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WO1997031125A2 - Procede de diagnostic - Google Patents

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WO1997031125A2
WO1997031125A2 PCT/JP1997/000487 JP9700487W WO9731125A2 WO 1997031125 A2 WO1997031125 A2 WO 1997031125A2 JP 9700487 W JP9700487 W JP 9700487W WO 9731125 A2 WO9731125 A2 WO 9731125A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mec
dna
nucleotide sequence
base sequence
mrsa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1997/000487
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Keiichi Hiramatsu
Teruyo Ito
Akira Awaya
Hiroie Ohno
Tsukasa Hayashi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kainos Laboratories Inc
Original Assignee
Kainos Laboratories Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kainos Laboratories Inc filed Critical Kainos Laboratories Inc
Priority to KR1019970707491A priority Critical patent/KR100287044B1/ko
Priority to US08/945,810 priority patent/US6156507A/en
Priority to CA002218476A priority patent/CA2218476C/en
Priority to AU18109/97A priority patent/AU696462B2/en
Priority to DE69735087T priority patent/DE69735087T2/de
Priority to EP97903593A priority patent/EP0887424B1/en
Publication of WO1997031125A2 publication Critical patent/WO1997031125A2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention provides a genetic diagnosis of resistant bacteria, particularly methicillin-resistant Staphylococcus aureus (hereinafter referred to as MRSA) and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococcus (MRSA). It relates to a diagnostic method for specifically and highly sensitively detecting negative staphylococci (MRC-NS). That is, the present invention relates to a diagnostic method capable of specifically and rapidly detecting and identifying methicillin-resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant Staphylococcus aureus.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • MRSA methicillin-resistant coagulase-negative staphylococcus
  • MRC-NS which includes MRSA ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ S (Staphylococcus haemo lyticus) ⁇ Staphylococcus epidermidis (Staphylococcus ep idermidis), etc.
  • MRSA MRSA ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ S (Staphylococcus haemo lyticus) ⁇ Staphylococcus epidermidis (Staphylococcus ep idermidis), etc.
  • MRSA is a PBP 2 '(penici II in-binding protein), a cell wall synthase with low affinity for all /?-Lactam antibiotics developed to date, including methicillin. Or Staphylococcus aureus that produces PBP 2 a). This production of PBP 2 'renders MRSA resistant to all conventional / -lactams.
  • PBP 2 penici II in-binding protein
  • MRSA produces PBP 2 'in addition to the four types of PBP originally possessed by Staphylococcus aureus.
  • the gene mecA encoding this PBP was cloned by Matsuhashi et al. The nucleotide sequence was determined.
  • me cA gene is present on the chromosome of the MR SA and MR C-NS, Staphylococcus aureus Mechishi phosphorus sensitive (MSSA; methicillin-susceptible St aphylococcus aureus) in standing city 0 Therefore, the mecA gene, yellow Bed It is thought to be a gene acquired exogenously on the chromosome of D. aureus. If the mecA gene is detected on the chromosomal DNA of Staphylococcus aureus by PCR (polymerase chain reaction) or hybridization, it can be identified as MRSA or MRC-NS.
  • the mecA gene is Staphylococcus (S.) epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. ca it is, S. warner i, S. sciuri, S. It is widely distributed in other Staphylococcal species such as caprae (Eiko Suzuki et al. Antimicrb. Agents Chemo ther. 37, 1219-1226, 1993.). Detection of the mecA gene directly from the sample does not prove the presence of MRSA, since the baculococcus species carrying mecA are detected simultaneously.
  • the mecA gene detection method has a restriction that it must be used after culturing the bacterium from a patient sample and confirming that it is Staphylococcus aureus by a conventional bacterial species identification method. Therefore, empiric th erapy had to be relied on until the infection was identified. As a result, unnecessary vancomycin administration had to be performed.
  • the present invention relates to an exogenous insertion which is present on the chromosome of MRSA (methici 11 in-resistant Staphylococcus a ureus) or MRC-NS (methici 11 in-resistant coagulase-negative staphylococci) and carries the mec A gene.
  • MRSA methici 11 in-resistant Staphylococcus a ureus
  • MRC-NS methici 11 in-resistant coagulase-negative staphylococci
  • a part of the mecDNA, which is a DNA, and the chromosomal DNA surrounding the inserted DNA A method for diagnosing MR SA or MR C-NS, which is characterized by performing a reaction operation with a sample by using a part of the base sequence of methicillin, and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (MSSA) or methicillin-sensitive C-NS (MSC-S) Perform the reaction with the sample using the base sequence of chromosomal DNA surrounding the mecDNA insertion site in the chromosome, and use the PCR, LCR or hybridization, RT-PCR.
  • MSSA methicillin-sensitive Staphylococcus aureus
  • MSC-S methicillin-sensitive C-NS
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the cloning of mecon region DNA of N315 by chromosome walking.
  • H indicates Hindlll
  • P indicates Pstl
  • E indicates EcoRl restriction enzyme cleavage sites.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the cloning of the mec region DNA of NCT C10442 by chromosome walking.
  • the restriction enzyme map of clones L02, L05, L07, and L021 obtained from the human phage library and the insertion site of mec region DNA are shown. 1 to 7 indicate probes of the mec region DNA. H, Hindi II; E, EcoRI; S, Sail; X, Xbal.
  • FIG. 3 is a diagram showing the structure of the mec region DNA of MRSA strain, 85/3907, and its insertion site on the chromosome.
  • the restriction enzyme map of clones pSJ9 and pSJIO obtained from the plasmid library and the clones LG12 and LG25 obtained from the human phage library and the insertion site of the mec region DNA are shown. 1 to 7 indicate probes of the mec region DNA.
  • H Hindlll
  • E EcoRI
  • S Sail
  • X Xbal
  • P Pstl.
  • FIG. 4 is a view showing restriction enzyme muting of LD8325 containing a mec insertion site and its partial nucleotide sequence.
  • the vertical arrow indicates the insertion site of mec.
  • the horizontal arrow indicates the direction of the nucleotide sequence (from 5 'to 3').
  • Base sequence The underlined part indicates the intM open reading frame.
  • the arrow at base numbers 1856 and 1857 indicates the insertion site of roec.
  • FIG. 5 is a diagram showing a comparison of the chromosomal DNA base sequences before and after the mec insertion site between the MSS A strains.
  • the type of coagulase produced by each strain is ATCC25 923, type 4; STP23, type 4; NCTC8325, type 3; STP43, 7; STP53, type 5.
  • 225 bases from base numbers 1708 to 1932 of NCTC8325pLEC12 containing the mec ⁇ insertion site (arrow) were compared with the corresponding 225 bases of other strains. Bases in parentheses are common to all strains.
  • FIG. 6 is a diagram showing a comparison of base sequences between MRSA and methicillin-resistant bacteria.
  • SH 518 and SH JA178 are clinical isolates of S. haemolyticus.
  • SE G3 is a S. epidermidis clinical isolate.
  • FIG. 7 is a diagram showing an outline of a method for identifying MRSA.
  • the arrow indicates the primer of the PCR.
  • the primer set as A reacts with the chromosomal DNA of MSSA on the MSSA side but not on the mec side primer (B).
  • the mec-side primer reacts with the chromosomal DNA of staphylococcal strains other than Staphylococcus aureus having mec, but the MSSA-side primer does not react (C) o
  • FIG. 8 is a diagram showing the concept of the PCR internal control. If a primer is designed to surround the region containing intM of MSSA, it will react with the chromosomal DNA of MSSA and amplify the DNA fragment by PCR.In the case of chromosomal DNA of MRSA, a mec region DNA of 30 Kb or more will be used. In this case, amplification cannot be performed by normal PCR. Furthermore, when a primer is synthesized including a mec insertion site, in the case of MRSA, the primer itself does not react.
  • FIG. 9 is a diagram showing the homology between the nucleotide sequences pLEC12rc and pSJ8-2a.
  • Subclone pSJ8-2a containing the mec upstream junction of N315 (see Fig. 1) (bottom sequence) and chromosomal DNA clone containing NCTC8325 intM The nucleotide sequences (upper nucleotide sequence) of pLEC12 (pLECla) were compared. The nucleotide sequences outside the upstream junction of mec are almost identical.
  • pLEC12rc is the reverse complementary of pLEC12;
  • FIG. 10 is a diagram showing the homology between the base sequences pLEC12rc and pSJ8-2a, and shows the continuation of FIG.
  • FIG. 11 is a view showing the homology between the nucleotide sequences pLEC12rc and N3115J3rc. Comparison of the nucleotide sequence of the subclone containing the mec downstream junction of N315 N315J3 (see Fig. 1) (lower nucleotide sequence) with the nucleotide sequence of the chromosomal DNA clone pLEC12 (pLECla) containing the intM of NCTC8325 (upper nucleotide sequence) did. The nucleotide sequences of intM outside the mec region DNA were almost identical. N315J3rc is the reverse complementary nucleotide sequence of the nucleotide sequence of N315J3.
  • Fig. 12 shows mec of N315 and NCTC10442! : Comparison of the nucleotide sequences of clones containing the junction (N315, upper nucleotide sequence; NCTC10442, lower nucleotide sequence). The base sequence of mec is very different from each other except for the IR near the junction. -On the other hand, the nucleotide sequences outside the junction were identical.
  • Figure 13 is a comparison of the nucleotide sequences of N315 and NCTC10442 containing the jimciton downstream of mec (N315, upper nucleotide sequence; NCTC 10442, lower nucleotide sequence).
  • the base sequences of each mec were very different except for IR.
  • the nucleotide sequence outside (downstream) of the junction had extremely high homology.
  • NCTC10442J3 is a reverse complementary nucleotide sequence of the nucleotide sequence of NCTC10442J3.
  • Fig. 14 shows a comparison between N315IS-J3rc and J3rc of NCTC10442.
  • the upper base sequence is N315IS-J3 (see FIGS. 1 and 17), and the lower base sequence is the first 176 base sequence corresponding to the mec region of J3rc of NCTC10442 (see FIG. 13).
  • Fig. 15 compares N315J3rc with pSJ10-3J3rc.
  • the upper nucleotide sequence is N315J3rc
  • the lower nucleotide sequence is pSJIO-3J3rc.
  • pSJIO-3J3rc is pS Base of J10-3J3 This is the reverse complementary base of S.
  • Fig. 16 compares pSJ8-2a and LG12H2.
  • the nucleotide sequence on the hen side is pSJ8-2a, and the nucleotide sequence on the lower side is LG12H2.
  • FIG. 17 is a diagram showing the nucleotide sequence of N3I5IS-J3.
  • the thin underline is the nucleotide sequence corresponding to the first 176 nucleotide sequence corresponding to the mec region of J3rc of NCTC 10442 (see Fig. 14).
  • the thick underline is the nucleotide sequence corresponding to intM outside the mec downstream junction.
  • FIG. 18 is a view showing the nucleotide sequence of NCTCC1042J3rc.
  • the underline indicates the nucleotide sequence corresponding to intM outside mec downstream junction.
  • FIG. 19 shows the nucleotide sequence of pSJIO-3J3rc.
  • the underline indicates the nucleotide sequence corresponding to intM outside mec downstream jimction.
  • mec region DNA mec region DNA
  • mec mec region DNA
  • mec mec region DNA
  • mec mec (Keiichi Hiramatsu: Microbiol. Immunol. 39 (8), 531-543, 1995.)
  • MRSA Clinical Isolate N315 type 2 core glase producing strain; type2j MRSA
  • UK MRS ⁇ ⁇ clinical isolate NCTC 10442 type 3 core glase producing strain; type 3e MRSA
  • German MRSA clinical isolate 85 / 3907 a type 4 core glase-producing strain; type 4e MRSA
  • mec is a huge DNA region of 52Kb for N315, 33Kb for NCTC10442, and 54Kb or more for 85/3907, and all MSSAs examined as controls It was found that the chromosomal DNA was composed of DNA that did not undergo cross hybridization (Figs. 1, 2, and 3).
  • IR base pair
  • MRSA can be identified by the following various methods by using mec and intM and their 5′-side nucleotide sequences.
  • the concept of the method of using the primer and the probe around the downstream junction of mec is described. The same effect can be obtained by surrounding the upstream junction of mec.
  • at least these three primers or sets of probes are designed based on the nucleotide sequence including the upstream junction of mec of N315, NCTC10442, 85/3907. It is necessary.
  • the selection of the primer or the probe is as follows: pSJ8-2a (base sequence in FIG. 9 and 10), L02C4 (base sequence in FIG. 12), LG12H2 (base sequence in FIG. 16) and base sequence in FIG. Numerous primers can be designed and combined around the mec upstream junction.
  • MRSA can be identified by creating two DNA fragments surrounding the mec and intM junctions and performing the reaction.
  • a single- or double-stranded DNA probe containing the junction between mec and intM can be synthesized, and MRSA can be identified using hybridization.
  • the primer or probe on the MSSA side used in the above method is intM and its surrounding chromosomal region, the nucleotide sequence pLEC12 (the nucleotide sequence in FIG. 4), and the nucleotide sequence intM in FIG. Many can be selected from the 5'-side nucleotide sequence.
  • the primer or probe on the mec side has the following nucleotide sequence: N315IS-J3 (nucleotide sequence in FIG. 17), NCTC10442J3rc (nucleotide sequence in FIG. 18), pSJ10-3J3rc (nucleotide in FIG. 19) Many sequences can be selected from the base sequence corresponding to the mec of the sequence.
  • RNA from bacterial cells such as MRSA and MSSA, convert it to DNA using reverse transcriptase, and perform PCR, LCR or hybridization using the above primers or probes to obtain MRSA. And MSSA can be identified.
  • Nucleic acid sequence-based amplification (RNase H, AMV-RT, T7 RNA polymerase) and two primers are simultaneously extracted by extracting RNA from the cells.
  • NA S BA See Jean Compton: Nature, 350, pp. 91-92, 1991) to amplify RNA and identify MRSA and MSSA.
  • the presence of MRSA can be determined directly from a patient sample, even if a mec-bearing B. aureus other than Staphylococcus aureus is mixed, without the sample being cultured. It is useful as a rapid diagnostic method and has high clinical diagnostic value.
  • a primer or DMA probe was designed on the 3 'side of the intM mec insertion site or including the insertion site, and PCR and NA SBA were designed.
  • PCR and NA SBA were designed on the 3 'side of the intM mec insertion site or including the insertion site.
  • a large number of primers or probes and combinations thereof used for these purposes can be selected from nucleotide sequences corresponding to the MSSA chromosome DNA containing or surrounding the mec insertion site of the nucleotide sequence of -F. That is, pLEC12 (pLE Cla) (base sequence in FIG. 4), pSJ8-2a (base sequence in FIGS. 9 and 10), L02C4 (base sequence in FIG. 12), and LG12H2 (base sequence in FIG. 16). is there.
  • ATCC 4380 (S. 1 ugdunensis), ATCC 1505 (S. saprophyticus), ATCC 4380 (S. schleiferisubs p. schleiferi), JCM 7470 (S. schleiferisubs p. coa gu lans), ATCC 2784 (S. si mu lans), ATCC 277836 (S. warnerii), AT CC 2 9 9 7 1 (S. Xy 1 osus)
  • MR C-NS can also be specifically detected using methods such as PCR, LCR, hybridization, RT-PCR, and NASBA, in the same manner as the above-described specific detection method for MR S A.
  • chromosomal DNA was cut with a restriction enzyme Sau3Al, and the size of 9 to 20 Kb was purified by agarose gel electrophoresis and used.
  • a restriction enzyme Sau3Al a restriction enzyme
  • 0.3 g of this Sau3Al fragment and 1.1 pig of pi asmid vector pACYC184 cut with the restriction enzyme BamHl were ligated, followed by transformation of Escherichia coli MC1061 and colony hybridization. I got In the case of the phage library, after ligating 0.3 ⁇ g of this Sau3Al fragment with Adash II lg cut with BamHl, in vitro packaging is performed, and after infecting with E.
  • plaque Hybridization was performed to obtain the desired clone.
  • the probe used for hybridization was mecA as the first probe, and the nucleotide sequence of the end of the obtained DNA clone was determined, so that the next probe was obtained by oliginucleotide synthesis or subcloning. Clones containing adjacent DNA regions were sequentially cloned (chromosome walking method) (Fig. 1).
  • probe 1-9 did not react with the MSSA strain at all, and only reacted with the MSSA strain with probe 10. This indicated that probe 10 was a DNA fragment containing the upstream junction of mec.
  • the base sequence of probe 10 was determined using the autosequencer (Appl led biosystem 373A) by the dedeoxy terminatioii method.
  • the sequence reaction was performed using DyeDoxy Terminator Cycle Sequencing Kit and Dye primer Cycle Sequencing Kit.
  • the DNA probe probe 11 (Fig. 1) of the region that reacts with MSSA at the upstream end of mec was used to identify the chromosomal DNA region of MSSA.
  • the NA fragment was cloned.
  • the chromosomal DNA extracted from NCTC8325 was digested with the restriction enzyme Sau3Al, and after ligation of 0.3 g of a 9 kb to 20 kb DNA fragment prepared by agarose gel electrophoresis and a dash ⁇ 1 g cut with BamHl, ligation was performed. 'Packaging was performed to produce phage 1 ibrary. O After that, recombinant phage was recovered from plaque power, which shows positive and live, by plaque hybridization.
  • the phage library of NCTC10442 was screened using plaque hybridization using probeNl, and a clone L021 containing a junction downstream of mec was obtained, and its nucleotide sequence was determined.
  • clone pSJIO contained the same nucleotide sequence as intM, matched with the mec insertion site of N315, NCTC10442, and found the downstream end of mec of these MRSA strains. A nucleotide sequence homologous to the nucleotide sequence was found. However, the nucleotide sequence of the mec downstream stump of 85/3907 is N315, NC It was different from that of TC10442 (Fig. 15).
  • LG12 nucleotide sequence LG12H2, N315, me of NCTC10442] upstream end of the IR nucleotide sequence and i nt M 3 1 to about 20 salt groups adjacent to j unc ti on corresponding to the end portion homologous Except for the sequence, little homology was found inside or outside mec ( Figure 16).
  • the MSSA chromosomal region (left) was found to be significantly different between MRSA strains of different origins.
  • the nucleotide sequences for selecting primers include the nucleotide sequence of the mec region from the I S431 (Fig. 1) on the right (downstream) of the mec of N315 to the downstream junction N315 I S-J3 (Fig. 17) and NCTC10442J3 rc (Fig. 18).
  • the following are arbitrarily selected primers, and many equivalent primers can be designed based on the above base sequence.
  • the nucleotide sequence of the primer and its position are indicated by the salt number of N315IS-J3 (Fig. 17).
  • the PCR method is as follows: 20 ⁇ 1 to 1 reaction solution (10 mM Tris-HCl pH8.3, 50 mM KC1, 1.5 mM MgC12, 0.0013 ⁇ 4 (w / v) gelatin, 200 M of dNTPs, 1.0 M primer, template DNA, 0.01 u / ju1 Taq DNA polymerase).
  • reaction conditions a system in which 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes was used was used was used.
  • GeneAmp PCR System 9600 Perkin Elmer
  • Nmec2, 3, 4, 4-2, 5, and 6 were used as primers for mecDNA primers, and J7, Nif, and J6 were used as primers downstream of the mec insertion site.
  • J7, J6, and Nif showed a reaction, but the signal was particularly strong when J6J7 was used.
  • a strong signal was obtained in each case.
  • the PCR product was not amplified in any of the above combinations, and the PCR product was detected when Gmecl045 was used as the mecDNA primer.
  • 1300, 1000, 700, 600, and 300 bp bands were detected by electrophoresis in combination of Nif, J6, J7, intMl, and J3 as the downstream primers of Gmecl045 and the mec insertion site.
  • PCR conditions are the same as in Example 8.
  • the mecDNA primer is a mecDNA primer that reacts with the mecDNA of 85/3907 Gmecl045.
  • the mecDNA primers' 111602, 3, 4, 4-2, 5, and 6 that react with the mecDNA of N315 and NCTC10442
  • Nmec5 confirmed the strongest band among all combinations.Therefore, sufficient results could not be obtained with a mixture of primers, and careful optimization is important. From these results, J6, Gmecl045, and Nmec5 were the most suitable combinations for the Bramer.
  • J6, Gmecl045, and Nmec5 primers were combined, and the PCR method was used to perform clinical isolation of MRSA, MSSA, mec-containing, and non-mec-free yellow buduococcal strains other than Staphylococcus aureus. Using strains to demonstrate their effectiveness Verified. PCR was performed using the DNA of 26 clinically isolated MRSA strains, 11 MSSA strains, 25 C-NS standard strains, and clinically isolated MRC-NS20 strains as templates. The primer used was a mixture of three types, J6, Gmecl045, and Nmec5. Braima I was a mixture of the following three types.
  • the PCR method uses a reaction mixture of 20 1 to 50 ⁇ 1 (10 niM Tris-HCl pH 8.3, 50 niM C1, 1.5 mM Mg C12, 0.0013 ⁇ 4 (w / v) gelatin, 200 M of dNTPs, lO ⁇ M primer, tempiate DNA, 0.01 u / j1 Taq DNA polymerase).
  • As the reaction conditions a system in which 30 cycles of 94 C for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 2 minutes was used was used was used.
  • Table 1 summarizes the results. All MRSAs in the world show a positive signal, and all MSSAs are negative. All Buddyococci other than Staphylococcus aureus were negative, regardless of whether or not they possessed niec.
  • RNAs of each strain were extracted, converted to DNA by RT-PCR, and genes were searched.
  • Nmec4-2, Nmec5, Nmec6 of Example 5, Gmecl045 used in Example 6, and IntMl of Example 7 were used as probes for detection.
  • the clinical isolates are ATCC25923, NCTC8325, MSSA (mec-), N315, NCTC10442, and 85/3907 as MRSA (mec +), and S. haemo lyticus SH518, SH631 'S. as MRC-NS. epidermidis strain G13 was used.
  • Cells obtained by culturing each strain in an LB medium are collected by centrifugation, washed with PBS, and washed with PBS / ImlRNase-free PK / SDS solution (200 ⁇ g / ml, ProteinaseK, 0.5 SDS, lOmMTris-HCl, pH8).
  • RNA thus obtained was treated with DNase (37 ° C., 60 minutes) After the reaction was completed, DNase was inactivated, extracted with phl / chl / lAA, extracted with chl / IAA, and then precipitated with ethanol.
  • RNA was heated at 95 ° C for 2 minutes, quenched on ice, and added with RTbuffer (201 reactions / sample) to perform reverse transcription reaction.
  • RTbuffer 201 reactions / sample
  • cDNA was obtained.
  • 2 5 ° at Thermal Cyc ler (TAKARA MP T P3000) Ide (, 1 0 minutes, 3 7 ° (, 6 0 minutes, and 9 0 ° C, 5 minutes after the reaction, a PCR reaction was carried out by a conventional method.
  • the PCR reaction conditions were as shown below, and two types of forward primer were used.
  • the template amount was calculated from the total RNA amount (l ⁇ g / 20 ⁇ 1) at the start of the RT reaction, and the amount of RT reaction solution (11) corresponding to 50 ng was taken and added to the 501 PCR reaction system.
  • N315 11 Water (PCR negative control) 6 N315 (MRSA) + 12 pLECla (PCR positive control)
  • the amplification product obtained by PCR was confirmed by 2% agarose gel electrophoresis.
  • the gel was prepared by adding 2% agarose (SeaKemGTG agarose, FMC) to 0.5XTBE (44.5mM Tris, 44.5mM Borate, 1nM EDTA) and then dissolving it in an autoclave. Mupid-2, C0SM0BI0). Take 10 1 corresponding to 1/5 amount from the amplified product (50 ⁇ 1), add 21 dye (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, ImM EDTA, 30% glycerol) and then add to wel 1 It was applied and electrophoresed in 0.5XTBE buffer at 100V for 45 minutes.
  • a size marker 0.5 bp of 100 bp DNA Ladder (100-1500 bp + 2072 bp, 1 ig // 1, GIBCO BRL) was used. ( After electrophoresis, the gel was transferred to TBE buffer containing 0.5 ⁇ g / ml ethidium bromide. After immersion and staining at room temperature for 20 minutes, amplified fragments were confirmed on a UV transilluminator, and photographed with a Polaroid photographing apparatus (Polaroid MP4 / type 667 film).
  • RNA of each strain was extracted using MRSA MRC-NS and clinical isolates of MSSA, and then RNA was amplified by NASBA.
  • the primer for amplification and the probe for detection were designed as follows.
  • the detection probe was designed as follows based on the base sequence of the IntM region common to each strain.
  • the clinical isolates were ATCC25923, NCTC8325, MSSA (mec-), N315, NCTC10442, and 85/3907 as MRSA (mec +), and S.haemolyticus SH518, SH631, and S.C. as MRC-NS. epidermidis strain G3 was used.
  • RNA was serially diluted with water at 1 ° (lpg / l-lg / ⁇ 1) to prepare a sample, and then the NASBA-dot hybridizion method shown below was performed.
  • Control tube i system control solution 201
  • centrifuge
  • Primer 15 11 is added to nucleic acid supernatant 81, and allowed to react at 65 ° (:, 5 minutes). Then, cool the reaction solution at 41 ° (:, at least 5 minutes).
  • Primer intMe was prepared based on the specific base sequence on the right side (downstream of mecA) of the mec input part of MR S. epidermidis in Fig. 6.
  • samples such as sputum, blood, urine, exudate, etc. can be obtained within the scope of conventional techniques. It is possible to detect MR SA directly from within 30 minutes and 1 hour.
  • This method enables effective selection of chemotherapeutic agents and early treatment of MRSA and MRC-NS infections by identifying MRSA at the bedside from patient samples.
  • this method can be applied to the carriage of MRSA in healthy individuals such as healthcare workers, and is therefore useful as a test to prevent outbreaks of hospital-acquired infections.

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Description

明 細
診断方法 技術分野
本発明は、 耐性菌の遺伝子診断を行う、 特にメチシリ ン耐性黄色ブド ゥ球菌 (methici 11 in-resistant Staphylococcus aureus, 以下 MR S A) およびメチシリ ン耐性コアグラ一ゼ陰性ブドウ球菌 （methicillin-resi stant coagulase - negative staphylococci 以下 MR C— N S ) を特異 的に高感度に検出する診断方法に関する。 すなわち、 メチシリ ン耐性黄 色ブドウ球菌やメチシリ ン耐性黄色ブドウ球菌を特異的に迅速に検出同 定できる診断方法に関する。 背景技術
MR S Aゃス夕フィ ロコ ヅカスへモリチカス （Staphylococcus haemo lyticus) ゃスタフイ ロコ ッカスェピデルミディ ス （Staphylococcus ep idermidis) などを含む M R C— N Sは、 世界各国の病院における院内感 染の主要な病原菌であり、 有効な伉菌薬が限られているために、 大きな 医療問題となっている。 臨床において、 その正確、 迅速な同定は、 感染 患者の診断と治療に重大な課題となっている。
MR S Aは、 メチシリンをはじめとする、 現在までに開発されたすベ ての/?—ラクタム系抗菌薬に低親和性の細胞壁合成酵素 P B P (penici II in-binding protein) である P B P 2 ' (または P B P 2 a) を産生 する黄色ブドウ球菌である。 この P B P 2 ' の産生により、 MR S Aは、 従来のすべての/?ーラクタム系薬に耐性を示す。 1 9 6 1年に、 その最 初の臨床分離株が、 英国で報告されて以来、 全世界に蔓延し、 現在では、 世界各国の病院で、 院内感染菌として、 現代医療の大きな問題となって いる。
MR S Aは、 本来黄色ブドウ球菌がもっている 4種の P B Pに加えて、 P B P 2 ' を産生するが、 この P B Pをコードする遺伝子 mecAは 1 9 8 6年に松橋らによりクローン化され、 その全塩基配列が決定された。 me cA遺伝子は、 MR S Aや MR C— N Sの染色体上に存在するが、 メチシ リン感受性の黄色ブドウ球菌 （M S S A ； methicillin-susceptible St aphylococcus aureus) には 在しない 0 従って、 mecA遺伝子は、 黄色ブ ドゥ球菌の染色体上に外来性に獲得された遺伝子であると考えられてい る。 この mecA遺伝子を一 に P C R (polymerase chain reaction)法， hybridization法で黄色ブドゥ球菌の染色体 D N A上に検出すれば、 MR S Aや MR C— N Sと同定することができる。
本邦では、 ED-PCR (enzyme detection PCR)法による mecA同定キッ 卜が 開発され、 厚生省の認可と保険薬価を得て、 臨床診断に頻用されている (Ubukata, K.， et al. J. Clin. Microbiol. 30,1728-1733, 1992.) 。 しかし、 この方法による MR S Aの同定には、 少なく とも、 以下の 2つ の問題点がある。
1 ) 患者検体から、 あらかじめ菌を培養し、 黄色ブドウ球菌の菌種同 定の操作を行った後にしか用いることができないので、 迅速性に難があ り、 種々の問題が発生する。
即ち、 mecA遺伝子は、 病原性の低いヒ トの常在菌である Staphylococc us ( S. ) epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. ca it is, S. warner i , S. sciuri, S. caprae などの、 ブドウ球菌属の他菌種 にも広く分布しており (Eiko Suzuki et al . Antimicrb. Agents Chemo ther. 37, 1219-1226, 1993. ) 、 患者検体では、 多くの場合、 これら me cA保有ブドゥ球菌菌種が同時に検出されるため、 検体から直接 mecA遺伝 子を検出しても MR S Aの存在を証明することにはならない。 このため に、 mecA遺伝子検出法は、 患者検体から、 菌の培養を行い、 黄色ブドウ 球菌であることを、 従来の菌種同定法で確定した後に用いなければなら ないという制約があった。 それ故、 感染菌同定までの間は、 empiric th erapyに頼らざるを得なかった。 また、 結果的に不要のバンコマイシンの 投与も行わざるを得なかった。
2 ) P C Rの内部コン ト ロールの欠如。 即ち、 現今の P C R操作にお いては、 thermal cyclerの作動条件により、 偽陽性、 偽陰性がでること があり、 陽性、 陰性を判定する場合、 毎回の操作における、 陰性、 陽性 の内部コン トロールがあることが望ましいが、 現行の診断方法では、 そ れがほとんど行われていない。 発明の開示
本発明者らは、 迅速 ·簡便で信頼しうる MR S Aや MR C— N Sの特 異的同定方法を確立することを目的として、 MR S Aや MS S Aや MR C一 N Sの遺伝子をより詳細に解析してきた。 そして、 メチシリ ン耐性 の遺伝子座に数十キロベース （K b) 以上の外来性の additional DNAが 存在するという報告に着目 した （Beck, W.D. et al. J. Bacteriol. 16 5,373-378, 1986. Skinner, S. et al. Mol. Microbiol. 2， 289-298， 1988.) 。
そして、 本発明者らは MR S Aや MR C— N Sの染色体上に MR S A 特異的な遺伝子配列が存在しないか、 鋭意研究を続け、 目的とする特異 的な D N A断片を発見 · 同定するに及び、 本発明を完成した。
即ち、 本発明は MR S A (methici 11 in-resistant Staphylococcus a ureus) または MR C— N S (methici 11 in-resistant coagulase-negat ive staphylococci) の染色体上に存在し mec A gene を担う外来性の挿 入 D NAである mecD NAの一部と、 その挿入 D NAを囲む染色体 D NA の塩基配列の一部を併用して、 検体と反応操作を行うことを特徴とする MR S Aまたは MR C— N Sの診断方法、 およびメチシリン感受性黄色 ブドウ球菌 ( M S S A ) またはメ シチリ ン感受性 C— N S (M S C - S ) 染色体における mecD N Aの挿入部位を囲む染色体 D N Aの塩基配列 を用いて検体との反応操作を行い、 mecD N Aが挿入している場合、 陰性 となることを利用した PCR、 LCRまたは hybridization、 RT-PCR. NASBAに よる MR S Aまたは MR C— N Sの診断方法である。 図面の簡単な説明
第 1図は染色体ウォーキングによる N 3 1 5の mec領域 D N Aのクロ一 ニングを説明するための図である。 Hは Hindlll, Pは Pstl, Eは EcoRlの それそれ制限酵素切断部位を示す。
第 2図は染色体ウォーキングによる N C T C 1 044 2の mec領域 D N Aのクロ一ニングを説明するための図である。 人ファージライブラ リー より得られたクローン L02, L05, L07, L021の制限酵素 地図及び mec 領 域 D N Aの挿入部位を示す。 1〜 7は mec領域 D N Aのプローブを示す。 H, Hindi II； E， EcoRI; S， Sail; X, Xbalである。
第 3図は MR S A株、 85/3907の mec領域 D N Aの構造と、 その染色体 上の挿入部位を示す図である。 プラスミ ドライブラ リーより得られたク ローン pSJ9, pSJIO, 人ファージライブラ リ一より得られたクローン LG1 2, LG25の制限酵素地図及び mec 領域 D N Aの挿入部位を示す。 1〜 7は mec領域 D N Aのプローブを示す。 H, Hindlll; E, EcoRI; S, Sail; X， Xbal; P, Pstlである。
第 4図は me c挿入部位を含む LD 8 3 2 5の制限酵素マツビングと その部分塩基配列を示す図である。 縦の矢印は、 mec の挿入部位を示す。 水平の矢印は、 塩基配列の方向を示す （5'から 3'にむけて） 。 塩基配列 の下線の部分は intMの open reading frameを意味する。 塩基番号 1856と 1857の問の矢印は roecの揷入部位を示す。
第 5図は mec挿入部位の前後の染色体 D N A塩基配列の M S S A菌株間 での比較を示す図である。 各菌株の産生するコアグラ一ゼ型は、 ATCC25 923, 4型； STP23, 4型； NCTC8325, 3型； STP43, 7 ； STP53, 5型。 mec揷入部位 （矢印） を含んだ NCTC8325pLEC12の塩基番号 1708から 1932の 225塩基を他の菌株の相当する 225塩基と比較した。 括弧で括った塩基は すべての菌株に共通のものである。
第 6図は MR S Aとメチシリ ン耐性菌との塩基配列での比較を示す図 である。 SH 518, SH JA178は S. haemolyticus 臨床分離株。 SE G3は S. epidermidis臨床分離株である。
第 7図は MR S Aの同定法の概略を示す図である。 矢印は P C Rのブ ライマ一を示す。 Aのように設定したプライマ一は、 MSSAの染色体 D NA とは、 MSSA側プライマ一は反応するが、 mec側プライマーとは反応しない (B ) 。 また、 mecをもった黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌株の染色体 D NAとは、 mec側プライマーは反応するが、 MSSA側プライマ一は反応し ない (C) o
第 8図は P C R内部コン トロールの概念を示す図である。 MSSAの intM を含んだ領域を囲むようにプライ マーを設計すると MSSAの染色体 D N A とは反応して PCRにより D N A断片が増幅されるが、 MRSAの染色体 D N A の場合は、 30Kb以上の mec領域 D N Aが揷入することにより、 通常の PCR では増幅ができない。 さらに、 mec 挿入部位を含めてブライマーを合成 した場合は、 MRSAの場合には、 ブライマー自体が反応しなくなる。
第 9図は塩基配列 p L E C 1 2 r cと p S J 8— 2 aの相同性を示す 図である。 N315の mec上流 junctionを含むサブクローン pSJ8-2a (図 1参 照） （下側の塩基配列） と NCTC8325の intMを含む染色体 D N Aクローン pLEC12(pLECla)の塩基配列 （上側の塩基配列） を比較した。 mecの上流 j unctionより外側の塩基配列はほとんど同一である。 pLEC12rcは pLEC12の reverse complementaryの； 基酉己歹 Uである。
第 1 0図は塩基配列 p LE C 1 2 r cと p S J 8— 2 aの相同性を示 す図であり、 図 9の続きの部分を示す。
第 1 1図は塩基配列 p L E C 1 2 r cと N 3 1 5 J 3 r cの相同性を 示す図である。 N315の mec下流 junctionを含むサブクローンの塩基配列 N 315J3 (図 1参照） （下側の塩基配列） と NCTC8325の intMを含む染色体 D N Aクローン pLEC12(pLECla)の塩基配列 （上側の塩基配列） を比較した。 mec領域 D N Aの外側の intM の塩基配列はほとんど同一であった。 N315 J3rcは N315J3の塩基配列の reverse complementaryの塩基配列である。
第 1 2図は N315 と NCTC10442の mecの！:流 junctionを含むクローンの塩 基配列を比較した図である （N315, 上側の塩基配列； NCTC10442, 下側の 塩基配列） 。 mecの塩基配列は junction近傍の IR以外はお互いにきわめて 異なっている。 -方、 junctionの外側の塩基配列は同一であった。
第 1 3図は N315と NCTC10442の mecの下流 jimcitonを含むク口一ンの塩 基配列を比較した （N315， 上側の塩基配列； NCTC 10442, 下側の塩基配列） 図である。 お互いの mec の塩基配列は、 IR 以外はきわめて異なっていた。 -方、 junctionの外側 （下流） の塩基配列はきわめて相同性が高かった。 NCTC10442J3は NCTC10442J3の塩基配列の reverse complementaryの塩基配 列である。
第 1 4図は N315IS- J3rcと NCTC10442の J3rcを比較した図である。 上側 の塩基配列は N315IS- J3 (図 1， 図 17を参照） 、 下側の塩基配列は NCTC1 0442の J3rc (図 13参照） の mec領域に相当する最初の 176塩基配列である。 第 1 5図は N315J3rcと pSJ10-3J3rcを比較する図である。 上側の塩基配 列は N315J3rc、 下側の塩基配列は pSJIO- 3J3rcである。 pSJIO- 3J3rcは pS J10-3J3の塩基 S己列の reverse complementaryの塩基酉己列である。
第 1 6図は pSJ8-2aと LG12H2を比較する図である。 ヒ側の塩基配列は p SJ8-2a、 下側の塩基配列は LG 12H2である。
第 1 7図は N 3 1 5 I S— J 3の塩基配列を示す図である。 細い下線 は， NCTC 10442の J3rcの mec領域に相当する最初の 176塩基配列に相当する 塩基配列 （図 1 4参照） である。 太い下線は、 mec下流 junctionの外側 i ntMに相当する塩基配列である。
第 1 8図は N C T C 1 044 2 J 3 r cの塩基配列を示す図である。 下線は、 me c下流 junc t i onの外側 i ntMに相当する塩基配列である。
第 1 9図は p S J I O— 3 J 3 r cの塩基配列を示す図である。 下線 は、 mec下流 jimc t i onの外側 i ntMに相当する塩基配列である。 発明を実施するための最良の形態
本発明者は、 上記 D NA断片、 即ち mec region DNA(mec 領域 D NA， 以下 mec (Keiichi Hiramatsu:Microbiol . Immunol . 39(8) , 531-543, 1995.) ) を染色体 walkingにより、 日本の M R S A臨床分離株 N315 ( 2 型コアグラ一ゼ産生株； type2j MRSA) , 英国の M R S Α臨床分離株 NCTC 10442 ( 3型コアグラ一ゼ産生株； type3e MRSA) 、 及びドイ ツの MR S A臨床分離株 85/3907 ( 4型コアグラ一ゼ産生株； type 4e MRSA) から、 それそれクローン化し、 その塩基配列を决定した。 これら 3株は、 リポ タイ ピング（ribotyping)法、 コアグラ一ゼ法、 mecl遺伝子の塩基配列の 決定による変異の位置と性質による分類で、 世界各国で分離された流行 分離株の代表として、 選出した株である。 その結果、 第 1,2，3図に示すよ うに、
1 ) mecは、 N315では 52Kb、 NCTC10442では 33Kb、 85/3907では 54Kb以上の 巨大な D N A領域であり、 いずれも対照として検討した多くの M S S A の染色体 D N Aとは交叉 hybridizationをしない D NAからなつているこ とが判明した （第 1,2, 3図） 。
2 ) mecの両端には 20-30ベース （base pair; bp) の逆位配列（ inverted repeat;以下 IR) があり、 本明細書では、 この 両端の IRを含めて mecと 定義する （第 1，2，3図） 。
3 ) これら mec領域 D N Aは、 黄色ブドウ球菌染色体 D N A上の特定の o rf (open reading frame) (以後 intMと呼ぶ） の中に挿入していることが 判明した （第 4図） 。
4 ) これら、 3株の塩基配列を比較することにより mec領域 D N Aの上流 側は、 お互いに大きく異なること、 また、 その f流側では、 N315と NCTC 10442は同 -の塩基配列を保有しており、 85/3907は他 2株とは異なる配 列であることが判明した。
5 ) intMの mec挿入部位より 5 ' 側の部分及びその J:流 （第 4図の上側） の染色体 D N Aの塩基配列は、 いずれの株でもよく保存されていたが、 intMの mec挿入部位より 3 ' 側及びその下流 （第 4図の下側） の染色体 D N Aの塩基配列は、 N315と NCTC10442では良く保存されていたが、 85/39 07では異なっていた （¾16図） 。
以上の事突から、 intM遗伝子は、 mec領域 D N Aの揷入部位としての役 割があることが推定されたため、 由来の異なる M S S A 5株の、 intMを 含む DNA断片をクローン化し、 その塩基配列を決定した （第 5図） 。 そ の結果、
6 ) intM遺伝子は、 いずれも、 mec挿入部位より 5， 側では同一の塩基配 列を保っていた力、 その 3 ' 側の塩基配列は異なっていた。
7 ) intMの外部の塩基配列については、 intMの 5， 側上流の塩基配列は、 いずれも保存されていたが、 その 3 ' 側下流の塩基配列は、 菌株ごとに 異なり多様性が観察された。 ついで、 黄色ブドゥ球菌以外のブドゥ球菌菌種における mecの揷入部位 を確かめる 的で、 mecA遺伝子を保有する S. haemolyticus 臨床分離株 JA178 、 495 および S. epidermidis臨床分離株 G3から mec下流端部のプロ ーブを用いて、 mecの下流 junctionを含んだ D NA断片をクローニングし た。 その塩基配列を決定すると、
8 ) いずれの mec下流端部の塩基配列も N315の mecの塩基配列と相同であ つたが、 juncitonの外側 （下流） の塩基配列は、 N315の intMと大きく異 なっていた（第 6図） 。
そこで、 黄色ブドゥ球菌以外のブドゥ球菌菌種の染色体 D N A上に in tMと相同性の高い遗伝了-がないことを確認するために、 ブドゥ球菌各菌 種の標準株 ATCC25923, NCTC8325(S. aureus ), ATCC14990 (S. epidermi dis),ATCC29970(S. haemolyticus) ,DSM20672(S. arlettae) ,CCM3573(S. caprae),ATCC29062(S. sci ri ) , ATCC33753( S. auricularis) , ATCC2784 0(S. capitis), DSM2050KS. carnosus ) , ATCC29750 (S. caseolyticus) , NCTC10530(S. chromogenes),ATCC29974(S. cohni i ), DS 2077K S. delph ini),DSM20674(S. equorum), JCM7469(S. felis),CCM3572(S. gallinaru m),ATCC27844(S. hominis) ,ATCC29663(S. intermedius ) , DMS20676( S. k loosii), ATCC29070 ( S . 1 entus )， ATCC43809(S . 1 ugdunens is), ATCC 15305 (S. saprophyt i cus ) , ATCC43808 ( S . schleiferi subsp. schleiferi ), JC M7470(S. shcleiferi subsp. coagulans ),ATCC27848(S. simulans)，AT CC27836(S. warneri),ATCC29971 (S. xylosus )を用いて、 N315の intMを プローブとして dot-blot hybridization をおこなった。 その結果、 9 ) intMのプローブは、 黄色ブドウ球菌以外の菌種の標準株とは、 hybr idizeしなかった。
以上の結果から、 以下の結論が得られた。
1 ) MR S Aの mecには、 少なく とも、 3種類があり、 お互いに大部分の 領域で異なっていたが、 そのうちの 2種 （N315mecと NCTC10442mec) は m ec の下流端部は相同の配列であった （第 12図） 。
2 ) mecの junction部に相当して、 比較的保存された 20- 30塩基の配列 IR が存在する。
3 ) MR S Aの染色体への挿入部位は、 調べたすべての MR S A株で同 一であり、 intMの中にある （第 17，18，19図） 。
4 ) int の塩基配列は、 少なく とも、 mec下流 junctionより右側 （下流 部分） ではほとんど同一である （第 6図） 。
5 ) intMの 5 ' より上流部分の塩基配列は、 3種の MR S Aで、 同一で あった (第 13,15, 17,18, 19図) 。
6 ) コアグラーゼ 2と 4型の株間では、 intMの mec挿入部位より 3， 側 （ 左側） の塩基配列は異なっていた （第 6図） 。
これらの知見をもとに mec と intM及びその 5 ' 側の塩基配列を利用す ることにより、 以下の諸方法により、 MR S Aの同定を行うことができ る。 以下には、 mecの下流 junctionを囲んでプライマ一、 プローブを用い る方法の概念を述べるが、 mecの上流 junctionを囲んで同様の効果をえる ことができる。 ただし、 後者の mecの上流 junctionを囲んで行う方法では、 N315、 NCTC10442, 85/3907の mec上流 junctionを含んだ塩基配列に基づき、 少なく ともこれら 3種のプライマ一あるいはプローブのセッ トを設計する こと必要となる。 この場合のブラィマーあるいはプローブの選定には、 pSJ8-2a (第 9，10図の塩基配列） 、 L02C4(図 12の塩基配列） 、 LG12H2 (第 16図の塩基配列） 及び第 5図の塩基配列のなかから mec上流 junctionを囲 んで、 数多くのブライマーの設計と組み合わせが可能である。
mec下流 junctionを囲んだブラィマ一あるいはプローブの設定による M R S Aの同定法
( 1 ) mec領域 D N A内と、 intM及びその 5， 側にプライマ一を設計し、 P CR法を用いる。 第 7図に示すように、 mecと intMの junctionを含んだ D N A断片が増幅されることによ り、 MR S Aと判定される （第 7A図） 。 MS S Aの場合は、 mec領域 D N A側のプライマーが反応できないために 陰性となり （第 7B図） 、 黄色ブドウ球菌以外の mec領域 DNA保有株につ いても、 intM及びその 5， 側のプライマーと反応できないために陰性と なる （第 7C図） 。
( 2 ) L C R ( ligase chain reaction) による場合は、 mecと intMの ju nctionを囲んで D N A断片を 2つ作成し、 反応をおこなうことにより、 MR S Aを同定できる。
( 3 ) mecと intMの junctionを含んで一本鎖あるいは二本鎖の D NAプロ —ブを合成し、 hybridizationを用いて MR S Aを同定できる。
( 4 ) 以上の方法に用いる MSSA側のプライマ一あるいはプローブは、 in tMおよびその周りの染色体領域の塩基配列 pLEC12(図 4の塩基配列） 、 そ して第 5図の塩基配列の intMおよびその 5'側の塩基配列から数多く選定す ることができる。
( 5 ) mec側のプライマ一あるいはプローブは、 以下の塩基配列、 即ち N 315IS-J3 (第 17図の塩基配列） 、 NCTC10442J3rc (図 18の塩基配列） 、 p SJ10-3J3rc (第 19図の塩基配列）の mecに相当する塩基配列から数多く選 定することができる。
( 6 ) MR S Aや M S S A等の菌体中の R N Aを抽出し、 reverse tran scriptase で DNAに変換して、 上記のブライマ一やプローブを用いて P CRや L CRやあるいは hybridizationを行い、 MR S Aや M S S Aを 同定できる。
( 7 ) さらに菌体中の RN Aを抽出し、 三種の酵素 （R N a s e H、 A MV— R T、 T 7 RNA polymerase) および 2種のブライマーを同時に 反)心させる nucleic acid sequence-based amplification (NA S BA) (Jean Compton: Nature, 350巻， 91- 92頁， 1991年参照） により、 R NA を増幅し、 MR S Aや M S S Aを同定することもできる。
これらの方法によれば、 患者検体に黄色ブドゥ球菌以外の mec保有ブド ゥ球菌が混在していても、 検体から菌の培養を経ることなく、 直接 MR S Aの存在を確定することができるので、 迅速診断法として有用であり、 臨床診断上の価値が高い。
さらに、 M R S Aの同定法の陰性コン トロールとして、 第 8図に示すよ うに、 intMの mec挿入箇所の 3 ' 側あるいは、 挿入箇所を含んでプライマ 一あるいは D M Aプローブを設計し、 P CRや NA S B Aを行うことに より、 MR S Aであれば、 陰性の結果が得られ、 M S S Aであれば陽性 の結果が得られるため， 内部陰性コン トロールとして、 実施条件の評価 を行うことができる。 また、 この方法で P C Rや N A S B Aが陰性にな ることを利用して、 MR S Aの同定を行うことも可能である。 ただし、 これらの試験では、 M S S Aの混入した患者検体については、 陽性にな るため、 MR S Aと判定された菌を単離、 培養したのちに、 上記 （ 1 ) 、 ( 2 ) 、 （ 3 ) また （ 6 ) ( 7 ) の各法に加えて行うとよい。 これらの 目的に使用するプライマーあるいはプローブと、 その組み合わせは、 以 —Fの塩基配列の mec挿入部位を含む、 あるいは囲んだ MSSA染色体 D N Aに 相当する塩基配列から数多く選定することができる。 即ち、 pLEC12(pLE Cla) (第 4図の塩基配列） 、 pSJ8-2a (第 9、 10図の塩基配列） 、 L02C4 ( 第 12図の塩基配列） 、 LG12H2 (第 16図の塩基配列） である。
上記の （ 1 ) 〜 （ 7 ) の方法を、 本邦を含む世界 18力国の流行 MR S A分離株 28株につき、 実施すると、 すべて陽性となったが、 コン ト口一 ルとして用いた M S S A株、 黄色ブドゥ球菌以外のブドゥ球菌菌種の標 準株、 mecを保有する黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌臨床分離株では陰 性の結果となり、 本診断法がきわめて有効で、 かつ有用なものであるこ とが実証された （表 表 1 mec-intM junctionを囲んだ P C R法による MR S Aの
特異的同定 菌株 プロ一ブ（J6+Nmec5+Gmecl045) 陰性 陽性
M S S A 1 1株 * 1 1 0
MR S A 2 6株 0 2 6
ブドゥ球菌標準株 2 5株' 2 5 0
MR C— N Sを含む
MRブドゥ球菌 2 0株' 2 0 0
'標準株 3株 A T C C 2 5 9 2 3、 N C T C 8 3 2 5 , AT C C 1 2 6 0 0を含む H本の臨床分離株。
' ' 1 8力国の流行分離株 ： E n g l a n d , N C T C 1 0 44 2 , 6 1 / 6 2 1 9 , 6 1 /384 6 , 6 1 /4 1 7 6 , 8 6/4 3 7 2， 8 6 / 5 6 0 , 8 6/9 6 1 , 8 6 / 2 6 5 2 , 8 6/9 3 0 2 ； Yu g o s l a v i a, 8 5/ 1 3 4 0 ; H u n g a r y, 8 5/ 1 7 6 2 ； e Z e a l a n d , 8 5/2 0 8 2 ; N o rwa y, 8 5/2 1 1 1 ； H o 1 1 a n d , 8 5/3 5 6 6 ; S a u d i A r a b i a, 8 5/5 49 5 ； J a a n, MR 1 0 8 , N 3 1 5 ； S au t h A f r i c a， 84/9 5 8 0 ； G e rma n y (We s t ) , 8 5/ 1 8 3 6 ; F r a n c e , 8 5/ 1 9 4 0 ; H o n g K o n g, 8 5/2 1 4 7 ； A u s t r i a , 8 5/3 6 1 9 ; G e rma n y ( E a s t ) , 8 5/3 9 0 7 ; C a n a d a, 8 5/4 2 3 1 , 8 5/4 6 7 0 ；
I s r a e l , 8 5/4 5 4 7 ; U. S . A. ， 8 5 / 2 2 3 2 , 8 5 / 2 2 3 5.
'''黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌標準株 AT C C 1 4 9 9 0 ( S . e p i d e r m i d i s ) , A T C C 2 9 9 7 0 ( S . h e amo l y t i c u s ) , D S M 2 0 6 7 2 ( S. a r l e t t a e ) , C C M 3 5 7 3 ( S . c a p r a e ) , A T C C 2 9 0 6 2 ( S . s c i u r i ) , A T C C 3 3 7 5 3 ( S . a u r i c u l a r i s ) , A T C C 2 7 8 4 0 ( S . c a p i t i s ) , D SM 2 0 50 1 ( S . c a r n o s u s ) , AT C C 2 9 7 50 ( S . c a s e o l y t i c u s ) , N C T C 1 0 5 3 0 ( S . c h r o mo g e n e s ) , AT C C 2 9 9 7 4 ( S . c o h n i i ) , D S M 2 0 7 7 1 ( S . d e l p h i n i ) , D S M 2 0 6 74 ( S . e q u o r u m) ， J C M 74 6 9 ( S . f e l i s ) ， C C M 3 5 7 2 ( S . g a l 1 i n a r um) ， AT C C 2 7
844 ( S . h o m i n i s ) ， AT C C 2 9 6 3 ( S . i n t e rm e d i u s ) , DM S 2 0 6 7 6 ( S . k l o o s i i ) ， A T C C 2
9 0 7 0 ( S . 1 e n t u s ) , AT C C 4 3 80 9 ( S . 1 u g d u n e n s i s ) , AT C C 1 5 3 0 5 ( S . s a p r o p h y t i c u s ) ， AT C C 4 3 8 0 8 ( S . s c h l e i f e r i s u b s p. s c h l e i f e r i ) ， J C M 74 7 0 ( S . s c h l e i f e r i s u b s p. c o a gu l a n s ) , AT C C 2 7 8 4 8 ( S . s i mu l a n s ) ， AT C C 2 7 8 3 6 ( S . wa r n e r i i ) , AT C C 2 9 9 7 1 ( S . x y 1 o s u s )
' ' ' '黄色ブドウ球菌以外のブドゥ球菌でメチシリン耐性の臨床分離株 ： S . h a e mo l y t i c u s , 1 0ネ禾 ； S . e p i d e rm i d i s . 1 0株 ； S . s c i u r i、 3株 ； S. c a p r a e , 2株 ； S. h o m i n i s、 2株 ； S. c ap i t i s、 1株 ； S. wa r ne r i、 1株
MR C - N Sの特異的検出法
MRC— N Sにも MR SAと同様の mecが挿入している。 しかし mecの 挿入部位周辺の染色体 D N Aの塩基配列は MR S Aのそれと異なってお り、 C— N Sの菌種に特異的な塩基配列である。 このことを利用して、 mec挿入部位を囲む塩基配列と mecの配列を組み合わせることにより、 M R C— N Sの特異的検出が可能となる。 MR C— NSについても、 前記 の MR S Aの特異的検出法と同様に、 PCR、 LCR、 hybridization, RT-PC R、 NASBA等の方法を用いて、 特異的に検出することができる。
以下、 本発明につき、 mec及び mec揷入 junctionを含んだ D N A断片を MRSA株からクローン化する実施例、 また M S S A株から mecの挿入部 位を含んだ DNA断片をクローン化する実施例などを記述し、 より詳細 に説明するが、 本発明はこれのみに限定されるものではない。
実施例 1
N315株からの mec領域 D N A (mec )および mecと MSSA染色体 D N Aの揷 入組み转ぇ連結部位（junction)を含んだ D N A断片 （上流、 下流の 2断 片） のクローン化及び MSSA標準株 NCTC8325からの mec挿入部位（int) を含 んだ染色体 D NA断片のクローン化。
1 ) 1 99 0年代の日本の MR S Aは、 コアグラーゼ 2型、 T S ST— 1産生型のものが、 日本全国で 70 %以上を占めている （Tae Tanaka e t al. J. Infect. Chemother. 1 ( 1 ), 40-49, 1995. ) 。 この流行型 MR SAと、 コアグラ一ゼ型、 リボタイブ （平松啓一 日本臨床 50, 333-33 8， 1992) が同一の MR S A臨床分離株 N315 (Keiichi Hiramatsu et al. FEBS Lett. 298, 133-136, 1991) を L-brothにて一夜培養したのち、 1 OmMtris lmMEDTA(pH8.0)に;'？遊させたのち、 ァクロモぺプチグ一ゼ処理 により溶菌後、 proteinaseK処理を行い、 その後、 フエノール抽出、 クロ ロフオルム抽出により染色体 D N Aを抽出した。 抽出した染色体 D N A を用いて、 plasmid 1 ibrary及び人 phage (え dash II) libraryを作製し た。
即ち、 染色体 D N Aを制限酵素 Sau3Alにて切断し、 9Kbから 20Kbの大き さのものを agarose gel電気泳動で精製して使用した。 plasmid library の場合には、 この Sau3Al断片 0.3 gと、 制限酵素 BamHlにて切断した pi asmid vector pACYC184 1.1〃 gとを 1 igationした後、 大腸菌 MC1061を 形質転換し、 colony hybridizationにより、 目的とするクローンを得た。 phage libraryの場合には、 この Sau3Al断片 0.3〃 gと BamHlにて切断した Adash II l gとを ligationした後、 in vitro packagingを行い、 大腸 菌 XU- blue MRA(P2)に感染させた後、 plaque hybridizationを行い， 目 的とするクローンを得た。 hybridization に用いたプローブは、 mecAを 最初のプローブとして用い、 得られた DNAクローンの末端部の塩基配列を 決定することにより、 次回のプローブを oliginucleotideの合成、 あるい は、 サブクローニングで得て、 さらに隣接する D N A領域を含むクロー ンを順次クローニングした （染色体 walking法） （第 1図） 。
2 ) このようにして、 mecA 遗伝子を含むクローン pSJlからはじめて、 p SJ2, pSJ4, pSJ5, pSJ7, pSJ8を得た。 これらの、 クローンをそれそれサ ブクロ一エングし、 10 61，2，3，4,5，6，7，8，9,10，11を得た。 これらのプ ローブを用いて、 MR S A 2 9株及び M S S A 9株より抽出した染色体 D N Aを用いて dot-blot hybridization法により、 それぞれのプローブ の反応性を検討した。 染色体 D NA、 200ngを 9 5 °C 5分熱処理したのち、 ナイ ロン膜上にスポッ ト し、 ジゴキシゲニンにて標識したブローブと反 応後、 抗ジゴキシゲニン抗体標識アル力リフォスファタ一ゼと反応させ、 発光基質 AMPPDを加えて検出を行った。 その結果 probe 1— 9は全く M S S A株とは反応せず、 probe 10ではじめて M S S A株と反応した。 この ことから、 probe 10が mecの上流 junction を含んだ DNA断片であるこ とが、 示された。
3 ) dedeoxy terminatioii法により、 autosequencer( Appl led biosystem 373A)を使用し、 probe 10の塩基配列を決定した。 sequence反応は DyeD eoxy Terminator Cycle Sequencing Kit 及び Dye primer Cycle Sequen cing Kitを用いて行った。
4 ) 次に、 mecの挿入部位を含んだ染色体 D N A領域を特定する目的で、 mecの上流端の M S S Aと反応する領域の D N Aプローブ probe 11 (第 1 図） を用いて、 MS S Aの染色体 D NA断片のクローニングを行った。 NCTC8325から抽出した染色体 DNAを制限酵素 Sau3Alにて切断し、 agarose gel 電気泳動で調製した 9kbから 20kbの D N A断片 0.3 gと BamHlにて切 断した人 dash Π 1 gとを ligationした後、 ノ、'ッケイジングを行い、 phage 1 ibraryを作製した o その後、 plaque hybridization法により、 陽 や生を示す、 plaque力 ら、 recombinant phage を回収した。
5 ) 上記 recombinant phage からサブクロ一ニングした D NAクロ一ン LD8325が、 probe 10と hybridi zationすることが dot - blot hybridizatio n法で確認された。 そこで、 制限酵素地図を作製したのち、 さらに、 mec の挿入部位を含んだ EcoIU- Pstl断片 （pLEla) のサブクローニングを行い、 その塩基配列を決定した。
6 ) LD8325のサブクローン pLElaの塩基配列 （pLEC12 reverse compleme ntary)と probe 10 の塩基配列 （pSJ8-2a)を比較すると、 mec挿入部位よ り左側の塩基配列は、 互いに高い相同性を示した （第 9、 10図） 。
7 ) 次に、 LD8325の mec挿入部位よ り右側に設定した primer J4と Nifを用 いて PCRで増幅した D NA断片をプローブ （probe N1) として、 N315の g enomic 1 ibrary¾ plaque hybridi zationでスク リーニングして、 N315me cの下流 junctionを aむ D N Aクローン LN4を得た。
8 ) mec挿入部位を含む LN4のサブクローン pLN2の塩基配列 （J3 reverse complementary)を决定すると、 このサブクローンの mec挿入部位より外 側の塩基配列は LD8325(pLEC12 reverse complementary)の intM及びその 上流部 （5'側） （第 4図） とほぼ同一の塩基配列を有していることが判明 した （第 11図） 。 このようにして、 N315の mecは、 M S S A染色体上のあ る特定の位置に挿入していることが示された。
実施例 2
日本以外の MR S A流行分離株として、 英国において世界で最初に報 告された MR S A臨床分離株 NCTC10442 (Jevons, M.P. Br. Med. J. 1, 124-125, 1961. )を用いて、 mec及びその挿入部位を含んだ染色体 D N Aをクローン化した。 即ち、
1 ) 上記 N315の場合と同様の方法を用いて、 mec及び上流部 junctionを含 んだクローン L02，L05, L07をクローン化し（第 2図） 、 その塩基配列を决 定した。
2 ) mec 上流 junctionを含んだサブクローン L02C4の塩基配列を N315の p SJ8- 2aの塩基配列と比較したところ、 mecの上流端の塩基配列は、 かなり 異なっていたが、 junctionの外側の M S S A染色体に相当する部分は、 pSJ8-2a と相同であった（第 12図） 。
3 ) そこで、 probeNlを用いて、 NCTC10442の phage library を plaque h ybridizationを用いてスク リーニングし、 mec下流の junctionを含むク口 —ン L021を得、 その塩基配列を決定した。
4 ) 第 13図に示すように、 mec junction より下流の M S S A染色体に相 当する領域では、 NCTC10442と N315では共通の配列が見られたが、 mec内 の下流断端部の塩基配列は IRの配列以外では、 相同性が見られなかった。
5 ) しかし、 NCTC10442mec junc i tonから上流側に約 200塩基遡った領域 に、 N315mec の下流断端部と相同の塩基配列が発見された （第 14図） 。
6 ) 以上から、 曰本及び英国、 1 9 8 2年と 1 9 6 1年という、 地理的、 時間的に大きく隔たたり、 しかもコアグラーゼ型などの疫学的マーカ一 も異なるふたつの MR S A株の mecが同一の揷入部位に揷入されているこ と、 さらに、 mec内の構造は異なるものの、 両者に共通の塩基配列を見出 し得ることが判明した。
7 ) しかし、 一方で、 mec領域 D N Aの構造は、 多様であることから、 有 効なブラィマーの設計は、 世界で蔓延している流行型の MR S A株のそ れそれについて、 mecの構造及び塩基配列を決定した後に本発明に記述さ れた考え、 手法にもとづき適宜実施する必要がある。
実施例 3
そこで、 日本以外の流行 MR S A分離株に関しても、 その mecの構造解 析を行った。 世界各国に最も広く蔓延している流行 MR S A株は、 コア グラ一ゼ 4型の MR S Aである （Keiichi HiramatsurMicrobiol . Inmun ol. 39(8)， 531-543, 1995.) 。 この M R S Aを代表する ドイ ツの分離株 85/3907を用いて mec及びその junctionを含んだ染色体 D N A断片をク口 ーン化した （第 3図） 。
1 ) probell及び probe N1を用いて、 85/3907の染色体 D N Aの plasmid libraryを colony hybridizationによりスク リ一二ングし、 反応する 2種 のクローン pSJ9、 pSJIOを得た。
2 ) これらクローンの塩基配列を决定したところ、 クローン pSJIOは、 i ntMと同一の塩基配列を含み、 N315, NCTC10442の mecの揷入部位に一致し て、 これら MR S A株の mecの下流末端部の塩基配列に相同の塩基配列が 見出された。 しかし、 85/3907の mec下流断端部の塩基配列は、 N315， NC TC10442のそれと異なっていた （第 15図） 。
3 ) もう一つのクローン pSJ9 (第 3図） の塩基配列は、 mecとの junction 部位を含んでいなかった。
4 ) そこで、 85/3907の phage libraryを用いて、 plaque hybridization により、 クローン pSJ9と反応する D N A断片をクローン化し、 さらにそ の D N A断片の端の塩基配列をプローブとして、 クローン LG12を得、 以 下同様の操作を繰り返して、 染色体 walkingを行った （第 3図） 。
5 ) これらのクローンは、 いずれも MSSA株 NCTC10442の染色体 D N Aとは、 dot-blot hybridization により、 反応しな力 つた。
6 ) そこで、 コアグラ一ゼ 4型の M S S A標準株である ATCC25923の染色 体 D N Aを抽出して、 上記クローンとの dot-blot hybridi zationを行つ たところ、 hybridization が陽性となった。 しかし、 上記クローンのう ち、 クローン LG12の右側の部分をプローブとすると、 hybridizationが陰 性となった。
7 ) LG12の塩基配列 LG12H2を决定すると、 N315, NCTC10442の me ]:流端 の I R塩基配列及び i nt Mの 31末端部に相当する j unc t i onに隣接した約 20塩 基に相同の配列が見出された以外には、 me cの内外でほとんど相同性がみ られなかった （第 16図） 。
8 ) 以上から、 mec が異なった MSSAの染色体上に挿入して誕生した明ら かに異なる起源の MR S A株があり、 少なく とも mec上流 junctionの外側
(左側） の MSSA染色体領域は、 起源の異なる MR S A株同士では大きく 異なることが判明した。
9 ) しかし、 mec下流 junctionの外側 （右側） では intMの塩基配列を含め、 調べた限りすベての MR S A株で保存されていた。
1 0 ) したがって、 mec junctionを囲んで P CR， L C R、 hybridizat ion用のブライマ一、 プローブを設計する際、 P CRの場合は、 mec側の 塩基配列としては N315, NCTC10442用のものと、 85/3907用のものとを別 々に設計する必要があることがわかった。 L C R、 hybridizationによる 場合は、 N315用， NCTC10442用， 85/3907用の 3種のプライマー、 プロ一 ブを用意しなければならない。
1 1 ) このように、 mec-MSSA染色体 juncitonを囲んだ PCR,LCR， hybridi zationによる MR S Aの同定は、 単に、 mecがいくつかの M R S Aにおい て同 の染色体挿入部位を持っているというだけの初期の知見 （Keiich i Hiramatsu:Microbiol. Immunol . 39(8), 531-543, 1995. ) からは、 実 現不可能であることが明かになった。
実施例 4
MR S Aの mecの相同性の検証
1 ) N315, NCTC10442, 85/3907のそれそれの mec領域をカバ一する D N A クローンをプローブとして、 世界 18力国 26株の流行 MR S A株の染色体 D N Aとの反応性を dot- blot hybridization 法で検索した。 100 ng/〃
1の染色体 DNA溶液と T10El(10mM Tris, ImM EDTA [pH8.0] )を等量混合し たのち， 9 5 °C 5分間加熱したのち、 冷却し 20XSSCを等量加えナイ口ン膜 に 4 1スポッ 卜する。 0.5N NaOH, 1.5MNaClにて変性後、 1.5M Tris (p H7.3), 1.5MNaCl, lmMEDTAにて中和した後、 ジゴキシゲニンにて標識し たプローブを用いて hybr i d i z at i onを行い、 抗ジゴキシゲニン抗体標識ァ ルカり フォスファタ一ゼを用いて検出を行った。
2 ) 表 2，3，4に示すように、 上記 3種の mecは、 お互いのプローブでほと んど検出されないことが判明した。
3 ) N315, NCTC 10442, 85/3907の各 mecプローブを用いることにより、 1 6株は、 上記 3種のいずれかの夕イブに分類されることが示唆された （表 2,3,4) 。 ¾ 2
N315株 roec MR S A株に於ける分布
Figure imgf000024_0001
1 PB. pcaicilUn-Dinding domain; MS. membrane-spanning domain
2 Romanはコアグラーゼ g
3 weak positive signal
4 NT: not tested ¾ 3
NCTC1044 mecの MR S A株に於ける分布 プロープ1
mecl mecRI mecA
Strain2 +++++- , - - - 7 , - - , - ,±±-+++ 6 4 3 2 1 PB MS
Π N315
ffl 10442 + + + + :- + + +
61/6291 + + + + - + + - , - - -± . -±+± + + + +
64/3846
64/4176 + + + +- -++ - - - +
86/4372
IV 86/961 ++++-------------+--++
86/560
85/1340
85/1762 + + +± +¾ - - ++ - ± - - -- ± . ±-++ +
85/2082
85/2111 -+ - - - , + + + + + + + + + + + + +- - -
85/2147
85/3907 + + + + 86/2652 + 85/5495
85/3619 + 85/3566 + 85/2235 + + 84/9580 + 86/9302 + 85/1940
IV 85/4231 +
85/2232 + 85/4547 + + +
1 PB, pentculin4>inaing domain; MS, mem rane-spuuung domain
2 Romwiはコアグラ一ゼ ¾
3 weak positive sigral 4
85/3907株 mecの M R S A株に於ける分布
Figure imgf000026_0001
1 PB, penicillin-bindinfi domain; MS, membrane-spanning domain 2 Rtwmnはコアグラーゼ fi
3 weak positive signal 実施例 5
N315 , NCTC 10442の mecの塩基配列に墓づき、 type2j， 3eの mecを検出す るためのプローブを常法により合成した。 プライマーを選定するための 塩基配列は、 N315の mecの右側 （下流） の I S431 (第 1図） から 下流 jun ctionにいたる mec領域の塩基配列 N315 I S-J3 (第 17図） 及び NCTC10442J3 rc (第 18図） をもとにして設計した。 以下は、 任意に選んだプライマーで, 同等のプライマーは、 上記塩基配列に基づいて、 数多く設計することが できる。 プライマ一の塩基配列と、 その位置を N315 I S- J3 (第 17図） の塩 基番 で示 "3■。
Nmec2 5 ' -GATAGACTAATTATCTTCATC-3' 229-249
Nmec3 5 ' -CAGACTGTGGACAAACTGATT-3' 507-527
Nmec4 5 ' -TGAGATCATCTACATCTTTA-3' 676-695
Nmec4-2 5 ' -GGATCAAAAGCTACTAAATC-3' 903-922
NiecS 5 ' -ATGCTCTTTGTTTTGCAGCA-3' 1504-1523
Nmec6 5' -ATGAAAGACTGCGGAGGCTAACT-3' 2051 -2073
実施例 6
85/3907の mecの塩基配列 pSJIO- 3J3rc (第 19図） に基づき、 type4eの m ecを検出するためのプローブを合成した。
Gmec l045 5' -ATATTCTAGATCATCAATAGTTG-3' 10-33
実施例 7
intM及びその上流の塩基配列 pLEC12 (pLECla ) (図 4) に基づき M S S A の染色体 D N Aを検出するためのプローブを合成した。
J3 5' -AAGAATTGAACCAACGCATGA-3' 1664- 1684
IntMl 5' -AAACGACATGAAAATCACCAT-3' 1389-1409
J7 5 ' -TCGGGCATAAATGTCAGGAAAAT-3' 1267- 1289
J6 5' -GTTCAAGCCCAGAAGCGATGT-3' 949-969 Nif 5' -TTATTAGGTAAACCAGCAGTAAGTGAACAACCA-3' 639-671
実施例 8
mecDNAプラィマーと mec挿入部の下流のプラィマーを組み合わせて PCRに より MRSAを検出するための予備実験
N315, NCTC10442の mecの塩基配列に基づき作製した type2j，3eの mecを 検出するためのプライマー 6稀:、 85/3907の mecの塩基配列に基づき作製 した type4eの mecを検出するためのプラィマー 2種と intM及びその J:流の 塩基配列に基づき M S S Aの染色体 D N Aを検出するために作製したプ ライマ一 6種を組み合わせてプライマー設定のための予備実験を行なつ た。 PCR法は 20〃 1から 1の反応液 （ 10 mM Tris-HCl pH8.3, 50 mM KC1, 1.5 mM MgC12, 0.001¾(w/v) gelatin, 200 M of dNTPs, 1.0 M primer, template DNA, 0.01 u/ ju 1 Taq DNA polymerase )中にて行つ た。 反応条件は 94°C 3 0秒、 55°C 1分、 7 2 °C 2分を 3 0サイクル繰り 返す系を使用した。 PCRは、 GeneAmp PCR System9600(Perkin Elmer)を用 いた。 PCR産物の検出には、 反応終了後 5microlを 0.8% agarose gel ele ctrophoresisに applyし、 泳動後、 0.1M ethidium bromide水溶液で 30分 染色食後、 transilluminaterでバン ドを検出した。
結果 1
表 5に示すように、 試験に供した ffi界各国の流行 MR S A株のすべて 力 s、 N315，NCTC10442の mecの塩基配列に基づき作製した Gmecl045と反応す るタイプと、 85/3907の mec の塩基配列に基づき作製した Nmec6と反応す るタイプのどちらかに分類された。 したがって、 上記 2種の mec の塩基 配列に基づき作製したブライマ一を用いることにより、 世界各国の MR S Aをすベて検出同定することが可能であることが示された。 ブライマ一の組み合わせ strains J7-N c6 J7-Gm cl04S
82 315 Japan
85/2235 U.S.A. + •
84/9580 Germany +
86/9302 U.K. +
85/1940 France +
10442 U. . +
61/6219 U.K. +
64/3846 U. K. +
νβο/4372 U. K. 十
ooyol U.K. +
ο Qθi/K3θtZfϋ U.K. + +
85/1340 Yugoslavia +
85/1762 Hungary +
85/2082 New Zealand +
85/2111 Norway +
85/1836 Germany +
85/3907 Germany +
86；2652 England
85/5495 Saudi Arabia +
85/3619 Austria +
85/3566 Holland +
85/4231 Canada +
85/2232 U.S.A. +
85/4547 Israel + 結果 2
プライマーは mecDNAプライマ一として Nmec2 , 3, 4， 4- 2， 5， 6を用い、 mec 挿入部の下流のプライマ一として J7，Nif，J6を用いた。 Nmecシリーズのプ ライマ一との組み合わせでは、 J7、 J6, Nif ともに反応が見られたが、 特に J6J7を用いた場合のシグナルが強かった。 また、 Gmecl045と M S S A側のプライマ一の組み合わせの実験では、 いずれも強いシグナルが得 られた。
すなわち、 J7と mecDNAプラィマー Nmec2， 3，4， 4-2， 5， 6の組み合わせでは、 それそれ 2500， 2300， 2100， 1900, 1300、 700bpのバン ドが PCR産物の agarose 電気泳動で観察され、 Nifと mecDNAプラィマー1^602,3,4，4-2，5，6の組み 合わせでは、 それそれ3200，2900，2700，2500,1900,140(^ のバン ドが検出 された。 また J6と mecDNAプラィマ一 Nmec2， 3,4, 4- 2， 5， 6の組み合わせでは、 それそれ 2800，2600,2400,2200， 1600, lOOObpのバン ドが検出された。
MRSA株 85/3907の DNAを用いた実験では、 以上のどの組み合わせでも PC R産物は増幅されず、 mecDNAプライマ一として、 Gmecl045を用いた場合 P CR産物が検出された。 すなわち、 Gmecl045と mec挿入部の下流ブライマー として Nif，J6，J7，intMl, J3の組み合わせで、 それそれ、 1300,1000,700， 600,300bpのバン ドが鼋気泳動により検出された。
実施例 9
混合するのに適したブラィマ一の組み合わせを設定するための実験
次に、 2種の mecのブラィマーと 1種の MSSA側ブラィマ一を混合した場 合の検討を行った。 PCRの条件は実施例 8と同様である。 すべての MRSAを 一度の PCRで検出するために、 mec揷入部の下流のプライマーとしては J7， Nif，J6から一つ用い、 mecDNAプライマーとしては、 85/3907の mecDNAと反 応する mecDNAブラィマ— Gmecl045と、 N315，NCTC10442夕ィプの mecDNAと 反応する mecDNAブラィマー '111602，3,4，4-2,5，6のぅち一つを選び、 3種の プライマーを混合して、 N315と 85/3907の DNAをテンプレートとして用い て PCRで増幅した場合、 最も多くの産物が検出される組み合わせを検討し た。
結果
Gmecl045と、 J7, Nif, J6 のそれぞれの組み合わせに、 Nmecシリーズ のプライマーを組み合わせたところ、 Gmecl045と J6を使用した場合、 Nm ec4，3,2のブライマ一を加えたときのシグナルがやや減弱した以外には、 良好なシグナルが得られた。 しかし、 同じ組み合わせで Ninec6，5，4-2を使 用した場合には、 むしろ他の組み合わせよりもシグナルが強かった。
すなわち、 N315の DNAをテンプレー ト とした場合、 J7，Gfflecl045，（Nmec2, 3，4,4-2,5,6)の組み合ゎせでは6 1^(1111111 bromideで agarose gelを stain ingしたところいずれも明瞭な PCR産物が検出された。 ところが Nif，Gmec 1045，（1½602,3，4，4-2，5，6)の組み合ゎせでは、 Nmec5，6のブライマ一を用 いると強いバン ドが検出されたが、 Nmec3，4，4- 2のブラィマーではバン ド が弱く、 Nmec2を用いるとバン ドが検出されなかった。 さらに J6，GmeclO 45，（^6(；2，3,4，4-2，5,6)の組み合ゎせでは^606では弱ぃバン ドか検出さ れ、 Nmec2,3，4ではバン ドが検出されず、 Nmec4- 2, 5では強いバン ドが検 出され、 とくに Nmec5では全組み合わせのうち最も強いバン ドを確認した, このことから、 ブライマ一の混合によっては十分な結果が得られず、 慎 重な optimizationが重要であることが証明された。 これらの結果から、 ブラィマーの組み合わせは、 J6，Gmecl045,Nmec5が最適であつた。
実施例 1 0
MRSAの PCRによる検出法の特異性の検証
実施例 9の結果を踏まえて、 J6， Gmecl045, Nmec5のブライマーを組み 合わせて、 PCR法で、 MRSA、 MSSA、 mec を有する、 及び mecを有しない黄 色ブドゥ球菌以外のブドゥ球菌株の臨床分離株を用いて、 その有効性を 検証した。 臨床分離 MRSA26株、 MSSA11株、 C-NS標準株 25株、 臨床分離 MR C- NS20株の DNAをテンプレート として、 PCR反応を行った。 プライマ一は J6，Gmecl045,Nmec5の 3種を混合して用いた。 ブラィマ一は次の 3種の混 合で、 mec側は Gmecl045と Nmec5、 M S S A側は J6を用いた。 PCR法は 20 1から 50〃 1の反応液 （10 niM Tris-HCl pH8.3， 50 niM C1, 1.5 mM Mg C12, 0.001¾(w/v) gelatin, 200 M of dNTPs, l.O^M primer, tempi ate DNA, 0.01 u/ j 1 Taq DNA polymerase )中にて行った。 反応条件は 9 4 C 3 0秒、 55°C 1分、 7 2 °C 2分を 3 0サイクル繰り返す系を使用した。
この結果をまとめたものが表 1である。 世界各国の MRSAは、 いずれも 陽性のシグナルを示し、 MSSAはすべて陰性。 黄色ブドウ球菌以外のブド ゥ球菌は、 niec の保有、 非保有に関わらず、 すべて陰性であった。
すなわち、 MRSA株すべてで明瞭なバン ドを検出し、 その大きさは、 1. 6kb(N315タイフ。）のものが 8株、 1.5kb(NCTC10442タイプ）のものが 5株、 lkb (85/3907タイプ）のものが 13株であった。 この結果から、 MRSAは全て検出 され、 しかもそのバン ドサイズにより、 3種類の MRSAのタイプを決定す ることもできることが示された。 MSSA株、 C-NS、 MRC-NSの各株では、 全 くバン ドが検出されず、 この検出法の MRSA特異性が示された。
実施例 1 1
RT-PCR法による MRSAの特異的検出
MRSA、 MRC- NS及び MSSAの臨床分離株を用いて、 各株の全 R N Aを抽出し、 RT-PCR法で D N Aに変換し、 遺伝子を検索した。 検出のためのプローブ は実施例 5の Nmec4-2, Nmec5、 Nmec6、 及び実施例 6で使用した Gmecl045そ して実施例 7の IntMlを用いた。
臨床分離株は、 MSSA(mec-)として ATCC25923株、 NCTC8325株、 MRSA(mec + )として N315株、 NCTC10442株、 及び 85/3907株、 MRC-NSとして S.haemo lyticus株 SH518, SH631' S. epidermidis株 G13を用いた。 各菌株を LB培地でー晚培養して得られた菌体を遠心回収後、 PBSで洗浄 し、 lmlRNase free PK/SDS溶液（200〃 g/ml， ProteinaseK, 0.5 SDS， lOmMT ris-HCl,pH8.0,lmMEDTA(pH8.0),100mM ( 1)に¾濁し 5 5°C、 60分ィ ンキュベー卜 した。 次に、 phenol/chloroform/isoamylalcohol(50/49/l ) 抽出し、 さらに chl/IAA(49 ）抽出し、 ついでエタノール沈殿させ、 ペレ ッ トを 7 5 %エタノールでリ ンス し、 風乾後、 2 0 1の nuclease free -waterで溶解した。 このようにして得られた全 RN Aを DNaseで処理した ( 3 7 °C , 6 0分） 。 反応終了後、 DNaseを失活させ、 phl/chl/lAA抽出、 chl/IAA抽出、 ついでエタノール沈殿させ、 ペレヅ 卜を 1 0 1の micle ase free-waterで溶解した。 次に、 得られた全 R N Aを 9 5 °C、 2分加 熱後、 氷上にて急冷し、 RTbuffer ( 2 0 1反応/サンプル） を加え、 逆転写反応を行い c D N Aを得た。 ついで Thermal Cyc ler(TAKARA MP T P3000)にて 2 5 ° (、 1 0分、 3 7° (、 6 0分、 及び 9 0°C、 5分反応 後、 常法により P C R反応を行った。
PCRで MRSAを特異的に検出するには、 forward primerとして N315，NCT C10442用のものと、 85/3907用のものを組み合わせる必要があり、 まず M RSA検出用として # 393(Nmec5)および 347(Gmecl045 )を用いた。 同様 に MSSA検出用の primerとして、 #210( junl )および ：： 351(25923-1 )を組 み合わせた。 Reverse側には intM内の primerから、 212( jun3)を用い た。 尚、 jun3 primerから mec挿入部位までの距離は primer(21 mer)を含 めて 193 bpである。 プライマ一名 濃度 Target (strain)
Figure imgf000033_0001
① #210 Junction 1 ( junl ) 82.1 MSSA(NCTC8325)
② #260 10442-J-3-l(Nmec6) 92.0 MRSA(N315,NCTC10442) ③ 30 lS431-right 7 - 2(Nmec4 - 2 ) 138.4 MRSA( N315 , NCTC10442 )
④ #347 pSJ10-4-5(Gmecl045) 67.9 MRSA(85/3907)
⑤ #351 25923-1 266.8 MSSA( ATCC25923 )
⑥ #393 lS431-right 5-new(Nmec5) 128.6 MRSA(N315,NCTC10442
PCR の反応条件は以下に示した通りで、 forward primerを 2種用いた。 Template量は、 RT反応開始時の total RNA量（ l〃g /20〃1)から計算し て 50ngに相当する RT反応液量（ 1 1 )を取り、 50 1の PCR反応系に加えた
く PCR反応液 [ MRSA ]>
Contents Volume/ 1 sample Final cone,
Water( nuclease free, S I GMA ) 42.4 fi \
10 x PCR buffer(with MgCl TAKARA)* 5.0 1 x
20mM dNTPs (TAKARA) 0.5 UL \ 200 M forward primer
67.9/iM Gmecl045 0.4 p.1 540 nM
128.6 zM Nmec5 0.2 μ.1 510 nM
84.3 M reverse primer jun3 0.3 fi 1 510 nM
5 U/ 1 Taq DNA Polymerase (TAKARA) 0.2 1 1 U/50/ 1 RT product (cDNAj_ template )_ 1.0 ji 1_
Total 50.0 fi 1 く PCR反応液 [ MSSA ]>
Contents Volume/ 1 sample Final cone, Water (nuclease free, SIGMA) 42.6 UL \ - 10x PCR buffer( ith MgCl ,TAKARA)* 5.0 1 1
20mM dNTPs (TAKARA) 0.5 j l 200 M forward primer
82.1 M junl 0.3 j \ 490 nM
266.8 M 25923-1 0.1 1 530 nM
84.3〃M reverse primer jun3 0.3 j 1 510 nM
5 1 Taq DNA Polymerase (TAKARA) 0.2 ju 1 1 U/50〃l
RT product (cDN A; template) _ 1.0 1
Total 50.0 PL \
* lOx PCR buffer ;100mM Tris-HCl (pH 8.3)，500mM KCl,15mM MgCl2
Templateを除く試薬（reaction mixture)を調製混和後、 50 1の軽質流 動パラフ ィ ン（TOYOBO)を予め分注しておいた 0.5ml PCR tubeに 49〃1ずつ 分注し、 最後に以下の templateを各 1 1加え tappingで撹拌、 flush d ownした後、 Thermal Cycler MPにセッ ト して PCR反応を開始した。 尚、 P CRの negative control (こ（ま waterを、 MSSA - PCRpositive control (こ（ま plasmid pLECla DNA (約 500ng/ 1 )を waterで 100倍希釈し、 その 1〃 1 (約 5ng)を用いた。
Template RTase Template RTase
① ATCC 25923 (MSSA) ⑦ NCTC 10442 (MRSA) 一
② ATCC 25923 (MSSA) + ⑧ NCTC 10442 (MRSA) +
③ NCTC 8325 (MSSA) ⑨ 85/3907 (MRSA) 一
④ NCTC 8325 (MSSA) + ⑩ 85/3907 (MRSA) +
⑤ N315 (MRSA) ⑪ Water (PCR negative control ) ⑥ N315 ( MRSA ) + ⑫ pLECla(PCR positive control)
Denaturation at 94。C for 30 sec.
Primer anneal ing at 50°C for 1 miri.
Chain e longati on ( extension) at 72 "C for 2 min. 上記反応温度で 30サイクル反応を繰り返した後、 泳動時まで増幅産物 を 4°Cに保存した。 増幅産物の確認
PCRによって得られた増幅産物について、 2%ァガロースゲル電気泳動 にて確認を行った。 ゲルは 0.5XTBE (44.5mM Tris, 44.5mM Borate, 1 nM EDTA)に 2%のァガロース（SeaKemGTG agarose, FMC)を加えた後ォー トクレーブにて溶解して調製し、 サブマリン型小型電気泳動装置（Mupid - 2, C0SM0BI0)の gei makerにて作製した。 増幅産物（ 50〃 1 )から 1/5量 に相当する 10 1を取り、 2 1の dye (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, ImM EDTA, 30% glycerol )を加えた後 wel 1にアプライ し、 0.5XTBE buffer中 100V，45分泳動した。 Size markerには 100bp DN A Ladder( 100-1500 bp + 2072bp, 1 ig// 1 , GIBCO BRL)を 0.5 1用いた ( 泳動終了後、 ゲルを 0.5〃g/mlの ethidium bromideを含む TBE bufferに 浸し室温下で 20分染色した後、 UV トランスイルミネ-夕一上で増幅断 片を確認すると共に、 ポラロイ ド撮影装置（Polaroid MP4 / type 667 f ilm)にて撮影した。
増幅産物の一部を 2%ァガロースゲル電気泳動した結果、 MRSA/MSSA 検出 PCRのいずれにおいても RTase freeの templateでは増幅産物が認め られず、 RTase存在下でのみ mRNA由来の増幅産物が認められた。 従って、 得られた増幅産物は全て逆転写によつて mRNAから合成された cDNA由来の ものであることが確かめられた。 MRSA検出用 PCRでは MSSA 2株では増幅 産物は認められず、 MRSA 3株において長さの異なる増幅産物（N315(906b p) >NCTC10442(804bp > 85/3907( 361bp)が得られた。 一方、 MSSA検出用 PCRでは MRSAでは増幅産物は認められず、 MSSA 2株においてのみ長さの 異なる増幅産物（AGTC25923 > NCTC8325 )が得られた。 また、 PCR positi ve control(pLECla)については MSSA検出 PCRにおいてのみ認められ、 pL ECla の sourceである NCTC8325 と同じ大きさの増幅産物が得られた。 以上の結果から、 MRSA特異的検出に必要な mec領域の mRNAが MSSAでは 認められず、 MRSAでのみ発現していることが確認された。
実施例 1 2
NASBAによる MRSAの特異的検出
MRSA MRC- NS及び MSSAの臨床分離株を用いて各菌株の全 RN Aを抽出し、 ついで NASBAにより RNAを増幅した。 増幅用のブライマ一及び検出用の プローブは以下のように設計した。
forward primerとして
N315(MRSA) NCTC10442 5' -GAAAGAGGCGGAGGCTAA-3'
85/3907 δ' -CATCTAAACATCGTATGA-3'
reverse primerとして
各菌株の I n t M領域の
3' -AAACGGGAACCCAGTACGCA-promotor-5'
検出用のプローブとしては各菌株共通で IntM領域塩基配列を基に以下の ように設計した。
捕捉用として
5' -GCTGAATGATAGTGCGTAGTTAC-3' (A)
検出用と して 5' -TGAAGACGTCCTTGTGCA-3' (B)
又は捕捉用として
5' -TGAATGATAGTGCGTAGTTACTGCG-3' (C)
検出用として
5' -TCATTTGATGTGGGAATGTG-3' (D)
を設計した。
臨床分離株は、 MSSA(mec-)として ATCC25923株、 NCTC8325株、 MRSA(me c+)として N315株、 NCTC10442株、 及び 85/3907株、 MRC- NSとして S.haemo lyticus株 SH518、 SH631、 S. epidermidis株 G3を用いた。
各菌株を LB培地で一晩培養して得られた菌体を実施例 1 1 と同様の方 法にて全 RN Aを回収した。 本 RNAを水にて 1 ◦段階希釈（lpg/ l-l g/^1)してサンブルの調製後、 以下に示す NASBA-dot hybridizatio n法を行った。
1. 溶出
1 ) サンプル 0. 5 m 1を溶出 buffer tubeに入れ、 数回撹拌する。
2 ) tube を遠心する （ 1， 5 0 0 X g, 1 5秒） 。
2. 分離
1 ) tubeにコン 卜ロール^ i (system control solution 2 0 1カ[]ぇて、 遠心する。
2 ) 各 tubeにシリ力懸濁液 7 0 1を加えて撹袢し、 室温 （ 1 5 - 3 0
°C) 、 1 0分間放置後、 2分毎に撹拌する。
3 ) 各 tubeを遠心する （ 1， 5 0 0 X g, 2分） 。
4 ) 上清を棄てる。
5 ) シリカ粒子を再! !f;濁した後、 遠心して上清を除去後、 wash buffer, 7 0 %E t O H ( 2回） 、 アセ トンで 4回洗浄、 遠心する。
6 ) シリカペレッ トを乾燥させる （ 5 6 °C、 1 0分） 。 7 ) 溶出液 1 0 0 ^ 1を加え、 再懸濁、 撹拌して （ 5 6 ° 1 0分） 、 核酸を溶出させる。
8 ) 心する （ 1 0 , O O O X g , 2分） 。
3. 増幅
1 ) 核酸上清液 8 1にプラ イ マ ー 1 5〃 1を加え、 6 5° (：、 5分反応 させた後、 4 1 ° (：、 最低 5分間反応液を冷却する。
2 ) 酵素液 2 1を加えて、 反応させる （ 4 1 °C、 最低 5分間） 。
3 ) tubeを検出室に移し、 軽く撹拌し、 4 1 ° (：、 9 0分間反応させる。
4. 検出
1 ) 3— 3 ) の反応液を 1 0倍程度に希釈し、 1〃 1を Hybound N+blott ing membrane ( Amersham社製) に滴下し、 それを 0. 6 NN a O H に 浸したろ紙上に 5分間のせた後、 5倍希釈の SSC液で洗浄、 中和する。 ろ 紙上で水分を切り、 Hybridization bufferで 5 0 °C、 1 5分振とう加温 し、 Hybridization buffer 1 m 1に ALP probe 1 /1加ぇたプ13——ブ液 に入れて 5 0°C、 1 5分振とう加温した。 2XSSC/ SDS液にメンブランを 移し、 50° (：、 1 5分振とう加温後、 室温で lXSSC/0.5 ritonX、 そして 1XSSC液にそれそれ 1 5分、 5分振とう加温したメンブランを発色液と 3 7°C、 1 0〜 6 0分反応させ、 そのメンブランを純水で振とう洗浄した 後、 ろ紙上で、 水分を切り、 乾燥させ、 発色を観察した。 結果を表 6に 示す。
表 6 ブドゥ球菌 フ0ロ-" A (捕捉用） フ。ロ-フ" B (捕捉用
フ0 D-rB (検出用） フ。 ϋ- Γ'Α (検出用
MSSA
1) ATCC25923 +
2) NCTC8325
MRSA
1) N315 + +
2) NCTC10442 + +
3) 85/3907 + +
MRS-NS
1 ) S.haemolyticus
SH518
2) S.epidermidis
G3
+ ； 明瞭な発色 士 ； 不明瞭な発色 — ； 発色を認めず 実施例 1 3
P C Rを用いたメチシリ ン耐性 S.haemolyticusの特異的検出
第 6図の M R S .haemolyticusの niec揷入部の右側 （mecAの下流） の特 異的な塩基配列をもとにプライマ一 intMhを作製した。
intMh: δ' -GATCAAATGGATTGCATGAGGA-3' (第 6図の 236-260塩基番号に 相当）
このプライマーと実施例 5の mec特異的ブラィマーを組み合わせて P C R反応を行うと、 メチシリ ン耐性 haeraoiyticus株 SH518、 SH631等 1 0株 では、 Nmec2、 Nmec3、 Nmec4、 Nmec4 - 2、 Nmec5、 Nmec6との組み合わせで、 それぞれ 2100、 1800、 1700、 1400、 850、 300bpのバン ドが検出されたが、 MR S A、 M S S A、 メチシリ ン感受性 C— N Sの標準株および臨床分 離株では全くバン ドが検出されなかった。
実施例 1 4
P C Rを用いたメチシリ ン耐性 S.epidermidisの特異的検出
第 6図の MR S .epidermidisの mec揷入部の右側 （mecAの下流） の特異 的な塩基配列をもとにプライマ一 intMeを作製した。
intMe: 5' -TCTTCAGAAGGACTCGCTAA-31 (第 6図の 318- 337塩基番号に相 当）
このプライマーと実施例 5の mec特異的ブラィマーを組み合わせて P C R反応を行うと、 メチシリ ン耐性 epidermidis株 G3等 1 0株では、 Nmec2、 Nmec3、 Nmec4、 Nmec4-2, Nmec5、 Nmec6との組み合わせで、 それそれ 220 0、 1900、 1800、 1600、 900、 400bpのバン ドが検出されたが、 MR S A、 MS S A, メチシリ ン感受性 C一 N Sの標準株および臨床分離株では全 くバン ドが検出されなかった。 以上より、 mecの下流端部分に 2種のプライマーを合成し、 intM内ある いは、 その 5， 側にもう一つのブライマーを合成すれば、 P C Rを用い て、 世界の主要な MR S A臨床分離株の raec のほとんどが、 検出され、 しかも、 この方法では、 mecを持つ黄色ブドウ球菌以外のヒ トの常在ブド ゥ球菌の混入があっても、 偽陽性を生じないことが実証された。 産業上の利用可能性
本法を用いて臨床検体からの超迅速 MR S Aおよび MR C— N S同定 のための条件設定を行えば、 従来の公知の技術の範囲内で、 痰、 血液、 尿、 滲出液、 などの検体から、 直接、 3 0分一 1時間以内に、 MR S A を検出することが可能である。 この方法は、 患者検体からベッ ドサイ ド で MR S A同定をおこなうことにより、 有効な化学療法剤の選択と MR S Aおよび MR C— N S感染症の早期治療が可能となる。 また、 この方 法は、 医療従事者などの健康者の MR S Aの保菌検査にも応用できるた め、 院内感染の勃発を未然に防ぐための検査としても有用である。

Claims

nF3 求 の 範 囲
1. M R S A (methici 11 in-resistant Staphylococcus aureus) または M R C - N S ( methici 11 in-resistant coagulase-negative staphyloc occi) の染色体上に存在し mecA gene を担う外来性の挿入 D N Aである mecD N Aの一部と、 その挿入 D N Aを囲む染色体 D N Aの塩基配列の一 部を併用して、 検体と反応操作を行うことを特徴とする M R S Aまたは MR C— N Sの診断方法。
2. mecD NAの -部とそれを囲む染色体 D N Aの塩基配列の一部をブラ イマ一として用い、 検体中の mecとそれを囲む染色体 D N Aの連結部位 （ junction) を含んだ D N A断片を polymerase chain reaction (PCR)法に より増幅させることにより、 MR SAまたは MR C— N Sと同定するこ とを特徴とする請求の範囲第 1項記載の診断方法。
3. mecD N Aの一部とそれを囲む染色体 D N Aの junctionを囲んで D N A断片を 2つ作製し、 ligase chain reaction (LCR)法により検体中の D NAを増幅させることにより MR S Aまたは MR C— N Sと同定するこ とを特徴とする請求の範囲第 1項記載の診断方法。
4. mecD N Aの一部とそれを IIむ染色体 D N Aの junctionを囲んで一本 鎖あるいは二本鎖の D N A断片をプローブとして作製し、 検体中の D N Aと hybridizationを行うことによ り MR S Aまたは MR C -N Sを同定 することを特徴とする請求の範囲第 1項記載の診断方法。
5. mecの上流断端部分の塩基配列が pSJ8-2a (図 9、 10の塩基配列） 、 L 02C4 (図 12の塩基配列） もしくは LG12H2 (図 16の塩基配列） の一部また はそれらの reverse complementaryの塩基配列または作用のかわらない程 度に他の塩基に置換された配列である請求の範囲 1〜 4のいずれか 1項 記載の診断方法。
6. mecの下流断端部分の塩基配列が N315IS-J3 (図 17の塩基配列） 、 NC TC10442J3rc (図 18の塩基配列） も しくは pSJIO- 3J3rc (図 19の塩基配列） の一部またはそれらの reverse complementaryの塩基配列または作用のか わらない程度に他の塩基に置換された配列である請求の範囲 1〜4のい ずれか 1項記載の診断方法。
7. mecD N Aを囲む染色体 D N Aの塩基配列が下記の配列も しくはその reverse compiementayの塩基配列の一部または作用のかわらない程度に 他の塩基に置換された配列である請求の範囲 1〜 4のいずれか 1項記載 の診断 法。
pLEC12(pLECla) (図 4の塩基配列） 、
N315J3rc (図 11の塩基配列） 、
NCTC10442J3rc (図 18の塩基配列） 、
pSJ10-3J3rc (図 19の塩基配列） 、
図 5の塩基配列、
図 6の塩基配列、
pSJ8-2a (図 9、 10の塩基配列） 、
L02C4 (図 12の塩基配列） 、
LG12H2 (図 16の塩基配列） 。
8. メチシリ ン感受性黄色ブドウ球菌 （ M S S A ) またはメシチリ ン感 受性 C— N S (MS C— N S ) 染色体における mecD N Aの挿入部位を囲 む染色体 D N Aの塩基配列を用いて検体との反応操作を行い、 mecD N A が挿入している場合、 陰性となることを利用した PCR、 LCRまたは hybrid izationによる MR S Aまたは MR C - N Sの診断方法。
9. mec 挿入部位を含んだ、 または mec 挿入部位を囲んだ D N A断片を ブラィマーとして用い、 検体 D N Aに mecが挿入されているため PCR法に より D N A断片が増幅されないことによって MR S Aまたは MR C— N Sと同定することを特徴とする請求の範囲第 8項の診断方法。
1 0. mec 挿人部位を含んだ、 または inec 挿入部位を囲んだ D N A断片 を 2つ作製し、 検体 D N Aに mecが揷入されているため ligase chain re action (LCR)法により D N A断片が増幅されないことによって MR SA または MR C— N Sと同定することを特徴とする請求の範囲第 8項の診 断方法。
1 1. mecの挿入部位を含んで一本鎖あるいは二本鎖の D N A断片をプロ —ブとして作製し、 検体中の D N Aと hybridizationを行うことにより、 mecが挿人した場合、 hybridizationが陰性となることにより MR S Aま たは MR C— N Sを同定することを特徴とする請求の範囲第 8項の診断 方法。
1 2. mec 挿入部位を含んだ、 または mec 挿入部位を囲んだ D N A断片 が以下の塩基配列の--部もしくはその reverse complementaryの塩基配列 または作用のかわらない程度に他の塩基に置換された配列を使用する請 求の範囲 8〜 1 1のいずれか 1項記載の診断方法。
pLEC12(pLECla) (図 4の塩基配列） 、
pSJ8-2a (図 9、 10の塩基配列） 、
L02C4 (図 12の塩基配列） 、
LG12H2 (図 16の塩基配列） 、
図 5の塩基配列。
図 6の塩基配列、
1 3. 検体中の DN Aが、 ブドウ球菌菌体中から抽出した RN Aを逆転 写酵素で D NAに変換したものである請求の範囲 1〜 1 2のいずれか 1 項に記載の方法。
1 4. 検体が、 ブドウ球菌菌体中から抽出した RN Aを N A S B A (nu cleic acid sequence-based amplification) により増幅させて得た RN Aであることを特徴とする請求の範囲 1 〜 1 2のいずれか 1項に記載の 方法。
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