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WO1991001999A1 - Proteine d'inhibition de la phospholipase a2 naissant dans une region inflammee, sa production et gene prevu a cet effet - Google Patents

Proteine d'inhibition de la phospholipase a2 naissant dans une region inflammee, sa production et gene prevu a cet effet Download PDF

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WO1991001999A1
WO1991001999A1 PCT/JP1990/000996 JP9000996W WO9101999A1 WO 1991001999 A1 WO1991001999 A1 WO 1991001999A1 JP 9000996 W JP9000996 W JP 9000996W WO 9101999 A1 WO9101999 A1 WO 9101999A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
phospholipase
amino acid
acid sequence
protein
inhibitory
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1990/000996
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yorimasa Suwa
Atsushi Imaizumi
Masahiro Okada
Ichiro Kudo
Keizo Inoue
Yoji Suzuki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Teijin Ltd
Original Assignee
Teijin Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority claimed from JP2089085A external-priority patent/JP2581823B2/ja
Application filed by Teijin Ltd filed Critical Teijin Ltd
Publication of WO1991001999A1 publication Critical patent/WO1991001999A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Tree invention inhibits protein against phospholipase A 2 which Azukasuru Toki the progression of inflammation and Toki to their preparation and their genes, more particularly La, zone preparative or inflammatory sites from Hosuhoripa over peptidase A 2 inhibitory proteins of human, the I will fight for the manufacturing method and its message.
  • Steroids have been used as powerful anti-inflammatory drugs in the treatment of many inflammatory diseases. However, steroids have a variety of side effects due to their hormonal effects.
  • the present inventors focused on these problems, was first purified Hosuhoripa Ichize A 2 Ri by peritoneal exudate of rats caused peritonitis by cold fin administration.
  • the present inventors have human inflammatory sites, i.e., succeeded in be purified phospholipase A 2 from chronic Toki clause Riu ⁇ Ji patient Toki clause solution (WO89 / 05851 Pat (Japanese Patent Application No. Sho 62- ⁇ 1 - ) ⁇ ⁇ ), Hara eta 1, J. ⁇ ⁇ ocne HI. 103 ⁇ 4, ⁇ oi 28 1988) revealed that phospholipase A 2 derived from human inflammation localization is very similar in enzyme activity and structure to phospholipase A 2 from rat inflammation localization.
  • the ⁇ white approximately 33kDa is an exploded 11 human complement C 3 as a protein enzyme treated to specifically inhibit human chronic Toki clause arthritis patients Toki clause liquid Yamaki phospholipase A 2
  • the amino acid sequence at the N-terminal was determined (JP-A-2-91100 (Japanese Patent Application No. 63-242556)).
  • inhibitory proteins are derived from phospholipase A 2 derived from ⁇ No inhibitory activity was shown at all. ⁇ In other words, these inhibitory breaks are completely unique in that they have an activity that overcomes the above two points, which have been problematic in conventional research. phospholipase a 2 is expected to show potent anti-inflammatory effects in either spring from inhibitory protein.
  • JP-A-2-91100 does not disclose the entire amino acid sequence or gene of the inhibitory protein at all.
  • An object of the present invention is to elucidate the entire amino acid sequence of an inflammation local-derived phospholipase 2 inhibitory protein.
  • the present inventors have conducted a study and found that the protein encoded by 1032 bases, a protein consisting of 344 amino acids, and encoded by 1047 bases, and 34 protein comprising an amino acid is one that has reached the present invention by finding that each have inflammatory sites derived phosphite Horipaze a 2 inhibitory activity.
  • the present invention relates to a phospholipase A 2 inhibitory protein originating from local inflammation having the amino acid sequence shown in FIG. 1 or an amino acid sequence physiologically equivalent thereto.
  • the ⁇ invention inflammatory sites from Hosuhoripa over peptidase A 2 inhibitory protein having a first figure shows ⁇ "Amino acid sequence or its physiologically equivalent amino acid sequence of feature to enzymatic treatment serum of a mammal It is a manufacturing method of.
  • the present invention comprises the amino acid sequence.
  • This is a physiologically-inflammatory topically-derived phospholipase A 2 inhibitory protein encoding inflammatory local-derived Hosuhoripa Ichize A 2 inhibitory proteins having equivalent amino acid sequence shown in Figure 1 Is the gene.
  • the present ⁇ are human inflammatory topical-derived phospholipase A 2 inhibitory proteins having the amino acid sequence or its physiologically equivalent amino acid sequence shown in Figure 3.
  • the present invention is characterized as to that the '3 figure to the amino acid sequence or its physiologically human inflammatory sites derived phospholipase A 2 inhibitory protein production method having the same amino acid sequence that enzymatic treatment of human serum is there.
  • ⁇ Also present invention is a gene encoding human inflammatory station plant derived Hosuhoripa Ichize A 2 inhibitory protein having an amino acid sequence or This is a physiologically equivalent amino acid sequence shown in Figure 3. '' Brief description of ⁇ !
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of a phospholipase- 2 inhibitory protein derived from a local inflammation of the present invention-rat (inhibitory protein rat).
  • FIG. 2 shows the inhibitory protein of the present invention containing the rat gene.
  • Figure 3 is shown Figure 4 the amino acid sequence site of inflammation derived phospholipase A 2 inhibitory proteins Hito (inhibitory protein Ichihi preparative> of the present invention, an example of the inhibitory protein Ichihi preparative gene DNA sequence of the present invention Is shown.
  • Fig. 5 shows the elution pattern of the inhibitory protein and rat using anion-exchanged HPLC.
  • FIG. 6 shows an elution pattern of an inhibitory protein rat using gel filtration HP LC.
  • FIG. 7 shows an elution pattern of an inhibitory protein from a rat using anion-exchanged HPLC.
  • FIG. 8 shows the output pattern of the inhibitory protein rat using reverse-phase HPLC.
  • FIG. 9 shows the inhibitory protein—SDS of rat—PAGE.
  • FIG. 10 shows the inhibitory activity of the inhibitory protein rat of the present invention.
  • Figure No. 1 1 (same a and same b) are both show various phospholipase A 2 inhibition ⁇ inhibition ⁇ M- rats of the present invention.
  • FIG. 12 shows the results of Western blotting of untreated and 37C-treated human sera.
  • Fig. 13 shows the elution pattern of human inhibitory protein when j'n was used for preparative size aion exchange HP LC (Fig. 13 a) and SDS-PAGE (b).
  • Fig. 14J1 shows the elution pattern of inhibitory protein (Fig. 14a) and SDS-PAGE (D) using anion-exchanged HPLC of analytical size.
  • Figure 15J1 shows the inhibitory protein-elution pattern ( Figure 15a) and SDS-PA when gel permeation HPLC was used.
  • Fig. 16 Inhibitory proteins when reversed-phase HPLC was used
  • FIG. 17 shows the inhibitory activity of the inhibitory protein of the present invention on human.
  • the 1st Sl shows the strategy for determining the nucleotide sequence including the genes of the inhibitory proteins of the present invention.
  • FIG. 19 shows a portion of the amino acid sequence of rat C3 corresponding to the amino acid sequence near the cleavage site of human C3 by factor-1I.
  • Fig.% ⁇ 0 shows the binding between the human inhibitory protein of the present invention, SDS- ⁇ GE (No. 2,011a) and Western protein / (b).
  • Inflammatory sites derived phospholipase A 2 inhibitory proteins of the present invention is poly consisting 349 amino acid sequence shown in Poripeachi de or Figure 3 consists of 344 amino acid sequence shown in Figure 1
  • the peptide is a peptide, if it has substantially the same biological activity as that of the polypeptide, a polypeptide which is formed by partial substitution, deletion, insertion or the like in the above amino acid sequence is also included in the present invention.
  • mammals for example humans, serum such as rats by enzymatic treatment Ru can produce inflammatory sites derived phospholipase A 2 inhibitory proteins that have a said amino acid sequence, the enzyme treatment in the production method
  • serum is directly treated with 3 C for 6 days to 1 (for 3 days) or that C 3 is purified from the serum and subjected to a normal enzyme treatment operation using Factor I. .
  • an example of the gene for the phospholipase- 2 inhibitory protein derived from the local inflammation of the present invention consists of 1032 or 1047 DNA base sequences shown in FIG. 2 or FIG.
  • Both A and double-stranded DNA comprising this single-stranded DNA and complementary DNA are included in the category. Furthermore, if the amino acid sequence encodes the amino acid sequence of the inhibitory protein, DNA composed of the base sequence by partial substitution, deletion and insertion, DNA containing the base sequence, and a part of the base sequence DNA that has only the above-mentioned is naturally included in the gene for the phospholipase derived from the inflammatory site of the present invention 2 inhibitory protein.
  • the phospholipase A2 inhibitory protein of the present invention can be obtained by heat treatment or after enzyme treatment by the method of serum (Vii, D. eai. J. Immuiio i. 134, 2571, J9a?). was San'aru inflammation localized derived phospholipase a 2 activity and indicators of Anion exchange HP LC, gel:. T over HP LC, reverse phase HP LC etc. Therefore isolating ⁇ purification,
  • mammalian serum particularly preferably sera / human serum, and human serum
  • human serum can be used. Then, the sample thus isolated / purified can be subjected to gas-phase flow analysis.
  • the N-terminal amino acid sequence is determined by the Nike's Appiiea isiosystem Nene ( ⁇ ).
  • the gene for the inflammation-localized phospholipase 2 inhibitory protein of the present invention is, for example, la, Screening is performed using DA (de Bruljn, et al, Pro Natl. Acad. ScL USA. 82, 70s, 1985).
  • ⁇ r C 3 ⁇ . ⁇ has the longest inserted gene fragment of about 2.7 Kbp, and is considered to be a protein similar to C. It is considered that it completely contains the gene portion encoding '.
  • nucleotide sequence of this clone was determined, and the N-terminal amino acid sequence of the inhibitory protein was used as an index to determine the inhibitory effect of the clone. Determine the nucleotide sequence of the protein gene.
  • the N-terminal amino acid sequence of the isolated and purified Sanal is determined, and this amino acid sequence is designated as a human; is transmitted bye euru 1 j ⁇ etai,? R oc. Ati Acad. Sci. USA, 82, 708- / 12, 1985) determines the entire nucleotide sequence of the gene of the present inhibitory protein.
  • the entire amino acid sequence of the present inhibitory protein is determined from the entire base sequence.
  • the enzymatic reaction is performed by adding a mixture of 50 ⁇ of 0.5 ⁇ Tris ⁇ HCi ( P H9.0), 25 Mi of 40 ⁇ CaCi 2 and 25 JUL ⁇ to a total of 240 j ⁇
  • the enzyme solution O. lng / ii
  • the reaction was stopped by adding Doie's reagent (i. 5 mi) and the method of Do ie the resulting 14 C one fatty acid and extracted ⁇ was measured by liquid scintillation one Chillon counter according (2) SDS—polyacrylamide electrophoresis and Western 'blotting
  • the protein was transferred from the gel to a nitrocellulose filter using a Millipore electroprotic sig- nal.
  • Anti-human C 3d sheep serum (Dakc) horseradish's peroxidase conjugated anti-shed IgG antibody (CappeH and 4-clo-one-naphthol (Bio-Rad) as substrate, enzyme
  • the C3d band was detected by antibody staining.
  • a gas-phase protein sequencer (Valid, Biosystem 477A) and HPLC (Applied Biosystem 120A) were used.
  • Acetic acid was added to the reaction solution to adjust the pH to about 5, and the solution was applied to an Anhydroximotriacin agarose column (Takara Shuzo, bed volume 1.5 mi) equilibrated with 50 l ⁇ sodium acetate buffer containing 20 mM CaCi 2 ( ⁇ 5.0). Was added. ,
  • the C-terminal fragment was recovered as a flow-through fraction and the amino acid sequence was determined in the same manner as in (3) to determine the C-terminal amino acid sequence of the present inhibitory protein.
  • the present invention the entire amino acid sequence is a clearly Tsutano
  • it can be produced by a known chemical synthesis method, but can be produced easily and in large quantities by a genetic recombination method.
  • Inflammatory sites derived phospholipase A 2 inhibition ⁇ obtained in this Yo not only used as a per se anti-inflammatory agents, diagnosis of inflammatory diseases such proteins are have ⁇ the resulting antibody or the like as the antigen.
  • the method can be used as a kit for this purpose or as a kit therefor.
  • fraction of fraction Nr.666 in which a 39 kDa band was detected by SDS-PAGE in the fractions shown in FIG. 5, was collected, reduced, and further purified by gel permeation HP LC (TSKgelG3000 SW). Fractionation ( Figure 6). In FIG. 6, the solid line shows the absorption at UV 28 Gnni, and the arrow shows the elution position of the molecular weight marker.
  • the condition is 20mM Tris-HCi, pK7.5-1 ⁇ C aC1, 0.5mi / miII. 2min. Ztube.
  • the inhibitory protein rat (fraction Nr. 30) thus obtained showed a single band (estimated molecular weight of about 39 kDa) on SDS-PAGE (Fig. 9). Each sanal of 29-33 was reduced 10 times and performed.
  • Inhibitory protein of the present invention obtained in (A) (reverse phase HP LC off Ratashiyon Nr.30, protein concentration 4G g ZMI) inflammation localized derived phospholipase A 2, and inhibitory activity against phospholipase A 2 of the pond, the aforementioned Hosuhoripa Ichize a 2 Gaigai was measured by the activity measurement method (Mel in those as an enzyme with Hosuhoribaze a 2 rat platelet secretory. this enzyme is rat inflammatory sites derived phospholipase 2 h the same one. ⁇
  • 1 inhibitory protein amount required to iig ho Horipa Ichize A 2 activity to inhibit 50% is about 6 ng, were the 1 C 50 value is 0.8 X 10- 9 M.
  • this inhibitory protein is composed of phospholipase A 2 (OO) derived from the local inflammation, phospholipase derived from the warrior fluid of patients with chronic rhizoma rheumatism in humans ( ⁇ 2 —)), and rotaius aaamanteus venom Phospholipase A 2 (Low-mouth) showed almost the same inhibitory activity, but bovine phospholipase A 2 X — X, 1, i ⁇ aja naja venom Hosholinose A 2 ( X ...... X> did not show any inhibitory activity. It was found that the enzyme specifically inhibits lipase- 2 .
  • this inhibitory protein was derived from rat peritoneal cavity.
  • inhibitory protein one person Human inflammatory sites derived * phospholipase A 2 inhibitory proteins (hereinafter, referred to as "inhibitory protein one person"> Preparation and activity measurement of
  • the elution conditions 20 mM Tris - made in HCi, P K 7.5- IMNaCi0.5 3 ⁇ 41 / ⁇ ⁇ , 2 mi ⁇ tube.
  • Inhibition of the present invention obtained in (A) protein over human (reverse phase HP LC fractions Nr.30, protein concentration of about 15 ng / "l) of human inflammatory sites derived phospholipase 2 and other e Suhoripaze inhibitory activity against A 2 It was measured by the above-mentioned method for the determination of phospholipase a 2 inhibitory activity.
  • the N-terminal amino acid sequence of the inhibitory protein having a molecular weight of about 39 kDa isolated and purified in Example 1 (A) was determined using a gas phase protein sequencer 477A of Applied Biosystems. As a result, the following sequence was found. This closely matches the N-terminal sequence of C3dg deduced from the nucleotide sequence of rat C3cDNA, which can be found later. both N-terminal amino acid sequence derived from phospholipase a 2 inhibition ⁇ white was completely consistent.
  • DAKOPATTS anti-Egret IgG / Saviperoxidase-conjugated goat IgG fraction
  • CAPPED enzyme antibody staining using 4-cloth-11-naphthol (Bio-Rad) as substrate
  • the inhibitory protein reacted specifically with anti-human C3d serum.
  • Rat tfcDNAAgU1 library manufactured by Clontech Co., Ltd.> was used as a screening material, and screening was performed according to the description of Clontech experimental protocol. .
  • the screening probe used was labeled with mouse C 3 c DN A fragment obtained above (A) in 32 P.
  • the sequence analysis was performed according to the 7-D EAZA method (Mizusawa, et. Ai, due reic Acid Res. 14, 1319, 1986). 2
  • For the ⁇ fragment proceed to base sequence analysis by sequentially synthesizing primers corresponding to the determined peripheral region.
  • Figure 1 shows The numbers at the top are base numbers based on the rat C3 dg part separated by a frame in the interruption, EcoRI etc. are the names of the restriction enzymes used, and the numbers in the exclusion boxes are the cleavage sites Or it is the start position (base number) of the base sequence determination. Horizontal arrows indicate the direction and range of base sequencing by restriction enzymes and primers.
  • Human C3 is cleaved by datater I between 283 Arg and 284 Gi3 ⁇ 4 of the chain, but the corresponding site is mutated to G-Gly in rat C3, and the C-terminal 5 residues Arg-G exists.
  • the N-terminal amino acid sequence of the fragment generated by cleavage at this site completely matches the N-terminal amino acid sequence of the inhibitory protein of the present invention purified from rat serum.
  • rat C3 is considered to be cleaved at this site by an enzyme having activity similar to that of human factor. It is.
  • Inflammatory sites derived phospholipase A 2 inhibitory proteins of the present invention is encoded by the 1032 bases, Atsuta in protein consisting of 344 amino acids.
  • Example 2 Isolated in Example 2 (A).
  • the ⁇ -terminal amino acid sequence of the inhibitory protein (reverse-phase HPLC fraction ⁇ ⁇ 30; ') was determined by the method described above. As a result, the following sequence was found.
  • Example 2 The inhibitory protein with a molecular weight of about 3 Da isolated and purified in Example 2 (A) (reverse-phase HPLC fraction Nr. 30) was subjected to SDS-PAGE in the manner described above, followed by dust blotting and filtering. The cells were transferred to the first place and detected by enzyme-antibody staining using anti-human C3d serum. As a result, this inhibitory protein reacted specifically with anti-human C3d serum.
  • Figure 2011a shows the results of SDS-PAGE.
  • Figure 20b shows the results of Western blotting. From the results of ( ⁇ ) and (2) above, the inhibitory protein was found to be
  • the human lipase-derived phospholipase A2 inhibitor protein of the present invention is human C 3 dg. Therefore, it is considered that the nucleotide sequence of the present inhibitory protein gene completely matches the C3-encoding portion of the entire human C3 gene nucleotide sequence. In addition, it is considered that the entire amino acid sequence of the present inhibitory protein completely matches the portion corresponding to C3 in the entire amino acid sequence of human C3 deduced from the entire base sequence of human C3 gene. From the above, inflammatory topical derived Hosuhoripa over peptidase A 2 inhibitory entire amino acid sequence and human inflammatory topical-derived phospho proteins.
  • Lipase A 2 inhibitory entire nucleotide sequence of the protein gene FIGS. 3 and 4 of the present invention It was determined to be the one shown in the figure.
  • the inflammation-derived phospholipase A2 inhibitory protein of the present invention was encoded by 1047 bases and was composed of 349 amino acids.

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Description

m * 発明の名称 - 炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白、 その製造 力 およひての; is伝子
技何分野 ,
木発明は炎症の進行に鬨与するホスホリパーゼ A 2 に 対する阻害蛋白、 その製造方法及びその遺伝子に鬨する , 更に詳しくはラ、ゾト又はヒトの炎症局所由来ホスホリパ ーゼ A 2 阻害蛋白、 その製造方法及びその遣伝子に鬨す 。
背景技術
ステロイ ド剤は強力な抗炎症薬と して、 多くの炎症性 疾患の治療に用いられてきた。 しかし、 ステロイ ドはそ のホルモン作用により様々な副作用を持っため、 その使
ΙΠは比較的重篤な患者に限らざるを得ない したがつて ステロイ ドと同等の抗炎症作用を持ち、 かつ副作用の少 ない新規医薬品の開発が、 炎症牲疾患の治療にあたる医 師にとって最大の要求となっている。 '
ステロイ ドが抗炎症作用を発撣するメカニズムの一つ と して、 炎症局所に'おいてホスホリパーゼ A 2 を阻害す る蛋白を合成誘導することにより、 この酵素によるァラ キドン酸の遊離を抑制し、 その結果起炎的な作用を持つ ァラキドン酸代謝物の産生を^下させることが考えられ てい ( Flower e t a 1. Nature 278, 4 ?D, 1979)。 この ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白は、 上記の要求を満足する 活性を持つことが期待され ため、 数多くの研究者によ り、 その単離■ 精製と抗炎症作用評価の試みが行われて きた。
しかしながら、 これまでのところステロイ ドに匹敵す るほどの強力な抗炎症作用を示すものは見いだされて ^ ない。 その原因として次の 2つが考えられる。
すなわち、'' . ....
(1) 従来の研究では阻害活性の評価系に塍臓由来の酵素 を用いていたが、 炎症局所由来のホスホリパ一ゼ A 2 は驊由来ホスホリパーゼ A 2 とは異る構造及び酵素活 住を持つものであること
(2) ホスホリパ一ゼ A 2 に直接作用するものではなく、 基質側との；相互作用による見かけ上の阻害活性を検出 していたこと
である 0
本発明者ら 、 これらの問題点に着目し、 まず、 カゼ ィン投与により腹膜炎を起こしたラットの腹腔浸出液よ りホスホリパ一ゼ A 2 を精製した。
また 本発明者らはヒト炎症局所、 すなわち、 慢性鬨 節リウ^チ患者鬨節液よりホスホリパーゼ A 2 を精製す ることに成功し （WO89/05851号明細書 （特願昭 62- ^ 1 ·)~^ ) 、 Hara e t a 1 , J . β ι o c n e HI . 10¾ , ^ o-i 28 1988) 、 ヒト炎症局所由来ホスホリパ一ゼ A 2 はラット 炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 と酵素活性及び構造に おいて極めてよく似たものであることを明らかにした。 すなわち、 酵素活性においては、 両酵素ともにホスファ チジルエタノールァミンに対して高い特異性を有してい た。 臈臓由来のホスホリパ一ゼ A 2 はこのような基質特 異性を有さない。 また、 構造においては、 N末端 34個の ァミノ酸配列を比較した結果、 ラ、ソ ト炎症局所由来ホス ホリパーゼ A 2 とヒ ト炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 とのホモロジ一は 67%であるのに対し、 ヒ 卜炎症局所由 来ホスホリパーゼ A 2 とヒト滕臓ホスホリパーゼ A 2 と のホモロジ一は 45%にすぎないことが明らかになった。
一方本発明者らは、 ラット腹腔浸出液から精製したホ スホリパーゼ A 2 を特異的に阻害する蛋白を、 デキサメ サゾン投与ラッ トの腹腔洗浄液中に見出し、 これを精製 して約 35kDa と 40kDa の蛋白を得、 各々の N末端アミノ 酸配列を決定した （特開昭 63-246397 号公報 （特願昭 号） ) 。
また本発明者らは、 ヒト慢性鬨節リウマチ患者鬨節液 山来ホスホリパーゼ A 2 を特異的に阻害する蛋白と して ヒト補体 C 3を酵素処理した分解 11である約 33kDa の蛋 白を得、 その N端部アミノ酸配列を決定した （特開平 2- 91100 号公報 〈特願昭 63-242556 号） ） 。
これらの阻害蛋白は嬅由来のホスホリパーゼ A 2 等に 対しては全く阻害活性を示さなかった <. すなわち、 これ らの阻害擘白は、 従来の研究において問題となっていた 上記 2点を克服した活性を持つ点で全くユニークなも のであり、 従来のホスホリパーゼ A2 阻害蛋白よりはる かに強力 抗炎症作用を示すことが期待できる。
しかしながら、 炎症局所由来ホスホリパーゼ 阻害 蛋白の全アミノ酸配列は未だ解明されていなかった。 ま た、 ラッ トの尊腔洗浄液から抽出精製する方法またはヒ ト C 3を ^口テア一ゼで分解する方法を用いる場合、 抗 炎症作用を評価するのに十分な量のホスホリパ一ゼ A 2 阻害蛋白を得ることは極めて困難である。
一方、 本発明者らによればラ、、 /ト腹腔洗浄液より精製 した炎症烏所由来ホスホリパ一ゼ A2 阻害蛋白の N末端 アミノ酸 列はヒ卜補体 C 3ひ鎖のアミノ酸配列の一部 と極めて ~高いホモロジ一を有しており、 C 3の分解物 C 3 (1。。または 3 (1 と類似の蛋白であると考えられた。
ヒト補体 C 3は血清中のァロテア一ゼによって段階的 に分解され、 最終的に C 3 dgまたは C 3 d が生成するこ とが知られている また、 慢性関節リウマチ患者鬨節 液において、 免疫化学的方法により、 高い C 3 d 直が検 出されること、 及びその値が病態の重症度と相鬨を示す ことが知もれている（Nydegger et al. J. Clin. Invest
862-868 1 77) ,
従来、 補^ C 3と炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻 害蛋白との鬨係に鬨するものと しては、 既述の特開平 2- 91100 号公報がある。 しかしながら特開平 2-91100 号公 報には、 該阻害蛋白の全アミ-ノ酸配列や遺伝子について の記載は全くなされていない。
また補体 C 3のなかでもその分解物である C 3 dgと該 阻害蛋白との鬨係についての記载や、 血清を酵素処理す ることによる該阻害蛋白の製造方法についても何ら記載 もされていないのである。
本発明の目的は、 炎症局所由来ホスホリパーゼ 2 阻 害蛋白の全アミノ酸配列を明らかにすることにある。
さらに本発明の目的は、 そのようなアミノ酸配列を有 する炎症局所由来ホスホリパ一ゼ A 2 阻害蛋白をコード する D N A配列を明らかにし、 この蛋白を大量に洪耠で きる製造方法を提供することにある。
発明の開示
かかる徒来技術の問題点に鑑みて本発明者らは銳意検 討の結果、 1032個の塩基でコードされ、 344 個のアミノ 酸からなる蛋白、 および 1047個の塩基でコードされ、 34 個のアミノ酸からなる蛋白が各々炎症局所由来ホス ホリパーゼ A 2 阻害活性を有することを知見して本発明 に到達したものである。
すなわち本発明は、 第 1図に示すァミノ酸配列又はこ れと生理学的に同等のァミノ酸配列を有する炎症局所由 来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白である また^発明は哺乳動物の血清を酵素処理することを特 徴とする第 1図に示^"ァミノ酸配列又はこれと生理学的 に同等のアミノ酸配列を有する炎症局所由来ホスホリパ ーゼ A 2 阻害蛋白の製造方法である。
更にまた本発明は、 第 1図に示すアミノ酸配列.又はこ れと生理学的に同等のアミノ酸配列を有する炎症局所由 来ホスホリパ一ゼ A 2 阻害蛋白をコードする炎症局所由 来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白の遺伝子である。
また本堯明は、 第 3図に示すアミノ酸配列又はこれと 生理学的に同等のアミノ酸配列を有するヒト炎症局所由 来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白である。
また本発明はヒト血清を酵素処理することを特徴とす る第' 3図に すアミノ酸配列又はこれと生理学的に同等 のアミノ酸配列を有するヒト炎症局所由来ホスホリパー ゼ A 2 阻害蛋白の製造方法である。
^にまた本発明は、 第 3図に示すアミノ酸配列又はこ れと生理学的に同等のアミノ酸配列を有するヒト炎症局 所由来ホスホリパ一ゼ A 2 阻害蛋白をコードする遺伝子 である。 ' ί!面の簡単な説明
第 1図は、 本発明の炎症局所由来ホスホリパーゼ Α 2 阻害蛋白—ラッ ト （阻害蛋白ーラット） のアミノ酸配列 を示'す.。 ，
第 2図は、 本発明の阻害蛋白ーラットの遺伝子を含む D N A Ji Sc歹 の一例を示す
第 3図は、 本発明の炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白ーヒト （阻害蛋白一ヒ ト〉 のアミノ酸配列を示 第 4図は、 本発明の阻害蛋白一ヒ トの遺伝子の DNA 塩基配列の一例を示す。
第 5図は、 ァニオン交換 H P LCを用いた場合の阻害 蛋白一ラットの溶出パタ一ンを示す
第 6図は、 ゲル沪過 HP LCを用いた場合の阻害蛋白 ーラットの溶出パターンを示す。
第 7図は、 ァニオン交換 H P LCを用いた場合の阻害 蛋白一ラットの溶出パターンを示す。
8図は、 逆相 H P L Cを用いた場合の阻害蛋白ーラ ツ Γの 出ノ ターンを示す。
第 9図は、 阻害蛋白—ラットの S D S— PAGEを示 す。
第 1 0図は、 本発明の阻害蛋白ーラットの阻害活性を 示す。
第 1 1図 （同 a及び同 b ) は、 ともに本発明の阻害蛋 M—ラッ トの各種ホスホリパーゼ A2 阻害话牲を示す。
第 1 2図は、 未^理及び 37C¾^理したヒ卜血清のゥェ スタンブロッティングの結果を示す。
第 1 3図は、 分取用サイズのァ二オン交換 H P LCを j'nいた場合の阻害蛋白ーヒトの溶出パターン （第 1 3図 a ) と S D S— PAGE (同 b〉 を示す。
第 14J1は、 分析用サイズのァニオン交換 H P LCを 用いた場合の阻害蛋白ーヒ の溶出パターン （第 14図 a〉 と S D S— PAGE (同 〉 を示す。
第 1 5J1は、 ゲル沪過 H P LCを用いた場合の阻害蛋 白—ヒ卜の溶出パターン （第 1 5図 a〉 と S D S— PA
GE: (.同!^) を示す。
第 1 6図 、 逆相 H P LCを用いた場合の阻害蛋白一
Lトの溶 ¾パターン （第 1 6図 a ) と S D S— PAGE (同 b〉 を：示す。
第 1 7図:は、 本発明の阻害蛋白ーヒトの阻害活性を示 す。
第 l Sl は、 本発明の阻害蛋白一ラ、、 /トの遺伝子を含 む塩基配列決定のストラテジーを示す。
第 1 9図は、 ラット C 3のァミノ酸配列のうち、 ヒト C 3のファクタ一 I による切断部位近傍のアミノ酸配列 に相当する部分を示す。
% Δ 0図は、 本発明の阻害蛋白ーヒトの S D S— ΡΑ GE (第 2,011a ) 及びウェスタンプロ "/ティング （同 b ) の結 を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明の炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白は 第 1図に示す 344 個のアミノ酸配列からなるポリペアチ ド又は第 3図に示す 349 個のアミノ酸配列からなるポリ ぺプチドであるが、 それと実質的に同等の生物活性が保 持されているならば、 上記アミノ酸配列に部分的な置換， 欠失， 揷入などがなされて楕成されるポリペアチドも本 発明の炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白に含ま Zしる 。
本発明の製造方法においては、 哺乳動物、 例えばヒト， ラット等の血清を酵素処理して上記アミノ酸配列を有す る炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白を製造でき るが、 かかる製造方法における酵素処理とは、 例えば、 血清を直接 3 Cで 6日〜 1 (3日間処理するか、 あるいは同 血清から C 3を精製しこれを F a c t o r Iを用いて通常の酵 素処理操作に付すことをいう。
更にまた、 本発明の炎症局所由来ホスホリパーゼ 2 阻害蛋白の遺伝子の一例は第 2図又は第 4図に示す 1 032 個又は 1 047個の D N A塩基配列からなるが、 一本鎮
A、 又はこの一本鎖 D N Aと相補 D N Aとからなる二本 鎖 D N Aのいずれもその範疇に含まれる。 更に上記阻害 蛋白のアミノ酸配列をコードするものであれば、 上記塩 基配列に部分的な置換， 欠失， 挿入がなされて構成され る D N A、 上記塩基配列を含む D N A、 および上記塩基 配列の一部分のみを有する D N A ί当然本発明の炎症局 所由来ホスホリパーゼ Α 2 阻害蛋白の遺伝子に含まれる。
次に本発明の炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋 白の全アミ ノ酸配列及びこの阻害蛋白の遺伝子に至る迄 の本発明め手法につき説明する。
本発明の炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白は、 血清 (Vii, D. . e a i . J. I mmuiio i . 134, 2571 , J 9 a?) らの方法により熱処理するか酵素処理後、 得られ たサンアルを炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 活性を指 標と してァニオン交換 H P LC , ゲル: T過 H P LC , 逆 相 H P LC等に.よって単離■ 精製する，
かかる血清としては、 哺乳動物の血清、 なかでも好ま しくはラ "/ド'血清、 スはヒ卜血清を用いることができる。 次いで、 このように単離■ 精製されたサンプルを気相 フ ロアィ ンン一ケン 'サー 、 Appiiea isiosystem ネェノ （^よ り、 N末端アミノ酸配列を決定する。
一方.、 本発明の炎症局所由来ホスホリパーゼ 2 阻害 蛋白の遣伝子は、 例えばラ、、/トの場合であればラ、、/ト肝 c i N Aライブラリ一をプ口一ブとしてマウス C 3 c D A ( de B r u l j n , et a 1 , Pro Natl. Acad. Sc ι . USA , 82， 70s, ·1985 )を用いてスクリ一二ングする。
得られたラット C 3 c D Ν Αのホジティブクローンの うち、 λ r C 3 Ζ.Πが挿入遺伝子断片が約 2.7Kbpと最も 長く、 C と類似の蛋白と考えられる本発明の阻害蛋 白をコードする遺伝子部分を完全に含んでいるものと考 え '。
そこで、 このクロ一ンの塩基配列を決定し、 更に前述 の本阻害蛋白の N末端アミノ酸配列を指標にして本阻害 蛋白の遺伝子の塩基配列を決定する。
またヒトの場合には、 まず単離 · 精製されたサンアル の N末端アミノ酸配列を決定し、 このアミノ酸配列を指 こ してヒ トし ； is伝卞 e uru 1 j η e t a i , ?r oc. a t i Acad. Sci. USA, 82, 708-/ 12, 1985)の塩基配列から本 阻害蛋白の遺伝子の全塩基配列を決定する。
更に、 この全塩基配列より、 本阻害蛋白の全アミ ノ酸 配列を決定する。
本発明において用いられた各種試験， 測定法は以下の とおりである。
(1) 炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害活性の測定法 酵素と してカゼィン誘導ラット腹腔浸出液又は慢性 鬨節リウマチ患者鬨節液より単離■ 精製したホスホリ パーゼ A 2 を用い、 基質と しては14 C 一酢酸と共に培 養した E. Coi i より抽出， 精製した14 C一ホスファチ ンノレ上； ノ ーノ V /* ン リ 2 , 00リ a pnjz anio J . 1 m l ) を 用いた。
酵素反応は、 50〃ϋ の 0. 5Μ Tris ■ HCi (PH9.0) , 25 M i の 40ηιΜ CaCi2 ， 25JUL ^ の基質にサンアルおよび 水を加えて総量 240 j ^ と して混合し最後に の 酵素液 （ O. lng / i i ) を加え、 37°Cにて 10分閬反応 させたのち、 Doie' s試薬 （ i. 5 mi ) を加えて反応を停 止し、 Do ieの方法に従って生成した14 C一脂肪酸を抽 岀し、 液体シンチレ一シヨン · カウンターで測定した (2) S D S—ポ ァクリルアミ ド電気泳動およびウェス タン ' ブロッティング
酵素処理又は H P L Cにより得られたサンアルに 1/10量の色素液 （ 0.1 % B P B , X C , 10%S D S ) を加え、 100 C 5分閭熱処理後、 12.5%ポリアクリル アミ ドゲルにアプライ し、 1 %S D S存在下、 15〜25 mAで ί, 時閤.電気泳動した。 還元状態での解析のため にはサ プルに 2—メルカプトエタノール （ 2 ΜΕ ) を加えた。 勤後、 蛋白の検出のために C Β Βで染色 した。、
また、： 同様に泳動した後ミ リポア社エレクトロプロ ッ.ティ シグ装置を用いて、 蛋白をゲルからニトロセル ロース . フィルターに移した。 抗ヒト C 3 d ヒッジ血 清 （Dakc) ， 西洋ヮサビ ' ペル才キシダ一ゼ結合抗ヒ ッジ IgG抗体 （ CappeH および基質と して 4—クロ口 - 一ナフトール （Bio-Rad)を用い、 酵素抗体染色法 により C 3 d のバンドを検出した。
(3) 蛋白 N末端アミノ酸配列の決定法
気相プロティン · シークェンサ一 （ァァライ ド，· バ ィォシステム 477 A ) および H P L C (アプライ ド · バイオシステム 120 A ) を用いた。
すなわち、 0.1 %TF Aに溶解したサンプル 100 M 'を、 上記気相プロティン · シークェンサ一にァァラ ィ した f 自動的にェドマン分解された P丁 H (フエ二 ルチオヒダントイン〉 アミノ酸誘導体は、 その後、 高 速液体クロマトグラフィ一にて各アミノ酸と して分析 された。 _
(4} 蛋白 C末端アミノ酸配列の決定法
サンプル約 150 gを 10ΰ xxi の 8 M尿素一 125mM トリス塩酸バッファー （ PH7. 6)に溶解し、 2 JJ の 2 一メルカァト.ェタノールを加え 37。C， 4時間置いた後、 2 の 4 一ビニルピリジンを加え、 37°C， 45分間反 応させた。 本サンアルを逆相 H P L C (Vydac 218TP54 ) にて脱塩後、 凍結乾燥する。 本サンプルを 200 の 8 M尿素一 1 %炭酸水素アンモニゥム溶液に溶解し、 これに 600 μ の 1 %炭酸水素アンモニゥム溶液を加 えた後、 1〃 gの ーキモトリアシンを加え、 3 Cで 時間反応させた。 ここでキモトリアシンを用いたの は本蛋白の C末端が Arg と予想されたためである。
応溶液に酢酸を加えて PHを約 5にし、 20mM CaCi2 を含む 50ιηΜ酢酸ナトリウムバッファ一 （ ρΗ5· 0) で平衡化したアンハイ ドロキモトリアシンァガロース カラム 〈宝酒造， ベッド体積 1.5 mi ) に添加した。，
C末端フラグメントを素通り画分に回収し、 （3) と 同様にしてアミノ酸配列を決定することによ り本阻害 蛋白の C末端アミノ酸配列を決定した。
本発明の炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白は、 本発明によってその全アミノ酸配列が明らかになつたの で、 公知のィ 学合或法によって製造することもできるが 遺伝子組換え法によって容易かつ大量に製造することが できる。 ―
このよ にして得られた炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害翬白はそれ自体抗炎症剤として利用するだけで なく、 かかる蛋白を抗原と して得られた抗体等を兩いて 炎症性疾患の診.断方法、 あるいはそのためのキットと し て利用することができる。
実施例
以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。
^施例 Ϊ
ラツト炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白 （以 下、 「阻害蛋白ーラット」 と略す〉 の調製および活性測 疋
(A) 阻害蛋白一ラットの調製
(1/ ラット血清' (日生材〉 に 0. 1 %NaN 3 を加え、 37 Cで 10日間処理した。 これにプロテアーゼ . インヒ ビター （ 20 g-ゾ miァァロチニン， g- /'mlダイ ズ リァシンインヒビタ一， 0. 5mM E D T A ) を 加えた後、 3 の 20mM Tris - il , ph'7. 5 に対し て 2回透析を行った。
(2) (1} で得られた透析後のサンプル （蛋白濃度約 30 mg/inl ) を 20倍稀釈し、 遠心分離操作によ り不溶物 取り除いた後、 以下のようにして目的蛋白を単離 ， 精製した。
まず、 サンアルを分取用サイズのァ二オン交換 H P L C ( TS geiDEAE-5.P ) で分画した （第 5図） 。 第 5図において、 実線は U V 280nin における吸収、 破線は NaCi濃度勾配を示す。
溶出は 20iriM Tris-HCi, PK7.5- aCl (0—0.35M), Ί . 5 mi ,.メ m i n , 2 m in · / " b eで行った。 カラムサイズ は 2丄.5 Φ X 30 cmでめる 0
次いで、 第 5図に示されたフラクション中の S D S— P A G Eで 39kDa のバンドが検出されたフラク シヨン Nr.6 63の部分を集め、 潢縮し、 これをゲル 過 HP LC ( TSKgelG3000 SW)で更に分画した （第 6図） 。 第 6図において、 実線は U V 28Gnni におけ る吸収、 矢印は分子量マーカーの溶出位置を示す。
¾条什は 20mM Tris-HCi, pK7. 5~1Μ Ν a C 1 , 0. 5 mi / m i II . 2min. Ztubeである。
次に第 6図中の S D S— P A G Eで 39kDa のバン ドが検出されたフラクション Nr. 19-20のピーク部分 を集め、 分析用サイズのァニオン交換 H P L C ( TS KgelDBAE-5PW) で精製した （第 7図〉 。 第 7図にお いて実線は U V 2S0nm における吸収、 破線は NaCl濃 度勾配を示す。
精製は、 20mM Tris-HCi, PH7. 5~NaCi (0—1. OM 1.0 mi / m i n, 2m in. ,'. t Ή b eで ίτつた - 最後に第 7図中のメイン ■ ピークのフラクション Nr.1 を更に逆相 H P LC ( Bi o-RadRP304 / で精製 した （第 8図〉 。 第 8図において実線は U V210nm における吸収、 破線は C¾CN濃度勾配を示すぐ 精製 は、 （k 1 %T F A C¾CN O〜80%, 1 ml/mia. ,
2mi n. Zttibeで行った。
こ よう して得られた阻害蛋白 ラツト （フラ クション Nr.30)は S D S— P A G Eで単一のバンド (推定分子量約 39kDa)を示した （第 9図〉 。 S D S — P AGEは、 フラクション Nr.29-33の各サンアル を 10倍 縮し、 行った。
(B) 阻害蛋白ーラットのホスホリパーゼ A 2 iS害活性
(A) で得られた本発明の阻害蛋白 （逆相 H P LCフ ラタシヨン Nr.30 , 蛋白濃度 4G g Zmi ) の炎症局所 由来ホスホリパーゼ A 2 およびその池のホスホリパー ゼ A2 に対する阻害活性を、 前述のホスホリパ一ゼ A2概害活性の測定法によって測定した （酵素と して ラット血小板分泌性のホスホリバーゼ A2 を用いた。 本酵素はラット炎症局所由来ホスホリパーゼ 2 h同 一のものでめる。 〉 。
(1) 本発明の阻害蛋白のラットホスホリバ一ゼ A 2 阻 害活性を見るために、 阻害蛋白の種々の量 （ 3， 6 , 9 , 12, 15, 18ng) で測定した,， 結果を第 : L 0図に 示した。. 1フ
第 1 ◦図から本阻害蛋白はラット炎症局所由来ホ スホリパーゼ A 2 を闬量依存的に阻害することが明 らかである。 1 iigのホ ホリパ一ゼ A 2 活性を 50% 阻害するのに必要な阻害蛋白量は約 6 ngであり、 1 C 50値は 0.8 X 10— 9Mであった。
(2) ホスホリパーゼ A 2 と して、 ラッ ト炎症局所由来 ホスホリパーゼ A 2 のほかに、 ヒト慢性閔節リウマ チ患者鬨節由来ホスホリパ一ゼ A 2 〈特開昭 63-246 " I -公報ノ ， Crotams adamanteu s venom (マム シ毒〉 ホスホリパーゼ A 2 ( Sigma 社製〉 ， ブタ滕 臓ホスホリパーゼ A 2 ( Sigma 社製） ， Naja naja venom (コブラ毒〉 ホスホリ.パーゼ A 2 ( Sigma 社 製〉 を用い、 同一条件で本発明の阻害蛋白による阻 害活性を測定し、 結果を第：！ 1図 a , 同 bに各々示 した。
第 1 1図から明らかなように、 本阻害蛋白はラ、、/ ト炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 ( O-O ) 、 ヒ ト慢性鬨節リゥマチ患者鬨節液由来ホスホリパーゼ Ά 2 — ΖΛ ) 、 し rotai us aaamanteus venom ホス ホリパーゼ A 2 (ロー口〉 に対しては、 ほぼ同等の 阻害活性を示したが、 ブ 驊臓ホスホリパーゼ A2 X — X ,1 、 i\a j a naja venom ホ.スホリノヾーセ A 2 ( X…… X〉 に対しては全く阻害活牲を示さなかつ た。 これにより、 本阻害蛋白は炎症局所由来ホスホ リパ^ "ゼ 2 に対して特異的に阻害作用を示すこと が明らかとなった。
(3) (A) で得られた本阻害蛋白について、 活性測定系 の基質濃度を 0.1 〜(！ · 35mMと変化させても本阻害蛋 白の阻害活性に変化は見られなかった。 また、 话性 測定の前に本阻寄蛋白を酵素とアレインキュベ一シ ヨンしても阻害活性に変化は見られなかった。
これらの結果から本阻害蛋白の活性は基質との相 互作用によるものではないと考えられた。
(4) 以上の,結果から本阻害蛋白は、 ラッ 卜腹腔由来の
'炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白と分子量 がほぼ同,一でかつ同じ活性を有する蛋白であること が明らかとなった。
実施例 2 '
ヒ 炎症局所由 *ホスホリパーゼ A2 阻害蛋白 （以下、 「阻害蛋白一ヒト」 と略す〉 の調製及び活性測定
(A) 阻害蛋白ーヒトの調製
(1) ヒ ^血清 30mしに 0.1 %HaN 3 を加え、 37でで 10日 閤^理した。 ， 処 ¾及び末処理サンアルをそれぞれ 50倍希釈後、 常法にしたがって SD S— PA GE後ゥヱスタン - ブ口ヅティ ングによ りフ ィ ゾレターに移した。 このフ ィルターについて抗ヒト C 3 d 血清を用いて酵素抗 体染色法-を行った結果、 未処理血清では lO! Da以上 のバンドのみが検岀され、 3 C処理血清では 39kDa のバンドのみが検出された （第 1 2図〉 。 この結果 から、 3 C処理により.、— C 3が ώ!清中の酵素によつ て切断されて C 3 c が生成していることが確認され た。 そこでこの血清にプロテア一ゼ . インヒビタ 一
Figure imgf000021_0001
ε / mlァフ。ロアニン、 10 β· ノ mlタイズト リァシンィンヒビター、 0. 5m E D T A ) を加えた 後、 の 20mM Tris ■ H C! , PH 7. 5に対して 2回 32析 1了った。
(2) (1) で得られた透析後のサンプル 〈蛋 S濃度約 30
Figure imgf000021_0002
) を 20倍希釈し、 遠心分離操作により不溶物 を取り除いた後、 以下のようにして目的蛋白を単離 - 精製した。
まず、 サンアルを分取用サイズのァニオン交換 H P L C ( TSKge lDEAE-5?W) で分画した （第： ί 3図〉 , 第 1 3図 aにおいて、 実線は U V 280MI における吸 収、 破線は NaCi l度勾配を示す。 溶出は 2 M Tris 一 iriし I， ρΗ / . フ— N aし 1 、 G→ 0. 3 iw )， 2. フ ml / mm 2 mi n z t lib eで行っ 。 カラムサイズは 21. 5腿 Φ X ：) ucraであ L
次いで、 第 1 '3 l bに示されたフラクション中の S D S— P A G Eで 39kDa のバンドが検出されたフ ラクション Nr. 52-54の部分を集め 4倍希釈後、 これ を分析用サイズのァニオン交換 hT P L C ( TSKge iDE 20
AE-5PW} で精製した （第 1 4図〉 。 第 1 4図¾にお いて実 は U V28G における吸収、 破線は NaCl濃 度勾配を、 棒グラフは tト炎症局所由来ホスホリパ —ゼ A2 阻害活性を示す。
精製は、 20mM Tris — HCし pH 7, 5— NaCl ( 〇一
1.0 M ， 1.0 ml / m l n , 2 m ι n t u b eて打った。 次に第 1.4図 b中の S D S— P A G Eで 39 kDa のバシ が検出され、 ヒト炎症局所由来ホスホリパ ーゼ A 2 阻害活性の最も強かったフラクション Nr.1 のピーク部分を集め、 ゲル沪過 H P LC ( TSKgel
G 3000SW)で更に：分画した （第 1 5図） 。 第 1 5図 a において、 実線は UV280nni における吸収を、 棒グ ラフ S:ヒト炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 阻害活 性を承す。
溶出条件は 20mM Tris — HCi, PK 7.5- IMNaCi0.5 ¾1 / \ η ， 2 mi η t u b eで行った。
： :後に第 1 5図 b中の S D S - P A G Eで 3 Da のバンドが検出され、 ヒト炎症局所由来ホスホリパ —ゼ. A 2 阻害活性の最も強かったフラクション Kr. 20, 2 を更に逆相 H P LC ( Bio-Rad RP304)で精製 した （第 1 6図〉 。 第 1 6図 aにおいて実線は UV 210n における吸収、 破線は C¾C N濃度勾配を示 す。 精製は'、 i i %TF A/C¾C N 〇〜80%， 1 ml m l u , ,2 mm / ub eでィ了つた t, 第 1 6 [lb中の S D S— PAGEに示したように 分子量 39kDa の阻害蛋白—ヒ トはフラクショ ン Nr. 30に溶出したが、 フラク—シヨン Nr.23 に主に溶出し ているアルブミンとみられる蛋白が若干混在してい ることがわかった。 しかし、 アルブミンは強いホス ホリパーゼ A 2 阻害活性を持たないこと、 及びフラ クシヨン Nr..23 もホスホリパーゼ A 2 阻害活性を示 さなかつたことから、 阻害蛋白ーヒ トの活性測定に は影響を及ぼさないものと考えた。
(B) 阻害蛋白一ヒトのホスホリパーゼ A2 阻害活性
(A) で得られた本発明の阻害蛋白ーヒ ト （逆相 H P LCフラクション Nr.30 、 蛋白濃度約 15ng/" l ) の ヒト炎症局所由来ホスホリパーゼ 2 及びその他のホ スホリパーゼ A 2 に対する阻害活性を、 前述のホスホ リパーゼ A2 阻害活性の測定法によって測定した。
その結杲を第 1 7図及び下記第 1表に示した。
第 1 表
ヒト炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白の各種ホ 又ホリパーゼ A 2 に対する活性の比較
ホスホリパーゼ A2 の種類 ホスホリバ-ゼ A 2
n/， 阻害活性 (
慢性関節リゥマチ患者鬨節液
(ヒト炎症局所由来）
ラット血小板 LL. U
(ラッ卜炎症局所由来 )
ブタ滕臓 0. "
* ホスホリパーゼ A2 I ngに対して 4 阻害蛋白
-ヒト約 15ngを加えた時の阻害活性
第 1 7図から本阻害蛋白はヒト炎症局所由来ホスホリ パ一ゼ A 2 を用量俵存的に阻害することが明らかである また、 l agのヒト炎症局所由来ホスホリパーゼ A2 活性 を阻害するのに必要な阻害蛋白量は約 50ngであった。 さ らに第 1表から明らかなように、 本阻害蛋白はラ、、/ト炎 症局所由来ホスホリパ一ゼ A 2 は阻害したが、 ブタ滕臓 ホスホリバーゼ A 2 に対しては有意な阻害活性を示さな かつた。
以上の結果から、 本阻害蛋白はヒト炎症局所由来ホ スホリパーゼ A 2 を特異的に阻害する活性を有するこ とが明らかである。 実施例 3
ラット炎症局所由来ホスホリパ一ゼ 2 阻害蛋白の同 疋 一
(A) 阻害蛋白一ラットの N末端アミノ酸配列の決定
実施例 1 {A) で単離■ 精製した分子量約 39kDa の阻 害蛋白について、 Appi ied Biosystem 社の気相プロテ ィンシークェ.ンサ一477 Aを用いて N末端アミノ酸配 列を決定した。 その結果、 下記のような配列であるこ とが判明した。
Figure imgf000025_0001
これほ、 後に逑べるラッ ト C 3 c D N Aの塩基配列 から推定される C 3 dgの N末端配列と完全に一致して おり、 また、 デキサメサゾン^理ラッ卜の腹腔洗浄液 より精製した炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋 白の N末端アミノ酸配列とも完全に一致していた。
(B) 該阻害蛋白の C末端フラグメントについて（A) j同 様にアミノ酸配列を決定し、 以下の配列を得た。 ，
Lrm-inr-Asp-vai-Pro-Asp-nis-Lys-As -Leu-Asii- Met-Asp-vai-ier-Leu-nis-Leti-fro-Ser-Arg これは後に述べるラッ 卜 C 3 c D N Aの塩基配列か ら推定される C 3 dgの C末端配列と完全に一致してい た。
(C) 阻害蛋白—ラットのゥ Xスタンプ ΰッティング
実施例 1 (Α) で単離■ 精製した分子量約 39kDa の阻 害蛋白—ラ-ットを常法に従って S D S—ポリァクリル アミ ドゲル電気泳動後、 ミ リポア社製エレク トロブ口 、'/ティング装.置を用い、 同社プロ卜コールに従って二 トロセルロースメンブレンフ ィルターに移した， この フィルターについて、 抗ヒ卜 C 3 d ゥサギ血清
(DAKOPATTS) を一次抗体、 抗ゥサギ IgGヮサビペルォ キシダ一ゼ結合ャギ IgGフラクション（CAPPEDを二次 抗体とし、 基質と して 4—クロ口一 1 —ナフトール ( Bio-Rad)を用いて酵素抗体染色を行った。
その結杲本阻害蛋白は抗ヒト C 3 d 血清と特異的に 反応した。
以上（A) 〜（C) から、 本阻害蛋白はラット C 3 dgで あることが確認された。
実施例 4
ラ-ット炎症局.所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白遺伝 子のク口 ニング
(A) マウス C 3 c D N A断片の調製
マウス C 3 c D N A断片を含むアラスミ ド pFC4Z
5.4 ( J. B. C.260, 10936, 1986) の' rii ndEI消化狗から 低融点ァガ口 "スゲル電気泳動にて 2.2 k b p断片を分離 した。 また Stii I消化物からも同様な操作で i.8kbP断 片を得た。
(B) c D N Aのスクリ一ニンニグ
ラット tf c D N A A g U 1ライブラリ一 、クロンテツ ク社製〉 をスクリーニングの素材と して用い、 クロン テック社実験プロトコールの記載に従ってスクリ一二 ングした。 .
すなわち、 Λ gtllファージを惑染させた E. c 0 ί i y 1090株を 37C , 5時閬培養して得られた約 5万個の形 質耘換体群を対象としてナイロンフィルタ一メンブレ ンにレアリカし、 5Μ NaOH - 1.5M aC! につけて D Aを変性させ、 1.5M aCli- i mM EDTA を含有する トリス塩酸バッファー （pH7.2)で中和した。 その後、 フィルターを風乾し、 トランスイルミネ一ターにて紫 外線を 3分間照射して D N Aをフ ィルターに固定した。
スクリーニング用プローブとしては、 上記（A) で得 られたマウス C 3 c DN A断片を32 Pで標識したもの を用いた。
上記被験フィルター上の形質転換体群をこのアロー ブにて 6 。Cのハイブリダイゼーシヨンによりスクリ一 ニングし、 オートラジオグラムでの感光により判定し たところ、 約 5万個の形質転換体群の内 7個がポジテ ィブク ΰーンであった ¾ これらのポジティブクローン を各々 A r C 3 Ζί1〜Πと命名した。 'これらのクローンを Ec oR I消化後、 ァガ口一スゲル 電気泳動を行いサザンハイブリダイゼーションにより 挿入遣伝子断片の鎖長を解析した： その結果、 7つの クローンのなかで λ r C 3 Z 11の挿入遺伝子断片が最 も長く、. このクローンは EcoRIにより 0.7kbpと 2. Okbp に切断される全長 2· 7kbpの挿入遺伝子断片を持つこと が判明した。 .
(C; ラット G 3 c D N Aの塩基配列の決定
入 r C 3 /11のファージ D N Aを抽出した後、 EcoR Iで切断 て 0. 7k と 2. Okbpの D N A断片を得た。 こ の銜片をシークェンシング用クローニングべクター PUC19 およびシークェンシング用ファージ M 13MP19RF DNA (S酒造〉 の EcoRI部位に挿入した。 7 bp断片 はさらに Bamh'I消化により得られた 0. ik'Dp断片と 0. D ib 断片をシークェンシング用ベクター pUCnSの EcoR
I、 B HI二重消化物に挿入し、 両末端から塩基配列 を法定した'。
配列解析は 7 — D E A Z A法 （ Mizusawa, et. ai, due re ic Acid Res. 14, 1319, 1986 ) に従っ 。 2 Γορ 断片については確定した周辺部に対応したプライ マ一を順次合成して塩基配列解析を進める Hoodちの手 & κ Hood, et. a 1 , Anaし B i ochem. 154， " 1986 / を用いた。
'i 1 8図に A r C 3 11の塩基配列決定のストラテ ジ一を示す。 最上段の数字は中断において枠で仕切ら れたラット C 3 dg部分を基準と して示した塩基の番号 であり、 EcoRI等は用い れた制限酵素名であり、 括 孤内の数字は切断部位又は塩基配列決定の開始位置 (塩基番号） である。 水平な矢印はそれぞれの制限酵 尜およびァライマーによる塩基配列決定の方向と範囲 不 し い .。
謂 5
ラッ ト炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白遣伝 子の塩基配列および該蛋白のアミノ酸配列の決定
(i) N末端および C末端の決定
実施例 4で判明したラット C 3 c D N Aクローンの 塩基配列（C) から推定されるラット C 3のアミノ酸配 列のうち、 ヒト C 3のファクターェによる切断部位近 傍のアミノ酸配列に相当する部分を第 1 9図に示す。
ヒ卜 C 3は 鎖の 283Arg — 284Gi¾ の間でファタ ター Iにより切断されるが、 ラット C 3ではこれに対 応する部位は G -Gly に変異しており、 5残基 C末端 側に Arg-G が存在する。 そして、 この部位で切断さ れて生成するフラグメントの N末端アミノ酸配列はラ ッ 卜血清より精製した本発明の阻害蛋白の N末端アミ ノ酸配列と完全に一致している。
従って、 ラット C 3はこの部位でヒ 卜のファクター ェと同様の活性を持つ酵素により切断されると考えら れる。
一方、 ヒト C 3 α鎖の 632Arg — 633Ser と
649Arg' - 65°Ser はラッ _ト C 3でも保存されていた 、 また、 の部位で切断されて生成するフラグメントの C末端アミノ酸配列はラット血清より精製した本発明 の阻害蛋白の c末端アミノ酸配列と完全に一致してい る。 ヒトと同様にこれらの位置でファクタ一 Iにより 切断さ ίΐ、 本発明の阻害蛋白の C末端はヒ卜 C 3 の c末端 一致しているものと考えられる。
(2) ラット炎症局所由来ホスホリパーゼ Α 2 阻害蛋白
( C 3 dg) 遺伝子の全塩基配列と推定される全ァミノ 酸配列
以上の結果から本発明の炎症局所由来ホスホリ ) 一 ゼ A 2 阻害蛋白の全アミノ酸配列と遺伝子の全塩基配 列は第 Γ図および第 2図のものと判断された。 本発明 の炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白は 1032個 の塩基でコードされ、 344 個のアミノ酸からなる蛋白 であつた。
突施例 6 ， ヒト炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白遺伝子 の全塩基 S冽及び本阻害蛋白の全アミノ酸配列の決定 (A) 阻害 ¾白ーヒトの同定
(1/ 阻害蛋白一ヒトの N末端アミノ酸配列の決定
実施例 2 (A) で単離■ 精製した分子量約 39kDa の 阻害蛋白 （逆相 H P L Cフラクション Ν Γ· 30;' につ いて、 前述した方法で Ν末端アミノ酸配列を決定し た。 その結果、 下記の.ような配列であることが判明 した。
-Giu-Lri y-Vai-Asn-Lys-Giii-Asp-i i e - Pro - Pro - これは鼓に知られているヒ ト C 3 dgの N末端アミ ノ酸配列と完全に一致した。
(2) 阻害蛋白一ヒトの免疫化学的解析
実施例 2 (A) で単離 · 精製した分子量約 3 Da の 阻害蛋白 （逆相 H P L Cフラクション Nr.30)につい て、 前述した方法で S D S— PA GE後、 ゥヱスタ ン ' ブロッテイングを行ってフィルタ一に移し、 抗 ヒト C 3 d 血清を用いて酵素抗体染色法により検出 した。 その結果、 本阻害蛋白は抗ヒト C 3 d 血清と 特異的に反応した。 第 2 011aに S D S— P AGE の結果を示す。 第 2 0図 bにウェスタン . ブロッテ イ ングの結果を示す。 ， 以上、 （ί)， （2) の結果から、 本阻害蛋白がヒト C
3 であることは明らかである。
(B) ヒト炎症局所由来ホスホリパーゼ 2 阻害蛋白 （ C 3 dg) 遺伝子の全塩基配列と本阻害蛋白の全アミノ酸 配列 ヒト C 3については既に cD N Aクローニングが行 れており、 その全塩基配列及びそれから推定される 全アミノ酸配 が決定さ f ている。 また、 C 3遺伝子 のなかで C 3 をコードする部分も決定されている (de Bru 1 j n e t a 1. Pr oc . i\ a 11. Acad. ¾c i, USA, 82
708-712, 1985に
前述 結果から本発明の炎症局所由来ホスホリパー ゼ A 2 阻害蛋白一ヒトはヒト C 3 dgであることが明ら かである。 したがって、 本阻害蛋白遺伝子の塩基配列 はヒト C 3遺伝子の全塩基配列のうち C 3 をコード する部分と完全に一致すると考えられる。 また、 本阻 害蛋白の全アミノ酸配列はヒト C 3遺伝子の全塩基配 列から推走されるヒト C 3の全アミノ酸配列のうち C 3 に相当する部分と完全に一致すると考えちれる。 以上のことから、 本発明の炎症局所由来ホスホリパ ーゼ A 2 阻害蛋白の全アミ ノ酸配列とヒ ト炎症局所由 来ホスホ.リパーゼ A 2 阻害蛋白遺伝子の全塩基配列は 第 3図及び第 4図のものと判断された。 本発明の炎症 所由来ホスホリパ一ゼ A 2 阻害蛋白は 1047個の塩基 でコ ドされ、 349 個のアミノ酸からなる蛋白であつ た。

Claims

言冑求の範囲
1. 第 1図に示すアミノ酸配列又はこれと生理学的に同 等のアミノ酸配列を有する炎症局所由来ホスホリパー ゼ A 2 阻害蛋白。
2. 第 1図に示すアミノ酸配列又はこれと生理学的に同 等のアミノ酸配列の一部を有する請求の範囲第 1項記 载の炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白。
3. ラット血清由来の請求の範囲第 1項又は第 2項記載 の炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白。
4. 哺乳動物の血清を酵素,処理することを特徴とする請 求の範囲第 1項記載の炎症局所由来ホスホリパーゼ
A 2 阻害蛋白の製造方法。
5. 哺乳動物がラットである請求の範囲第 4項記載の炎 症局所由来ホスホリパ一ゼ A 2 詛害蛋白の製造方法。
6. 請求の範囲第 1項記載の炎症局所由来ホスホリパー せ 阻害蛋白の遺伝子。
7. 第 2図に示す D N A塩基配列を含む請求の範囲第 6 項記載の炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白の rnm-r o
δ. ラ、νト由来の請求の範囲第 6項又は第 7項記載の炎 ilH局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白の遺伝子。
第 3図に示すアミノ酸配列又はこれと生理学的に同 等のアミノ酸配列を有する炎症局所由来ホスホリパー ゼ A2 阻害蛋白。
10. 第 3図に示すアミノ酸配列.又はこれと生理学的に同 等のアミノ酸配列の一部を一有する請求の範囲第 9項記 載の炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋白。
11. ヒト血清を酵素処理することを特徴とする請求の範 囲第 9項記載の炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害 白の製造方法。
12. 請求の範囲第 9項記載の炎症局所由来ホスホリパー ゼ A2 蛋白の遺伝子。
13. 第 4 に示す D N A塩基配列を含む請求の範囲第
1、2項記載の炎症局所由来ホスホリパーゼ A 2 阻害蛋 ϋめ遺伝子。 -
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