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WO1997039034A1 - Moyens pour la detection de bacteries de l'espece taylorella equigenitalis et applications biologiques - Google Patents

Moyens pour la detection de bacteries de l'espece taylorella equigenitalis et applications biologiques Download PDF

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Publication number
WO1997039034A1
WO1997039034A1 PCT/FR1997/000649 FR9700649W WO9739034A1 WO 1997039034 A1 WO1997039034 A1 WO 1997039034A1 FR 9700649 W FR9700649 W FR 9700649W WO 9739034 A1 WO9739034 A1 WO 9739034A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
monoclonal antibodies
equigenitalis
fragments
species
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1997/000649
Other languages
English (en)
Inventor
Frédéric Klein
Dragos Gradinaru
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Conseil General de l'Orne
Original Assignee
Conseil General de l'Orne
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Conseil General de l'Orne filed Critical Conseil General de l'Orne
Priority to US09/155,982 priority Critical patent/US6858209B2/en
Priority to AU26416/97A priority patent/AU708879B2/en
Publication of WO1997039034A1 publication Critical patent/WO1997039034A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4233—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-bacterial Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1242—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the subject of the invention is means for the detection of bacteria of the genus Taylorella and their biological applications.
  • ECM Since the outbreak of this disease in 1977 in Newmarket (Great Britain), CEM has spread among the equine population in the world (Europe, USA, Japan). ECM was initially characterized by the appearance of purulent vaginal discharge caused by acute endometritis. The epidemiology and clinical manifestations of the disease have now changed. There are only a few rare foci with an acute form of CEM; these are then contaminations of several mares belonging to the same harem. The clinical forms of metritis have, indeed, become rare and T. equigenitalis is mainly found in asymptomatic carriers or in the pre-clinical stage. The disease is transmitted by stallions which show no clinical symptoms. The ECM constitutes an obstacle to the international exchange of equines and its detection is recommended by the OIE (Office International des Epizooties, list B). Indirect means of screening such as serology have been abandoned by many countries such as the USA, Great Britain and France.
  • OIE Office International des Epizooties, list B
  • Direct means of screening are practiced: screening by bacteriological culture in many countries, screening by indirect immunofluorescence. In France, prophylactic measures include both bacteriological culture and
  • IIF indirect immunofluorescence
  • T. equigenitalis is a very fragile and very slow growing bacterium (the observation time of the seed boxes is at least 6 days). It is, moreover, liable to be inhibited by other bacteria of the flora examined.
  • equigenitalis are themselves either too succinct and subject to variation (evidence of absence activity for the three classic enzymatic activities that T. equigenitalis presents), is too cumbersome to manage within the required time. Screening using only the bacteriological technique has therefore become a hazardous method of diagnosis. An undetermined percentage of healthy carriers is therefore considered to be uninfected each season.
  • a second screening test for infection with T. equigenitalis was selected in France. This test is based on the identification of the bacterium by indirect immunofluorescence using antiserum produced on rabbits and anti-rabbit fluorescent antibodies. This screening test has the advantage of delivering its results much faster (24 to 48 hours) than a test by bacteriological culture.
  • the inventors have sought to remedy these difficulties in detecting infection with T. equigenitalis, by developing new means making it possible to identify a bacterium of the species T. equigenitalis without the risk of either false positives or false negatives.
  • the invention therefore aims to provide means for specific, highly reliable detection of T. equigenitalis, based on recognition of the defined antigen-antibody type. It also relates to the use of these means for the diagnosis, treatment and prophylaxis of diseases caused by T. equigenitalis.
  • the means of the invention are monoclonal antibodies characterized in that they recognize an epi tope of a bacterium of the species T. equigenitalis.
  • these antibodies do not exhibit cross-reactions with one or more epi topes of a Taylorella bacteria of a different species or of a bacteria of a different genus. They therefore make it possible to detect T. equigenitalis with certainty and, according to an aspect of great interest, using a single test.
  • the monoclonal antibodies of the invention are also as obtained from hybrids, by fusion of non-secreting murine myeloma cells with spleen cells from immunized mice using of a strain of the inactive species T. equigenitalis or of extract (s) of such a strain, cloning and selection according to the property of their culture supernatant to recognize one or more epi topes of a bacterium of the species T. equigenitalis, and recovery of the antibodies sought, followed where appropriate by their purification.
  • the invention also relates to the fragments of the mAbs defined above, more particularly their fragments Fv, Fab, F (ab ') 2.
  • the mAbs of the invention and, where appropriate, their fragments, are further characterized in that they are capable of recognizing proteins of T. equigenitalis from the group comprising proteins such as the proteins of 150, 120, 52.7 or 22 (LPS) kDa.
  • the means of the invention are immunogenic proteins characterized in that they are capable of interacting with said mAbs or their fragments. These proteins are obtained, thanks to the so-called mAbs or their fragments, from T. equigenitalis, or by synthesis.
  • the means of the invention are anti -antibodies (hereinafter referred to as anti -AcM for short) and the fragments of these anti -anti co rps, these anti -AcM and their fragments being characterized in what they are capable of interacting with mAbs or their fragments defined above.
  • the invention therefore provides a method for obtaining and selecting MAb defined above, characterized in that it comprises 1: cell fusion of non-secreting murine myeloma with spleen cells from mice immunized using '' a strain of the species T. equigenitalis or extract (s) of such a strain, screening using a revelation technique, such as, in particular, indirect immunofluorescence, hybridomas whose culture supernatants react positively with a bacterium of the species T. equigenitalis or a fragment thereof this,
  • the invention also relates to the application of the above technique for the production of anti-mAb antibodies.
  • the invention relates to strains of hybridomas as obtained according to the methods defined above.
  • the mAb fragments and the anti-mAb can be easily obtained using conventional enzymatic techniques.
  • the contacting step is carried out under conditions in particular of duration, temperature, buffer, allowing the establishment of an antigen-antibody type reaction.
  • markers are used, for example fluorescent, enzymatic, radioactive or luminescent markers. It will be noted that the judicious choice of a particular mAb, or of a fragment of this mAb, makes it possible to directly identify a given epi tope of T. equigenitalis in a sample or a culture to be analyzed. By using an immunogenic protein or an anti-mAb antibody or a fragment of the latter, a prior contact of the sample or of the culture with the bacteria will be demonstrated.
  • the absence of cross-reactions of the mAbs of the invention and their fragments with epithets of bacteria of the genus Taylorella other than T. equigenitalis, and bacteria of a different genus, is advantageously taken advantage of for the diagnosis of pathologies linked to T. equigenitalis.
  • the invention therefore also relates to the use of said mAbs and their fragments for the diagnosis of an infection with T. equigenitalis, more particularly contagious equine metritis, characterized in that it comprises: - bringing into contact one or more mAbs of the invention, or their fragments, with a biological sample, and
  • the reagents in particular the markers or buffers, allowing the revelation of the targeted immunological reaction, and, optionally, reagents for blocking non-antigen-antibody reactions such as mouse serum,
  • the mAbs and their fragments defined above can be used in therapy to combat infection by T. equigenitalis, and more particularly against contagious equine metritis.
  • the invention thus also relates to pharmaceutical compositions containing one or more mAbs, or their fragments, defined above, as drug vectors or as passive immunotherapy agents, alone or in combination with pharmaceutically inert vehicles. It also relates to their use for the development of biosensors.
  • the invention relates to the use of immunogenic proteins and anti-mAbs or their fragments for the preparation of vaccine compositions preventive of infection by T. equigenitalis.
  • the vaccine compositions of the invention are characterized in that they contain at least one immunogenic protein or an anti-mAb or their fragments, as defined above, in an amount sufficient to elicit an immune response, in association with excipients physiologically acceptable.
  • FIGS. 1 to 3 respectively represent:
  • Example 1 Obtaining and selecting hybridomas capable of producing anti-T monoclonal antibodies. equigenitalis strains of T. equigenitalis used for immunization
  • the two reference strains RI-16 and R2-19 therefore exhibit the properties generally observed for all the strains of T. equigenitalis studied in the prior art and are therefore used for the immunization of mice.
  • the reference strains Rl-16 and R2-19 are washed twice in 0.1 M PBS buffer, pH 7.4, and inactivated by heating at 56 ° C for 75 min. The cells are then diluted in PBS, until bacterial suspensions of optical density 0.77 to 380 nm. They are then divided into aliquots and stored at -80 ° C until use.
  • mice are injected 0.5 ml of Rl-16 and R2-19 bacterial suspension emulsified with the complete Freund's adjuvant (2 mice per strain) into BALB C adult mice. A booster injection is given on the 14th day with the same preparation. On the 21st day, the mice are immunized with 0.2 ml of suspension without adjuvant by the intravenous route and the spleen cells are collected 2 days later.
  • Hybridomas are produced according to the standard procedure described by Kohler and Milstein (see reference below).
  • Hybridoma growth is observed in 820 of the 1020 wells used (81.37%). IIF tests are carried out on 60 of these 820 wells to detect hybridomas producing the desired monoclonal antibodies. screening of hybridomas and monoclonal antibodies produced
  • Unimmunized mouse serum is used as a negative control.
  • the FITC mouse antiserum conjugate is incubated with each bacterial strain to serve as a conjugate control.
  • the hybridomas of these wells are cloned by the limit dilution method in order to obtain a single cell per well in a 96-well tissue culture plate using the HT-DMEM medium and feeder cells.
  • Single clone wells are screened with IIF and positive cells are frozen in liquid nitrogen.
  • tissue culture supernatants of hybridomas are buffered by the addition of Tris IM, pH 8.0 (vol. 1/20) and sodium azide (0.02%). Aliquots are made and stored at -20 ° C.
  • Example 2 Characterization of the anti-T monoclonal antibodies. equigenitalis
  • the supernatants of the 14 hybridoma clones obtained according to Example 1 are tested by IIF according to the capacity of their supernatants to recognize other bacterial strains than the two reference strains R-16 and R-19 used for immunization, namely: the 7 wild strains of T.
  • Staphyloccoccus aureus Pseudomonas fluorescens and Klebsiella pneumoniae. These bacteria are grown on a Columbia-based blood-agar medium.
  • the 14 monoclonal antibodies tested recognize the seven wild strains of T. equigenitalis. 3 of them give a weaker positive response, namely 7 B7.1; 7 B7.10 and 10C9.6. None of the 14 monoclonal antibodies tested recognizes one of the 8 bacterial strains which do not belong to the species T. equigenitalis.
  • the EN extracts of the T. equigenitalis strains were dissolved in a sample solvent (Tris.HCl 0.1 M pH 6.8; glycerol 10%; SDS 2%; ⁇ -mercaptoethanol 2 mM and bromophenol blue 0.01% ) in order to obtain a protein concentration of 1 mg / ml, then were brought to a boil at 100 ° C for 5 min (extract under denaturing conditions of T. equigenitalis, ED).
  • a sample solvent Tris.HCl 0.1 M pH 6.8; glycerol 10%; SDS 2%; ⁇ -mercaptoethanol 2 mM and bromophenol blue 0.01%
  • LPS Lipopolysaccharide extract
  • the coloration of the total proteins by colloidal gold was used.
  • the membranes were immersed for 30 min in a blocking solution (3% gelatin in 20 mM Tris and 0.5 M NaCl) and rinsed with gentle stirring in a washing solution (20 mM Tris; NaCl, 0.5 M; Tween R 20 0.05%).
  • the membranes were then brought into contact with monoclonal antibody solutions diluted from 1/100 to 1/1000 in the antibody buffer (Tris 20 mM; 0.5 M NaCl, Tween R 20 0.05% gelatin 1% ) for 180 min at 25 ° C.
  • the binding of monoclonal antibodies to the peptide bands was visualized using alkaline phosphatases (AP) conjugated with IgG immunoglobulins. goat (heavy and light chains) anti-mice (BLoRad, dilution to 1/2000) and using a substrate solution for PA (EoRad).
  • AP alkaline phosphatases
  • FIG. 2 illustrates an immunoblot between the bacterial proteins and the mAbs according to the invention on the one hand and the positive serum of mice on the other hand.
  • the positive serum collected from immunized mice reacts with 5 proteins of the strain R-19: 120 kDA; 52.7 kDA; 33.4kDA; 17.5 kDA and 22 (LPS) kDA.
  • Immobilon R PVDF (Sigma) membranes were pre-wetted with 100% methanol solution for
  • the binding of the monoclonal antibodies to the dot blot membranes was revealed using PA conjugated to goat IgG immunoglobulins (heavy and light chains) anti-mice and using a substrate solution for PA (BLoRad) .
  • the 14 monoclonal antibodies are compared in dot-blot with the extracts EN and ED of the strain R-19.
  • These 8 monoclonal antibodies can therefore constitute reagents suitable for the detection of antigens of T. equigenitalis and, more particularly, for the diagnosis of CEM.
  • Such antibodies can be used to characterize bacteria of the Taylorella genus in any biological preparation using denaturing conditions.
  • the immunotype kit from Sigma which consists of strips of ni trocellulose pre ⁇ coated with anti-isotype antibodies of mouse immunoglobulins. After additional incubations, the identity The results obtained appear in column 9 of Table III.
  • the 14 monoclonal antibodies produced are part of IgM for 5 of them, IgG2b for 4 of them, IgG3 for 3 of them and IgGl for 2 of them.
  • Both antibody and indirect immunofluorescence screening techniques namely the "polyclonal antibody” technique and the technique which is the subject of the present invention, have both screened for T. equigenitalis isolated by bacteriological culture.
  • the specificity of the monoclonal antibodies according to the invention, used in the context of indirect immunofluorescence, is better than that of polyclonal antibodies (94% vs 60%).
  • Example 5 Elimination of non "antigen-antibody” reactions.
  • Nonspecific reactions can sometimes be obtained between antibodies and Staphylococcus protein intermediary (protein A for S. aureus and protein G for Streptococci of groups C and G).
  • the reactions are not of the antigen-antibody type.
  • FITC were separated from the unlabeled molecules by passage through a Sephadex G25 column (Pharmacia).
  • the slides are incubated for 1 hour at 37 ° C. with the FITC-labeled monoclonal antibodies according to the invention described above.
  • the slides After washing and final rinsing, the slides are mounted in glycerin, buffered and examined under a fluorescence microscope. These three blocking techniques give fluorescence for the T. equigenitalis slides and do not give fluorescence for the non-specific binding slides (S. aureus and Streptococcus).
  • the mAbs are precipitated by adding saturated ammonium sulfate to the final concentration of 50%. After centrifugation, the precipitate is resuspended in PBS, then filtered through Sephadex® G75 gel (Pharmacia) and finally purified by affinity chromatography on a column of protein A- Sepharose® CL-4B
  • mice BUJEV'C mice are immunized by 1 SC injection of a mixture of equal parts of 50 ⁇ g of polymerized mAb and complete Freund's adjuvant. 2 subsequent injections are given 2 weeks apart, one with incomplete Freund's adjuvant, and the other without any adjuvant and peritoneally.
  • microplates (Maxisorb, Nunc) are incubated for 16 h at 4 ° C with 100 ⁇ l / well of a suspension of 0.2 ⁇ g / ml of Fab in carbonate buffer pH8.
  • the microplates are washed 3 times with P BS-Tween 20® (0.05%), pH 7.2, then the non-specific sites are blocked by a solution of BSA 2% in P BS-Tween 20® for 30 min at 37 ° C.
  • the culture supernatants of the hybridomas are incubated 1 H at 37 ° C.
  • the reaction is revealed by an anti-mouse conjugate labeled with peroxidase and its substrate.
  • the AcM2 antibodies of the selected hybridomas, then their corresponding Fab fragments are purified according to the methods described below.
  • the Fab fragments are coupled to the limpet hemocyanin keyhole (KLH, Sigma) by incubation for 16 h at 4 ° C. in a 0.05% glutaraldehyde (Sigma) solution, in a ratio of 1/1.
  • the reaction is stopped with a 0.02M glycine solution and the conjugates are dialyzed against PBS.
  • the protein is dosed at 25-100 ⁇ g per dose of vaccine and the vaccine is supplemented with alumina hydroxide as an adjuvant.

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Abstract

L'invention se rapporte à des anticorps monoclonaux et à leurs applications biologiques. Ces anticorps monoclonaux sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope d'une bactérie de l'espèce T. equigenitalis.

Description

MOYENS POUR LA DETECTION DE BACTERIES DE L'ESPECE TAYLORELLA EQUIGENITALIS ET APPLICATIONS BIOLOGIQUES
L'invention a pour objet des moyens pour la détection de bactéries du genre Taylorella et leurs applications biologiques.
Elle vise en particulier la détection de T. equigenitalis et le traitement ou la prévention d'infections provoquées par des bactéries de cette espèce. La première souche de T. equigenitalis a été isolée par Crowhurst, 1977, Vet. Fee. 100, 476 et caractérisée par Taylor et al. , 1978, Equine Vet. J. 10, 136-134. Cette bactérie est l'agent d'une maladie vénérienne des équidés dénommée métrite contagieuse équine (désignée ci- après par MCE) .
Depuis le déclenchement de cette maladie en 1977 à Newmarket (Grande- Bretagne) , la MCE s'est répandue parmi la population équine dans le monde (Europe, USA, Japon). La MCE a été initialement caractérisée par l' apparition d' écoulements vaginaux purulents causés par une endométrite aiguë. L' épidémiologie et les manifestations cliniques de la maladie ont maintenant changé. Il ne subsiste que quelques rares foyers présentant une forme aiguë de la MCE ; il s'agit alors de contaminations de plusieurs juments faisant partie d'un même harem. Les formes cliniques de métrite sont, en effet, devenues rares et T. equigenitalis est principalement trouvée chez des porteurs asymptomatiques ou au stade pré-clinique. La maladie est transmise par les étalons qui ne manifestent aucun symptôme clinique. La MCE constitue une entrave à l' échange international des équidés et son dépistage est préconisé par l' OIE (Office International des Epizooties, liste B) . Les moyens indirects de dépistage tels que la sérologie ont été abandonnés par de nombreux pays comme les USA, la Grande-Bretagne et la France.
Des moyens directs de dépistage sont pratiqués : dépistage par culture bactériologique dans de nombreux pays, dépistage par immunofluorescence indirecte. En France, les mesures prophylactiques comprennent à la fois la culture bactériologique et
1' immunofluorescence indirecte (IIF).
Un dépistage systématique des étalons est devenu obligatoire préalablement à chaque saison de monte. Pour des raisons à la fois économiques et d'organisation, ce dépistage systématique ne peut se faire qu'à partir d'un ou de deux prélèvement (s ) par animal et par saison. La fiabilité du dépistage en est donc d' autant plus cruciale. Le test de dépistage d'une infection par T. equigenitalis actuellement pratiqué en France repose principalement sur l'isolement de la bactérie par culture sur milieux nutritifs et/ou sélectifs et sur l'identification de cet agent selon des critères morphologiques et biochimiques. Or, T. equigenitalis est une bactérie très fragile et à très lente croissance (le délai d'observation des boîtes d' ensemencement est d'au moins 6 jours). Elle est, de plus, susceptible d' être inhibée par d' autres bactéries de la flore examinée. Les critères d'identification des différentes souches de T. equigenitalis sont eux-mêmes soit trop succincts et sujets à variations (mise en évidence d' absence d' activité pour les trois activités enzymatiques classiques que T. equigenitalis présente), soit trop lourds à gérer dans les délais requis. Le dépistage par la seule technique de bactériologie est donc devenu une méthode hasardeuse de diagnostic. Un pourcentage non déterminé de porteurs sains est ainsi chaque saison considéré comme non infecté.
Un second test de dépistage d'une infection par T. equigenitalis a été retenu en France. Ce test est basé sur l'identification de la bactérie par immunofluorescence indirecte à l' aide d' antisérum fabriqué sur lapin et d' anticorps fluorescents anti¬ lapin. Ce test de dépistage présente l' avantage de livrer ses résultats beaucoup plus rapidement (24 à 48 heures) qu'un test par culture bactériologique.
L'utilisation de cette technique peut toutefois conduire à des erreurs par excès (faux positifs), les antisera utilisés donnant lieu, dans de nombreux cas, à des réactions avec des espèces autres que T. equigenitalis.
La portée de ces résultats est ainsi très restreinte: si le test d' immunofluorescence est négatif, le laboratoire agréé peut communiquer une conclusion négative, mais, si le résultat est positif, ce résultat doit être confirmé ou infirmé par la bactériologie.
Les inventeurs ont recherché à remédier à ces difficultés de dépistage d'une infection par T. equigenitalis, en élaborant de nouveaux moyens permettant d'identifier une bactérie de l'espèce T. equigenitalis sans risque ni de faux positifs, ni de faux négatifs. La L'invention vise donc à fournir des moyens pour une détection spécifique, de grande fiabilité, de T. equigenitalis, basés sur les reconnaissances de type antigène-anticorps défini. Elle vise également l'utilisation de ces moyens pour le diagnostic, le traitement et la prophylaxie des maladies causées par T. equigenitalis.
Selon un premier aspect, les moyens de l'invention sont des anticorps monoclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épi tope d'une bactérie de l'espèce T. equigenitalis.
De manière avantageuse, ces anticorps ne présentent pas de réactions croisées avec un ou des épi topes d'une bactérie Taylorella d'une espèce différente ou d'une bactérie d'un genre différent. Ils permettent donc de détecter T. equigenitalis avec sûreté et, selon un aspect de grand intérêt, à l'aide d'un seul test.
Les anticorps monoclonaux de l'invention (désignés ci -après par AcM en abrégé) sont également tels qu'obtenus à partir d'hybrides, par fusion de cellules de myélome murin non sécrétrices avec des cellules spléniques issues de souris immunisées à l'aide d'une souche de l' espèce T. equigenitalis inactivée ou d'extrait (s) d'une telle souche, clonage et sélection selon la propriété de leur surnageant de culture à reconnaître un ou des épi tope (s) d'une bactérie de 1' espèce T. equigenitalis, et récupération des anticorps recherchés, suivie le cas échéant de leur purification.
L'invention vise également les fragments des AcM définis ci -dessus, plus particulièrement leurs fragments Fv, Fab, F(ab' )2. Les AcM de l'invention et, le cas échéant, leurs fragments, sont encore caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître des protéines de T. equigenitalis du groupe comprenant des protéines telles que les protéines de 150, 120, 52,7 ou 22 (LPS) kDa.
Selon un deuxième aspect, les moyens de l'invention sont des protéines immunogènes caractérisées en ce qu'elles sont capables d'interagir avec lesdits AcM ou leurs fragments. Ces protéines sont obtenues, grâce aux dits AcM ou à leurs fragments, à partir de T. equigenitalis, ou par voie de synthèse.
Selon un troisième aspect, les moyens de l'invention sont des anti -anti corps (désignés ci -après par anti -AcM en abrégé) et les fragments de ces anti -anti co rps , ces anti -AcM et leurs fragments étant caractérisés en ce qu'ils sont capables d'interagir avec les AcM ou leurs fragments définis plus haut.
L'invention vise également des procédés d'obtention des moyens définis ci -dessus.
Pour produire les AcM de l'invention, ou les anti- AcM, on a avantageusement recours à la technique d'obtention d' hyb ri dômes telle que décrite par Kôhler et Milstein dans Nature 1975, 256, 495-497. L'invention vise donc un procédé d'obtention et de sélection des AcM définis ci-dessus, caractérisé en ce qu1 il comprend : la fusion de cellules de myélome murin non sécrétrices avec des cellules spléniques issues de souris immunisées à l'aide d'une souche de l'espèce T. equigenitalis ou d'extrait (s) d'une telle souche, le criblage à l'aide d'une technique de révélation, telle que, notamment, l' immunofluorescence indirecte, des hybridomes dont les surnageants de culture présentent une réaction positive avec une bactérie de l'espèce T. equigenitalis ou un fragment de celle-ci,
- le clonage de tels hybridomes, au regard de leur réactivité par rapport à T. equigenitalis, et
- la récupération des AcM recherchés, suivie le cas échéant de leur purification. L'invention vise également l'application de la technique ci -dessus pour la production d' anticorps anti- AcM.
On utilise dans ce cas des cellules spléniques de souris immunisées au préalable à l' aide des AcM déjà définis. Les souches clonées peuvent être conservées dans de l' azote liquide et leurs surnageants de culture à -20°C. Ces souches qui sont caractérisées par le fait qu'elles sont capables de produire des AcM ou respectivement des anti -AcM, tels que définis ci-dessus, entrent également dans le cadre de l'invention. De manière générale, l'invention vise les souches d' hybridomes telles qu' obtenues selon les procédés définis plus haut.
Les fragments des AcM et les anti -AcM peuvent être aisément obtenus à l' aide des techniques enzyma tiques conventionnelles .
Avec les trois aspects définis ci -dessus, à savoir les AcM ou leurs fragments, les protéines immunogènes, et les anti -AcM ou leurs fragments, l'invention fournit les moyens pour établir, soit directement, soit indirectement, une contamination éventuelle d'un échantillon ou d'une culture avec une bactérie de 1' espèce de T. equigenitalis.
Dans le cadre d'une telle détermination, l'invention vise une méthode d'identification d'une bactérie de l'espèce T. equigenitalis ou d'un ou plusieurs épi topes d'une telle bactérie dans un échantillon ou dans une culture, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact de l' échantillon ou de la culture à analyser, susceptible de renfermer T. equigenitalis, avec i. une quantité efficace d'au moins un AcM ou un fragment d' AcM tel que défini ci -dessus et, optionnellement, blocage des réactions non antigène- anticorps, par exemple par saturation de l'échantillon ou de la culture à analyser à l' aide de sérum, tel que sérum de souris, dépourvu d'anticorps anti -T. equigenitalis, ii. ou en variante, pour mettre en évidence la présence d'anticorps dirigés contre T. equigenitalis, avec une quantité efficace d'une protéine immunogène ou d'anticorps anti -AcM, ou de fragments de ce dernier, tels que définis ci -des s us, dans des conditions permettant une réaction du type anti gène-anti co rps , et la révélation du produit de réaction de type antigène-anticorps éventuellement formé.
L'étape de mise en contact est réalisée dans des conditions notamment de durée, température, tampon, permettant l'établissement d'une réaction de type antigène-anticorps. Pour la révélation, on utilise des marqueurs, par exemple des marqueurs fluorescents, enzymatiques , radioactifs ou luminescents. On remarquera que le choix judicieux d'un AcM particulier, ou d'un fragment de cet AcM, permet d'identifier directement un épi tope donné de T. equigenitalis dans un échantillon ou une culture à analyser. En utilisant une protéine immunogène ou un anticorps anti -AcM ou un fragment de ce dernier, on mettra en évidence un contact préalable de l' échantillon ou de la culture avec la bactérie.
L' absence de réactions croisées des AcM de l'invention et de leurs fragments avec des épi topes de bactéries du genre Taylorella autres que T. equigenitalis, et de bactéries d'un genre différent, est avantageusement mise à profit pour le diagnostic de pathologies liées à T. equigenitalis. L'invention vise donc également l'utilisation desdits AcM et de leurs fragments pour le diagnostic d'une infection par T. equigenitalis, plus particulièrement de la métrite équine contagieuse, caractérisée en ce qu' elle comprend : - la mise en contact d'un ou plusieurs AcM de l'invention, ou de leurs fragments, avec un prélèvement biologique, et
- la révélation de la réaction du type antigène- anticorps produite dans le cas de la présence de T. equigenitalis dans le prélèvement,
- et, optionnellement, le blocage des réactions non antigène- anticorps, par exemple, par saturation de l' échantillon prélevé à l'aide d'un sérum, tel qu'un sérum de souris, dépourvu d'anticorps anti-T. equigenitalis . Les étapes de mise en contact et de révélation sont avantageusement mises en oeuvre comme indiqué pour la méthode précédente. L'invention fournit également des kits pour la mise en oeuvre des méthodes d'identification et des méthodes de diagnostic décrites ci -dessus.
Ces kits sont caractérisés en ce qu'ils renferment
- un ou plusieurs AcM ou leurs fragments ou au moins une protéine immunogène, ou un ou plusieurs anti-AcM ou leurs fragments,
- les réactifs, notamment les marqueurs ou tampons, permettant la révélation de la réaction immunologique visée, et, optionnellement, des réactifs de blocage des réactions non antigène-anticorps tels que sérum de souris ,
- ainsi qu'une notice d'utilisation. Selon une autre disposition avantageuse de l'invention, les AcM et leurs fragments définis ci-dessus sont utilisables en thérapeutique pour lutter contre une infection par T. equigenitalis, et plus particulièrement contre la métrite équine contagieuse. L'invention vise ainsi également des compositions pharmaceutiques renfermant un ou plusieurs AcM, ou leurs fragments, définis ci-dessus, comme vecteurs de médicaments ou comme agents d'immunothérapie passive, seuls ou en association avec des véhicules pharmaceutiquement inertes. Elle vise également leur utilisation pour l'élaboration de biocapteurs.
Selon encore une autre disposition, l'invention vise l'utilisation des protéines immunogènes et des anti -AcM ou leurs fragments pour l' élaboration de compositions vaccinales préventives d' une infection par T. equigenitalis. Les compositions vaccinales de l'invention sont caractérisées en ce qu' elles renferment au moins une protéine immunogène ou un anti -AcM ou leurs fragments, tels que définis ci -dessus, en quantité suffisante pour susciter une réponse immunitaire, en association avec des excipients physiologiquement acceptables.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 3, qui représentent respectivement :
- la figure 1 représente une photo d'un test IIF (immunofluorescence indirecte) sur T. equigenitalis en présence d' AcM selon l'invention,
- la figure 2, une photo d'un immunoblot après réaction de protéines de T. equigenitalis avec des AcM de l'invention et du sérum de souris immunisée (sérum positif) ,
- la figure 3, une photo d'un dot blot réalisé sur les protéines non dénaturées d' une souche de T. equigenitalis de référence et mises à incuber avec les AcM selon l'invention, un sérum positif de souris (SP) ou un sérum négatif de souris ( SN) (souris non immunisée).
Exemple 1 : Obtention et sélection d' hybridomes capables de produire des anticorps monoclonaux anti-T. equigenitalis souches de T. equigenitalis utilisées pour 1 'immunisation
On rapporte les résultats obtenus avec les neuf souches suivantes : - deux souches de références (Rl-16 et R2-19) , provenant du Centre National d'Etudes Vétérinaires et Alimentaires - Laboratoire Central de Recherches Vétérinaires CNEVA-LCRV, Maisons -Al fort, France,
- sept souches dites souches sauvages isolées dans quatre régions différentes du
Nord-Ouest de la France (Indre et Loire, Calvados, Côtes d'Armor et Orne).
Figure imgf000013_0001
Ces souches sont identifiées dans le tableau I ci- après
TAELEAU I
Désignation de Sources Résistance à la la souche streptomycine
Rl-16/16 CNEVA S R2-19/19 CNEVA R
1/ 129S LVD37 R
2/ 1 LVD14 R
3/ 12.397 LDA22 R
4/ 26.658 LDA22 R 5/ 7001-01 LDA22 R
6/ 250 LVD61 R
7/ 715 LVD61 R
S = sensible R = résistante
Toutes ces souches sont cultivées sur des géloses d' agar chocolat avec ou sans addition d' actidione et de streptomycine. Elles sont incubées sous atmosphère humide à 7 % de C02. Les analyses de réaction enzymatique et de fermentation de sucre sont effectuées à l' aide du système API-NH (ELoMérieux, Marcy-1* Etoile, France).
En outre, ces souches sont testées pour leur activité catalase, cytochrome-oxydase et par le test d'agglutination du sérum (SAT), en utilisant un antisérum polyclonal de lapin.
La plupart d' entre elles présentent - une forme cocobacillai re à Gram négatif,
- une activité catalase et cytochrome oxydas e, et elles répondent positivement au test d'agglutination SAT. On constate qu' elles présentent toutes une activité phosphatase alcaline et gamma glutamyl transférase positives (excepté la souche de terrain 5 qui présente une activité gamma glutamyl transférase négative), - des activités pénicillinase, ornithine- décarboxylase, uréase, lipase, bêtagalactosidase et proline-amylase négatives. On constate également qu'elles ne métabolisent pas les sucres (glucose, fructose, maltose, saccharose).
En outre, elles présentent des profils polypeptidiques et lipopolysaccharidiques très similai res.
Les deux souches de référence RI- 16 et R2-19 présentent donc les propriétés généralement observées pour l' ensemble des souches de T. equigenitalis étudiées dans l' art antérieur et sont donc utilisées pour l'immunisation de souris.
- immunisation de souris
Les souches de référence Rl-16 et R2-19 sont lavées deux fois dans du tampon PBS 0,1 M, pH 7, 4 et inactivées par chauffage à 56°C pendant 75 min. Les cellules sont alors diluées dans le PBS, jusqu'à l'obtention de suspensions bactériennes de densité optique 0,77 à 380 nm. Elles sont ensuite réparties en portions aliquotes et stockées à -80°C jusqu'à utilisation.
On injecte par voie intra-péri tonéale, à des souris adultes BALB C 0,5 ml de suspension bactérienne Rl-16 et R2-19 émulsifiees avec l'adjuvant complet de Freund (2 souris par souche). Une injection de rappel est effectuée au 14ème jour avec la même préparation. Au 21ème jour, les souris sont immunisées avec 0,2 ml de suspension sans adjuvant par voie intr a- veineuse et les cellules spléniques sont recueillies 2 jours plus tard.
- production d' hybridomes
Les hybridomes sont produits selon la procédure standard décrite par Kohler et Milstein (voir référence ci -des s us ) .
Des cellules de myélomes de souris SP2-0-Agl4 et des cellules spléniques immunes sont fusionnées dans un rapport 1/5 en utilisant du PEG 1500 (Sigma, l' Isle d'Abeau, France) et maintenues dans des plaques de cultures cellulaires à 96 puits contenant des macrophages de souris ou des cellules nourricières de rate ou un supplément OPI (Sigma) dans un milieu sélectif HAT-DMEM.
Une croissance d' hybridome est observée dans 820 des 1020 puits utilisés (81,37 %) . On réalise les tests IIF sur 60 de ces 820 puits pour détecter les hybridomes producteurs des anticorps monoclonaux recherchés. criblage des hybridomes et des anticorps monoclonaux produits
Les hybridomes sont testés par immunofluorescence indirecte (IIF) pour la capacité de leurs surnageants à reconnaître les deux souches de référence de T. equigenitalis. On utilise la procédure standard décrite par Vaissaire et al. (1992), Bail. Acad. Vet. Fr. 65,
161-170. Après deux lavages dans PBS 0,1 M, pH 7,4, les souches bactériennes sont remises en suspension dans le tampon PBS contenant, de plus, 1 % de formaldéhyde afin d'obtenir une suspension ayant une turbidité de 1 dans l' échelle de Mac Farland. On applique 10 μl de cette suspension sur chaque spot de lamelles fluorescentes.
Après séchage 15 min à 37°C, les lamelles sont fixées dans de l' acétone pur pendant 15 min à température ambiante. Après séchage, les lamelles sont mises à incuber avec 40 μl de surnageants d' hybridomes , pendant 30 min à
37 °C.
Les lamelles sont ensuite lavées dans un bain de P BS sous agitation pendant 15 min. Après rinçage dans de l' eau distillée et séchage, les lamelles sont incubées 30 min à 37°C avec 40 μl d'une solution d' isothiocyanate de fluorés céine conjugué à la fraction F (ab) 2 de lapin anti -souris (Eurobio Les Ulis , France), dilué à 1/40 dans
PBS contenant du bleu Evans (1/10000). Les lamelles sont enfin lavées dans du PBS, rincées dans de l'eau distillée, séchées comme indiqué ci-dessus, montées dans du PBS renfermant 1 % de glycérine et examinées à l'aide d'un microscope à fluorescence.
On utilise un sérum de souris non immunisée comme témoin négatif. Le conjugué d' antisérum de souris FITC est incubé avec chaque souche bactérienne pour servir de témoin de conjugué.
Les clones positifs au test IIF sont transférés pour expansion avant clonage dans des plaques à 24 puits contenant le milieu HAT-DMEM. On rapporte sur la figure 1 un test IIF sur T. equigenitalis en présence d' AcM selon l'invention. Cette figure montre une forte fluorescence de la paroi bactérienne.
4 à 7 jours plus tard, les hybridomes de ces puits sont clones par la méthode de dilution limite afin d'obtenir une cellule unique par puits dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits en utilisant le milieu HT- DMEM et des cellules nourricières. Les puits contenant un seul clone sont criblés par IIF et les cellules positives sont congelées dans de l' azote liquide.
Parmi l'ensemble des clones positifs 14 d'entre eux sont utilisés pour la production d' anticorps monoclonaux et la caractérisation de ces anticorps.
Les surnageants de cultures tissulaires d' hybridomes sont tamponnés par addition de Tris IM, pH 8,0 (vol. 1/20) et de l' azide de sodium (0,02 %) . Des préparations aliquotes sont effectuées et stockées à -20° C.
Exemple 2 : Caractérisation des anticorps monoclonaux anti-T. equigenitalis
- spécificité des anticorps monoclonaux Afin de vérifier la spécificité des anticorps monoclonaux, les surnageants des 14 clones d' hybridomes obtenus selon l'exemple 1 sont testés par IIF selon la capacité de leurs surnageants à reconnaître d' autres souches bactériennes que les deux souches de référence R- 16 et R-19 utilisées pour l'immunisation, à savoir : les 7 souches sauvages de T. equigenitalis décrites dans l' exemple 1, et - des souches bactériennes décrites dans l' art antérieur comme donnant lieu à des réactions croisées avec les antisérums de T. equigenitalis ou couramment présentes dans la flore génitale : Actinobacillus equuli, Pseudomonas aeruginosa, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Streptococcus equi,
Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas fluorescens et Klebsiella pneumoniae. Ces bactéries sont cultivées sur un milieu sang-agar base Columbia.
Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau II ci-après.
Figure imgf000020_0001
Les 14 anticorps monoclonaux testés reconnaissent les sept souches sauvages de T. equigenitalis. 3 d' entre eux donnent une réponse plus faiblement positive, à savoir 7 B7.1 ; 7 B7.10 et 10C9.6. Aucun des 14 anticorps monoclonaux testés ne reconnaît une des 8 souches bactériennes qui n' appartiennent pas à l'espèce T. equigenitalis.
Ces résultats démontrent la spécificité des 14 anticorps monoclonaux testés envers les souches de T. equigenitalis et l' abscence de réactivité croisée entre T. equigenitalis et d'autres bactéries, n'appartenant pas à l'espèce T. equigenitalis, et, soit ayant été décrites avec les outils de l' art antérieur comme présentant une réactivité croisée avec cette espèce {Actinobacillus equuli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Straphylococcus aureus, Pseudomonas fluorescens) soit faisant partie de la flore génitale courante [Streptococcus equi, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa) . Les réactions positives de l' antisérum polyclonal de lapin observées en IIF avec Staphylococcus aureus et Pseudomonas fluorescens n'ont donc pas été observées avec les anticorps monoclonaux de l'invention.
Les anticorps monoclonaux objet de la présente demande ne détectent pas de différence antigénique entre les différentes souches de T. equigenitalis testées.
- SAT (Sérum Agglutination Test)
Pour tester la réactivité des anticorps monoclonaux au SAT, seule la souche R-19 a été utilisée. Les résultats obtenus sont donnés dans la colonne 4 du tableau III ci-après.
13 des 14 anticorps monoclonaux donnent une réponse positive.
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
- localisation d'épitopes spécifiques
préparation des extraits proteiques et lipopolysaccharidiques de la souche R-19 de r. equigenitalis
- Extrait en conditions non dénaturantes (EN) de T. equigenitalis
Les cellules de T. equigenitalis ont été récoltées par centrifugation (6000 g, 10 min) et lavées trois fois dans une solution de PBS 0,1 M à pH 7,4. Les culots ont été remis en suspension dans un petit volume de tampon SDS (sodiumdodécylsulfate à 2 %, PBS pH = 7,4) et mis à incuber à 37° C pendant 30 min. A la suite de ce procédé, les protéines conservent leur activité biologique. Après extraction dans le tampon SDS, l'intégrité des cellules a été contrôlée par observations en microscopie à contraste de phases. Après centrifugation (10000 g, 10 min), les surnageants contenant EN ont été complètement dialyses contre de l'eau distillée à 4°C pendant 48 h, répartis en aliquotes et conservés à l'état congelé (-80°C) jusqu'à utilisation. La concentration en protéines de EN a été déterminée à l'aide du test protéique BLoBad (BloRad, Ivry-sur- Seine, France).
- Extrait en conditions dénaturantes ED
Les extraits EN des souches de T. equigenitalis ont été dissouts dans un solvant échantillon (Tris.HCl 0, 1 M pH 6,8 ; glycérol 10 % ; SDS 2 % ; β-mercaptoéthanol 2 mM et bleu de bromophénol 0,01 %) afin d'obtenir une concentration en protéines de 1 mg/ml, puis ont été portés à ébullition à 100° C pendant 5 min (extrait en conditions dénaturantes de T. equigenitalis, ED) .
- Extrait lipopolysaccharidique (LPS) Des extraits EN digérés par la protéinase K ont été utilisés comme extraits LPS (Hanner et al., 1991 Am. J. Vet. Res. 52,1065-1068). 10 μl de EN ont été dilués dans 35 μl du tampon de digestion pour LPS. Ce tampon de digestion pour LPS est constitué de 0,0625 M Tris.HCl pH 6,8 ; 0,1% SDS ; 10 % glycérol et de 5 μg de protéinase-K (Sigma). Ces préparations ont été incubées à 57° C pendant 1 heure et chauffées à 100° C pendant 5 min avant électrophorese.
- électrophorese sur gel de polyacrylamide dodecyl sulfate de sodium (SDS - PAGE)
Pour la séparation des protéines bactériennes, une électrophorese discontinue SDS-PAGE a été utilisée (Laemmli, 1970, Nature, 227, 680-685). Le gel de séparation contenait 12 % d' acrylamide et le gel de s taking 4 % d' acrylamide. 20 μl de chaque échantillon ED ont été déposés au fond des puits à une concentration équivalente à 5 μg de protéines par piste. L' électrophorese a été réalisée à 100 V, 50 mA (courant continu) pendant 10 h dans une unité verticale de plaques pour gel (Hoefer Scientific Instr. , San Francisco, CA) . Pour les déterminations de poids moléculaire, un kit destiné à la calibration des faibles poids moléculaires (Pharmacia- BLotech, Saint-Quentin en Yvelines, France) a été utilisé. Pour visualiser les bandes sur la matrice de polyacrylamide, on a utilisé la coloration au Coomasie R350 (Pharmacia- BLotech, France) et pour la visualisation des composants LPS, la coloration argentique (Tsai et Frasch, 1982 Anal. ELochem. 199, 115-119).
- immunoblotting
Les bandes de protéines ont été trans ferrées du gel sur une membrane ImmobilonR PVDF (Millipore Corp. , St Quentin en Yvelines, France) par électroblotting à l' aide d'une cellule de transfert électrophorétique MiniTrans- BlotR ( BLoRad) avec une solution tampon de transfert (Tris 25 mM ; glycine 192 mM ; méthanol 20 % v/v ; pH = 8,3) à 100 V, 250 mA pendant 1 heure. Pour vérifier les conditions de transfert électrophorétique et pour identifier les bandes proteiques sur les membranes, on a utilisé la coloration des protéines totales par l'or colloïdal (BLoRad, Colloidal Gold Total Protein Stain). Après transfert, les membranes ont été immergées pendant 30 min dans une solution bloquante (gélatine 3 % dans Tris 20 mM et NaCl 0,5 M) et rincées sous douce agitation dans une solution de lavage (Tris 20 mM ; NaCl, 0,5 M ; TweenR 20 0, 05 %) . Les membranes ont alors été mises en contact avec des solutions d' anticorps monoclonaux diluées de 1/100 à 1/1000 dans le tampon pour anticorps (Tris 20 mM ; NaCl 0,5 M, TweenR 20 0,05 % gélatine 1 %) pendant 180 min à 25 °C. La fixation des anticorps monoclonaux aux bandes peptidiques a été visualisée à l' aide de phosphatases alcalines (PA) conjuguées à des immunoglobulines IgG de chèvre (chaînes lourdes et légères) anti -souris (BLoRad, dilution à 1/2000) et à l'aide d'une solution substrat pour PA ( EoRad) .
Un sérum positif provenant de souris immunisées avec une souche de référence de T. equigenitalis et un sérum négatif issu de souris non immunisées ont été utilisés comme témoins expérimentaux. La figure 2 illustre un immunoblot entre les protéines bactériennes et les AcM selon l'invention d'une part et le sérum positif de souris d' autre part.
Le sérum positif collecté de souris immunisées réagit avec 5 protéines de la souche R-19 : 120 kDA ; 52,7 kDA ; 33, 4 kDA ; 17,5 kDA et 22 (LPS) kDA.
8 des 14 anticorps monoclonaux testés réagissent positivement et 6 d' entre eux négativement. Les épi topes spécifiques reconnus par ces 8 anticorps monoclonaux réagissant positivement sont :
150 kDa pour l'anticorps monoclonal 3B6.1, 120 kDa pour l' anticorps monoclonal 11C9.1, 52,7 kDa pour les anticorps monoclonaux 7B8.1 et
7C4.10,
22 kDa (LPS) pour les anticorps monoclonaux 7B7.10, 7D7.3, 11C9.4 et 11C9.5
Ces résultats sont également rassemblés dans le tableau III, colonnes 5 et 8.
- dot-blotting
Des membranes ImmobilonR PVDF (Sigma) ont été pré- humidifiées avec une solution de méthanol à 100 % pendant
1 à 3s, immergées dans de l'eau distillée pendant 1-2 min afin d' éluer le méthanol et équilibrées dans une solution de lavage (Tris 20 mM ; NaCl 500 mM ; TweenR 20 0,05 % ; pH = 7,5). Les extraits EN et ED ont été fixés aux membranes par incubation pendant 1 heure à température ambiante. Les membranes dot ont été lavées deux fois pendant 10 min dans la solution de lavage puis immergées dans la solution bloquante (gélatine 3 % dans Tris 20 mM et NaCl 500 mM) pendant 1 heure. Les membranes ont été lavées deux fois comme précédemment et incubées avec les anticorps monoclonaux sélectionnés dans les mêmes conditions que pour l' immunoblotting.
La fixation des anticorps monoclonaux aux membranes de dot blot a été révélée à l' aide de PA conjuguées à des immunoglobulines IgG de chèvre (chaînes lourdes et légères) anti -souris et à l'aide d'une solution substrat pour PA ( BLoRad) .
Les mêmes sérums, témoins positifs et négatifs, ont été utilisés tout comme pour l' immunoblotting.
Pour déterminer si les résultats négatifs observés sur l' immunoblotting sont dus au fait que les épi topes ont été endommagés par les réactifs dénaturants utilisés pour préparer les extraits, les 14 anticorps monoclonaux sont confrontés en dot-blot aux extraits EN et ED de la souche R-19.
Sur la figure 3, on rapporte en dot blot les protéines de R19 ayant réagi sur les pistes 1 à 14 avec les AcM du tableau III, sur la piste SP avec le sérum positif de souris et sur la piste SN avec le sérum négatif de souris. Les résultats obtenus sont également rassemblés dans le tableau III, colonnes 6 et 7. Les 6 anticorps qui présentent un immunoblot négatif présentent également un dot-blot négatif avec les extraits dénaturés de la souche R-19 (Tableau III, colonnes 5 et 6). Ils présentent cependant un dot-blot positif avec les extraits non dénaturés (Tableau III, colonne 7) .
En conditions non dénaturantes (traitement au SDS seulement), la conformation et l'activité des protéines restent intactes mais, sous des conditions réductrices (traitement au β-mercaptoéthanol et hautes températures), la conformation de certaines protéines change et les épi topes sont détruits. L' abscence de réactivité des 6 anticorps monoclonaux testés en immunoblot avec la souche R-19 est donc très vraisemblablement due à de tels changements de conformation et destruction d'épi topes.
8 anticorps monoclonaux qui conservent leur réactivité sur les extraits bactériens ED ont donc été produits.
Ces 8 anticorps monoclonaux peuvent donc constituer des réactifs appropriés à la détection des antigènes de T. equigenitalis et, plus particulièrement, au diagnostic de la MCE. De tels anticorps peuvent servir à caractériser des bactéries du genre Taylorella dans toute préparation biologique utilisant des conditions dénaturantes.
- Détermination de l' isotype
Pour la détermination de l' isotype des anticorps monoclonaux, on a utilisé le kit immunotype de chez Sigma qui est constitué de bandelettes de ni trocellulose pré¬ recouvertes d'anticorps anti -isotype d' immunoglobulines de souris. Après incubations supplémentaires, l'identité Les résultats obtenus figurent dans la colonne 9 du tableau III.
Les 14 anticorps monoclonaux produits font partie des IgM pour 5 d' entre eux, des IgG2b pour 4 d' entre eux, des IgG3 pour 3 d' entre eux et des IgGl pour 2 d' entre eux.
Exemple 3 :
Essai comparatif des différents tests de diagnostic de la MCE
a) culture bactériologique de la flore bactérienne b) détection par polyclonaux et IIF c) détection par l'invention objet de la présente demande : monoclonaux et IIF.
Pendant 1 mois, 368 écouvi lions de juments (fosse clitoridienne, de col utérin) et d' étalons (liquide liquide pré-éjaculatoi re, fosse uréthrale) ont été étudiés par les deux techniques d' immuno fluorés cences , la technique au sens de la note de service du Ministère de l'agriculture et de la pêche (DGAL/SDSPA/N95/N°8037) avec anticorps polyclonaux et la technique selon l'invention. Les positifs par l'une des deux techniques ont subi un isolement par culture sur milieux géloses. 64 prélèvements ont été trouvés positifs avec les anticorps polyclonaux et 17 avec les anticorps monoclonaux ; aucune mise en culture n'a permis d'isoler de bactérie T. equigenitalis. Ces résultats mettent bien en évidence la plus forte spécificité apportée par l'invention dans cette étude. Exemple 4 : Autre essai comparatif
Un deuxième essai visant à comparer le dépistage de la MCE par culture bactériologique, par polyclonaux et IIF et par l'invention objet de la présente demande (monoclonaux et IIF) a été mené sur 1014 échantillons représentant l'ensemble des demandes d' analyse. 1 T. equigenitalis a été isolée par culture bactériologique (sur 1014 échantillons), 58 fluorescences ont été établies avec les anticorps monoclonaux selon l'invention (6%) et 409 avec les anticorps polyclonaux (40%).
Les différences mesurées entre les anticorps monoclonaux et polyclonaux sont statistiquement significatives avec une probabilité supérieure à 99,9% (Test Khi 2).
Les techniques de dépistage par anticorps et immunofluorescence indirecte, à savoir la technique "anticorps polyclonaux" et la technique objet de la présente invention, ont toutes deux dépisté la T. equigenitalis isolée par culture bactériologique.
La spécificité des anticorps monoclonaux selon l'invention, utilisés dans le cadre de l' immunofluorescence indirecte, est meilleure que celle des anticorps polyclonaux (94% vs 60%).
Exemple 5 : Elimination de réactions non "antigène- anticorps".
Des réactions non spécifiques peuvent parfois être obtenues entre des anticorps et des Staphylococcus l'intermédiaire de protéines (protéine A pour S. aureus et protéine G pour les Streptocoques de groupes C et G). Les réactions ne sont pas de type antigène-anticorps.
De telles réactions non spécifiques peuvent être observées avec les anticorps monoclonaux selon l'invention : en effet, 2 souches de bactéries connues pour produire des protéines A et G {Staphylococcus aureus souche Cowan et Streptocoques souche 26RP66) ont été soumises à la technique de détection selon l'invention, à savoir anticorps monoclonaux et immunofluorescence indirecte, et ont toutes deux donné une fluorescence (la souche R-19 de T. equigenitalis a servi de témoin expérimental) .
Afin d'éliminer ces réactions non spécifiques, une technique dite blocking a été mise au point.
Des anticorps monoclonaux selon l'invention conjugués à FITC, destinés à une détection en immunofluorescence directe, ont été réalisés.
Deux anticorps monoclonaux selon l'invention, un IgG2b (10C9.6) et un IgG3 (7C4.10) ont été concentrés 10 fois par précipitation au sulfate d' ammonium et purifiés sur une colonne de Protéine A Sépharose (Pharmacia) par adsorption dans un tampon Tris lOOmM pH 8 et élution dans un tampon lOOmM glycine pH 3. Les anticorps ainsi purifiés ont été marqués par FITC Isomère gamma
(fluorescein isothiocyanate) et les conjugués anticorps-
FITC ont été séparés des molécules non marquées par passage dans une colonne Sephadex G25 (Pharmacia).
Trois types de lames ont été réalisés :
T. equigenitalis souche R-19 streptomycine résistante, - Staphylococcus aureus souche Cowan,
- Streptococcus de groupe C souche 26RP66.
Ces lames ont ensuite été soumises au blocking par incubation à 37 °C pendant lh dans un sérum dépourvu d'anticorps anti-T. equigenitalis. Trois sera ont été comparés : sérum de souris, sérum de lapin et sérum humain.
Après lavages au PBS et rinçages à l' eau distillée, les lames sont incubées lh à 37°C avec les anticorps monoclonaux selon l'invention marqués par FITC décrits ci -avant.
Après lavage et rinçage final, les lames sont montées dans de la glycérine, tamponnées et examinées sous un microscope à fluorescence. Ces trois techniques de blocking donnent une fluorescence pour les lames T. equigenitalis et ne donnent pas de fluorescence pour les lames de liaisons non spécifiques (S. aureus et Streptococcus).
Le meilleur blocking a été obtenu avec le sérum de souris.
Il est donc possible avec la technique de détection selon la présente invention d'éliminer les réactions non spécifiques tout en conservant la réaction spécifique anti gène-an ti co rps . Cette technique de blocking par sérum dépourvu d'anticorps anti-T. equigenitalis et immunofluorescence directe peut être avantageusement utilisée en confirmation des résultats positifs obtenus par la technique d' immunofluorescence indirecte et anticorps monoclonaux selon l'invention. Exemple 6 : Production d'anti-anticorps anti -Taylorella equigenitalis.
1. Production des anticorps monoclonaux anti-T. equigenitalis (AcMl)
On opère comme indiqué ci-dessus.
2. Purification des AcMl
Les AcMl sont précipités par addition de sulfate d'ammonium saturé à la concentration finale de 50%. Après centrifugation, le précipité est remis en suspension dans du PBS, puis filtré sur gel de Séphadex® G75 (Pharmacia) et enfin purifié par chromatographie d' affinité sur une colonne de protéine A- Sépharose® CL-4B
3. Préparation de l' immunogène Les AcMl purifiés sont homopolymerises en présence de glutaraldéhyde à 0,25% pendant heures à 4°C. La réaction est stoppée par adjonction d'un tampon glycine 0,2M et les polymères sont dialyses contre du PBS.
4. Immunisation de souris Des souris BUJEV'C sont immunisées par 1 injection SC d'un mélange à partie égale de 50μg d' AcMl polymérisés et d' adjuvant de Freund complet. 2 injections ultérieures sont pratiquées à 2 semaines d'intervalle , l'une avec de 1' adjuvant de Freund incomplet, et l' autre sans aucun adjuvant et par voie péritonéale.
5. Obtention des anticorps monoclonaux anti -anti corps contre T. equigenitalis. (AcM2)
On procède comme décrit plus haut.
6. Purification des fragments Fab des AcMl Des fragments Fab des anticorps AcMl sont purifiés après digestion des AcMl par de la papalne (incubation 45 min à 37 °C des AcMl dans une solution de papaine, de 2-β- mercaptoéthanol, d' EDTA 1,5M à pH8. le rapport est de lOμg de papaïne par mg d' AcMl. La digestion est stoppée par l'addition de N-méthylmaléimide lOmM (Sigma). Les anticorps non digérés et les fragments Fc sont éliminés par chromatographie d' affinité sur une colonne de protéine A-Sépharose CL-4 E® (Pharmacia). La pureté des fragments Fab est vérifiée par SDS- PAGE.
7. Criblage des hybridomes producteurs d' AcM2 par un test ELISA
Les microplaques (Maxisorb, Nunc) sont incubées 16h à 4°C avec 100 μl/puit d'une suspension de 0,2 μg/ml de Fab dans du tampon carbonate pH8. Les microplaques sont lavées 3 fois avec du P BS-Tween 20® (0,05%), pH 7,2, puis les sites non spécifiques sont bloqués par une solution de BSA 2% dans le P BS-Tween 20® pendant 30 min à 37 °C. Après 3 lavages par du PBS- Tween 20®, les surnageants de culture des hybridomes sont incubés IH à 37 °C. Après 3 lavages par du P BS-Tween 20®, la réaction est révélée par un conjugué anti-souris marqué à la peroxydase et son substrat.
Les hybridomes positifs par le test ELISA sont sélectionnés et les surnageants sont utilisés pour la préparation du vaccin. 8. Préparation du vaccin
Les anticorps AcM2 des hybridomes sélectionnés , puis leurs fragments Fab correspondants sont purifiés selon les méthodes décrites ci -des s us. Les fragments Fab sont couplés à la keyhole limpet hemocyanin (KLH, Sigma) par incubation pendant 16h à 4°C dans une solution 0,05% de glutaraldéhyde (Sigma), dans un rapport de 1/1. La réaction est stoppée par une solution de glycine 0,02M et les conjugués sont dialyses contre du PBS. La protéine est dosée à 25-100μg par dose de vaccin et le vaccin est additionné d' hydroxyde d' alumine à titre d'adjuvant.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments, plus particulièrement, leurs fragments Fv, Fab, F(ab' )2, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épi tope d'une bactérie de l' espèce T. equigenitalis.
2/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments, plus particulièrement leurs fragments Fv, Fab, F(ab' )2, selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils ne présentent pas de réaction croisée avec un ou des épi tope (s) d'une bactérie d'une espèce Taylorella différente ou d'une bactérie d'un genre différent.
3/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments, selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître des protéines de T. equigenitalis du groupe comprenant des protéines telles que les protéines de 150 kDa, 120 kDa, 52,7 kDa ou 22 (LPS) kDa.
4/ Anticorps monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils peuvent être obtenus à partir d'hybrides - par fusion de cellules de myélome murin non sécrétrices avec des cellules spléniques issues de souris immunisées à l'aide d'une souche de l'espèce T. equigenitalis inactivée ou d'extrait (s) d'une telle souche, et - clonage et sélection selon la propriété de leur surnageant de culture à reconnaître un ou des épi tope (s) d'une bactérie de l'espèce T. equigenitalis,
- récupération des anticorps monoclonaux recherchés, suivie le cas échéant d'une purification. 5/ Protéines immunogènes, caractérisées en ce qu' elles sont capables d'interagir avec des anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon l' une quelconque des revendications 1 à 4.
6/ Anticorps monoclonaux, et leurs fragments, particulièrement leurs fragments Fv, Fab, F(ab')2, caractérisés en ce qu'il s'agit d' anti -anti corps , à savoir d'anticorps capables d'interagir avec les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
7/ Procédé d' obtention d' anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend : la fusion de cellules de myélome murin non sécrétrices avec des cellules spléniques issues de souris immunisées à l'aide d'une souche de l'espèce T. equigenitalis ou d'extrait (s) d'une telle souche, le criblage à l'aide d'une technique de révélation, telle que notamment l' immunofluorescence indirecte, des hybridomes dont les surnageants de culture présentent une réaction positive avec une bactérie de l'espèce T. equigenitalis ou un fragment de celle-ci,
- la sélection par clonage de tels hybridomes au regard de leur réactivité, par rapport à T equigenitalis , et
- la récupération des anticorps monoclonaux, suivie le cas échéant de leur purification.
8/ Procédé d' obtention d' anticorps monoclonaux selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend : la fusion de cellules de myélome murin non sécrétrices avec des cellules spléniques issues de souris immunisées à l' aide d' anticorps monoclonaux ou de leurs fragments tels que défini (s) dans l'une des revendications 1 à 4, le criblage a l' aide d'une technique de révélation, telle que notamment l' immunofluorescence indirecte, des hybridomes dont les surnageants de culture présentent une reaction positive avec l'un desdits anticorps monoclonaux ou leurs fragments,
- la sélection par clonage de tels hybridomes, et
- la récupération des anti -anti corps recherches.
9/ Souches d' hybridomes caractérisées en ce qu' elles sont capables de sécréter des anticorps monoclonaux selon 1' une quelconque des revendications 1 à 4.
10/ Souches d' hybridomes caractérisées en ce qu' elles sont capables de sécréter des anticorps monoclonaux selon la revendication 6.
11/ Méthode d'identification d'une bactérie de 1' espèce T. eguigemtaiis dans un échantillon ou dans une culture, comprenant :
- la mise en contact de l' échantillon ou de la culture à analyser, susceptible de renfermer T. equigenitalis, avec î.une quantité efficace d'au moins un anticorps monoclonal ou un fragment d'un tel anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et, optionnellement, blocage des réactions non antigène-anticorps, ii. ou, en variante, pour mettre en évidence la présence d'anticorps dirigés contre T. equigenitalis avec une protéine immunogène selon la revendication 5 ou un anticorps selon la revendication 6, dans des conditions permettant une réaction du type anti gene-antico rps , et - la révélation du produit de réaction de type antigène-anticorps éventuellement formé. 12/ Méthode de diagnostic d' une infection par T. equigenitalis, plus particulièrement de la métrite contagieuse équine dans un échantillon ou une culture, comprenant : - la mise en contact d'un ou plusieurs anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou de leurs fragments, avec un prélèvement biologique, et
- la révélation de la réaction du type antigène- anticorps produite dans le cas de la présence de T. eguigenitalis dans le prélèvement,
- et, optionnellement, le blocage des réactions non antigène-anticorps, par exemple, par saturation de l' échantillon prélevé à l' aide d'un sérum dépourvu d'anticorps anti-T. equigenitalis.
13/ Kits pour la mise en oeuvre d' une méthode selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisés en ce qu'ils comportent
- un ou plusieurs anticorps monoclonaux, ou leurs fragments, selon l'une quelconque des revendications 1 à
4, ou au moins une protéine immunogène selon la revendication 5, ou un ou plusieurs anticorps monoclonaux, ou leurs fragments, selon la revendication 6, - les réactifs, notamment les marqueurs ou tampons, permettant la réalisation de la réaction immunologique visée, et, optionnellement, des réactifs de blocage des réactions non antigène-anticorps tels que sérum de souris , - ainsi qu'une notice d'utilisation.
14/ Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu' elles renferment un ou plusieurs anticorps monoclonaux, ou leurs fragments, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comme vecteurs de médicaments ou comme agents d'immunothérapie passive, seuls ou en association avec des véhicules pharmaceutiquement inertes.
15/ Compositions vaccinales, caractérisées en ce qu' elles renferment, en association avec des excipients physiologiquement acceptables, au moins une protéine immunogène telle que définie selon la revendication 5, ou un anticorps selon la revendication 6, ou un fragment d'un tel anticorps, en quantité suffisante pour susciter une réaction immunitaire.
16/ Utilisation des anticorps monoclonaux selon 1' une des revendications 1 à 4 pour l' élaboration de biocapteurs.
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