunogènes.
22. Application de la protéine à activité NDP kinase selon la revendication 14 à l'élaboration d'immunsérums spécifiques polyclonaux, d'anticorps monoclonaux et de compositions immunogènes.
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