JPS63246397A - 起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白 - Google Patents
起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、起炎性フォスフＡリパーゼＡ２ （ＰＬＡ
２ ）阻害活性を有する蛋白に関する。更に詳しくは、
グルココルチコイド投与により、細胞から誘導され、起
炎性ＰＬＡ２阻害活性を有りる蛋白に関するものである
。
２ ）阻害活性を有する蛋白に関する。更に詳しくは、
グルココルチコイド投与により、細胞から誘導され、起
炎性ＰＬＡ２阻害活性を有りる蛋白に関するものである
。
グルココルチコイドは、慢性関箇リウマチ、全身性エリ
テマトーデス、気管支喘息等の種々の炎症性、アレルギ
ー性疾患の治療薬として、今日量も有効性の高い医薬品
のひとつとして幅広く用いられている。その作用メカニ
ズムは、グルココルチコイドの抗炎症作用、抗浮腫作用
、免疫抑制作用などに由来している。その中で抗炎症効
果の発現は、炎症関連物質であるロイコトリエンやブロ
スタブランジンの前駆体であるアラキドン酸の、遊離を
抑制することに関連する。即ち、アラキドン酸をリン脂
質から直接切り出す酵素、Ｐ ＬＡ２を阻害するとの説
が近年Ｆ ｌｏｗｅｒ （Ｎ ａｔＬＩｒＥ！ ２
７８ ：４５Ｇ、１９７９）により提唱されている。グ
ルココルチコイドの作用機序については、細胞内に入っ
たグルココルチコイドは最初に胞体内受容体と結合し、
この複合体が核内へと輸送されて、遭伝子発現の制御が
働き、最終的には蛋白合成の誘導が行なわれる。事実、
鶴藤ら（Ｎ ａｔｕｒｅ ２８０ ： ４０８，１９
７９）は、蛋白合成阻害剤シクロへキシミドとｍＲＮＡ
合成阻害剤アクチノマイシンＤとが、セロトニンにより
惹起される足蹟浮１ｈｉ（実験的炎症動物モデル）に対
する、グルココルチコイドの治療効果を抑制することを
示した。これらの結果より、グルココルチコイド抗炎症
作用は、ＰＬ’Ａｚ阻害活性のある蛋白の合成誘導を介
して行なわれると考えられる。
テマトーデス、気管支喘息等の種々の炎症性、アレルギ
ー性疾患の治療薬として、今日量も有効性の高い医薬品
のひとつとして幅広く用いられている。その作用メカニ
ズムは、グルココルチコイドの抗炎症作用、抗浮腫作用
、免疫抑制作用などに由来している。その中で抗炎症効
果の発現は、炎症関連物質であるロイコトリエンやブロ
スタブランジンの前駆体であるアラキドン酸の、遊離を
抑制することに関連する。即ち、アラキドン酸をリン脂
質から直接切り出す酵素、Ｐ ＬＡ２を阻害するとの説
が近年Ｆ ｌｏｗｅｒ （Ｎ ａｔＬＩｒＥ！ ２
７８ ：４５Ｇ、１９７９）により提唱されている。グ
ルココルチコイドの作用機序については、細胞内に入っ
たグルココルチコイドは最初に胞体内受容体と結合し、
この複合体が核内へと輸送されて、遭伝子発現の制御が
働き、最終的には蛋白合成の誘導が行なわれる。事実、
鶴藤ら（Ｎ ａｔｕｒｅ ２８０ ： ４０８，１９
７９）は、蛋白合成阻害剤シクロへキシミドとｍＲＮＡ
合成阻害剤アクチノマイシンＤとが、セロトニンにより
惹起される足蹟浮１ｈｉ（実験的炎症動物モデル）に対
する、グルココルチコイドの治療効果を抑制することを
示した。これらの結果より、グルココルチコイド抗炎症
作用は、ＰＬ’Ａｚ阻害活性のある蛋白の合成誘導を介
して行なわれると考えられる。
グルココルチコイドにより合成が誘導され、１ｎｖｉｔ
ｒｏでＰＬＡ２活性を阻害し、ｉｎ ｖｉｖｏでブロス
フグランジン生成を抑制するような蛋白を分離する試み
は、これまで数グループよりなされている。これらの試
みはいずれも、その評価系にブタ膵臓ＰＬＡｚを用いて
いる。
ｒｏでＰＬＡ２活性を阻害し、ｉｎ ｖｉｖｏでブロス
フグランジン生成を抑制するような蛋白を分離する試み
は、これまで数グループよりなされている。これらの試
みはいずれも、その評価系にブタ膵臓ＰＬＡｚを用いて
いる。
ところが、一般的に膵臓のＰＬＡ２は消化酵素的役割を
果すと考えられるのに対し、それとは性質の異なる起炎
性ＰＬＡ２が存在する。最近、打上らはカゼイン投与時
のラット腹腔中に見い出させるＰＬＡ２を単離・精製し
、その性質を調べている（生化学、 Ｖｏｌ ５８．Ｎ
ｏ８ 、７６６．１９８６）。それによれば、精製酵素
１１００ｎをラット背部皮内に接種すると、あらかじめ
静脈投与したエバンスブルーが漏出し、局所での血管透
過性が八進しくいることを観察している。一方膵臓由来
のＰ Ｌ Ａ ２は、この活性を示さないことも確認し
ている。またＶ ａｄａｓらは、リウマチ患者の関節内
Ｐ ｌ−Ａ ２活性が、几進していることを報告してお
り、更にその酵素を精製しその性質を調べたところ、ヒ
ト膵臓ＰＬＡ２の抗体とは反応しないことを報告してい
る（ Ｊ 、 Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、１００．１２９７−
１３０３．１９８６） 、このように膵臓由来ＰＬＡｚ
と起炎性ＰＬＡｚはその蛋白の一次及び高次構造が異な
り、なおかつ生体内に於ける役割が明確に異なるものと
思われる。
果すと考えられるのに対し、それとは性質の異なる起炎
性ＰＬＡ２が存在する。最近、打上らはカゼイン投与時
のラット腹腔中に見い出させるＰＬＡ２を単離・精製し
、その性質を調べている（生化学、 Ｖｏｌ ５８．Ｎ
ｏ８ 、７６６．１９８６）。それによれば、精製酵素
１１００ｎをラット背部皮内に接種すると、あらかじめ
静脈投与したエバンスブルーが漏出し、局所での血管透
過性が八進しくいることを観察している。一方膵臓由来
のＰ Ｌ Ａ ２は、この活性を示さないことも確認し
ている。またＶ ａｄａｓらは、リウマチ患者の関節内
Ｐ ｌ−Ａ ２活性が、几進していることを報告してお
り、更にその酵素を精製しその性質を調べたところ、ヒ
ト膵臓ＰＬＡ２の抗体とは反応しないことを報告してい
る（ Ｊ 、 Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、１００．１２９７−
１３０３．１９８６） 、このように膵臓由来ＰＬＡｚ
と起炎性ＰＬＡｚはその蛋白の一次及び高次構造が異な
り、なおかつ生体内に於ける役割が明確に異なるものと
思われる。
このような背景のもとに、本発明者らは、上記カビイン
投与時のラット腹腔中に見いだされる起炎性ＰＬＡ２を
用い、本酵素を特異的に阻害する蛋白を鋭意検索し、本
発明に到った。
投与時のラット腹腔中に見いだされる起炎性ＰＬＡ２を
用い、本酵素を特異的に阻害する蛋白を鋭意検索し、本
発明に到った。
即ち、本発明は、起炎性フォスフォリパーゼＡ２阻害活
性を有する蛋白である。本発明の蛋白は、グルココルチ
コイド投与により、細胞から誘導されるという性質を有
する。そして、特に好ましいのは、グルココルチコイド
投与後、ラット腹腔より精製され、分子量４０にでＮ端
部のアミノ酸配列が、Ｎ端部アミノ酸−Ａ ＳｐＶ ａ
ｌ −Ｐ ｒｏ −Ａ ｌａ −Ａ ｌａ −Ａ ３＋
） −Ｌ ｅｕ −Ｓｅｒ −Ａ Ｓ＋）−よりなる、
起炎性ＰＬＡ２阻害活性を有する蛋白、又はグルココル
チコイド投与後、ラット腹腔より精製され、分子１３５
１（でＮ端部のアミノ酸配列がＮ端部アミノ酸−Ｇ Ｉ
ｕ −Ａ ｒ（１−Ｌ ｅｕ −Ｌ ｙＳ−Ａ Ｓ＋）
−Ｈｉｓ −Ｌ ｅｕ−１ｌｅ −Ｖａｌ−よりなる
、起炎性ＰＬＡ２阻害活性を有する蛋白である。
性を有する蛋白である。本発明の蛋白は、グルココルチ
コイド投与により、細胞から誘導されるという性質を有
する。そして、特に好ましいのは、グルココルチコイド
投与後、ラット腹腔より精製され、分子量４０にでＮ端
部のアミノ酸配列が、Ｎ端部アミノ酸−Ａ ＳｐＶ ａ
ｌ −Ｐ ｒｏ −Ａ ｌａ −Ａ ｌａ −Ａ ３＋
） −Ｌ ｅｕ −Ｓｅｒ −Ａ Ｓ＋）−よりなる、
起炎性ＰＬＡ２阻害活性を有する蛋白、又はグルココル
チコイド投与後、ラット腹腔より精製され、分子１３５
１（でＮ端部のアミノ酸配列がＮ端部アミノ酸−Ｇ Ｉ
ｕ −Ａ ｒ（１−Ｌ ｅｕ −Ｌ ｙＳ−Ａ Ｓ＋）
−Ｈｉｓ −Ｌ ｅｕ−１ｌｅ −Ｖａｌ−よりなる
、起炎性ＰＬＡ２阻害活性を有する蛋白である。
次に本発明の蛋白の、単離間装方法について述べる。本
蛋白は、ステロイドの投与により生体内で合成される蛋
白であることから、その誘導法としては、直接ステロイ
ドを生体内に投与し、本蛋白を誘導してもよいが、正常
細胞あるいは株化細胞を用いて、ｉｎ ＶｉｔｒＯで直
接ステロイドと接触させて誘導させる方法もある。−例
としては、ラット背部皮下にデキサメサゾンを投与し、
１．５時間後にドライアイスにて炭酸ガス下窒息死さけ
、腹腔をリン酸、ヘパリン及びＰＭＳＦ （ｐ ｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｐｈｏｎｙｌｆ
ｌｕｏｒｉｄｅ ）加生即口塩水にてよく洗浄後、洗浄
液を回収する。この洗浄液を酢酸アンモニウム緩衝液に
てよく透析後、凍結乾燥する。１匹のラットより、約２
０７１１９のラット腹腔洗浄凍結標品を得る。この標品
を出発材料としＣ１例えば、以下の如き方法で本蛋白は
精製単離される。
蛋白は、ステロイドの投与により生体内で合成される蛋
白であることから、その誘導法としては、直接ステロイ
ドを生体内に投与し、本蛋白を誘導してもよいが、正常
細胞あるいは株化細胞を用いて、ｉｎ ＶｉｔｒＯで直
接ステロイドと接触させて誘導させる方法もある。−例
としては、ラット背部皮下にデキサメサゾンを投与し、
１．５時間後にドライアイスにて炭酸ガス下窒息死さけ
、腹腔をリン酸、ヘパリン及びＰＭＳＦ （ｐ ｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｐｈｏｎｙｌｆ
ｌｕｏｒｉｄｅ ）加生即口塩水にてよく洗浄後、洗浄
液を回収する。この洗浄液を酢酸アンモニウム緩衝液に
てよく透析後、凍結乾燥する。１匹のラットより、約２
０７１１９のラット腹腔洗浄凍結標品を得る。この標品
を出発材料としＣ１例えば、以下の如き方法で本蛋白は
精製単離される。
起炎性ＰＬＡ２を阻害する活性を指標にして、例えば、
アニオン交換高速液体クロマトグラフィ−に標品をアプ
ライし、各画分の起炎性ＰＬＡ２阻害活性を測定し、活
性ピークを得た。活性ピークをＳＤＳポリアクリルアミ
ド電気泳動で調べたどころ、多数の蛋白の混合物である
ことを認めた。
アニオン交換高速液体クロマトグラフィ−に標品をアプ
ライし、各画分の起炎性ＰＬＡ２阻害活性を測定し、活
性ピークを得た。活性ピークをＳＤＳポリアクリルアミ
ド電気泳動で調べたどころ、多数の蛋白の混合物である
ことを認めた。
更にこの活性画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィ
ーにかけた。ここに於いても活性両分はｊｑられたが、
まだ単一蛋白には精製されておらず、史に逆相高速液体
クロマトグラフィーにＪ、る精製を行ない、活性ピーク
を得た。この活性ピークは、Ｓ［）Ｓポリアクリルアミ
ド電気泳動から単一蛋白であることがわかった。約２０
０■の標品から、起炎性ＰＬＡ２阻害蛋白を約１１００
ｎ単離した。
ーにかけた。ここに於いても活性両分はｊｑられたが、
まだ単一蛋白には精製されておらず、史に逆相高速液体
クロマトグラフィーにＪ、る精製を行ない、活性ピーク
を得た。この活性ピークは、Ｓ［）Ｓポリアクリルアミ
ド電気泳動から単一蛋白であることがわかった。約２０
０■の標品から、起炎性ＰＬＡ２阻害蛋白を約１１００
ｎ単離した。
Ｌス上、ステロイド誘導ラット腹腔から、本発明の起炎
性Ｐ Ｌ Ａ ２阻害活性を右する蛋白を、精製・単ｆ
ｆｌする方法を中心に説明したが、本発明において、蛋
白の起源や蛋白の製法は何ら限定されるものではない。
性Ｐ Ｌ Ａ ２阻害活性を右する蛋白を、精製・単ｆ
ｆｌする方法を中心に説明したが、本発明において、蛋
白の起源や蛋白の製法は何ら限定されるものではない。
ヒトや他の動物から抽出・精製単離してもよく、また遍
伝子工学的手法で微生物あるいは動物細胞から製造して
もよい。起炎性ＰＬＡ２阻害活性を有する蛋白である限
り、本発明に含まれるものである。
伝子工学的手法で微生物あるいは動物細胞から製造して
もよい。起炎性ＰＬＡ２阻害活性を有する蛋白である限
り、本発明に含まれるものである。
本発明において用いられた各種試験、測定法は以下の通
りである。
りである。
（１）起炎性ＰＬΔ２阻害活性の測定法カゼイン誘導ラ
ット腹腔浸出液より単ｒ４精製した起炎性Ｐ Ｌ Ａ
２を用い、基質としては１４ Ｃ酢酸を［、Ｃｏ１１に
取り込ませ、＋４ Ｃでラベル化されたホスファデジル
エタノールアミンを抽出して用いた。標準の反応系は、
１３０μρの試料あるいは対照（ｖｉ函液）に５０μす
の０．５ＭＴｒｉｓ −）−ＩＣｆ （ｐＨ９，０＞及
び２５μ旦の４０ ｍＭＣａＣ１２及び２５μ文の基質
（４００ｄｌｌｌ／ ｎ ｌｏ ｌ 、 ２ｍＭ）を入
れ混合後、最後に２０μ文の起炎性ＰＬＡ２ （０，
Ｉｎ（１／μＪＪ、 ８０ＵｎｉｔＳ／ｒＩｔｇ”蛋白
）を入れて混合し、３７℃にて１０分間インキュベート
する。その１１ ［） ｏｌｅ試薬で反応を停止させる
。
ット腹腔浸出液より単ｒ４精製した起炎性Ｐ Ｌ Ａ
２を用い、基質としては１４ Ｃ酢酸を［、Ｃｏ１１に
取り込ませ、＋４ Ｃでラベル化されたホスファデジル
エタノールアミンを抽出して用いた。標準の反応系は、
１３０μρの試料あるいは対照（ｖｉ函液）に５０μす
の０．５ＭＴｒｉｓ −）−ＩＣｆ （ｐＨ９，０＞及
び２５μ旦の４０ ｍＭＣａＣ１２及び２５μ文の基質
（４００ｄｌｌｌ／ ｎ ｌｏ ｌ 、 ２ｍＭ）を入
れ混合後、最後に２０μ文の起炎性ＰＬＡ２ （０，
Ｉｎ（１／μＪＪ、 ８０ＵｎｉｔＳ／ｒＩｔｇ”蛋白
）を入れて混合し、３７℃にて１０分間インキュベート
する。その１１ ［） ｏｌｅ試薬で反応を停止させる
。
ホスファチジルエタノールアミンが加水分解されて生成
したラベル化脂肪酸をヘプタンで抽出後、液体シンチレ
ーションカウンターにてその門を測定する。
したラベル化脂肪酸をヘプタンで抽出後、液体シンチレ
ーションカウンターにてその門を測定する。
＋２）ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動各種クロマト
的手法により分画した試料の一部を取り、１％ＳＤＳ、
２−メルカプトエタノール存在下、１００℃で１０分間
加熱した。次いで、１２．５％ポリアクリルアミドゲル
に試料をアプライし、１５ＩＩｌ△で１．５時間電気泳
動した。泳動終了後、バイオラッド社製シルバースティ
ンキラ１〜で染色した。
的手法により分画した試料の一部を取り、１％ＳＤＳ、
２−メルカプトエタノール存在下、１００℃で１０分間
加熱した。次いで、１２．５％ポリアクリルアミドゲル
に試料をアプライし、１５ＩＩｌ△で１．５時間電気泳
動した。泳動終了後、バイオラッド社製シルバースティ
ンキラ１〜で染色した。
（３） 蛋白−次構造の決定法
気相プロティンシーケンサ−（アプライド・バイオシス
テム社、 ｍｏｄｅｌ ４７０ Ａ ）を用いて決定し
た。即ち、単離精製されたサンプル１０μ９を、３０μ
すの１％ＳＤＳに溶解し、上記気相プロディンシーケン
サ−にアプライした。自動的にエドマン分解されたＰＴ
Ｈ（フェニルチオヒダントイン）アミノ酸誘導体は、そ
の後、高速液体クロマトグラフィーにて各アミノ酸とし
て分析された。
テム社、 ｍｏｄｅｌ ４７０ Ａ ）を用いて決定し
た。即ち、単離精製されたサンプル１０μ９を、３０μ
すの１％ＳＤＳに溶解し、上記気相プロディンシーケン
サ−にアプライした。自動的にエドマン分解されたＰＴ
Ｈ（フェニルチオヒダントイン）アミノ酸誘導体は、そ
の後、高速液体クロマトグラフィーにて各アミノ酸とし
て分析された。
以下、実施例により本発明を詳）ホする。
実施例１
（１） ラット腹腔洗浄液凍結標品の作ＩＪ３゜ＳＤ
系ラうト８週令、雄５０匹を用いて、デキサメサゾンを
１．５１Ｒ’Ｊ／に９となるように背部皮下に注射し、
１．５時間後にドライアイスにて炭酸ガス下窒息死させ
、腹腔を１匹当り１２Ｉｎｉの２υ／Ｉｄｌのヘパリン
及び５０μＭのＰ Ｍ Ｓ Ｆ （１）ｈｅｎｙｌｆｆ
ｉｅｉｔｈＶＩｓｕｌｌ）ｈｏｎＶＩｆｌｕｏｒｉｄｅ
）加生理食塩水に−Ｃよく洗浄後、洗浄液的５００７
を回収した。この洗浄液を、４０倍量の１Ｏｎ＋Ｍ酢酸
アンモニウム緩衝液（ｐＨ７，４）にて、２回透析後、
凍結乾燥し、約’Ｊ４０＃＋３のラット腹腔洗浄凍結乾
燥標品を得た。
系ラうト８週令、雄５０匹を用いて、デキサメサゾンを
１．５１Ｒ’Ｊ／に９となるように背部皮下に注射し、
１．５時間後にドライアイスにて炭酸ガス下窒息死させ
、腹腔を１匹当り１２Ｉｎｉの２υ／Ｉｄｌのヘパリン
及び５０μＭのＰ Ｍ Ｓ Ｆ （１）ｈｅｎｙｌｆｆ
ｉｅｉｔｈＶＩｓｕｌｌ）ｈｏｎＶＩｆｌｕｏｒｉｄｅ
）加生理食塩水に−Ｃよく洗浄後、洗浄液的５００７
を回収した。この洗浄液を、４０倍量の１Ｏｎ＋Ｍ酢酸
アンモニウム緩衝液（ｐＨ７，４）にて、２回透析後、
凍結乾燥し、約’Ｊ４０＃＋３のラット腹腔洗浄凍結乾
燥標品を得た。
水冷下、２００■のラット腹腔洗浄凍結乾燥標品を５０
ｄの２０ ｍＭ ”ｒｒｉｓ −１−（ＣＩ （ＤＨ
８，０）に溶解させ、０．４５μｍＭｅｍｂｒａｎｃ
Ｆｉｌｔｅｒにて濾過した後に、直接５ｐ８７５０Ｈ
Ｐ Ｌ Ｃ用ボンブでカラム（下ＳＫ Ｇｅｌ Ｄ
ＥＡＥ−５ＰＷ）にアプライした。吸着した試料は、流
速２，５ｄ／ ｍｉｎで、第１図破線で示すＮａＣｆ直
接濃度勾配にて溶出させた。第１図の実線は、ＵＶ２８
０Ｍに於ける吸収で蛋白敬を表わしたものであるが、起
炎性ＰＬ△２に対する阻害活性がＦ ｒ、Ｉ〜Ｆｒ、Ｉ
Ｖに認められた。各々の両分はＳＤＳ電気泳動の結果、
多くの分子量の異なる蛋白の混合物であった。
ｄの２０ ｍＭ ”ｒｒｉｓ −１−（ＣＩ （ＤＨ
８，０）に溶解させ、０．４５μｍＭｅｍｂｒａｎｃ
Ｆｉｌｔｅｒにて濾過した後に、直接５ｐ８７５０Ｈ
Ｐ Ｌ Ｃ用ボンブでカラム（下ＳＫ Ｇｅｌ Ｄ
ＥＡＥ−５ＰＷ）にアプライした。吸着した試料は、流
速２，５ｄ／ ｍｉｎで、第１図破線で示すＮａＣｆ直
接濃度勾配にて溶出させた。第１図の実線は、ＵＶ２８
０Ｍに於ける吸収で蛋白敬を表わしたものであるが、起
炎性ＰＬ△２に対する阻害活性がＦ ｒ、Ｉ〜Ｆｒ、Ｉ
Ｖに認められた。各々の両分はＳＤＳ電気泳動の結果、
多くの分子量の異なる蛋白の混合物であった。
更に起炎性ＰＬＡ２阻害分画（Ｆｒ、ＩＶ）を精製する
ために、限外濾過（セントリカット１０Ｘ３０００Ｇ）
で濃縮した。約０．７１１１ｉ！に濃縮された分画を、
０．ＩＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＮ、 １．ＯＭ Ｎ
ａ Ｃ１゜ｐＨ７，７で平衡化したゲル濾過カラム（１
−Ｓ ＫＱｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ）にアプライし
、流速０．５．１７１ｎで溶出させた。起炎性ＰＬＡ２
阻古活性は２ビーク得られた（第２図の斜線部）。保持
時間３７分〜４４分に溶出させる分画に着目し、更にＭ
製を進めた。
ために、限外濾過（セントリカット１０Ｘ３０００Ｇ）
で濃縮した。約０．７１１１ｉ！に濃縮された分画を、
０．ＩＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＮ、 １．ＯＭ Ｎ
ａ Ｃ１゜ｐＨ７，７で平衡化したゲル濾過カラム（１
−Ｓ ＫＱｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ）にアプライし
、流速０．５．１７１ｎで溶出させた。起炎性ＰＬＡ２
阻古活性は２ビーク得られた（第２図の斜線部）。保持
時間３７分〜４４分に溶出させる分画に着目し、更にＭ
製を進めた。
ゲル濾過カラムにて保持時間４０分前後に溶出された活
性分画を集め、２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ｔ−ＩＣｆ
（１）Ｉ−１７，７）のバッファーに対し透析し、同バ
ッファーで平衡化したアニオン交換カラム（ＴＳＫ
Ｇｅｔ ＤＥＡＥ−５ｐＷ）にアプライした。流速１
．０ｙ／ｍｉｎ 、 Ｎａ ＣｌｆＡ度勾配下、目的蛋
白の分離を行なった。
性分画を集め、２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ｔ−ＩＣｆ
（１）Ｉ−１７，７）のバッファーに対し透析し、同バ
ッファーで平衡化したアニオン交換カラム（ＴＳＫ
Ｇｅｔ ＤＥＡＥ−５ｐＷ）にアプライした。流速１
．０ｙ／ｍｉｎ 、 Ｎａ ＣｌｆＡ度勾配下、目的蛋
白の分離を行なった。
起炎性ＰＬＡ２阻害活性は、保持時間２６分〜３６分の
分画に認められた（第３図の斜線部）。
分画に認められた（第３図の斜線部）。
分析用アニオン交換１−Ｉ Ｐ Ｌ Ｃにて起炎性ＰＬ
Ａ２に阻害活性を示す活性分画は、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動より、主に４０にと３５により成る
ことが判った。そこでこれらを単一蛋白とする目的で、
それぞれ逆相ＨＰＬＣによる精製を行なった。０．１％
ＴＦＡで平衡化したカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｈｉ
−ｐｏｒｅ ＲＰ −３０４）に、第３図の活性ピー
クを各々アプライした。４０にの蛋白は、流速１．０ｓ
ｅ／ｌ１ｉｎにて、第４図破線で示すアヒトニトリル直
、線濃度勾配にて溶出させた。 ｔＪ Ｖ ２１０ｎａ
＋で吸収を検出した両分にライて、２５ ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ −Ｈ（Ｊ、 ｐｌ−１９，０に対して透析した
後、起炎性ＰＬＡ２に対する阻害活性を測定した。その
結果、第４図に示す保持時間５９分の単一な画分に、顕
著な阻害活性を検出した。ＳＯＳポリアクリルアミド電
気泳動で、この蛋白は単一で分子）が約４０，０００で
あることが判明した。また３５Ｋを主に含む両分を同様
に逆相トＩＰＬｃにて精製し、同様に蛋白画分の起炎性
ＰＬＡｚに対り−る阻害活性を調べた結果、第５図に示
すように保持時間５９分の単一な画分に、著明な阻害活
性が検出された。
Ａ２に阻害活性を示す活性分画は、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動より、主に４０にと３５により成る
ことが判った。そこでこれらを単一蛋白とする目的で、
それぞれ逆相ＨＰＬＣによる精製を行なった。０．１％
ＴＦＡで平衡化したカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｈｉ
−ｐｏｒｅ ＲＰ −３０４）に、第３図の活性ピー
クを各々アプライした。４０にの蛋白は、流速１．０ｓ
ｅ／ｌ１ｉｎにて、第４図破線で示すアヒトニトリル直
、線濃度勾配にて溶出させた。 ｔＪ Ｖ ２１０ｎａ
＋で吸収を検出した両分にライて、２５ ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ −Ｈ（Ｊ、 ｐｌ−１９，０に対して透析した
後、起炎性ＰＬＡ２に対する阻害活性を測定した。その
結果、第４図に示す保持時間５９分の単一な画分に、顕
著な阻害活性を検出した。ＳＯＳポリアクリルアミド電
気泳動で、この蛋白は単一で分子）が約４０，０００で
あることが判明した。また３５Ｋを主に含む両分を同様
に逆相トＩＰＬｃにて精製し、同様に蛋白画分の起炎性
ＰＬＡｚに対り−る阻害活性を調べた結果、第５図に示
すように保持時間５９分の単一な画分に、著明な阻害活
性が検出された。
この蛋白は、ＳＤＳポリアクリルアミドに電気泳動で、
単一で分子量約３５，０００であることが判明した。
単一で分子量約３５，０００であることが判明した。
実施例２
３５に蛋白の起炎性ＰＬＡ２に対する阻害様式を知る目
的で、以下の実験を行なった。即ら、反応系に於けるＭ
素濃度及び阻害蛋白の濃度を一定にし、基質１１Ｅ１１
＆を変化させて反応速度を測定した。
的で、以下の実験を行なった。即ら、反応系に於けるＭ
素濃度及び阻害蛋白の濃度を一定にし、基質１１Ｅ１１
＆を変化させて反応速度を測定した。
その結果を、逆数プロットで第６図に示したく白めきは
阻害蛋白を含まない系での酵素反応を示し、黒ぬぎは一
定量の阻害蛋白存在時の酵素反応を示す）。
阻害蛋白を含まない系での酵素反応を示し、黒ぬぎは一
定量の阻害蛋白存在時の酵素反応を示す）。
第６図より、本蛋白の阻害様式は非拮抗阻害（Ｗ質と阻
害物質が非拮抗的に作用する）であり、阻害定数は４，
５ｘ １０″８Ｍと騨出された。
害物質が非拮抗的に作用する）であり、阻害定数は４，
５ｘ １０″８Ｍと騨出された。
実施例３
実施例１で単餠精装したサンプルの、蛋白−次構造の一
部を決定した。その結果、４０に蛋白は以下の通りであ
った。即ら、Ｎ端部アミノ酸はＧｌｕかＡＳｌｌか決定
されていないが、２番目からは、Ａ ｓｐ−Ｖ ａｌ
−Ｐ ｒｏ−Ａ ｌａ −Ａｌａ −Ａ ｓｐ −Ｌ
ｃｕ−８ｅｒ−Ａｓｐ−であった。
部を決定した。その結果、４０に蛋白は以下の通りであ
った。即ら、Ｎ端部アミノ酸はＧｌｕかＡＳｌｌか決定
されていないが、２番目からは、Ａ ｓｐ−Ｖ ａｌ
−Ｐ ｒｏ−Ａ ｌａ −Ａｌａ −Ａ ｓｐ −Ｌ
ｃｕ−８ｅｒ−Ａｓｐ−であった。
また、３５に蛋白の一次配列は、Ｎ端部アミノ酸はＧｌ
ｙかＡｓｐか決定されていないが、２番目からは、Ｇｌ
ｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ −Ｉｌ
ｅ−Ｖａｌ−−であった。
ｙかＡｓｐか決定されていないが、２番目からは、Ｇｌ
ｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ −Ｉｌ
ｅ−Ｖａｌ−−であった。
第１図は、アニオン交換１−Ｉ Ｐ Ｌ Ｃを用いｌζ
目的蛋白の溶出パターンを示す。第２図は、ゲル濾過Ｉ
ｔ Ｐ Ｌ Ｃを用いた目的蛋白の溶出パターンを示す
。 第３図は、アニオン交換ＨＰ Ｌ Ｃを用いた目的蛋−
白の溶出バクーンを示す。第４図は、逆相１−Ｉ Ｐ
ＬＣを用いた目的蛋白（４０Ｋ）の溶出パターンを示づ
゛。第５図は、逆層１−ＩＰＬｃを用いた目的蛋白（３
５Ｋ）の溶出パターンを示す。第６図、目的阻害蛋白の
動力学データを示す。 特許出願人 帝 人 株一式 会 社 第２図
目的蛋白の溶出パターンを示す。第２図は、ゲル濾過Ｉ
ｔ Ｐ Ｌ Ｃを用いた目的蛋白の溶出パターンを示す
。 第３図は、アニオン交換ＨＰ Ｌ Ｃを用いた目的蛋−
白の溶出バクーンを示す。第４図は、逆相１−Ｉ Ｐ
ＬＣを用いた目的蛋白（４０Ｋ）の溶出パターンを示づ
゛。第５図は、逆層１−ＩＰＬｃを用いた目的蛋白（３
５Ｋ）の溶出パターンを示す。第６図、目的阻害蛋白の
動力学データを示す。 特許出願人 帝 人 株一式 会 社 第２図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、起炎性フォスフォリパーゼＡ＿２阻害活性を有する
蛋白。 ２、グルココルチコイド投与により細胞から誘導される
という性質を有し、起炎性フォスフォリパーゼＡ＿２阻
害活性を有する特許請求の範囲第１項記載の蛋白。 ３、グルココルチコイド投与後、ラット腹腔より精製さ
れ、分子量４０ＫでＮ端部のアミノ酸配列が、Ｎ端部ア
ミノ酸−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−よりなる、起炎性フォ
スフォリパーゼＡ＿２阻害活性を有する特許請求の範囲
第１項または第２項記載の蛋白。 ４、グルココルチコイド投与後、ラット腹腔より精製さ
れ、分子量３５ＫでＮ端部のアミノ酸配列が、Ｎ端部ア
ミノ酸−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｈ
ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−よりなる、起炎性フォ
スフォリパーゼＡ＿２阻害活性を有する特許請求の範囲
第１項または第２項記載の蛋白。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62079693A JPH06799B2 (ja) | 1987-04-02 | 1987-04-02 | 起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白 |
| DE3850407T DE3850407T2 (de) | 1987-04-02 | 1988-03-30 | Protein mit inhibierender wirkung auf die entzündungserregende phospholipase a2. |
| PCT/JP1988/000318 WO1988007552A1 (fr) | 1987-04-02 | 1988-03-30 | Proteine inhibant la phospholipase a2 provoquant des inflammations |
| US07/295,724 US5116942A (en) | 1987-04-02 | 1988-03-30 | Protein having an inflammatory phospholipase a2 inhibitory activity |
| EP88902933A EP0413024B1 (en) | 1987-04-02 | 1988-03-30 | Protein having activity of inhibiting inflammation-inducing phospholipase a2 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62079693A JPH06799B2 (ja) | 1987-04-02 | 1987-04-02 | 起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63246397A true JPS63246397A (ja) | 1988-10-13 |
| JPH06799B2 JPH06799B2 (ja) | 1994-01-05 |
Family
ID=13697288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62079693A Expired - Lifetime JPH06799B2 (ja) | 1987-04-02 | 1987-04-02 | 起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5116942A (ja) |
| EP (1) | EP0413024B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06799B2 (ja) |
| DE (1) | DE3850407T2 (ja) |
| WO (1) | WO1988007552A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991001999A1 (fr) * | 1989-08-03 | 1991-02-21 | Teijin Limited | Proteine d'inhibition de la phospholipase a2 naissant dans une region inflammee, sa production et gene prevu a cet effet |
| JPH0365187A (ja) * | 1989-08-03 | 1991-03-20 | Teijin Ltd | 起炎性ホスホリパーゼａ↓２阻害蛋白、その製造方法およびその遺伝子 |
| US5344764A (en) * | 1989-08-03 | 1994-09-06 | Teijin Limited | Protein inhibitors of phospholipase A2 purified from inflammatory sites and production process |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5264550A (en) * | 1985-04-15 | 1993-11-23 | Scios Nova Inc. | Human anti-inflammatory phospholipase inhibitor protein |
| WO1992008475A1 (en) * | 1990-11-20 | 1992-05-29 | Kowa Co., Ltd. | Therapeutic agent for skin or corneal disease |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6256429A (ja) * | 1985-09-04 | 1987-03-12 | Teijin Ltd | フオスフオリパ−ゼａ↓２阻害活性を有する蛋白 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4879224A (en) * | 1985-01-10 | 1989-11-07 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor polypeptides |
| ES8704184A1 (es) * | 1985-01-10 | 1987-03-16 | Biogen Nv | Un metodo para producir un polipeptidos similar a lipocortina humana. |
| US4874743A (en) * | 1985-01-10 | 1989-10-17 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor-like polypeptides |
| AU5770786A (en) * | 1985-04-15 | 1986-11-05 | Biotechnology Research Partners Limited | Human anti-inflammatory phospholipase inhibitor protein |
| US4937324A (en) * | 1987-02-06 | 1990-06-26 | Zymogenetics, Inc. | Chromatographic purification of human proteins having anticoagulant and anti-inflammatory activity |
-
1987
- 1987-04-02 JP JP62079693A patent/JPH06799B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-03-30 DE DE3850407T patent/DE3850407T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-30 US US07/295,724 patent/US5116942A/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-30 EP EP88902933A patent/EP0413024B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-30 WO PCT/JP1988/000318 patent/WO1988007552A1/ja not_active Ceased
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6256429A (ja) * | 1985-09-04 | 1987-03-12 | Teijin Ltd | フオスフオリパ−ゼａ↓２阻害活性を有する蛋白 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991001999A1 (fr) * | 1989-08-03 | 1991-02-21 | Teijin Limited | Proteine d'inhibition de la phospholipase a2 naissant dans une region inflammee, sa production et gene prevu a cet effet |
| JPH0365187A (ja) * | 1989-08-03 | 1991-03-20 | Teijin Ltd | 起炎性ホスホリパーゼａ↓２阻害蛋白、その製造方法およびその遺伝子 |
| US5344764A (en) * | 1989-08-03 | 1994-09-06 | Teijin Limited | Protein inhibitors of phospholipase A2 purified from inflammatory sites and production process |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0413024B1 (en) | 1994-06-22 |
| EP0413024A1 (en) | 1991-02-20 |
| DE3850407D1 (de) | 1994-07-28 |
| US5116942A (en) | 1992-05-26 |
| EP0413024A4 (en) | 1990-03-08 |
| DE3850407T2 (de) | 1995-03-09 |
| JPH06799B2 (ja) | 1994-01-05 |
| WO1988007552A1 (fr) | 1988-10-06 |
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