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WO1996006942A1 - Genetisch veränderte t-zellen - Google Patents

Genetisch veränderte t-zellen Download PDF

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WO1996006942A1
WO1996006942A1 PCT/EP1995/003410 EP9503410W WO9606942A1 WO 1996006942 A1 WO1996006942 A1 WO 1996006942A1 EP 9503410 W EP9503410 W EP 9503410W WO 9606942 A1 WO9606942 A1 WO 9606942A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell according
cell
epitope
cells
poly
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP1995/003410
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hartmut Wekerle
Hans Thoenen
Rainer Kramer
Yiping Zhang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority to EP95931225A priority Critical patent/EP0782627A1/de
Priority to AU34745/95A priority patent/AU3474595A/en
Priority to JP8508497A priority patent/JPH10505235A/ja
Publication of WO1996006942A1 publication Critical patent/WO1996006942A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the invention relates to genetically modified mature T cells with autoreactive receptors which carry at least one externally introduced gene in their genome which is capable of expressing a (poly) peptide.
  • the invention further relates to medicaments which contain such T cells.
  • the object of the invention was therefore to provide a vehicle with which a biologically active molecule can be transported to a desired target molecule or target tissue and only interacts with it.
  • This problem is solved by providing a T cell with the features of claim 1.
  • the invention thus relates to a genetically modified, mature T cell with the following properties:
  • T cell or its precursor has been modified using molecular biological techniques.
  • Suitable molecular biological techniques such as vector constructions, transformations or transfections or (inducible) expressions are described, for example, in Sambrook et al. , "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1989).
  • autoreactive means that the T cell receptor bind an autoantigen presented by an MHC molecule to a suitable cell.
  • the term “externally introduced gene which is normally not expressed in mature T cells” means that the gene coding for the (poly) peptide, which may be of homologous or heterologous origin, does not exist in vivo in mature T cells is expressed and the expression is only achieved through the molecular biological manipulations.
  • the externally introduced gene can, for example, be under the control of its own regulatory elements. According to the invention, one or more of these genes on one or more vectors may have been introduced into the T cells simultaneously or in succession.
  • a vehicle for the first time which can transport and deliver a heterologous protein directly and specifically to a target sequence or target location, for example in the nervous system.
  • This specificity is achieved by the specificity of the T-cell receptor, which recognizes a certain autoantigen presented by an MHC molecule. Since it is known that If the reactivity pattern of a T cell receptor is highly specific, the T cell receptor and thus the molecule to be transported do not interact with other undesired molecules in the body of a patient. In the area of the nervous system there is another peculiarity that can be used for the proposed therapeutic route.
  • the MHC antigens are induced in a large number of pathological changes. This relates in particular to degenerative and inflammatory processes, in the course of which glial cells of the nerve tissue acquire the ability to present antigens.
  • diseases such as Parkinson’s disease or Alzheimer are examples.
  • the brain-reactive T lymphocytes according to the invention preferably detect such altered brain areas, tissue areas where the therapeutic agents are particularly needed.
  • a pool of mature T cells is removed from a patient for producing the T cell according to the invention by customary methods and immediately selected for uniform properties, in particular with regard to the receptor specificity.
  • the T cell according to the invention is usually reapplied to the patient from whom the T cells were originally removed in order to avoid histocompatibility problems.
  • neurotrophic molecules or anti-inflammatory factors can, for example, be brought to specific target locations and used there to prevent harmful side effects. This can take place, for example, in that the neurotrophic factors act on a target cell and there a cascade is desired. biochemical or metabolic events. An example of this is that in Parkinson's patients the remaining substantia nigra is kept alive and thus further cell loss is avoided.
  • the expressed (poly) peptide is exposed or secreted on the surface.
  • the expression of the (poly) peptide on the surface occurs when the (poly) peptide has a membrane anchoring sequence. If the (poly) peptide does not naturally contain such a sequence, it can be added genetically using conventional methods without any problems.
  • the surface expression of the (poly) peptide is particularly desirable if an interaction is only to take place with the cell to which the T cell has docked via its receptor.
  • secretion of the (poly) peptide is desirable if its effect is not to be restricted to the docked cell itself.
  • secreted (poly) peptides are antibodies or neurotrophic, immunomodulating or growth-regulating substances. If these (poly) peptides naturally do not have any signal sequences necessary for export, the person skilled in the art can easily attach them by genetic engineering.
  • the expressed (poly) peptide inhibits or activates the expression of endogenous proteins, the inhibition or activation leading to a change in the pattern on the surface of endogenous (poly) peptides or secreted proteins / Peptides.
  • the (poly) peptide has a trigger function in order to change the expression pattern of the cell.
  • This change in the expression pattern in turn exerts a desired effect on a target molecule or a target cell, for example via the Expression or the inhibition of the expression of a neurotrophic, immunomodulating or growth-regulating molecule or a surface molecule is achieved.
  • An example of this embodiment are immunomodulators which regulate the expression of the MHC molecules down in the brain.
  • its receptor is directed against an epitope of the nervous system.
  • the epitope is an epitope of the central nervous system.
  • examples include proteins that occur specifically in certain brain areas or defined cell types. This is the case for transmitter-specific enzymes (tyrosine hydroxylase), but also possibly for the pigment of the substantia nigra (Parkinson) or certain transmitter receptors.
  • Transient-specific enzymes tyrosine hydroxylase
  • Parkinsoninson the pigment of the substantia nigra
  • Regionally specific receptors and neuropeptides e.g. Galanin to call CGRP.
  • the epitope is an epitope of the peripheral nervous system.
  • Another particularly preferred embodiment of the invention relates to a T cell, the receptor of which is directed against an epitope of the myelin protein P2 or against S100.
  • the epitope is an epitope of a state-specific protein, for example amyloid precursor protein (APP), a tissue-specific protein, a receptor protein, for example regionally specific GABA, glutanate or glycine Receptors, a cytoskeleton protein or a transmitter synthesis enzyme, for example tyrosine hydroxylase.
  • a state-specific protein for example amyloid precursor protein (APP), a tissue-specific protein, a receptor protein, for example regionally specific GABA, glutanate or glycine Receptors, a cytoskeleton protein or a transmitter synthesis enzyme, for example tyrosine hydroxylase.
  • neurotrophic factor is understood to mean mediators who control the survival, growth and differentiation of neuronal cells. Neurotrophins also have the ability to protect neurons against various types of damage and to restore impaired functions.
  • the neurotrophic factor belongs to the NGF gene family (neurotrophins) and is, for example, NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, NT-6 or other neurotrophic factors, such as FGF , GDNF or CNTF.
  • NGF neurotrophins
  • BDNF neurotrophin-derived neurotrophic factor
  • NT-3 neurotrophic factor
  • NT-4/5 neurotrophic factors
  • NT-6 neurotrophic factor
  • NT-6 neurotrophic factor
  • the transport of these neurotrophic factors, alone or in combination, by means of inventive autoreactive T cells directed against an epitope of the nervous system enables e.g. the study and application of therapeutic options for degenerative, traumatic, metabolic or myelodegenerative diseases of the nervous system, such as Alzheimer's disease, Parkinson's see disease, tumors, degenerative diseases, autoimmune diseases, infections, metabolic or traumatic diseases.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a T cell which has the CD4 + CD8 ⁇ phenotype.
  • T-helper cells will primarily be used as vehicles when CD4 + T lymphocytes occur in two subclasses (Thl and Th2), which differ in the spectrum of the cytokines produced and thus also differ Have functions.
  • Thl cells produce especially interferon-gamma and tumor necrosis factor (- ⁇ and -ß).
  • Th2 cells specialize in IL-4, IL-5 and IL-10.
  • Thl cells would mainly be used in degenerative processes, but also in tumors (they induce MHC antigens), while Th2 cells are inflammatory have a dampening effect and would be helpful for autoimmune diseases (e.g. MS etc.).
  • CD8 + lymphocytes are mostly highly effective killer lymphocytes which are used in the field of tumor and virus defense can.
  • the externally introduced gene is under the control of retroviral regulatory elements.
  • retroviral regulatory elements is understood here to mean any regulatory element for the expression of genes which has been isolated from retroviruses or which has been derived from such elements. Examples of such regulatory elements are retroviral promoters or enhancers.
  • the use of retroviral regulatory elements has the particular advantage that the genes under their control are only expressed when the T cells are activated. In other words, the (poly) peptide is only expressed when the T cells are activated by interaction of the receptor with the antigen. In this way, tissue-specific expression and controllability of the expression of the (poly) peptide is achieved by activating the T cell at the target site.
  • the regulatory elements can be adapted to the respective requirements.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a T cell in which the externally introduced gene is under the control of an inducible promoter.
  • the use of an inducible promoter also has the advantage that the expression of the (poly) peptide in the T cell can be controlled and can therefore be tissue-specific. Inducible promoters are widely known in the art.
  • the externally introduced gene is under the control of T cell-specific regulatory elements.
  • a more finely tuned activation of the externally introduced gene (transgene) could be achieved, possibly also a longer (permanent) expression of the transgene.
  • the externally introduced gene is recombinant components of the genome of a lytic / lysogenic T cell-specific virus, which can lyse the T cell after the receptor has been attached to the target epitope .
  • This embodiment also serves for the defined release of the (poly) peptide at its destination.
  • the function of the secretion from the cell in the embodiments of the invention discussed above is enhanced by the apoptosis of the T-lymphocytes according to the invention, which are promoted by the special microenvironment of the target tissue.
  • the invention further relates to a medicament which contains a T cell according to the invention in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the medicaments according to the invention can be used for all diseases whose treatment has a local interaction of the (poly) peptide or a combination of (poly) peptides with one or more target molecules. It is conceivable that such a drug contains one or more different T cells according to the invention, which in turn express one or more of the externally introduced (poly) peptides.
  • the pharmaceuticals according to the invention are suitable, for example, for the treatment of regenerative or inflammatory diseases.
  • the invention relates to the use of an inventive T-cell for the treatment of degenerative Erkran ⁇ effects such as ALS (amyotrophic lateral sclerosis), Alzheimer's disease, pressures Parkinson 1 shear's disease, multiple sclerosis, trauma, infections, autoimmune diseases, immunosuppression, vascular insults, tumors, or acute edema.
  • ALS amotrophic lateral sclerosis
  • Alzheimer's disease amyotrophic lateral sclerosis
  • pressures Parkinson 1 shear's disease CAD
  • multiple sclerosis trauma, infections, autoimmune diseases, immunosuppression, vascular insults, tumors, or acute edema.
  • FIG. 1A retroviral NGF construct which has been used for transduction of R4 lymphocytes
  • B NGF production by R4 T cells after retroviral
  • C NGF expression in EAN (experimental autoimmune neuritis) in filtrates by transduced T-lymphocytes (in situ hybridization). The animals were sacrificed 14 days after the injection of 2.5 ⁇ 10 6 NGF-transduced (upper and lower diagram) or wild-type R4 lymphocytes (middle diagram) into the tail vein of ether-anesthetized adult Lewis rats ;
  • FIG. 2 Clinical results and weight changes in rats in which EAN has been induced. The animals were examined daily for clinical disease symptoms (FIG. 2A) and change in weight (FIG. 2A);
  • Fig. 4 Cellular composition of EAN infiltrates caused by NGF-transduced or control T cell lines in the presence or absence of exogenous NGF: Immunohistochemical staining of W3 / 13-positive T lymphocytes (left row) or EDI-positive macrophages (right row) in the sciatic nerve, positive cells. Positive cells are cells which bind the antibody, ie which express the marker antigen on the surface.
  • Treatment groups a, only wild-type R4 cells __. ⁇ , b, NGF-transduced R4 cells, c) and d) Wilc, -p-R4 cells in combination with the administration of either BSA (c) or NGF protein (d), e, distribution of ET1- and W3-13 positive cells a.. ⁇ s a) to d) shown as a bar graph, including the values for recipients of sham-translated R4 cells (immunocytochemistry not shown). * Statistical significance was examined by the Student t test p ⁇ 0.00001.
  • the neuritogenic, P2 protein-specific R4 cell line was used as a cellular vehicle of NGF in the peripheral nervous system.
  • R4 lymphocytes induce demyelizing autoimmune inflammation (EAN), which is limited only to the peripheral nervous system (PNS) (Linington et al., J. Immunol. 133 (1984), 1946-1950).
  • PNS peripheral nervous system
  • the lesion is characterized by a strong infiltration of mononuclear cells, followed by extensive destruction of the myelin sheath (Izumo, S. et al., Lab. Invest. 53 (1985), 209-218).
  • the time course and the extent of the pathogenic reactions are highly predictable.
  • the clinical manifestations of this disease develop very quickly four days after the induction of the T cells and are caused by one markedly reduced nerve conduction within a few hours (Hier, K. et al., Ann. Neurol. 19 (1986), 44-49).
  • R4 lymphocytes were transduced with a replication-deficient, ecotrophic recombinant retrovirus, which encodes the cDNA of mouse NGF (FIG. 1 a).
  • a replication-deficient, ecotrophic recombinant retrovirus which encodes the cDNA of mouse NGF (FIG. 1 a).
  • an 882 bp Sphl / PstI fragment of the mouse NGF cDNA J. Scott et al., Nature 302 (1983), 538-540
  • was first under the control of the viral promoter in the 5'-LTR of the 5.8 kb vector pLXSN D. Miller et al., Bio Technique 7, (1989) 980-990.
  • Functional splice donor (SD) and splice acceptor (SA sites) are located upstream of the NGF cDNA.
  • GP + E-86 packaging cell line (D. Markowitz et al., J. Virol. 62 (1988) pp. 1120-1124) was transfected by calcium phosphate coprecipitation. The retrovirus-containing supernatant was collected after 48 hours and used to infect a GP + E-86 culture treated with tunicamycin (100 ng / ml 16 hours).
  • G418 (1 mg / ml) resistant clones were subcloned after 12 days and tested for the production of infectious retroviral particles, the number of G418-resistant NIH 3T3 fibroblasts being determined.
  • the titers of the individual packaging clones were in the range from 2 to 6 x 10 plaque-forming units (pfu) per ml.
  • R4 lymphocytes were activated for 48 hours in the presence of native bovine myelin P2 protein (20 ⁇ g / ml) and thymus cells (1x10 cells / ml irradiated at 2000 R) as a source of antigen-presenting cells. These stimulated lymphoblasts were treated with RPMI 1640 containing 5% fetal calf serum, 15% T cell growth factor (Supernatant from ConA-activated mouse spleen cells) supplemented with 80% retrovirus ( 6 ⁇ 10 6 pfu / ml) and 8 ⁇ g / ml polypene transduced.
  • Virus-containing supernatant was removed by repeated washing and transduced R4 lymphocytes were resuspended in RPMI 1640 medium and grown in an atmosphere containing 5% CO2 at 37 ° C.
  • Conditioned media of 10 wild-type (R4) -, NGF-retrovirus transduced (R4NGF) - or sham-transfected (retrovirus, which does not encode NGF; R4mock) R4-lymphocytes were found at NGF concentration (pg / ml) 12 hours after the Transfection tested by an immunoassay testing two binding sites (S. Korsching et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 3513-3516).
  • the transduction itself did not change the antigen specificity or the proliferative activity of the R4 cells; the Thl-like secretion pattern on cytokines with a strong production of 11-2 and interferon-7 also remained unchanged (results not shown).
  • the transduced R4 lymphocytes infiltrated the peripheral nervous system to the same extent as wild-type or sham-transfected R4 cells (FIG. 4). 14 days after the travenous injection of NGF-transduced R4 cells could be shown by in situ hybridization (Fig. lc) that these genetically modified lymphocytes still strongly express NGF-mRNA in vivo in the peripheral nervous system.
  • Fig. lc in situ hybridization
  • 2,5 ⁇ 10 6 -stimulated wild-type (R4), NGF-transduced (R4NGF) or sham-transfected (R4mock) -R4 lymphocytes into the tail vein were ether-anesthetized Lewis rats in a total volume of 1 ml injected on day 0.
  • the animals were sacrificed 14 days after the injection of 2.5x10 R3-T lymphocytes and perfused with 4% paraformaldehyde containing 0.5% glutardialdehyde in 0.1 M phosphate-buffered saline, using the same fixative overnight at 4 ° C immersion fixed and then embedded in Epon by conventional methods.
  • 1 ⁇ m sections were made and stained with 0.1% toluidine blue to estimate the extent of demyelination; the unit of measure here is 2.5 ⁇ m.
  • Ultra-thin sections were made and prepared for electron microscopy, as described by J. Gehrmann et al. Lab. Invest. 67 (1992) 100-113; one unit on the scale is 1 ⁇ m.
  • Bovine serum albumin or NGF was administered to ether-anesthetized Lewis rats by implantation of a sponge gel cushion (spongostan) containing either 125 ⁇ g NGF (2.5 S) or 250 ⁇ g BSA (Sigma, Cohn fraction V) in 50 ⁇ l 0.9% Na ⁇ trium chloride contained.
  • the administration took place in the vicinity of the left or right sciatic nerve in the sub-gluteal region of the same rat 24 hours before the injection of 2.5 ⁇ 10 6 wild-type R4 cells.
  • cryostat sections (10 ⁇ m) of the sciatic nerve preparations were carried out under stringent conditions either with single-stranded s 35-labeled antisense (upper and middle diagram) or more meaning-oriented (lower diagram) ) NGF-specific cDNA probes hybridized by reverse transcription from sense or antisense NGF cRNA according to customary methods (E. Castren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 ( 1992) 9444-9448).
  • the morphological changes caused by NGF-transfected R4 cells differed significantly from typical EAN, which was brought about by non- or sham-transfected R4 cells (FIG. 3).
  • the demyelination of the sciatic nerve axons V / L r 14 days after the transfer of NGF-synthesizing R4 lymphocytes was drastically reduced (FIG. 3c), whereas that with the wild type (FIG. 3a) or with the sham-transfected R4 cells (FIG 3b) treated animals showed the typical changes in peripheral myelin sheaths.
  • NGF protein by implantation of a sponge gel cushion in vivo showed the same reduction in macrophage invasion as the NGF-producing R4 cells (FIG. 4d).
  • the implantation of a sponge gel cushion containing BSA on the contralateral side (FIG. 4c) had no influence on the typical macrophage recruitment in EAN induced by the transfer of wild type R4 cells.
  • the number of W3 / 13 positive cells on the differently treated sides of the rats were the same (FIGS. 4c, d).

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Abstract

Die Erfindung betrifft genetisch veränderte reife T-Zellen mit autoreaktiven Rezeptoren, die in ihrem Genom mindestens ein extern eingeführtes Gen tragen, das zur Expression eines (Poly)peptids fähig ist. Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, die derartige T-Zellen enthalten.

Description

Genetisch veränderte T-Zellen
Die Erfindung betrifft genetisch veränderte reife T-Zellen mit autoreaktiven Rezeptoren, die in ihrem Genom mindestens ein extern eingeführtes Gen tragen, das zur Expression eines (Poly) peptids fähig ist. Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, die derartige T-Zellen enthalten.
Die moderne Medizin entwickelt sich immer weiter dahinge¬ hend, schwere operative Eingriffe zu vermeiden und klinisch gleichwertige oder günstigere Ergebnisse durch andere, neue Verfahren zu erzielen, die den Patienten vor allen vom phy¬ sischen Trauma einer Operation befreien.
Derartige neue Verfahren wurden in der Vergangenheit bei¬ spielsweise auf der Grundlage von Erkenntnissen der Moleku¬ larbiologie, insbesondere in Verbindung mit den Disziplinen Immunologie und Neurologie entwickelt. So ist z.B. versucht worden, Tumortherapien durch Applikation von gegen Tumoran- tigene gerichteten Antikörpern, gekoppelt an Toxine zu eta¬ blieren; vgl. Vallera, Blood 83 (1994), 309-317. Anderer¬ seits ist bei der Isolierung und Clonierung neurotropher Faktoren, wie BDNF, NGF oder NT-3 daran gedacht worden, sie zur Behandlung degenerativer Krankheiten des Nervensystems einzusetzen (vgl. z.B. WO 91/03568).
Vielen dieser Verfahren liegt die Idee zugrunde, einen Wirk¬ stoff so an den gewünschten Zielort zu transportieren, daß er nur dort seine Aktivität entfaltet. Die praktische Um¬ setzung dieser Idee scheitert bisher in der Regel daran, daß die Wirkstoffe nicht oder nur zu einem bestimmten Prozent¬ satz tatsächlich ihren Zielort erreichen. Einige Gewebe, be¬ sonders das Gehirn und die peripheren Nerven, sind nämlich durch eine dichte endotheliale Blut-Hirnschranke vom Blut¬ kreislauf abgetrennt. Ins Blut verabreichte makromolekulare Wirkstoffe erreichen somit nur sehr schwer die "sequestrierten" Gewebe. Dadurch wird einerseits der ge¬ wünschte therapeutische Effekt der genannten Verfahren mög¬ licherweise nicht erreicht, andererseits kann es, wie im Falle der Immuntoxine, zu unerwünschten Nebenwirkungen kom¬ men, wenn der Wirkstoff an einem anderen, als dem gewünsch¬ ten Zielort abgeladen wird. Wie im Stand der Technik bekannt ist, wird der Zugang für im Stand der Technik bekannte Wirk¬ stoffe, wie z.B. Immuntoxine, durch die Bluthirnschranke verhindert. Ausnahmen für medizinisch wirksame Substanzen, die diese Schranke überwinden konnten, bildeten bisher nur lipophile Substanzen bzw. über spezifische Rezeptoren trans¬ portierte Substanzen (z.B. Transferrin) .
Der Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, ein Vehikel bereitzustellen, mit dem ein biologisch aktives Molekül an ein gewünschtes Zielmolekül bzw. Zielgewebe transportiert werden kann und nur mit diesem interagiert. Die Lösung die¬ ser Aufgabe erfolgt durch die Bereitstellung einer T-Zelle mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Somit betrifft die Erfindung eine genetisch veränderte, reife T-Zelle mit den folgenden Eigenschaften:
(a) ihr Rezeptor ist autoreaktiv; und
(b) sie trägt in ihrem Genom mindestens ein extern einge¬ führtes, in reifen T-Zellen normalerweise nicht expri- miertes Gen, das zur Expression eines (Poly)peptids fä¬ hig ist.
Der Begriff "genetisch verändert" im Sinne dieser Anmeldung bedeutet, daß die T-Zelle oder ihr Vorläufer mit molekular¬ biologischen Techniken verändert worden ist. Geeignete mole¬ kularbiologische Techniken, wie Vektorkonstruktionen, Trans¬ formationen bzw. Transfektionen oder (induzierbare) Ex¬ pressions sind beispielsweise in Sambrook et al . , "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1989) beschrieben.
Der Begriff "autoreaktiv" bedeutet, daß der T-Zell-Rezeptor ein Autoantigen, das durch ein MHC-Molekül einer geeigneten Zelle präsentiert wird, zu binden.
Der Begriff "extern eingeführtes, in reifen T-Zellen norma¬ lerweise nicht exprimiertes Gen" bedeutet im Sinne dieser Erfindung, daß das das (Poly)peptid codierende Gen, welches homologen oder heterologen Ursprungs sein kann, in reifen T- Zellen in vivo nicht exprimiert wird und die Expression erst durch die molekularbiologischen Manipulationen erreicht wird. Das extern eingeführte Gen kann beispielsweise unter der Kontrolle eigener Regulationselemente stehen. Erfindungsgemäß können in die T-Zellen ein oder mehrere die¬ ser Gene auf einem oder mehreren Vektoren gleichzeitig oder aufeinanderfolgend eingeführt worden sein.
Mit der erfindungsgemäßen T-Zelle wird zum ersten Mal ein Vehikel bereitgestellt, das ein heterologes Protein direkt und spezifisch an eine Zielsequenz bzw. Zielort beispiels¬ weise im Nervensystem transportieren und dort abliefern kann. Diese Spezifität wird erreicht durch die Spezifität des T-Zeil-Rezeptors, der ein durch ein MHC-Molekül präsen¬ tiertes bestimmtes Autoantigen erkennt. Da bekannt ist, daß das Reaktivitätsmusters eines T-Zell-Rezeptors hochspezi¬ fisch ist, kommt es nicht zu Interaktionen des T-Zell-Rezep¬ tors und damit des zu transportierenden Moleküls mit anderen unerwünschten Molekülen im Körper eines Patienten. Im Bereich des Nervensystems kommt eine weitere, für den vorgeschlagenen Therapieweg nutzbare Eigenheit hinzu. Wäh¬ rend die Zellen des gesunden Hirngewebes kaum MHC-Moleküle produzieren und somit auch nicht in der Lage sind, den T- Lymphozyten (Selbst-)Antigen erkennbar zu präsentieren, wer¬ den MHC-Antigene in einer Vielzahl pathologischer Verände¬ rungen induziert. Die betrifft in besonderem Maße degenera¬ tive und entzündliche Prozesse, in deren Gefolge Gliazellen des Nervengewebes die Fähigkeit erwerben, Antigene zu prä¬ sentieren. Als Beispiele sind, außer den (Auto-)Immunent¬ zündungen Krankheiten, wie M. Parkinson oder Alzheimer, zu nennen. Wie gezeigt wurde, spüren die erfindungsgemäßen hirnreaktiven T-Lymphozyten vorzugsweise solche veränderte Hirnpartien auf, Gewebsareale, wo die therapeutischen Agen- tien besonders gebraucht werden.
Damit wurde in der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit ak¬ tivierter T-Zellen ausgenutzt, die Bluthirnschranke zu durchdringen.
In der medizinischen Praxis wird einem Patienten zur Her¬ stellung der erfindungsgemäßen T-Zelle ein Pool reifer T- Zellen nach üblichen Verfahren entnommen und sofort auf uni¬ forme Eigenschaften, insbesondere hinsichtlich der Rezeptor- spezifität, hin selektioniert. Nach Vornahme der molekular¬ biologischen Manipulationen wird die erfindungsgemäße T- Zelle üblicherweise dem Patienten wieder appliziert, dem die T-Zellen ursprünglich entnommen worden waren, um Histokompa- tibilitätsprobleme zu vermeiden.
Mit dem erfindungsgemäßen System können neurotrophe Moleküle oder antiinflammatorische Faktoren beispielsweise an be¬ stimmte Zielorte gebracht werden und dort zur Verhinderung schädlicher Nebenwirkungen eingesetzt werden. Dies kann bei¬ spielsweise dadurch erfolgen, daß die neurotrophen Faktoren auf eine Zielzelle einwirken und dort eine Kaskade gewünsch- ter biochemischer oder metabolischer Ereignisse in Gang setzt. Ein Beispiel hierfür ist, daß bei Parkinson-Patienten die noch verbliebene Substantia nigra am Überleben gehalten und so ein weiterer Zellverlust vermieden wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen T-Zelle wird das exprimierte (Poly)peptid auf der Oberfläche exponiert oder sezemiert .
Die Expression des (Poly)peptids auf der Oberfläche erfolgt dann, wenn das (Poly)peptid eine Membranverankerungssequenz aufweist. Sofern das (Poly)peptid eine derartige Sequenz na¬ türlicherweise nicht enthält, kann diese ohne Probleme nach üblichen Verfahren gentechnisch angefügt werden. Die Oberflächenexpression des (Poly)peptids ist vor allem dann wünschenswert, wenn eine Interaktion lediglich mit der Zelle erfolgen soll, an die die T-Zelle über ihren Rezeptor angedockt hat .
Dagegen ist die Sezernierung des (Poly)peptids wünschens¬ wert, wenn dessen Wirkung nicht auf die angedockte Zelle selbst beschränkt bleiben soll. Beispiele für sezernierte (Poly)peptide sind Antikörper oder neurotrophe, immunmodu¬ lierende oder wachstumsregulierende Substanzen. Sofern diese (Poly)peptide natürlicherweise keine für den Export notwendigen Signalsequenzen aufweisen, kann der Fach¬ mann diese leicht auf gentechnologischem Wege anheften.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfin¬ dungsgemäßen T-Zelle hemmt oder aktiviert des exprimierte (Poly)peptid die Expression endogener Proteine, wobei die Hemmung oder Aktivierung zu einer Veränderung des Musters an der Oberfläche exprimierter endogener (Poly)peptide oder se- zernierter Proteine/Peptide bewirkt.
In dieser Ausführungsform der Erfindung übt das (Poly)peptid eine Triggerfunktion aus, um das Expressionsmuster der Zelle zu verändern. Durch diese Veränderung des Expressionsmusters wird wiederum ein gewünschter Effekt auf ein Zielmolekül oder eine Zielzelle ausgeübt, die beispielsweise über die Expression oder die Hemmung der Expression eines neurotro- phen, immunmodulierenden oder wachstumsregulierenden Mole¬ küls oder eines Oberflächenmoleküls erzielt wird. Ein Bei¬ spiel für diese Ausführungsform sind Immunmodulatoren, die im Gehirn die Expression der MHC-Moleküle herunter regulie¬ ren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfin¬ dungsgemäßen T-Zelle ist deren Rezeptor gegen ein Epitop des Nervensystems gerichtet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Epitop ein Epitop des zentralen Nervensystems. Als Beispiele sind Proteine zu nennen, welche speziell in bestimmten Hirnarealen bzw. definierten Zelltypen vorkommen. Dies ist der Fall für Transmitter-spezifische Enzyme (Tyrosin-Hydroxylase) , aber auch möglicherweise für das Pig¬ ment der Substantia nigra (Parkinson) oder bestimmte Trans- mitterrezeptoren. Ferner sind hier regional spezifische Re¬ zeptoren und Neuropeptide, z.B. Galanin, CGRP zu nennen.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Epitop ein Epitop des peripheren Nervensy¬ stems.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfin¬ dung betrifft eine T-Zelle, deren Rezeptor gegen ein Epitop des Myelinproteins P2 oder gegen S100 gerichtet ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfin¬ dungsgemäßen T-Zelle ist das Epitop ein Epitop eines zu- standsspezifischen Proteins, beispielsweise von Amyloid Precursor Protein (APP) , eines gewebespezifischen Proteins, eines Rezeptorproteins, z.B. regionalspezifische GABA-, Gluta at- oder Glycin-Rezeptoren, eines Cytoskelettproteins oder eines Transmittersyntheseenzyms, z.B. der Tyrosin-Hy¬ droxylase. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung be¬ trifft eine T-Zelle, wobei das exprimierte (Poly)peptid ein neurotropher Faktor ist .
Unter dem Begriff "neurotropher Faktor" versteht man Media¬ toren, welche Überleben, Wachstum und Differenzierung neura- ler Zellen kontrollieren. Neurotrophine haben auch die Fä¬ higkeit, Neuronen gegen vielfältige Schädigungen zu schützen und beeinträchtigte Funktionen zu restituieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfin¬ dungsgemäßen T-Zelle gehört der neurotrophe Faktor zur NGF- Genfamilie (Neurotrophine) und ist beispielsweise NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, NT-6 oder andere neurotrophe Faktoren, wie FGF, GDNF oder CNTF. Der Transport dieser neurotrophen Fak¬ toren, allein oder in Kombination, mittels erfindungsgemä¬ ßer, gegen ein Epitop des Nervensystems gerichteter autore¬ aktiver T-Zellen ermöglicht z.B. das Studium und die Anwen¬ dung von Therapiemöglichkeiten bei degenerativen, traumati¬ schen, metabolischen oder myelodegenerativen Erkrankungen des Nervensystems, wie z.B. der AIzheimer-Krankheit, der Parkinson' sehen Krankheit, Tumoren, Degenerationskrankhei¬ ten, Autoimmunkrankheiten, Infekten, metabolischen oder traumatischen Erkrankungen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung be¬ trifft eine T-Zelle, die den CD4+ CD8~-Phänotyp aufweist. T-Helfer-Zellen werden vor allem dann als Vehikel zum Ein¬ satz kommen, wenn CD4+ T-Lymphozyten in zwei Subklassen vor¬ kommen (Thl und Th2) , welche sich durch das Spektrum der produzierten Cytokine unterscheiden und somit auch unter¬ schiedliche Funktionen aufweisen. Thl Zellen produzieren ne¬ ben IL-2 besonders Interferon-gamma und Tumornekrosefaktor (-α und -ß) . Th2-Zellen hingegen sind auf IL-4, IL-5 und IL- 10 spezialisiert. Thl-Zellen wären hauptsächlich bei degene¬ rativen Prozessen, aber auch bei Tumoren einzusetzen (sie induzieren MHC-Antigene) , während Th2-Zellen entzündungs- dämpfend wirken und bei Autoimmunerkrankungen (etwa MS etc.) hilfreich wären.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung be¬ trifft eine T-Zelle, die den CD4" CD8+-Phänotyp aufweist. CD8+-Lyhmphozyten sind zumeist hoch effektive Killerlympho- zyten, die Ihr Einsatzgebiet im Bereich der Tumor-, aber auch der Virusabwehr finden können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfin¬ dungsgemäßen T-Zelle steht das extern eingeführte Gen unter der Kontrolle retroviraler Regulationselemente. Unter "retroviralen Regulationselementen" wird hier jedes Regulationselement zur Expression von Genen verstanden, das aus Retroviren isoliert worden ist oder von derartigen Ele¬ menten abgeleitet wurde. Beispiele für derartige Regula¬ tionselemente sind retrovirale Promotore oder Enhancer. Die Verwendung retroviraler Regulationselemente hat vor al¬ lem den Vorteil, daß die unter ihrer Kontrolle stehenden Gene erst mit der Aktivierung der T-Zellen exprimiert wer¬ den. Mit anderen Worten, das (Poly)peptid wird erst dann ex¬ primiert, wenn die T-Zellen durch Interaktion des Rezeptors mit dem Antigen aktiviert werden. Dadurch wird eine gewe¬ bespezifische Expression und eine Steuerbarkeit der Expres¬ sion des (Poly)peptids durch die Aktivierung der T-Zelle am Zielort erreicht. Wie dem Fachmann bekannt ist, können die regulatorischen Elemente den jeweiligen Erfordernissen ange¬ paßt werden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung be¬ trifft eine T-Zelle, in der das extern eingeführte Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht. Auch die Verwendung eines induzierbaren Promotors hat den Vorteil, daß die Expression des (Poly)peptids in der T-Zelle steuerbar ist und damit gewebespezifisch erfolgen kann. In¬ duzierbare Promotoren sind im Stand der Technik weithin be¬ kannt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfin¬ dungsgemäßen T-Zelle steht das extern eingeführte Gen unter der Kontrolle T-Zell-spezifischer Regulationselemente. Hierbei könnte eine feiner abgestimmte Aktivierung des ex¬ tern eingeführten Gens (Transgens) erreicht werden, even¬ tuell auch eine längere (permanente) Expression des Trans¬ gens .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfin¬ dungsgemäßen T-Zelle ist das extern eingeführte Gen rekom- binanter Bestandteile des Genoms eines lytischen/lysogenen T-Zell-spezifischen Virus, welches die T-Zelle nach Anhef¬ tung des Rezeptors an das Zielepitop lysieren kann. Auch diese Ausführungsform dient der definierten Freisetzung des (Poly)peptids an seinem Zielort. Die Funktion der Sezer- nierung aus der Zelle bei vorstehend diskutierten erfin¬ dungsgemäßen Ausführungsformen wird durch die Apoptose der erfindungsgemäßen T-Lymphocyten verstärkt, welche durch das besondere Mikromilieu des Zielgewebes gefördert werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Arzneimittel, das eine er¬ findungsgemäße T-Zelle in Kombination mit einem pharmazeu¬ tisch verträglichen Träger enthält.
Die Formulierung derartiger Arzneimittel ist dem entspre¬ chenden Fachmann bekannt.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können prinzipiell bei allen Krankheiten, deren Behandlung eine lokale Interaktion des (Poly)peptids oder einer Kombination von (Poly)peptiden mit einem oder mehreren Zielmolekülen aufweist, eingesetzt werden. Dabei ist denkbar, daß ein derartiges Arzneimittel eine oder mehrere unterschiedliche erfindungsgemäße T-Zellen enthält, die wiederum eines oder mehrere der extern einge¬ führten (Poly)peptide exprimieren. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel sind geeignet beispielsweise zur Behandlung de- generativer oder inflammatorischer Erkrankungen. Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung einer er¬ findungsgemäßen T-Zelle zur Behandlung degenerativer Erkran¬ kungen wie ALS (amyotrophe Lateralsklerose) , Alzheimer- Krankheit, Parkinson1 scher-Krankheit, Multipler Sclerose, von Traumata, Infektionen, Autoimmunkrankheiten, Immunsup- pressionen, vaskuläre Insulte, Tumoren, oder akuter Ödeme.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 A: retrovirales NGF-Konstrukt, das zur Transduktion von R4-Lymphocyten verwendet worden ist; B: NGF-Produktion durch R4-T-Zellen nach retroviraler
Transduktion; C: NGF-Expression in EAN (Experimentelle Autoimmun- Neuritis) in Filtraten durch transduzierte T-Lym- phocyten (in situ-Hybridisierung) . Die Tiere wur¬ den 14 Tage nach der Injektion von 2,5 x 106 NGF- transduzierten (oberes und unteres Schaubild) oder Wildtyp-R4-Lymphocyten (mittleres Schaubild) in die Schwanzvene von Ether-anästhesierten ausge¬ wachsenen Lewis-Ratten geopfert;
Fig. 2 Klinische Ergebnisse und Gewichtsänderungen in Ratten, in denen EAN induziert worden ist. Die Tiere wurden täglich auf klinische Krankheits¬ symptome (Fig. 2 A) und Gewichtsänderung (Fig. 2 B) untersucht;
Fig. 3 Histopathologische Veränderungen des Ischianervs nach Injektion von Wildtyp (a) , scheintransduzier- ten (b) oder NGF-transduzierten R4-Lymphocyten (c) .
Linke Reihe: Toluidin-Blaufärbung von Semidünn- Schnitten. Rechte Reihe: elektronenmikroskopische Aufnahme.
Fig. 4 Zelluläre Zusammensetzung von EAN-Infiltraten, die durch NGF-transduzierte oder Kontroll-T-Zellinien in Gegenwart oder Abwesenheit von exogenem NGF verursacht wurden: Immunhistochemische Färbung von W3/13-positiven T- Lymphocyten (linke Reihe) oder EDI-positiven Ma- krophagen (rechte Reihe) im Ischiasnerv, positive Zellen. Positive Zellen sind Zellen, die den Anti¬ körper binden, also das Marker-Antigen auf der Oberfläche exprimieren.
Behandlungsgruppen: a, nur Wildtyp-R4-Zei__.ι, b, NGF-transduzierte R4-Zellen, c) und d) Wilc ,-p-R4- Zellen in Kombination mit der Verabreichung von entweder BSA (c) oder NGF-Protein (d) , e, Vertei¬ lung von ET1- und W3-13 positiven Zellen a..ιs a) bis d) als Balkengraphik gezeigt, einschließlich der Werte für Empfänger von scheintransduzierten R4-Zellen (Immuncytochemie nicht dargestellt) . *Statistische Signifikanszwurde durch den Student t-Test untersucht p <0, 00001.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Transduktion von P2-spezifischen, MHC-Klasse II-restringier- ten CD4+-T-Lymphocyten
Die neuritogene, P2-Protein-spezifische T-Zellinie R4 wurde als zelluläres Vehikel von NGF in das periphere Nervensystem verwendet. R4-Lymphcyten induzieren eine demyelierende Au- toimmunentzündung (EAN) , die lediglich auf das periphere Nervensystem (PNS) beschränkt ist (Linington et al . , J. Immunol . 133 (1984) , 1946-1950) . Die Läsion ist durch eine starke Infiltration mononuclearer Zellen, gefolgt von einer weitgehenden Zerstörung der Myelinscheide gekennzeichnet (Izumo, S. et al., Lab. Invest . 53 (1985), 209-218) . Der zeitliche Verlauf und das Ausmaß der pathogenen Reaktionen sind in hohem Maße vorhersehbar. Die klinischen Manifesta¬ tionen dieser Krankheit entwickeln sich sehr schnell vier Tage nach der Induktion der T-Zellen und sind durch eine drastische Herabsetzung der Nervenleitung innerhalb weniger Stunden gekennzeichnet (Heiniger, K. et al . , Ann. Neurol . 19 (1986) , 44-49) .
Für den Transport von NGF an das Zielmolekül wurden R4-Lym- phocyten mit einem replikationsdefizienten, ecotrophischen rekombinanten Retrovirus transduziert, das die cDNA von Maus-NGF codiert (Fig. la) . Zur Konstruktion dieses Vektors wurde zunächst ein 882 bp Sphl/PstI-Fragment der Maus-NGF- cDNA (J. Scott et al., Nature 302 (1983) , 538-540) unter die Kontrolle des viralen Promotors im 5'-LTR des 5,8 kb-Vektors pLXSN (D. Miller et al . , Bio Technique 7, (1989) 980-990) gestellt. Funktioneller Spleißdonor (SD-) und Spleißakzeptor (SA-Stellen) befinden sich stromaufwärts der NGF-cDNA. Ein interner SV40-Promotor kontrolliert die Expression des G418- Resistenzgens (neo) , während die Polyadenylierung (pA) in¬ nerhalb des 3 ' -LTR vonstatten geht. Die Initiation der Transkription ist durch Pfeile dargestellt. Mit dem so er¬ haltenen Konstrukt wurde die GP+E-86-Verpackungszellinie (D. Markowitz et al. , J. Virol . 62 (1988) S. 1120-1124) durch Calciumphosphat-Copräzipitation transfizier . Der Retrovirus enthaltende Überstand wurde nach 48 Stunden gesammelt und zur Infektion einer mit Tunicamycin (100 ng/ml 16 Stunden) behandelten GP+E-86-Kultur verwendet. Einzelne G418 (1 mg/ml) resistente Clone wurden nach 12 Tagen subcloniert und auf die Produktion von infektiösen retroviralen Partikeln getestet, wobei die Anzahl der G418-resistenten NIH 3T3-Fi- broblasten bestimmt wurde. Die Titer der einzelnen Ver- packungsclone befanden sich im Bereich von 2 bis 6 x 10 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro ml.
R4-Lymphocyten wurden in Gegenwart von nativem Rindermyelin- P2-Protein (20 μg/ml) und von Thymuszellen (1x10 -Zellen/ml bei 2000 R bestrahlt) als Quelle Antigen-präsentierender Zellen 48 Stunden lang aktiviert. Diese stimulierten Lympho- blasten wurden durch Übernacht-Behandlung mit RPMI 1640 ent¬ haltend 5 % fötales Kälberserum, 15 % T-Zell-Wuchsfaktor (Überstand von ConA-aktivierten Mausmilzzellen) supplemen- tiert mit 80 % Retrovirus (6x 106pfu/ml) und 8 μg/ml Poly¬ pren transduziert. Virus enthaltender Überstand wurde durch wiederholtes Waschen entfernt und transduzierte R4-Lymphocy- ten wurden RPMI 1640-Medium resuspendiert und in einer 5 % CO2 enthaltenden Atmosphäre bei 37°C gezüchtet. Konditio- nierte Medien von jeweils 10 Wildtyp (R4)-, NGF-Retrovirus transduzierten (R4NGF) - oder scheintransfizierten (Retrovirus, das nicht NGF codiert; R4mock) R4-Lymphocyten wurde auf NGF-Konzentration (pg/ml) 12 Stunden nach der Transfektion durch einen zwei Bindungsstellen testenden Immuntest (S. Korsching et al . , Proc Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 3513-3516) getestet. Das Ergebnis dieses Versuches zeigt, daß Wildtyp R4-Zellen und R4-Zellen, die scheintrans- fiziert wurden, keine nachweisbaren Mengen an NGF produzier¬ ten. Dagegen schieden mit dem NGF-Retrovirus transduzierte R4-Lymphocyten mehr als 2000 pg/ml NGF in das Kulturmedium ab (Fig. lb) . Die NGF-Produktion durch R4-Zellen ist derje¬ nigen von genetisch veränderten Ratten-Fibroblasten ver¬ gleichbar, die durch Übertragung in das zentrale Nervensy¬ stem verwendet wurden, um NGF zur Behandlung von experimen¬ tell erzeugten neurodegenerativen Krankheiten bereitzustel¬ len (M.D. Kawaja et al . , J. Neurosci. 12 (1992), 2849-2864) . Die Transduktion an sich änderte weder die Antigenspezifität noch die proliferative Aktivität der R4-Zellen; das Thl-ähn- liche Sekretionsmuster an Cytokinen mit einer starken Pro¬ duktion von 11-2 und Interferon-7 blieb ebenso unverändert (Ergebnisse nicht dargestellt) .
Beispiel 2
In vivo-Migration von mit dem NGF-Gen transduzierten neuri- togenen T-Zellen
Die transduzierten R4-Lymphocyten infiltrierten das peri¬ phere Nervensystem in gleichem Umfang wie Wildtyp- oder scheintransfizierte R4-Zellen (Fig. 4) . 14 Tage nach der in- travenösen Injektion von NGF-transduzierten R4-Zellen konnte durch in situ-Hybridisierung (Fig. lc) gezeigt werden, daß diese genetisch veränderten Lymphocyten NGF-mRNA im periphe- rem Nervensystem in vivo noch stark exprimieren. Für die In¬ jektion wurden 2, 5xl06-stimulierte Wildtyp (R4) , NGF-trans- duzierte (R4NGF) oder scheintransfizierte (R4mock) -R4-Lym¬ phocyten in die Schwanzvene Ether-anästhesierter Lewis-Rat¬ ten in einem Gesamtvolumen von 1 ml am Tag 0 injiziert. Kli¬ nische Symptome wurden nach der folgenden Einstufung aufge¬ zeichnet: 1: Teilverlust des Schwanztonus; 2: vollständiger Verlust des Schwanztonus; 3: Paraparese der Hinterbeine; 4: Paralyse der Hinterbeine; 5: Paraparese der Vorderbeine. Alle Werte sind hier als Mittelwerte jeder Gruppe (n = 3) gegeben, wobei Standardabweichungen zwischen Tag 0 und Tag 9 eingeschlossen ist.
Die Tiere wurden 14 Tage nach der Injektion von 2,5x10 R3- T-Lymphocyten geopfert und mit 4 % Paraformaldehyd enthal¬ tend 0,5 % Glutardialdehyd in 0,1 M phosphat-gepufferter Kochsalzlösung perfundiert, mit demselben Fixierungsmittel über Nacht bei 4°C immersionsfixiert und anschließend in Epon nach üblichen Verfahren eingebettet. Es wurden 1 um Se¬ mithinschnitte hergestellt und mit 0,1 % Toluidinblau ge¬ färbt, um das Ausmaß der Demyelinierung abzuschätzen; die Maßeinheit beträgt hier 2,5 μm. Ultradünne Schnitte wurden hergestellt und für die Elektronenmikroskopie aufbereitet, wie von J.Gehrmann et al. Lab. Invest. 67 (1992) 100-113 be¬ schrieben; eine Einheit auf der Skala beträgt 1 μm.
Rinderserumalbumin oder NGF wurden Ether-anästhesierten Lewis-Ratten durch Implantation eines Schwammgelkissens (Spongostan) verabreicht, das entweder 125 μg NGF (2,5 S) oder 250 μg BSA (Sigma, Cohn-Fraktion V) in 50 μl 0,9 % Na¬ triumchlorid enthielt . Die Verabreichung erfolgte in der Nähe des linken oder des rechten Ischiasnerves in der sub- glutealen Region derselben Ratte 24 Stunden vor der Injek¬ tion von 2,5x 106 Wildtyp-R4-Zellen. EDI- und W13-positive Zellen wurden aus fünf Bereichen jedes Präparats (n=3) ge¬ zählt und die Werte als Mittelwerte einschließlich der Stan¬ dardabweichung in Zellen pro mm2 gegeben.
Für die in situ-Hybridisierungen wurden Cryostatschnitte (10 μm) der Ischiasnerv-Präparationen (der Länge nach geschnit¬ ten) unter stringenten Bedingungen entweder mit einzelsträn- gigen s35-markierten Antisense (oberes und mittleres Schau¬ bild) oder sinnorientierter (unteres Schaubild) NGF-spezifi- scher cDNA-Sonden hybridisiert, die durch reverse Transkrip¬ tion aus sinn- oder antisense-NGF-cRNA nach üblichen Verfah¬ ren (E. Castren et al . , Proc. Natl . Acad. Sei. USA 89 (1992) 9444-9448) hergestellt worden waren.
Beispiel 3
Antiinflammatorische Wirkung von lokal freigesetztem NGF
Die durch NGF-transfizierte R4-Zellen verursachten morpholo¬ gischen Änderungen unterschieden sich deutlich von typischer EAN, die durch nicht- oder scheintransfizierte R4-Zellen herbeigeführt wurde (Fig. 3) . Die Demyelinierung der Ischiasnerv-Axone V/L r 14 Tage nach dem Transfer von NGF-syn- thetisierenden R4-Lymphocyten drastisch reduziert (Fig. 3c) wohingegen die mit dem Wildtyp (Fig. 3a) oder mit den scheintransfizierten R4-Zellen (Fig. 3b) behandelten Tiere die typischen Veränderungen der peripheren Myelinscheiden aufwiesen. Die immuncytochemischen Färbungen mit dem T-Lym- phocyten-Marker W3/13 zeigten keine signifikanten Unter¬ schiede zwischen der Anzahl von Wildtyp- oder von genetisch veränderten R4-Lymphocyten, die den Ischiasnerv infiltrier¬ ten (Fig. 4e) . Im auffallenden Gegensatz zu den klassischen EAN-Läsionen wurden jedoch nach Transfer mit NGF-sezernie- renden R4-Zellen ausgesprochen wenige Makrophagen nachgewie¬ sen, wobei als Nachweissystem der lysosomale Marker EDI diente (Fig. 4e) . Die veränderte Pathogenität genetisch modifizierter NGF-pro- duzierender T-Zellen kann theoretisch zwei Gründe haben:
(a) Die genetische Modifikation an sich könnte das pathogene Eigenpotential der neuritogenen T-Zellen vermindert ha¬ ben, oder
(b) das durch die genetisch veränderten T-Zellen syntheti¬ sierte NGF könnte die starke Verminderung der Demyeli- nierung bewirkt haben.
Sofern lokal freigesetzte NGF für die verminderte Pathogeni¬ tät verantwortlich ist, sollte exogen verabreichtes NGF einen ähnlichen Effekt auf die Makrophagenaktivierung haben. Tatsächlich zeigte die örtliche Verabreichung von NGF-Pro- tein durch Implantation eines Schwammgelkissens in vivo die¬ selbe Verminderung an Makrophageninvasion wie die NGF-produ- zierenden R4-Zellen (Fig. 4d) . Die Implantation eines BSA enthaltenden Schwammgelkissens auf der contralateralen Seite (Fig. 4c) hatte hingegen keinen Einfluß auf die typische Ma- krophagenrekrutierung bei durch den Transfer von Wildtyp R4- Zellen induzierter EAN. Die Anzahl von W3/13 positiven Zel¬ len auf den unterschiedlich behandelten Seiten der Ratten waren die gleichen (Fig. 4c, d) .

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Genetisch veränderte, reife T-Zelle mit den folgenden Eigenschaften:
(a) ihr Rezeptor ist autoreaktiv; un "
(b) sie trägt in ihrem Genom mindestens ein extern ein¬ geführtes, in reifen T-Zellen normalerweise nicht exprimiertes Gen, das zur Expression eines (Poly) peptids fähig ist.
2. T-Zelle nach Anspruch 1, wobei das exprimierte (Poly)peptid auf der Oberfläche exponiert oder sezer- niert wird.
3. T-Zelle nach Anspruch 1, wobei das exprimierte (Poly)peptid die Expression endogener Proteine hemmt oder aktiviert, wobei die Hemmung oder Aktivierung zu einer Veränderung des Musters an der Oberfläche expri- mierter endogener (Poly)peptide oder sezernierter (Poly) peptide bewirkt.
4. T-Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Re¬ zeptor gegen ein Epitop des Nervensystems gerichtet ist.
5. T-Zelle nach Anspruch 4, wobei das Epitop ein Epitop des zentralen Nervensystems ist.
6. T-Zelle nach Anspruch 4, wobei das Epitop ein Epitop des peripheren Nervensystems ist .
7. T-Zelle nach Anspruch 6, wobei das Epitop ein Epitop des Myelinproteins P2 oder S100 ist.
8. T-Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Epitop ein Epitop eines zustandsspezifischen Proteins, APP, eines gewebespezifsehen Proteins, eines Rezeptor- proteins, eines Cytoskelettproteins oder der Tyrosin-Hy- droxylase ist.
9. T-Zelle nach einem der Ansprüche 1, 2 und 4 bis 7, wobei das exprimierte (Poly)peptid ein neutropher Faktor ist.
10. T-Zelle nach Anspruch 8, wobei der neurotrophe Faktor NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5 und NT-6 ist.
11. T-Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 10, die den CD4+ CD8"-Phänotyp aufweist.
12. T-Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 10, die den CD4" CD8+-Phänotyp aufweist.
13. T-Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das ex¬ tern eingeführte Gen unter der Kontrolle retroviraler Regulationselemente steht.
14. T-Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das ex¬ tern eingeführte Gen unter der Kontrolle eines induzier¬ baren Promotors steht.
15. T-Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das ex¬ tern eingeführte Gen unter der Kontrolle T-Zell-spezifi- scher Regulationselemente steht.
16. T-Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das ex¬ tern eingeführte Gen rekombinanter Bestandteil des Ge¬ noms eines lytischen/lysogenen T-Zell-spezifischen Virus ist, welches die T-Zelle nach Anheftung des Rezeptors an das Zielepitop lysieren kann.
17. Arzneimittel, enthaltend eine T-Zelle nach einem der An¬ sprüche 1 bis 16 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
18. Verwendung einer T-Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Behandlung degenerativer Erkrankungen, Lasionen, Traumata, Infektionen, Autoimmunkrankheiten, Immun- suppressionen, Tumoren, ALS, vaskulärer Insulte, Alzhei¬ mer-Krankheit, Parkinson1 scher Krankheit, Multipler Sklerose oder akuter Ödeme.
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