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WO1996002255A1 - Medicinal composition containing sialic acid derivative - Google Patents

Medicinal composition containing sialic acid derivative Download PDF

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Publication number
WO1996002255A1
WO1996002255A1 PCT/JP1995/001415 JP9501415W WO9602255A1 WO 1996002255 A1 WO1996002255 A1 WO 1996002255A1 JP 9501415 W JP9501415 W JP 9501415W WO 9602255 A1 WO9602255 A1 WO 9602255A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glcnac
sialic acid
acid derivative
gal
man
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1995/001415
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mamoru Koketsu
Masakazu Nishizono
Teruhiko Nitoda
Yuko Enoki
Hiroshi Kawanami
Lekh Raj Juneja
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Taiyo Kagaku KK
Original Assignee
Taiyo Kagaku KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Taiyo Kagaku KK filed Critical Taiyo Kagaku KK
Priority to EP95925133A priority Critical patent/EP0727216B1/en
Priority to US08/617,821 priority patent/US5834423A/en
Priority to DE69530910T priority patent/DE69530910T4/de
Priority to DE69530910A priority patent/DE69530910D1/de
Priority to CA002171614A priority patent/CA2171614C/en
Priority to JP50488896A priority patent/JP3930559B2/ja
Publication of WO1996002255A1 publication Critical patent/WO1996002255A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7012—Compounds having a free or esterified carboxyl group attached, directly or through a carbon chain, to a carbon atom of the saccharide radical, e.g. glucuronic acid, neuraminic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/73—Rosaceae (Rose family), e.g. strawberry, chokeberry, blackberry, pear or firethorn
    • A61K36/736—Prunus, e.g. plum, cherry, peach, apricot or almond
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents

Definitions

  • compositions containing sialic acid derivatives are provided.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing a sialic acid derivative.
  • the present invention further relates to a method for producing a sialic acid derivative from avian egg yolk.
  • the oral virus is one of the viruses that cause severe diarrhea in humans and animals, but this virus has a high infection rate during the lactation period, especially in developing countries where medical technology and medical facilities are not adequate. As a result, many people have died. The damage to the livestock industry is also enormous. Despite these circumstances, no effective preventive or therapeutic method has been developed for rotaviral diseases.
  • Herpes virus causes various symptoms of disease, including chronic herpes, in humans and animals, but no fundamental preventive or therapeutic method has been established because of latent infection.
  • Newcastle disease virus is a deadly infectious disease for birds Many poultry farmers have been affected by a certain Newcastle disease. Although preventive measures are being taken with vaccines, complete prevention is not possible, and Newcastle disease is a fast-transmitting disease, and is always a threat to poultry farmers because of the possibility of being transmitted by foreign viruses. One of them.
  • diarrhea can be roughly classified into two types: infectious ones caused by viruses, etc., and non-infectious ones caused by stress.However, it is easy to determine the cause of individual diarrhea. is not. Infectious diarrhea in human infants is mainly attributed to the oral virus.Especially, even in developing countries, more than one million infants per year are affected by rotavirus diarrhea. It is said to be dead. However, diarrhea can be caused by other viruses, bacteria, or stress, and most diarrhea is caused by a combination of these multiple causes. Therefore, for effective prevention and treatment of diarrhea, a means that is effective against such multiple causes is desired.
  • sialic acid-containing oligosaccharides include oligosaccharides present in glycoprotein molecules, oligosaccharides present in gangliosides, and sugar proteins or gangliosides. It is naturally present as a more free oligosaccharide peptide or oligosaccharide chain.
  • Sialic acid-containing oligosaccharides are present by binding to glycoproteins, and are involved in maintaining the tertiary structure of protein molecules, increasing resistance to proteases, half-life in blood, molecular interactions, and increasing dragon resistance I do.
  • the ganglion it is a component that affects intercellular recognition, cell differentiation, etc., and is used as a receptor for various cytotoxins, neurotransmitters, hormones, interferons, viruses, etc. There is also a role.
  • sialyl Lewis-X antigen a helicobacter that causes ulcers.
  • breast milk contains 1.5 to 7.0 times as much sialic acid as cow's milk, which enhances the baby's immunity, develops brain functions, and helps the intestine. It has been suggested that bacterial growth is promoted. Based on these findings, research on the application of sialic acid-containing oligosaccharides to pharmaceuticals and functional foods is underway.
  • a method for producing sialic acid-containing oligosaccharides on an industrial scale a method of purifying from defatted egg yolk of birds is known.
  • This is a method in which bird egg defatted egg yolk or an aqueous extract thereof is enzymatically digested and prepared using ultrafiltration and a reverse osmosis membrane (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 6-245,784).
  • the enzyme used here is protease II PNGase (peptide N-glycanase), the former is an enzyme that releases glycopeptides from glycoproteins, and the latter is an enzyme that releases N-glycosyl sugar chains from glycoproteins or glycopeptides. .
  • sialic acid-containing oligosaccharide peptides or sialic acid-containing oligosaccharides obtained using these enzymes were a mixture of monosialic and disialic types.
  • sialic acid-containing oligosaccharide peptides may be immunogenic due to the presence of a peptide consisting of 5 to 6 amino acids at the reducing end, and PNGase is a pathogen. Many of them are derived from tsumugi fungus, which makes them difficult to apply to foods.
  • PNGase is present in armon seeds, but protease, S-D-galactosidase, 8-D-glucosidase, ⁇ -D-mannosidase and other contaminating enzymes are present in the armone seeds. And it was difficult to purify PNGase in large quantities. In addition, PNGase had limited application because it was unable to release sugar chains linked to large, tightly folded protein molecules such as phosvitin. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies and have found that a sialic acid derivative having a specific structure is surprisingly excellent in antiviral effect, diarrhea effect, antiulcer effect, antiinflammatory effect, It has been found that it has an allergic effect and has an extremely excellent growth promoting effect against the intestinal bacteria Bifidobacterium.
  • bird egg yolk is used as a substrate
  • the sialic acid-containing oligosaccharide chains are extremely easily released unexpectedly simply by adding the armando or apricot seed itself instead of the purified PNGase, and the target product can be obtained easily and in high yield.
  • the inventors have found that the present invention can be obtained, and have completed the present invention.
  • the gist of the present invention is:
  • composition represented by the following general formula (1) or (2), comprising a sialic acid derivative as an active ingredient;
  • R 1 represents a sugar residue or a sugar peptide residue.
  • X 1 and X 2 represent NeuAc (H 2,6) Gal ( ⁇ S 1,4) GlcNAc ⁇ 1,2)-, Gal (/ S1,4) GlcNAc (yS1,2)-or GlcNAc (1,2)-is shown.
  • X 1 and X 2 may be the same or different. However, either one of X 1 and X 2 represents at least NeuAc (H 2,6) Gal (S 1,4) GlcNAc ( ⁇ 1,2)-. )
  • X 3- (CH 2) ⁇ -0- ⁇ -0 ( ⁇ ⁇ 2 (2) (Wherein, R 2 and R 3 represent a hydrogen atom, or a linear, branched, or cyclic saturated or unsaturated acyl group having 1 to 30 carbon atoms. R 2 and R 3 are the same. N represents a natural number of 1 to 20. X 3 represents a sialic acid derivative residue or the following general formula (3
  • X 4 and X 5 are NeuAc (2.6) Gal (S 1,4) GlcNAc (1,2) one, Gal (/ S 1,) GlcNAc (/ SI, 2) —, or GlcNAc ( / S I.2)-, and X 4 and X 5 may be the same or different, provided that at least one of X 4 and X 5 is at least NeuAc (H 2 , 6) Gal (j81, 4) GlcNAc (1, 2) — Y represents a sugar residue.) Represents a residue of a sugar oligosaccharide derivative represented by )
  • R 4 represents a sugar residue.
  • X 1 and X 2 represent NeuA and 2,6) Gal (1,4) GlcNAc ( ⁇ 1,2) —, Gal (1,4) GlcNAc ( ⁇ 1,2) — or GlcN Ac (/ SI, 2) —.
  • X 1 and X 2 may be the same or different. Provided that one of X 1 and X 2 are small At least NeuAc (2,6) Gal (/ Sl, 4) GlcNAc (51.2) is shown. )
  • R 4 represents a sugar residue.
  • X 1 and X 2 represent NeuAc (a 2, 6) Gal (1, 4) GlcNAc (1, 2) —, GaK ⁇ S 1.4) GlcNAc ⁇ 1 , 2)-. Or GlcN Ac (yS l, 2) —.
  • X 1 and X 2 may be the same or different. Provided that one of X 1 and X 2 are, even without least NeuAc (shed 2.6) Gal (S 1, 4 ) GlcNAc (; 81, 2) - shows the. )
  • FIG. 1 is a diagram showing the inhibition of infection of human trophovirus by sialic acid derivatives (sialyl phospholipids).
  • FIG. 2 is a graph showing the preventive effect of sialic acid derivatives (sialyl phospholipids) on oral viral diarrhea.
  • FIG. 3 is a diagram showing the therapeutic effect of rotavirus diarrhea by a sialic acid derivative (sialyl lipid).
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains a sialic acid derivative represented by the following general formula (1) or (2) as an active ingredient.
  • R ′ is not particularly limited as a sugar residue representing a sugar residue or a sugar peptide residue.
  • a sugar residue representing a sugar residue or a sugar peptide residue.
  • the sugar peptide residue is not particularly limited, but includes, for example, one GlcNAc (S1,4) GlcNAcAsn, -GlcNAcAsn, IleLysValAlaAsp (-GlcNAc) LysThr, LysValAlaAsp (-GlcNAc) LysTr and the like.
  • X 1 and X 2 are NeuAcCa 2,6) Gal (; 81,4) GlcNAc (1,2)-, Ga ⁇ (B 1,4) GlcNAc ( ⁇ 1,2)-. Or GlcNAc (/ S I .2).
  • X 1 and X 2 may be the same or different. However, one of X 1 and X 2 at least shows NeuAc (H 2,6) Gal (S 1,4) GlcNAc (yS 1.2) —.
  • R 2 and R 3 are a hydrogen atom or a linear, branched, or cyclic saturated or unsaturated, having 1 to 30 carbon atoms, preferably 12 to 24 carbon atoms. Represents a phenyl group. R 2 and R 3 may be the same or different.
  • the straight-chain, branched-chain or cyclic saturated or unsaturated acyl group having 1 to 30 carbon atoms is not particularly limited, and examples thereof include a lauroyl group, a myristyl group, a palmitoyl group, Examples include a stearyl group, an oleoyl group, a linoleoyl group, a linolenoyl group, an arachidnoyl group, an eicosapentyl enol group, and a docosahexaenoyl group. Of these, lauroyl, myristoyl, palmitoyl, and stearoyl are preferred because they are easily available.
  • N in this column is a natural number from 1 to 20 Show. It is preferably from 4 to 16, more preferably from 6 to 12, and particularly preferably from 8 to 10. N is preferably 1 or more from the viewpoint of preventing the sialic acid derivative residue or sialyl oligosaccharide derivative residue represented by X 3 from being buried in the membrane, and preferably 20 or less from the viewpoint of flexibility. .
  • X 3 is a sialic acid derivative residue or the following general formula (3)
  • X 4 and X 5 are NeuAc (H 2,6) Gal (/ S l, 4) GlcNAc ( ⁇ ⁇ , 2) one, GaK S I.4) GlcNAc (S l, 2) —, Or GlcNAc (S 1.2).
  • X 4 and X 5 may be the same or different. Provided that one of X 4 and X 5, least for a NeuAc also (shed 2, 6) Gal (/ S 1, 4) GlcNAc (/ SI, 2) - shows the.
  • Y represents a sugar residue.
  • sialic acid derivative residue is not particularly limited, and examples thereof include those derived from the following compounds.
  • 3'-ylactylactose 6'-ylylactylose, silyl-lewis X, N-acetylamino, N-glycol cetyl-methyl, N-glycol Rilnoylamic acid, 0-glycolylylamino acid, and 3-doxynoulosonic acid, and their alkyl esters, 0-acylated, monoalkylated, deoxylated, thiog These are the ricosides and the lactones.
  • Y represents a sugar residue.
  • the sugar residue is not particularly limited, but includes, for example, one GlcNAc ⁇ 1,4) GlcNAc -.— GlcNAc-, -GaK ⁇ l, 4) Glc and the like.
  • aryl oligo hammer derivative residue represented by the general formula (3) include, for example, the following.
  • the sialic acid derivative represented by the general formula (1) can be obtained, for example, by digesting a glycoprotein having a sugar chain structure satisfying the single-branch formula (1) by digestion with bronase or PNGase according to a conventional method. , Or can be obtained by the method of the present invention using avian egg yolk.
  • the origin of the bird egg yolk used in the present invention is not particularly limited as long as it is the egg yolk of a bird egg, but egg yolks such as nitrite, pebble, duck and duck are preferred.
  • egg yolks such as nitrite, pebble, duck and duck are preferred.
  • the residue (defatted egg yolk) obtained by defatting the bird egg yolk by extracting it with an organic solvent (methanol, ethanol, getyl ether, etc.) may be used as a raw material.
  • the aroma and apricot seed used in the present invention are not purified enzyme, and are used as such, or as long as they have not been subjected to a treatment such as heating so as to deactivate the contained enzyme even if treated.
  • the form may be powder or paste.
  • defatted armor and defatted apricot seed are particularly preferred.
  • the defatted armand and the defatted apricot seed are defatted raw ammonium and apricot seeds, for example, extracted with an organic solvent (aceton, getyl ether, etc.). It is not a purified enzyme.
  • the degree of defatting is preferably one having a lipid content of 25% or less, more preferably 5% or less.
  • powders or pastes of such defatted armor or defatted apricot seeds are more preferably used.
  • a purified enzyme is used as in the conventional method, a mixture of substantially the same amount of the monial type and the disial type can be obtained. As a result, there is a great advantage that the monosial type and the disial type can be easily separated.
  • anion exchange resin used here examples include D0WEX (manufactured by Dow Chemical), SEPABEADS (manufactured by Mitsubishi Chemical), AMBERUTE (manufactured by Rohm and Haas), and the like.
  • D0WEX manufactured by Dow Chemical
  • SEPABEADS manufactured by Mitsubishi Chemical
  • AMBERUTE manufactured by Rohm and Haas
  • the types of these products are not particularly limited, or strongly basic types are preferred.
  • the sialic acid derivative obtained in this manner is represented by a one-branch formula (4), and has the general formula (1) except that R 4 is a sugar residue and not a sugar peptide residue. It is similar.
  • R 4 represents a sugar residue.
  • X 1 and X 2 represent NeuAc (H 2,6) GaK ⁇ 1.4) GlcNAc (; 81,2)-, GaK ⁇ 1.4) GlcNAc (31,2) —, Or GlcN Ac (1.2) —.
  • X 1 and X 2 may be the same or different. Provided that one of X 1 and X 2 are even less Do rather NeuAc (shed 2, 6) Gal (S 1.4 ) GlcNAc (; 51,2) - shows the. )
  • the sialic acid derivative represented by the general formula (4) can be produced cheaper and more easily than before, and the obtained sialic acid derivative can be used for the pharmaceutical composition of the present invention and its raw material. Therefore, it is industrially very advantageous.
  • the sialic acid derivative is, for example, an enzyme using a chemical synthesis reaction and phospholipase D (hereinafter abbreviated as PLD) using a compound that is a raw material of a sugar component, phospholipid, and spacer as a raw material. It can be prepared by combining the synthesis reactions.
  • PLD phospholipase D
  • the sugar component mentioned here, represented by X 3, is a compound having a sialic acid derivative residue or Xia Li Ruori Gore sugar derivative residue, such as those listed above in its structure.
  • the phospholipid may be a phospholipid having a hydrogen atom or the above-mentioned acyl group, that is, an acyl group described in the description of R 2 and R 3 .
  • phosphatidylcholine and phosphatidyl having the above-mentioned acyl group The first method is a method in which a sugar component linked to a spacer is transferred to a polar group portion of phospholipid by a transesterification reaction using PLD.
  • the sugar component is reacted with methanol under acidic conditions to form a methylated product, and hydrogen chloride is allowed to act on it in acetyl chloride to acetylate all hydroxyl groups, and the sugar residue at the reducing end of the sugar component is reduced.
  • a peracetyl-2-macro mouth derivative is obtained in which the hydrogen atom at the 2-position of the group is replaced with a chlorine atom.
  • a monoester of an alkyl diol is allowed to act on this in the presence of molecular sieves and Ag 2 C 0 a to obtain a peracetyl-2-0-alkyl derivative. This is deacetylated under basic conditions to obtain a 0-alkylated sugar component.
  • a transesterified product of the polar group portion of the phospholipid and the 0-alkylated product of the sugar component is obtained.
  • This is demethylated by treating it with a metal hydroxide, and then purified to obtain a sialic acid derivative.
  • the conditions for the enzymatic reaction by PLD in this method are, for example, as follows.
  • the pH of the reaction solution is usually pH 4.0 to 8.0, preferably pH 5.6 to 7.0. It is preferable to adjust the pH within the range of ⁇ 0.5 from the optimum pH of the PLD to be used. At a pH outside this range, the reaction rate decreases.
  • the amount of PLD used is usually 10 to 100 units / g of phospholipid, preferably 20 to 50 units / g of phospholipid. 100 units or more are preferable from the viewpoint of sufficiently promoting the reaction, and 100 units are preferable from the viewpoint of the reaction efficiency. Or less is preferred.
  • the reaction temperature is usually 15 to 50 ° C, preferably 25 to 30 ° C.
  • the reaction time is usually 0.5 to 12 hours, preferably 1 to 6 hours. 0.5 hours or more is preferable from the viewpoint of sufficiently promoting the reaction, and 12 hours or less is preferable from the viewpoint of suppressing the reaction efficiency and side reactions.
  • a calcium salt in order to further improve the enzyme activity of PLD, but a salt of another ion may be added.
  • a salt of another ion examples include halides, carbonates, and phosphates of transition elements such as divalent typical elements such as calcium and barium ions, manganese, lanthanum, and cerium. Salts, acetates and the like.
  • the amount of addition is 1 OmM to 1 M, preferably 1 OmV! ⁇ 0.5M. It is preferably 10 mM or more from the viewpoint of obtaining the desired effect, and preferably 1 M or less from the viewpoint of reaction efficiency.
  • the reaction system may be an aqueous system, a two-phase system consisting of an aqueous phase and an organic solvent phase, or an organic solvent system, but the component is often water-soluble, and the fat and oil are oil-soluble. For this reason, a two-phase system of an aqueous phase and an organic solvent phase is preferable.
  • the organic solvent used for dissolving phospholipids include carboxylic acid alkyl esters and alkyls having a melting point of 40 ° C or lower.
  • One or more compounds selected from the group consisting of ethers, aliphatic hydrocarbons, alicyclic hydrocarbons, aromatic hydrocarbons and halogenated hydrocarbons can be used.
  • alkyl esters of carboxylic acids include esters of straight or branched chain fatty acids having 2 to 6 carbon atoms with straight or branched chain alcohols having 8 or less carbon atoms, such as methyl acetate, Ethyl acetate, methyl valerate, methyl propionate, methyl butyrate, methyl carboxylate Although it can be used, methyl acetate is preferred.
  • alkyl ether include a straight-chain or branched-chain alkyl ether having 2 to 6 carbon atoms, such as dimethyl ether, getyl ether, ethyl methyl ether, and isopropyl ether. Til ether is preferred.
  • Examples of the aliphatic hydrocarbon include linear or branched aliphatic hydrocarbons having 6 to 12 carbon atoms, and among them, hexane, heptane, and petroleum ether are preferable.
  • Examples of the alicyclic hydrocarbon include alicyclic hydrocarbons having 6 to 12 carbon atoms, with or without a substituent, among which cyclohexane, methylcyclohexane, and cyclooctane. Is preferred.
  • Examples of the aromatic hydrocarbon include those having or not having a substituent and having 6 to 12 carbon atoms. Among them, benzene, toluene, and kylene are preferable.
  • halogenated hydrocarbons examples include chlorides, bromides, and iodides of straight-chain or branched alkanes having 8 or less carbon atoms. Among them, clot-form form, carbon tetrachloride, and methylene chloride are preferred. Chlorides such as are preferred.
  • Examples of the alkali metal hydroxide to be used in the demethylation reaction include sodium hydroxide and a hydroxylic rhodium.
  • the demethylation reaction is usually performed under ice cooling, and the reaction time is about 30 minutes to 1 day.
  • the sialic acid derivative can be obtained by subjecting the reaction product to a conventional purification method such as extraction, chromatography, and recrystallization.
  • the second method is a method in which a spacer is bound to phospholipids by a transesterification reaction with PLD, and then a glycol component is bound to a sugar component.
  • phospholipids and alkyl diols are mixed in an organic solvent, and an appropriate pH buffer is added thereto to dissolve the calcium salt.
  • PLD or cells containing PLD stir, and perform enzyme reaction for several hours to several tens of hours.
  • an intermediate is obtained in which the polar group portion of the phospholipid is transesterified with the alkyldiol.
  • this acetylated product is deacetylated by treating it with an alkali metal hydroxide, and is debenzylated by hydrogenation in the presence of a catalyst to obtain a sialic acid derivative.
  • the activator used in the glycosylation reaction includes trimethylsilyl triflate, silver triflate and the like, and preferably silver triflate.
  • the amount added is 0.1 to 10 equivalents, preferably 0.1 to 5 equivalents. From the viewpoint of sufficiently proceeding the reaction, 0.1 equivalent or more is preferred, and from the viewpoint of reaction efficiency, 10 equivalent or less is preferred.
  • the ⁇ -chain structure of the sialic acid derivative used in the present invention can be confirmed by a known method using HPLC ⁇ NMR.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be obtained by preparing the sialic acid derivative thus obtained into a liquid, tablet, granule or the like using an appropriate solvent or base.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is particularly preferably used as an antiviral agent, a therapeutic agent for diarrhea, an antiulcer agent, an antiinflammatory agent, an antiallergic agent, and as a bifidobacterium growth promoter.
  • the target virus is not particularly limited, but in particular, influenza virus, rotavirus, Newcastle disease virus, herpes virus And the like.
  • the target virus is not particularly limited, but in particular, influenza virus, rotavirus, Newcastle disease virus, herpes virus And the like.
  • a diarrhea treatment It is preferably used for both infectious diarrhea and infectious diarrhea caused by rotavirus, Salmonella and the like.
  • As an anti-ulcer agent it is suitably used especially for ulcers caused by Helicobacter pylori.
  • As an anti-inflammatory agent it is suitably used for rheumatism, asthma and the like.
  • As an anti-allergic agent it is suitably used for allergic recruitment, hay fever and the like.
  • one component of the sialic acid derivative represented by the general formula (1) or (2) may be used as a single insect, or may be used as a mixture of two or more components.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on age, sex, body weight, symptoms and the like, but when used as an antiviral agent, it is 1.0 to 30 Og per 1 kg of body weight. When used as a therapeutic agent for diarrhea, it is 0.5-1 O mg / kg body weight. When used as an anti-ulcer agent, the weight is 1.0 to 2000 g per kg of body weight. When used as an anti-inflammatory agent, the weight is 0 to 100 g per 1 kg of body weight. When used as an antiallergic agent, it is 0 to 30 O ⁇ g / kg body weight. When used as a Bifidobacterium growth promoter, it is 100 to 100 mg per 1 kg of body weight. 'Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Production Examples, Examples, and Test Examples, but the present invention is not limited to these Examples and the like. Production Example 1 Preparation of N-acetylneuraminyllin lipid
  • this sialic acid derivative is referred to as sialyl phospholipid 1.
  • N-acetylnoylamino acid, a propyl ester of a N-acetylamino-2-acid, synthesized by the method described in Production Example 1 2.34 g of benzyl ester of a chloro mouth derivative and phosphatidyl octanol 3 3.3 g was dissolved in 20 mL of clog mouth form, and 1.14 g of sodium hydrogen phosphate and 2.34 g of molecular sieve 4A were added. The mixture was cooled to 150 to 140 ° C., and a solution prepared by dissolving 0.3 g of silver in trifluorene silver sulfonate in 15 in L of toluene was added dropwise.
  • sialic acid derivative that is, the general formula (2)
  • X 3 is an N-acetylaminoylamino acid residue
  • R 2 and R 3 are an acyl group of soybean hydrogenated phosphatidylcholine
  • n is 8 in a sialinolerin lipid 4 3 .2 mg
  • this sialic acid derivative is referred to as sialyl phospholipid 2.
  • sialyl linoleic acid which is a toxic carbonyl N-acetylnoyl amic acid residue
  • R 2 and R 3 are both palmitoyl groups
  • n is 8 .
  • this sialic acid derivative is referred to as sialyl phospholipid.
  • this sialic acid derivative is referred to as sialyl phospholipid 4.
  • 1,4-butanediol 420 mg, dimyristyl phosphatid 765 mg of zirconine (Funakoshi) and 420 mg of 410-acetylneuramic acid synthesized by a known method were used as raw materials. These raw materials are treated in the same manner as in Production Example 2 to obtain the desired sialic acid derivative, that is, in the general formula (2), X 3 is a 40-acetylacetylamino acid residue. , R 2 , and R 3 are each a myristol group, and 4.7 mg of a sialyl phospholipid in which n is 4 was obtained. Hereinafter, this sialic acid derivative is referred to as sialyl phospholipid 5. Production Example 6 Preparation of 3'-Sialyl Lacto Sylrin Lipid
  • 1,8-Octanediol 44 mg, 1-Palmytoyl 2-Stearoyl lecithin (Funakoshi) 790 mg, N-Acetylnoylamic acid 40 Omg were used as raw materials. These raw materials are treated in the same manner as in Production Example 2 to obtain the desired sialic acid derivative, that is, in the general formula (2), X 3 is an N-acetyl neuraminic acid residue, and R 2 is palmitic acid. 4.5 mg of a sialyl phospholipid in which the toyl group and R 3 were stearoyl groups and n was 8 were obtained. Hereinafter, this sialic acid derivative is referred to as “sialyl phospholipid 9”.
  • Preparation Example 10 Preparation of N-acetylnoylaminolin lipid
  • Example 2 A 50 liter concentrated solution was obtained in the same manner as in Example 2.
  • the resulting concentrated Chijimieki the p H was adjusted to 5.0 by the defatted apricot seeds 7 0 0 g was added and was stirred 3 7 e C, 1 day.
  • the obtained liquid was filtered and adsorbed on 250 liters of the same anion exchange resin as in Example 1. This was washed with 500 liters of water, and then eluted with a 0.3 to 0.3 M NaCl aqueous solution.
  • the fraction eluted from 0.05 to 0.1 MNaCl was concentrated, desalted, and dried to obtain 27.2 g of dicyaryl oligosaccharide. The purity was confirmed by HPLC to be 92%.
  • Test Example 1 Confirmation of oligosaccharide sugar chain structure
  • GlcNAc-2 2.071 2.067 2.07 1 GlcNAc-5 2.068 2.065 2.07 1 GlcNAc-5 '2.044 2.048 2.062 NeuAc 2.028 2.028 2.028 NeuAc 2. 028 Note)
  • the acetylated compound was added to 100 mL of dichloromethane to which 15 g of molecular sieve 4 A, Ag 2 C 0 a 10 g, and 5 g of the phosphatidylocanol obtained above were added.
  • sialic acid derivatives having different acyl groups and spacers were obtained by changing the materials used for the phospholipids and spacers.
  • Distearoylphosphatidylcholine as a phospholipid DSPL 1 using 1,3-propanediol as a raw material for disulfide, and dimyristylphosphatidylcholine as a phospholipid.
  • DSPL2 As a raw material for phosphorus and spacer, use DSPL2 as a raw material for 4-butanediol, and as a raw material for lipids, as dirawdoylphosphatidylcholine, and as a raw material for spacer, 1,8 — DSPL 4 was obtained by using octanediol, DSPL5 by using dilinolenoylphosphatidylcholine as a phospholipid, and 1,10-decanediol as a raw material for spacer.
  • the structure of each sialic acid derivative is shown below.
  • the desired sialic acid was produced in the same manner as in Production Example 11. 20.1 mg of a derivative (monosialyloligoglycophospholipid (MSPL3)) was obtained.
  • sialic acid derivatives having different acyl groups and spacers were obtained by changing the materials used for the phospholipids and spacers.
  • Distearoylphosphatidylcholine as a phospholipid MSPL1 using 1,3-propanediol as a raw material for spacer, and dimyristylphosphatidylcholine as a phospholipid.
  • MSPL 2 using 4-butanediol as a raw material for sugars and spacers, and diarachidoylphosphatidylcholine as a phospholipid, and 1,8-octa as a raw material for spacers
  • MSPL 4 was obtained by using diol, dilinolenoylphosphatidylcholine as a phospholipid, and MSPL 5 by using 1,10-decanediol as a raw material of a spacer.
  • the structure of each sialic acid derivative is shown below.
  • Table 2 Each sample shown in Table 2 was mixed with 0.25 mL of PBS containing the concentrations shown in Table 2 and 0.25 mL of influenza A type 2 virus solution (4 HA units) and shaken at 37 ° C for 30 minutes. . After leaving at room temperature for 1 hour, the nitrile hemagglutinating ability was measured. Hemagglutination inhibition rate was determined by using a test group using PBS containing no sialic acid derivative as a control. Table 2 shows the results. Table 2 Concentration (g / mL)
  • Each of the samples shown in Table 3 was subjected to the concentration shown in Table 3, and to the sialic acid derivative (sialyl phospholipid) obtained in Production Examples 2, 4, 6, and 8 and N-acetylneuraminic acid.
  • Eagle's minimal medium containing 100 mg / ml, 100 mg / ml, 1 m / ml, 0.1 mg / ml, and 0.1 g gm Each of them was mixed with 100 ⁇ L of ELO M4, and allowed to stand at 37 ° C for 1 hour. This was added to MA104 cells (monkey kidney cells) cultured to a monolayer on a 96-well plate.
  • MA virus MO strain
  • MA104 cells saliva cells
  • EMEM fetal calf serum
  • Table 4 concentrations shown in Table 4
  • the rotavirus infectivity titer of the culture supernatant was measured by the indirect fluorescent antibody method, and EME 1V containing no sialic acid derivative was used in place of the above EME 1V containing sialic acid derivative.
  • EME 1V containing no sialic acid derivative was used in place of the above EME 1V containing sialic acid derivative.
  • the rate of oral viral growth inhibition was determined, and the results are shown in Table 4.
  • Each of the samples shown in Table 6 was mixed with 0.25 mL of EME M containing the concentration shown in Table 6 with 25 mL of EME MO of simple herpes virus type I, and allowed to stand for 1 hour. Was placed. This was then added to Hela cells cultured to monolayer in a mini-bottle. After standing for 1 hour, the liquid component was removed, EMEM was added, and the mixture was left still for 72 hours. After fixation with 10% formalin, the cells were stained with crystal violet and the number of plaques was measured. Then, the plaque formation inhibition rate was determined by using a test group in which EMEM containing no sialic acid derivative was used instead of the above sialic acid derivative EMEM diluent as a control. The results are shown in Table 6.
  • Table 6 shows that sialic acid derivatives, especially those to which phospholipids are bound, have an anti-herpesvirus effect. In addition, all of the sialic acid derivatives exhibited significantly higher black formation inhibitory effects than N-acetyl neuraminic acid.
  • Test Example 7 Inhibitory Effect of Sialic Acid Derivatives on Helicobacter pylori Adhesion of each sample shown in Table 7 in PBS containing the concentrations shown in Table 7 was performed using a suspension of Helicobacter pylori ZPBS (2x10 5 CFU / L) and left at 37 ° C for 30 minutes. Thereafter, the plate was added to a 24-well plate coated with mucin (derived from pig) and left at 37 ° C for 2 hours.
  • the cells were washed with PBS, and the number of remaining bacteria was measured by the indophenol method utilizing the protease activity secreted by the bacteria.
  • the adhesion inhibition rate was determined using a test group in which PBS containing no sialic acid derivative was used instead of the PBS containing sialic acid as a control. Table 7 shows the results.
  • MS was administered at 1 mg, 5 mg, and 10 mg per 1 kg body weight.
  • I group: DS was administered at 1 mg / kg, 5 mg / l O mg / kg body weight.
  • HI group 1 mg, 5 mg, 10 mg of MSPL3 was administered per 1 kg of body weight.
  • IV group DSPL3 was administered at 1 mg, 5 mg, and lOmg per kg body weight.
  • Group V 1 mL of physiological saline was administered per 1 kg of body weight.
  • N-acetylneuraminic acid was administered at 1 mg, 5 mg, and 10 mg per 1 kg of body weight.
  • Test Example 10 Effect of sialic acid derivative on growth of bifidobacteria
  • B. infant is 32. 8
  • Table 10 shows that the sialic acid derivative has an effect of promoting the growth of bifidobacteria. In addition, each of the sialic acid derivatives exhibited a remarkably higher growth promoting effect than N-acetyl neuraminic acid.
  • Test Example 1 1 Preventive effect of sialic acid derivative on diarrhea caused by rotavirus
  • sialic acid derivatives (sialyl lin lipids) obtained in Production Examples 2, 4, 6, and 8 were diluted with physiological saline to a concentration of 1.0 mgZmL, and they were diluted with ddY at 5 days of age. Mice were orally administered 50 L each. One hour after the administration of the sialic acid derivative solution, the mice were orally infected with 50 zL of Rotavirus MEM diluent at a concentration sufficient for infection. That The presence of diarrhea was observed over the next 5 days. As a result, as shown in Fig.
  • the 120 calves infected with Salmonella dublin were divided into 12 groups of 10 cows each, with 11 groups each containing the sialic acid derivative obtained in Production Examples 1 to 10 (sialyluri). ) And N-acetylnoylamic acid at a daily rate of 100 mg per animal per day, and the remaining one group receives artificial milk without a sialic acid derivative. The same amount of milk was given and the animals were kept for 5 weeks. In the meantime, fecal score as an indicator of diarrhea and Salmonella dublin in feces was measured. The results are shown in Tables 11 and 12.
  • the figures are the average of 10 animals, with 0 for normal stool, 1 for stool, 2 for muddy stool, and 3 for watery stool. Table 1 2
  • the values are the average of 10 animals and are shown as logarithmic values per 1 g of feces.
  • Tables 11 and 12 the fecal score of the group administered with the sialic acid derivative-added artificial milk was lower than that of the non-supplemented artificial milk-administered group, and the number of Salmone lla dublin in feces decreased. This demonstrated that the sialic acid derivative exhibited an excellent therapeutic effect on diarrhea due to Salmonel la la dublin infection. In addition, all of the sialic acid derivatives showed remarkably higher therapeutic effects than N-acetylneuraminic acid. Test Example 14 Therapeutic effect of sialic acid derivatives on non-infectious diarrhea
  • the 60 calves were divided into 6 groups of 10 calves, 5 of which were the sialic acid derivatives (sialyl lin lipids) obtained in Production Examples 2, 4, 6, and 8, respectively, and N — Give artificial milk supplemented daily with 100 mg of acetyl neuraminic acid per animal per day, and give the remaining one group the same amount of artificial milk without sialic acid derivative. Bred for 5 weeks. During that time, fecal scores and intestinal bacterial flora were measured as indicators of non-infectious diarrhea. The results are shown in Tables 13-17. For the group to which N-acetyl neuraminic acid was administered, only fecal scores are shown.
  • the figures are the average of 10 animals, with 0 for normal stool, 1 for ⁇ stool, 2 for muddy stool, and 3 for watery stool.
  • the numerical values are the average of 10 animals and are expressed as logarithmic values per 1 g of feces c Table 16
  • the numerical value is the average of 10 animals and is expressed in logarithmic value per 1 g of feces c Table 17
  • the values are the average of 10 animals and are shown as logarithmic values per 1 g of feces.
  • the sialic acid derivative-added artificial milk-administered group had a lower fecal score than the non-added artificial milk-administered group, and also had reduced Perscherichia coli and Escherichia coli, and showed bifidobacteria and lactic acid bacteria. increased. This demonstrated that sialyl phospholipids have an excellent therapeutic effect on non-infectious diarrhea. In addition, the results of the fecal scores showed that all of the sialic acid derivatives exhibited a remarkably higher therapeutic effect than N-acetylneuraminic acid. Industrial applicability
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as an antiviral agent, a therapeutic agent for diarrhea, an antiulcer agent, an antiinflammatory agent, an antiallergic agent, and a bifidobacterium growth promoter. Further, the production method of the present invention can produce a sialic acid derivative on an industrial scale at low cost and simply.

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Description

明 細 書
シアル酸誘導体を含有する医薬組成物 技術分野
本発明はシアル酸誘導体を含有する医薬組成物に関する。 さらに 本発明は、 鳥類卵卵黄よりシアル酸誘導体を製造する方法に関する
背景技術
ウィルス性の疾患に対する治療剤、 予防剤の開発には、 これまで 多く の労力が費やされてきたが、 ある種のウィルスに対しては、 い まだに有効な抗ウィルス剤の開発には至っていない。 なかでもイ ン フルェンザウィルスによる感冒は、 数年に一度の割合で世界的な大 流行をおこ し、 多数の犠牲者を出すため、 世界中の人々から恐れら れている。 しかし、 イ ンフルエンザウイ ルスの抗原は頻繁に変異す るため、 有効な薬剤の開発は困難を極めている。
口夕ウィルスは、 ヒ ト及び動物に激しい下痢症を起こすウィルス のひとつであるが、 このウィルスは授乳期において感染率が高く、 特に発展途上国においては医療技術、 医療設備が充実していないた め、 多く の死亡者が出ている。 また、 畜産業における被害も莫大な ものである。 このような現状にもかかわらず、 ロタウィルス性の疾 患に対する有効な予防法、 治療法はいまだに開発されていない。
ヘルぺスウィルスは、 ヒ トおよび動物に慢性的な疱疹をはじめさ まざまな症状の疾患をもたらすが、 潜伏感染するこ となどから根本 的な予防法、 治療法は確立されていない。
ニューカッスル病ウィルスは鳥類に対して致死的な感染性疾患で あるニューカ ッ スル病をもたらし、 多く の養鶏業者が被害を受けて いる。 ワ クチンによる予防策がと られてはいるが、 完全な予防は不 可能であり、 しかもニューカ ッ スル病は感染が早く 、 常に外来ウイ ルスによる感染の可能性があるため、 いまだに養鶏業者の脅威のひ とつとなっている。
また、 下痢症は大別する と、 ウィルスゃ紬菌などによる感染性の ものとス ト レスなどによる非感染性のものとがあるが、 個々の下痢 症についてその原因を確定するこ とは容易ではない。 ヒ トの乳幼児 においておこる感染性下痢症は、 主と して口夕ウィルスによる もの とされ、 特に発展途上国においては現在でも年間百万人以上の乳幼 児が、 このロタウィルス性下痢症により死亡していると言われてい る。 しかし、 下痢症には他のウィルスや細菌、 あるいはス ト レ スが 原因であるものもあり、 ほとんどの下痢症は、 これらの複数の原因 が複雑に関与して起こ っている。 したがって、 下痢症の有効な予防 、 治療には、 このような複数の原因に対して効果を発揮する手段が 望まれる。 家畜や家禽においても、 哺乳期の下痢症は罹患率が高く 、 死に至るこ とが多いため、 畜産業や養鶏業に多大の被害を与え続 けている。 これらの下痢症もほとんどは複数の原因による と思われ る。 しかしながら、 複数の異なる原因による、 下痢症に対する有効 な予防法、 治療法はいまだに開発されていないのが現状である。
ところで、 シアル酸含有オ リ ゴ糖は、 糖タ ンパク質分子中に存在 するオ リ ゴ糖鎖、 ガングリ オシ ドに存在するオ リ ゴ糖鎖、 及び糖夕 ンパク質もしく はガングリ ォシ ドより遊離して存在するオ リ ゴ糖ぺ プチ ドも し く はオ リ ゴ糖鎖と して天然に存在している。
鳥類卵卵黄中ではシ了ル酸含有オ リ ゴ糖はホスビチン分子に結合 して存在している ものが知られている [ Sha i nk i n, R. . and Per l man n, G. EC 1971 ) Arch. Bi ochem. B i ophys. 145, 693-700 ] 。
近年数多く の研究により、 シアル酸含有オリ ゴ糖の生物学的意義 が明らかになりつつある。 シアル酸含有オリゴ糖は糖タンパク質に 結合して存在しており、 タンパク質分子の三次構造の保持、 プロテ ァーゼに対する抵抗性の増大、 血中半減期、 分子間相互作用、 龍 度の増大などに関与する。 またガングリオン ドでは細胞間認識、 細 胞分化などに影響を与える構成要素となっており、 種々の細胞毒素 、 神経伝達物質、 ホルモ ン、 イ ン ターフ ヱ ロ ン、 ウィ ルスな どの レ セプターとしての役割もある。 特に、 炎症反応の初期過程において はシァ リ ルルイス - X抗原、 潰瘍の原因となるへリ コパクター . ピ□ リの宿主への感染ゃィ ンフルェンザウィルスの宿主への感染におい てはシアル酸含有ォリゴ糖鎖が重要な役割を果たしているこ となど が知られている。 また、 イ ンフルエンザウイルスに関するシ了ル酸 誘導体の生物学的機能については、 赤血球凝集反応、 去痰効果 （特 開昭 6 1 - 6 8 4 1 8号） 、 感染防御剤 （特開昭 6 3 - 2 8 4 1 3 3号） などが開示されている。
このほかにも母乳中には牛乳の 1 . 5〜 7 . 0倍ものシアル酸が 含まれているこ とが知られており、 乳児の免疫力付加、 脳の機能の 発達、 有用な腸内細菌の増殖促進効果などが示唆されている。 この ような知見に基づいてシアル酸含有オリゴ糖の医薬品及び機能性食 品への応用研究が進められている。
シアル酸含有オリ ゴ糖の工業的規模での生産方法としては鳥類卵 脱脂卵黄より精製する方法が知られている。 これは鳥類卵脱脂卵黄 を直接も しく はその水抽出物を酵素消化し限外ろ過及び逆浸透膜を 用いて調製する方法である （特開平 6 - 2 4 5 7 8 4号公報） 。 こ こで使用される酵素とはプロテアーゼゃ P N G a s e (ペプチ ド一 N— グリ カナーゼ） といった酵素であり、 前者は糖タ ンパク質から 糖ペプチ ドを、 後者は糖タ ンパク質も しく は糖ペプチ ドから N —グ リ コシ ド型糖鎖を遊離させる酵素である。 しかしこれらの酵素を使 つて得られるシアル酸含有オ リ ゴ糖ペプチ ドまたはシアル酸含有ォ リ ゴ糖はモノ シアル型とダイ シアル型の混合物であった。 さ らにシ アル酸含有オ リ ゴ糖ペプチ ドはその還元末端にア ミ ノ酸 5〜 6個か ら成るペプチ ドが存在するために免疫原となる可能性があり、 また P N G a s e は病原性を有する紬菌由来である ものが多く 、 食品へ の応用を困難にしていた。 P N G a s e はアーモ ン ド種子中にも存 在するがアーモ ン ド種子中にはプロテアーゼ、 S — D —ガラ ク ト シ ダーゼ、 8— D — グルコシダーゼ、 α— D —マンノ シダーゼ等が夾 雑酵素と して存在しており、 P N G a s eの大量精製は困難であつ た。 さ らに P N G a s e はホスビチンのような巨大で密に折り畳ま れたタ ンパク分子に結合した糖鎖を遊離させるこ とができないため 応用範囲も限られていた。 発明の開示
したがって本発明の目的は、 シ了ル酸誘導体を有効成分と して含 有する医薬組成物を提供するこ とにある。 さ らに本発明の目的は、 'シアル酸誘導体を工業的規模で安価 · 簡便に製造する方法を提供す - とにめ
そ こで本発明者らは鋭意研究した結果、 ある特定の構造を有する シアル酸誘導体が意外にも顕著に優れた抗ウィ ルス効果、 下痢に対 する効果、 抗潰瘍効果、 抗炎症効果、 抗ア レルギー効果を示すこ と や、 腸内細菌である ビフ ィ ズス菌に対して極めて優れた増殖促進効 果を有するこ とを見い出した。 さ らに、 鳥類卵卵黄を基質と して用 いた場合、 精製した P N G a s eではなくてアーモン ド又は杏種子 そのものを添加するだけで意外にもシアル酸含有ォリ ゴ糖鎖が極め て容易に遊離され、 簡易にかつ高収率に目的物が得られることを見 い出し、 本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明の要旨は、
( a ) 下記の一般式 （ 1 ) 又は （ 2 ) で表される、 シアル酸誘 導体を有効成分とするこ とを特徴とする医薬組成物、
X 1 —Man (ひ 1, 6)
X 2 —Man (ひ 1,3)
Figure imgf000007_0001
(式中、 R 1 は糖残基又は糖ペプチ ド残基を示す。 X 1 及び X 2 は 、 NeuAc (ひ 2, 6)Gal(^S 1, 4)GlcNAc { β 1,2)-, Gal(/S 1, 4)GlcNAc ( yS 1,2)-, 又は GlcNAc ( 1,2)—を示す。 また、 X 1 及び X 2 は同 —であってもよく、 異なっていてもよい。 ただし、 X 1 及び X 2 の いずれか一方は、 少なく とも NeuAc (ひ 2, 6)Gal( S 1, 4)GlcNAc ( β 1, 2) -を示す。 ）
〇
Figure imgf000007_0002
X 3 - ( C H 2 ) η - 0 - ^ - 0 (^ Η 2 ( 2 ) (式中、 R 2 及び R 3 は水素原子、 又は炭素数 1〜 3 0の直鎖、 分 岐鎖、 若しく は環状の飽和又は不飽和のァシル基を示す。 R 2 及び R 3 は同一であってもよく、 異なっていてもよい。 nは 1〜 2 0の 自然数を示す。 X 3 はシアル酸誘導体残基、 又は下記の一般式 （ 3
)
Figure imgf000008_0001
(式中、 X 4 及び X 5 は、 NeuAc (ひ 2.6)Gal( S 1， 4)GlcNAc ( 1, 2) 一、 Gal(/S 1, )GlcNAc (/S I, 2)—、 又は GlcNAc (/S I.2)-を示す。 また、 X 4 及び X 5 は同一であってもよく、 異なっていてもよい。 ただし、 X 4 及び X 5 のいずれか一方は、 少なく とも NeuAc (ひ 2, 6) Gal(j81, 4)GlcNAc ( 1, 2)—を示す。 Yは糖残基を示す。 ） で表さ れるシァリ ルオリ ゴ糖誘導体残基を示す。 ）
( b ) 抗ウィルス剤として用いられる前記 （ a ) 記載の医薬組 成物、
( c ) 下痢治療剤と して用いられる前記 （ a ) 記載の医薬組成 物、 ( d ) 抗潰癌剤として用いられる前記 （ a ) 記載の医薬組成物
( e ) 抗炎症剤として用いられる前記 （ a ) 記載の医薬組成物
( f ) 抗アレルギー剤として用いられる前記 （ a ) 記載の医薬 組成物、
( g ) ビフィ ズス菌増殖促進剤として用いられる前記 （ a ) 記 載の医薬組成物、
( h ) 鳥類卵卵黄にァーモン ドを添加するこ とを特徴とする、 下記一般式 （ 4 ) で表されるシアル酸誘導体の製造方法、
X ' —Man (ひ 1, 6)
X 2 —Man (ひ 1, 3)
Figure imgf000009_0001
(式中、 R 4 は糖残基を示す。 X 1 及び X 2 は、 NeuA ひ 2, 6)Gal( 1, 4)GlcNAc (^ 1,2)—、 Gal ( 1， 4)GlcNAc (^ 1,2)—、 又は GlcN Ac (/S I, 2)—を示す。 また、 X 1 及び X 2 は同一であってもよ く、 異なっていてもよい。 ただし、 X 1 及び X 2 のいずれか一方は、 少 なく とも NeuAc (ひ 2, 6)Gal(/S l， 4)GlcNAc ( 51.2)—を示す。 ）
( i ) アーモ ン ドが脱脂されたものである前記 （ h ) 記載の製 造方法、
( j ) 鳥類卵卵黄に杏種子を添加するこ とを特徴とする、 下記 一般式 （ 4 ) で表されるシアル酸誘導体の製造方法、
X Man (ひ 1, 6)
X 2 一 Man (ひ 1, 3)
Figure imgf000010_0001
(式中、 R 4 は糖残基を示す。 X 1 及び X 2 は、 NeuAc(a 2, 6)Gal( 1, 4)GlcNAc ( 1, 2)—、 GaK^S 1.4)GlcNAc {β 1,2)-. 又は GlcN Ac (yS l,2)—を示す。 また、 X 1 及び X 2 は同一であってもよ く、 異なっていてもよい。 ただし、 X 1 及び X 2 のいずれか一方は、 少 なく とも NeuAc (ひ 2.6)Gal( S 1, 4)GlcNAc (；81, 2)—を示す。 ）
( k ) 杏種子が脱脂されたものである前記 （ j ) 記載の製造方 法、 に関するものである。 図面の簡単な説明
図 1 はシアル酸誘導体 （シァ リ ル リ ン脂質） によるヒ トロタウイ ルスの感染阻害を示す図である。 図 2はシアル酸誘導体 （シァ リ ル リ ン脂質） による 口 夕 ウィルス 性下痢症に対する予防効果を示す図である。
図 3はシアル酸誘導体 （シァリルリ ン脂質） によるロタウィルス 性下痢症に対する治療効果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
o
本発明の医薬組成物は、 下記の一般式 （ 1 ) 又は （ 2 ) で表され るシアル酸誘導体を有効成分とするものである。
X 1 —Man (ひ 1, 6)
Man 一 R 1 ( 1 )
X 2 _ ManCa 1, 3)
Figure imgf000011_0001
C H 2 〇 R 2
H 0 R 3
X 3 - ( C H2 ) n 〇 C H2 ( 2 )
般式 （ 1 ) で表される化合物について
一般式 （ 1 ) において、 R ' は糖残基又は糖ペプチ ド残基を示す 糖残基としては特に限定されないが、 例えば一 GlcNAc ( 31, 4)G1 cNAc、 -GlcNAc, -Gal ( β 1.4)Glc 等が挙げられる。 糖ペプチ ド 残基と しては特に限定されないが、 例えば一 GlcNAc ( S 1, 4)GlcNAc Asn 、 - GlcNAcAsn 、 I leLysValAlaAsp(- GlcNAc) LysThr 、 LysVa lAlaAsp(-GlcNAc)LysT r 等が挙げられる。
X 1 及び X 2 は、 NeuAcCa 2, 6)Gal(;81, 4)GlcNAc ( 1, 2)—、 Ga \ {B 1, 4)GlcNAc (β 1, 2)-. 又は GlcNAc (/S I.2)—を示す。 また、 X 1 及び X 2 は同一であってもよ く、 異なっていてもよい。 ただし 、 X 1 及び X 2 のいずれか一方は、 少な く と も NeuAc (ひ 2， 6)Gal( S 1, 4)GlcNAc (yS l.2)—を示す。 一般式 （ 2 ) で表される化合物について
一般式 （ 2 ) において、 R 2 及び R 3 は水素原子、 又は炭素数 1 〜 3 0、 好ま しく は 1 2〜 2 4 の直鎖、 分岐鎖、 若しく は環状の飽 和又は不飽和のァシル基を示す。 R 2 及び R 3 は同一であってもよ く 、 異なっていてもよい。 炭素数 1 〜 3 0の直鎖、 分岐鎖、 若し く は環状の飽和又は不飽和のァシル基と しては特に限定されないが、 例えばラウロイル基、 ミ リ ス トイル基、 パル ミ トイル基、 ステア口 ィル基、 ォレオイル基、 リ ノ レオイル基、 リ ノ レノ ィル基、 ァラキ ドノ ィル基、 エイ コサペン夕エノ ィル基、 ドコサへキサエノ ィル基 等が挙げられる。 これらのうちでラウロイル基、 ミ リ ス トイル基、 パル ミ トイル基、 ステアロイル基が、 入手が容易であるこ とから好 ま しい。
本明細書において、 一般式 （ 2 ) 中の 一 （ C H 2 ) n - をスぺ一サ一という。 このスぺ一サ一中の nは 1 〜 2 0 の自然数を 示す。 好ま しく は 4〜 1 6であり、 より好ま しく は 6〜 1 2であり 、 特に好ま しく は 8〜 1 0である。 X 3 で表されるシアル酸誘導体 残基又はシァ リ ルォ リ ゴ糖誘導体残基の膜への埋没を防ぐ観点から n は 1 以上が好ま しく、 可撓性の観点から 2 0以下が好ま しい。
X 3 はシアル酸誘導体残基、 又は下記の一般式 （ 3 )
Figure imgf000013_0001
(式中、 X 4 及び X 5 は、 NeuAc (ひ 2， 6)Gal(/S l, 4)GlcNAc ( β \, 2) 一、 GaK S I.4)GlcNAc ( S l， 2)—、 又は GlcNAc ( S 1.2)—を示す。 また、 X 4 及び X 5 は同一であってもよ く、 異なっていてもよい。 ただし、 X 4 及び X 5 のいずれか一方は、 少な く と も NeuAc (ひ 2, 6) Gal(/S 1, 4)GlcNAc (/S I, 2)—を示す。 Yは糖残基を示す。 ） で表さ れる シァ リ ルオ リ ゴ糖誘導体残基を示す。
こ こでいぅ シアル酸誘導体残基とは特に限定される ものではない か、 例えば以下の化合物由来のものが挙げられる。
3 ' 一 シァ リ ノレラ ク ト 一ス、 6 ' — シァ リ ルラ ク ト 一ス、 シァ リ ルルイス X、 N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸、 〇 一了セチルメ イ ラ ミ ン 酸、 N— グリ コ リ ルノ ィ ラ ミ ン酸、 0— グリ コ リ ルノ ィ ラ ミ ン酸、 及び 3 —デォキシノ ヌ ロソ ン酸、 並びにこれらのアルキルエステル 化物、 0 -ァシル化物、 〇 一アルキル化物、 デォキシ化物、 チォグ リ コ シ ド、 及びラ ク ト ン体等である。 これらのう ち、 好ま し く は 3 ' — シァ リ ルラ ク ト一ス、 6 ' —シァ リ ルラ ク トース、 及び N—ァ セチルノ イラ ミ ン酸、 並びにこれらのアルキルエステル化物、 0— ァシル化物、 〇一アルキル化物、 及びデォキシ化物であり、 さ らに 好ま しく は N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸である。
一般式 （ 3 ) において、 Yは糖残基を示す。 糖残基と しては特に 限定されないが、 例えば一 GlcNAc { β 1, 4)GlcNAc- . — GlcNAc -、 -GaK^ l, 4)Glc 一等が挙げられる。
従って、 一般式 （ 3 ) で表されるシァ リ ルオ リ ゴ槌誘導体残基の 具体例と しては、 例えば以下のよ うなものが挙げられる。
Gal /31-4 GlcNAc/31-2Man l-6
： Man 31-4 GlcNAc 3 l-4GlcNAc
NeuAc a 2- 6Ga l Sl-4 Gl cNAc β l-2Man a 1-3
GlcNAc^l-2Man l-6
； Man /31-4 GlcNAc^l- 4GlcNAc
NeuAc 2-6Gal β 1-4 GlcNAc β l-2Man a 1-3
NeuAc 2 - 6Gal /31- 4 ClcNAc^l-2Man 1-6
Man /31-4 GlcNAc^l-4GlcNAc
Gal 31-4 GlcNAc Sl-2Man 1-3
NeuAc a 2-6Ga 1/31-4 Gl cNAc β 1- 2Man a 1-6
： Man/31-4 GlcNAc ^ l-4GlcNAc
NeuAc a 2-6Ga 1/91-4 Gl cNAc β l-2Man a 1-3 次に、 一般式 （ 1 ) 、 （ 2 ) で表されるシアル酸誘導体の製造方 法について説明する。
一般式 （ 1 ) で表されるシアル酸誘導体は、 例えぱ一股式 （ 1 ) を満たす糖鎖構造を有する糖タンパク質を、 常法に従ってブロナ一 ゼ消化や P N G a s e消化するこ とにより得ることができ、 又は鳥 類卵卵黄を用いる本発明の方法等により得ることができる。
鳥類卵卵黄を用いる本発明のシアル酸誘導体の製造方法について より具体的に説明する。
本発明に用いられる鳥類卵卵黄とは、 鳥類の卵の卵黄であればその 起源については特に限定されるものではないが、 ニヮ ト リ、 ゥズラ 、 ァヒル、 カモなどの卵黄が好ましい。 また、 原料として用いる際 は、 液状、 粉末のいずれでもよい。 また、 鳥類卵卵黄を有機溶媒抽 出 （メタノール、 エタノール、 ジェチルエーテル等） するこ とによ り脱脂した後の残渣 （脱脂卵黄） を原料として用いてもよい。
本発明に用いられるアーモ ン ド及び杏種子は、 精製酵素にするこ となく、 そのままで、 あるいは処理をしても含有酵素が失活するよ うな加熱等の処理をしていないものであれば特に限定されるもので はなく、 そしてその形態は粉末であってもよくペース ト等であって もよい。 本発明においては、 中でも脱脂されたアーモ ン ド、 脱脂さ れた杏種子が好ま しい。 脱脂されたァーモ ン ド及び脱脂された杏種 子とは、 生アーモ ン ド及び生杏種子を例えば有機溶媒抽出 （ァセ ト ン、 ジェチルエーテル等） するこ とにより脱脂したものを指し、 精 製酵素にしたものではない。 脱脂の程度は脂質含有率が 2 5 %以下 であるものが好ま しく、 より好ま しく は 5 %以下のものである。 本 発明においては、 このような脱脂アーモン ド又は脱脂杏種子そのも のを粉末やペース ト等にしたものがより好ま しく 用いられる。 尚、 従来法のように精製酵素を用いると、 モノ ンアル型とダイ シアル型 がほぼ同量の混合物が得られるが、 本発明においては、 意外にもご く 少量のモノ シアル型と多量のダイ シアル型が得られるため、 モノ シアル型とダイ シアル型の分離を容易に行う こ とができるという大 きな利点がある。
以下、 上記の鳥類卵卵黄及びアーモ ン ド等を用いる本発明の製造 方法の具体的な操作の 1例について説明する。
鳥類卵脱脂卵黄に水も しく は塩溶液 （力 リ ゥム塩、 ナ ト リ ウム塩 も し く は p H 5〜 l 0の領域内に緩衝能を持つ塩の溶液） を加え、 4〜 8 0 °C、 好ま し く は 4〜 4 0 °Cで 1 0分間〜 3 日間攪拌した後 、 ろ過を行い不溶性タ ンパク質を分別する。 得られる抽出ろ液 1 リ ッ トルに対し、 脱脂アーモ ン ド粉末も しく は脱脂杏種子粉末を 0. 5〜 2 0 g加え、 p H 5. 0〜 5. 5、 3 0〜 4 5てで 8〜 2 4時 間攪拌する。 この溶液をろ過してから陰イオン交換樹脂に吸着させ 、 水洗後 0〜 0. 3 Mの N a C 1水溶液でグラジェン ト溶出する。 得られる溶出液を逆浸透膜 （R O膜） を用いて脱塩 · 濃縮した後、 凍結乾燥する こ とにより シアル酸誘導体を得る。
こ こで用いられる陰イ オ ン交換樹脂は、 例えば D0WEX (ダウケ ミ カル製） 、 SEPABEADS (三菱化学製） 、 AMBERUTE (ローム ' ア ン ド . ハース製） 等の製品が挙げられる。 これらの製品のタイプにつ いては特に限定される ものではないか、 強塩基性型のものが好ま し レ
このようにして得られるシアル酸誘導体は一股式 （ 4 ) に表され る ものであり、 R4 が糖残基であって糖ペプチ ド残基とならない点 を除けば一般式 （ 1 ) と同様のものである。
Figure imgf000017_0001
(式中、 R 4 は糖残基を示す。 X 1 及び X 2 は、 NeuAc (ひ 2, 6)GaK β 1.4)GlcNAc (；81,2)-、 GaK^ 1.4)GlcNAc ( 31,2)—、 又は GlcN Ac ( 1.2)—を示す。 また、 X 1 及び X 2 は同一であってもよ く 、 異なっていてもよい。 ただし、 X 1 及び X 2 のいずれか一方は、 少 な く とも NeuAc (ひ 2, 6)Gal( S 1.4)GlcNAc (；51,2)-を示す。 ）
この製造方法は一般式 （ 4 ) で表されるシアル酸誘導体を従来よ り安価かつ簡便に製造でき、 しかも得られるシアル酸誘導体は本発 明の医薬組成物及びその原料に用いるこ とができるため、 工業上極 めて有利である。
次に、 一般式 （ 2 ) で表されるシアル酸誘導体の製造方法につい て説明する。 当該シアル酸誘導体は、 例えば、 糖成分、 リ ン脂質及 びスぺーサ一の原料となる化合物を原料と して、 化学合成反応とホ スホ リパーゼ D (以下 P L Dと表記する。 ） を用いる酵素合成反応 を組み合わせる こ とにより調製するこ とができる。
こ こでいう糖成分とは、 X 3 で示される、 前記に列挙したような シアル酸誘導体残基又はシァ リ ルオリ ゴ糖誘導体残基をその構造中 に有する化合物である。
リ ン脂質は水素原子又は前記のァシル基、 即ち、 R 2 及び R 3 の 説明の箇所で記載したァシル基をもつリ ン脂質であればよい。 具体 的には前記のァシル基をもつホスフ ァチジルコ リ ン、 ホスフ ァチジ 第 1 の方法は、 糖成分にスぺ一サーを結合させたものを、 P L D を用いるエステル交換反応により、 リ ン脂質の極性基部分と転移さ せる方法である。
まず、 糖成分に酸性条件下でメ タノ ールを作用させてメチル化物 と し、 これに塩化ァセチル中で塩化水素を作用させて水酸基すベて をァセチル化し、 糖成分の還元末端の糖残基の 2位の水素原子を塩 素原子に置換したパーァセチルー 2 — ク ロ口誘導体を得る。 これに モレキュラーシーブ、 A g 2 C 0 a 存在下、 アルキルジオールのモ ノエステルを作用させ、 パーァセチル— 2 — 0—アルキル誘導体を 得る。 これを塩基性条件下で脱ァセチル化し、 糖成分の 0 -アルキ ル化物を得る。 これを適当な p H ( 4. 0〜 8. 0 ) の緩衝液に溶 解し、 カルシウム塩を加える。 これに P L Dまたは P L Dを有する 菌体を加え、 さ らにあらかじめ有機溶媒に溶解しておいたリ ン脂質 を加えて攪拌し、 数時間〜数十時間酵素反応を行う。
その結果、 リ ン脂質の極性基部分と糖成分の 0 -アルキル化物が エステル交換されたものが得られる。 これをアル力 リ 金属の水酸化 物で処理するこ とによ り脱メチル化した後精製してシアル酸誘導体 を得る。
この方法における P L Dによる酵素反応の条件は例えば次の通り である。 まず反応液の p Hについては、 通常 p H 4. 0〜 8. 0で あり、 好ま し く は p H 5. 6〜 7. 0である。 使用される P L Dの 至適 p Hよ り ± 0. 5の範囲内に調整するのが好ま しい。 その範囲 外の p Hでは反応率が低下する。 また、 使用する P L Dの量は通常 リ ン脂質 1 gあたり 1 0〜 1 0 0ユニッ ト、 好ま し く はリ ン脂質 1 gあたり 2 0〜 5 0ュニッ トである。 反応を充分に進める観点から 1 0ュニッ ト以上が好ま しく 、 反応の効率の観点から 1 0 0ュニッ ト以下が好ま しい。 反応温度は通常 1 5〜 5 0 °C、 好ま しく は 2 5 〜 3 0てである。 反応時間については通常 0 . 5〜 1 2時間、 好ま しく は 1 〜 6時間である。 反応を充分に進める観点から 0 . 5時間 以上が好ま しく 、 反応効率及び副反応を抑える観点から 1 2時間以 下が好ま しい。
また、 さ らに P L Dの酵素活性を向上させるためにカルシウム塩 を加えればよ り好ま しいが、 他のイオンの塩を加えてもよい。 例と してはカルシウムイオンやバ リ ウムイオンなどの 2価の典型元素ィ オ ン、 マ ンガン、 ラ ン タ ン、 セ リ ウムな どの遷移元素イオ ンのハロ ゲン化物や炭酸塩、 リ ン酸塩、 酢酸塩などが挙げられる。 添加量と しては反応液に対して 1 O m M〜 l M、 好ま しく は 1 O m lV！〜 0 . 5 Mである。 所望の効果を得る観点から 1 0 m M以上が好ま し く 、 反応効率の観点から 1 M以下が好ま しい。
反応系と しては、 水系、 水相と有機溶媒相との 2相系、 有機溶媒 系のいずれでもよいが、 撺成分は水溶性である こ とが多く 、 リ ン脂 質は油溶性であるこ とから水相と有機溶媒相との 2相系が好ま しい リ ン脂質を溶解するために使用する有機溶媒と しては、 例えば融 点 4 0 °C以下のカルボン酸のアルキルエステル、 アルキルエーテル 、 脂肪族炭化水素、 脂環式炭化水素、 芳香族炭化水素及びハロゲン 化炭化水素からなる群より選ばれる 1 種以上のものが使用できる。 カルボン酸のアルキルエステルの例と しては、 炭素数 2〜 6 の直 鎖または分岐鎖脂肪酸と炭素数 8以下の直鎖または分岐鎖のアルコ —ルとのエステルが挙げられ、 酢酸メチ儿、 酢酸ェチル、 吉草酸メ チル、 プロ ピオン酸メチル、 酪酸メチル、 カブロ ン酸メチルなどを 用いるこ とができるが、 なかでも酢酸メチルが好ま しい。 アルキル エーテルと しては炭素数 2 〜 6 の直鎖または分岐鎖のアルキルエー テルが挙げられ、 ジメチルエーテル、 ジェチルエーテル、 ェチルメ チルエーテル、 イ ソプロ ピルエーテルなどを用いるこ とができるが 、 なかでもジェチルエーテルが好ま しい。 脂肪族炭化水素と しては 、 炭素数 6 〜 1 2の直鎖または分岐脂肪族炭化水素が挙げられ、 な かでもへキサン、 ヘプタ ン、 石油エーテルが好ま しい。 脂環式炭化 水素と しては、 置換基を有するか、 または有しない炭素数 6 〜 1 2 の脂環式炭化水素が挙げられ、 なかでもシクロへキサン、 メチルシ ク ロへキサン、 シク ロオクタ ンが好ま しい。 芳香族炭化水素と して は置換基を有するか、 または有しない炭素数 6 〜 1 2の芳香族炭化 水素が挙げられ、 なかでもベンゼン、 トルエン、 キンレンが好ま し い。 また、 ハロゲン化炭化水素と しては、 炭素数 8以下の直鎖また は分岐アルカ ンの塩化物、 臭化物、 ヨウ化物が挙げられるが、 なか でも ク ロ口ホルム、 四塩化炭素、 塩化メチレ ン等のク ロル化物が好 ま しい。
また、 脱メチル化反応において使用するアルカ リ金属の水酸化物 と しては水酸化ナ ト リ ゥム、 水酸化力 リ ゥ厶などが挙げられる。 脱 メチル化反応は、 通常氷冷下で行い、 反応時間は約 3 0分〜 1 日で ある。 反応物を抽出、 クロマ ト グラフ ィ ー、 再結晶など通常の精製 方法に供すこ とによ り、 シアル酸誘導体を得るこ とができる。
また、 第 2の方法は、 P L Dによるエステル交換反応によって リ ン脂質にスぺーサーを結合させ、 次いで糖成分にグリ コンル結合さ せる方法である。
即ち、 リ ン脂質とアルキルジオールを有機溶媒中で混合し、 これ に適当な p Hの緩衝液を加えてカルシウム塩を溶解させる。 これに P L Dまたは P L Dを有する菌体を加えて攪拌し、 数時間〜数十時 間酵素反応を行う。 その結果、 リ ン脂質の極性基部分とアルキルジ オールとがエステル交換した中間体を得る。 この中間体と、 上記の 方法で合成した糖成分のパーァセチルー 2 — クロ口誘導体のベンジ ルエステルとを活性化剤の存在下、 0 eC以下の低温条件でグリ コシ ル化するこ とにより所望のシアル酸誘導体のァセチル化物を得る。 次に、 このァセチル化物をアルカ リ金属の水酸化物で処理して脱ァ セチル化し、 これを触媒存在下で水素添加するこ とにより脱べンジ ル化し、 シアル酸誘導体を得る。
グリ コシル化反応において使用する活性化剤と しては、 ト リ メチ ルシ リ ル ト リ フラー ト、 銀 ト リ フラー トなどが挙げられるが、 好ま し く は銀 ト リ フラー トである。 添加量と しては 0 . 1 〜 1 0当量で あり、 好ま し く は 0 . 1 〜 5 当量である。 反応を充分に進める観点 から 0 . 1 当量以上が好ま しく 、 反応効率の観点から 1 0 当量以下 が好ま しい。
本発明に用いられるシアル酸誘導体の楗鎖構造は、 H P L CゃN M Rを用いる公知の方法で確認するこ とができる。
このようにして得られるシアル酸誘導体を適当な溶剤や基剤を用 いて液剤、 錠剤、 顆粒剤などに調剤するこ とにより、 本発明の医薬 組成物を得るこ とができる。
本発明の医薬組成物は、 と りわけ抗ウィ ルス剤、 下痢治療剤、 抗 潰瘍剤、 抗炎症剤、 抗ア レルギー剤と して、 またビフ ィ ズス菌増殖 促進剤と して好適に用いられる。 抗ウィ ルス剤と して用いる場合、 その対象とな る ウ ィ ルスは特に限定されないが、 特にイ ンフルェ ン ザゥイ ノレス、 ロ タ ウィ ルス、 ニュ ーカ ッ スル病ウィ ルス、 ヘルぺス ウィ ルス等に好適に用いられる。 下痢治療剤と して用いる場合、 非 感染性の下痢症またロタウィルス、 サルモネラ菌等による感染性の 下痢症のいずれに対しても好適に用いられる。 抗潰瘍剤と しては、 特にへリ コバタ ター · ピロ リが原因の潰瘍に対して好適に用いられ る。 抗炎症剤と しては、 リ ューマチ、 喘息等に対して好適に用いら れる。 抗ア レルギー剤と してはア レルギー性募炎、 花粉症等に対し て好適に用いられる。
本発明の医薬組成物は、 一般式 （ 1 ) 又は （ 2 ) で表されるシァ ル酸誘導体一成分を単 ί虫で用いても良く 、 二成分以上の混合物で用 いても良い。
本発明の医薬組成物の用量は、 年齢、 性別、 体重、 症状等によつ て異なるが、 抗ウィルス剤と して用いる場合、 体重 1 k gあたり 1 . 0〜 3 0 O gである。 下痢治療剤と して用いる場合、 体重 1 k gあたり 0. 5〜 1 O m gである。 抗潰瘪剤と して用いる場合、 体 重 1 k gあたり 1 . 0〜 2 0 0 0 gである。 抗炎症剤と して用い る場合、 体重 1 k gあたり し 0〜 1 0 0 gである。 抗ア レルギ 一剤と して用いる場合、 体重 1 k gあたり し 0〜 3 0 O ^ gであ る。 ビフ ィ ズス菌増殖促進剤と して用いる場合、 体重 l k gあたり 1 0 0〜 1 0 0 0 m gである。 ' 以下、 製造例、 実施例及び試験例によ り本発明をさ らに詳しく 説 明するが、 本発明はこれらの実施例等により何ら限定される もので はない。 製造例 1 N—ァセチルノ イラ ミニルリ ン脂質の調製
N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸 3 gをメ タ ノ ール 3 0 O m Lに溶解し 、 D 0 w e X - 5 0 (H+ ) (ダウケ ミ カル製） 3 gを加えて、 室 温で 4時間攪拌した。 反応終了後、 反応液をろ過して D 0 w e X - 5 0を除去した。 ろ液のメ タノ ール溶液を 1 5 m Lに濃縮し、 一 2 0 °Cに冷却した。 同温度でこれにジェチルエーテル 6 m Lを添加し 、 再結晶するこ とにより N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸のメチル化物 2 . 4 7 gを得た。
得られたメチル化物に一 2 0 °Cで塩化ァセチル 2 5 g、 無水醉酸 3 gを加えた。 次いで乾燥した塩化水素ガスを飽和させ、 室温で 2 0時間攪拌した。 反応液の溶媒を留去し、 ベンゼン、 トルエンを用 いて完全に脱水した。 次いでこのものをジクロロ メ タ ン、 ジェチル エーテル、 へキサンの等量混合物により再結晶し、 ァセチル化物 3 gを得た。
ァセチル化物を— 2 0 °C下で、 6 gのモレキュラーシーブ 4 A、 5 gの A g 2 C 03 、 3 gの 1 , 8 —オクタ ンジオールモノ メチル エステルを添加したジクロロ メ タ ン 6 O m Lに溶解し、 室温で 3時 間攪拌してグリ コシル化反応を行った。 反応液をセライ ト ろ過した のち、 溶媒を留去した。 次いでシ リ カゲルカラムク ロマ ト グラフ ィ - ( C H 2 C 1 2 ： M e 0 H = 9 8 ： 2 ) で精製し、 グリ コシル化 物 1 . 9 gを得た （ R f = 0. 6 3 S i l i c a g e 1 /C H
2 C 1 2 ： M e O H = 1 5 : l ) 。
グリ コ シル化物 1 . 9 gを氷冷下で、 完全に脱水したメ タノ ール
3 0 m Lに溶解した。 氷冷下でカ リ ウム 3 0 0 m gを完全に脱水し たメ タ ノ ールに加えてカ リ ウムメ トキシ ドと し、 これを先に調製し ておいたグリ コシル化物のメ タノ ール溶液に加えた。 0でで 3時間 攪拌して反応を行ったのち、 一 2 0 °Cで反応液に D o w e X - 5 0
( H + ) を加えた。 反応液をろ過して D o w e x— 5 0を除去した のち、 ろ液のメ タノ ールを留去し、 シ リ カゲルカラムクロマ ト ダラ フ ィ ー （ C H C 1 3 ： M e 0 H = 5 ： 1 ) で精製するこ とによって 脱ァセチル化物 0. 9 gを得た （ R f = 0. 2 5 S i l i c a g e 1 /C H C 1 3 : M e 〇 H = 5 : l ) 。
脱ァセチル化物をジェチルエーテル 1 2 0 m L、 水 2 4 m Lの混 合溶媒中で 0. 4 M酢酸カルシウム 6 m L、 P L D (旭化成製） 1 0 0ュニッ ト存在下、 ジパル ミ トイルホスフ ァチジルコ リ ン 3 g と 3 0 °Cで 6時間攪拌して粗生成物を得た。 このものをシ リ カゲルク 口マ ト グラフィ ー （ C H C 1 3 ： M e 0 H = 9 ： 1 ) で精製するこ とにより中間体 0. 3 gを得た。
得られた中間体 0. 3 gをT H F 1 0 m L、 H 2 O 5 m Lの混合 溶媒に溶解し、 氷冷下で 1 N - N a 〇 H 0. 3 m Lを加えて 1 時間 攪拌した。 反応液に D o w e x - 5 0 (H+ ) を加えて中和 （ p H 8 ) したのち、 ろ過により D o w e x — 5 0 を除去した。 ろ液を濃 縮してカラムク ロマ トグラフ ィ ー （ O D S /H 2 〇、 M e 0 H) で 精製する こ とによ り 目的のシアル酸誘導体、 すなわち、 一般式 （ 2 ) において X 3 が N—ァセチルノ イラ ミ ン酸残基であり、 R 2 、 R 3 がと もにパル ミ トイル基であり、 nが 8 であるシ了 リ ル リ ン脂質 9. 6 m gを得た。
このシァ リ ルリ ン脂質を T L C分析したところ単一のスポッ トを 示し、 D i t mm e r試薬、 レゾルシノ ール試薬の両方に呈色反応 を示した。 また、 その機器分析値は次の通りであった。 1 H - NM R ( C D 3 0 D , 4 0 0 MH z ) 6 0. 8 9 6 ( 6 H, t , J = 6 . 9 Η ζ ) 、 δ 1 . 3 2 7 ( 5 6 H, m) 、 δ 1 . 5 2 5 ( 4 H, m) 、 δ 1 . 6 1 6 ( 4 H, m) 、 δ 1 . 7 2 9 ( 1 H, t， J = 1 2. 4 H z ) 、 <5 1 . 9 9 7 ( 3 H, s ) 、 <5 2. 3 1 0 ( 2 H , t , J = 7. 4 H z ) 、 （5 2. 3 2 6 ( 2 H, t , J = 7. 4 H z ) . 6 2 . 6 7 4 ( 1 H, d d， J = 1 3. 2 , 4. 7 H z ) 、 δ 3. 9 9 7 ( 2 H, t , J = 6. 0 H z ) , δ A . 1 4 1 ( 1 H , d d , J = 1 2. 1 , 7. 1 H z ) , 5 4. 4 3 6 ( 1 H, d d ， J = 1 2. 1 , 3. 3 H z ) , δ 5. 2 4 7 ( 1 H, m) 。 分子 量 1 0 6 7。 以下このシアル酸誘導体をシァ リ ルリ ン脂質 1 とする
製造例 2 N—ァセチルノ イ ラ ミニルリ ン脂質の調製
1 , 8 —オ ク タ ン ジオール 4 . 3 9 gをク ロ 口ホルム 2 0 0 m L に溶解し、 大豆水添ホスフ ァチジルコ リ ン （太陽化学製） 7. 9 0 gを加えた。 これに酢酸緩衝液 （ p H 5. 6 ) 3 0 m Lおよび 0. 4 M酢酸カルシウム水溶液 3 m Lを添加し、 さ らに P L D 3 7 0 ュ ニッ トを前記緩衝液に溶解したものを徐々 に添加し、 3 0〜 3 5 °C で 5 0時間攪拌し、 反応させた。 反応終了後、 有機溶媒を留去し、 シ リ カゲルカ ラム ク ロマ ト グラ フ ィ ー （A c O E t ： C H C 】 3 = 3 ： 1 ) で精製し、 ホスフ ァチジルォクタノ ール 5 . 6 5 gを得た 製造例 1 に記載の方法で合成した N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸のパ 一ァセチルー 2 — ク ロ口誘導体のベン ジルエステル 2. 3 4 g とホ スフ ァ チジルォ ク タ ノ ール 3. 3 3 gをク ロ 口ホルム 2 0 O m Lに 溶解し、 リ ン酸水素ニナ ト リ ウム 1 . 1 4 gおよびモ レキュ ラ ー シ ーブ 4 A 2. 3 4 gを加えた。 これを一 5 0〜一 4 0 °Cに冷却し 、 ト リ フルォロ メ 夕 ンスルホ ン酸銀 に 0 3 gを トルエン 1 5 in L に溶解したものを滴下した。 その後、 徐々 に室温まで昇温させなが ら 1 時間攪拌して反応させた。 反応液をセライ トろ過して不溶物を 除去し、 ろ液を得た。 このろ液の有機溶媒を留去したのちシ リ カゲ ルカ ラム ク ロマ ト グラ フ ィ ー （ C H C 1 3 ： e 0 H = 2 0 ： 1 〜 1 ： 1 ) で精製し、 シァ リ ル リ ン脂質ァセチル化誘導体のメ チル化 物 9 0 O m gを得た。
シァ リ ルリ ン脂質のァセチル化物 2 3 4 m gをメタノ ール 7 0 m Lに溶解した。 このものに、 氷冷下、 カ リ ウムメ トキシ ドの 3 0 % メ タノ ール溶液 （M e O K 4 2 m g /M e 0 H 1 0 O m g ) をゆつ く り滴下した。 反応終了後、 D o w e x— 5 0 (H+ ) を加えて中 和したのち、 ろ過によって D o w e x— 5 0を除去した。 ろ液の有 機溶媒を留去したのち、 シリ カゲルカラムク ロマ ト グラフ ィ ー （ C H C 1 3 ： M e 0 H = 2 ： 1 ) で精製し、 シァ リ ルリ ン脂質のメチ ル化物 1 1 1 m gを得た。 シァ リ ルリ ン脂質のメチル化物 1 0 0 m gをエタ ノ ール 3 O m L とク ロ口ホルム 1 O m Lの混合溶媒に溶解 し、 1 0 %パラ ジゥム活性炭素 2 O m gを加え、 超音波で充分に分 散させた。 これに 0. 0 1 N塩酸 3滴を滴下し、 常圧下で攪拌しな がら 2 4時間水素添加反応を行った。 反応終了後、 減圧にして水素 を除去し、 窒素で置換した。 その後セライ トろ過によってパラジゥ ム炭素を除去し、 ろ液を得た。 ろ液の有機溶媒を留去したのち分取 T L C ( C H C 1 3 : M e O H : H 2 〇 = 7 0 : 3 0 : 5 ) で精製 し、 目的のシアル酸誘導体、 すなわち、 一般式 （ 2 ) において、 X 3 が N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸残基であり、 R 2 、 R 3 が大豆水添 ホスフ ァチジルコ リ ンのァシル基であり、 nが 8であるシァ リ ノレリ ン脂質 4 3. 2 m gを得た。 以下、 このシアル酸誘導体をシァ リ ル リ ン脂質 2 とする。 製造例 3 1 ー メ トキシカルボ二ルー N—ァセチルノ イラ ミ ニル リ ン脂質の調製
N—了セチルノ イ ラ ミ ン酸 3 gをメ タノ ール 3 0 O m Lに溶解し 、 D o w e x - 5 0 (H+ ) 3 gを加えて、 室温で 4時間攪拌した 。 反応終了後、 反応液をろ過して D o w e x— 5 0を除去した。 ろ 液のメ タノ ール溶液を 1 5 m Lに濃縮し、 一 2 0 °Cでジェチルエー テル 6 m Lを添加し、 再結晶するこ とにより N—ァセチルノ イラ ミ ン酸のメチル化物 2. 4 7 gを得た。
得られたメチル化物に一 2 0 °Cで塩化ァセチル 2 5 g、 無水酢酸 3 gを加えた。 このものに乾燥した塩化水素ガスを飽和させ、 室温 で 2 0時間攪拌した。 反応液の溶媒を留去し、 ベンゼン、 トルエン を用いて完全に脱水した。 次いでジク ロロ メ タ ン、 ジェチルエーテ ル、 へキサンの等量混合物により再結晶し、 ァセチル化物 3 gを得 た。
ァセチル化物を一 2 0 eC下で、 モレキュラーシーブ 4 A 6 g、 A g 2 C 0 a 5 g、 1 , 8 —オクタ ンジオールモノ メチルエステル 3 gを添加したジクロロ メ タ ン 6 O m Lに溶解し、 室温で 3時間攪 拌してグリ コシル化反応を行った。 反応液をセライ 卜ろ過したのち 、 ろ液の溶媒を留去した。 このものをシ リ カゲルカラムクロマ ト グ ラフ ィ ー （ C H 2 C 1 2 ： M e O H= 9 8 ： 2 ) で精製し、 グリ コ シル化物 1 . 9 gを得た （ R f = 0. 6 3 S i l i c a g e l / C H 2 C 1 2 ： M e O H = 1 5 : l ) 。
グリ コシル化物 1 . 9 gを氷冷下で、 完全に脱水したメ タノ ール
3 0 m Lに溶解した。 氷冷下でカ リ ウム 3 0 0 m gを完全に脱水し たメ タノ ールに加えてカ リ ウムメ トキシ ドと し、 これを先に調製し ておいたグリ コシル化物のメ タ ノ ール溶液に加えた。 0 °Cで 3時間 攪拌して反応を行ったのち、 一 2 0 °Cで反応液に D o w e x— 5 0
(H + ) を加えた。 反応液をろ過して D o w e x— 5 0を除去し、 ろ液のメ タノ ールを留去した。 次いでシ リ カゲルカラムク ロマ ト グ ラフ ィ 一 （ C H C 1 3 ： M e 0 H = 5 ： 1 ) で精製するこ とによつ て脱ァセチル化物 0. 9 gを得た （R f = 0. 2 5 S i l i c a g e 1 /C H C 1 3 ： M e O H= 5 : 1 ) 。
脱ァセチル化物をジェチルエーテル 1 2 0 m L、 水 2 4 m Lの混 合溶媒中で 0. 4 M酢酸カルシウム 6 m L、 P L D 1 0 0ユニッ ト 存在下、 ジパル ミ トイルホスフ ァチジルコ リ ン 3 gと 3 0 °Cで 6時 間反応させ、 粗生成物を得た。 これをシリ カゲルク ロマ ト グラフ ィ 一 ( C H C 1 3 ： M e 0 H = 9 ： 1 ) で精製するこ とにより 目的の シアル酸誘導体、 すなわち、 一般式 （ 2 ) において、 X 3 が 1 ー メ トキシカルボ二ルー N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸残基であり、 R 2 、 R 3 がと もにパル ミ トイル基であり、 nが 8であるシァ リ ルリ ン脂 質 0. 3 gを得た。 以下、 このシアル酸誘導体をシァ リ ルリ ン脂質
3 とする。 製造例 4 9 一〇ーァセチルノ イラ ミ ニルリ ン脂質の調製
1 , 3 —プロノ、0ンジオール 4 0 0 m g、 ジステアロイルホスフ ァ チジルコ リ ン （フナコシ製） 7 9 0 m g、 既知の方法により合成し た 9 一〇ーァセチルノ イ ラ ミ ン酸 4 2 O m gを原料と して用いた。 これらの原料を製造例 2 と同様の方法で処理して目的のシアル酸誘 導体、 即ち、 一般式 （ 2 ) において、 X 3 が 9 一〇 -ァセチルノ ィ ラ ミ ン酸残基であり、 R 2 、 R 3 がと もにステアロイル基であり、 nが 3であるシァ リ ルリ ン脂質 4. 5 m gを得た。 以下、 このシァ ル酸誘導体をシァ リ ル リ ン脂質 4 とする。 製造例 5 4 —〇ーァセチルノ イ ラ ミニルリ ン脂質の調製
1 ， 4 一ブタ ンジオール 4 2 0 m g、 ジ ミ リ ス トイルホスフ ァチ ジルコ リ ン （フナコシ製） 7 6 5 m g、 既知の方法により合成した 4 一 0—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸 4 2 0 m gを原料と して用いた。 こ れらの原料を製造例 2 と同様の方法で処理して目的のシアル酸誘導 体、 即ち、 一般式 （ 2 ) において、 X 3 が 4 一 0—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸残基であり、 R 2 、 R 3 がともに ミ リ ス トイル基であり、 n が 4 である シァ リ ル リ ン脂質 4 . 7 m gを得た。 以下、 このシアル 酸誘導体をシァ リ ルリ ン脂質 5 とする。 製造例 6 3 ' ー シァ リ ルラ ク ト シルリ ン脂質の調製
1 , 6 —へキサ ン ジオール 2 4 0 m g、 ステアロイ ル リ ゾホス フ ァ チジルコ リ ン （フナコ シ製） 4 0 0 m g、 3 ' ー シァ リ ルラ ク ト ース 2 0 O m gを原料と して用いた。 これらの原料を製造例 2 と同 様の方法で処理して目的のシアル酸誘導体、 即ち、 一般式 （ 2 ) に おいて、 X 3 が 3 ' — シァ リ ルラ ク トース残基であり、 R 2 がステ ァロイル基であり、 R 3 か水素原子であり、 nが 6であるシァ リ ル リ ン脂質 2. 2 m gを得た。 以下、 このシアル酸誘導体をシァ リ ル リ ン脂質 6 とする。 製造例 7 6 ' ーシァ リ ルラ ク ト シルリ ン脂質の調製
1 ， 1 0 —デカ ン ジオール 2 8 0 m g、 ジ リ ノ レ ノ ィ ルホス フ ァ チジルコ リ ン （フナコ シ製） 4 0 0 m g、 6 ' 一 シ了 リ ノレラ タ ト ー ス 2 0 O m gを原料と して用いた。 これらの原料を製造例 2 と同様 の方法で処理して目的のシアル酸誘導体、 即ち、 一般式 （ 2 ) にお いて、 X 3 が 6 ' — シァ リ ルラ ク ト 一ス残基であ り、 R 2 、 R 3 が と もに リ ノ レノ ィル基であり、 n力 1 0であるシァ リ ルリ ン脂質 2 . 1 m gを得た。 以下、 このシアル酸誘導体をシァ リ ルリ ン脂質 7 とする。 製造例 8 N—ァセチルノ イラ ミニルリ ン脂質の調製
1 , 8 —オクタ ンジオール 2 3 0 m g、 ジァラキ ドノ ィルレンチ ン （フナコシ製） 2 5 0 m g、 N—ァセチルノ イラ ミ ン酸 2 0 0 m gを原料と して用いた。 これらの原料を製造例 2 と同様の方法で処 理して目的のシアル酸誘導体、 即ち、 一般式 （ 2 ) において、 X 3 が N—ァセチルノ イラ ミ ン酸残基であり、 R 2 、 R 3 がともにァラ キ ドノ ィル基であり、 nが 8であるシァ リ ルリ ン脂質 2. 5 m gを 得た。 以下、 このシアル酸誘導体をシァ リ ルリ ン脂質 8 とする。 製造例 9 N—ァセチルノ イラ ミ ニルリ ン脂質の調製
1 , 8 —オクタ ンジオール 4 4 0 m g、 1 —パルミ トイルー 2 — ステアロイルレシチン （フナコシ製） 7 9 0 m g、 N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸 4 0 O m gを原料と して用いた。 これらの原料を製造例 2 と同様の方法で処理して目的のシアル酸誘導体、 即ち、 一般式 （ 2 ) において、 X 3 が N—ァセチルノ イラ ミ ン酸残基であり、 R 2 がパル ミ トイル基、 R 3 がステアロイル基であり、 nが 8であるシ ァ リ ルリ ン脂質 4. 5 m gを得た。 以下、 このシアル酸誘導体をシ ァ リ ルリ ン脂質 9 とする。 製造例 1 0 N—ァセチルノ イ ラ ミ ニルリ ン脂質の調製
1 , 8 —オクタ ンジオール 4 4 O m g、 1 ーステアロイルー 2 — パル ミ トイ ル レ シチ ン （フナコ シ製） 7 9 O m g、 N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸 4 0 O m gを原料と して用いた。 これらの原料を製造例 2 と同様の方法で処理して目的のシアル酸誘導体、 即ち、 一般式 （ 2 ) において、 X 3 が N—ァセチルノ イラ ミ ン酸残基であり、 R 2 がステアロイル基、 R 3 がパル ミ トイル基であり、 nが 8であるシ ァ リ ルリ ン脂質 4. 3 m gを得た。 以下、 このシアル酸誘導体をシ ァ リ ルリ ン脂質 1 0 とする。 実施例 1 モノ シァ リ ルオ リ ゴ糖の調製
鶏卵由来脱脂卵黄 （粉末） 4 0 k gを 2 0 0 リ ッ トルの水に懸濁 し、 室温で 3時間攪拌した。 これをろ過した後、 4 °Cで 2 日間静置 して微量の不溶物を沈澱させ、 上清を得た。 得られた上清を逆浸透 膜 （日東電工製、 NT R - 7 4 1 0 ) を用いて 2 0 リ ッ トルに濃縮 した。 得られた濃縮液の p Hを 5. 0 に調整して脱脂アーモ ン ド粉 末を 4 0 g加え、 3 7 eC、 1 日間攪拌した。 得られた液をろ過し、 陰イオン交換樹脂 （ダウケ ミ カル製、 D o w e x 1 x 8 ) 1 0 0 リ ッ トルに吸着させた。 これを水 2 0 0 リ ッ トルで洗浄した後、 0〜 0. 1 5 Mの A c 〇 N a水溶液でグラジェン ト溶出した。 0〜 0. 0 6 Mの画分を濃縮、 脱塩、 乾燥して 1 . 4 gのモノ シァ リ ルオ リ ゴ糖を得た。 H P L Cで純度を確認したところ 9 3 %であった。 実施例 2 ダイ シァ リ ルオ リ ゴ糖の調製
鶏卵由来脱脂卵黄 （粉末） 1 0 0 k gを 5 0 0 リ ッ トルの水に懸 濁し、 室温で 3時間攪拌した。 これをろ過した後、 4 °Cで 2 日間静 置して微量の不溶物を沈澱させ、 上清を得た。 得られた上清を実施 例 1 と同じ逆浸透膜によ り 5 0 リ ッ トルに濃縮した。 得られた濃縮 液の p Hを 5. 0 に調整して脱脂了一モ ン ド粉末を 7 0 0 g加え、 3 7て、 1 日間攪拌した。 得られた液をろ過し、 実施例 1 と同じ陰 イオン交換樹脂 2 5 0 リ ッ トルに吸着させた。 これを水 5 0 0 リ ッ トルで洗浄した後、 0〜 0. 3 Mの N a C 1 水溶液でグラジェン ト 溶出した。 0. 0 5〜 0. 1 MN a C 1 溶出画分を濃縮 · 脱塩 · 乾 燥して 2 9. 5 gのダイシァリルオリゴ糖を得た。 純度を H P L C で確認したところ 9 5 %であった。 実施例 3 ダイシァ リルォリ ゴ糖の調製
実施例 2 と同様にして 5 0 リ ッ トルの濃縮液を得た。 得られた濃 縮液の p Hを 5. 0に調整して脱脂杏種子 7 0 0 gを加え、 3 7 eC 、 1 日間攪拌した。 得られた液をろ過し、 実施例 1 と同じ陰イオン 交換樹脂 2 5 0 リ ッ トルに吸着させた。 これを水 5 0 0 リ ッ トルで 洗浄した後、 0〜 0. 3 Mの N a C 1 水溶液でグラジェン ト溶出し た。 0. 0 5〜 0. 1 MN a C 1 溶出画分を濃縮 · 脱塩 · 乾燥して 2 7. 2 gのダイシァリルオリゴ糖を得た。 純度を H P L Cで確認 したところ 9 2 %であった。 試験例 1 ォリ ゴ糖糖鎖構造の確認
実施例 1 〜 3で得られたォリ ゴ糖の糖鎖構造を確認した。 具体的 には、 得られたオリ ゴ糖を文献 （Journal of Food Science 58.743 一 747(1993) ) 記載の方法で A B E E誘導体化後、 B i o - G e 1
P— 4 クロマ トグラフィ ー、 H P L C、 NMR、 糖組成分析によ りその構造を確認した。 表 1 に NMR分析で得られたデータを示す 表 1 ストラクチャ— レポ-夕-グ プ MS 1 MS 2 DS
Structure reporter
group 測定値 (ppm ) 则定値 (ppm ) 測定値 (ppm )
H— 1 GlcNAc- 2 4. 629 4. 624 4. 625
Man-3 検出されず 検出されず 検出されず
Man-4 5. 1 32 5. 1 33 5. 1 32 Man- 4, 4. 926 4. 91 6 4. 946 GlcNAc - 5 4. 602 4. 60 4. 60 GlcNAc- 5' 4. 58 1 4. 547 4. 60 Gal -6 4. 445 4. 44 4. 442 Gal -6" 4. 466 4. 442
H-2 Man-3 4. 237 4. 235 4. 240
Man-4 4. 1 92 4. 1 88 4. 1 93 Man-4' 4. 1 08 4. 099 4. 1 1 5
H-3 a NeuAc 1. 723 1. 720 7 1 8
NeuAc 71 8
H-3 e NeuAc 2. 667 2. 668 2. 669
NeuAc' 2. 669
NAc GlcNAc-1 1. 902 1. 903 1. 903
GlcNAc - 2 2. 071 2. 067 2. 07 1 GlcNAc-5 2. 068 2. 065 2. 07 1 GlcNAc - 5' 2. 044 2. 048 2. 062 NeuAc 2. 028 2. 028 2. 028 NeuAc 2. 028 注）
6' 5' 4'
(NeuAc a 2-6 )Gal/Sl-4 GlcNAcySl-2Man l-6 3 2 1
： Man 31-4 GlcNAc 31-4GlcNAc-ABEE
NeuAc a 2 - 6Ga 1/51-4 Gl cNAc β l-2Man a 1-3
6 5 4 また、 H P L C分析から実施例 1 のォリゴ糖は表 1 中の MS 1 と M S 2の 2成分が、 実施例 2及び 3のオリ ゴ糖は表 1 中の D Sが主 成分であるこ とが分かった。 表 1 と文献 （Journal of Food Scienc e 58.743- 747(1993) ) 記戦の既知のデ—夕を比較した結果、 各実 施例で得られたォリ ゴ槌の糖鎖構造は以下に示すものであるこ とが 分かった。
実施例 1 由来のもの
Gal ;31-4 GlcNAc^l-2Man l-6
： Man ^1- GlcNAcSl-4GlcNAc
NeuAc a 2-6Ga 1/31-4 Gl cNAc β l-2 an a 1-3
(MS 1)
GlcNAc/31-2Manal-6
： Man^l-4 GlcNAc/?.l-4GlcNAc
NeuAc 2-6Gal/31-4 GlcNAc^ l-2Man 1-3
(MS 2)
実施例 2及び実施例 3由来のもの
NeuAc a 2-6Ga ly91-4 Gl cNAc β l-2Man a 1-6
： Man/31-4 GlcNAc/3 l-4GlcNAc
NeuAc a 2-6Ga 1 S1-4 Gl cNAc β l-2Man a 1-3
(DS) 鶏卵卵黄中のシァ リ ルオリ ゴ糖の主成分は、 既に上記の M S 1 、 M S 2、 及び D Sであるこ とが分かっている （Journal of Food Sc ience 58,743- 747(1993) ) 。 従って、 本発明の方法は、 夾雑する グリ コシダーゼの存在にも関わらず、 糖鎖構造を損なう こ とな く 簡 易に所望のオ リ ゴ糖を製造するものであるといえる。 なお、 実施例 1 で得られた M S 1 と M S 2の混合物を、 「M S」 と表記する。 製造例 1 1 ダイ シァ リ ルオ リ ゴ糖リ ン脂質の調製
1 , 8 —オク タ ンジオール 4. 5 gをク ロ口ホルム 2 0 0 m Lに 溶解し、 ジパル ミ トイルホスフ ァチジルコ リ ン 6. 8 gを加えた。 これに酢酸緩衝液 （ P H 5. 6 ) 3 0 m L及び 0. 4 M酢酸カルシ ゥ厶水溶液 3 m Lを加え、 さ らに 3 7 0ュニッ 卜の P L Dを酢酸緩 衝液 （ p H 5. 6 ) 0. 5 m Lに溶かしたものを徐々 に添加し、 3 0〜 3 5 °Cで 5 0時間攪拌し、 反応させた。 反応終了後、 有機溶媒 を除去し、 シリ カゲルクロマ ト グラフ ィ ー （A c O E t ： C H C 1 3 = 3 ： 1 ) で精製した。 このようにしてホスフ ァチジルォク タ ノ —ル 5. 5 gを得た。
実施例 2で得られたダイ シァ リ ルオ リ ゴ糖 1 8 gをメ タ ノ ール 1 リ ッ トルに溶解し、 D o w e x— 5 0 (H+ ) 1 0 gを加えて室温 で 4時間攪拌した。 反応終了後、 反応液をろ過して D o w e x - 5 0を除去した。 ろ液のメ タノ ール溶液を 3 O m Lに濃縮し、 これに 一 2 0 °Cでジェチルエーテル 1 0 m Lを添加して再結晶を行い、 ダ イ シァ リ ルオ リ ゴ糖のメチル化物 1 5. 3 gを得た。
得られたメチル化物に - 2 0てで塩化ァセチル 2 5 g、 無水酢酸 3 gを加えた。 これに乾燥塩化水素ガスを飽和させて室温で 2 4時 間攪拌した。 反応液の溶媒を留去し、 次いでベンゼン、 トルエンを 用いて反応液を完全に脱水した。 この後、 ジク ロロメ タ ン、 ジェチ ルエーテル、 へキサンの等量混合物により再結晶し、 ァセチル化物
1 6. 2 gを得た。
1 5 gのモレキュラーシーブ 4 A、 A g 2 C 0 a 1 0 g、 上記で 得られたホスファチジルォクタノ ール 5 gを添加したジク ロロ メタ ン 1 0 0 m Lにァセチル化物を一 2 0 °Cで溶解し、 室温で 4時間攪 拌してグリ コ シル化反応を行った。 反応液をセライ 卜ろ過した後、 溶媒を留去した。 このものをシリ カゲルク ロマ ト グラフ ィ ー （C H 2 C 1 2 ： M e 0 H = 9 ： 1 ) で精製し、 ダイ シァ リ ルォ リ ゴ糖リ ン脂質ァセチル化誘導体のメチル化物 1. 0 8 gを得た。
当該メチル化物 5 0 O m gをメ タノ ール 1 0 O mLに溶解し、 氷 冷下カ リ ウムメ トキシ ドの 3 0 %メ タノ ール溶液 （M e〇K 4 2 m gZM e OH l 0 0 m g ) をゆっ く り滴下した。 反応終了後、 D o w e X - 5 0 ( H + ) を加えて中和した後、 ろ過して D ow e x— 5 0を除去し、 次いで得られたろ液の有機溶媒を留去した。 このも のをシリ カゲルクロマ ト グラフ ィ ー （CH2 C 1 2 ： M e 0 H = 2 ： 1 ) で精製し、 ダイ シァ リ ルォ リ ゴ糖リ ン脂質のメチル化物 2 3 5 m gを得た。
当該メチル化物 2 0 O m gを THF 2 O mL、 H 2 0 1 O mLの 混合溶媒に溶かし、 氷冷下で 1 N— N a 0 H 0. 6 mLを加え 1時 間攪拌した。 反応液を D ow e x - 5 0 (H+ ) にて中和し、 樹脂 を H2 〇で洗浄した。 ろ液、 洗液を合わせて濃縮し、 これをカラム ク ロマ ト グラフ ィ ー （〇D SZH2 〇、 M e〇H) で精製して目的 のシアル酸誘導体 （ダイ シァ リ ルオ リ ゴ糖リ ン脂質 （D S P L 3 ) ) 2 0. 1 m gを得た。 このダイ シァ リ ルオ リ ゴ糖リ ン脂質を T L C分析したところ、 単一のスポッ トを示し、 D i t mm e r試薬、 レゾルンノ ール試薬の両方に呈色反応を示した。
また、 用いる リ ン脂質とスぺーサ一の原料を変えるこ とによって 、 ァシル基及びスぺーサ一の異なるシアル酸誘導体を得た。 リ ン脂 質と してジステアロイルホスフ ァチジルコ リ ン、 スぺ一サ一の原料 と して 1 , 3—プロパンジオールを用いて D S P L 1 を、' リ ン脂質 と してジ ミ リ ス トィルホスフ ァチジルコ リ ン、 スぺーサ一の原料と して し 4 一ブタ ンジオールを用いて D S P L 2を、 リ ン脂質と し てジァラキ ドイルホスフ ァチジルコ リ ン、 スぺ一サ一の原料と して 1， 8 —オク タ ンジオールを用いて D S P L 4を、 リ ン脂質と して ジ リ ノ レノ ィルホスフ ァチジルコ リ ン、 スぺーサ一の原料と して 1 , 1 0—デカ ンジオールを用いて D S P L 5を得た。 以下にそれぞ れのシアル酸誘導体の構造を示す。
C H 2 0 -ステ了ロイル
H〇一ステ了ロイル
D S - ( C H 2 ) 3 - 0
Figure imgf000037_0001
〇 C H 2
( D S P L 1 )
C H 2 0 -ミリ
〇 i H 0 -ミリストイル
II
D S - ( C H 2 ) 一 〇一 P— 0 C H 2
( D S P L 2 ) C H 0 -パルミトイル
HO -パルミ卜ィル
D S - ( C H2 ) 〇 C H2
〇
0 (D S P L 3 )
O OPPHH
C H 0—了ラキドイル
〇 H O -了ラキドイル
II
D S - ( C H2 ) 〇一 P—〇 C H2
0 ( D S P L 4 )
C H 0 - H〇ーリノレノィル
D S— （ C H 2 ) 〇 0 C H
(D S P L 5 )
一 3 製造例 1 2 モノ シァ リ ルオ リ ゴ糖リ ン脂質の調製
実施例 1 で得られたモノ シァ リ ルオ リ ゴ糖 （ M S ) 、 ジパル ミ ト ィルホスフ ァチジルコ リ ン、 及び 1 , 8 —オクタ ンジオールを用い て、 製造例 1 1 と同様の方法により 目的のシアル酸誘導体 （モノ シ ァ リ ルォ リ ゴ糖リ ン脂質 （MS P L 3 ) ) 2 0. 1 m gを得た。
また、 用いる リ ン脂質とスぺーサ一の原料を変えるこ とによって 、 ァシル基及びスぺーサ一の異なるシアル酸誘導体を得た。 リ ン脂 質と してジステアロイルホスフ ァチジルコ リ ン、 スぺーサ一の原料 と して 1 , 3 —プロパンジオールを用いて MS P L 1 を、 リ ン脂質 と してジ ミ リ ス トィルホスフ ァチジルコ リ ン、 スぺーサ一の原料と して し 4 一ブタ ンジオールを用いて M S P L 2を、 リ ン脂質と し てジァラキ ドイルホスフ ァチジルコ リ ン、 スぺーサ一の原料と して 1 , 8 —オク タ ンジオールを用いて MS P L 4を、 リ ン脂質と して ジ リ ノ レノ ィルホスフ ァチジルコ リ ン、 スぺ一サ一の原料と して 1 , 1 0 —デカ ンジオールを用いて M S P L 5を得た。 以下にそれぞ れのシアル酸誘導体の構造を示す。
C H 2 0—ステ了 πィル
I
C H 0—ステ了 Dィル
M S ( C H 2 ) 0一 0 i H2
0 ( S P L 1 ) C H 2 0 -ミリストイル
〇 H O -ミリス卜ィル
II
M S - ( C H 2 ) , - 0 P 0 C H 2
〇 (M S P L 2 )
C H 2 0—パルミトイル
〇 H O -バルミ卜ィル
II M S - ( C H 2 ) 8 - 0 - PP -〇 C H 2
(M S P L 3 )
C H 2 0 -了ラキドイル
0 H 0 -了ラキドイル
II
M S - ( C H , ) 〇一 P
〇 (M S P L 4 )
C H 2 0 -リノレバル
Figure imgf000040_0001
製造例 1 3 シァ リ ルォ リ ゴ糖ぺプチ ドの調製
鶏卵由来脱脂卵黄 （粉末） 5 0 k gを 2 5 0 Lの水に懸濁し、 室 温で 3時間攪拌した。 ろ過した後、 4 °Cで 2 日間静置して微量の不 溶物を除き、 上清を得た。 得られた上清を逆浸透膜 （R O膜） によ り 5 0 Lに濃縮した。 濃縮液を陰イオン交換樹脂 （ダウケ ミ カル製 、 M S A - 1 ) 2 5 0 Lに吸着させ、 水 5 0 0 Lで洗浄後、 5 0 m MN a C 1 水溶液で溶出した。 水洗画分及び 5 0 mMN a C 1 溶出 画分をそれぞれ濃縮 ' 脱塩 · 乾燥し、 5. 6 gのモノ シァ リ ルオ リ ゴ糖ペプチ ド （ M Sペプチ ド） と 1 3. 8 gのダイ シァ リ ルオ リ ゴ 糖ペプチ ド （ D Sペプチ ド） を得た。 純度を H P L Cで確認したと ころ、 それぞれ 8 8 %、 9 1 %であった。 試験例 2 シアル酸誘導体によるィ ンフルェンザウィルスの
赤血球凝集阻害効果
表 2中に示す各サンプルを表 2に示す濃度含有する P B S 0.25m L とイ ン フルエンザ A 2 型ウィルス液 0.25m L (4HA 単位） とを混 合し、 37°Cで 30分間振とう した。 1 時間室温で放置後、 ニヮ ト リ赤 血球凝集能を測定した。 シアル酸誘導体を含有しない P B Sを用い た試験区を対照と して赤血球凝集抑制率を求めた。 結果を表 2に示 す。 表 2 濃度 ( g/mL)
サンプル
「
100 50 25 12.5 6.25 3.125
「八 η/\ ヽ
Mb 74 (%) 57 (¾) 50 (¾) 28 (¾) 17 (¾) 9 (¾)
D S 89 70 65 38 24 15
八
Mb Fし 1 100 100 100 95 84 69
M PL 6 100 100 100 91 78 60
MS P L J 100 100 98 89 74 62
100 9/ 100 87 76 59
M し 1UU 1UU 9b 70 55 U Π i Q5 r P Tし 丄 1 1リリ 1UU 1 ΛΑ ΠΛ
丄 00
Π P T 9 10U 1UU 97 89 78
八
U Γ L 0 100 100 100 91 81 72 o r L 4 100 100 100 90 76 69
D r L 5 100 100 97 89 74 60
M S八0 ィ
へゾチ卜 72 54 41 29 16 7
D へアナ卜 84 69 62 37 20 12 ン リルリノ 旨 k 1 100 100 100 94.3 82.1 69.5
'ノアリルリノ)!旨 Sf 2 100 100 100 100 92.3 80.3 ン了リルリノ脂 10U 100 no c 80.1 DO.1
'ン'/7 ίΠリルιΙ 1リ1ノ } [j1ヒ曰員 4 A リ 丄リリ 1UU IUU 04. ノ リルリノ/！曰 _M D 100 100 100 95.1 86.3 70.5
'ン了'则ン脂質 6 100 100 100 100 91.4 83.0 シァリルリン脂質 7 100 100 100 90.5 81.1 74.4 シァリルリン脂質 8 100 100 100 92.2 79.3 68.6 シァリルリン脂質 9 100 100 100 97.5 83.1 70.2 シ了リルリン脂質 1 0 100 100 100 94.4 82.5 71.5
Ν-ァセチルバラミン酸 63.3 47.1 35.5 20.9 12.4 4.3 表 2 よ り、 シアル酸誘導体、 特に リ ン脂質が結合したものに、 ィ ンフルェンザウイルスの赤血球凝集能の阻害効果が認められるこ と が分かった。 また、 いずれのシアル酸誘導体も N—ァセチルノ イラ ミ ン酸よ り顕著に阻害効果が高いこ とが分かった。 試験例 3 シアル酸誘導体のロタウイルス感染阻害効果
表 3 中に示す各サンプルを表 3 に示す濃度、 及び製造例 2、 4、 6、 8で得られたシアル酸誘導体 （シァ リ ルリ ン脂質） と N—ァセ チルノ イ ラ ミ ン酸を 1 0 0 m g /m L、 1 0 m g /m L , 1 m / m L、 0. 1 m g / m L , 0 . O l m gZm L含有するイーグル最 小培地 （日水製、 以下 E ME Mと表記する） 100 をそれぞれヒ ト ロ 夕ウィ ルス （M〇株） E M E M100 〃 L と混合し、 37°C、 1 時 間静置した。 そ してこれを、 96穴プレー ト上で単層となるまで培養 した M A 1 0 4細胞 （サル腎細胞） に加えた。 37°C、 1 時間静置し た後液体部分を除去し、 E M E Mを加えてさ らに 37°C、 17時間静置 した。 これを冷メ タノ ールで固定した後、 間接蛍光抗体法によ り感 染細胞を染色してロタウィルス感染率を求めた。 さ らに上記シアル 酸誘導体含有 E M E Mの代わりにこれらを含有しない E M E Mを用 いた試験区を対照と して、 ロタウィ ルス感染阻害率を求めた。 その 結果を図 1 及び表 3 に示す。 表 3
Figure imgf000044_0001
図 1 及び表 3 より、 シアル酸誘導体にはいずれも口夕ウイルス,感 染阻害効果が認められ、 しかもいずれのシアル酸誘導体も N -ァセ チルノ イ ラ ミ ン酸よ り顕著に阻害効果が高いこ とが分かった。 試験例 4 シアル酸誘導体のロタウィルス増殖抑制効果
ローラ 一ボ トル中で単層となるまで培養した M A 1 0 4細胞 （サ ル腎細胞） にヒ トロ夕ウィルス （MO株） を加え、 37° (：、 1 時間振 とう培養して口夕ウィルスを細胞に感染させた。 E ME Mで細胞を 洗浄した後、 表 4 に示すサンプルを表 4 に示す濃度含有する E ME Mをローラ一ボ トルに加えて 37て、 3 日間振とう培養した。 その培 養上清について、 間接蛍光抗体法を用いてロタウィルスの感染力価 を測定した。 また上記シアル酸誘導体含有 E ME 1V [の代わりにこれ らを含有しない E ME Mを用いた試験区を対照と して、 口夕ウィル ス増殖抑制率を求めた。 その結果を表 4 に示す。
表 4 サンプル 濃 度 ロタウィルス力価 （％)
MS 1 m g/mし 2 8. 7
DS 1 mg/mL 1 2. 0
MS PL 1 \ 0 0 g/mL 8. 3
MSPL 2 I 0 0 U g/mL 7. 1
MS PL 3 I 0 0 g/mL 1 0. 0
MSPL 4 I 0 0 μ g/mL 9. 8
MS PL 5 1 0 0 g/mL 1 2. 1
DS PL 1 I 0 0 g/mL 5. 2
DS Pし 2 I 0 0 μ. g/mL 6. 3
DS PL 3 1 0 0 w g/mL 4. 9
DSPL 4 1 0 0 " g/mL 5. 5
DSPL 5 1 0 0 /mL 6. 1 シァリルリ ン脂質 1 1 0 0 g/mL 8 シァリノレリ ン 8旨質 2 1 0 0 g/mL 5 シァリルリ ン脂質 3 1 0 0〃 g/mL 1 0 シァリ レリ ン月旨質 4 1 0 0 " g/mL 7 シァリノレリ ン 旨質 5 1 0 0〃 g/mL 1 0 シァリノレリ ン 旨質 6 1 0 0 g/mL 1 2 シァリルリ ン脂質 7 1 0 0 u /mL 1 4 シァリノレリ ン月旨質 8 1 0 0 ^ g/mL 1 0 シァリルリ ン脂質 9 1 0 0 g/mL 5 シァリノレリ ン脂質 1 0 1 0 0 g/mL 6
N -了セチル /イラミン 酸 1 0 mg/mL 1 5
無添加 1 0 0 表 4 より、 シアル酸誘導体はいずれもロタウィルス増殖抑制効果 が認められ、 しかも N—ァセチルノイラ ミ ン酸より顕著に抑制効果 が高いこ とが示された。 試験例 5 シアル酸誘導体の抗ニュ ーカ ッ スル病ウィ ルス効果 表 5中に示す各サ ンプルを表 5中に示す濃度含有する P B S 0. 25 m L とニュ ーカ ッ スル病ウィ ルス液 0. 25m L ( 4HA 単位） とを混合 し、 37て、 30分間振とう した。 1 時間室温で放置後、 ニヮ ト リ赤血 球凝集能を測定した。 これらを含有しない P B Sを用いた試験区を 対照として、 赤血球凝集抑制率を求めた。 結果を表 5 に示す。
表 5 濃度 iug/ml
サンプル
100 50 25 12.5 6.25 3.125
MS 51 (¾) 46 (¾) 33 (¾) 20 (X) 5 (X)
DS 67 55 46 25 16
MSPL 1 100 100 83 69 44
MSPL2 100 100 82 72 60
MSPL 3 100 100 85 82 72
MSPL 4 100 100 83 79 69
MSPL 5 100 100 90 77 65
DSPL 1 100 100 92 76 59
DSPL2 100 100 95 80 64
DSPL 3 100 100 100 93 79
DSPL 4 100 100 100 92 80
DSPL 5 100 100 98 89 76
シ 7リルリン脂質 1 100 100 97.2 83.3 71.5 60.4 (¾) ンァリル1)ン脂質 2 100 100 100 92.5 78.8 64.7 シ了リルリン脂質 3 100 100 85.3 69.8 52.1 40.6 ン 7リルリン脂質 4 100 100 93.2 72.1 59.6 44.3 シ 7リルリン脂質 5 100 100 91.0 68.8 57.5 42.4 シ 7リルリン脂質 6 100 100 100 89.5 72.0 59.7
'ン 7リルリン脂質 7 100 100 94.4 80.6 68.7 87.1 シァリルリン脂質 8 100 100 90.3 78.6 62.3 47.7 シァリルリン脂質 9 100 100 95.3 84.1 70.1 59.8
'ン 7リルリン脂質 1 0 100 100 92.4 80.5 67.2 60.7
N-ァセチルバラミン酸 46.3 30.1 18.8
一 表 5 より、 シアル酸誘導体に、 ニューカ ッスル病ウィルスの赤血 球凝集能の阻害効果が認められるこ とが分かった。 また、 いずれの シアル酸誘導体も N—ァセチルノ イラ ミ ン酸より顕著に阻害効果が 高いこ とが分かった。 試験例 6 シアル酸誘導体の抗ヘルぺスウィルス効果
表 6中に示す各サンプルを表 6中に示す濃度含有する E ME M0. 25m Lをそれぞれ、 単純へルぺスウィルス I型の E ME MO.25m L と混合し、 37て、 1 時間静置した。 そしてこれを、 ミニボ トル中で 単層となるまで培養した Hela細胞に加えた。 37て、 1 時間静置した 後液体成分を除去し、 E MEMを加えてさ らに 72時間静置した。 こ れに 10%ホルマ リ ンを加えて固定した後、 ク リ スタルバイオレ ツ ト 染色してプラーク数を測定した。 そして上記シアル酸誘導体 E ME M希釈液の代わりにこれらを含有しない EME Mを用いた試験区を 対照と して、 プラーク形成抑制率を求めた。 その結果を表 6 に示す
表 6
Figure imgf000050_0001
表 6 より、 シアル酸誘導体、 特にリ ン脂質が結合したものには抗 ヘルぺスウィルス効果が認められるこ とが分かった。 また、 いずれ のシアル酸誘導体も N—ァセチルノイラ ミ ン酸より顕著に高いブラ ーク形成抑制効果を示した。 試験例 7 シアル酸誘導体のへリ コパクター ' ピロ リ接着阻害効果 表 7 に示す各サンプルを表 7 に示す濃度含有する P B Sをそれぞ れ、 へリ コパクター · ピロ リ Z P B S懸濁液 （2x l 0 5 CFU / L ) と混合し、 37°Cで 30分間静置した。 その後、 muc i n (豚由来） でコ 一ト した 24穴プレ― トに加え 37°Cで 2時間静置した。 菌液を除いた 後 P B Sで洗浄し、 残った菌数を、 菌が分泌するゥレアーゼ活性を 利用するィ ン ドフェノール法で測定した。 上記シアル酸誘導体含有 P B Sの代わりにこれらを含有しない P B Sを用いた試験区を対照 として、 接着阻害率を求めた。 その結果を表 7に示す。
濃度 (mg/mL)
サンプル
10 1 0.1 0.01 0.001
MS 56 (¾) 40 (¾) 29 (¾) 13 (¾) 0 (X)
DS 62 49 38 18 2
MSPL 1 100 100 78 63 45
MS PL 2 100 98 77 60 41
MS P L 3 100 95 70 55 37
MS PL 4 100 93 66 57 32
MS PL 5 100 90 63 48 29
DSPL 1 100 100 87 70 49
DSPL 2 100 100 80 66 51
DS PL 3 100 94 72 54 38
DS PL 4 100 96 69 55 39
DS PL 5 100 91 65 51 30
N-ァセチル"ラミン酸 29 14 3 0 0
D Sぺプチド 58 42 37 17 0
表 7 よ り、 シアル酸誘導体特に リ ン脂質が結合 したものにヘリ コ パク ター . ピロ リ接着阻害効果が認められるこ とが分かつた。 また 、 いずれのシアル酸誘導体も N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸よ り も顕著 に高い接着阻害効果を示した。 試験例 8 シアル酸誘導体の抗炎症効果 （力ラゲニンひざ浮腫に対 する効果）
ウィスター系雄性ラ ッ ト （ 8週令） にラッ ト体重 1 k g当り 2 m Lのエバンスブルー Z生理食塩水溶液 （lOm gZm L ) を静脈内投 与した後、 右ひざ閬節腔内へ 2 %力ラゲニン/生理食塩水溶液 0. l m Lを投与した。 力ラゲニンの投与 15分前に、 表 8に示す各サン プル 100 、 10、 1 gを生理食塩水 100 Lにとかしたもの、 及び 対照としてこれらを含有しない生理食塩水 100 Lを関節内に投与 しておいた。 4時間後に屠殺し皮をはいで関節部を露出し、 エバン スブルーの漏出を観察した。 その後、 関節腔内に 0.15m Lの生理食 塩水溶液を注入して関節を切開し、 5 m Lの関節腔内液を採取した 。 得られた関節腔内液に含まれる細胞を数え、 対照例の細胞数を 10 0 %として抑制率をみた。 抑制率は下記の式に従って算出した。
(対照の細胞数-サンブル投与時の細胞数）
抑制率 （％) = X 1 0 0
(対照の細胞数） その結果を表 8 に示す。
表 8
Figure imgf000054_0001
表 8より、 シアル酸誘導体に抗炎症効果が認められるこ とが分か つた。 また、 シアル酸誘導体はいずれも Ν—ァセチルノイラ ミ ン酸 より顕著に高い抗炎症効果のあることが分かった。 試験例 9 シ了ル酸誘導体の抗ア レルギー効果 （ P C A (Passive
Cutaneous Anaphylaxis ) 反応に対する効果) ハー ト レー系雄性モルモッ ト （体重 3 0 0〜 4 0 0 g ) に抗血清 (ゥサギ I g G、 抗体価 1/36000 以上） の 16xl03 倍希釈または 8x 104 倍希釈液 0.1 mLを皮内投与した。 4時間後にモルモッ ト体重 1 k g当たり 1 O m gの抗原 （ovalbumin ) に 1 %エバンスブル一 2 mLを加えた抗原液を静注して P CA反応を惹起させた。 その後 モルモッ トを屠殺し、 その表皮を剝離して色素浸出面積を測定した 。 さらに、 皮膚青染部の色素量を Katayamaらの方法 （Microbiol. Im munol. , 22 89(1978)) に従い、 吸光度 （ 6 2 0 nm) で測定し、 色 素抽出濃度を求めた。 また P C A反応惹起 30分前、 即ち抗血清によ る感作 3時間 30分後に、 以下に示す群のモルモッ トにシアル酸誘導 体または生理食塩水を静脈内投与し、 P C A反応に対するシアル酸 誘導体の作用をみた。 数値は V群のデータを 100 %として換算した ものである。 その結果を表 9 に示す。
表 9
Figure imgf000055_0001
*希釈率 表 9より、 シアル酸誘導体に抗アレルギー効果が認められること が分かった。 また、 いずれのシアル酸誘導体も N—ァセチルノイラ ミ ン酸より顕著に高い抗ァレルギ一効果のあることが分かった。 なお、 各群のサンプルの種類、 投与量を以下に示す。
I群 ： MSを体重 1 k g当り 1 m g、 5 mg、 1 0 mg投与。 I I群 ： D Sを体重 1 k g当り 1 m g、 5 m g、 l O mg投与。 HI 群 ： M S P L 3を体重 1 k g当り 1 m g、 5 m g、 l O m g投 与。
I V群 ： D S P L 3を体重 1 k g当り 1 m g、 5 m g、 l O m g投 与。
V群 ： 生理食塩水を体重 1 k g当り 1 mL投与。
V I群 ： N-ァセチルノイラ ミ ン酸を体重 1 k g当り 1 m g、 5 m g、 1 0 m g投与。 試験例 1 0 シアル酸誘導体のビフ ィ ズス菌増殖促進効果
下記に示す培地に表 1 0に示す各サンプルを 500 m g/mL添加 し、 B. adolescentis, B. breve 、 B. infantis B. longum E.coliの 5株を接種し、 37て、 5 日間嫌気培養を行った。 6 0 0 n mにおけ る濁度を測定して菌の増殖の程度をみた。 そしてこれらの代わりに 、 グルコースを 500 m gZmL含む培地での値を 1 0 0 %として増 殖率を求めた。 その結果を表 1 0に示す。 表 1 0
サンプル 菌 株 増殖率 （％)
MS B. adolescentis 63. 5
B. breve 59. 7
B. infantis 80. 1
B. longum 6 1. 1 li. col i 38. 7
DS B. adolescentis 60. 4
B. breve 58. 2
B. infantis 76. 8
B. longum 65. 5
E. col i 22. 1
DSぺプチ ド B. adolescentis 57. 1
B. breve 58. 2
B. infantis 69. 8
B. longum 67. 3
E. coli 25. 8
N-ァセチルバラミン 酸 B. adolescentis 28. 3
B. breve 2 1. 5
B. infant is 32. 8
B. longum 1 9. 8
E. col i 25. 4 また、 培地組成は次の通りである（
(NH4 ) 2 S 04 9 g
KH2 P O 4 4 5 g
K 2 H P 0 * 0 7 5 g
Figure imgf000058_0001
N a C 1 9 g
C a C 1 2 · 2 H2 0 0 9 g
ト リ プティ ケース （B B L) 1 0 g
Yeast extract ( D i f c 0 ) 5 g
肉エキス （D i f c o) 2 g
へミ ン 0. 0 0 g
Figure imgf000058_0002
L一システィ ン一塩酸塩一水和物 0. 3 g
蒸留水 1 0 0 0 m L
p H 7. 2
表 1 0よ り シアル酸誘導体にビフィ ズス菌増殖促進効果が認めら るこ とが分かった。 また、 いずれのシアル酸誘導体も N—ァセチル ノ イラ ミ ン酸よ り顕著に高い増殖促進効果を示した。 試験例 1 1 ロタウィ ルスによる下痢症に対するシアル酸誘導体の 予防効果
製造例 2、 4、 6、 8で得られたシアル酸誘導体 （シァ リ ルリ ン 脂質） を 1.0 m gZmLの濃度になるように生理的食塩水で希釈し 、 それらを生後 5 日齢の d d Yマウスに 50 Lずつ経口投与した。 シアル酸誘導体溶液投与 1時間後、 同マウスに感染に充分な濃度の ロ タウィ ルス MEM希釈液を 50 z Lずつ与え経口感染させた。 その 後 5 日間にわたって下痢発生の有無を観察した。 その結果、 図 2の ようになり、 シアル酸誘導体投与群は、 非投与群にく らベて下痢の 発生率が大き く低下し、 ロタウイルス性下痢症に対する優れた予防 効果が見られた。 試験例 1 2 ロタウィルスによる下痢症に対するシアル酸誘導体の 治療効果
生後 5 日齢の d d Yマウスに感染に充分な濃度のロタウィルス M EM希釈液を 50" Lずつ与え経口感染させた。 その後 3日間、 製造 例 2、 4、 6、 8で得られたシアル酸誘導体 （シァ リ ル リ ン脂質） の 1.0 m g/mL生理的食塩水希釈液を 50 Lずつ経口投与した。 経口感染後 5 日間にわたって下痢発生の有無を観察し罹患率を算定 した。 その結果、 図 3のようになり、 シアル酸誘導体投与群は非投 与群にく らべて下痢の罹患率が低く、 回復も早かった。 このよ う に 、 シアル酸誘導体は、 口夕ウィ ルス性下痢症に対して優れた治療効 果を示した。 試験例 1 3 サルモネラによる下痢症に対するシアル酸誘導体の治 療効果
Salmonella dublin を感染させた子牛 1 2 0頭を 1 0頭ずつの 1 2群に分け、 そのうちの 1 1群には、 それぞれ製造例 1〜 1 0で得 られたシアル酸誘導体 （シァ リ ルリ ン脂質） 、 及び N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸を 1頭につき 1 日あたり 1 0 O m gとなるように添加し た人工乳を毎日与え、 残りの 1群にはシアル酸誘導体無添加の人工 乳を同量、 同様に与えて、 5週間にわたって飼育した。 そのあいだ 、 下痢症の指標と しての糞便スコアと糞便中の Salmonella dublin の菌数を測定した。 その結果を表 1 1 及び 1 2 に示す,
表 1 1 糞便スコア
Figure imgf000060_0001
数値は、 10頭の平均を示し、 正常便を 0、 钦便を 1、 泥様便を 2 水様便を 3とした。 表 1 2
糞便中のサルモネラ ダブリンの菌数
Figure imgf000061_0001
数値は、 10頭の平均を示し、 糞便 1 gあたりの対数値で示した。 表 1 1 及び 1 2 より、 シアル酸誘導体添加人工乳投与群は、 無添 加人工乳投与群にく らベて糞便スコアが低下し、 糞便中の Salmone l l a dub l i n の菌数が減少した。 このことより、 シアル酸誘導体が Sa lmone l la dub l i n 感染による下痢に対して優れた治療効果を示すこ とが明らかとなった。 また、 シアル酸誘導体はいずれも、 N —ァセ チルノイラ ミ ン酸より顕著に高い治療効果を示した。 試験例 1 4 非感染性の下痢症に対するシアル酸誘導体の治療効果
6 0頭の子牛を 1 0頭ずつの 6群に分け、 そのうちの 5群にはそ れぞれ製造例 2、 4、 6、 8で得たシアル酸誘導体 （シァリルリ ン 脂質） 、 及び N —ァセチルノイラ ミ ン酸を 1 頭につき 1 日あたり 1 0 0 m gになるように添加した人工乳を毎日与え、 残りの 1 群には シアル酸誘導体無添加の人工乳を同量、 同様に与えて、 5週間にわ たって飼育した。 そのあいだ、 非感染性下痢症の指標としての糞便 スコアと腸内細菌フローラを測定した。 その結果を表 1 3〜 1 7に 示す。 なお、 N —ァセチルノイラ ミ ン酸を投与した群については、 糞便スコァのみを示す。
表 1 3
箕便スコア
Figure imgf000063_0001
数値は、 10頭の平均を示し、 正常便を 0、 钦便を 1、 泥様便を 2 水様便を 3とした。
表 1 4
腸内細菌フロー'
Figure imgf000064_0001
数値は、 10頭の平均を示し、 糞便 1 gあたりの対数値で示した。 表 1 5
腸内細菌フローラ
Figure imgf000065_0001
数値は、 10頭の平均を示し、 糞便 1 gあたりの対数値で示した c 表 1 6
腸内細菌フロー-
Figure imgf000065_0002
数値は、 10頭の平均を示し、 糞便 1 gあたりの対数値で示した c 表 1 7
腸内細菌フローラ
Figure imgf000066_0001
数値は、 10頭の平均を示し、 糞便 1 gあたりの対数値で示した。
表 1 3 1 7 より、 シアル酸誘導体添加人工乳投与群は、 無添加 人工乳投与群に く らべて糞便スコアが低下し、 また、 ゥ ヱルシュ菌 、 大腸菌が減少し、 ビフィ ズス菌、 乳酸菌が増加した。 このこ とよ り、 シァ リ ル リ ン脂質が非感染性の下痢に対して優れた治療効果を 示すこ とが明らかとなった。 また、 糞便スコアの結果から、 シアル 酸誘導体はいずれも N —ァセチルノ イラ ミ ン酸よ り も顕著に高い治 療効果を示すこ とが分かった。 産業上の利用可能性
本発明の医薬組成物は、 抗ウィルス剤、 下痢治療剤、 抗潰瘍剤、 抗炎症剤、 抗ア レルギー剤、 ビフ ィ ズス菌増殖促進剤と して用いる こ とができる。 また本発明の製造方法は、 シアル酸誘導体を工業的 規模で安価 · 簡便に製造するこ とができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 下記の一般式 （ 1 ) 又は （ 2 ) で表される、 ンアル酸誘導 体を有効成分とすることを特徴とする医薬組成物。
X Man (ひ 1.6)
X 2 -Man ( 1.3)
Figure imgf000067_0001
(式中、 R 1 は糖残基又は糖ペプチ ド残基を示す。 X 1 及び X2 は 、 NeuAc(a2, 6)Gal( 31.4)GlcNAc (/S I, 2)—、 Gal ( /S 1, 4)GlcNAc ( ;31, 2)—、 又は GlcNAc (/S I, 2)-を示す。 また、 X 1 及び X 2 は同 —であってもよ く、 異なっていてもよい。 ただし、 X 1 及び X 2 の いずれか一方は、 少なく とも NeuAc ( 2, 6)Gal(/81, 4)GlcNAc ( yS 1, 2)—を示す。 ）
C H 2 O R 2
0 H 0 R 3
II
X ( C H 2 ) n—〇一 PP—〇 C H2 ( 2 )
0
(式中、 R 2 及び R 3 は水素原子、 又は炭素数 1〜 3 0の直鎖、 分 岐鎖、 若しく は環状の飽和又は不飽和のァ シル基を示す。 R 2 及び R 3 は同一であってもよく、 異なっていてもよい。 nは 1〜2 0の 自然数を示す。 X 3 はシアル酸誘導体残基、 又は下記の一般式 （ 3 )
X 4 —Man (な 1.6)
X 5 —Man (ひ 1,3)
Figure imgf000068_0001
(式中、 X 4 及び X 5 は、 NeuAc (ひ 2.6)Gal(yS 1.4)GlcNAc {β 1.2) 一、 GaK^ 1.4)GlcNAc ( 81.2)—、 又は GlcNAc (yS l,2)—を示す。 また、 X 4 及び X 5 は同一であってもよく、 異なっていてもよい。 ただし、 X 4 及び X 5 のいずれか一方は、 少なく とも NeuAc (ひ 2, 6) GaK^ 1.4)GlcNAc ( 51,2)—を示す。 Yは糖残基を示す。 ） で表さ れるシァ リルォリゴ糖誘導体残基を示す。 ）
2. 抗ウィ ルス剤として用いられる請求項 1記載の医薬組成物
下痢治療剤として用いられる請求項 1記載の医薬組成物
4. 抗潰瘍剤として用いられる請求項 1 記載の医薬組成物,
5. 抗炎症剤として用いられる請求項 1記載の医薬組成物
6. 抗アレルギー剤として用いられる請求項 1記載の医薬組成 物。
7. ビフ ィ ズス菌増殖促進剤として用いられる請求項 1 記載の 医薬組成物。
8. 鳥類卵卵黄にアーモン ドを添加することを特徵とする、 下 記一般式 （ 4 ) で表されるシアル酸誘導体の製造方法。
X 1 -Man (ひ 1.6)
Man 一 R ( 4 )
X 2 _ Man ( 1, 3)
(式中、 R 4 は糖残基を示す。 X ' 及び X 2 は、 NeuAc(a2.6)Gal( 1.4)GlcNAc ( S 1.2)—、 Gal(/S 1, 4)GlcNAc (/31,2)—、 又は GlcN Ac (/S I, 2)—を示す。 また、 X 1 及び X 2 は同一であってもよく、 異なっていてもよい。 ただし、 X 1 及び X 2 のいずれか一方は、 少 なく とも NeuAc ( 2.6)Gal( S 1, 4)GlcNAc ( S 1.2)—を示す。 ）
9. ァーモ ン ドが脱脂されたものである請求項 8記載の製造方 法 ο
1 0. 鳥類卵卵黄に杏種子を添加するこ とを特徴とする、 下記 —般式 （ 4 ) で表されるシアル酸誘導体の製造方法,
X Man (ひ 1.6)
Man 一 R ( 4 )
X 2 -Man ( 1, 3)
Figure imgf000070_0001
(式中、 R 4 は糖残基を示す。 X 1 及び X 2 は、 NeuAc(a2, 6)Gal( β 1, 4)GlcNAc ( β 1.2)-, Gal(/S 1. )GlcNAc ( S I.2)—、 又は GlcN Ac (/S I, 2)—を示す。 また、 X 1 及び X 2 は同一であってもよく、 異なっていてもよい。 ただし、 X 1 及び X 2 のいずれか一方は、 少 なく とも NeuAc(cz2， 6)Gal( S 1.4)GlcNAc ( 61, 2)—を示す。 ）
1 1 . 杏種子が脱脂されたものである請求項 1 0記載の製造方 法,
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