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WO1992002230A1 - Composition pharmaceutique comprenant une ou des bleomycines, et une ou des proteines inactivant les bleomycines - Google Patents

Composition pharmaceutique comprenant une ou des bleomycines, et une ou des proteines inactivant les bleomycines Download PDF

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WO1992002230A1
WO1992002230A1 PCT/FR1991/000623 FR9100623W WO9202230A1 WO 1992002230 A1 WO1992002230 A1 WO 1992002230A1 FR 9100623 W FR9100623 W FR 9100623W WO 9202230 A1 WO9202230 A1 WO 9202230A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bleomycins
protein
pharmaceutical composition
inactivating
composition according
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR1991/000623
Other languages
English (en)
Inventor
Henri Paul Durand
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cayla
Original Assignee
Cayla
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cayla filed Critical Cayla
Publication of WO1992002230A1 publication Critical patent/WO1992002230A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
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    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4873—Cysteine endopeptidases (3.4.22), e.g. stem bromelain, papain, ficin, cathepsin H

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition based on antibiotics of the bleomycin family on the one hand, and of proteins inactivating bleomycins on the other hand, in which the side effects induced by bleomycins in certain organs will be considerably reduced.
  • Bleomycins are anti-tumor antibiotics discovered in 1966 (Umeza a et al., 1966) which are very widely used, alone or in combination with other molecules for the treatment of cancer.
  • the interest of bleomycins lies in their high activity against various tumors (lymphomas, testicular carcinomas, squamous cell carcinomas ...) and their low hepatic, renal and bone marrow toxicity which distinguish them from most of the other antitumor drugs.
  • an important limitation in the use of bleomycins is their pulmonary toxicity, characterized by the frequent occurrence of irreversible and often lethal interstitial fibrosis in patients treated with high doses (J.M. Bennett and S.D. Reich, 1979).
  • Bacterial antibiotic resistance genes of the bleomycin family have been described. Under the generic name phleo, they were cloned and incorporated into prokaryotic and eukaryotic cells. This makes it possible to use the antibiotics of the phleomycin family as a selection marker in the field of genetic engineering (patent FR 8-V 13502) (patent EP 85 904 261-6).
  • the phleo r gene can be carried by a cloning or expression vector, or else integrated into a chromosome of the cell which will express this characteristic of resistance to phleomycins.
  • the genes can be expressed in prokaryotes or higher or lower eukaryotes, that is to say in particular in bacteria, yeasts, fungi, animal or plant cells. It was thus possible to obtain a recombinant strain of filamentous fungus Tolyplocladium geodes, expressing a gene for resistance to phleomycins. The addition upstream of said gene of a fungal signal sequence allowed the excretion of the resistance protein in the culture medium (French patent application n ° 89 08838).
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one antibiotic from the bleomycin family and at least one protein which inactivates said bleomycin (s) administered before, during and / or after administration of bleomycins.
  • bleomycin will denote below both the bleomycins themselves as well as the antibiotic giycopeptides of the same family.
  • bleomycins which differ essentially in the terminal amine function or isolated products, bleomycin A or bleomycin B and in particular bleomycin A2, but also products such as phleomycins, tallysomycins, platomycins and victomycins and which are prepared in particular from the following microorganisms: - Streptomyces verticillus ATCC 15003 (bleomycins)
  • FIGURE 1 represents the Ble gene of plasmid PUB110
  • FIGURE 2 represents the Ble Tn5 gene of the Tn5 transposon
  • FIGURE 3 represents the B] e Sh gene of Streptoalloteichus hindustanus
  • FIGURE represents the BJe 990 gene from Streptomyces sp CL990
  • FIGURE 5 represents the comparison of the protein sequences of 4 proteins coded by the Ble genes of Streptoalloteichus hindustanus (Sh), of Streptomyces sp CL99Q (S990), of the plasmid pUBHO (PUB1 10) and TN5 transposon (TN5).
  • FIGURE 6 represents the gene for blereycin acetyl tranferase from streptomyces sp CL990
  • FIGURE 7 represents the plasmid PUT751 Proteins inactivating bleomycins of different types have been identified, some being isolated from animal tissue, others being encoded by bacterial antibiotic resistance genes.
  • - Bleomycin hydrolase was purified from rabbit lungs (Sebti et al. 1987). Its presence may have been correlated with the greater or lesser sensitivity of certain tissues to the toxicity of bleomycins. Its activity is high in healthy tissues and in tumors resistant to bleomycins, in the lungs of rabbits and of species resistant to the toxicity of bleomycins. This activity is practically nil in the lungs and in sensitive tumors.
  • mice differences in sensitivity observed between different lines could be correlated with pulmonary bleomycin hydrolase activity. Its mode of action is known: it acts by hydrolyzing the carboxamide bond of the aminoamilamide part of the molecule, which is thus transformed into deaminogleomycin, practically inactive.
  • - Bleomycin acetyltransferase is an enzyme of bacterial resistance, recently highlighted. This enzyme is capable of transferring the acetyl group of AcetylCoA onto bleomycins, producing an acetylated, inactive molecule.
  • the nucleotide sequence of the bleomycin acetyltransferase gene has been determined in Streptomyces sp. CL990 and the protein sequence was deduced therefrom. The sequence of this gene is shown in Figure 6.
  • the bacterial proteins of resistance to antibiotics of the bleomycin family act by complexing the antibiotic.
  • the genes corresponding to the proteins of this group have been isolated and cloned from different bacterial species.
  • Active derivatives can be deduced from the analysis of homoiogies.
  • these derivatives mention should be made of glycosylated derivatives or not, derivatives of the ⁇ 1et-prote ⁇ ne type when the product is of bacterial origin or else derivatives comprising an N-terminal extension, in particular a gl utam inyl radical which improves the stability of protein by cyciisation to pyroglutamyl.
  • the present invention therefore proposes to combine the administration of bleomycins by the general route, in particular parenteral, and the administration of proteins inactivating bleomycins by any mechanism, in particular one of those described below.
  • the administration of the proteins inactivating bleomycins will be kept so as to concentrate on or in certain organs, in particular by a route avoiding the systemic passage, so as to localize this activity to a determined organ on which the toxicity is concentrated.
  • the anti-tumor activity of bleomycins on the target tissues will thus not be hampered.
  • the undesirable toxic effects could be counter-square.
  • the protection of a specific organ against the toxicity of bleomycins can therefore be achieved, as soon as a route is available for the administration of proteins inactivating bleomycins.
  • bleomycin inactivating proteins should be carried out in such a way that their action is simultaneous with that of bleomycins.
  • the inactivating proteins can therefore be administered beforehand to bleomycins, so that the concentration of inactivating proteins is balanced and to impregnate the organ to be protected.
  • the administration of the inactivating proteins may be carried out at the same time as that of the bleomycins.
  • the administration of the inactivating proteins may take place after that of the bleomycins. We can of course combine these different administration kinetics.
  • One of the applications of this invention is protection against pulmonary fibrosis induced by bleomycins.
  • the administration of the proteins inactivating bleomycins will advantageously be carried out by aerosol, which ensures good pulmonary diffusion of the product.
  • Another possible approach is intra-pleural injection, which also makes it possible to reach the pulmonary nodes, inaccessible by the other routes.
  • One aspect of this invention relates to obtaining the purified, large amount of bleomycin inactivating proteins.
  • the bleomycin resistance genes have been cloned and expressed in various organisms: bacteria, yeasts (Gatignol et al., 1989, Gailiardin and Ribet, I 9SS), fungi (Durand et al. , 1987, Kolar et al., 1988, van Engelenburg et al., 1989), animal cells (Mulsant et al., 1988), plant cells (Hille et al., 1986, Perez et al., 1989) conferring on clones thus obtained high resistance to antibiotics of the bleomycin family.
  • the resistance protein is normally intracellular but after fusion with an appropriate signal peptide, it was possible to obtain the excretion of the protein in the periplasmic space of E. coli (Gatignol et al. 1988) and in the culture medium by the fungus Tolypocladium geodes (H. Durand and T. Calmels, French patent application No. 89 08838) protease-deficient and growing in a relatively simple medium. In the latter case, the selection of highly resistant clones led to extracellular Sh protein production of the order of 2 g / i in 6 days of fermentation. Such productivity, combined with the ease of purification of the Sh protein, has made it possible to envisage its large-scale production for therapeutic purposes.
  • the Sh protein can be prepared from a culture supernatant of Tolypocladium geodes transformed by the plasmid pUT720. It is purified by chromatography on an ion exchange column and on phenylsepharose in the presence of IM ammonium sulfate. After desalting by passage through a column of Sephadex G25 medium gel (Pharmacia) of successive aliquots, a solution titrating about 2 g / l of Sh protein is obtained. It is this solution which will be used for the experiment, after filtration on a membrane with a porosity of 0.2 ⁇ .
  • the Tolypocladium geodes strain was deposited at the National Collection of Microorganism Cultures, 28 rue du Dondel Roux - 0 750 15 P ⁇ RIS, under the number I 880.
  • the strain NC50 was transformed using the plasmid pUT751.
  • This plasmid is characterized by the presence, under the dependence of the promoter TR I (T. Calalmels, submitted for publication) of
  • a 200 g / l glucose beta solution was introduced continuously at the rate of 0.8 liters per 24 hours, or approximately 20 grams of glucose per liter per day.
  • the culture was harvested and centrifuged. 7 liters of a supernatant containing 8.3 g / l of total protein, of which approximately 20 ° o of Sh protein were thus obtained.
  • the supernatant was applied to a 2 l volume chromatography column filled with an anion exchange gel "Q Sepharose Fast Flow" (Pharmacia) balanced by an acetate buffer 50 m M pH 4.5.
  • the Sh protein was read with the same buffer containing 0.4 M sodium chloride. To this fraction, crystallized ammonium sulfate was added until a concentration of 1 M was obtained. The solution obtained was applied to a column of 1 L of Phenyl Sepharose Fast Flow (Pharmacia) equilibrated with acetate buffer. 50 m M pH 4.5 containing ammonium sulfate at concentration 1 ⁇ 1. After washing with the same buffer, the Sh protein was eluted with 2.5 l of buffer containing 0.6 M ammonium sulfate.
  • mice 20 female C57B46 mice (Charles River, France) aged 6 to 5 weeks and weighing 17 to 20 g were divided into 4 batches of 5 animals, marked A, B, C and D. Each batch was placed in an enclosure made of plastic and was fed and watered ad libitum throughout the duration of the experiment.
  • Lot A received no treatment and served as a control.
  • Lot B received a treatment consisting of 5 intravenous injections into the tail vein with a solution of phleomycin D l copper complex (Cayla). Each injection contained 0.45 mg of phleomycin dissolved in 100 ⁇ l of isotonic solute (sodium chloride 9 g / 1 pyrogen-free). The interval between 2 injections was 3 days.
  • Lot C received 4th same treatment with phleomycin as lot B.
  • the animals were placed for 4 hours in a plastic enclosure of 25 x 25 x 1 cm 0 in which was sprayed by a hole arranged for this purpose, the solution of Sh protein described in Example 1 above.
  • the device used for puh e ⁇ sation was a device intended to produce aerosols for the treatment of certain human ENT conditions (Atomizor, Saint Etienne, France).
  • the device tank was filled with 50 ml of Sh protein protein at the start of treatment and refilled after 2 hours.
  • the total solution consumption after a 4 hour treatment cycle was between 65 and 90 ml.
  • the mice were replaced in a normal atmosphere.
  • Lot D received 5 injections of 100 ml of isotonic solute alone, followed by treatment with an aerosol of Sh protein identical to that applied to lot C. 6 weeks after stopping treatment, ie 8 weeks after the start of experiment, the animals were sacrificed and a histological study of their lungs was carried out according to the protocol described below. One of the animals in lot B died 24 days after stopping treatment. One of the animals in batch D showed symptoms of hyper- thermia and anorexia and had to be sacrificed 4 days after the end of treatment. The histological study was also carried out on these two individuals.

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Abstract

La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins un antibiotique de la famille des bléomycines et au moins une protéine inactivant ladite ou lesdites bléomycines administrables avant, pendant et/ou après l'administration des bléomycines. Elle a pour objet de réduire les effets secondaires induits par les bléomycines au niveau de certains organes. Les protéines inactivant les bléomycines peuvent être produites par une souche de Tolypocladium geodes transformée.

Description

COMPOSITION PHARMACEUTIQUE COMPRENANT UNE OU DES BLEOMYCINES, ET UNE OU DES PROTEINES INACTIVANT LES BLEOMYCINES
La présente invention concerne une composition pharmaceu¬ tique à base d'antibiotiques de la famille des bléomycines d'une part, et de protéines inactivant les bléomycines d'autre part, dans laquelle les effets secondaires induits par les bléomycines au niveau de certains organes seront considérablement réduits.
Les bléomycines sont des antibiotiques antitumoraux décou¬ verts en 1966 (Umeza a et coll., 1966) qui sont très largement utilisés, seuls ou en association avec d'autres molécules pour le traitement des cancers. L'intérêt des bléomycines réside dans leur activité élevée contre des tumeurs variées (lymphomes, carcinomes testiculaires, carcinomes des cellules squameuses ...) et leur faible toxicité hépatique, rénale et vis à vis de la moelle osseuse qui les distinguent de la plupart des autres antitumoraux. Cependant une limitation importante à l'utilisation des bléomycines est leur toxicité pulmonaire, caractérisée par l'apparition fréquence de fibroses interstitielles irréversibles et souvent létales chez les patients traités à haute dose (J.M. Bennett et S.D. Reich, 1979). Cet effet est dose-dépendant et cumulatif ; il a pu être reproduit sur différents modèles animaux (pour revue. J.H. Harrison Jr et J.5. Lazo, 1987) les bléomycines constituent même un outil pour l'étude expérimentale des fibroses pulmonaires (I.H. Raisfeld, 1978).
Des gènes bactériens de résistance aux antibiotiques de la famille des bléomycines ont été décrits. Sous la dénomination générique phléo , ils ont été clones et incorporés dans des cellules procaryotes et eucaryotes. Cela permet d'utiliser les antibiotiques de la famille des phleomycines à titre de marqueur de sélection dans le domaine du génie génétique (brevet FR 8-V 13502) (brevet EP 85 904261-6). Le gène phléor peut être porté par un vecteur de clonage ou d'expression, ou bien intégré dans un chromosome de la cellule qui exprimera ce caractère de résistance aux phleomycines. Les gènes peuvent s'exprimer chez des procaryotes ou des eucaryotes supérieures ou inférieures, c'est-à-dire notamment chez les bactéries, les levures, les champignons, les cellules animales ou végétales. On a ainsi pu obtenir une souche recombinaπte de champignon filamenteux Tolyplocladium géodes, exprimant un gène de résistance aux phleomycines. L'adjonction en amont dudit gène d'une séquence signai fongique a permis l'excrétion de la protéine de résistance dans le milieu de culture (demande de brevet français n° 89 08838).
La présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique comprenant au moins un antibiotique de la famille des bléomycines et au moins une protéine inactivant ladite ou iesdites bléomycines administrabies avant, pendant et/ou après l'administration des bléomycines.
La terminologie bleomycine désignera ci-après aussi bien les bléomycines elles-mêmes que les giycopeptides antibiotiques de la même famille.
Il s'agit notamment des mélanges de bléomycines qui diffèrent essentiellement par la fonction aminé terminale ou des produits isolés, bleomycine A ou bleomycine B et notamment bleomycine A2, mais également des produits tels que les phleomycines, tallysomycines, platomycines, victomycines et qui sont préparés notamment à partir des microorganismes suivants : - Streptomyces verticillus ATCC 15003 (bléomycines)
- Streptomyces verticillus ATCC 21678 (bléomycines)
- Streptomyces verticillus ATCC 21890 (phleomycines)
- Streptomyces flavoridis ATCC 21892 (phleomycines)
- treptoalloteichus hindustanus ATCC 31 158 (tallysomycines) - Streptosporangium violaceochromogenes sub. sp. ATCC 21893 (platomycines) globophiium
- Streptosporangium violaceochromogenes ATCC 21807 (victomycines) - Streptomyces toyocaensis ATCC 31248 (S.F. 1771) Les antibiotiques de la famille des bléomycines, après administration par voie générale, présentent une activité élevée contre des tumeurs variées. Mais si leur toxicité hépatique, rénale, et vis à vis de la moelle osseuse est faible, les bléomycines présentent une toxicité pulmonaire élevée chez l'homme et chez certaines espèces animales. L'utilisation de protéines inactivant les bléomycines en cause permet de réduire les effets secondaires desdites bléomycines.
Il peut s'agir notamment :
- d'enzymes qui scindent les bléomycines en produits pas ou peu toxiques tels que les hydroiases,
- d'enzymes qui modifient les bléomycines en produits pas ou peu toxiques tels que les transférases,
- les protéines qui complexent les bléomycines, notamment les protéines de xation aux bléomycines.
Dans ce qui suit, on se réfère aux figures ci-anexées sur lesquelles :
La FIGURE 1 représente le gène Ble du plasmide PUB110
La FIGURE 2 représente le gène Ble Tn5 du transposon Tn5
La FIGURE 3 représente le gène B]e Sh de Streptoalloteichus hindustanus
La FIGURE représente le gène BJe 990 de Streptomyces sp CL990 La FIGURE 5 représente la comparaison des séquences protéiques de 4 protéines codées par les gènes Ble de Streptoalloteichus hindustanus (Sh), de Streptomyces sp CL99Q (S990), du plasmide pUBHO (PUB1 10) et du transposon TN5 (TN5). La FIGURE 6 représente le gène de la bleomycine acétyl tranférase de streptomyces sp CL990
La FIGURE 7 représente le plasmide PUT751 On a pu identifier des protéines inactivant les bléomycines de différents types, certaines étant isolées à partir de tissus animaux, d'autres étant codées par des gènes bactériens de résistance aux antibiotiques. - La bleomycine hydrolase a été purifiée à partir de poumons de lapin (Sebti et al. 1987). Sa présence a pu être correlée à la plus ou moins grande sensibilité de certains tissus à la toxicité des bléomycines. Son activité est élevée dans les tissus sains et dans les tumeurs résistantes aux bléomycines, dans les poumons de lapin et d'espèces résistant à la toxicité des bléomycines. Cette activité est pratiquement nulle dans les poumons et dans les tumeurs sensibles. A l'intérieur d'une même espèce, la souris, des différences de sensibilité constatées entre différentes lignées pourraient être correlées à l'activité bleomycine hydrolase pulmonaire. Son mode d'action est connu : elle agit en hydrolysant la liaison carboxamide de la partie aminoamilamide de la molécule, qui est ainsi transformée en déaminogléomycine, pratiquement inactive.
- La bleomycine acétyltransférase est une enzyme de résistance bactérienne, mise en évidence récemment. Cette enzyme est capable de transférer le groupement acétyl de l'AcetylCoA sur les bléomycines, produisant une molécule acétylée, inactive. La séquence nucléotidique du gène de la bleomycine acétyltransférase a été déterminée chez Streptomyces sp. CL990 et la séquence de la protéine en a été déduite. La séquence de ce gène est représentée sur la figure 6.
- Les protéines bactériennes de résistance aux antibiotiques de la famille des bléomycines, agissent en complexant l'antibiotique. Les gènes correspondant aux protéines de ce groupe ont été isolés et clones chez différentes espèces bactériennes. Parmi les protéines de fixation aux bléomycines, il faut citer en particulier les protéines correspondant aux protéines de la figure 5 :
- Protéine Sh,
- protéine S 990, - Protéine pUB 1 10,
- Protéine Tn 5, ainsi que leurs dérivés actifs.
Les dérivés actifs peuvent être déduits de l'analyse des homoiogies . Parmi ces dérivés, il faut citer les dérivés glycosylés ou non, les dérivés de type \1et-protéιne lorsque le produit est d'origine bactérienne ou bien des dérivés comportant une extension N-terminale notamment un radical gl utam inyl qui améliore la stabilité de la protéine par cyciisation en pyroglutamyl.
Un des gènes codant pour ce type d'enzymes est porté par le plasmide naturel pUB U O de Staphylococcus aureus (Armau et coll., 1984,
Mac Kenzie et col l., 1986), un autre par le transposon Tn5 d'Escheπchia co (Armau et coll., 1984, Genilloud et coll., 1984, Mazodier et coll., 1 985). D'autres gènes ont été clones à partir du génome d'organismes producteurs d'antibiotiques de la famille des bléomycines, comme Streptoalloteichus hindustanus (Armau et coll., 1984) ou Streptomyces sp. CL990. Les figures 1 à 4 représentent les séquences nucleotidiques des 4 gènes de résistance mentionnés ci-dessus. Ces séquences nucleotidiques, provenant d'organismes très différents, présentent très peu d'homologie. En revanche, les protéines codées par ces gènes sont assez fortement homologues sur le plan de leur structure primaire (figure 5) et sur celui de leurs propriétés physico¬ chimiques, poids moléculaires, point isoéiectπque, profil d'hydropathie.
Le mode d'actfon de la protéine codée par le gène de S_. hi ndustanus dénommée protéine Sh a été élucidé (Gatignol et coll., 1988). L'inactivation de l'antibiotique a lieu par formation d'un complexe équimolécuiaire réversible mais très fort avec la protéine. Il est probable que le mécanisme d'action des autres protéines mentionnées sur la figure 5 est identique. L'antibiotique ainsi complexé ne possède plus d'activité antimicrobienne et son action in vitro de cassure de l'ADN catalysée par l'oxygène et le fer est inhibée.
La présente invention propose donc d'associer l'administration de bléomycines par voie générale, en particulier parentérale, et l'admi¬ nistration de protéines inactivant les bléomycines par un mécanisme quelconque, notamment l'un de ceux décris ci-dessous. L'administration des protéines inactivant les bléomycines se tera de façon à se concentrer sur ou dans certains organes, notamment par une voie évitant le passage systémique, de façon à localiser cette activité à un organe déterminé sur lequel se concentre la toxicité. L'activité antitumorale des bléomycines sur les tissus cibles ne sera ainsi pas entravée. Par contre, les effets toxiques indésirables pourront être contre-carrés. La protection d'un organe déterminé contre la toxicité des bléomycines pourra donc être réalisée, dès l'instant qu'une voie est disponible pour l'administration des protéines inactivant les bléomycines.
L'administration de ces protéines inactivant les bléomycines devra être réalisée de telle sorte que leur action soit simultanée à celle des bléomycines. Les protéines inactivatrices pourront donc être admi¬ nistrées préalablement aux bléomycines, de façon a e que la concentration en protéines inactivatrices s'équilibre et à réaliser une imprégnation de l'organe à protéger. L'administration des protéines inactivatrices pourra être réalisée en même temps que celle des bléomycines.
Selon la biodisponibilité des bléomycines dans l'organe considéré, l'administration des protéines inactivatrices pourra se faire après celle des bléomycines. On pourra bien entendu combiner ces différentes cinétiques d'administration. L'une des applications de cette invention est la protection contre les fibroses pulmonaires induites par les bléomycines. L'adminis¬ tration des protéines inactivant les bléomycines sera avantageusement réalisée par voie d'aérosol, qui assure une bonne diffusion pulmonaire du produit.
Une autre voie d'abord envisageable est l'injection intra- pleuraie, qui permet en outre d'atteindre les ganglions pulmonaires, inaccessibles par les autres voies.
L'un des aspects de cette invention concerne l'obtention des protéines inactivant les bléomycines en grande quantité, purifiées. Nous avons considéré plus particulièrement la composition pharmaceutique incluant des protéines compiexant les bléomycines comme protéines inactivatrices.
Les gènes de résistance aux bléomycines, et particulièrement les gènes ble Sh et ble Tn5 ont été clones et exprimés chez différents organismes : bactéries, levures (Gatignol et coll., 1989, Gailiardin et Ribet, I 9SS), champignons (Durand et coll., 1987, Kolar et colle., 1988, van Engelenburg et coll., 1989), cellules animales (Mulsant et coll., 1988), cellules végétales (Hille et coll., 1986, Perez et coll., 1989) conférant aux clones ainsi obtenus une résistance élevée aux antibiotiques de la famille des bléomycines. La protéine de résistance est normalement intracellulaire mais après fusion avec un peptide signal approprié, on a pu obtenir l'excrétion de la protéine dans l'espace périplasmique d'E. coli (Gatignol et coll. 1988) et dans le milieu de culture par le champignon Tolypocladium géodes (H. Durand et T. Calmels, demande de brevet français n ° 89 08838) déficient en protéases et poussant dans un milieu relativement simple. Dans ce dernier cas, la sélection de clones fortement résistants a conduit à des productions de protéine Sh extracellulaire de l'ordre de 2 g/i en 6 jours de f ermentation. Une telle productivité, alliée à la facilité de purification de la protéine Sh a permis d'envisager sa production à grande échelle à des f ins thérapeutiques. Il convient d'ajouter que la construction utilisée a conduit à l'excrétion d'une protéine comportant 2 acides aminés supplémentaires : une glutamine et une alanine en N-terminal par rapport à la protéine d'origine. La présence d'un résidu glutamine en N-terminal rend, après cyclisation spontanée en pyroglutamyl, la protéine insensible à la réaction d'Edman (ce qui a été vérifié expérimentalement) ainsi qu'à l'attaque par les aminopeptidases, enzymes largement répandues dans les tissus animaux et particulièrement dans les tissus pulmonaires.
La protéine Sh peut être préparée à partir d'un surnageant de culture de Tolypocladium géodes transformé par le plasmide pUT720. On le purifie par chromatographie sur colonne échangeuse d'ions et sur phénylsepharose en présence de sulfate d'ammonium IM. Après dessalage par passage sur une colonne de gel Sephadex G25 médium (Pharmacia) d'aliquots successifs, on obtient une solution titrant environ 2 g/1 de protéine Sh. C'est cette solution qui sera utilisée pour l'expérimentation, après fi ltration sur une membrane de porosité 0,2 μ.
Son efficacité à titre de traitement préventif des fibroses pulmonaires induits par les bléomycines a été vérifiée sur un iot de souris. Ont été étudiés simultanément un lot de souris témoins ne recevant aucun trai tement, un lot de souris recevant la bleomycine seule, un lot de souris recevant la protéine Sh seule, et un lot de souris traitées à la fois par la bleomycine et la solution de protéine Sh. La bleomycine était administrée par injections IV, la solution de protéine Sh par aérosol ; on a utilisé un dispositif de pulvérisation destiné à produire des aérosols pour le traitement de certaines affections ORL, la solution de protéine Sh étant administrée immédiatement après l'injection de bleomycine, pendant 4 heures. Les animaux sont exposés au traitement par cycles répétés, et sont placés dans une atmosphère normale entre chaque cycle. Six semaines après l'arrêt du traitement, les animaux sons sacrifiés et une étude histologique de leurs poumons est réalisée. On constate une diminution significative de l'incidence des fibroses pulmonaires chez les animaux traités par la bleomycine et recevant la protéine Sh, par rapport aux animaux traités par la bleomycine seule.
L'activité protectrice de la protéine Sh a donc été démontrée.
5 II est logique de penser que des résultats similaires seront obtenus avec les protéines complexant les bléomycines telles que celles déjà identifiées, et plus généralement avec toute protéine capable d'inactiver les bléomycines, par voie enzymatique ou en les complexant.
Les exemples qui suivent concernent un mode de réalisation 10 intéressant mais il est clair au vu de ce qui précède que les protéines en cause peuvent être obtenues par des technologies qui sont connues notamment voir WO 86 01537.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer de façon non limitative cette invention. I 5
EXEMPLE 1 : Préparation de protéine Sh purifiée
La souche de Tolypocladium géodes a été déposée à la Collection Nationale des Cultures de microorganismes, 28 rue du Docteur Roux - 0 750 15 PΛRIS, sous le n° I 880.
L'obtention de clones transformants résistants à la phiéo- mycine indique que le gène codant pour la protéine Sh s'exprime dans la souche NC 0 de Tolypocladium géodes. Cependant, la protéine n'a pas pu être mise en évidence dans les surnageants de culture des souches 5 transformées et n'est donc vraisemblablement pas excrétée en quantité détectable.
Dans l'exemple*suιvant, la souche NC50 a été transformée en utilisant le plasmide pUT751. Ce plasmide se caractérise par la présence, sous la dépendance du promoteur TR I (T.Calmels, soumis à publication) du
30 gène de la protéine Sh en amont duquel a été ajoutée une séquence signal sv nthetique d'excrétion (Fιg.7). Parmi les colonies résistantes, obtenues avec une fréquence de 3000 transformants par microgramme d'ADN, une centaine ont été repiquées sur des boîtes de PDA contenant des concentrations croissantes de phléomycine, de 25 à 1000 μg/mf. 3 souches résistantes à plus de 1000 μg/ml de phléomycine ont ainsi été sélectionnées ; l'une d'elles a été cultivée en fermenteur de laboratoire dans les conditions suivantes : les spores provenant d'une boîte de PDA incubée 7 jours à 27°C ont servi à inoculer 500 ml de milieu selon Mandels contenant 20 g/1 de glucose et 1 g/1 d'extrait de levure, réparti dans deux erlenmeyers de 1 1. Après incubation 48 h sur table agitée à 27°C, 200 rpm, cette culture a permis d'inoculer un fermenteur de 14 litres de volume total (Chemap) contenant 8 l itres du même milieu. La fermentation a duré 6 jours à 27°C avec une agitation de 500 rpm et une aération de 0,5 v.v.m, le pH étant régulé supérieur à 5.0 avec de l'ammoniaque. A partir du 2ème jour, une solution btéπ le de glucose à 200 g/1 a été introduite en continu à raison de 0,8 l itres par 24 h, soit environ 20 grammes de glucose par litre et par jour. Après 6 jours, la culture a été récoltée et centrifugée. 7 litres d'un surnageant contenant 8,3 g/1 de protéines totales, dont environ 20 °o de protéine Sh ont ainsi été obtenues. Le surnageant a été appliqué sur une colonne de chromatographie de 2 1 de volume remplie avec un gel échangeur d'anions "Q Sepharose Fast Flow" (Pharmacia) équilibrée par un tampon acétate 50 m M pH 4,5. Après lavage par 4 l de tampon, puis par 4 1 du même tampon contenant du chlorure de sodium à 0,2 M, la protéine Sh a été é luée par le même tampon contenant du chlorure de sodium à la concentration de 0,4 M. A cette fraction, du sulfate d'ammonium cristallisé a été ajouté jusqu'à obtenir une concentration de l M. La solution obtenue a été appliquée sur une co onne de 1 1 de Phenyl Sepharose Fast Flow (Pharmacia) équilibrée par du tampon acétate 50 m M pH 4,5 contenant du sulfate d'ammonium à la concentration 1 \1. Après lavage par le même tampon, la protéine Sh a été éluée par 2,5 I de tampon contenant du sulfate d'ammonium à 0,6 M. Cette fraction, contenant 7,2 g de protéine dosée par la méthode de Bradford, dont plus de 95 °6 de protéine Sh 5 (estimée par électrophorèse en gel de polyacrylamide) a été dessalée par passage successif d'aliquots de 300 ml sur une colonne de 2 I de gel Sephadex G25 médium (Pharmacia) équilibrée avec une solution aqueuse de chlorure de sodium à 9 g/1. La préparation ainsi obtenue contenait 6,9 g de protéine pour un volume total de 3,55 1, soit environ 2 g/i. Cette solution a 1 0 été utilisée telle quelle, après filtration sur membrane de 0,2 μm de porosité, pour l'expérimentation sur souris décrite dans l'exemple 2 ci-apres.
EXEMPLE 2 : Expérimentation sur souris
I 5
20 souris femelles C57B46 (Charles River, France) âgées de 6 a S semaines et pesant de 17 à 20 g ont été réparties en 4 lots de 5 animaux, notés A, B, C et D. Chaque lot a été placé dans une enceinte en matière plastique et a été nourri et abreuvé ad libitum pendant toute la 0 durée de l'expérimentation.
Le lot A n'a reçu aucun traitement et servait de témoin.
Le lot B a reçu un traitement consistant en 5 injections intraveineuses au niveau de la veine de la queue d'une solution de phléomycine D l complexe cuivπque (Cayla). Chaque injection contenait 0,4 5 mg de phléomycine dissous dans 100 μl de soluté isotonique (chlorure de sodium à 9 g/1 apyrogène). L'intervalle entre 2 injections était de 3 jours.
Le lot C a reçu 4e même traitement par la phléomycine que le lot B. De plus, i mmédiatement après chaque injection, les animaux étaient places pendant 4 heures dans une enceinte en plastique de 25 x 25 x 1 cm 0 dans laquelle était pulvérisé par un trou aménagé à cet effet, la solution de ι protéine Sh décrite dans l'exemple 1 ci-dessus. Le dispositif utilisé pour la puh eπsation était un appareil destiné à produire des aérosols pour le traitement de certaines affections ORL humaines (Atomizor, Saint Etienne, France). Le réservoir de l'appareil était rempli par 50 ml de solution de protéine Sh au début du traitement et à nouveau rempli après 2 heures. La consommation totale de solution après un cycle de 4 heures de traitement était comprise entre 65 et 90 ml. A la fin de chaque cycle de traitement, les souris étaient replacées en atmosphère normale.
Le lot D a reçu 5 injections de 100 ml de soluté isotonique seul, suivies d'un traitement par aérosol de protéine Sh identique à celui appliqué au lot C. 6 semaines après l'arrêt du traitement, soit 8 semaines après le début de l'expérimentation, les animaux ont été sacrifiés et une étude histologique de leurs poumons a été pratiquée selon le protocole décrit ci-après. L'un des animaux du lot B est décédé 24 jours après l' arrêt du traitement. L'un des animaux du lot D présentait des symptômes d'hyper- thermie et d'anorexie et a dû être sacrifié 4 jours après la fin du traitement. L'étude histologique a également été pratiquée sur ces deux individus.
Etude histologique
Après sacrifice de l'animal par injection d'une solution de pentobarbital de sodium (2 mg), 1 ml d'une solution de formaiine à 10 % dans un tampon phosphate 0,1 M pH 7, 1 a été injecté dans la trachée. Puis les poumons ont été prélevés et immergés dans la même solution fixatrice pendant 24 heures ou plus. Après inclusion des organes ainsi fixés dans la parafine, des coupes de 5 μm d'épaisseur ont été pratiquées au microtome : les sections ont été placées sur des lames pour observation microscopique et colorées par le réactif au trichome selon Mallory. L'observation de ces coupes au microscope optique (grossissement 10X et 50X) a permis, par comparaison avec des organes d'animaux sains d'attribuer une "note" correspondant à la gravité des lésions (les tissus atteints de fibrose étant plus fortement colorés et présentant des hétérogénéités de coloration). Ces notes sont les suivantes :
0 : pas de fibrose
1 : légère atteinte fibrotique
2 : atteinte modérée
3 : forte atteinte
4 : très forte atteinte
Les résultats obtenus sur les 20 animaux observés sont résumés dans le tableau ci-après.
Il a donc été constaté une diminution significative de l ' incidence des fibroses pulmonaires chez les animaux traités par la phléomycine et recevant la protéine Sh par voie aérosol, par rapport aux animaux traités par la phléomycine seule. Parmi ces derniers, l'un des indiv idus (B3) est décédé 24 jours après l'arrêt du traitement, très probablement des suite d'une très forte atteinte fibrotique. La cause de la maladie ayant nécessité le sacrifice de l'individu 4 du lot D n'a pas pu être déterminée, mais l'examen histologique pulmonaire était normal.
Figure imgf000016_0001
Individu décédé 24 jours après l'arrêt du traitement Individu sacrifié 4 jours après l'arrêt du traitement REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Perez et col l. 1989. Plant. Mol. Biol. 13 : 365-373.

Claims

REVENDICATIONS
1 ) Composition pharmaceutique comprenant au moins un antibiotique de la famille des bléomycines et au moins une protéine inactivant la dite ou lesdites bléomycines administrable avant, pendant et/ou après l'administration des bléomycines.
2) Composition pharmaceutique selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est choisie parmi :
- les enzymes qui scindent les bléomycines en produits pas ou peu toxiques.
- les enzymes qui modifient les bléomycines en produits pas ou peu toxiques.
- les protéines qui complexent les bléomycines.
3) Composition pharmaceutique selon la revendication 2, caractérisée en ce que les protéines inactivant les bléomycines sont choisies parmi :
- les bléomycines hydrolases - les bléomycines transférases
- les protéines de fixation aux bléomycines.
4) Composition pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est une protéine de résistance aux bléomycines, d'origine bactérienne.
5) CompositionΛpharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est une bleomycine acétyl transférase.
6) Composition pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est une bléomvcine hvdrolase. 7) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications I à 6, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est une protéine recombinante.
8) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications
1 à 4 et 7, - caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est choisie parmi les protéines suivantes décrites à la figure 5.
- Protéine Sh
- Protéine S 990 - Protéine PUB 1 10
- Protéine TN5 et leurs dérivés inactivant les bléomycines.
9) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications I à S, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est produi te par une souche de Tolypocladium géodes transformée.
10) Composition pharmaceutique caractérisée selon la reven¬ dication 9, caractérisée en ce que la souche de Tolypocladium géodes est transformée par le plasmide pUT751 et produit la protéine Sh.
I l ) Composition pharmaceutique selon l'une des revendica¬ tions 9 et 10, caractérisée en ce que la protéine Sh est purifiée à partir du milieu de culture de T. géodes.
12) Composition pharmaceutique selon l'une des revendi¬ cations l à 1 1, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est administrée de façon à se concentrer sur ou dans certains organes.
13) Composition pharmaceutique selon la revendication 12, caractérisée en ce que les protéines inactivant les bléomycines sont administrées par voie aérosol. 14) Composition pharmaceutique selon la revendication 12, caractérisée en ce que les protéines inactivant les bléomycines sont administrées par voie intrapleurale.
15) Composition pharmaceutique selon l'une des revendica¬ tions 1 à 14, caractérisée en ce que la bleomycine est administrée par voie systémique.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP0667164A1 (fr) * 1994-02-10 1995-08-16 MUCOS EMULSIONSGESELLSCHAFT m.b.H. Utilisation d'enzyme hydrolytique pour réduire ou empêcher les effets secondaires de la bléomycine
US20210244805A1 (en) * 2020-02-11 2021-08-12 University Of South Carolina Pharmaceutical for prevention of bleomycin-induced pulmonary fibrosis

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Chemical Abstracts, volume 110, no. 1, 2 janvier 1989, (Columbus, Ohio, US), J.S. Lazo et al.: "Pulmonary metabolic inactivation of bleomycin and protection from drug-induced lung injury", voir page 4, résumé 92w, & Dev. Oncol. 1988, 53 (Organ Directed Toxic. Anticancer Drugs), 128-39 *

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