DE4338119A1

DE4338119A1 - Spezifische Gensonden und Verfahren zum quantitativen Nachweis von methicillinresistenten Staphylococcen

Info

Publication number: DE4338119A1
Application number: DE4338119A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr Springer; Rainer Dr Endermann
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1993-11-08
Filing date: 1993-11-08
Publication date: 1995-05-11
Also published as: WO1995013395A1

Description

Seit Mitte der siebziger Jahre nahm der Anteil an methicillinresistenten Stämmen bei Staphylococceninfektionen von wenigen Prozenten bis auf 70% deutlich zu. Während das Auftreten dieser Stämme zunächst nur auf große Universitätskliniken beschränkt war, findet man heute diese resistenten Stämme auch immer häufiger in Krankenhäusern der Grundversorgung (Paul et al., Abstr. 23 ICAAC (1991)).

Methicillinresistente Staphylococcen sind wichtige nosokomiale Erreger. Sie sind verantwortlich für schwere postoperative Wundinfektionen, Bakteriämien und Infektionen, die von in den Körper eingebrachten Fremdmaterialien, z. B. Kathe dern, ausgehen.

Von besonderer klinischer Bedeutung sind methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) und Staphylococcus epidermidis (MRSE) während Staphylococcus hämolyticus Infektionen nur gelegentlich auftreten.

MRSA/MRSE sind gegen alle β-Laktamantibiotika, wie Penicilline, Cephalospo rine, Peneme und Carbapeneme resistent. 80% der MRSA/MRSE Stämme be sitzen auch Resistenzen gegen andere Antibiotikaklassen wie Makrolide, Amino glykoside und Chinolone.

Es ist deshalb besonders wichtig möglichst frühzeitig eine Therapie mit dem wirk samen Antibiotikum einzuleiten. Die Alternativen für die Therapie von Infektionen mit methicillinresistenten Staphylococcen sind auf wenige Antibiotika beschränkt. Vankomycin ist das Antibiotikum der Wahl. Ein anderes Glycopeptidantibiotikum, Teicoplanin, wurde kürzlich erst eingeführt. Eine weitere Therapiemöglichkeit ist die Kombination von Antibiotika wie Ciprofloxacin mit Rifampicin.

Die klassische Diagnostik der MRSA/MRSE ist zeit- und arbeitsaufwendig und er fordert die in vitro Kultivierung der Stämme auf Platten mit anschließender phy siologischer Identifizierung mit Hilfe von Testsystemen wie z. B. "api staph" (BioM´rieux) und Bestimmung der Antibiotikaresistenzen durch Reihenverdün nungsteste (MHK-Werte) oder Agardiffusionsteste (Hemmhofteste).

Methicillinresistente Staphylococcen besitzen im Gegensatz zu den in sensitiven Stämmen vorhandenen Penicillin Bindeprotein-Genen ein zusätzliches sogenanntes mec A Gen, das für das Penicillin-Bindeprotein PBP2a codiert. Dieses PBP2a hat eine äußerst geringe Affinität für alle β-Lactamantibiotika und ermöglicht deshalb als Transpeptidase die Zellwandsynthese in Gegenwart von β-Lactamkonzentra tionen, die alle anderen PBPs inhibieren (Neu, Science 257, 1064 (1992)).

Da dieses mec A Gen in allen Methicillin-resistenten Staphylococcen vorhanden ist und die Homologie zwischen den verschiedenen mec A Genen sehr hoch ist, bot es sich an auf der Basis dieses Gens eine DNA-Schnell-Diagnostik mit spezi fischen Gensonden kombiniert mit bekannten DNA- oder RNA-Applikationsver fahren zu entwickeln.

Die vorliegende Erfindung beschreibt spezifische Oligonukleotid- und Polynukleo tidsonden und ihre Verwendung zum schnellen Nachweis von methicillinresisten ten Staphylococcen direkt im klinischen Probenmaterial.

1. Die Gensonden wurden aus der Gensequenz des mec A Gens durch chemi sche Synthese (Oligonukleotid-Sonden) oder PCR-Klonierung (Polynukleo tid-Sonden) hergestellt.
Die bevorzugten Gensonden wurden aus einem Bereich ausgewählt, der
- a) spezifisch für methicillinresistente S. aureus und S. epidermidis ist
- b) in anderen Penicillin Bindeprotein-Genen nicht vorkommt und
- c) alle methicillinresistenten Staphylococcen mit MHK-Werten zwi schen 4 bis 120 µg/ml eindeutig erfaßt.
2. Die genomische DNA von methicillinresistenten Staphylococcen wurde durch an sich bekannte Verfahren, die für Staphylococcus adaptiert wurden, isoliert.
3. Die Applikation von Teilen des mec A Gens wurde durch spezifische Primer aus dem kodierenden und nicht kodierenden Strang des mec A Gens unter gleichzeitiger Markierung des Amplifikationsproduktes mi Digoxi genin-dUTP mit Hilfe bekannter Amplifikationsmethoden, bevorzugt der PCR-DNA-Amplifikationsmethode (EP 200 362) oder der HAS-RNA-Am plifikationsmethode (EP 427 074) durchgeführt.
4. Der Nachweis des spezifischen Amplifikationsproduktes erfolgte durch Hy bridisierung des Amplifikationsproduktes mit den obengenannten, biotiny lierten Gensonden. Dadurch wird mit einem Nachweis von 10 Keimen eine signifikant höhere Sensitivität erreicht als durch direkten Nachweis des Amplifikationsproduktes im Gel, bei dem maximal 10³ Keime nachge wiesen werden.
5. Der Hybridisierungskomplex wird mit Streptavidin gekoppelten magneti schen Partikeln separiert.
6. Die Auswertung des gebildeten Hybridisierungskomplex als Maß für die Menge oder das Vorhandensein von methicillinresistenten Staphylococcen erfolgt durch einen Chemilumineszenztest mit Antidigoxigenin-Antikörpern die mit alk. Phosphatase gekoppelt sind (PCR) oder durch DNA/RNA- Antikörper, die mit alk. Phosphatase gekoppelt sind (HAS-Amplifikation).

Die Auswertung kann bei Verwendung eines externen mitamplifizierten Staphylococcen-DNA-Standard semiquantitativ zur Ermittlung der Menge an methicillinresistenten Staphylococcen im klinischen Probenmaterial eingesetzt werden.

Die Gensonden-Diagnostik insbesondere in Verbindung mit Amplifikationstechni ken ist eine schnelle, spezifische und hochempfindliche Methode, die eine Früher kennung der Erreger auf DNA/RNA Ebene ermöglicht. Die Technik kann direkt ohne in vitro Kultivierung im Untersuchungsmaterial durchgeführt werden. Sie basiert auf der DNA/RNA Hybridisierungstechnik, d. h. der spezifischen in vitro Bindung von komplementärer Einzelstrang-Nukleinsäure unter Bildung von Watson-Crick-Basenpaaren. Die gebildeten DNA/DNA oder DNA/RNA Doppel stränge werden auch als DNA-Hybride bezeichnet. Zur Detektion der spezifischen DNA oder RNA eines Erregers durch die Hybridisierungsreaktion werden kom plementäre sequenzspezifische Gensonden verwendet. Diese Gensonden sind ent weder kurze, chemisch synthetisierte Oligonukleotidsonden mit einer Länge von 10 bis 50 Nukleotiden oder DNA/RNA Fragmente von 0,5 bis 10 kb, die durch rekombinante Gentechniken hergestellt wurden.

Die Gensonden können photochemisch (N.Dattagupta, et al., Biochem. 177, 85, 1989) oder enzymatisch durch nick Translation (Rigby, P.W.J. et al., J. Mol. Biol. 113, 237, 1977) oder Random Primed Techniken (Feinberg und Vogelstein, Anal. Biochem. 132, 6, 1983) mit einer radioaktiven oder nicht radioaktiven Markierung versehen werden. Geeignet sind hierfür Markierungen mit ³²P NTPs oder nicht radioaktive Markierungen mit Digoxigenin-dUTP, Biotin-dUTP oder direkte Markierung mit Enzymen wie alk. Phosphatase oder Horseradish Peroxidase.

Für die spezifische Hybridisierung zwischen der nachzuweisenden Nukleinsäure des Erregers und der erregerspezifischen Gensonde werden die Nukleinsäuren zu nächst durch Denaturierung (Hitze oder Alkalibehandlung) in Einzelstränge ge trennt und dann unter stringenten Bedingungen, die durch Temperatur, Ionenstärke der Puffer und organische Lösungsmittel erreicht werden, ganz spezifisch mitein ander hybridisiert. Bei geeigneten Hybridisierungsbedingungen bindet die Gen sonde nur an komplementäre Sequenzen der nachzuweisenden DNA oder RNA. Diese Hybridisierungsreaktion kann in verschiedenen Testformaten z. B. als Fest phasenhybridisierung an einen Träger wie z. B. Nitrozellulose gekoppelter Target- DNA oder Gensonde oder als Flüssighybridisierung durchgeführt werden. Die Auswertung (Read Out) erfolgt über die Markierung der Gensonde mit einem Reportermolekül wie oben aufgeführt oder wie in dem hier dargestellten Reversed Phase Hybridisierungssystem über die Target-DNA, die während der Amplifikation mit Digoxigenin-dUTP markiert wird und die Gensonde, die zur Bindung an magnetische Partikel mit Biotin markiert wird. Der Hybridisierungskomplex aus Target-DNA und markierter Gensonde wird nach Entfernen von nicht hybri disierter DNA über das verwendete Reportermolekül quantitativ bestimmt. Dieser Read Out kann direkt erfolgen bei Fluoreszenz-Markierung oder radioaktiver Markierung oder indirekt durch Enzymteste und immunologische Verfahren mit Antikörperkonjugaten, die Enzyme wie die alk. Phosphatase enthalten und dann eine Farbreaktion oder Chemilumineszenz-Reaktion ermöglichen.

Die Testsensitivität mit dieser Gensonden-Diagnostik liegt im Bereich von 10⁵ bis 10⁶ Keimen auf der Basis der Detektion von Einzelgenen. Eine Erhöhung der Test sensitivität kann durch die Kombination mit DNA- oder RNA-Amplifikations techniken wie der PCR (EP 200 362). LCR (EP 320 308), NASBA (EP 329 822), Qß (PCT 87/06270) oder HAS-Technik (EP 427 074) erreicht werden. Mit diesen Techniken kann bis zu einer 10⁹fachen Multiplikation der nachzuweisenden DNA erzielt werden. Durch die Kombination von Amplifikation und Hybridisierung wird so die Detektion von einzelnen DNA-Molekülen möglich.

Da bei Infektionen im Blut Keimzählen von 10¹-10³ Keimen/ml auftreten, bietet sich mit dieser Technologie die Möglichkeit einer frühzeitigen Erkennung von methicillinresistenten Infektionsverläufen.

In der vorliegenden Erfindung werden neue spezifische und besonders sensitive Gensonden für methicillinresistente Staphylococcen beschrieben.

Die neuen Gensonden wurden aus Genbereichen des mec A Gens entwickelt, die spezifische und besonders starke Hybridisierungssignale für methicillinresistente Staphylococcen aufweisen und sowohl methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) und Staphylococcus epidermidis (MRSE) erfassen, aber kein Signal mit methicillinsensitiven Staphylococcen ergeben. Die Konstruktion von Oligo nukleotidsonden und Polynukleotidsonden für methicillinresistente Staphylococcen wird in der Erfindung beschrieben. GenBank und EMBL Nukleotidsequenz- Datenbanken wurden auf keine Homologien zu bekannten Gensonden (Ligozzi, M., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 35, 575-578, 1991) (U-Gene Research, WO 9108305) oder Primern für die Amplifikation (EP 0 526 876, EP 0 527 628) gefunden.

Es wird darüber hinaus ein Verfahren zum Einsatz dieser Gensonden in Hybri disierungstesten beschrieben, bei denen eine spezifische Hybridisieerung mit Target-DNA von methicillinresistenten Staphylococcen erfolgt.

Weiterhin wird in dieser Erfindung die Kombination dieser Hybridisierungs verfahren mit Amplifikationstechniken, insbesondere der Hairpinamplifikations methode (EP 427 074), beschrieben, durch die eine sehr starke Verbesserung der Testsensitivität erzielt wird.

Es wurde auch der Einsatz dieser Gensonden und Testverfahren zum Nachweis von methicillinresistenten Staphylococcen in klinischem Probenmaterial beschrie ben. Ein großer Vorteil dieses Verfahrens ist darüber hinaus die Möglichkeit einer semiquantitativen Bestimmung der Menge an methicillinresistenten Infektionskei men in dem Probenmaterial.

Auswahl und Synthese von Oligonukleotidsonden

Für die Auswahl von geeigneten spezifischen Oligonukleotidsonden wurde die Nukleotidsequenz des mec A Gens von Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis herangezogen (Ryffel et al., Gene 94, 137 (1990) Song et al., FEBS Letters 221, 167 (1987). Ausgewählt wurden solche Sequenzen, die konserviert im mec A Gen von MRSA/MRSE vorkommen, aber keine Homologie zu den bekannten PBPs aufweisen. Die bevorzugte Oligonukleotidsonde ist in dem Sequenzprotokoll SEQ ID No 1 beschrieben. Mit dieser Oligonukleotidsonde können Festphasen-Hybridisierungsteste mit z. B. Digoxigenin endmarkierten Sonden oder Flüssighybridisierungsteste mit z. B. Photodigoxigenin markierter genomischer DNA und biotinmarkierten Oligonukleotidsonden mit denen dann der Hybridisierungskomplex mit Hilfe von Streptavidin gekoppelten magnetischen Partikeln separiert werden, durchgeführt werden. Der Nachteil dieser Verfahren ist die relativ geringe Nachweisgrenze von 10⁵ Erregern. Da im Frühstadium der Infektion weitaus geringere Erregerkonzentrationen vorkommen, reicht dieses Ver fahren für eine Frühdiagnose nicht aus.

In der vorliegenden Erfindung wurde deshalb die beschriebene Gensondentechnik kombiniert mit DNA- und RNA-Amplifikationsmethoden wie z. B. der PCR-Technik (EP 200 362, EP 201 184) und Hairpin-Amplifikationstechnik (EP 427 074).

Das Verfahren, bei dem zunächst das mec A Gen oder Teile davon aus der genomischen DNA amplifiziert werden und dann anschließend das Amplifikations produkt spezifisch mit der Oligonukleotidsonde hybridisiert, hat gegenüber der reinen Amplifikationsdiagnostik folgende Vorteile:

1. Die Amplifikationsprodukte enthalten häufig in Abhängigkeit von den Verfahrensbedingungen wie der Annealingtemperatur, Primer und Enzym konzentration, Primersequenz und MgCL2-Konzentration und verwendeten Polymerase, durch Primer-Mismatching unspezifische Nebenprodukte, die bei Anfarbung der Amplifikationsprodukte im Gel oder bei Fluoreszenz- Markierung während der Amplifikation falsch positive Ergebnisse vor spiegeln.
2. Hinzu kommt die deutlich geringere Testsensitivität bei direkter Auswer tung der PCR-Produkte, die bei 10³ Keimen liegt, während in Kombination mit der Gensondenhybridisierung und einem Chemilumineszenz-Read Out ein Nachweis von 10 Keimen pro ml Probenmaterial problemlos gelingt.

Die chemische Synthese der ausgewählten Oligonukleotidsonde erfolgte nach der Phosphoramiditmethode von S.L. Beaucage und M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981.

Konstruktion der Polynukleotidsonde

Die Polynukleotidsonde wurde durch PCR-Klonierung mit einem SureCloneTM Ligation Kit der Firma Pharmacia Biochemicals durchgeführt. Erhalten wurde, kloniert in den pUC18 Vektor, eine Polynukleotidsonde von 467 Nukleotiden mit der Nukleotidsequenz beschrieben im Sequenzprotokoll SEQ ID No 2.

Die 467 Sp Sonde wurde aus dem Vektor durch Restriktionsenzymspaltung, Aga rosegelelektrophorese und Elektoelution isoliert und dann durch Standard-Markie rungsmethoden (random prime, 3′Endgruppenmarkierung) mit z. B. Biotin-d-UTP markiert. Alternativ wurde die Sonde direkt durch PCR-Synthese mit Primer 3 und 4 unter gleichzeitigem Einbau von Biotin-d-UTP hergestellt.

Diese Gensonde kann wie die Oligonukleotidsonde direkt zur Hybridisierung von genomischer DNA (Slot Blot Hybridisierung, Reversed Phase Flüssighybridisie rung oder amplifizierter mec A DNA) eingesetzt werden.

Amplifikation von genomischer MRSA/MRSE DNA

Für die Amplifikation des mec A Gens oder Teilen davon wurden verschiedene Primer eingesetzt (z. B. EP 527 628 oder EP 526 876). In Verbindung mit den hier beschriebenen MRSA/MRSE spezifischen Oligo- und Polynukleotidsonden sind die Primer 1 Sequenzprotokoll SEQ ID No 3 und Primer 2 Sequenzprotokoll SEQ ID No 4 besonders gut geeignet zur spezifischen Detektion von methicillin resistenten Staphylococcen. Sie ergeben mit der genomischen DNA von methicil linsensitiven Staphylococcen kein im Agarosegel sichtbares Amplifikationsprodukt. Genomische DNA von methicillinresistenten Staphylococcen dagegen ergibt eine starke Amplifikationsbande, die gut mit der Oligonukleotidsonde oder der Poly nukleotidsonde hybridisiert und dadurch sehr gute Testsensitivitäten von < als 10 Keimen/ml Probenmaterial erreicht werden.

Bei der PCR-Amplifikation kann neben den 4 dNTPs (Desoxyadenosintriphosphat, Desoxyguanosintriphosphat, Desoxycytidintriphosphat und Thymidintriphosphat) zusätzlich z. B. Digoxogenin-dUTP in das Amplifikationsprodukt eingebaut wer den. Dadurch kann das Amplifikationsprodukt mit einem Antidigoxigenin-Anti körper, der z. B. alk. Phosphatase gekoppelt enthält über einen Chemilumineszenz test mit AMPPD als Substrat oder einem Farbstofftest mit Brom-Chlor-Indo lylphosphat und Nitroblautetrazolium ausgewertet werden.

Alternativ besteht die Möglichkeit fluoreszenzmarkierte Nukleosidtriphosphate wie z. B. Fluoreszein-dUTP oder Cumarin-dUTPs in das Amplifikationsprodukt einzu bauen und das Amplifikationsprodukt mit viel höherer Sensitivität als mit Ethidiumbromidanfärbung zu identifizieren.

Bei der Hairpin-Amplifikation (EP 427 074) wird z. B. ein T7/T3 Hairpinoligo nukleotid verwendet, das zusätzlich zur Hairpinsequenz eine Sequenz entsprechend den Oligonukleotidsequenzen aus der mec A Oligonukleotidsonde enthält (SEQ ID No 6-8). Mit T7/T3 Polymerase werden dann RNA-Transkripte her gestellt, die mit z. B. biotinylierten Capture-Gensonden (SEQ ID No 5) hybridi sieren und an Streptavidin gecoateten magnetischen Partikeln aus der Reaktions lösung separiert werden können. Der DNA/RNA Komplex kann dann durch DNA/RNA spezifische Antikörper (EP 339 686) detektiert werden, die mit alk. Phosphatase gekoppelt sind.

Detektion von MRSA/MRSE

Die MRSA/MRSE können direkt über ihre genomische DNA mit den in der Erfindung beschriebenen Gensonden nachgewiesen werden. Die Auswertung kann quantitativ über Slot Blot Hybridisierung oder Reversed Phase Flüssighybridisie rung erfolgen. Allerdings ist die Testsensitivität mit ca. 10⁵ Zellen/ml Probenmaterial relativ gering und damit für die Früherkennung von Infektionen mit diesen Erregern nur bedingt geeignet.

Besser geeignet ist die Amplifikation des mec A Gens durch die in der Erfindung beschriebenen Primer, die für verschiedene Read Out Methoden mit Fluoreszenz, Boitin, Digoxigenin oder Enzyme wie alk. Phosphatase oder Horse Radish Peroxidase markiert werden können.

Eine mögliche Read Out Methode ist die Anfärbung des durch Agarosegel elektrophorese separierten Amplifikationsproduktes mit interkalierenden Agenzien wie Ethidiumbromid. Eine andere Möglichkeit ist der Einbau von fluoreszenz markierten Nukleosidtriphosphaten in das DNA- oder RNA-Amplifikationsprodukt. Hierdurch wird eine deutliche Verbesserung der Testsensitivität erreicht.

Die zuverlässigste und sensitivste Methode, die gleichzeitig eine semiquantitative Auswertung ermöglicht ist die in der Erfindung beschriebene Methode der Hybridisierung der Amplifikationsprodukte mit den beschriebenen MRSA/MRSE spezifischen Gensonden. Diese Methode erlaubt darüber hinaus eine Quantifizie rung der MRSA/MRSE in klinischem Probenmaterial (Fig. 1). Beim Einbau von z. B. Digoxigenin-dUTP während der Amplifikation und Verwendung von biotin markierten Gensonden läßt sich der Hybridisierungskomplex an Streptavidin ge coateten magnetischen Partikeln separieren und bei Verwendung von Antidi goxigenin-Antikörpern, die mit alk. Phosphatase gekoppelt sind, mit AMIPPD als Substrat über Chemilumineszenz semiquantitativ auswerten.

Beispiel 1 Synthese von Oligonukleotidsonden und Starteroligonukleotiden (Primer)

Die chemische Synthese der ausgewählten Oligonukleotidsonden und Starteroligo nukleotide (Primer) erfolgte nach der Phosphoramiditmethode von S.L. Beaucage und M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981. Folgende Nukleotid sequenzen wurden synthetisiert:

Oligonukleotidsonde: SEQ ID No 1
PCR-Primer 1: SEQ ID No 3
PCR-Primer 2: SEQ ID No 4
HAS-Capture-Probe, 5′-biotinyliert: SEQ ID No 5
T3-Hairpinoligo mit mec A Oligonukleotidsequenz: SEQ ID No 6
T7-Hairpinoligo mit mec A Oligonukleotidsequenz: SEQ ID No 7
SP6-Hairpinoligo mit mec A Oligonukleotidsequenz: SEQ ID No 8
PCR-Primer 3: SEQ ID No 9
PCR-Primer 4: SEQ ID No 10

Die Oligonukleotidsonde wurde nach der Methode von Bollum, The enzymes Boyer ed, Vol 10, p 145, Academic Press New York, am 3′Ende mit Biotin-dUTP markiert. Die Endgruppenmarkierung wurde nicht radioaktiv mit Digoxigenin- dUTP vorgenommen (Chang, L.M.S., Bollum T.J., J. Biol. Chem. 246, 909, 1971).

In einem 50 µl Ansatz mit 10 µl Reaktionspuffer (Kaliumkakodylat 1 Mol/l; Tris/HCl 125 mmol/l; Rinderserumalbumin 1,25 mg/ml; pH 6,6; 25°C) 1-2 µg Oligonukleotid, 25 Einheiten Terminale Transferase, CoCl₂ 2,5 mmol/l und 1 µl Biotin-d-UTP (1 mmol/l) werden nach 60 Minuten bei 37°C ca. 50% 3′Endmar kierung erreicht.

Beispiel 2 Konstruktion von Polynukleotidsonden für MRSA/MRSE

Die Polynukleotidsonde wurde durch PCR-Klonierung mit einem SureCloneTM Ligation Kit der Firma Pharmacia Biochemicals erhalten. Für die PCR-Reaktion wurden 100 ng genomische DNA von MRSA/MRSE, 200 µmol dNTPs, 1,9 mM MgCl 2,2 µmol Primer 3 (SEQIDNO9) und Primer 4 (SEQIDNO10) und PCR- Puffer eingesetzt. Nach einer Initialschmelzung 5 Minuten bei 95°C wurde die DNA pro Zyklus 1 Minute bei 94°C denaturiert und dann 2 Minuten bei 50°C das Primerannealing durchgeführt. Anschließend wurde die Primerextension 2 Minuten bei 72°C durchgeführt nach 40 Zyklen wurde die Reaktion 20 Minuten bei 72°C behandelt und dann sofort die PCR-Klonierung durchgeführt. Dazu wurden die dATP Enden am 3′Ende des PCR-Produktes durch die 3′-5′Exonukleaseaktivität des Klenows Fragmentes entfernt. Die PCR Fragmente wurden dann mit T4 Polynukleotidkinase phosphoryliert und nach einer Phenol/Chloroform Behandlung und MicroSpin Säulenchromatographie das PCR-Produkt Blunt End ligiert in den mit boviner alkalischer Phosphatase entphosphorilierten pUC 18 Vektor. Anschließend erfolgte die Transformation und Selektion von PCR-Klonen nach Standardmethoden (Maniatis et al., Molecular Cloning) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Die aus den Polylinkersequenzen des Vektors isolierte 467 SP Sonde wurde durch random prime-Standardmethoden mit Biotin-d-UTP markiert. Alternativ wurde die Gensonde direkt durch PCR-Synthese mit Primer 3 und Primer 4 unter gleichzeitigem Einbau von 0,2 µmol Biotin-d-UTP hergestellt und in den Gentesten und Beispiel 6 eingesetzt.

Beispiel 3 MRSA/MRSE spezifische DNA-Amplifikation mit der PCR

Die Amplifikation der Target-DNA wurde nach der Polymerase Chain Reaktion (EP 200 362; 201 184) durchgeführt.

Zur PCR-Reaktion wurden eingesetzt 1-1000 pg genomische DNA von methicillinresistenten Staphylococcen, 2 µmol Primer 1 SEQ ID No 3 und Primer 2 SEQ ID No 4, 2,5 Units Taq-Polymerase von Cetus/Perkin-Elmer sowie jeweils 200 µmol dNTPS in einem Gesamtansatz von 100 µl PCR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris/HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, und 0,01% Gelatine. Die Ampli fikation wurde in einem PCR-Prozessor der Firma Cetus/Perkin-Elmer durchge führt. Für den Chemilumineszenztest nach Beispiel 6 wurde in der PCR zusätzlich 0,15 µmol Digoxidgonin-d-UTP zur Markierung des PCR-Produktes eingesetzt.

Mit den Ansätzen wurde zunächst eine Initialschmelzung der DNA 2 Minuten, 30 Sekunden bei 94°C durchgeführt, dann pro Zyklus 1 Minute bei 94°C die DNA denaturiert, 1 Minute 30 Sekunden bei 50°C das Primer-Annealing und 1 Minute 30 Sekunden bei 72°C die Primer-Extension durchgeführt. Nach 35 Zyklen wurde abschließend eine 10 Minuten-Extension bei 72°C durchgeführt und die Ansätze bei 4°C gekühlt.

Beispiel 4 MRSA/MRSE spezifische RNA-Amplifikation mit HAS

Zur RNA-Amplifikation wurde eine Sandwich-Hybridisierung mit einer 5′biotinylierten Capture-Sonde (SEQ ID No 5) der genomischen DNA von Staphiococcen und dem 5′phosphorylierten Hairpinoligonukleotid SEQ ID No 6-8 durchgeführt, wobei der Hybridisierungskomplex an Streptavidin gecoatete magnetische Partikel gekoppelt war. Nach Legierung von Capture Sonde und Hairpinoligonukleotid erfolgt die Transkriptionsamplifikation vom T7/T3 Hairpin mit Hilfe der entsprechenden RNA Polymerase.

500 fmol Capture Oligo wurden mit 500 fmol Hairpinoligo und 10 bis 100 amol Target.-DNA in 50 µl T10E1-Puffer 5 Minuten gekocht. 50 µl Target- Hybridisierungspuffer wurden hinzugegeben und dann 10 Minuten bei 52°C inkubiert. Dann wurden 100 µl Dynal Streptavidin Partikel zugegeben, 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann magnetisch separiert und der Überstand verworfen. Nach 3 × Waschen und Separieren mit Waschpuffer wurden 10 µl Ligase Premix-Puffer zugegeben und 15 Minuten bei 37°C ligiert. Nach 2 × Waschen und Separieren mit 200 µl Waschpuffer wurden 25 ml Transkriptionspuffer (IVT-MIX) mit T7-RNA-Polymerase zugegeben. Nach 2,5 Stunden bei 37°C war die RNA-Amplifikation beendet.

T10E1-Puffer 10 mM Tris/HCl; pH 8, 1 mM EDTA

Beispiel 5 Direkte Auswertung des Amplifikationsproduktes

Zur direkten Auswertung des DNA-Amplifikationsproduktes wurden nach der Amplifikation interkalierende Agenzien wie z. B. Ethidiumbromid eingesetzt oder während der Amplifikation Fluoreszenz-Nukleotidtriphosphate wie z. B. Fluor eszein dTUP oder Cumarin dUTP eingebaut. Es können auch Biotin-dUTP oder Digoxigenin-dUTP eingesetzt werden und mit Antikörper gekoppelter alk. Phos phatase ein Farbstoff-Readout durchgeführt werden. Auch können bei geringerer Sensitivität entsprechend markierte Primer verwendet werden.

Die bevorzugte Methode war der Einbau von Cumarin dUTP, weil dabei die beste Testsensitivität erreicht wurde.

Das Amplifikationsprodukt wurde auf ein 0,8%iges Agarosegel aufgetragen und 30 Minuten bei 70 mA elektrophoretisiert. Die Fluoreszenz-Signale von methi cillinsensitiven und methicillinresistenten Staphylococcen wurden unter einem UV- Transilluminator direkt ausgewertet.

Beispiel 6 Chemilumineszenz-Gensondentest von DNA-Amplifikationsprodukten

Durch die Kombination von geeigneten Target-Amplifikationsmethoden wie PCR (EP 200 362), LCR (EP 320 308), NASBA (EP 329 822), Qß (PCT 87/06270) oder HAS (EP 427 074) und der Gensondentechnik wird eine signifikante Sensitivitätssteigerung gegenüber den herkömmlichen Gensonden-Read Out Methoden erzielt.

Die Flüssighybridisierungsteste wurden als Reversed Phase Teste mit 100 ng 3′-biotinylierten Oligonukleotidsonde und amplifizierter DNA nach Beispiel 3 in einem Volumen von 50 µl durchgeführt.

Nach 10minütigem Erhitzen auf 100°C und anschließendem Abkühlen auf 0°C wurden 50 µl 2 × Boehringer Hybridisierungsmix zugegeben und 1 Stunde bei 45°C hybridisiert. Die magnetischen Beads wurden mit 1 × Boehringermix vorbehandelt und nach dem Separieren über einen Magneten die Flüssigkeit abpipettiert und der Hybridisierungsansatz zugegeben und 1/2 Stunde bei Raumtemperatur unter schwacher Bewegung inkubiert. Der gekoppelte Hybridisie rungskomplex wurde mit den Beads separiert, die Restflüssigkeit abpipettiert und einmal mit Puffer A (2 × SSC; 0,1% DS) bei Raumtemperatur, dann mit Puffer B (0,1 SSC; 0,1% SDS) 2 × bei 45°C gewaschen.

Anschließend wurde die Blocking Reaktion und Antikörper-Reaktion zum Nachweis der Hybridisierung über Chemilumineszenz durchgeführt. Die mit DNA beladenen Beads wurden 1 × mit 150 µl Waschpuffer (0,1 M Maleinsäure, 0,1 MNaCl pH 7,5, 0,3% Tween 20) behandelt und nach dem Separieren und Abpipettieren des Waschpuffers 400 µl Puffer 2 (0,1 M Maleinsäure; 0,15 M NaCl, pH 7,5; 1% Blocking Reagenz (Boehringer)) zugegeben. Nach 1/2 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde separiert, abpipettiert und 100 µl Antikörperkonjugat-Lösung (AK 1 : 10000 in Puffer 2) zugegeben und 1/2 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, dann separiert, abpipettiert und mit 400 µl Wasch puffer behandelt 2 × 15 Minuten bei schwacher Bewegung. Anschließend wurde separiert und mit 150 µl Puffer 3 (0,1 M Tris/HCl Puffer mit 0,1 M NaCl und 50 mM MgCl₂ pH 9,5) behandelt. Es wurde wieder separiert und mit Detektions lösung mit AMPPD 1 : 100 in Puffer 3 15 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert, dann die Chemilumineszenz im Lumineszenz-Photometer bei 477 nm (Lumacounter von Lumac) gemessen.

Mit diesem Test können DNA-Mengen entsprechend 106 bis 101 Staphylococcus Keime detektiert werden. Die gleiche Detektionsgrenze von 10 Keimen pro ml Blut wurde auch nach Zugabe von unspezifischer Blut-DNA erreicht. Blut-DNA alleine gibt nur geringe Background-Signale im Hybridisierungstest.

Beispiel 7 Chemilumineszenz-Gensondentest von RNA-Amplifikationsprodukten

Die MRSA/MRSE spezifischen RNA-Transskripte (ca. 0,5 pmol) wurden mit dem Capture Oligo (4 pmol) und 10 µl 3 × Transkriptionspuffer 2 in einem Gesamtvolumen von 30 µl hybridisiert. Dazu wurde der Ansatz 2 Minuten bei 98°C denaturiert, dann 10 Minuten bei 57°C hybridisiert und dann 70 µl H₂O hinzugefügt. Nach Zugabe von 100 µl Dynal Streptavidin Partikel wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, magnetisch separiert und der Überstand verworfen. Dann wurde 3 × mit 200 µl Waschpuffer gewaschen und separiert. Anschließend wurde 2 × mit 200 µl Antikörper-Bindepuffer gewaschen. Es wurden 250 µl Anti-DNA/RNA-Antikörper (0,05 µg/ml) gekoppelt mit alk. Phosphatase zugegeben und 15 Minuten bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Dann wurde 3 × mit 200 µl Antikörper-Bindepuffer gewaschen. Die magnetischen Partikel wurden in 200 µl Antikörper-Bindepuffer resuspendiert und in frischen Teströhrchen mit 0,5 ml AMPPD-Lösung 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Auswertung erfolgte wie im Beispiel 6 in einem Luminometer.

Ab Bindungspuffer [0,1 M Tris.HCl, 0,1 M NaCl, 0,1% BSA, 0,1% Tween]

Beispiel 8 Isolierung von Staphylococcen-Nukleinsäure

Das mit Staphylococcen infizierte Probenmaterial, z. B. infiziertes Blut, wurde bei 8000 UpM 5 bis 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand abpipettiert und verworfen. Das Sediment (ca. 180 bis 200 µl) wurde mit 50 µl TE mit 15%iger Saccharose versetzt, 20 µl Lysozym + Lysostaphin (10+ 5 mg/ml in bidest.H₂O) zugegeben und 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die weitere Aufarbeitung erfolgte mit einem Quiamp-DNA-Kit der Firma Diagen. Nach Zugabe von 25 µl Proteinase K und 235 µl AL Puffer wurde gemischt und 10 Minuten bei 70°C behandelt. Dann in Eis abgekühlt und 240 µl 100%iges Ethanol zugegeben und nach kurzem Mischen auf die Qiagen-Säule aufgetragen. Anschließend wurde die Säule 1 Minute bei 8000 UpM zentrifugiert, das Eluat verworfen. Es wurde 700 µl Wasch-Puffer aufgetragen und nochmals 1 Minute bei 8000 UpM zentrifugiert. Anschließend wurde nochmals mit der gleichen Menge AW Puffer gewaschen und 1 Minute bei 8000 UpM und 10 Sekunden bei 14000 UpM zentrifugiert und das Eluat verworfen. Es wurden dann 200 µl bidest H₂O auf die Säule aufgetragen und 1 Minute bei 8000 UpM zentrifugiert. Das Eluat enthält die für die Amplifikation einsetzbare gereinigte Nukleinsäurelösung.

Beispiel 9 Nachweis von MRSA/MRSE in klinischem Probenmaterial

Die MRSA/MRSE DNA wurde aus dem klinischen Probenmaterial nach der in Beispiel 8 beschriebenen Methode isoliert. Das Staphylccoccen-DNA-Lysat wurde dann mit Hilfe geeigneter Amplifikationsmethoden wie im Beispiel 5 beschrieben mit MRSA/MRSE spezifischen Oligonukleotid-Primern amplifiziert. Die amplifizierte Nukleinsäure wurde dann mit der Oligonukleotidsonde SEQ ID No 1 oder der Polynukleotidsonde SEQ ID No 2 hybridisiert und der unter stringenten Bedingungen sich ausbildende spezifische Hybridisierungskomplex aus amplifizierter Staphylococcen-Nukleinsäure und Gensonden-DNA wurde mit magnetischen Partikeln der Firma Dynal separiert und wie im Beispiel 6 durch Chemilumineszenz-Read Out quantitativ bestimmt.

In den mit MRSA/MRSE infizierten Blutlysaten wurden mec A Gen-spezifische Hybridisierungssignale noch in einer Konzentration von 10′ Keimen problemlos nachgewiesen.

Beispiel 10 Quantitativer Nachweis von MRSA/MRSE

MRSA/MRSE-Nukleinsäure wurden wie im Beispiel 8 aus klinischem Proben material, z. B. Blut, isoliert. Die Amplifikation wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Die Zyklenzahl wurde auf 25 Zyklon beschränkt um eine gute Korrelation zwischen Zellzahl und Chemilumineszenzsignal in dem klinisch rele vanten Bereich von 10³ bis 10 Keimen zu erreichen. Neben den klinischen Proben wurden Proben mit MRSA/MRSE DNA entsprechend den Zellzahlen von 10⁶ bis 100 Zeilen in 500 ng Blut-DNA parallel amplifiziert und im Chemilumineszenztest analysiert (Beispiel 6). Die Fig. 1 zeigt die Chemilumineszenzsignale von 10⁶ bis 10 MRSA/MRSE im Blut im Vergleich zu parallel amplifizierten Testproben mit 10³ und 10² Keimen, die mikrobiologisch nachgewiesen worden waren. Das Diagramm zeigt, daß die Chemilumineszenzsignale aus dem Zell zahl-DNA-Standard (10³-10²) sehr gut mit den Chemilumineszenzsignalen der Testproben mit 10³ und 10² Keimen vergleichen lassen und der Chemilumin eszenztest zur Quantifizierung der MRSA/MRSE z. B. im Blut eingesetzt werden kann.

Sequenzprotokoll

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
- (i) ANMELDER:
  - (A) NAME: Bayer AG
  - (B) STRASSE: Bayerwerk
  - (C) ORT: Leverkusen
  - (E) LAND: Deutschland
  - (F) POSTLEITZAHL: 51368
  - (G) TELEPHON: 0214/3061455
  - (H) TELEFAX: 0214/303482
- (ii) ANMELDETITEL: Spezifische Gensonden und Verfahren zum quantitativen Nachweis von methicillin-resistenten Staphylococcen
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 10
- (iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
  - (A) DATENTRÄGER: Floppy disk
  - (B) COMPUTER: IBM PC compatible
  - (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  - (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
- (1) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
  - (A) LÄNGE: 35 Basenpaare
  - (B) ART: Nukleinsäure
  - (C) STRANGFORM: Einzel
  - (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (iii) ANTISENSE: NEIN
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
  - (A) ORGANISMUS: Staphylococcus aureus
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
  - (A) LÄNGE: 467 Basenpaare
  - (B) ART: Nukleinsäure
  - (C) STRANGFORM: Einzel
  - (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (iii) ANTISENSE: NEIN
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
  - (A) ORGANISMUS: Staphylococcus aureus
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
  - (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  - (B) ART: Nukleinsäure
  - (C) STRANGFORM: Einzel
  - (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (iii) ANTISENSE: NEIN
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
  - (A) ORGANISMUS: Staphylococcus aureus
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
  - (A) LÄNGE: 24 Basenpaare
  - (B) ART: Nukleinsäure
  - (C) STRANGFORM: Einzel
  - (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (iii) ANTISENSE: NEIN
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
  - (A) ORGANISMUS: Staphylococcus aureus
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 4:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
  - (A) LÄNGE: 26 Basenpaare
  - (B) ART: Nukleinsäure
  - (C) STRANGFORM: Einzel
  - (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (iii) ANTISENSE: NEIN
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
  - (A) ORGANISMUS: Staphylococcus aureus
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
  - (A) LÄNGE: 66 Basenpaare
  - (B) ART: Nukleinsäure
  - (C) STRANGFORM: Einzel
  - (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (iii) ANTISENSE: NEIN
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
  - (A) ORGANISMUS: Staphylococcus aureus/T3 Phage
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID No: 7:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
  - (A) LÄNGE: 62 Basenpaare
  - (B) ART: Nukleinsäure
  - (C) STRANGFORM: Einzel
  - (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (iii) ANTISENSE: NEIN
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
  - (A) ORGANISMUS: Staphylococcus aureus/T7 Phage
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 7:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
  - (A) LÄNGE: 74 Basenpaare
  - (B) ART: Nukleinsäure
  - (C) STRANGFORM: Einzel
  - (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (iii) ANTISENSE: NEIN
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
  - (A) ORGANISMUS: Staphylococcus aureus/SP6 Phage
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 8:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
  - (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  - (B) ART: Nukleinsäure
  - (C) STRANGFORM: Einzel
  - (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (iii) ANTISENSE: NEIN
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
  - (A) ORGANISMUS: Staphylococcus aureus
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
  - (A) LÄNGE: 19 Basenpaare
  - (B) ART: Nukleinsäure
  - (C) STRANGFORM: Einzel
  - (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
- (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
- (iii) ANTISENSE: NEIN
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
  - (A) ORGANISMUS: Staphylococcus aureus
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

Claims

1. Eine Oligonukleotidsonde, die mit DNA oder RNA von methicillin resistenten Staphylococcen hybridisiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotidsequenz wie im Sequenzprotokoll SEQ ID No 1 enthält oder mutierte Sequenzen davon oder markierte Sequenzen davon.

2. Eine Polynukleotidsonde, die mit DNA oder RNA von methicillin resistenten Staphylococcen hybridisiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie 467 Basen oder Teile davon enthält und die Nukleotidsequenz wie im Sequenzprotokoll SEQ ID No 2 oder Teile davon enthält oder mutierte Sequenzen davon oder markierte Sequenzen davon.

3. Starteroligonukleotide (Primer) für die Amplifikation und den spezifischen Nachweis von Teilen des mec A Gens, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotidsequenz wie im Sequenzprotokoll SEQ ID No 3 und 4 enthalten.

4. Hairpinoligonukleotide für die RNA-Amplifikation und den spezifischen Nachweis von Teilen des mec A Gens, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotidsequenz wie im Sequenzprotokoll SEQ ID No 6 bis 8 enthalten.

5. Verfahren zum Nachweis von methicillinresistenten Staphylococcen in Probenmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß

a) Oligonukleotid- oder Polynukleotidsonden nach Anspruch 1 und 2 zur spezifischen Hybridisierung und Detektion von methicillinresi stenter Nukleinsäure von Staphylococcen eingesetzt werden
b) Oligo- und Polynukleotidsonden mit Hilfe von bekannten Methoden mit Reportermolekülen markiert werden
c) die Nukleinsäure von methicillinresistenten/methicillinsensitiven Staphylococcen direkt oder bevorzugt nach Amplifikation mit an sich bekannten Verfahren zur Reaktion mit den Sonden eingesetzt wird oder direkt ohne weitere Hybridisierung analysiert wird
d) der Hybridisierungskomplex über die Markierung der amplifizierten Target-DNA ein direktes Maß für den Nachweis und die Menge an methicillinresistenten Staphylococcen liefert.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Oligo nukleotidsonden nach Anspruch 1 eingesetzt werden.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Poly nukleotidsonde nach Anspruch 2 verwendet wird.

8. Ein Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß für die Amplifikation von Teilen des mec A Gens die Primer nach Anspruch 3 eingesetzt werden.

9. Ein Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß für die Amplifikation von Teilen des mec A Gens Hairpinoligonukleotide nach Anspruch 4 eingesetzt werden.

10. Testkit, enthaltend eine oder mehrere der Oligonukleotide nach Ansprüchen 1 bis 4 sowie Puffer und andere Lösungen zur praktischen Durchführung einer Analyse auf Methicillinresistenz in klinischen Probenmaterial.