JP2000175698A

JP2000175698A - ピラノースオキシダーゼを含有するピラノース測定用試薬

Info

Publication number: JP2000175698A
Application number: JP10357423A
Authority: JP
Inventors: Yoshimitsu Takakura; 由光高倉; Shigeru Kuwata; 茂桑田; Shozo Ota; 象三太田; Satoru Usami; 悟宇佐美
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1998-12-16
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2000-06-27

Abstract

(57)【要約】【課題】糖類、特にグルコースの測定試薬、例えば血
糖値の検査薬、より具体的には糖尿病の診断薬として有
用な新規なピラノースオキシダーゼを同定し、さらに遺
伝子組み換え技術を適用して本酵素を大量に、安価に、
効率的に得ることができるように、本酵素タンパク質を
コードするＤＮＡ配列を特定すること。【解決手段】マツタケの水性抽出液から硫安沈殿法で
沈殿する画分から得ることができ、少なくともイネ紋枯
病菌またはイネイモチ病菌に対する抗菌活性を有し、ゲ
ル濾過法による分子量が約２１０ｋＤであり、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ法では約５０ｋＤと約１５ｋＤの成分の存在を
示し、中性水溶液中で６０℃１０分間の加熱により上記
抗菌活性が保持され、中性水溶液中で８０℃１０分間の
加熱により上記抗菌活性が失活することを特徴とするピ
ラノースオキシダーゼを含む、ピラノース測定用試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グルコース並びに
他のアルドピラノースの酵素的測定法に有用なピラノー
スオキシダーゼ、より具体的には上記ピラノースオキシ
ダーゼを含むピラノース測定用の試薬、並びに上記試薬
を使用するピラノースの測定方法および糖尿病などの糖
類の代謝異常を伴う疾患の診断方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ピラノースオキシダーゼ（pyranose: ox
ygen 2-oxidoreductase, EC 1.1.3.10）は、Ｄ-グルコ
ースや他のアルドピラノースの２位の炭素を酸化し、２
−ケト産物と過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素
である。

【０００３】本酵素はある抗生物質の生成（Koths et a
l.(1992) Carbohydr. Res. 232: 59-75）や、フルクト
ースの工業生産（Shaked and Wolfe (1988) Methods En
zymol137: 599-615）への応用可能性が述べられてい
る。また本酵素は、グルコースバイオセンサーとしての
実用的価値が知られている。本酵素によって生成した過
酸化水素を、パーオキシダーゼやカタラーゼなどを共役
させてから適切な発色系に供するなどして定量すること
により、試料中のグルコースの酵素的な測定を行うこと
ができる。具体的には食品や体液などのグルコースの測
定に用いることができる。特に、糖尿病診断検査などの
臨床場面においては、血糖の検査法として既に応用され
ている。

【０００４】従来から使用されているグルコースオキシ
ダーゼと比較して、本酵素の利点としては、基質親和性
が高いこと（Nishimura et al. (1996) J. Biotechnol.
52:11-20）、並びにβ-Ｄ-グルコースのみならず同時
にα-Ｄ-グルコースにも作用するので、ムタロターゼを
加える必要のないこと（Taguchi et al. (1985) J. App
l. Biochem.7: 289）が挙げられる。さらに、本酵素
は、糖尿病の血糖コントロールマーカーとして注目され
ている1,5-アンヒドログルシトールを基質とすることが
近年になって判明し（Yabuuchi et al. (1989) Clin. C
hem. 35: 2039-2043）、糖尿病の診断薬としても有用で
あることが期待される。

【０００５】本酵素はこれまでに様々な担子菌から精製
され、その酵素学的特性が解析されているが、本酵素を
コードする遺伝子の単離は、カワラタケ（Coriolus ver
sico lor）からの単離例があるのみである（特願平7-124
835）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、糖類、特にグルコースの測定試薬、例えば
血糖値の検査薬、より具体的には糖尿病の診断薬として
有用な新規なピラノースオキシダーゼを同定し、さらに
遺伝子組み換え技術を適用して本酵素を大量に、安価
に、効率的に得ることができるように、本酵素タンパク
質をコードするＤＮＡ配列を特定することである。即
ち、本発明の目的の一つは、新規なピラノースオキシダ
ーゼを同定してピラノース測定用試薬を提供することで
ある。また、本発明の別の目的は、本発明によるピラノ
ースオキシダーゼを含むピラノース測定用試薬を使用す
るピラノースの測定方法並びに糖類の代謝異常を伴う疾
患の診断方法を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
の手段として、本発明者は先ず、植物病原菌に対してin
vitroで抗菌的作用を持つタンパク質のアッセイ系を確
立し、食用キノコの一つであるマツタケからタンパク質
を抽出し、イオン交換カラムとゲル濾過カラムとを組み
合わせて、各画分を上記アッセイ系に供試することによ
り、抗菌的タンパク質画分を同定、そのタンパク質を分
離・精製した。次いで、この精製タンパク質のＮ末端ア
ミノ酸配列を決定し、この配列に関してデータベースサ
ーチを実施したところ、カワラタケ（Coriorus versico
lor）のピラノースオキシダーゼと相同性を有すること
が判明した。そこで精製したタンパク質のピラノースオ
キシダーゼ活性を測定したところ、実際に強い活性が検
出され、本発明を完成するに至った。

【０００８】さらにまた、決定された部分アミノ酸配列
をもとにオリゴＤＮＡを合成し、ＲＴ−ＰＣＲにより当
該タンパク質をコードする部分長ｃＤＮＡを得た。次い
で、これをプローブとしてマツタケｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングすることにより当該タンパク質をコ
ードする完全長のｃＤＮＡを同定し、全塩基配列を決定
した。こうしてマツタケ由来ピラノースオキシダーゼの
全アミノ酸配列と、それをコードする遺伝子のＤＮＡ配
列を同定し、本発明を完成させた。

【０００９】本発明の第１の側面によれば、マツタケの
水性抽出液から硫安沈殿法で沈殿する画分から得ること
ができ、少なくともイネ紋枯病菌またはイネイモチ病菌
に対する抗菌活性を有し、ゲル濾過法による分子量が約
２１０ｋＤであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法では約５０ｋＤ
と約１５ｋＤの成分の存在を示し、中性水溶液中で６０
℃１０分間の加熱により上記抗菌活性が保持され、中性
水溶液中で８０℃１０分間の加熱により上記抗菌活性が
失活することを特徴とするピラノースオキシダーゼを含
む、ピラノース測定用試薬が提供される。

【００１０】本発明におけるピラノースオキシダーゼは
好ましくは、以下の酵素学的性質を有する；（１）基質特異性：Ｄ（＋）−グルコース、１，５−ア
ンヒドロ−Ｄ−グルシトール、Ｌ（−）−ソルボース、
Ｄ（＋）−キシロース、トレハロース、Ｄ（＋）−ガラ
クトースおよびマルトースを基質とし、マンノース、マ
ンニトール、Ｄ（−）−フルクトース、Ｄ−ソルビトー
ル、シュークロース、Ｄ（−）−アラビノースおよびＮ
−アセチル−Ｄ−グルコサミンを基質としない；（２）最適温度：約５０℃が最適温度であり、４０〜６
０℃の範囲では８０％以上の酵素活性が保持される；（３）温度安定性：各温度で３０分間保温した後の残存
活性は、３０〜５０℃の温度では９５％以上、５５〜６
０℃の温度では約５０％、６０〜７０℃の温度では３０
〜４０％；（４）最適ｐＨ：ｐＨ７．５〜８．０が最適ｐＨであ
り、ｐＨ６．５〜９．０の範囲では８０％以上の酵素活
性が保持される；（５）ｐＨ安定性：各ｐＨで５０℃で３０分間保温した
後の残存活性が８０％以上である安定ｐＨ領域は７．０
から１１．０；

【００１１】好ましくは、本発明におけるピラノースオ
キシダーゼの約５０ｋＤの成分は配列表の配列番号３に
記載のＮ末端アミノ酸配列：His Glu Ile Val His Tyr
ThrAsp Val Phe Ile Ala Gly Ser Gly Pro Ile Ser Xaa
Thr Tyr Ala Arg His IleIle Asp Asn Thr Ser Thr Th
r：を有し、約１５ｋＤの成分は配列表の配列番号４に
記載のＮ末端アミノ酸配列：Arg Glu Trp Glu Ala Gly
Val Thr Asp Thr Tyr Gly Met Pro Gln Pro Thr Phe Hi
s Val Lys Arg Thr Asn Ala Asp Gly Asp Arg Asp Gln
Arg Met Met Asn Asp Met Thr Asn Val Ala Asn Met Le
u Gly Gly Tyr Leu Pro Gly Ser Tyr Pro Gln Phe Met
Ala Pro Gly Leu Val Leu His Ile Thr Gly Thrを有す
る。

【００１２】好ましくは、本発明におけるピラノースオ
キシダーゼは、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
列；この配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有する
アミノ酸配列；またはこの配列と５０％以上、好ましく
は６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ま
しくは８０％以上、特に好ましくは９０％、最も好まし
くは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有す
る。

【００１３】本発明の第２の側面によれば、配列表の配
列番号２の部分アミノ酸配列１−２５からなるポリペプ
チド：部分アミノ酸配列２６−４３５からなるポリペプ
チド：部分アミノ酸配列４３６−５６４からなるポリペ
プチド：部分アミノ酸配列１−４３５からなるポリペプ
チド：及び部分アミノ酸配列２６−５６４からなるポリ
ペプチド：並びに上記アミノ酸配列の何れかの中に１〜
複数個のアミノ酸変異を有するポリペプチドおよび上記
アミノ酸配列の何れかと５０％以上の相同性を有するア
ミノ酸配列を有するポリペプチド；の単独又は何れかの
ポリペプチドの組み合わせから成るピラノースオキシダ
ーゼを含む、ピラノース測定用試薬が提供される。

【００１４】本発明において、ピラノースは好ましく
は、Ｄ（＋）−グルコース、１，５−アンヒドロ−Ｄ−
グルシトール、Ｌ（−）−ソルボース、Ｄ（＋）−キシ
ロース、トレハロース、Ｄ（＋）−ガラクトースまたは
マルトースから選択され、最も好ましくはピラノースは
Ｄ（＋）−グルコースである。本発明のピラノース測定
用試薬は、例えば、糖類の代謝異常を伴う疾患の診断薬
として使用することができ、特には糖尿病の診断薬とし
て使用することができる。

【００１５】本発明の第３の側面によれば、本発明のピ
ラノース測定用試薬を試料中のピラノースと反応させ、
生成する過酸化水素を酵素と反応させて発色させること
を含む、試料中のピラノースの測定方法が提供される。

【００１６】本発明の第４の側面によれば、本発明のピ
ラノース測定用試薬を被験者から採取した試料中のピラ
ノースと反応させ、生成する過酸化水素を酵素と反応さ
せて発色させることを含む、糖類の代謝異常を伴う疾患
（例えば、糖尿病）の診断方法が提供される。

【００１７】本発明の第５の側面によれば、本発明のピ
ラノース測定用試薬を含む、ピラノース分析用あるいは
糖類の代謝異常を伴う疾患の診断用のキットが提供され
る。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下に本発明のより詳細な態様を
説明する。本発明におけるピラノースオキシダーゼは、
マツタケからの抗菌タンパク質の分離・精製過程で、得
られたものであるが、本明細書に記載した特徴を有する
限り、その起源、製法などは限定されず、天然産のタン
パク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現
させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れ
でもよい。

【００１９】本発明におけるピラノースオキシダーゼは
典型的には、配列表の配列番号２に記載の５６４個のア
ミノ酸配列を有する。しかし、天然のタンパク質の中に
はそれを生産する生物種の品種の違いや、生態型の違い
による遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの
存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有す
る変異タンパク質が存在することは周知である。なお、
本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、１以上
のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などを意
味する。本発明におけるピラノースオキシダーゼは、ク
ローニングされた遺伝子の塩基配列からの推測に基づい
て、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するが、その
配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではな
く、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同
タンパク質を含むことが意図される。相同性は少なくと
も５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは
７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好まし
くは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。

【００２０】一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同
士の置換（例えば、疎水性アミノ酸同士の置換、親水性
アミノ酸同士の置換、酸性アミノ酸同士の置換または塩
基性アミノ酸同士の置換）を導入した場合、得られる変
異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有するこ
とが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所
望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当
業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明
の範囲に含まれる。

【００２１】本発明のピラノースオキシダーゼは、SDS
−PAGEで分子量が約50ｋＤ（配列表の配列番号２の配列
のうち第26番目から第435番目のアミノ酸配列からなる
ポリペプチドに相当）、および15ｋＤ（第436番目から
第564番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドに相
当）と見積もられる２つのポリペプチドから成り、ゲル
濾過カラムで分子量が約210ｋＤと推定されることを特
徴とするタンパク質として同定された。しかしながら、
配列番号２のうち第１番目から第25番目のアミノ酸配列
からなるポリペプチドもこのタンパク質の一つのサブユ
ニットとなっている可能性は残る。

【００２２】本発明におけるピラノースオキシダーゼ
は、例えば後述の実施例に従ってマツタケ子実体から硫
安沈殿法およびイオン交換カラムクロマトグラフィー等
を用いて精製することができる。即ち、細粉化したマツ
タケをマツタケを緩衝液で抽出した後、ろ過し、その上
清に硫安（硫酸アンモニウム）を好適な濃度、例えば、
７５％飽和になるまで添加して静置することにより本発
明のタンパク質を含む沈殿が得られる。この沈殿をさら
に透析した後、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、
塩濃度のグラジェント（例えば、塩化ナトリウムで５０
ｍＭから１Ｍ）で溶出し、所望のタンパク質を含む画分
を回収すればよい。

【００２３】あるいは、本発明によるピラノースオキシ
ダーゼは、本発明によるマツタケピラノースオキシダー
ゼをコードする配列表の配列番号１のＤＮＡ配列のう
ち、第101番目から第1792番目の配列であることを特徴
とするＤＮＡ配列、第176番目から第1792番目の配列で
あることを特徴とするＤＮＡ配列、あるいは、第176番
目から第1405番目の配列であるＤＮＡ配列、第1406番目
から第1792番目の配列であるＤＮＡ配列、またはこれら
の両方を、大腸菌や酵母、あるいはカイコの幼虫などの
昆虫やアフリカツメガエル等のある種の動物細胞に、そ
れぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入、
発現させることによっても得ることができると考えられ
る。

【００２４】発現ベクターは、発現させるタンパク質が
そのままの形で生産させるもの、あるいはそのＮ末端ま
たはＣ末端にヒスチジンのタグが付加された形で生産さ
れるもの、あるいはＮ末端またはＣ末端にマルトース結
合タンパク質やＧＳＴペプチドが融合された形で生産さ
れるものなどから、適宜選択される。

【００２５】本発明の遺伝子が組込まれた発現ベクター
の宿主細胞への導入（形質転換（形質移入））は従来公
知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（E.
col i、Bacillus subtilis等）の場合は、例えばCohen
らの方法（Proc.Natl.Acad.Sci. USA.、第６９巻、第２
１１０頁、１９７２年）、プロトプラスト法（Mol.Gen.
Genet.、第１６８巻、第１１１頁、１９７９年）やコン
ピテント法（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（J.Mol.Biol.）、第５６巻、第２０９頁、１９
７１年）によって、酵母（Saccharomyces cerevisiae、
Pichia postoris等）の場合は、例えばハイネン（Hinne
n）らの方法（Proc.Natl.Acad.USA.、第７５巻、第１９
２７頁、１９７８年）やリチウム法（J.Bacteriol.、第
１５３巻、第１６３頁、１９８３年）によって、動物細
胞の場合は、例えば、グラハム（Graham）の方法（バイ
ロロジー（Virology）、第５２巻、第４５６頁、１９７
３年）によって、昆虫細胞の場合は、例えば、サマーズ
（Summers）らの方法（Mol.Cell.Biol.、第３巻、第２
１５６〜第２１６５頁、１９８３年）によってそれぞれ
形質転換することができる。

【００２６】本発明のタンパク質は、上記の如く調整さ
れた発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養
することによって発現（生産）することができる。栄養
培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素
源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが
好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキス
トラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが例
示されるが、本発明のピラノースオキシダーゼの基質と
なる栄養を使用した場合、過酸化水素が発生し、これが
宿主細胞の性質に影響を及ぼすことも予想される。無機
窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウ
ム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカ
ー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイシ
ョ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養
素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カル
シウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウ
ム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリ
ン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）な
ど）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知ら
れている方法により行われる。培養条件、例えば温度、
培地のｐＨ及び培養時間は、本発明のタンパク質が大量
に生産されるように適宜選択される。

【００２７】なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる
具体的な培地及び培養条件を例示するが、何らこれらに
限定されるものではない。宿主が細菌、放線菌、酵母、
糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培
地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地
としてＬＢ培地、Ｍ９培地（ミラー（Miller）ら、Exp.
Mol.Genet.、Cold Spring Harbor Laboratory、第４３
１頁、１９７２年）等が例示される。かかる場合、培養
は、必要により通気、攪拌しながら、通常１４〜４３
℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主が、Bacill
us属菌の場合、必要により通気、攪拌しながら、通常３
０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。

【００２８】宿主が酵母である場合、培地として、例え
ばBurkholder最小培地（ボスチアン（Bostian）、Proc.
Natl.Acad.ScI.USA.、第７７巻、第４５０５頁、１９８
０年）を挙げることができ、ｐＨは５〜８であることが
望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４
時間行われ、必要により通気や攪拌を行うこともでき
る。宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２
０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（サイエンス（Scie
nce）、第１２２巻、第５０１頁、１９５２年）、ＤＭ
ＥＭ培地（バイロロジー（Virology）、第８巻、第３９
６頁、１９５９年）、ＲＰＭＩ１６４０培地（J.Am.Me
d.Assoc.、第１９９巻、第５１９頁、１９６７年）、１
９９倍地（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、第７３巻、第１
頁、１９５０年）などを用いることができる。培地のｐ
Ｈは約６〜８であることが好ましく、培養は通常３０〜
４０℃で約１５〜７２時間行われ、必要により通気や攪
拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば
胎児牛血清を含むGrace's培地（Proc.Natl.Acad.Sci. U
SA.、第８２巻、第８４０４頁、１９８５年）などを挙
げることができ、そのｐＨは約５〜８であることが好ま
しい。培養は通常約２０〜４０℃で１５時間〜１００時
間行われ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。

【００２９】本発明のタンパク質は、上記培養により得
られる培養物より以下のようにして取得することができ
る。すなわち、本発明のタンパク質が宿主細胞内に蓄積
する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細
胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０ｍＭ
〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用い
る緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲
が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方
法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を
得る。一方、本発明のタンパク質が宿主細胞外に分泌さ
れる場合には、遠心分離や濾過などの操作により宿主細
胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、
あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を
行った後に、本発明のタンパク質の精製、単離に供する
ことができる。精製・単離の方法としては、以下の方法
を挙げることができる。即ち、当該タンパク質に６×ヒ
スチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパク質といった
タグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれ
のタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによ
る方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを
付けずに本発明のタンパク質を生産した場合には、例え
ば後述する実施例に詳しく述べられている方法、即ちイ
オン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることが
できる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマト
グラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わ
せる方法も挙げることができる。

【００３０】本発明のタンパク質、即ち配列表の配列番
号３のアミノ酸配列をＮ末端側の配列として有すること
を特徴とする、SDS-PAGEで分子量がおよそ50ｋＤのタン
パク質と、配列表の配列番号４のアミノ酸配列をＮ末端
側の配列として有することを特徴とする、SDS-PAGEで分
子量がおよそ15ｋＤのタンパク質が結合した、ゲル濾過
カラムで分子量がおよそ210ｋＤと推定されることを特
徴とするタンパク質は、強いピラノースオキシダーゼ活
性を持つ。

【００３１】本タンパク質のピラノースオキシダーゼ活
性は25.78 U/mgであり、従来報告されているPolyporus
obtususからのピラノースオキシダーゼ（Janssen and R
uelius (1975) Methods Enzymol. 41: 170-173）、ある
いはCoriolus versicolor由来のピラノースオキシダー
ゼ（Nishimura et al. (1996) J. Biotechnol. 52: 11-
20）よりも２倍程度強く、Phanerochaete chrysosporiu
m由来のピラノースオキシダーゼ（Artolozaga et al.
(1997) Appl. Microbiol. Biotechnol. 47: 508-514）
と同程度の活性を有する。

【００３２】またマツタケピラノースオキシダーゼは、
グルコースの他、1,5-アンヒドログルシトールをよい基
質とし、ソルボースやキシロース、およびトレハロー
ス、ガラクトース、マルトースも基質とすることが明ら
かとなった。Polyporus obtusu sのピラノースオキシダ
ーゼとの比較では、マツタケピラノースオキシダーゼは
特に1,5-アンヒドログルシトールに対する活性が約1.6
倍高かった。

【００３３】マツタケピラノースオキシダーゼのグルコ
ースに対するKmは1.28mM、1,5-アンヒドログルシトール
に対するKmは10.7mMと算出された。このことから、マツ
タケピラノースオキシダーゼは、グルコースの測定のみ
ならず、近年、糖尿病の診断用マーカーとして注目され
ている1,5-アンヒドログルシトールの酵素的測定にも特
に有効であることが示された。

【００３４】マツタケピラノースオキシダーゼの最適温
度は50℃付近であり、40℃〜60℃の範囲では80％以上の
酵素活性を有していた。また温度安定性（30分間）は50
℃付近までであった。50℃までは95％以上の活性を保持
しているが、55〜60℃では約半分、それ以上の温度では
30〜40％の残存活性を示した。

【００３５】マツタケピラノースオキシダーゼの最適pH
は7.5〜8.0付近であり、pH6.5〜9.0の範囲では80％以上
の酵素活性を有していた。また安定ｐＨ領域（50℃で30
分間）はpH7.0〜11.0であった。マツタケピラノースオ
キシダーゼを-20℃で凍結させた後の残存活性は、凍結
融解前の活性を100％とした場合、78％であった。マツ
タケピラノースオキシダーゼは、Polyporus obtususピ
ラノースオキシダーゼと比較して、グルコースに対する
Km、温度安定性、ｐＨ安定性はほぼ同じ値を示すが、1,
5-アンヒドログルシトールに対する作用性とＫｍ、およ
び凍結融解安定性に優れていた。

【００３６】以上の酵素学的諸性質は、配列表の配列番
号２の配列のうち第26番目から第435番目のアミノ酸配
列からなるポリペプチドと、第436番目から第564番目の
アミノ酸配列からなるポリペプチドがある一定の数で結
合したタンパク質においても、当然のことながら保持さ
れていることが期待される。本発明のマツタケ由来のピ
ラノースオキシダーゼは、強い酵素活性を有することか
ら、従来のピラノースオキシダーゼと比較して、より少
ない量の酵素でグルコース測定が可能となる。また、1,
5-アンヒドログルシトールに対するKmが低く、作用性も
従来のものよりも高いことから、糖尿病の診断薬として
特に有効に用いられることが可能である。

【００３７】本発明のマツタケ由来タンパク質およびそ
の遺伝子について、データベースＤＤＢＪのＢＬＡＳＴ
による相同性検索を行うと、カワラタケのピラノースオ
キシダーゼと相同性を示す。マツタケ由来タンパク質
と、カワラタケのピラノースオキシダーゼについてタン
パク質の全アミノ酸配列、および遺伝子の全塩基配列を
比較すると、それぞれ35％、46％の相同性を示す。ま
た、これ以外で相同性のある配列は存在していないこ
と、さらにマツタケからのピラノースオキシダーゼの精
製・単離報告は未だないことから、本タンパク質は新規
なピラノースオキシダーゼであると考えられる。

【００３８】本発明によってこのタンパク質のアミノ酸
配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれ
ば、この配列またはその一部を利用して、ハイブリダイ
ゼーションや、ＰＣＲという遺伝子工学の基本的手法を
用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子が単離され得る。このような場
合、ピラノースオキシダーゼ活性を有する当該タンパク
質を使用することも本発明の範囲に含まれる。

【００３９】本発明のピラノース測定用試薬は、ピラノ
ースオキシダーゼを必須成分として含むものであり、そ
の他の成分は特に限定されず、当分野で慣用される任意
の添加剤を所望により含んでいてもよい。そのような添
加剤の例としては、緩衝剤（例えば、リン酸塩、酢酸
塩、炭酸塩、トリス塩酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩な
ど）、溶解補助剤（例えば、トリトンＸ−１００、Noni
det Ｐ−４０など）、安定化剤（例えば、グリセリン、
牛血清アルブミン、α−又はβ−シクロデキストリンな
ど）、補酵素ＦＡＤが挙げられる。

【００４０】本発明のピラノース測定用試薬は、乾燥物
の形態または溶解した形態の何れでも使用することがで
き、薄膜状の担体、例えばシート、含浸性の紙などに含
浸させて用いてもよい。

【００４１】上記の通り、本発明によれば、本明細書中
上記したような特徴を有するピラノースオキシダーゼを
含む、ピラノース測定用試薬が提供される。本発明の試
薬ををピラノースを含む試料と接触させて、当該試料中
のピラノースとピラノースオキシダーゼとを反応させる
と過酸化水素が生成する。この過酸化水素をパーオキシ
ダーゼまたはカタラーゼと反応させて、パーオキシダー
ゼの場合は、４−アミノアンチピリンとフェノール類と
の縮合反応により生じるキノン色素を、カタラーゼの場
合は、まずメタノール類と反応させてホルムアルデヒド
とし、これをアセチルアセトンを用いてHantzsch反応で
lutidine誘導体とし、生じた黄色色素を定量することで
試料中のピラノース量を測定することができる。

【００４２】試料は、血漿、血清、尿、または他の体液
から選択することができ、また、このような生物学的試
料に限定されるわけではなく、化学製品や食料品などの
産業上または商業上の製品に由来する試料に適用するこ
ともできる。上記のようなピラノースオキシダーゼによ
るピラノースの測定方法は当業者に周知であり、例え
ば、Machida and Nakanishi (1984) Agric.Biol.Chem.4
8:2463-2470、あるいは佐々木禎一（１９８４）臨床検
査ＭＯＯＫ１８：１３−２８などに記載されている。

【００４３】本発明によるピラノース測定方法の一例に
ついて以下に説明する。これは典型的なピラノースオキ
シダーゼ／パーオキシダーゼ反応を利用した測定法で、
ピラノースとピラノースオキシダーゼによって生じた過
酸化水素を、パーオキシダーゼ存在下の４−アミノアン
チピリンとフェノールとの縮合反応で赤色キノン色素と
して測定する。先ず、ピラノースを含む試料に、１〜４
０ｍＵ／ｍｌ、好ましくは５〜２０ｍＵ／ｍｌの本発明
のピラノース測定用試薬、０．２〜３ｍＭ、好ましくは
０．４〜１．６ｍＭの４−アミノアンチピリン、０．２
〜１２ｍＭ、好ましくは０．４〜１．６ｍＭのフェノー
ル、および０．２〜１０Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜２Ｕ
／ｍｌのパーオキシダーゼの含まれたｐＨ６．５〜１
０、好ましくはｐＨ７．５〜８．０の適切な緩衝液を加
え、温度３５〜６０℃、好ましくは４５〜５５℃におい
て、３〜２０分間、好ましくは５〜１０分間反応させ
る。次に、生成したキノン色素の発色の度合いを比色計
などを用いて５００〜５１０ｎｍで吸光度を測定する。
最後に、予め測定しておいた既知の濃度のピラノースを
含む標準品の吸光度の値と、試料を用いて得た吸光度と
を対比することによって試料中のピラノース濃度を算出
する。

【００４４】本発明によれば、ピラノース分析用あるい
は糖類の代謝異常を伴う疾患の診断用のキットが提供さ
れる。キットの成分としては、（１）本発明のピラノー
ス測定用試薬、（２）試料と当該ピラノース測定用試薬
との反応のための緩衝液、（３）発色反応のために使用
する酵素（例えば、パーオキシダーゼ、カタラーゼな
ど）、並びに（４）発色反応用の基質（例えば、４−ア
ミノアンチピリンとフェノールなど）などが含まれる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明は実施例によって限定されることはない。

【００４５】

【実施例】実施例１：アッセイ系の構築１）検定系の確立病原菌の培養：イネいもち病菌（菌株TUS-1、レース33
7；農水省東北農業試験場より分譲）はオートミル培地
（Difco社製，1%ショ糖添加）上で培養して分生胞子を
得た。胞子液は10%グリセロールを加えて、-80℃で保存
した。イネ紋枯病菌（菌株JT872）は１／２ジャガイモ
煎汁培地（PD培地：Difco社製）で2日間培養し、5mm程
度の菌糸塊を3個をテフロンホモジナイザーで1/2PD培地
とともに軽く磨砕して得られた断片化菌糸を接種源とし
た。

【００４６】上記の接種源を96穴マイクロタイタープレ
ート（コーニング社製）に１ウエル当たりいもち病菌分
生胞子は約1,000個、紋枯病菌は断片化菌糸は約300個に
なる様に100μlの1/2PD培地とともに加え、28℃の恒温
器で培養した。菌の増殖はマイクロプレートリーダー
（Bio-Rad社製Benchmark）で595nmの吸光度を測定し
た。菌の増殖に対する塩や緩衝液の影響を、培地にNaCl
やリン酸緩衝液、Tris緩衝液、Hepes緩衝液、牛血清ア
ルブミン、ジチオスレイトールなどを一定量加えて判定
した。

【００４７】２）マツタケからのタンパク質抽出日本産マツタケ20gをあらかじめハサミで細かく切断
後、液体窒素を用いて凍結して乳鉢で細粉となるまで磨
砕し、3倍量の50mM Hepes緩衝液を加えて30分間抽出を
行った。抽出液はミラクロスでろ過後、10,000Xg、20分
間の遠心を行った上清に硫安を75%飽和になるように加
えて、一晩4℃で静置した。再度、15,000Xg、20分間の
遠心で沈殿させて、沈殿物を3mlの10mM Hepes緩衝液, p
H7.5に溶解し、透析チューブ（Spectra/Por1 MWCO 6-80
00, Spectrum Medical Industries 社製）またはベンゾ
イル化透析チューブ（SIGMA社製）を用いて10mM Hepes
緩衝液、pH7.5に対して透析を行って、不溶物を遠心に
よって除去してマツタケタンパク質試料とした。マツタ
ケタンパク質試料のタンパク質濃度は牛血清アルブミン
（BSA）を標準タンパク質としてBradford法で測定し
た。

【００４８】実施例２：抗菌活性を有するタンパク質の
精製１）マツタケ粗タンパク質試料の抗菌活性上記のいもち病菌、紋枯れ病菌の培養系に培養開始直後
にマツタケタンパク質試料を一定量加えて、2日間まで
培養して、吸光度変化を経時的に測定して抗菌性の有無
について判定した。タンパク質試料は希釈系列を作成
し、抗菌性に対するdillution end pointを検出した。
その結果、いもち病菌と紋枯れ病菌の両方に対する非常
に高い抗菌活性が見いだされた（表１）。

【００４９】

【表１】表１：マツタケ水性抽出液の抗菌活性キノコ抽出時ｐＨ完全生長阻害濃度（μg/ｍｌ）いもち病菌紋枯れ病菌マツタケ 7.5 0.07＜〜0.7 ＜3.6

【００５０】いもち病菌に対する完全生長阻害濃度は0.
7μg全抽出タンパク質/ml以下と概算され、このことか
ら、マツタケの抽出物の中には極めて高い抗菌活性をも
つ物質が含まれていることが明らかとなった。またその
阻害の様式は、濃度の高い場合は発芽の完全抑制、低い
場合は菌糸の生長阻害が観察された。菌糸の伸長阻害程
度は、明らかに濃度依存的であった。また、いもち病菌
の細胞は、その細胞質が細胞壁から離れ、原形質分離様
の様相を呈していた。

【００５１】これらの結果が、タンパク質によるものか
否かを確認するために、まず熱処理を行い、残存活性を
調査した。次に、およその分子量を把握するため、限外
濾過膜により、サンプルを分画した。マツタケタンパク
質サンプルについていもち病菌に対する抗菌活性を調査
した。熱処理は60℃、80℃、100℃をそれぞれ10分間行
い、限外濾過膜はセントリカットミニＶ-10（カットオ
フ分子量10000）、Ｖ-20（カットオフ分子量20000）
（ともにクラボウ社製）を用い、膜を通過した画分と、
膜を通過しなかった画分に分けてアッセイを行った。そ
の結果、60℃では活性は保持されたが（多少失活）、80
℃、100℃では活性はほぼ完全に消失した。また用いた
限外濾過膜では、活性はともに膜不通過画分のみに存在
していた（表２）。

【００５２】

【表２】表２：抗菌性に対する熱処理の影響と分子量の推定キノコ熱処理（10分間）限外濾過膜 60℃ 80℃ 100℃ Ｖ-10 Ｖ-20 通過画分不通過画分通過画分不通過画分マツタケ＋ − − − ＋ − ＋（＋：活性あり −：活性なし）

【００５３】熱による失活が見られた点、分子量は少な
くとも20000以上であると見積もられる点から抗菌活性
を示しているのはタンパク質性物質であることが強く示
唆された。

【００５４】２）イオン交換カラムによる精製次に抗菌活性を有するタンパク質の精製を行った。タン
パク質試料3.6 mg/10mlをまず、イオン交換カラムMonoQ
HR5/5（Pharmacia社製）にかけ、抗菌タンパク質を部分
精製した。流速は１ml/分とし、基本緩衝液は50 mM Mes
pH 6.0, 50mM NaCl、溶出緩衝液は50 mM Mes pH6.0, 1
M NaClを用い、グラジエント（NaClで50 mMから1M）
は、試料を打った20分後から40分間かけた。各画分（1
ml）の一部をいもち病菌に対する抗菌アッセイと、SDS-
PAGE電気泳動に供試した。抗菌活性はMonoQの各画分か
ら5、1、0.2、0.04μlをとり、イモチ病菌に対するアッ
セイを行い、+++（0.2μlまで阻害、0.04μlでは阻害し
ない）、++（1μlまで阻害）、+（5μlまで阻害）、−
（5μlでも阻害しない）の４段階で表示した。その結
果、A280と、いもち菌に対する抗菌活性によりタンパク
質をモニターすると、pH6.0においてイオン強度（NaCl
濃度）が375mM付近に抗菌活性を有するタンパク質の溶
出ピークが現れた。その後、イオン強度が高くなるにつ
れ、単位溶出液あたりのタンパク質の抗菌性は徐々に減
少することが明らかとなった（図１）。

【００５５】次に各画分から5μlをとり、等量の2×SDS
泳動用緩衝液（Sambrook et al. 1989）を加え、95℃で
５分間処理した後、Laemmli (1970)の方法に従い、SDS-
PAGE電気泳動を行った。ゲルは15％のPAGEL（ATTO社
製）を用い、銀染色IIキットワコー（和光純薬社製）に
よりタンパク質を検出した。タンパク質のおよその分子
量と量を見積もるため、分子量マーカー（LMW ：Pharma
cia LKB社製、分子量の大きい順に94kD、67kD、43kD、3
0kD、20.1kD、14.4kD）を１本のバンドが20 ngとなるよ
うに泳動した。電気泳動像と抗菌性の強さの関係を図２
に示した。各レーンの上に表示した数字は、図１の画分
の番号と同じもので、抗菌性の強さも図１に準じて表示
した。抗菌性とリンクすると考えられるタンパク質のバ
ンドを精査すると、約50 kDと、約15 kDの２つのバンド
が有力候補として挙げられた（図２矢印）。これら2種
のバンドの濃度と抗菌活性の度合いは正の相関関係にあ
るので、これらのバンドが抗菌作用を持つタンパク質本
体である可能性が強く示唆された。分子量マーカー（67
kDのアルブミン）から、イメージングデンシトメーター
（モデルＧＳ-670、BIO-RAD社製）により抗菌タンパク
質の量を推定し、いもち病菌に対する完全生長阻害濃度
を算出すると、およそ20 ngタンパク質／ml抗菌アッセ
イ培地となった。

【００５６】３）ゲルろ過カラムによる分子量の推定次に、マツタケ抗菌タンパク質のnativeな状態でのおよ
その分子量を推定するため、また、本当に50 kDと15kD
の２つのバンドのみが抗菌性に関与しているか否かを確
認するため、さらにこれら２つのバンドが一つのタンパ
ク質複合体のサブユニットになっているか否かを推定す
るために、上記のMonoQ画分の＃39をセントリカットＶ-
20で濃縮し、ゲル濾過カラムSuperose6 HR 10/30（Phar
macia社製）にかけた。流速は0.5 ml/分とし、緩衝液は
上記の基本緩衝液を用いた。まずGel filtration stand
ard (BIO-RAD社製)によりタンパク質の分子量とおよそ
の溶出時間を把握した後、抗菌活性のあるMonoQ画分を
打ち込んだ。その結果、A280でタンパク質をモニターす
ると210kDを頂点とする鋭いピークと、22kDを頂点とす
る比較的なだらかなピークが現れた（図３）。抗菌活性
は210kDのピークと、近接したその前後に集中し、総抗
菌活性量は、添加したMonoQ画分の抗菌活性量とほぼ一
致したことから、マツタケの有する抗菌性は、ゲル濾過
でおよそ210kDの分子量を有する単一のタンパク質に由
来することが分かった。また、各フラクション（0.25 m
l）の20μlをSDS−PAGE後、銀染色すると、210kD付近に
のみ、２）でみられた50kDと15kDのバンドが検出された
（図４）。隣接して泳動したMonoQ画分＃39（5μl）の
抗菌力（+++）と、Superose6により分画された抗菌性の
検出された画分＃28〜＃32の抗菌力、およびそれらの画
分のバンドパターンから、抗菌性に寄与しているのは、
やはり50 kDと15 kDであることがここでも強く示唆され
た。また分子量の違いでタンパク質を分画するゲル濾過
カラムにおいても、50kDと15kDバンドがともに抗菌性と
挙動を同じくしていたことから、両タンパク質は抗菌活
性を有するタンパク質のサブユニットを形成しているこ
とが示唆された。なお、22kDを含むその他のフラクショ
ンにはメインバンドは見られなかった。

【００５７】４）マツタケタンパク質のアミノ酸配列の
解読上記のMonoQ画分＃39〜44をセントリカットＶ-20（クラ
ボウ社製）で濃縮し、SDS-PAGE電気泳動した。トリスを
除去し、グリシンを含まない緩衝液系でPVDF膜（ミリポ
ア社製）へ転写し、クマシーブリリアントブルーＲ-250
で染色した後、脱色した。その後、抗菌性に関与すると
考えられた50ｋＤと、15ｋＤのタンパク質バンドを切り
出した。Ｎ末端アミノ酸配列は、気相プロテインシーク
エンサー（HP G1005A Protein Sequencing System）を
用いて、エドマン分解法により決定した。

【００５８】その結果、50ｋＤタンパク質からは次のよ
うな32アミノ酸（配列番号３）Ｎ末端-HEIVHYTDVFIAGSG
PISXTYARHIIDNTSTT-Ｃ末端が、また、15ｋＤタンパク質
からは次のような67アミノ酸（配列番号４）Ｎ末端−RE
WEAGVTDT YGMPQPTFHV KRTNADGDRD QRMMNDMTNV ANML
GGYLPG SYPQFMAPGL VLHITGT-Ｃ末端が決定された。

【００５９】これらのアミノ酸配列をデータベースＤＤ
ＢＪに対してＢＬＡＳＴによる相同性検索を行ったとこ
ろ、カワラタケ(Coriorus versicolor)のピラノースオ
キシダーゼと相同性を示した。この酵素はグルコースを
酸化し、グルコソンにする過程で副産物として過酸化水
素を生じる。このことから、我々が検出した抗菌性は直
接的には培地に含まれるグルコースから本酵素によって
生成された過酸化水素に起因する可能性が示唆された。

【００６０】実施例３：ピラノースオキシダーゼ活性の
測定上述のイオン交換カラム、ゲル濾過カラムからの各画分
のピラノースオキシダーゼ活性を測定した。活性測定は
Machida and Nakanishi (1984)の方法に従い、グルコー
スの酸化に伴って生産されるH₂O₂の量を決定することに
より行った。即ち全量120μlの反応液中に4μmolのTris
-HCl緩衝液（pH7.0）、0.08μmol の4-アミノアンチピ
リン、0.08μmolのフェノール、0.16 Uのペルオキシダ
ーゼ（タイプII, SIGMA社製）、4μmol のグルコース、
および酵素溶液を加え、37℃で10分間保温し、H₂O₂の生
産を500 nmの吸光の増加を測定することにより行った。
酵素活性の１単位（1 U）はpH7.0、37℃において、グル
コースより１分間に1μmolのH₂O₂を生産する活性と定義
した。

【００６１】その結果、MonoQによる分画では、塩濃度
が350mM（画分番号38）からピラノースオキシダーゼ活
性が検出されはじめ、塩濃度が400mM（画分番号40）
で、活性は最大となり（0.66U/ml）、その後活性は減少
していった。各画分のピラノースオキシダーゼ活性の強
さとその画分における抗菌活性の強さは非常によく一致
した（図１）。またSuperose6による分画でも、分子量
が210kDaのあたりで活性の値は最大となり、やはり抗菌
活性の強さとよく一致した（図３）。

【００６２】以上のことからイネいもち病菌に対する強
い抗菌性は、マツタケのピラノースオキシダーゼ活性に
起因するものであると考えられた。その作用機作は、お
そらく、ピラノースオキシダーゼによる培地中のグルコ
ースや、他のアルドピラノースの酸化の際に生じる過酸
化水素が、いもち病菌細胞にダメージを与えるものであ
ると推定された。

【００６３】実施例４：マツタケ由来ピラノースオキシ
ダーゼの酵素学的諸性質の分析次に、MonoQカラムによって得られた画分番号42〜44の
画分を用いて、マツタケピラノースオキシダーゼの比活
性、基質特異性、Km、最適温度、温度安定性、最適ｐ
Ｈ、ｐＨ安定性、及び凍結融解耐性について検討を加え
た。対照として担子菌の一種Polyporus obtususのピラ
ノースオキシダーゼ（宝酒造製）を用いた。反応液中の
酵素量はマツタケピラノースオキシダーゼが20 ng(0.52
mU)、Polyporus obtususのピラノースオキシダーゼが80
ng(0.91mU)とした。

【００６４】１）比活性 MonoQカラムによる画分番号42の画分の一部と、一本の
バンドが１μgになるように量を調節した分子量マーカ
ー（LMW ：Pharmacia LKB社製）とを、SDS-PAGE電気泳
動し、クマシーブリリアントブルー（CBB）R-250により
染色し、脱色した。マーカーのバンドの濃度から、50kD
aと15kDaのバンドの量を、イメージングデンシトメータ
ー（モデルＧＳ-670、BIO-RAD社製）により定量した。
次に画分番号42のピラノースオキシダーゼ活性を測定
し、比活性を算出した。その結果、マツタケピラノース
オキシダーゼの比活性は、25.8 U/mgタンパク質と算出
された。

【００６５】同じ方法で、市販のPolyporus obtususの
ピラノースオキシダーゼの量を定量し、比活性を計算す
ると、11.3 U/mgタンパク質となった。この値は酵素に
添付されたデータシートに記載された活性11.7 U/mgタ
ンパク質とよく一致した。このことからマツタケのピラ
ノースオキシダーゼは、Polyporus obtususのピラノー
スオキシダーゼの２倍程度強い比活性をもつことが明ら
かとなった。

【００６６】２）基質特異性グルコースをはじめ、総計１４種の糖を基質とした場合
の活性を各々測定した。各糖の濃度は33mMとし、各々の
活性を、グルコースのそれを100として、相対値で示し
た（表３）。その結果、マツタケピラノースオキシダー
ゼは、グルコースの他、1,5-アンヒドログルシトールを
よい基質とし、また、ソルボースやキシロース、および
トレハロース、ガラクトース、マルトースも基質とする
ことが分かった。Polyporus obtususのピラノースオキ
シダーゼとの比較では、マツタケピラノースオキシダー
ゼは特に1,5-アンヒドログルシトールに対する活性が高
かった（約1.6倍）。

【００６７】

【表３】表３：マツタケピラノースオキシダーゼの基質特異性相対活性（％）マツタケ Polyporus obtusus 基質（33ｍＭ）ピラノースオキシダーゼピラノースオキシダーゼＤ(+)-グルコース 100 100 1,5-アンヒドロ-D-グルシトール 52.4 32.6 Ｌ(-)-ソルボース 24.1 25 Ｄ(+)-キシロース 12.9 14.5 トレハロース 8.8 15.8 Ｄ(+)-ガラクトース 3.2 0.5 マルトース 3.1 4.4 マンノース 0 2.9 マンニトール 0 0 Ｄ(-)-フラクトース 0 0 Ｄ-ソルビトール 0 0 シュークロース 0 0 Ｄ(-)-アラビノース 0 0Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン 0 0

【００６８】３）Km 次にグルコースと1,5-アンヒドログルシトールに対する
Km値を求めた。グルコースは、0.04mM〜100mMの範囲の
９点、1,5-アンヒドログルシトールは、0.1mM〜300mMの
範囲の10点について酵素活性を測定した。結果を表４に
示す。マツタケピラノースオキシダーゼのグルコースに
対するKmは1.28mM、1,5-アンヒドログルシトールに対す
るKmは10.7 mMと算出された。一方、Polyporus obtusus
のピラノースオキシダーゼのグルコースに対するKmは1.
18mM、1,5-アンヒドログルシトールに対するKmは15.1 m
Mであった。1,5-アンヒドログルシトールは、近年糖尿
病の診断用マーカーとして注目されているが、マツタケ
ピラノースオキシダーゼは、グルコースの測定のみなら
ず、1,5-アンヒドログルシトールの酵素的測定にも特に
有効であることが示された。

【００６９】４）最適温度と温度安定性ピラノースオキシダーゼ活性を、30℃〜70℃の温度範囲
において（各温度で10分間反応）測定した。その結果、
マツタケピラノースオキシダーゼの最適温度は50℃付近
であることが判明した（図５）。また、40℃〜60℃の範
囲では80％以上の酵素活性を有していた。

【００７０】次に温度安定性（温度耐性）を調査した。
30℃〜70℃の温度範囲において、酵素を各温度で30分
間、0.1M Tris-HCl pH7.0中で保温した後、基質等を含
む反応液中で37℃、10分間反応させ、残存酵素活性を測
定した。その結果、マツタケピラノースオキシダーゼの
耐性温度は50℃付近までであることが判明した（図
６）。50℃までは95％以上の残存活性を示したが、55〜
60℃では約半分、それ以上の温度では30〜40％の残存活
性を示した。なお、Polyporus obtususのピラノースオ
キシダーゼの最適温度は55℃、温度安定性は50℃であっ
た。

【００７１】５）最適ｐＨとｐＨ安定性ピラノースオキシダーゼ活性を、pH3.5〜11の範囲にお
いて（37℃で10分間反応）測定した。その結果、マツタ
ケピラノースオキシダーゼの最適pHは7.5〜8.0付近であ
ることが判明した（図７）。また、pH6.5〜9.0の範囲で
は80％以上の酵素活性を有していた。

【００７２】次にｐＨ安定性（ｐＨ耐性）を調査した。
pH3.5〜11の範囲において、酵素を各ｐＨで50℃、30分
間保温した後、基質等を含む反応液中で37℃、10分間反
応させ、残存酵素活性を測定した。その結果、マツタケ
ピラノースオキシダーゼの安定ｐＨ領域（80％以上の残
存活性）はpH7.0〜11.0であることが判明した（図
８）。なお、Polyporus obtususのピラノースオキシダ
ーゼの最適ｐＨは7.0〜7.5、安定ｐＨは7.0〜11.0であ
った。

【００７３】緩衝液の塩濃度は、最適ｐＨ測定時が33m
M、ｐＨ安定性解析時が100mMとし、各ｐＨに合わせて、
酢酸ナトリウム-酢酸緩衝液（pH3.5〜5.5）、メス-水酸
化ナトリウム緩衝液（pH5.5〜7.0）ヘペス-水酸化ナト
リウム緩衝液（pH7.0〜8.0）、トリス-塩酸緩衝液（pH
8.0〜9.5）、キャプス-水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.5
〜11.0）を用いた。

【００７４】６）凍結融解耐性酵素をグリセロールを含まない0.1M Tris-HCl pH7.0中
で、-20℃で２時間処理し凍結させ、その後融解した後
の残存活性を調査した。その結果、マツタケピラノース
オキシダーゼ、およびPolyporus obtususのピラノース
オキシダーゼの残存活性は、凍結融解前の活性を100％
とした場合、それぞれ78％、44％であった。以上のマツ
タケピラノースオキシダーゼの酵素学的諸性質を表４に
まとめた。対照として、Polyporus obtususのピラノー
スオキシダーゼの実験結果も併せて記載した。

【００７５】

【表４】表４:マツタケとPolyporus obtususのピラノースオキシダーゼの酵素学的諸性質酵素タンパク質比活性 Km (mM) (U/mg protein) グルコース 1,5-アンヒドログルシトールマツタケピラノースオキシダーゼ 25.8 1.28 10.7Polyporus obtusus ピラノースオキシダーゼ 11.3 1.18 15.1 最適温度温度耐性最適pH 安定pH 凍結耐性（℃）（℃）マツタケピラノースオキシダーゼ 50 50 7.5〜8.0 7.0〜11.0 78％Polyporus obtusus ピラノースオキシダーゼ 55 50 7.0〜7.5 7.0〜11.0 44％

【００７６】マツタケピラノースオキシダーゼは、Poly
porus obtususピラノースオキシダーゼと比較して、グ
ルコースに対するKm、温度安定性、ｐＨ安定性はほぼ同
じ値を示すが、1,5-アンヒドログルシトールに対するK
m、および凍結融解安定性に優れていた。また、比活性
が高く、Polyporus obtususの約２倍、また先述のCorio
rus versicolorのピラノースオキシダーゼのそれ（Nish
imura et al. (1996) J.Biotechnol. 52: 11-20）と比
較してもおよそ２倍程度の比活性を有することが明らか
となった。

【００７７】実施例５：ｃＤＮＡの単離１）ディジェネレートプライマーの設計実施例２の４）で決定されたアミノ酸配列を基に、考え
られる全ての塩基がミックスされたプライマーを合成し
た（Ｔｍは50〜54℃、括弧内の数字はdegeneracyを示
す）。50ｋＤタンパク質（33アミノ酸分を解読）から２
つのプライマー、MT50R1（5'-caytwyacigaygtittyathgc
-3'(96)）（配列番号５）、およびMT50F1（5'-gtigaigt
rttrtcdatdatrtg-3'(72)）（配列番号６）を、15ｋＤタ
ンパク質（67アミノ酸分を解読）から３つのプライマー
MT15R1（5'-acigayacitayggiatgcc-3'(4)）（配列番号
７）、MT15F-1（5'-crttigtcatrtcrttcatca-3'(8)）
（配列番号８）、およびMT15F-2（5'-aaicciggigccatra
aytg-3'(4)）（配列番号９）を合成した（ただし、iは
イノシン、yはｃまたはｔ、rはaまたはg、ｗはaまたは
ｔ、ｈはcまたはaまたはt、ｄはgまたはaまたはt、をそ
れぞれ示す）。

【００７８】２）マツタケ子実体ｃＤＮＡライブラリー
の構築マツタケ子実体からSDSフェノール法で全核酸を抽出
し、塩化リチウム沈殿により全ＲＮＡを回収した。ここ
からmRNA purification kit（Pharmacia社製）によりマ
ツタケｍＲＮＡを調製した。子実体約5 gから10 μgの
ｍＲＮＡが得られた。このうち5μgをZAP cDNA synthes
is kit (Stratagene社製)に供試し、ｃＤＮＡを合成し
た。ゲル濾過カラムにより1〜5 kbのｃＤＮＡを分画
し、Uni-ZAP XR ベクター（Stratagene社製）にライゲ
ーションし、GigapackIII（Stratagene社製）によりパ
ッケージングを行った。全ての手順はキット添付の説明
書に従った。構築したマツタケｃＤＮＡライブラリーの
タイターは、およそ100万pfuと算出された。

【００７９】３）ＲＴ−ＰＣＲによるプローブの取得１）で合成したプライマーを用いて２）で合成したｃＤ
ＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ライブラリーをスクリーニ
ングするためのプローブとなるマツタケタンパク質の部
分長ｃＤＮＡの増幅を試みた。反応条件は以下のように
行った。50μlの反応液中に、cDNA 60 ng、10X Ex taq
buffer 5μl、dNTPs 4μl、プライマー10 pmoles ／各
配列、Ex taq (Takara社製)+ Taq START antibody (Clo
ntech社製) 1μl をそれぞれ含み、プログラムテンプコ
ントロールシステムＰＣ-700（ASTEK社製）を用いて、9
4℃ 3分を1回、次いで94℃ 1分、50℃ 1分及び72℃ 2分
のサイクルを40 回、最後に72℃ 6分を1回行った。。そ
の結果、MT50R1-15F1、MT50R1-15F2のプライマー組み合
わせにおいて各々1.3ｋｂ、1.4ｋｂの産物が増幅され
た。これらのうち増幅効率のより高かった50R1-15F1の
組み合わせによる1.3ｋｂの断片をゲル精製し、ベクタ
ーpCRII（Invitrogen社製）にクローニングした。サイ
ズの微妙に異なる６つのクローンに関して塩基配列を決
定した結果、うち２つのクローンにおいて、実施例２の
４）で決定された２カ所のアミノ酸配列と非常によく似
た（92〜98％の相同性）配列が両方とも含まれていた。
このことから得られたクローンは精製したタンパク質を
コードする配列であることが明らかとなった。また精製
した50 kDと15kDの抗菌タンパク質は、この順序で両ペ
プチドを含むある一つの前駆体タンパク質から生成する
ことが示唆された。

【００８０】４）ゲノミックサザン分析によるコピー数
の推定マツタケから全ＤＮＡを抽出し、5μgのＤＮＡを６種の
制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で分画した
後、Zeta-probeブロッティングメンブレン（BIO-RAD社
製）にアルカリブロティングした。３）のクローン化Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ産物をRedi-primeラベリングキット（Amarsh
am社製）によりRIラベルし、これをプローブとしてゲノ
ミックサザン分析を行った。ハイブリダイゼーション、
洗浄の条件はメンブレン添付の説明書きに従った。その
結果、EcoRIとXhoI消化では１本、BamHIとPstI消化では
２本、HindIII消化で３本のバンドが検出された。ま
た、SalI消化では高分子側にスメアーバンドが検出され
た（図９）。このことからマツタケタンパク質をコード
する遺伝子はマツタケゲノム内に最少で１コピー、最多
でも３コピー程度存在することが明らかとなった。EcoR
Iのバンドの濃度が濃いことからこれはdoubletであると
考えられ、マツタケピラノースオキシダーゼ遺伝子は、
マツタケゲノム中におそらく２コピー存在するのではな
いかと考えられた。

【００８１】５）完全長ｃＤＮＡのスクリーニング３）で得られたクローンをベクターから切り出し、これ
をプローブに用いて２）で構築したマツタケｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングした。14×10 cmの角形シ
ャーレにZAP cDNA synthesis kit (Stratagene社製)の
説明書きに従って、約15,000 pfuのファージを宿主菌XL
1-blue MRF'とともにプレーティングした。プラークをH
ybond-N+ナイロンメンブレンフィルター（Amersham社
製）に接触させ、メンブレン添付の説明書きに従ってア
ルカリ処理を行い、ＤＮＡを変性させ、メンブレン上に
固定させた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件
は、Zeta-probeメンブレンに添付の説明書に従って高い
ストリンジェンシーの条件下で行った。１次スクリーニ
ングで約120,000 pfuのファージから４０個の陽性クロ
ーンが得られた。うち１６個のクローンに関して、２次
スクリーニング、プラークの精製を兼ねた３次スクリー
ニングを行い、１６個全てについてZAP cDNAsynthesis
kit (Stratagene社製)の説明書に従って、in vivo exci
sionを行った。その結果、５個（＃１、４、５、１１、
１４）のクローンが、ファージミドベクターpBluescrip
t SKに組み込まれたｃＤＮＡとして回収された。これら
のクローンの長さは1.7〜2.3ｋｂであり、制限酵素分析
から非常によく似た遺伝子由来であることが示唆され
た。

【００８２】実施例６：塩基配列の決定上記の５つのｃＤＮＡクローンについて、５'側の塩基
配列およそ500 bpを決定した。得られた塩基配列データ
をGenetyx ver.9.0解析ソフト（Software Development
社製）を用いて解析した。その結果、＃１(2.0 kb)と１
４(1.9 kb)は、同じ遺伝子由来であり、＃５(2.3 kb)は
このグループとは異なることが示唆された。即ち、＃５
の５'側の塩基配列には、実施例２の４）で決定した50
ｋＤの31アミノ酸と非常によく似た配列（31アミノ酸中
29アミノ酸が一致）をコードするＤＮＡ配列が存在する
が、その読み枠においては上流域に翻訳開始コドンが現
れず、翻訳終始コドンが連続して現れ、最初の翻訳開始
コドンは、実施例２の４）で決定した31アミノ酸をコー
ドするＤＮＡ配列の後に初めて現れた。

【００８３】一方、＃１と１４のクローンにおいては、
実施例２の４）で決定した31アミノ酸と非常によく似た
配列（31アミノ酸中29アミノ酸が一致）が含まれ、その
読み枠において31アミノ酸のＮ末端から25アミノ酸分上
流に翻訳開始コドンATGが存在していた。しかもその27
bp（同じ読み枠）上流に翻訳終始コドンTAAが存在して
いたことから、このATGが翻訳開始点であることが強く
示唆された。＃４(1.8kb)と１１(1.7 kb)については、
ｃＤＮＡインサートの配列の長さが短く、両クローンと
も50ｋＤの31アミノ酸の一部は保持しているが、それよ
り上流の差異のある領域が存在していないことから、グ
ループ分けは困難であった。

【００８４】なお、実施例２の４）の50kDaのＮ末端配
列中で、唯一決定されなかった第19番目のアミノ酸は、
その部分に相当するｃＤＮＡ配列からシステイン（Cy
s）であることが明らかとなった。エドマン分解法では
システインは解析できないため、アミノ酸シーケンシン
グの際に検出不能であったのであろう。

【００８５】次に、３'側のおよそ500 bpの塩基配列を
５つのクローンについて比較したところ、全クローンと
も塩基配列はほぼ一致し、実施例２の４）で決定した15
ｋＤの67アミノ酸と非常によく似た配列（67アミノ酸中
63アミノ酸が一致）が５つのクローン全てにおいて保存
されていた。なお、ポリA付加部位にはクローン間で差
異があり、＃１のそれを起点とした場合、＃４、５、１
１では10塩基上流、＃１４では17塩基下流であった。

【００８６】＃１と＃１４のクローンと、それらとは遺
伝子の一次構造が異なる＃５のクローンにおいて、１）
で決定した50kDaのＮ末端32アミノ酸と、15kDaのＮ末端
67アミノ酸に相当する部分の塩基配列は全て保存されて
いた。特に15kDaのＮ末端67アミノ酸は、単離された５
つのｃＤＮＡクローン全てにおいて保存されていた。即
ち、精製タンパク質からアミノ酸シーケンシングによっ
て直接決定されたアミノ酸配列と、ｃＤＮＡから予測さ
れたアミノ酸配列との間に存在した少数のアミノ酸配列
の差異の位置と種類は、全てのクローンで同一であっ
た。

【００８７】このことから、実施例２の４）で決定した
アミノ酸配列と、その部分に相当するｃＤＮＡによって
コードされるアミノ酸配列が完全には一致しない理由と
して、良く似たアイソザイムの遺伝子由来のクローンを
単離したというよりはむしろ、タンパク質を精製し、ア
ミノ酸配列を決定した際に用いたマツタケ試料と、ＲＮ
Ａを精製し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した際に用い
たマツタケ試料の微妙な品種、あるいは生態型の違いに
起因する可能性が高いと考えられる。しかしながら、単
離したｃＤＮＡクローンがコードするアミノ酸配列は、
アミノ酸シーケンシングによって決定されたアミノ酸と
非常に良く似ている（93〜94％）ことから、単離したｃ
ＤＮＡの発現によって得られるタンパク質も先述の精製
タンパク質と同様の活性、ならびに酵素学的諸性質を兼
ね備えている可能性が高いのはいうまでもない。

【００８８】以上の結果より、マツタケピラノースオキ
シダーゼの全情報をコードするのは＃１や＃１４のグル
ープであると考え、よりサイズの大きい、＃１クローン
の全塩基配列を決定した。まず、2.0 kbのクローンを内
部にある数カ所の制限部位を利用して、ベクターpBlues
criptへサブクローニングし、Ｍ13プライマーを用い
て、ABI PRISM蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic
Analyzer , Perkin Elmer社製）により塩基配列を決定
した。また、制限部位を含むその周辺配列は、内部の塩
基配列を基にプライマーを合成し、配列決定に利用し
た。以上のようにしてＤＮＡの両鎖の配列を解読し、全
塩基配列を決定した（図10）。その結果、マツタケピラ
ノースオキシダーゼをコードするｃＤＮＡは全長1946塩
基からなり、564個のアミノ酸をコードしていた（配列
表配列番号１および２）。アミノ酸配列から推定される
分子量は約61.9ｋＤ、等電点は5.68と算出された。また
推定糖鎖付加部位が２カ所（配列表配列番号２のアミノ
酸番号53〜56、同287〜290のＮ）存在していた。

【００８９】精製タンパク質から決定されたＮ末端のア
ミノ酸に相当する領域を検索すると、50ｋＤのＮ末端32
アミノ酸が配列表の配列番号２のアミノ酸配列の26〜57
番目のアミノ酸配列に、15ｋＤのＮ末端67アミノ酸が同
436〜502番目のアミノ酸配列にそれぞれ相当した。ま
た、配列番号２のアミノ酸配列のうち、第26番目から第
435番目のアミノ酸配列、及び第436番目から第564番目
のアミノ酸配列の分子量を計算すると、それぞれおよそ
45.3ｋＤ、13.8ｋＤとなり、SDS-PAGEから推定された大
まかな分子量とよく似た値となった。このことから、マ
ツタケピラノースオキシダーゼは、マツタケ細胞内でま
ず前駆体型として翻訳された後、然るべき細胞内器官に
おいてＮ末のリーダー配列（25アミノ酸）が切り離さ
れ、またアミノ酸番号435と436の間で切断され、結果生
じたおよそ50ｋＤと15ｋＤの２つのポリペプチドが相互
に会合すると推定された。

【００９０】以上の結果から、クローニングしたｃＤＮ
Ａはマツタケピラノースオキシダーゼをコードする遺伝
子に由来すると結論された。本発明のマツタケ由来ピラ
ノースオキシダーゼの全アミノ酸配列およびその全ＤＮ
Ａ配列について、データベース（ＤＤＢＪ）に対する相
同性検索（ＢＬＡＳＴ）を実施したところ、やはりカワ
ラタケのピラノースオキシダーゼに対して相同性を示し
た。そこで両者の全アミノ酸配列、および全ＤＮＡ配列
についてGenetyx ver.9.0解析ソフト（Software Develo
pment社製）を用いて相同性検索を行った。その結果、
アミノ酸配列は全体で35％、ＤＮＡ配列は全体で46％の
相同性を示した。また、カワラタケのピラノースオキシ
ダーゼ以外で相同性のある配列は存在していないことか
ら、本タンパク質は新規なピラノースオキシダーゼであ
ると考えられた。

【００９１】

【発明の効果】本発明の配列表の配列番号２の配列また
は、このうち第１番目から第25番目の配列を除いた全配
列あるいは、第26番目から第435番目のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドおよび第436番目から第564番目のア
ミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とす
るピラノースオキシダーゼによって、グルコースをはじ
め、ソルボースやキシロース、あるいはトレハロース、
ガラクトース、マルトースといった糖を、従来のピラノ
ースオキシダーゼと比較して、より少量の酵素量で検出
することが可能となる。また、本発明のピラノースオキ
シダーゼは、1,5-アンヒドログルシトールに対しても高
い作用性を示すことから、糖尿病の診断薬としての利用
が期待できる。

【００９２】しかも本発明によれば、配列表の配列番号
１のＤＮＡ配列のうち、第101番目から第1792番目の配
列であることを特徴とするＤＮＡ配列、または第176番
目から第1792番目の配列であることを特徴とするＤＮＡ
配列、若しくは第176番目から第1405番目のＤＮＡ配
列、第1406番目から第1792番目のＤＮＡ配列、またはこ
れらの両方を、大腸菌や酵母あるいは昆虫やある種の動
物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを
用いて導入、発現させることにより、当該タンパク質を
大量に、しかも安価に得ることができると期待される。

【００９３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JAPAN TOBACCO INC. <120> An agent for the determination of pyranose comprising a pyranose oxidase <130> 981883 <160> 9

【００９４】 <210> 1 <211> 1946 <212> DNA <213> Tricholoma matsutake <400> 1 cttccttcga tttctaggtc tcatattatt tgatacatgc cgcggcatag gggcaaagtc 60 acaggccagg acataaggtc agtcttaccc acctactacc atg ccg ata cgt ctt 115 Met Pro Ile Arg Leu 1 5 tcc aaa gaa aaa atc aac gac ctg ctg caa cgt tct caa ggg gat ctt 163 Ser Lys Glu Lys Ile Asn Asp Leu Leu Gln Arg Ser Gln Gly Asp Leu 10 15 20 act tcc tcg caa gac gaa att gta cat tac act gat gtt ttc att gct 211 Thr Ser Ser Gln Asp Glu Ile Val His Tyr Thr Asp Val Phe Ile Ala 25 30 35 ggc agt ggt ccc att gcc tgt act tac gcc cgc cac atc att gac aat 259 Gly Ser Gly Pro Ile Ala Cys Thr Tyr Ala Arg His Ile Ile Asp Asn 40 45 50 acc tca act aca aag gtc tac atg gcc gaa ata ggt tct caa gat aac 307 Thr Ser Thr Thr Lys Val Tyr Met Ala Glu Ile Gly Ser Gln Asp Asn 55 60 65 cct gtc atc gga gcc cat cac agg aac tcc ata aag ttt cag aaa gac 355 Pro Val Ile Gly Ala His His Arg Asn Ser Ile Lys Phe Gln Lys Asp 70 75 80 85 act gac aag ttt gtg aat atc atc aac ggt gcc ctc cag ccc att tcg 403 Thr Asp Lys Phe Val Asn Ile Ile Asn Gly Ala Leu Gln Pro Ile Ser 90 95 100 att tcg cca tcg gac acc tac cag ccc act ctc gct gta gca gcg tgg 451 Ile Ser Pro Ser Asp Thr Tyr Gln Pro Thr Leu Ala Val Ala Ala Trp 105 110 115 gcg ccg ccc atc gat cct gcc gaa ggc cag ctc gtg att atg gga cac 499 Ala Pro Pro Ile Asp Pro Ala Glu Gly Gln Leu Val Ile Met Gly His 120 125 130 aat ccg aat cag gag gcc ggc ctg aac ctt ccc ggt agc gct gtc acg 547 Asn Pro Asn Gln Glu Ala Gly Leu Asn Leu Pro Gly Ser Ala Val Thr 135 140 145 agg aca gtc ggg gga atg gcg acc cac tgg act tgc gcg tgt cct act 595 Arg Thr Val Gly Gly Met Ala Thr His Trp Thr Cys Ala Cys Pro Thr 150 155 160 165 cca cat gac gaa gag agg gtc aac aac cca gtt gac aag cag gag ttc 643 Pro His Asp Glu Glu Arg Val Asn Asn Pro Val Asp Lys Gln Glu Phe 170 175 180 gac gca ctg ctc gaa cgt gct aaa aca ttg ctc aac gtt cac agc gac 691 Asp Ala Leu Leu Glu Arg Ala Lys Thr Leu Leu Asn Val His Ser Asp 185 190 195 cag tat gac gat tct atc cgt cag ata gtt gtc aaa gag acc ctt cag 739 Gln Tyr Asp Asp Ser Ile Arg Gln Ile Val Val Lys Glu Thr Leu Gln 200 205 210 cag acc ctt gat gcg tcg cgg ggt gtg acc act ctc ccg ctg ggg gtg 787 Gln Thr Leu Asp Ala Ser Arg Gly Val Thr Thr Leu Pro Leu Gly Val 215 220 225 gag cgc cgc acg gac aat cct att tat gtc acc tgg acc ggt gcc gat 835 Glu Arg Arg Thr Asp Asn Pro Ile Tyr Val Thr Trp Thr Gly Ala Asp 230 235 240 245 acc gtc ctt ggt gat gtg ccg aag agt ccc cga ttc gtt ttg gtt aca 883 Thr Val Leu Gly Asp Val Pro Lys Ser Pro Arg Phe Val Leu Val Thr 250 255 260 gag acg aga gtg acg aag ttt att gtc agt gaa acc aat ccg acg cag 931 Glu Thr Arg Val Thr Lys Phe Ile Val Ser Glu Thr Asn Pro Thr Gln 265 270 275 gtt gtt gct gcg ttg cta cgt aac ttg aat aca agc aac gat gaa ctt 979 Val Val Ala Ala Leu Leu Arg Asn Leu Asn Thr Ser Asn Asp Glu Leu 280 285 290 gtc gtg gcc cag agt ttc gtc ata gct tgt gga gca gtc tgc aca ccg 1027 Val Val Ala Gln Ser Phe Val Ile Ala Cys Gly Ala Val Cys Thr Pro 295 300 305 caa atc ctg tgg aac agc aac atc cgc cca cat gcg ctt ggt cgc tac 1075 Gln Ile Leu Trp Asn Ser Asn Ile Arg Pro His Ala Leu Gly Arg Tyr 310 315 320 325 ctc agc gaa cag tcc atg act ttt tgt cag att gtt ctc aag agg agc 1123 Leu Ser Glu Gln Ser Met Thr Phe Cys Gln Ile Val Leu Lys Arg Ser 330 335 340 ata gtc gat tcc atc gct act gac cct cgc ttc gct gcg aag gtt gag 1171 Ile Val Asp Ser Ile Ala Thr Asp Pro Arg Phe Ala Ala Lys Val Glu 345 350 355 gcg cac aag aag aag cac ccc gat gac gtg ctg ccg att cca ttc cac 1219 Ala His Lys Lys Lys His Pro Asp Asp Val Leu Pro Ile Pro Phe His 360 365 370 gag cct gaa cct caa gtg atg att ccg tac acg tcg gac ttc cct tgg 1267 Glu Pro Glu Pro Gln Val Met Ile Pro Tyr Thr Ser Asp Phe Pro Trp 375 380 385 cat gtt cag gtc cat cgc tat gca ttt ggt gat gtt gga ccc aag gcc 1315 His Val Gln Val His Arg Tyr Ala Phe Gly Asp Val Gly Pro Lys Ala 390 395 400 405 gac ccg cgt gtt gtc gtc gat ctg agg ttt ttc ggc aaa tca gat att 1363 Asp Pro Arg Val Val Val Asp Leu Arg Phe Phe Gly Lys Ser Asp Ile 410 415 420 gtc gaa gaa aat cga gtg act ttc ggt ccg aac cct aag cta cgc gac 1411 Val Glu Glu Asn Arg Val Thr Phe Gly Pro Asn Pro Lys Leu Arg Asp 425 430 435 tgg gaa gcg ggt gtt aca gac act tat gga atg cca cag ccg aca ttc 1459 Trp Glu Ala Gly Val Thr Asp Thr Tyr Gly Met Pro Gln Pro Thr Phe 440 445 450 cat gtc aag cgg acc aac gcc gat gga gac cgt gac cag agg atg atg 1507 His Val Lys Arg Thr Asn Ala Asp Gly Asp Arg Asp Gln Arg Met Met 455 460 465 aat gat atg acc aac gtc gcg aac ata ctg ggc ggg tac ctt cct ggc 1555 Asn Asp Met Thr Asn Val Ala Asn Ile Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Gly 470 475 480 485 tcc tac cct caa ttt atg gca cct ggt ctc gca cag cac atc acg gga 1603 Ser Tyr Pro Gln Phe Met Ala Pro Gly Leu Ala Gln His Ile Thr Gly 490 495 500 act act cgg atc ggg aca gat gat caa act tct gtt gct gat ccg aca 1651 Thr Thr Arg Ile Gly Thr Asp Asp Gln Thr Ser Val Ala Asp Pro Thr 505 510 515 tca aag gtt cat aac ttc gac aat ctg tgg gtc ggc ggg aat ggg tgc 1699 520 525 530 att cca gat gcg act gcc tgc aac ccg act cgt acg agc gtc gcg tat 1747 Ile Pro Asp Ala Thr Ala Cys Asn Pro Thr Arg Thr Ser Val Ala Tyr 535 540 545 gcg ctt aag ggt gct gag gct gta gtc agt tac ctt ggc gtc tcc tgaaa 1797 Ala Leu Lys Gly Ala Glu Ala Val Val Ser Tyr Leu Gly Val Ser 550 555 560 gattctcgtg tcttgagagc gattcaagtt tgaaaagctg tacttaatat atctaggtcc 1857 tgacgttcgc attttaacat gtacttgtat ccgattgttg tcttatgtga tgattttcgt 1917 catatttact tgaaaaaaaa aaaaaaaaa 1946

【００９５】 <210> 2 <211> 564 <212> PRT <213> Tricholoma matsutake <400> 2 Met Pro Ile Arg Leu Ser Lys Glu Lys Ile Asn Asp Leu Leu Gln Arg 1 5 10 15 Ser Gln Gly Asp Leu Thr Ser Ser Gln Asp Glu Ile Val His Tyr Thr 20 25 30 Asp Val Phe Ile Ala Gly Ser Gly Pro Ile Ala Cys Thr Tyr Ala Arg 35 40 45 His Ile Ile Asp Asn Thr Ser Thr Thr Lys Val Tyr Met Ala Glu Ile 50 55 60 Gly Ser Gln Asp Asn Pro Val Ile Gly Ala His His Arg Asn Ser Ile 65 70 75 80 Lys Phe Gln Lys Asp Thr Asp Lys Phe Val Asn Ile Ile Asn Gly Ala 85 90 95 Leu Gln Pro Ile Ser Ile Ser Pro Ser Asp Thr Tyr Gln Pro Thr Leu 100 105 110 Ala Val Ala Ala Trp Ala Pro Pro Ile Asp Pro Ala Glu Gly Gln Leu 115 120 125 Val Ile Met Gly His Asn Pro Asn Gln Glu Ala Gly Leu Asn Leu Pro 130 135 140 Gly Ser Ala Val Thr Arg Thr Val Gly Gly Met Ala Thr His Trp Thr 145 150 155 160 Cys Ala Cys Pro Thr Pro His Asp Glu Glu Arg Val Asn Asn Pro Val 165 170 175 Asp Lys Gln Glu Phe Asp Ala Leu Leu Glu Arg Ala Lys Thr Leu Leu 180 185 190 Asn Val His Ser Asp Gln Tyr Asp Asp Ser Ile Arg Gln Ile Val Val 195 200 205 Lys Glu Thr Leu Gln Gln Thr Leu Asp Ala Ser Arg Gly Val Thr Thr 210 215 220 Leu Pro Leu Gly Val Glu Arg Arg Thr Asp Asn Pro Ile Tyr Val Thr 225 230 235 240 Trp Thr Gly Ala Asp Thr Val Leu Gly Asp Val Pro Lys Ser Pro Arg 245 250 255 Phe Val Leu Val Thr Glu Thr Arg Val Thr Lys Phe Ile Val Ser Glu 260 265 270 Thr Asn Pro Thr Gln Val Val Ala Ala Leu Leu Arg Asn Leu Asn Thr 275 280 285 Ser Asn Asp Glu Leu Val Val Ala Gln Ser Phe Val Ile Ala Cys Gly 290 295 300 Ala Val Cys Thr Pro Gln Ile Leu Trp Asn Ser Asn Ile Arg Pro His 305 310 315 320 Ala Leu Gly Arg Tyr Leu Ser Glu Gln Ser Met Thr Phe Cys Gln Ile 325 330 335 Val Leu Lys Arg Ser Ile Val Asp Ser Ile Ala Thr Asp Pro Arg Phe 340 345 350 Ala Ala Lys Val Glu Ala His Lys Lys Lys His Pro Asp Asp Val Leu 355 360 365 Pro Ile Pro Phe His Glu Pro Glu Pro Gln Val Met Ile Pro Tyr Thr 370 375 380 Ser Asp Phe Pro Trp His Val Gln Val His Arg Tyr Ala Phe Gly Asp 385 390 395 400 Val Gly Pro Lys Ala Asp Pro Arg Val Val Val Asp Leu Arg Phe Phe 405 410 415 Gly Lys Ser Asp Ile Val Glu Glu Asn Arg Val Thr Phe Gly Pro Asn 420 425 430 Pro Lys Leu Arg Asp Trp Glu Ala Gly Val Thr Asp Thr Tyr Gly Met 435 440 445 Pro Gln Pro Thr Phe His Val Lys Arg Thr Asn Ala Asp Gly Asp Arg 450 455 460 Asp Gln Arg Met Met Asn Asp Met Thr Asn Val Ala Asn Ile Leu Gly 465 470 475 480 Gly Tyr Leu Pro Gly Ser Tyr Pro Gln Phe Met Ala Pro Gly Leu Ala 485 490 495 Gln His Ile Thr Gly Thr Thr Arg Ile Gly Thr Asp Asp Gln Thr Ser 500 505 510 Val Ala Asp Pro Thr Ser Lys Val His Asn Phe Asp Asn Leu Trp Val 515 520 525 Gly Gly Asn Gly Cys Ile Pro Asp Ala Thr Ala Cys Asn Pro Thr Arg 530 535 540 Thr Ser Val Ala Tyr Ala Leu Lys Gly Ala Glu Ala Val Val Ser Tyr 545 550 555 560 Leu Gly Val Ser

【００９６】 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Tricholoma matsutake <220> <221> UNSURE <222> 19 <400> 3 His Glu Ile Val His Tyr Thr Asp Val Phe Ile Ala Gly Ser Gly Pro 5 10 15 Ile Ser Xaa Thr Tyr Ala Arg His Ile Ile Asp Asn Thr Ser Thr Thr 20 25 30

【００９７】 <210> 4 <211> 67 <212> PRT <213> Tricholoma matsutake <400> 4 Arg Glu Trp Glu Ala Gly Val Thr Asp Thr Tyr Gly Met Pro Gln Pro 5 10 15 Thr Phe His Val Lys Arg Thr Asn Ala Asp Gly Asp Arg Asp Gln Arg 20 25 30 Met Met Asn Asp Met Thr Asn Val Ala Asn Met Leu Gly Gly Tyr Leu 35 40 45 Pro Gly Ser Tyr Pro Gln Phe Met Ala Pro Gly Leu Val Leu His Ile 50 55 60 Thr Gly Thr 65

【００９８】 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <222> 9 and 15 <223> n represents i (inosine) <400> 5 caytwyacng aygtnttyat hgc 23

【００９９】 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <222> 3 and 6 <223> n represents i (inosine) <400> 6 gtngangtrt trtcdatdat rtg 23

【０１００】 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <222> 3, 9 and 15 <223> n represents i (inosine) <400> 7 acngayacnt ayggnatgcc 20

【０１０１】 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <222> 5 <223> n represents i (inosine) <400> 8 crttngtcat rtcrttcatc a 21

【０１０２】 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <222> 3, 6 and 9 <223> n represents i (inosine) <400> 9 aanccnggng ccatraaytg 20

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、MonoQカラムによるマツタケタンパ
ク質の分離のチャートと抗菌性、およびピラノースオキ
シダーゼ活性との関係を示す。

【図２】図２は、MonoQカラムによるマツタケタンパ
ク質の分離の電気泳動像と抗菌性との関係を示す。レー
ン上の番号は図１の画分番号に一致し、Ｍは分子量マー
カーを示す。またレーン下の記号（-、+、++、+++）は
抗菌活性の強さを示す。抗菌作用を有するタンパク質
（50ｋＤと15ｋＤ）を矢印で示した。

【図３】図３は、Superose6によるマツタケタンパク
質の精製のチャートと抗菌性、およびピラノースオキシ
ダーゼ活性との関係を示す。矢印はGel filtration sta
ndard (BIO-RAD社製)の各分子量のタンパク質標品の溶
出位置を示す。

【図４】図４は、Superose6によるマツタケタンパク
質の精製の電気泳動像と抗菌性との関係を示す。レーン
上の番号は図３の画分番号に一致し、ｍ39はSuperose6
にかけたmonoQの第39画分（図４参照）を、Ｍは分子量
マーカーを示す。またレーン下の記号（-、+、++、++
+）は抗菌活性の強さを示す。抗菌作用を有するタンパ
ク質（50ｋＤと15ｋＤ）を矢印で示した。

【図５】図５は、マツタケピラノースオキシダーゼの
最適温度の解析結果を示す。

【図６】図６は、マツタケピラノースオキシダーゼの
温度安定性の解析結果を示す。

【図７】図７は、マツタケピラノースオキシダーゼ最
適ｐＨの解析結果を示す。▲は100mM酢酸ナトリウム-酢
酸緩衝液（pH3.5〜5.5）、□は100mMメス-水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH5.5〜7.0）、◆は100mMヘペス-水酸化ナ
トリウム緩衝液（pH7.0〜8.0）、△は100mMトリス-塩酸
緩衝液（pH8.0〜9.5）、は100mMキャプス-水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH9.5〜11.0）をそれぞれ示す。

【図８】図８は、マツタケピラノースオキシダーゼｐ
Ｈ安定性の解析結果を示す。▲は100mM酢酸ナトリウム-
酢酸緩衝液（pH3.5〜5.5）、□は100mMメス-水酸化ナト
リウム緩衝液（pH5.5〜7.0）、◆は100mMヘペス-水酸化
ナトリウム緩衝液（pH7.0〜8.0）、△は100mMトリス-塩
酸緩衝液（pH8.0〜9.5）、は100mMキャプス-水酸化ナト
リウム緩衝液（pH9.5〜11.0）をそれぞれ示す。

【図９】図９は、マツタケピラノースオキシダーゼを
コードする遺伝子の、マツタケゲノムに対するサザンブ
ロット分析の結果を示す。XはXhoIを、SはSalIを、PはP
stIを、HはHindIIIを、EはEcoRIを、BはBamHIをそれぞ
れ示す。

【図１０】図１０は、マツタケピラノースオキシダー
ゼをコードするｃＤＮＡの制限酵素地図と塩基配列決定
の方法を示す。太線はｃＤＮＡを示し、AAAA...はポリA
を示す。ｃＤＮＡ上にある制限酵素部位を太線上に示し
た（EcoRIとXhoIはベクターへのクローニング部位）。
各矢印は塩基配列を決定した領域の方向と長さを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:645） (72)発明者太田象三静岡県磐田郡豊田町東原700番地日本たばこ産業株式会社遺伝育種研究所内 (72)発明者宇佐美悟静岡県磐田郡豊田町東原700番地日本たばこ産業株式会社遺伝育種研究所内Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA34 BB50 BB51 CB20 CB21 CB30 DA30 DA31 DA36 FB01 FB11 GC12 4B024 AA11 AA20 BA08 CA02 DA01 HA11 HA19 4B050 CC01 DD05 LL03 4B063 QA01 QA13 QA18 QA19 QQ03 QQ16 QQ44 QQ68 QQ89 QR02 QR03 QR10 QR32 QR48 QR73 QS02 QS13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】マツタケの水性抽出液から硫安沈殿法で
沈殿する画分から得ることができ、少なくともイネ紋枯
病菌またはイネイモチ病菌に対する抗菌活性を有し、ゲ
ル濾過法による分子量が約２１０ｋＤであり、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ法では約５０ｋＤと約１５ｋＤの成分の存在を
示し、中性水溶液中で６０℃１０分間の加熱により上記
抗菌活性が保持され、中性水溶液中で８０℃１０分間の
加熱により上記抗菌活性が失活することを特徴とするピ
ラノースオキシダーゼを含む、ピラノース測定用試薬。
【請求項２】ピラノースオキシダーゼが以下の酵素学
的性質を有する、請求項１に記載のピラノース測定用試
薬；（１）基質特異性：Ｄ（＋）−グルコース、１，５−ア
ンヒドロ−Ｄ−グルシトール、Ｌ（−）−ソルボース、
Ｄ（＋）−キシロース、トレハロース、Ｄ（＋）−ガラ
クトースおよびマルトースを基質とし、マンノース、マ
ンニトール、Ｄ（−）−フルクトース、Ｄ−ソルビトー
ル、シュークロース、Ｄ（−）−アラビノースおよびＮ
−アセチル−Ｄ−グルコサミンを基質としない；（２）最適温度：約５０℃が最適温度であり、４０〜６
０℃の範囲では８０％以上の酵素活性が保持される；（３）温度安定性：各温度で３０分間保温した後の残存
活性は、３０〜５０℃の温度では９５％以上、５５〜６
０℃の温度では約５０％、６０〜７０℃の温度では３０
〜４０％；（４）最適ｐＨ：ｐＨ７．５〜８．０が最適ｐＨであ
り、ｐＨ６．５〜９．０の範囲では８０％以上の酵素活
性が保持される；（５）ｐＨ安定性：各ｐＨで５０℃で３０分間保温した
後の残存活性が８０％以上である安定ｐＨ領域は７．０
から１１．０；
【請求項３】ピラノースオキシダーゼの約５０ｋＤの
成分が配列表の配列番号３に記載のＮ末端アミノ酸配
列：His Glu Ile Val His Tyr Thr Asp Val Phe Ile Al
a Gly Ser Gly Pro Ile Ser Xaa Thr Tyr Ala Arg His
Ile Ile Asp Asn Thr Ser Thr Thr：を有し、約１５ｋ
Ｄの成分が配列表の配列番号４に記載のＮ末端アミノ酸
配列：Arg Glu Trp Glu Ala Gly Val Thr Asp Thr Tyr
Gly MetPro Gln Pro Thr Phe His Val Lys Arg Thr Asn
Ala Asp Gly Asp Arg Asp GlnArg Met Met Asn Asp Me
t Thr Asn Val Ala Asn Met Leu Gly Gly Tyr Leu ProG
ly Ser Tyr Pro Gln Phe Met Ala Pro Gly Leu Val Leu
His Ile Thr Gly Thrを有する、請求項１または２に記
載のピラノース測定用試薬。
【請求項４】ピラノースオキシダーゼが、配列表の配
列番号２に記載のアミノ酸配列；この配列中に１から複
数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列；またはこの
配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有す
る、請求項１から３の何れか１項に記載のピラノース測
定用試薬。
【請求項５】ピラノースオキシダーゼが配列表の配列
番号２に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有
するアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のピラノー
ス測定用試薬。
【請求項６】ピラノースオキシダーゼが配列表の配列
番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有
するアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のピラノー
ス測定用試薬。
【請求項７】ピラノースオキシダーゼが配列表の配列
番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有
するアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のピラノー
ス測定用試薬。
【請求項８】ピラノースオキシダーゼが配列表の配列
番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有
するアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のピラノー
ス測定用試薬。
【請求項９】ピラノースオキシダーゼが配列表の配列
番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有
するアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のピラノー
ス測定用試薬。
【請求項１０】配列表の配列番号２の部分アミノ酸配
列１−２５からなるポリペプチド：部分アミノ酸配列２
６−４３５からなるポリペプチド：部分アミノ酸配列４
３６−５６４からなるポリペプチド：部分アミノ酸配列
１−４３５からなるポリペプチド：及び部分アミノ酸配
列２６−５６４からなるポリペプチド：並びに上記アミ
ノ酸配列の何れかの中に１〜複数個のアミノ酸変異を有
するポリペプチドおよび上記アミノ酸配列の何れかと５
０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペ
プチド；の単独又は何れかのポリペプチドの組み合わせ
から成るピラノースオキシダーゼを含む、ピラノース測
定用試薬。
【請求項１１】ピラノースが、Ｄ（＋）−グルコー
ス、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール、Ｌ（−）
−ソルボース、Ｄ（＋）−キシロース、トレハロース、
Ｄ（＋）−ガラクトースまたはマルトースから選択され
る、請求項１から１０の何れか１項に記載のピラノース
測定用試薬。
【請求項１２】ピラノースがＤ（＋）−グルコースで
ある、請求項１１に記載のピラノース測定用試薬。
【請求項１３】糖類の代謝異常を伴う疾患の診断薬で
ある、請求項１から１２の何れか１項に記載のピラノー
ス測定用試薬。
【請求項１４】糖尿病の診断薬である、請求項１３に
記載のピラノース測定用試薬。
【請求項１５】請求項１から１２の何れか１項に記載
のピラノース測定用試薬を試料中のピラノースと反応さ
せ、生成する過酸化水素を酵素と反応させて発色させる
ことを含む、試料中のピラノースの測定方法。
【請求項１６】請求項１３に記載のピラノース測定用
試薬を被験者から採取した試料中のピラノースと反応さ
せ、生成する過酸化水素を酵素と反応させて発色させる
ことを含む、糖類の代謝異常を伴う疾患の診断方法。
【請求項１７】糖類の代謝異常を伴う疾患が糖尿病で
ある、請求項１６に記載の診断方法。
【請求項１８】請求項１から１４の何れか１項に記載
の試薬を含む、ピラノース分析用あるいは糖類の代謝異
常を伴う疾患の診断用のキット。