DE69935862T2

DE69935862T2 - Guanylat-bindendes protein (gbp-1) als inhibitor der zellproliferation

Info

Publication number: DE69935862T2
Application number: DE69935862T
Authority: DE
Inventors: Michael STÜRZL; Emmanuelle Cornali
Original assignee: Stuerzl Michael Prof Dr Rer Nat
Current assignee: Stuerzl Michael Prof Dr Rer Nat
Priority date: 1998-08-26
Filing date: 1999-08-23
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2019-08-24
Also published as: DK1108046T3; US6894157B2; DE69935862D1; EP1736547A1; CA2340596A1; EP1108046B1; US20020115138A1; JP2002523104A; ES2286893T3; US20060025362A1; AU5518499A; EP1108046A1; ATE360081T1; WO2000012737A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen retroviralen Expressionsvektor, welcher das Guanylat Bindungsproteine 1 (GBP-1) Gen fusioniert an ein Transportprotein (Shuttleproteine) umfasst. Das Einführen des besagten Vektors, welcher besagtes Gen umfasst, in Zellen, kann dazu verwendet werden, phänotypische Veränderungen der besagten Zellen auszulösen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Ein gesundes luminales Endothel besteht aus ruhenden Endothelzellen, die eine regelmäßig organisierte und eine relativ nicht-adhäsive Oberfläche gegenüber den Blutbestandteilen bilden. Diese Verbindungsfläche ist jedoch dynamisch und der Phänotyp von Endothelzellen kann tiefgreifende Änderungen durchlaufen, die zu einem aktivierten Phänotyp führen. Der aktivierte Phänotyp stellt eine über Zeit- und Dosis-integrierte Antwort auf verschiedene Stimuli dar, die aus dem zirkulierenden Blut und/oder von benachbarten Zellen und Geweben ausgehen. Unter diesen Stimuli wurde für inflammatorische Zytokine (IC), wie Interleukin-1-beta (IL-1β), Tumor Nekrose Faktor-alpha (TNF-α) und Interferon-gamma (IFN-γ) oder angiogener Wachstumsfaktoren (AGF), wie vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) oder dem basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) gezeigt, dass diese Endothelzellen durch ein Verändern deren Genexpressionsmuster aktivieren und dadurch deren Eigenschaften und Phänotyp verändern. Mit Bezug auf die biologischen Aktivitäten von Endothelzellen können zwei verschiedene aktivierte Phänotypen unterschieden werden (1). Auf der einen Seite gibt es einen adhäsionskompetenten und nicht proliferierenden Phänotyp, der durch IC induziert werden kann. Der andere, ziemlich gegensätzliche Phänotyp wird durch eine erhöhte Beweglichkeit und Zellproliferation charakterisiert und ist durch AGF induzierbar. Unter in vivo Bedingungen aktivieren potentiell alle Zytokine und Wachstumsfaktoren die Endothelzellen. Dem zufolge hängt der Phänotyp von Endothelzellen von deren Fähigkeit ab, auf das lokale Gleichgewicht der Konzentration von inflammatorischen Zytokinen und Wachstumsfaktor zu reagieren.
Die IC wie IL-1β, TNF-α oder IFN-γ werden hauptsächlich durch aktivierte Lymphozyten, Monozyten oder Makrophagen sezerniert. Neben vielen anderen stimulierenden oder regulatorischen Wirkungen auf verschieden Zelltypen ist den besagten IC's die Heraufregulierung der Expression von Adhäsionsmolekülen – wie ICAM-1, VCAM-1 oder ELAM-1 – an der Oberfläche von Endothelzellen gemeinsam. Dies führt zu einem adhäsionskompetenten Zustand der Zellen. Dieser adhäsionskompetente Zustand wird als die Zeitspanne definiert, in welchen eine Zelle in der Lage ist an andere Zellen oder an eine extrazelluläre Matrix anzuheften. Ein wohl bekanntes Beispiel ist die erhöhte Adhäsion von aktivierten Leukozyten an das Endothel. Darüber hinaus wurde beschrieben, dass IL-1β, IFN-γ und TNF-α eine proliferationshemmende Wirkung (anti-proliferativer Effekt) auf Endothelzellen ausüben. Weiterhin wurde gezeigt, dass IFN-γ und TNF-α in vitro Apoptosis von Endothelzellen auslösen können.
Im Gegensatz hierzu agieren die AGFs, wie VEGF und bFGF als potente Mitogene und chemotaktische Faktoren für Endothelzellen. bFGF ist ein pleiotroper Faktor, der in nahe zu allen normalen Geweben gefunden wurde und der eine breite Spezifität für eine Anzahl von Zielzellen aufweist. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass bFGF in vitro und in vivo Angiogenese induziert. VEGF ist ein sezerniertes Protein, welches eine hohe Spezifität für Endothelzellen zeigt und die Angiogenese während normalen physiologischen Abläufen unterstützt. Darüber hinaus induziert VEGF deutlich eine mikrovaskuläre Permeabilität, was sich auch als ein allgemeines Merkmal einer Tumor-assoziierten Mikrovaskularität darstellt. Mehrere Beweislinien legen nahe, dass VEGF und bFGF, die eine synergistische Wirkung auf die Induktion von Angiogenese in vitro und in vivo in einem Mausmodel haben, auch zu den pathologischen Abläufen einer Tumor-assoziierten Angiogenese beitragen könnten (Plate et al., 1992, Vascular endothelial growth factor is a potential tumor angiogensis factor in human gliomas in vivo. Nature 359, 845-848).
Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Aktivierung von Endothelzellen eine wichtige Rolle in vielen physiologischen Anpassungen oder auch pathologischen Fehlfunktionen, wie Entzündung, Hämostase, Immunreaktionen, Psoriasis, Atheriosklerose, Wundheilung, Angiogenese und Neovaskularisation z. B. bei malignen Tumoren spielt (Cotran & Pober, 1988, Endothelial activaton: its role in inflammatory and immune reactions. In Endothelial Cell Biology, N. Simionescu and M. Simionescu, eds. (New York: Plenum Press, pp. 335-347), ist es von herausragender Bedeutung die verschiedenen Aktivierungszustände von Endothelzellen zu verstehen, zu beeinflussen und zu kontrollieren. Zusätzlich wäre eine klare Bestimmung der verschiedenen Phänotypen von Endothelzellen von besonderem Interesse für eine Entscheidung bezüglich einer geeigneter therapeutischen Strategie, die einem Patienten Erleichterung verschaffen kann, der an medizinischen Syndromen, die in Zusammenhang mit der Aktivierung von Endothelzellen – wie sie oben erwähnt sind – stehen, leidet.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren zur Hemmung der Proliferation von Zellen, z. B. Tumorzellen, bereit zu stellen, die für die Behandlung von Krankheiten geeignet sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Während der ausführlichen Untersuchungen der verschiedenen Aktivierungsstadien von Endothelzellen haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ein Gen identifiziert, welches nahezu ausschließlich in den, unterschiedlichen Phänotypen von Endothelzellen exprimiert ist. Dieses Gen wurde als Guanylat Bindungsprotein 1 (GBP-1) Gen identifiziert. Das GBP-1 Protein wurde ursprünglich in vitro als ein reichlich vorkommendes, Interferon-induzierendes Protein in menschlichen oder Mausfibroblasten entdeckt (Cheng et al., 1983, Interferon induction of fibroblast Proteins with guanylate binding activity. J. Biol. Chem. 258, 7746-7750), welches auf Guanylat Agarose Affinitätssäulen zurückgehalten wurde. Im Anschluss hieran, wurde GBP-1 als das erste Mitglied eine neuen Familie von GTP-Bindungsproteinen, den GBPs (Cheng et al., 1991) identifiziert, welche durch Interferon (IFN) stark induzierbar sind. Ein CaaX-Motiv am C-Terminus des menschlichen GBP-1 dient als ein Isoprenylierungssignal, welches die Anheftung von einem 20-Kohlenstoffatommolekül erlaubt, welches wiederum dazu dient das Protein in einer Membran zu verankern (Schwemmle et al., 1994, The interferon-induced 67-kDA guanylate-binding Protein (hGBP1) is a GTPase that converts GTP to GMP. J. Biol. Chem. 269: 11299-11305). Die physiologische Rolle von GBP-1 blieb bis heute unerkannt.
Das Protein, welches von dem GPB-1 Gen kodiert wird, wurde nun als ein zellulärer Faktor identifiziert, der die Differenzierung von wenigstens zwei bekannten Phänotypen von aktivierten Endothelzellen induziert. Die Erfinder beschreiben und beweisen hierin zum ersten Mal eine biologische Funktion, welche mit der GBP-1 Genexpression zusammen hängt (2). Entsprechend wurde hier gezeigt, dass auch die beiden unterschiedlichen Aktivierungsstadien bzw. Phänotypen von Endothelzellen sich in der GBP-1 Expression auf molekulare Ebene klar unterscheiden und gegenseitig ausschließen. Dem entsprechend ist die Differenzierung zur Zellmotilität und Zellproliferation des angiogenen Phänotyps von Endothelzellen auf eine Herunterregulierung der GBP-1 Genexpression durch AGF zurückzuführen. Auf der anderen Seite wurde gezeigt, dass eine erhöhte Expression des GBP-1 Genprodukts auf einer Induktion durch IC zurück zu führen ist und dass die erhöhte Expression von GBP-1 die Differenzierung eines adhäsionskompetenten und nicht proliferativen endothelialen Phänotyps induziert. Die Erfinder legen Beweise vor, dass die gesamte Gruppe der inflammatorischen Zytokine und nicht nur einige Mitglieder, wie IFN-γ, den adhäsionskompetenten und nicht proliferativen Phänotyp induzieren. Dies ist insbesondere für Endothelzellen überraschend, da die Wirkung von Zytokinen vorzugsweise an Zellen des Immunsystems untersucht wird. Ein detailliertes Verständnis der molekularen und zellulären Zusammenhänge bei der durch GBP-1 induzierten Endothelzellaktivierung ist Voraussetzung für die Entwicklung von Therapeutika und Diagnostika, die in die Regulation und Differenzierung von Zellen vorzugsweise Endothelzellen, eingreifen.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung einen retroviraler Expressionsvektor bereit, der eine Nukleinsäuresequenz, die das Guanylat Bindungsproteins-1 Gen (GBP-1) als ein Fusionsprotein mit einem geeigneten Shuttleprotein kodiert, umfasst. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu erwähnen, dass sich der Begriff „GBP-1 Gen", wie er hierin verwendet wird, auf alle Nukleotidsequenzen bezieht, die für eine funktionelle Form des GBP-1 Proteins kodieren, einschließlich spezieller, natürlich vorkommender Varianten des menschlichen GBP-1 Genes.
Die vorliegende Erfindung stellt einen retroviralen Vektor bereit, der das GBP-1 Gen im Leseraster verbleibend, fusioniert an eine Nukleinsäuresequenz, welche ein Shuttleprotein kodiert, umfasst. Dieser Vektor kann daher eingesetzt werden, um rekombinantes GBP-1 Fusionsprotein gemäß dem Verfahren der Erfindung zu produzieren.
Im Anschluss an eine Infektion oder Transfektion eine eukaryontischen Zielzelle mit besagtem Vektor wird das GBP-1 Gen in der Zelle exprimiert. Auf Grund der Insertion des Vektors, welcher das GBP-1 Gen exprimiert, erhöht sich der intrazelluläre Gehalt des GBP-1 Genproduktes. Überraschenderweise wurde gezeigt, dass durch die Zunahme der Menge an intrazellulärem GBP-1 die Differenzierung von Endothelzellen in die Richtung eines adhäsionskompetenten und/oder nicht proliferativen endothelialen Phänotyps induziert wird. Die vermehrte Expression von GBP-1 Gen in besagten Zellen resultiert in einer Abnahme der Proliferationsaktivität und/oder eine Zunahme der Zell-zu-Zell Adhäsion.
Die bevorzugten Zielzellen, die mit dem Vektor transduziert werden, sind Endothelzellen, insbesondere Endothelzellen, die in eine Neovaskularisation und in das Rekrutieren von inflammatorischen Zellen im Gewebe involviert sind. Überraschenderweise wurde auch gezeigt, dass eine vermehrte Expression des GBP-1 Gens in Nicht-Endothelzellen ebenso einen nicht proliferativen Phänotyp induziert. Dies ist z. B. der Fall in inflammatorischen Zellen und Immunzellen, wie Monozyten oder Lymphozyten, jedoch auch in anderen Zelltypen. Dem gemäß können durch eine gerichtete Induktion der besagten phänotypischen Veränderungen durch die Einführung des Vektors insbesondere pathologische Fehlfunktionen wie Krebs, Sarkom, Lymphom, Hämangiom, Atheriosklerose oder Restenose behandelt werden, da die Abnahme der Proliferation und Zunahme des Zell-zu-Zell Adhäsion diese Symptome lindert.
Zusätzlich kann der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung auch in Zelllinien eingeführt werden, vorzugsweise Fibroblasten, die als „Feederzellen" (Ernährer) zu Kultivierung von komplexen oder in anderer Weise relevanten Zellen eingesetzt werden. Sofern komplexe Zelltypen, z. B. Keratinozyten, in vitro kultiviert werden, müssen sie mit eine bis heute unbekann ten Zusammensetzung von Faktoren versorgt (gefüttert) werden. Im Fall von Keratinozyten werden diese Faktoren durch Fibroblasten bereitgestellt, den so genannten Ernährerzellen, welche kokultiviert werden. Eine Kokultivierung hat jedoch den Nachteil, das Fibroblasten, die eine höherer Wachstumsrate haben, früher oder später die Keratinozyten einfach überwachsen. Daher werden Fibroblasten, die als Ernährerzellen eingesetzt werden, normalerweise mit einem hochtoxischen Zytostatikum (Mitomycin C) behandelt, um einen Wachstumsstillstand zu erziehen. Diese hat zur Folge, dass auch kokultivierte Keratinozyten mit geringen Konzentrationen des Zytostatikums in Kontakt kommen. Sofern Keratinozyten für therapeutische Zwecke verwendet werden, muss ein solcher Kontakt jedoch vermieden werden. Gemäß der vorliegende Erfindung wird der Vektor gemäß der Ansprüche oder der virale Partikel gemäß der Ansprüche in Ernährerzellen, wie Fibroblasten, eingeführt. Danach wird die GBP-1 Expression verstärkt und dem entsprechend das Wachstum der besagten transduzierten Zellen reduziert. So können Fibroblasten oder jeder andere Ernährerzelllinie ohne den Einsatz von zytostatischen Toxinen in ihrem Wachstum arretiert werden.
Die Expression der Nukleinsäuresequenz, welche für das GBP-1 fusioniert mit einem Shuttleprotein kodiert, steht gemäß einer Ausführungsform der vorliegende Erfindung unter der transkriptionellen Kontrolle einer normalen (homologen) zellulären Sequenz, die auch die Expression eines normalen GBP-1 Genes reguliert. Die Verwendung der normalen regulatorischen Elemente kann insbesondere wichtig sein, wenn der Vektor, der das GBP-1 Gen trägt, in der Gentherapie eingesetzt wird. Gewöhnlich schließen Verfahren der Gentherapie den Austausch eines nicht funktionierenden Gens mit einem entsprechenden funktionierenden Gen ein. Bei einem solchen Austausch ist es höchst wünschenswert, dass das neu eingeführte Gen unter derselben physiologischen Kontrolle wie das natürliche Gen steht. Daher ist es im Falle, dass das GBP-1 Gen in der Gentherapie eingesetzt wird, zu bevorzugen, dass es unter der transkriptionellen Kontrolle seines normalen Promotors steht. Dem gemäß ist das neu eingeführte GBP-1 Gen unter derselben physiologischen Kontrolle wie ein natürliches GBP-1 Gen. Aufgrund des Austausches eines nicht funktionierenden mit einem funktionierenden GBP-1 Gen kann die physiologische Aufgabe des GBP-1 Genes wieder hergestellt werden.
Alternativ, gemäß einer weiteren Ausführungsform steht die Nukleinsäuresequenz, die für das GBP-1 Gen fusioniert mit einem Shuttleprotein kodiert, unter der transkriptionellen Kontrolle eines heterologen Promotors. Der Begriff „heterolog" wird nachfolgend verwendet für jede Kombination eine DNA Sequenz, die normalerweise in der Natur nicht eng assoziiert gefunden wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der heterologe Promotor ein Verstärkerelement oder jeder andere Promotor, der die Genexpression anregt, sein. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die heterologen Promotoren konstitutiv, induzier bar und/oder zelltyplimitierte Promotoren, welcher die Expression von GBP-1 Genen oder Teilen desselben in einem Wirtsorganismus antreiben. Konstitutive Promotoren werden fortwährend in einer Zelle exprimiert. Da sie oft von einem regulatorischen Element eines zellulären „house keeping" Gens oder eines strukturellen Gens eines Viruses abstammen, sind sie verhältnismäßig wenig anfällig gegenüber den meisten inhibierenden oder aktivierenden Stimuli. Im Gegensatz zu konstitutiven Promotoren sind induzierbare Promotoren genau reguliert und nur in der Anwesenheit eines geeigneten „inducer molecules" aktiv. Der Vorteil eines induzierbaren Promotors ist seine kontrollierbare Aktivierung der Genexpression durch von außen zugegebene Inducer- oder Repressormoleküle. Auch zelltyplimitierte Promotoren können als induzierbare Promotoren verstanden werden. In diesem Fall kann besagter Promotor durch interne Inducer- oder Repressormoleküle aktiviert werden, welche durch den bestimmten Zelltyp bereitgestellt werden. Daher sind besagte Promotoren nur in solchen bestimmten Zelltypen aktiv, während in allen anderen Zellen die Transkription von besagten Promotoren verhindert oder wenigstens reduziert wird.
Ein heterologer Promotor wird eingesetzt, um das GBP-1 Gen fusioniert mit einem Shuttleprotein in der transduzierten Zelle zu überexprimieren.
Die Überexpression des GBP-1 Genes fusioniert mit einem Shuttleprotein ist insbesondere geeignet die Proliferation von unkontrolliert wachsenden Zellen, wie bei malignen Tumoren, Karzinomen oder Lymphomen zu unterbinden. Sie ist aber auch geeignet um das weitere Einwandern von Zellen zu verhindern, die eine Tumorangiogenese induzieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Vektor wenigstens ein Gen, welches eine Substanz, die eine GBP-1 Genexpression induziert und/oder verstärkt, kodiert. Für ein Induzieren und/oder Verstärken der GBP-1 Expression, aktivieren besagte Substanzen die regulatorischen Elemente, welche die GBP-1 Genexpression kontrollieren. Daher kann das in den Vektor inserierte Gen, welches eine Substanz kodiert, die die GBP-1 Genexpression induziert und/oder verstärkt, von den regulatorischen Elementen und Promotoren, die die GBP-1 Genexpression kontrollieren, abhängig sein: z. B. kann der homologe Promotor, der die normale zelluläre GBP-1 Genexpression kontrolliert, durch Zytokine induziert sein. In dem Fall, dass das mit einem Shuttleprotein fusioniert GBP-1 Gen des Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung unter der transkriptionellen Kontrolle des normalen, homologen Promotors steht, welcher gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zusätzlich wenigstens ein Zytokin wie das Gen für Interleukin, Tumor- Nekrosefaktor oder Interferon trägt. Die Expression des besagten Zytokins induziert oder verstärkt daher weiter die Expression des GBP-1 Gens.
Darüber hinaus, wenn ein induzierbarer Promotor für die transkriptionelle Kontrolle der GBP-1 Genexpression verwendet wird, trägt der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung das Gen, welches das entsprechende Inducermolekül des induzierbaren Promotors kodiert. Dem entsprechend trägt der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung in dem Fall wo ein zelltyplimitierter Promotor verwendet wird, das Gen, welches den limitierenden, zellspezifischen Faktor kodiert, der den zelltyplimitierte Promotor induziert und/oder verstärkt. Der Expressionsvektor, welcher das GBP-1 Gen fusioniert mit einem Shuttleprotein kodiert, ist ein retroviraler Vektor. Der besagte viraler Vektor umfasst daher alle Gene und Faktoren, die benötigt werden, um besagten Transfer der heterologen genetische Information in eine Zielzelle zu ermöglichen.
Der Vektor der Erfindung basiert auf einem Retrovirus. Retroviren oder retrovirale Vektoren sind ideale Vehikel für den Transport von genetische Information in eine Zielzelle sowohl in vivo wie auch in vitro. Zum Ersten sind Retroviren und retrovirale Vektorsysteme gut untersucht und daher heutzutage das bevorzugte System für eine Gentherapie. Zum Zweiten sind retrovirale Vektoren leicht zu handhaben und anzupassen. Für die Konstruktion eines rekombinaten retroviralen Vektors wird ein DNA Plasmid gemäß einem Standardprotokoll hergestellt, um die gewünschte genetische Information und die essentiellen Gene für das retrovirale Genom zu tragen. Nach der Transfektion einer Zelle mit besagtem DNA Vektor wird das retrovirale RNA Genom transkribiert und in ein infektiöses, replikationskompetentes Partikel verpackt. Dieses Partikel wird aus dem Überstand der Zellen isoliert und dazu verwendet eine Zielzelle in vivo oder in vitro zu infizieren. Direkt nach der Infektion wird das retrovirale RNA Genom revers in eine DNA Kopie transkribiert, welche nachfolgend stabil in das zelluläre Genom integriert wird.
Es müssen jedoch auch Sicherheitsaspekte berücksichtigt werden. Die stabile Integration des retroviralen Genoms in das Genom der Zielzelle birgt das Risiko eines genetischen Rearangements oder eine Deregulierung von zellulären Faktoren, einschließlich Proto-Onkogenen. Auch wenn die Chancen ziemlich gering sind, ist dennoch anerkannt, dass besagtes Risiko mit der Anzahl der Infektionsereignisse ansteigt. Daher ist der retrovirale Vektor gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezüglich der Replikation defekt. Dem Genom eines derartigen retroviraler Vektors, der bezüglich der Replikation defekt ist, fehlt die genetische Information von einem oder mehreren der Proteine, die zur Partikelbildung benötigt werden. Daher wird gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Produzentenzelle bereitgestellt, welche alle Proteine, die zur Partikelbildung und zur Verpackung des besagten Vektors benötigt werden, kodiert und exprimiert.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden auch virale Partikel bereitgestellt, die den viralen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen und/oder aus dem Überstand besagter Produzentenzellen isoliert wurden. Retrovirale Partikel werden verwendet, um Zellen entweder in vivo oder in vitro zu infizieren.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung den retroviralen Provirus bereit, wobei es sich um die integrierte DNA Kopie des retroviralen Vektors handelt und welcher wie jedes andere natürlich vorliegende Gen in eine mRNA transkribiert wird. Folglich stellt die vorliegende Erfindung auch die mRNA, die dem retroviralen Provirus entspricht, die RNA und cDNA des viralen Vektors wie oben beschrieben und die Zellen, welche mit besagten viralen Vektoren transfiziert sind und/oder mit besagten retroviralen bzw. viralen Partikel infiziert sind, zur Verfügung. Darüber hinaus ist besagte Zelle gemäß eines noch weiteren Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung eine Endothelzelle, sie kann jedoch auch jede andere Zelle wie z. B. eine Immunzelle sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Einführung der Nukleinsäuresequenz, welche das GBP-1 Gen fusioniert mit einem Shuttleprotein kodiert, in Zellen in vitro bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst unter anderem die Transfektion einer Zelle mit den Vektoren oder der RNA gemäß der vorliegenden Erfindung oder die Infektion besagter Zellen mit den viralen Partikeln. Um die Menge der effizient transduzierten Zellen zu erhöhen, können die transfizierten oder infizierten Zellen unter Selektionsdruck gesetzt werden.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten GBP-1 Fusionsproteins bereit. Zur Herstellung z. B. in eukaryontischen Zellen werden diese Zellen mit dem eukaryontischen Vektor, der das GBP-1 Gen fusioniert mit dem Shuttleprotein kodiert, transfiziert und/oder mit einem viralen Partikel, welcher für das GBP-1 Gen fusioniert mit dem Shuttleprotein kodiert, infiziert. Besagte Zellen werden unter geeigneten Bedingungen kultiviert bis das rekombinante GBP-1 Fusionsprotein isoliert wird. Dieses Verfahren erlaubt eine rentable Herstellung von großen Mengen des rekombinanten GBP-1 Fusionsproteins, welches dann als Vakzine oder zur Behandlung von proliferativen Fehlfunktionen von Zellen verwendet werden kann.
Wenn das reine GBP-1 Protein extrazellulär auf Zellen aufgebracht wird, ist es vermutlich nicht in der Lage die Zellmembranen zu durchqueren und kann daher nicht in das Zytoplasma und/oder den Kern der Zelle eindringen. Die vorliegende Erfindung wird daher dazu verwendet ein Fusionsprotein des GBP-1 Proteins mit einem so genannten „Shuttleprotein" herzustellen. Es wurde gefunden dass Shuttleproteine – extrazellulär aufgebracht – in der Lage sind, in das Zytoplasma und/oder den Kern einzudringen. Entsprechend wird das GBP-1 Protein in der Lage sein in die Zelle einzudringen, wenn es an ein solches Shuttleprotein fusioniert ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das HIV1-tat Gen an das GBP-1 Gen fusioniert, da gezeigt worden ist, das HIV1-tat insbesondere in der Lage ist in solche Zellen einzudringen, die ein αVβ3 Molekül auf ihre Oberfläche tragen. Solche Moleküle sind unter anderen auf aktivierten Endothelzellen sowie auf Zellen von proliferierenden Tumoren exprimiert. Dem entsprechend ist die Aufnahme eines GBP-1-HIV1-tat Fusionsproteins in solche Zellen erleichtert.
Darüber hinaus offenbart die vorliegende Anmeldung Oligonukldeotide die unter stringenten Bedingungen in Sense- oder Antisense-Orientierung an eine Nukleinsäuresequenz hybridisieren, welche das GBP-1 Gen, Teile desselben oder regulatorische Elemente desselben kodiert. Der Begriff „unter stringenten Bedingungen" definiert Parameter bezüglich Standardprotokolle, wie die Reaktionstemperatur, welche eine Hybridisierung von DNA-DNA und/oder DNA-RNA Sequenzen mit einer Homologie von um die oder über 70 % erlaubt. Allgemein gesprochen können Oligonukleotide durch einen DNA-Verdau hergestellt werden oder sie sind chemisch, enzymatisch oder in vitro synthetisierte Nukleinsäuresequenzen, wie RNAs oder DNAs, welche komplementär zu einer Zielnukleinsäuresequenz sind. Die Länge eines Oligonukleotids ist variabel und hängt in erster Linie von der Schmelztemperatur der ausgewählten Sequenz ab. Sofern die Schmelztemperatur eines Oligonukleotids gemäß der vorliegenden Erfindung unter 35°C fällt, muss die Länge des Oligonukleotids verlängert werden. Darüber hinaus können die Oligonukleotide gemäß der vorliegende Erfindung weiter modifizierte DNA oder RNA Moleküle sein, welche unter Verwendung von modifizierten Nukleotiden wie z. B. Desoxy-, Phosphothioester- oder Methoxy-modifizierten Nukleotiden synthetisiert wurden.
Die vorliegende Anmeldung offenbart Oligonukleotide welche in Sense- oder Antisense-Orientierung an das GBP-1 Gen und/oder dessen regulatorische Elemente hybridisieren. Besagte Oligonukleotide werden vorzugsweise aus den folgenden Nukleotidsequenzen ausgewählt: 5'-CTT TTT CTC CTT AGT TCA CG-3' (Seq ID Nr.: 1), 5' TCC CTT GTC TGT TCT TTT TC-3' (Seq ID Nr.: 2), 5'-TCC CTT GTC TGT TCT TTT TCT CCT TAG TTC-3' (Seq ID Nr.: 3), 5'-GCT CTA GAT TAG CTT ATG GTA CAT GCC TTT CG-3' (Seq ID Nr.: 4), 5'-CGG AAT TCG CCG CCG CCA TGG CAT CAG AGA TCC ACA TG-3' (Seq ID Nr.: 5). Besagte Oligonukleotide werden als Primer für eine PCR oder RT-PCR eingesetzt, um definierte Teile des GBP-1 Genes bzw. Genprodukts zu amplifizieren. Dem entsprechend sind solche Oligonukleotide insbesondere für einen sehr sensitiven Nachweis und/oder eine Quantifizierung des GBP-1 Gens oder Genprodukts in Zellkultur oder an Gewebeproben geeignet. Alternativ können solche Oligonukleotide als Proben für den Nachweis und/oder die Quantifizierung der GBP-1 spezifischen mRNA in einem Northern Blot Assay eingesetzt werden.
Die Anmeldung offenbart weiterhin einen diagnostischen Bestandteil, welcher als reaktiver Bestandteil die Oligonukleotide, wie oben beschrieben, in einem wässrigen Medium enthält, wobei die eingesetzte Menge Komplexe in einer der oben beschriebenen Techniken oder jedem anderen relevanten diagnostischen Assay bildet. Solche Komplexe sind z. B. Hybridisierungskomplexe zwischen einer Nukleinsäuresequenz, die aus einer biologischen Probe stammt und dem reaktiven Bestandteil.
Darüber hinaus offenbart die vorliegende Anmeldung einen Kit für ein diagnostisches Assay, welcher besagte diagnostische Komponente in einem geeigneten Behälter und/oder an einen festen Träger gebunden, enthält. Da das diagnostische Reagenz an einem festen Träger gebunden ist, wird das Risiko minimiert, dass Komplexe zwischen dem diagnostischen Reagenz und der GBP-1 RNA oder dem Protein, welches aus einer biologischen Probe stammt verloren gehen, bevor solche Komplexe nachgewiesen oder quantifiziert werden.
Darüber hinaus offenbart die vorliegende Anmeldung, dass die Oligonukleotide wie sie hierin beschrieben sind dazu eingesetzt werden können, die GBP-1 Genexpression in vivo oder in vitro zu modulieren. Dabei dringen die Oligonukleotide in die Zelle ein und gelangen in den Kern der Zelle, wo sie an spezifische Sequenzen des GBP-1 Genes binden, z. B. eine Splicedonor oder -acceptor Stelle binden und dadurch mit der GBP-1 Genexpression interferieren und/oder diese hemmen. Alternativ binden solche Oligonukleotide an eine GBP-1 spezifische RNA und verhindern die Translation der besagten RNA, wodurch die GBP-1 Proteinsynthese gehemmt wird.
Darüber hinaus offenbart die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zur Bestimmung der zellulären Differenzierungsstadien in Zellen, wobei die GBP-1 Expression als Marker für die aktivierenden Substanzen, welche eine Zellproliferation hemmen und/oder die Adhäsionskompetenz der Zellen erhöhen, eingesetzt wird. Es wurde von den Erfindern gezeigt, dass bei Endothelzellen die Expression von GBP-1 dahingehend einzigartig ist, dass sie durch drei inflammatorischen Zytokine-Interleukin, Tumor-Nekrosefaktor, Interferon, und/oder jedes funktionelle Analogon – schnell induzierbar ist und durch die AGFs, nämlich VEGF und bFGF und/oder jedes funktionelle Analogon derselben, herunter regulierbar ist. Daher stellt das Verfahren, wie oben beschrieben, zum ersten Mal einen gemeinsamen und spezifischen molekularen Marker für Endothelzellen dar, die durch inflammatorische Zytokine aktiviert und/oder durch angiogene Wachstumsfaktoren herunter reguliert sind. Gemäß besagtem Verfahren wird die Expression des GBP-1 Gens in Zellen eines zu untersuchenden Gewebes unter Verwendung der Oligonukleotide analysiert, um GBP-1 mRNA oder Fragmente derselben in einer RT-PCR, einem Northern Blot Hybridisierungsassay, einer In-situ Hybridisierung oder einer anderen relevanten Technik nachzuweisen und/oder zu quantifizieren.
Alternativ kann auch markierte RNA, die komplementär zu der GBP-1 mRNA ist und welche durch in vitro Transkription synthetisiert wurde, für den Nachwies der GBP-1 mRNA gemäß einem Verfahren wie es hierin offenbart ist, eingesetzt werden für diese in vitro Transkription offenbart die vorliegende Anmeldung auch einen Vektor, wobei die GBP-1 cDNA zur Synthese der GBP-1 Sense-RNA inter alia unter der Kontrolle eines T7-, T3-, SP6-Promotors steht und daher in vitro durch eine T7-, T3-, SP6-Polymerase transkribiert werden kann.
Die Detektion der GBP-1 Expression in Zellen gemäß dem offenbarten Verfahren zeigt an, dass besagte Zellen durch inflammatorische Zytokine aktiviert wurden. Darüber hinaus zeigt der Nachweis der GBP-1 Expression auch an, dass die Zellen in einem adhäsionskompetenten Zustand sind.
Der Nachweis einer fehlenden GBP-1 Expression zeigt an, dass die Zellen nicht in einem adhäsionskompetenten Zustand sind, was z. B. ein proliferations kompetenter Zustand ist. Der molekulare Mechanismus, welcher der Herunterregulierung der GBP-1 Expression durch VEGF und/oder bFGF zu Grunde liegt, bleibt unerkannt. Das Verfahren ist insbesondere geeignet um frühe Veränderungen im Adhäsionsverhalten der Zellen zur erkennen. Es wird weiterhin offenbart, dass diese Methode vorzugsweise geeignet ist, zur besagten Bestimmung des Aktivierungszustandes – adhäsionskompetent gegenüber proliferativ – von Geweben, vorzugsweise in Endothelzellen, während der Entwicklung eine Krankheit oder im Nachgang eine medizinischen Therapie, eingesetzt zu werden.
Es wird weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung der zellulären Differenzierungsstadien offenbart, welches auch dazu eingesetzt werden kann, das GBP-1 Protein oder Teile desselben unter Verwendung inter alia von GBP-1 Antikörpern in einem Western Blot Assay, einer Immunhistochemie oder einem ELISA nachzuweisen und/oder zu quantifizieren.
Die Anmeldung offenbart weiterhin ein Verfahren zu Modulierung der GBP-1 Genexpression in Zellen insbesondere in Endothelzellen in vivo oder in vitro. Hierzu wird eine Substanz, die entweder die GBP-1 Genexpression induziert oder unterdrückt, zugegeben. Die vorliegende Anmeldung offenbart, dass wenigstens ein Zytokine, vorzugsweise Interleukin, Tumor-Nekrose-Faktor und/oder Interferon zu gegeben wird, um die GBP-1 Genexpression zu induzieren und zu erhöhen. Besagte GBP-1 Genexpression wird dann zur Hemmung der Zellproliferation und/oder zur Erhöhung der Adhäsionskompetenz der Zellen verwendet.
Auf der anderen Seite wird durch die Zugabe wenigstens eines Wachstumsfaktors, vorzugsweise VEGF und bFGF, die GBP-1 Genexpression reduziert. Die Erfinder zeigten, dass sowohl die GBP-1 Expression und die biologische Aktivität von Il-1β und IFN-γ in Endothelzellen durch angiogene Wachstumsfaktoren, VEGF und bFGF, herunterreguliert werden. Darüber hinaus löste die Vorbehandlungen von Endothelzellen mit VEGF und bFGF über einen längeren Zeitraum die GBP-1 Expression sowie die Fähigkeit IL-1β induzierte Monozyten zu binden rasch aus. Diese Herunterregulierung der GBP-1 Genexpression ist insbesondere interessant für die in vitro Expansion von eukaryontischen Zellkulturen, da sie die zelluläre Proliferation erhöht wird und die Zell-zu-Zell Adhäsion abnimmt.
Bemerkungswerter Weise ist besagte Herunterregulierung auch in vivo sehr nützlich, insbesondere während oder nach einer Organtransplantation. In der Tat kann die Abstoßung eines transplantierten Organs vermieden werden oder zumindest verzögert werden, wenn aufgrund der Hemmung der Adhäsion von Immunzellen an das Endothel der relevanten Blutgefäße das Einwandern von Immunzellen in das transplantierte Organ verhindert wird.
Anstatt die GBP-1 Genexpression zu modulieren kann auch die GBP-1 Proteinaktivität durch die Zugabe geeignete Substanzen erhöht oder reduziert werden. Solche Substanzen schließen Moleküle ein, die die GTPase-Funktion des GBP-1 Proteins inaktivieren sowie auch intrazellulär exprimierte GBP-1 Antikörper.
Dieses Verfahren zur Modulation der GBP-1 Genexpression oder Proteinaktivität kann eingesetzt werden, um die Zelldifferenzierung zu beeinflussen. Es kann angewandt werden, um eine virale Replikation z. B. die Replikation von HIV in vivo oder in vitro zu hemmen. Es ist bekannt, dass das Stadium der zellulären Differenzierung, insbesondere die Aktivierung eines nicht proliferativen Phänotypes, eine effiziente virale Replikation in einer infizierten Zelle behindert. Besagte Methode kann daher eingesetzt werden, um die GBP-1 Genexpression zu erhöhen und die GBP-1 Proteinaktivität zu verstärken mit dem Ziel einen nicht proliferativen Phänotyp einer Zelle zu induzieren. Ein Virus, das besagte Zelle dann infiziert, kann gar nicht oder weniger effizient replizieren. Durch die Herabsetzung der viralen Replikation in infizierten Zellen, reduziert sich die Menge an freiem Virus in einem Patienten. Im Falle eine HIV Infektion trägt besagte Reduzierung der Menge an freiem Virus zu einem späteren Beginn der tatsächlichen AIDS Erkrankung bei und/oder wenigstens zur Verlängerung der symptomfreien Phase für den Patienten bei.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Kultivierung von eukaryotischen Zellen. Dieses Verfahren ist insbesondere geeignet – wie oben bereits erwähnt – für die in vitro Vermehrung von Primärzellen oder beliebigen anderen Zellen oder Zelllinien, bei welchen die Kultivierung oder Vermehrung in Kultur schwierig, zeitintensiv oder kostenintensiv ist. Alternativ ist dieses Verfahren auch geeignet – wie oben bereits erwähnt – um eine Wachstumsarretierung bei Zellen in Kultur zu induzieren. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die Zellen in Kultur mit eine wirksame Menge des GBP-1 Gens, funktionellen Teilen desselben, dem GBP-1 Protein, dem GBP-1 Fusionsprotein wie oben beschrieben, der GBP-1 RNA in Sense- oder Antisenseorientierung welche entweder von einem Vektor der vorliegenden Erfindung isoliert oder exprimiert wurde, den oben beschriebener Oligonukleotiden, den oben beschriebenen viralen Partikeln, einem Inducer oder Inhibitor der GBP-1 Genexpression wie VEGF oder bFGF und/oder einem Verstärker oder Repressor der GBP-1 Proteinaktivität, welcher zu dem Zellkulturmedium zugegeben werden kann, inkubiert oder transfiziert.
Weiterhin offenbart die vorliegende Anmeldung die Verwendung des GBP-1 Gens des, GBP-1 Fusionsproteins wie oben beschrieben, der oben beschriebenen Vektoren, der oben beschriebenen Produzentenzellen, des oben beschriebenen viralen Partikels, der oben beschriebenen RNA und/oder der oben beschriebenen Oligonukleotide zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von malignen Erkrankungen wie Krebs, Sarkom, Lymphom aber auch zur Behandlung von Hämangiomen, Arteriosklerose, Restenose, entzündlichen Prozessen wie chronischen Darmerkrankungen, Psoriasis, Insektenstichen, Erfrierungen oder Verbrennungen, Wundheilung, Morbus Crohn, und/oder jeder anderen relevanten Krankheit und Fehlfunktion.
Zusätzlich offenbart die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zu Behandlung maligner Erkrankungen oder jeglicher anderer relevanten Erkrankungen oder Fehlfunktionen, welches die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des GBP-1 Gens, des GBP-1 Proteins oder des GBP-1 Fusionsproteins wie oben beschrieben, der oben beschriebenen Vektoren, der oben beschrieben Produzentenzelle, des oben beschriebenen viralen Partikels, der oben beschriebene RNA und/oder der oben beschriebenen Oligonukleotide an einen dies benötigenden Patienten, einschließt.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die in vivo oder in vitro eingesetzt wird und als einen ersten Bestandteil eine therapeutisch wirksame Menge der oben beschriebenen Vektoren, der oben beschrieben Produzentenzellen, des oben beschriebenen viralen Partikels, der oben beschriebenen RNA und/oder als einen zweiten Bestandteil eine pharmazeutische annehmbaren Träger, ein Verdünnungsmittel oder ein Trägermolekül enthält.
Die nachfolgenden detaillierten Beispiele dienen dazu ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung zu vermitteln. Es ist jedoch nicht beabsichtigt den Anschein zu geben, dass die Erfindung auf den Inhalt der Beispiele beschränkt ist.
Beispiel 1: Charakterisierung der biologischen Funktionen des GBP-1 Genproduktes
1. Durch Differentialdisplay RT-PCR (DDRT-PCR) wurde GBP-1 als Gen identifiziert, das in humanen mikrovaskulären Endothelzellen die aus der Dermis (HDMVEC) stammen, durch IL-1β, aber nicht durch VEGF induziert wird.
Die meisten der Endothelzellen die an physiologischen und pathologischen vaskulären Prozessen beteiligt sind, haben mikrovaskuären Ursprung. Primäre humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Dermis (HDMVEC) und primäre humane Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC) wurden bei Clonetics (San Diego, CA) gekauft und in endothelialem Basismedium (EBM, Clonetics), ergänzt mit 5 % fötalem Rinderserum (FBS), Rinderhirnextrakt 12 mg/ml, humanem epidermalem Wachstumsfaktor 10 ng/ml, Hydrocortison-Acetat 1 mg/ml, Gentamycin 50 mg/ml, Amphotericin 0,25 mg/ml (Clonetics), Penicillin 100 U/ml und Streptomycin 100 mg/ml (Gibco BRL, Eggenstein, Germany), kultiviert. Die Zellen wurden in Flaschen, die mit 0,01% Kollagen Typ I (PromoCell, Heidelberg, Germany) beschichtet waren, vermehrt. Das Medium wurde alle 2-3 Tage ausgetauscht und die Zellen einmal pro Woche in einem Verhältnis von 1:6 (HDMVEC) oder 1:10 (HUVEC) geteilt und bis zur Passage acht (HDMVEC) oder vierzehn (HUVEC) verwendet.
Um mit Hilfe der DDRT-PCR Gene zu identifizieren, die spezifisch in durch Zytokin aktivierten Zellen exprimiert werden, wurden die Muster der Genexpression in HDMVEC (Clonetics, San Diego, CA), stimuliert mit dem angiogenen Faktor VEGF165, mit HDMVEC, stimuliert durch das inflammatorische Zytokin IL-1β, verglichen. Für die Stimulation wurde rekombinanter humaner VEGF165 von R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN) und rekombinantes humanes IL-1β von Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany) erworben. HDMVEC Zellen wurden in komplettem EBM/5 % FBS Medium (Clonetics) kultiviert, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreicht hatten. Anschließend, nach einer Ruhephase von 24 Stunden in einem wenig Serum enthaltenden (low-serum) Medium EBM/0,5 % FBS (Clonetics), wurden die Zellen mit den beiden Zytokinen, welche dem low-serum Medium in entsprechend verdünnter Konzentration zugegeben wurden, stimuliert.
Anschließend wurde die zelluläre Gesamt RNA, welche mit Hilfe des RNeasy Kits (QUIA-GEN, Hilden, Germany), gemäß den Angaben des Herstellers aus den HDMVEC isoliert wurde, die für 5 Stunden mit oder ohne VEGF165/10 ng/ml) oder IL-1β (20 U/ml) inkubiert waren, einer Differentialdisplay Analyse unterzogen. Hierfür wurde 1 μg der mit DNAse-I be handelten RNA als Matrize in drei Reaktionen der reversen Transkription verwendet, die drei verschiedene 5'-H-T11M-3' Primer (wobei H die HindIII Restriktionsschnittstelle ist und M entweder G, C oder A sein kann) (RNAimage, GenHunter Corporation, Brookline, MA) mit einem Einzelbasenanker enthielten, verwendet. In Kürze, jede RNA Probe wurde in der Gegenwart von 1 × RT Puffer (Gibco), 20 μM dNTPs und dem 5'-H-T11M-3' Primer mit 0,2 μM in einem Perkin Elmer 9600 Thermocycler (Perkin Elmer, Roche Molecular Systems Inc., Branchburg, New Jersey) wie folgt inkubiert: 5 min bei 65°C, 5 min bei 37°C, 60 min bei 42°C, 5 min bei 75°C und dann bei 4°C abgekühlt. Nach 5 min bei 42°C wurden jedem Röhrchen 100 Einheiten von Superscript-II Reverser Transkriptase (Gibco) für die verbleibenden 55 min bei 42°C zugegeben. Anschließend wurde mit 1/5 Volumen der RT-Reaktion eine PCR Amplifikation in der Gegenwart von 1 × PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl₂, einer Einheit AmpliTaq Poymerase (Perkin-Elmer), 2 μM dNTPs, 0,2 μM upstream 10mer-Primer (5'-TCGATACAGG-3'), 0,2 μM korrespondierender 5'-H-T11M-3' Primer und α-[³³P]dATP (Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) in einem Perkin-Elmer Thermocycler 9600 wie folgt durchgeführt: 5 min bei 95°C, anschließend 40 Zyklen mit: 30 sec bei 94°C, 2 min bei 42°C, 30 sec bei 72°C und abschließend 5 min bei 72°C. 5 ml der PCR-Reaktion wurden auf ein 6 %iges Sequenziergel geladen. Das Gel wurde auf ein 3M Whatman Papier geblottet, unter Vakuum bei 80°C getrocknet und über Nacht auf einem Röntgenfilm (Amersham) exponiert. Die Gelstücke welche die interessanten Banden enthielten wurden zusammen mit dem 3M Papier ausgeschnitten und für 15 min in 100 ml H₂0 gekocht. Die DNA wurde anschließend präzipitiert und als Matrize in einer kalten PCR Reaktion verwendet, die wie für DDRT-PCR beschrieben durchgeführt wurde, mit der Ausnahme, dass die Konzentration der dNTPs auf 20 μM angehoben wurde und die radioaktiven Nukleotide weggelassen wurden. Die erneut vervielfältigten Fragmente wurden durch random prime Markierung (High Prime, Boehringer Mannheim) direkt radioaktiv markiert und als Probe in einer Northern Blot Analyse eingesetzt. Die interessanten PCR-Fragmente wurden in den von pBlueScript II+/– abgeleiteten Vektor pCRScript (Stratagene, Heidelberg, Germany) gemäß der Anleitung des Herstellers kloniert. Ein Cycle-Sequencing wurde unter der Verwendung der ABI Prism (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA) Fluoreszenzmethode durchgeführt.
Die mit dieser Primerkombination (5'-HT11G-3' und TCG ATA CAG G) erhaltenen Muster deckten das Vorkommen eines 330 bp langen Produktes im Differential-Display auf, welches in IL-1β behandelten HDMVEC spezifisch hochreguliert ist, nicht aber in VEGF165 behandelten oder unbehandelten Kontrollzellen. Die differentielle Expression wurde durch Northern Blot Hybridisierung an den korrespondierenden RNAs unter Verwendung der radioaktiv markierten 330 bp cDNA als Probe bestätigt. Die Klonierung und Sequenzierung deckte auf, dass das Produkt aus dem Differential-Display mit den Nuldeotiden 1430 bis 1768 vom 3' Ende der kodierenden Sequenz der 2,8 kB mRNA des humanen Guanylate Binding Protein-1 (GBP-1) übereinstimmt. GBP-1 ist eine GTPase mit einem Molekuargewicht von 67 kDa ohne jegliche assoziierte biologische Funktion. Es wurde jedoch interessanterweise als Interferon induzierbares Protein in Fibroblasten entdeckt und Interferon-gamma gehört zur Gruppe der inflammatorischen Zytokine. In diesen Zellen kann GBP-1 durch α- und γ-Interferon, jedoch durch unterschiedliche Signalwege, induziert werden, was unterschiedliche Muster der Induktion zur Folge hat.
2. Dosisabhängigkeit und zeitlicher Verlauf der GBP-1 mRNA Niveaus in Abhängigkeit zur IL-1β Stimulation.
Nachdem dies der erste Bericht einer durch IL-1β induzierbaren GBP-1 Genexpression in HDMVEV ist, haben die Erfinder diese Induktion durch einen Zeitverlauf und eine Dosisanalyse weiter beschrieben. Nur 2 U/ml von IL-1β im Inkubationsmedium ergaben einen 2,4-fachen Anstieg der Menge an GBP-1 mRNA nach 5 Stunden Behandlung. Eine maximale Induktion (zwischen 5- und 70-fach) wurde erreicht, wenn 20 U/ml IL-1β verwendet wurden. Die Zeitverlauf Analyse zeigte, dass die Induktion der GBP-1 mRNA rasch verlief, ihr Maximum nach 5 Stunden erreichte und über einen Zeitraum von 24 Stunden auf einem hohen Niveau verblieb. IL-1β erzeugte ein rasches und stabiles intrazelluläres Signal, das zu einer GBP-1 Induktionskinektik führte, die der durch IFN-γ in diploiden Fibroblasten oder HeLa-Zellen (Decker et al., 1991, Lew et al., 1991) erzeugten, ähnlich ist. Solche hohen, rasch induzierbaren, Expressionsniveaus, weisen daraufhin, dass das GBP-1 Genprodukt eine entscheidende Rolle in der Aktivierung von Endothelzellen spielt.
3. Auswirkung von Cycloheximid auf die IL-1β Induktion der GBP-1 mRNA.
Die rasche Reaktion des GBP-1 Gens auf IL-1β deutet an, dass bezüglich der Induktion von GBP-1 durch IFNe in FS2 Fibroblasten in HDMVEC eine Protein Synthese nicht erforderlich ist, um die beobachtete Induktion von GBP-1 mRNA zu erreichen. Deshalb wurden die Zellen mit dem Protein-Synthese-Inhibitor Cycloheximid (CHX) 15 min vor und während der 5 ständigen Inkubation mit IL-1β, behandelt. Daran anschließend wurde die mRNA Menge von GBP-1 mittels Northern Blot Hybridisierung gemessen. Dazu wurden 30 μl Aliquots der zellulären Gesamt-RNA auf einem vertikalen 1 % Agarose/6 % Formaldehyd Gel fraktioniert und auf ein Nylonmembrane (Hybond N⁺, Amersham) transferriert und durch UV-Bestrahlung crossgelinkt (264 nm, 2 min). Die mit ³²P markierten DNA-Proben für die Hybridisierung wurden unter Verwendung eines random prime Markierungskits (Boehringer, Mannheim, Deutschland) hergestellt. Die Hybridisierung wurde bei 42°C über 16 Stunden in 50 % Formamid, 5 × Saline-Trinatriumcitrat (SSC), 10 % Dextransulfat, % N-Lauroylsarcosin, 100 μg/ml Sonicated Salmon Sperm DNA und 250 μg/ml tRNA, durchgeführt. Radioaktiv markierte Proben (2 × 10⁶ cpm/ml, mit einer spezifischen Aktivität von > 6 × 10⁸ cpm/μg DNA), wurden für die Hybridisierung verwendet. Nach der Hybridisierung wurden die Filter gewaschen, mit einer Endstringenz von 0.1 × SSC, 0.1 % N-Lauroylsarcosin, bei 50°C. Die Autoradiographie wurde bei –70°C mit einer Verstärkermaske durchgeführt.
Unter diesen Bedingungen hatte CHX keinen inhibitorischen Effekt auf das durch IL-1β induzierte Expressionslevel der GBP-1 mRNA. Dies deutet an, dass sämtliche Proteine, die für eine transkriptionelle Antwort von GBP-1 auf IL-1β in HDMVEC erforderlich sind, bereits vor der Zugabe von IL-1β vorhanden waren. Demnach produziert IL-1β, ähnlich wie IFN-γ in Fibroblasten oder HeLa, eine schnelle und lang anhaltende Induktion von GBP-1 mRNA in HDMVEC, in der Abwesenheit von Proteinsynthese.
4. Die Expression von GBP-1 mRNA wird durch ICs, aber nicht durch angiogene Wachstumsfaktoren induziert
Als GBP-1 erstmals als Interferon induzierbares Protein beschrieben wurde, untersuchten wir, ob in HDMVEC, IFN-γ, andere ICs, oder Wachstumsfaktoren von den bekannt ist, dass sie endotheliale Zellen aktivieren, ebenfalls die GPB-1 Expression regulieren konnten, oder nicht. HDMVEC wurden für 5 Stunden mit oder ohne IFN-γ 100 U/ml), TNF-α (300 U/ml), VEGF (10 ng/ml) oder bFGF (10 ng/ml) behandelt und die GBP-1 Expression wurde, wie oben beschrieben, durch Northern Blot Hybridisierung analysiert. Es wurde gezeigt, dass IFN-γ und TNF-α die GBP-1 mRNA Menge in HDMVEC drastisch nach oben regulierten, wohingegen VEGF oder bFGF dies nicht taten. Die GBP-1 Expression, die spezifisch durch ICs, aber nicht durch angiogene Wachstumsfaktoren nach oben reguliert wird, stellt demnach einen potentiellen Marker für die IC Aktivierung dar.
5. VEGF und bFGF hemmen die IL-1β Induktion der GBP-1 mRNA in HDMVEC
Es wurde weiterhin getestet, ob VEGF und/oder bFGF in der Lage waren, die IL-1β induzierte Expression der GBP-1 mRNA zu modulieren. Deshalb wurden HDMVEC für 5 Stunden mit IL-1β (20 U/ ml) im Beisein oder Absenz von VEGF (10 ng/ ml) und/oder bFGF (10 ng/ml) stimuliert und das GBP-1 Expressionsniveau durch Northern Blot, wie oben beschrieben, analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Gegenwart von entweder VEGF oder bFGF die GBP-1 Expression auf entsprechende 60 % und 40 % der IL-1β Induktion (100 %) nach unten reguliert. Wenn beide angiogenen Wachstumsfaktoren zusammen dem Inkubationsmedium gleichzeitig mit dem IL-1β zugegeben wurden, fiel die GBP-1 mRNA Expression drastisch auf 17 %. Demzufolge regulieren beide angiogenen Wachstumsfaktoren die IL-1β induzierte GBP-1 Expression in HDMVEC wirksam nach unten. Außerdem scheint die GBP-1 mRNA Expression nicht nur die IC Aktivierung widerzuspiegeln, sondern auch die sich gegenseitig ausschließenden molekularen Veränderungen der durch ICs oder Wachstumsfaktoren geförderten Genexpression von Endothelzellen.
6. VEGF und bFGF hemmen die Bindung von U397 Monozyten an IL-1β oder IFN-γ aktivierte HDMVEC.
Es wurde untersucht, ob die mit VEGF und bFGF assoziierte Herunterregulierung der IL-1β induzierten GBP-1 mRNA Expression mit einer Modulation der biologischen Aktivität von ICs zusammenhängt. ICs sind dafür bekannt, die Expression von Adhäsionsmolekülen auf der Oberfläche von HDMVEC nach oben zu regulieren und das Anheften der U937 Monozyten an das aktivierte Endothel auszulösen. Deshalb wurde der Einfluss von VEGF und bFGF auf die durch IL-1β induzierte Adhäsionskompetenz von HDMVEC untersucht. HDMVEC wurden mit l0⁴ Zellen/ cm² in 8-well Mikrokammer-Objekträger (Lab-Tek, Nunc Inc., Naperville, Illinois) eingesät und bis zu einer 90 %igen Konfluenz in komplettem EBM/5 % FBS (Clonetics) kultiviert. Diese subkonfluenten Endothelzellen wurden für 6 Stunden mit IL-1β bei 20 U/ml unter Zugabe angiogener Wachstumsfaktoren oder ohne, behandelt. Dann wurden die U937 Monozyten wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, an die durch Zytokin aktivierten HDMVEC zu binden, gefordert. Dazu wurden die U937 Monozyten mit 7 × 10⁵ Zellen/ml in RPMI/1640, 1 FBS bei 37°C für 30 min vorinkubiert und anschließend wurden HDMVEC Monolayer für 15 min zusammen mit 500 μl dieser U937 Zellsuspension inkubiert. Nicht adherierende Monozyten wurden durch Schwenken der Objektträger in RPMI/1640, 1 % FBS vorsichtig abgewaschen und adherente Zellen wurden durch ein 15 minütiges Eintauchen in RPMI/1640/1 % FBS mit 5 % Glutaraldehyd (Serva, Heidelberg, Deutschland), fixiert. Die adherenten Zellen wurden pro beliebiger Oberflächeneinheit unter Verwendung eines Computerprogramms (Optimas, Unterhaching, Deutschland), gezählt.
Es wurde gezeigt, dass die gleichzeitige Zugabe von IL-1β und entweder VEGF (10 ng/ml) oder bFGF (10 ng/ml) die Anzahl der adherenten Monozyten um mehr als 40 % reduzierte, im Vergleich zu den Experimenten in denen nur IL-1β zugeben wurde. Die Reduktion der Anzahl an adherenten Monozyten war sogar noch deutlicher (bis zu 60 %), wenn beide Faktoren kombiniert wurden. Es war keine signifikante Aktivierung der Adhäsion zu beobachten, wenn die HDMVEC mit VEGF oder bFGF alleine behandelt wurden. Diese Daten weisen daraufhin, dass die Fähigkeit der HDMVEC die U937 Monozyten zu binden, mit dem Expressionsmuster der GBP-1 mRNA korreliert. Interessanterweise hemmen VEGF und/oder bFGF die Bindung von Monozyten an IC-aktivierte HDMVEC ebenso stark, wie sie die GBP-1 Expression hemmen. Zusammengefasst, weisen diese Daten daraufhin, dass die GTPase GBP-1 in HDMVEC an dem durch ICs aktivierten Signaltransduktionsweg beteiligt ist, was zur Adhäsionsfähigkeit von endothelialen Zellen führt.
7. VEGF und bFGF neutralisieren die durch IL-1β und IFN-γ induzierte Wachstumshemmung.
Eine weitere Eigenschaft der inflammatorischen Zytokine ist ihre Fähigkeit die Zellproliferation (IL-1β und IFN-γ) zu hemmen oder sogar die Apoptose (IFN-γ und TNF-α) von endothelialen Zellen zu induzieren. Deshalb wurde untersucht, ob VEGF und/oder bFGF die durch IL-1β oder IFN-γ induzierte Wachstumshemmung beeinflussen. Für diesen Zweck wurden HDMVEC mit einer Dichte von 10⁴ Zellen/cm² 12-Multiwellplatten (Costar) eingesät und für 24 Stunden in Medium mit niedrigem Serum gehalten. Die entsprechende Kombination an Faktoren wurde in angepasster Konzentration in frischem Medium mit niedrigem Serumgehalt jeden zweiten Tag zugegeben. Nach 5 Tagen Kultivierung wurden die Zellen in PBS gewaschen, durch Trypsinisierung geerntet und die Zellzahl wurde mit einem Hemacytometer bestimmt. Zellen, die mit VEGF (10 ng/ml) oder bFGF (10 ng/ml) behandelt wurden, zeigten eine 2- bis 2.7-fach höhere Proliferationsrate verglichen mit den unbehandelten Kontrollzellen. Im Gegensatz dazu hemmten IL-1β (20 U/ml) oder IFN-γ (100 U/ml) die Proliferation der HDMVEC. Jedoch wurde die Fähigkeit der HDMVEC zu proliferieren wieder hergestellt, wenn zu IL-1β, VEGF oder bFGF zugeben wurden, was in einem 1.7- bis 2-fachen Anstieg der Proliferationsrate, verglichen mit den unbehandelten Kontrollzellen, resultierte. Dieser Effekt war sogar noch stärker ausgeprägt, wenn VEGF und bFGF gleichzeitig zu den mit IL-1β behandelten Zellen gegeben wurden. Auch der durch IFN-γ induzierten Wachstumshemmung wurde durch die Zugabe von VEGF und/oder bFGF entgegengewirkt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die GBP-1 Expression mit der Fähigkeit von HDMVEC zur Zellproliferation umgekehrt korreliert. Schlussgefolgert spielt GBP-1 eine wichtige Rolle bei der durch ICs erzeugten und der durch Wachstumsfaktoren entgegen gewirkten Wachstumshemmung oder Apoptose.
Zusammengefasst korreliert das GBP-1 mRNA Expressionsmuster direkt mit der Adhäsionskompetenz und indirekt mit der Proliferationsrate von HDMVEC, was darauf hinweist, dass GBP-1 diese beiden Vorgänge regulieren kann.
Beispiel 2: Überexpression des GBP-1 Gens in sense und anti-sense Orientierung
1. Konstruktion von GBP-1 Vektoren.
Um einen direkten Nachweis der Rolle, die GBP-1 in IC-aktivierten endothelialen Zellen einnimmt, zu erhalten, wurde als funktioneller Test untersucht, ob eine konstitutive, rekombinante Expression von GBP-1 die biologischen Eigenschaften von endothelialen Zellen beeinflussen kann. Deshalb wurde ein GBP-1 Expressionsvektor konstruiert. Hierzu wurde die für GBP-1 kodierende Volllänge-cDNA unter Verwendung von RT-PCR an aus IFN-γ behandelten HDMVEC extrahierter zellulärer Gesamt-RNA, isoliert und wie nachfolgend beschrieben, in verschiedene Vektoren kloniert. Reverse Transkription wurde an 5 μg zellulärer Gesamt-RNA, vorbehandelt mit DNAase-I, unter Verwendung von 2 pmol des anti-sense Oligonukleotids 5'-GCT CTA GAT TAG CTT ATG GTA CAT GCC TTT CG-3' (Seq ID No.: 4), das als Primer an die Positionen 1824 bis 1847 der veröffentlichten humanen GPB-1 cDNA (Cheng, Y.E., et al., 1988, „Accumulation of Guanylate-Binding Proteins in Patients treated with Interferons", J. Interferon Res., 385-391) bindet, 0.5 μg dNTPs und 200 Units der Superscript Reverse Transcriptase (Gibco BRL), durchgeführt. PCR wurde an einem Zehntel der Reverse Transkriptionsreaktion mit 10 pmol des sense Primers 2 (5'-CGG AAT TCG CCG CCA TGG CAT CAG AGA TCC ACA TG-3'; Seq ID No.: 5) und dem anti-sense Primer 1 in einem PCR Gesamtvolumen von 100 μl durchgeführt. Die 30 Amplifikationszyklen waren wie folgt: Denaturierung für 60 Sekunden bei 94°C, Bindung des Primers für 60 Sekunden bei 55°C und Verlängerung 120 Sekunden bei 72°C. Diese RT-PCR Reaktion erzeugte ein 1801 Bp langes Produkt, der gesamten Kodierungssequenz von GBP-1 entsprechend und flankiert von zwei Schnittstellen für Restriktions-Endonuklease EcoRI und XbaI. Die PCR-Produkte wurden zunächst in den PCRScript Vektor (Stratagen) inseriert und komplett durchsequenziert. Eine cDNA die eine GBP-1 Kodierungssequenz kodierte, die genau der veröffentlichten Sequenz entspricht, wurde dann in sense und anti-sense Orientierung in die EcoRI Mehrfach- Klonierungsstelle von pCDNA3 (Invitrogen), pCDNA3-GFP (ein Geschenk von Dr. J.F. Giot) und den von MoMuLV abstammenden pBabePuro (Morgenstein, 1990), einkloniert.
2. Produktion von retroviralen Partikeln und Infektion.
Die Verpackungszelllinie PG13/J7 (Miller, 1991) wurde in modifiziertem Dulbecco Medium, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum (Gibco), 1 × HAT (Gibco) kultiviert und in 100 mm Schalen (Falcon) durch die Kalziumphospat Kopräzipitatiostechnik, mit 10 ng retroviralen DNA Konstrukten und 25 μg Träger-DNA, über Nacht transfiziert. Die Viren wurden von isolierten stabilen Klonen der transfizierten Zelllinien erhalten. Bei einer Konfluenz von 80 % wurde das Medium durch DMEM mit 10 % FCS ohne Puromycin ausgetauscht. 12 Stunden später wurden die Überstände der Zellkultur geerntet und durch einen 0.45 μm Filter steril filtriert.
Die retrovirale Infektion wurde durch Zugabe von Polybren mit einer Endkonzentration von 8 μg/ml und der Inkubation der HDMVEC oder HUVEC für zweimal 4 Stunden mit unverdünnten oder verdünnten Überständen durchgeführt, die durch eine Inkubation in frischem normalen Endothelmedium (EBM 5 % FBS) ebenfalls für 4 Stunden, voneinander getrennt waren. 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen unter Selektion gesetzt, indem 0.5 μg/ml Puromycin verwendet wurde. Das Medium wurde jeden dritten Tag ersetzt, bis die resistenten Kolonien zu erkennen waren.
Die Titer der retroviralen Partikel, die GBP-1 in sense oder anti-sense Orientierung trugen, wurden durch Semiquantitative PCR miteinander verglichen. Die RNA wurde von Viren aus dem Überstand, gemäß der Angaben des Herstellers mit dem High Pure virale RNA-Kit (Boehringer Mannheim), extrahiert. Eine RT-PCR wurde nach der Titan One Reaktionsmethode mit einer Reihe, für die GBP-1 Kodierungssequenz spezifischen Primern, durchgeführt. RNA, die aus GBP-1 Sequenz – in sense oder anti-sense Orientierung – tragenden Viren extrahiert wurde, wurde entweder seriell verdünnt und die verschiedenen Verdünnungen derselben Anzahl an Amplifikationsschritten unterworfen, oder eine konstante Verdünnung wurde auf verschiedene Experimente mit derselben Anzahl an PCR Zyklen verteilt. Für jede Reaktion, unabhängig vom experimentellen Ansatz, wurden identische Ergebnisse erzielt: in beiden Fällen (GBP-1 sense oder anti-sense) war das 950 bp Amplifikationsprodukt bei derselben Matrizenverdünnung oder Anzahl von Zyklen nachzuweisen. Dies zeigt, dass beide Virus-Stocks (sense, antisense Konstrukte) den selben Titer hatten.
3. Überexpression von GBP-1 hemmt die endotheliale Zellproliferation.
Primäre humane Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC) wurden mit retroviralen Vektoren (pBabePuro) infiziert, welche die GBP-1 mRNA entweder in sense (pBabePuroD16=D16) oder anti-sense (pBabePuroD3=D3) Orientierung exprimieren. Die Titer von pBabePuroD3 und pBabePuroD16, die für die Infektion verwendet wurden, waren equivalent, wie durch Semiquantitative RT-PCR bestimmt wurde. Nach 10 Tagen Selektion wurden zahlreiche schnell wachsende Puromycin resistente Klone in Experimenten gewonnen, in denen eine Infektion mit dem retroviralen Vektor (pBabePuro) alleine oder mit pBabePuroD3 (anti-sense GBP-1) durchgeführt wurde. Im Gegensatz dazu, wurden nur langsam wachsende Klone von den Zellen erhalten, die mit dem das sense GPB-1 enthaltenden pBabePuroD16 infiziert waren. Diese Ergebnisse weisen bereits daraufhin, dass GBP-1 möglicherweise als Wachstumshemmer in HUVEC agiert. Die Charakterisierung der Transgenexpression wurde durch Northern Blot Analyse bestätigt, indem ein 300 Bp langes internes Fragment von GBP-1 und ein gag-pol Fragment von MMLV als Proben verwendet wurden. Wie erwartet, wurde die Expression der retroviralen, gag-kodierenden mRNA (2.5 Kb) in pBabePuroD3 transduzierten Zellen nachgewiesen. In Zellen, die mit pBabePuroD3 oder pBabePuroD16 transduziert waren, wurden entsprechende 4.4 Kb mRNA kodierende Teile der retroviralen gag-Sequenzen (2.5 Kb) und GBP-1 mRNA Sequenzen (1.8 Kb), nachgewiesen. Als sie über einen Zeitraum von 6 Tagen auf ihre Proliferationsfähigkeit hin untersucht wurden, wuchsen endotheliale Zellen, die rekombinantes GBP-1 (D16) konstitutiv exprimierten, klar langsamer, als die Kontrollzellen oder Zellen, welche die GBP-1 mRNA in anti-sense Orientierung (D3) exprimierten. Ausserdem erreichten die pBabePuroD16 transduzierten Zellen in Gegenwart ansteigender Konzentrationen von VEGF und bFGF (1, 10, 100 ng/ml) nur 58 % der Proliferationsrate, die mit pBabePuro transduzierten Kontrollzellen unter diesen Bedingungen erreicht wurde. Diese Werte zeigen, dass die Expression von GBP-1 in endothelialen Zellen, die Proliferation der Zellen hemmt.
4. Überexpression von anti-sense GPB-1 mRNA in endothelialen Zellen wirkt einer durch IL-1β oder IFN-γ induzierten Wachstumshemmung entgegen.
Schlieflich wurde untersucht, ob eine Hemmung der zellulären GBP-1 Expression durch die rekombinante Expression von GPB-1 anti-sense mRNA in endothelialen Zellen die antiproliferative Wirkung der inflammatorischen Zytokine beeinflusst.
HUVECs transduziert mit pBabePuroD3 und folglich konstitutiv hohe Mengen an GBP-1 mRNA exprimierend und Kontrollzellen transduziert mit pBabePuro, wurden mit VEGF und bFGF (jeweils 10 ng/ml) in Medium mit niedrigem Serumgehalt kultiviert und gleichzeitig ansteigenden Konzentrationen von IL-1β (2-200 U/ml) oder IFN-γ (10-1000 U/ml) ausgesetzt. Nach 6 Tagen in Kultur wurde die Zellzahl bestimmt. In beiden Fällen führten IL-1β und IFN-γ in dosisabhängiger Art und Weise zu einer Abnahme der durch die Wachstumsfaktoren induzierten Proliferation. Jedoch waren die pBabePuroD3 transduzierten Zellen deutlich weniger sensitiv als die Kontrollzellen und zeigten nur 62 % und 27 % Wachstumshemmung im Vergleich zu entsprechenden 17 % und 15 % in Gegenwart der höchsten Konzentrationen an IL-1β und IFN-γ. Die Expression der anti-sense GBP-1 mRNA in den mit pBabePuro transduzierten Zellen schützte die endothelialen Zellen wirksam vor der durch IC induzierten Hemmung der Zellproliferation.
Beispiel 3: Visualisierung von GFP-GPB-1 in transfizierten Zellen
Um zu untersuchen, ob die klonierte cDNA für ein komplettes funktionales GBP-1 Protein kodieren kann, wurde das Molekulargewicht des kodierten Proteins durch Western Blot bestimmt und Lokalisierungssrudien von GBP-1 in der Zellen durchgeführt.
Das GBP-1 Protein trägt ein CAAX Isoprenylierungssignal-Motiv am C-Terminus, von dem gezeigt wurde, dass es in vitro und in in vivo funktionell ist und darauf hinweist, dass es sich bei GBP-1 um ein Membran-assoziiertes Protein handeln könnte. Um die Lokalisierung des GBP-1 Proteins in eukaryontischen Zellen zu untersuchen, wurde ein chimäres Protein aus dem green fluorescent Protein (GFP) der Qualle Aequorea victoria und GBP-1 konstruiert. Folglich wurde das GFP an den N-Terminus des GBP-1 Proteins fusioniert, um irgendwelche Interferenzen mit dem am C-Terminus befindlichen Isoprenylierungs-Motiv CAAX zu vermeiden. Deshalb wurde die komplette GBP-1 cDNA mit einer GFP cDNA (GFP-GBP-1) im Leseraster befindlich in den Säugerexpressionsvektor pcDNA3 inseriert. Mit diesem Plasmid kann die inserierte cDNA unter der Kontrolle der T7-RNA Polymerase in eukaryontischen Zellen in hohem Maße exprimiert werden. Die T7-RNA Polymerase Expression in den entsprechenden Zellen wird durch eine Superinfektion mit T7-RNA Polymerase kodierenden Vaccinia Viren ausgelöst. CV1 Zellen wurden in 6-well Platten eingesät, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreichten, mit Optimem (Gibco) gewaschen und für eine Stunde bei 37°C mit 10⁶ pfu pro well eines T7-RNA Polymerase kodierenden Vaccinia Virus in DMEM/0 % FBS, infiziert. Nach einem Waschschritt mit Optimem wurde die Transfektion der Zellen durch Inkubation in einer Optimem Lösung mit 7 μl Lipofectamin und 2 μg Plasmid pro Well über Nacht durchgeführt. Die CV1 Zellen wurden dann in PBS gewaschen und für 15 min bei Raumtemperatur in 2 % Formaldehyd, 2 % Glutaraldehyd, 1 × PBS, fixiert. Die Visualisierung des GFP oder des GFP-GBP-1 Fusionsproteins wurde durch Fluoreszenzmikroskopie erreicht. Zellen die mit den Konstrukten, die GFP alleine oder fusioniert an anti-sense GBP-1 trugen, transfiziert waren, zeigten eine diffuse Fluoreszenz, die gleichmäßig im Zytoplasma verteilt und geringfügig konzentriert im Kern war. Diese Verteilung deckte sich mit früheren Berichten der diffusen, zellulären Lokalisierung von GFP. Im Gegensatz dazu ergab die Expression des GFP-GBP-1 Proteins ein punktiertes, perinukleares Fluoreszenzmuster. Dies deutete auf eine Verbindung mit inneren zellulären Membranen hin und erinnerte an die charakteristischen Muster, die Proteine, die an den intrazellulären Membranen des Golgi Apparates lokalisiert sind, zeigen. Diese ausgeprägte Lokalisierung wurde einheitlich und reproduzierbar in CV1 Zellen erhalten, aber auch in anderen untersuchten Zelltypen wie etwa CHO, NIH-3T3 und HeLa-Zellen.
Die Western Blot Analyse der transfizierten Zellen mit einem anti-GFP Antikörper bestätigte die Expression von GFP (27 kDa) oder des GFP-GBP-1 Fusionsproteins (97 kDa) in CV1 Zellen. Für die Western Blot Analyse wurden die CV1 Zellen in T75 cm² Flaschen angezüchtet, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreicht hatten und mit Lipofectamin (Gibco) transfiziert. Nach 12 Stunden wurden die Zellen geerntet und Proteinextrakte hergestellt unter Verwendung von RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1 % Na-Deoxycholat, 1 % Triton X-100, 0.1 % Dodecylsulfat (SDS) und 10 mM Tris-Cl pH 8.5) (Roux 1982) und diese sonifiziert. Die Proteinextrakte wurden in 1 × Laemmlipuffer (50 mM Tris/HCl pH 6.8, 100 mM Dithiothreitol (DTT), 2 % SDS, 0.1 % Bromphenolblau und 10 % Glyzerin) gekocht und einer SDS (12 %) Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) in Gegenwart von 10 % β-Mercaptoethanol (reduzierende Bedingungen) unterworfen. Die Proteine wurden dann elektrophoretisch mit einem Semidry-Blotapparat auf einer 0.2 μm PVDF-Membran (Pall Filtron) transferriert. Eine Immunofärbung wurde mit einem monoklonalen anti-GFP Mausantikörper (Boehringer Mannheim) und einem an Meerrettich-Peroxidase gekoppelten anti-Maus IgG Antikörper (Dako Diagnostika, Hamburg, Deutschland) durchgeführt. Die Immunkomplexe wurden mit dem Chemolumineszenz Nachweissystem (ECL) (Amersham Buchler, Braunschweig, Deutschland) dargestellt. Der Nachweis eines 97 kDa Proteins (27 kDa vom GFP Anteil und 70 kDa vom GBP-1 Anteil) in den Extrakten von Zellen, die mit der GFP-GBP-1 Fusionsprotein kodierenden cDNA transfiziert waren, beweist eindeutig, dass die isolierte cDNA für ein komplettes GBP-1 Protein kodiert.
REFERENZVERZEICHNIS

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SEQUENCE LISTING

Claims

Ein retroviraler Vektor umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die das GBP-1 Gen kodiert, wobei besagte Nukleinsäuresequenz mit einem Gen, welches für ein Shuttle-Protein kodiert, fusioniert ist.
Der Vektor gemäß Anspruch 1, wobei besagtes Shuttleprotein endothelzell-spezifisch ist.
Der Vektor gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 2, wobei besagtes Shuttleprotein das HIV-1-Tat ist.
Der Vektor gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 3, wobei besagte Nukleinsäuresequenz unter der transkriptionellen Kontrolle eines homologen regulatorischen Elementes der Expression des normalen GBP-1 Genes steht.
Der Vektor gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 4, wobei besagte Nukleinsäuresequenz unter der transkriptionellen Kontrolle eines heterologen Promotor steht.
Der Vektor gemäß Anspruch 5, wobei besagter Promotor ein konstitutiver, induzierbarer und/oder zelltyp-beschränkter Promotor ist.
Der Vektor gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 6, wobei besagter Vektor ein oder mehrere Gene, die für Substanzen kodieren, welche die GBP-1 Genexpression induzieren und/oder verstärken, umfasst.
Der Vektor gemäß Anspruch 7, wobei das Gen ein Zytokin Gen ist.
Der Vektor gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, wobei besagter retroviraler Vektor bezüglich der Replikation defekt ist.
Eine Produzentenzelle umfassend einen retroviralen Vektor gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 9 und ein DNA Konstrukt, welches für die Proteine kodiert, die nötig sind, um besagten viralen Vektor zu verpacken.
Ein viraler Partikel umfassend den retroviralen Vektor gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 9.
Das retrovirale Partikel gemäß Anspruch 11 erhältlich durch eine Produzentenzelle gemäß Anspruch 10.
Einen retroviralen Provirus erhältlich durch Infektion einer Zielzelle mit dem retroviralen Partikel gemäß den Ansprüchen 11 oder 12.
Eine mRNA des retroviralen Provirus gemäß Anspruch 13.
Eine RNA des Vektors gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 9.
Eine cDNA der RNA gemäß Anspruch 15.
Eine Zelle die mit dem Vektor gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 9 transduziert ist und/oder mit einem viralen Partikel gemäß den Ansprüchen 11 oder 12 infiziert ist.
Die Zelle gemäß Anspruch 17, wobei besagte Zelle eine Endothelzelle ist.
Ein in vitro Verfahren zur Einführung einer Nukleinsäuresequenz, die das GBP-1 Gen kodiert, welches an eine Sequenz, die ein Shuttleprotein kodiert, fusioniert ist, in Zellen umfassend die Transfektion einer Zelle mit besagter Nukleinsäuresequenz, mit RNA von besagter Nukleinsäuresequenz, mit dem Vektor gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 9 oder durch Infektion besagter Zelle oder eines Organismuses mit dem rekombinaten viralen Partikel gemäß der Ansprüche 11 oder 12.
Der Vektor gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 9, die Produzentenzelle gemäß Anspruch 10, das virale Partikel gemäß der Ansprüche 11 oder 12 und/oder die RNA gemäß Anspruch 14 oder 15 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines GBP-1 Genes welches an eine Nukleinsäuresequenz für ein Shuttleprotein fusioniert ist, ein GBP-1 Protein, welches an ein Shuttleprotein fusioniert ist, den Vektor gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 9, die Produzentenzelle gemäß Anspruch 10, das virale Partikel gemäß Anspruch 11 oder 12 und/oder die RNA gemäß Anspruch 14 oder 15 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer proliferativen Fehlfunktion von Zellen.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine therapeutisch effektive Menge des Vektors gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 9, der Produzentenzelle gemäß Anspruch 10, des viralen Partikels gemäß Anspruch 11 oder 12 und/oder der RNA gemäß Anspruch 14 oder 15 und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.
Ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten GBP-1 Fusionproteins umfassend a) die Transduktion einer Zelle mit dem Vektor gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 9 und/oder die Infektion mit einem viralen Partikel gemäß der Ansprüche 11 oder 12, b) die Kultivierung der besagten Zelle, und c) die Isolierung des rekombinanten GBP-1 Fusionsproteins.