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WO1988007552A1 - Proteine inhibant la phospholipase a2 provoquant des inflammations - Google Patents

Proteine inhibant la phospholipase a2 provoquant des inflammations Download PDF

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WO1988007552A1
WO1988007552A1 PCT/JP1988/000318 JP8800318W WO8807552A1 WO 1988007552 A1 WO1988007552 A1 WO 1988007552A1 JP 8800318 W JP8800318 W JP 8800318W WO 8807552 A1 WO8807552 A1 WO 8807552A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
inhibitory activity
pla
inflammatory
amino acid
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP1988/000318
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English (en)
French (fr)
Inventor
Keizo Inoue
Atsushi Imaizumi
Takashi Kamimura
Yorimasa Suwa
Masahiro Okada
Yoji Suzuki
Ichiro Kudo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Teijin Ltd
Original Assignee
Teijin Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Teijin Ltd filed Critical Teijin Ltd
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Priority to EP88902933A priority patent/EP0413024B1/en
Publication of WO1988007552A1 publication Critical patent/WO1988007552A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a protein having an activity of inhibiting: a proinflammatory phospholipase A2 (P and A2).
  • BACKGROUND ART-Dalco-co-cotide is currently used as a therapeutic agent for various inflammatory and allergic diseases such as rheumatoid arthritis, physical erythematosus, and bronchial asthma. It is widely used as one of the most effective pharmaceutical products on a daily basis. Its action mechanism is derived from the anti-inflammatory, anti-edema, and immunosuppressive effects of glucocorticoid. Among them, the expression of anti-inflammatory effect is based on the release of arachidonic acid, a precursor of locotrienprostaglandin, an inflammation-related substance. Related to suppressing.
  • Paw edema (experimental inflammation. Inhibition of the therapeutic effects of dalcocorticoid on animal models. These results indicate that glucocorticoid anti-inflammatory activity is PLA 2 inhibitory. It is thought to be performed through induction of protein synthesis.
  • stomach PLA 2 is used in the evaluation system.
  • PLA 2 of ⁇ against to believed to play a digestive enzyme role therewith are present differ an inflammatory PLA 2 in properties.
  • the PLA 2 is found in rats Bok in the peritoneal cavity at the time of taxation down administration isolated ⁇ purified, are investigating the nature (biochemistry, V ol 58, No.8, 766 , 1986) . According to this, it was observed that when 100 ng of the purified enzyme was inoculated intradermally into the back of the rat, intravenously administered Evans Blue leaked in advance, and local vascular permeability was enhanced. I have.
  • PLA 2 derived from arm It has been confirmed that it does not show any properties.
  • the present inventors have used the pro-inflammatory PLA2 found in the rat abdominal cavity upon administration of the above-described casein to specifically identify the present enzyme.
  • the present inventors have intensively searched for a protein to be inhibited, and reached the present invention.
  • the protein of the present invention has a property of being induced from cells by administration of glucocorticoid. Particularly preferred is that, after administration of glucocorticoid, it is purified from rat peritoneal cavity, has a molecular weight of 40K, and has an N-terminal amino acid sequence having an N-terminal amino acid sequence.
  • dalcocholate After the administration of dalcocholate, it was purified from rat abdominal cavity and had a molecular weight of 35 and the N-terminal amino acid sequence was N-terminal amino acid—Glu—Arg L eu—L ys—His—L eu—I le—V al— It is a protein having inflammatory PLA 2 inhibitory activity.
  • FIG. 1 shows the elution pattern of the target protein using anion exchange HPLC.
  • FIG. 2 shows the elution pattern of the target protein using gel filtration HPLC.
  • Figure 3 shows the elution pattern of the target protein using anion-exchanged HPC.
  • FIG. 4 shows the elution pattern of the target protein (40 K) using reversed-phase HPLC.
  • FIG. 5 shows the elution pattern of the target protein (35 K) using reversed-phase HPLG.
  • Fig. 6 shows the kinetic data of the target inhibitory protein.
  • the present protein is a protein synthesized in vivo by the administration of steroid
  • the method of inducing it is to directly administer steroid to the living body to induce the protein.
  • inV is induced by directly contacting steroid with ro using a normal cell or a transformed cell.
  • inV was administered subcutaneously on the back of the rat.
  • the present protein is purified and isolated by, for example, the following method.
  • the standard reaction was performed on a 130 ⁇ l sample or control (buffer) with 50 f ⁇ of 0.5 MT ris-HCI (H9.0) and 25 of 40 mM CaCiz and 25 substrate. (400di) mn mol, 2 mM) and mix. Finally, add 20 ⁇ Jl of inflammatory P and A2 (0.1 ng / i, 80Un sZfflg * protein), mix, and incubate for 10 minutes at 37. Go ahead. afterwards
  • Dexamethasone was injected subcutaneously into the back of the SD rat, 8 weeks old, using 50 males at a dose of 1./ ⁇ . Let the abdominal cavity per rat be washed with 12 ⁇ 2 Un heparin and 50 M PMSF (phenylmethyl sulphonylifluoride) saline solution per animal. Thereafter, about 500 washings were collected. This cleaning solution was added to a 40-fold amount of 10 mM ammonium hydroxide. After dialysis twice in a buffer solution (pH 7.4), the solution was freeze-dried to obtain a lyophilized rat-peritoneally washed sample of about 940 ffl ?.
  • PMSF phenylmethyl sulphonylifluoride
  • Fig. 1 shows the amount of labeled fatty acids measured by a method for measuring the pro-inflammatory PLAz inhibitory activity.
  • Tris — gel filtration column (TSKG el G 3000 SW) equilibrated with H, .0 ⁇ NaC, pH 7.7. The mixture was eluted at a flow rate of ⁇ . ⁇ . Inflammatory ⁇ LA 2 inhibitory activity was obtained in two peaks (shaded area in FIG. 2). Purification was further promoted by focusing on the fraction eluted at a retention time of 37 to 44 minutes.
  • the active fraction showing inhibitory activity on the inflammatory PLA 2 by analytical anion exchange HPLC consists mainly of 40 K and 35 K by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. I understood this. For the purpose of converting them into single proteins, each was purified by reversed-phase HPLC. Each of the activated peaks shown in FIG. 3 was applied to a column (Bio-Rad Hi-pore RP-304) equilibrated with 0.1% TFA. At 40 K, the flow velocity ⁇ . ⁇ ⁇ ⁇ Eluted with a linear concentration gradient
  • Example I A portion of the primary protein structure of the sample isolated and purified in Example I was determined. As a result, the 40K protein was as follows. Immediately, it has not been determined whether the N-terminal amino acid is Glu or Asf), but from the second, Asp—Val—Pro—Ala—Ala—Asp — Le eu—Ser—A sp—
  • the primary sequence of the 35K protein has not been determined as to whether the terminal amino acid is Gly or Asp, but from the second, G Iu—
  • the present invention is, you about the ⁇ white you have a an inflammatory PLA 2 inhibitory activity. Therefore, by inhibiting the inflammatory PLA 2 which promotes the release of inflammatory-related substances from arachidonic acid during inflammation, rheumatoid arthritis, It can be used as an anti-inflammatory agent, an immunosuppressant, etc. for treating various inflammations such as systemic erythematosus, bronchial asthma, etc., and allergic diseases. .

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Description

明 棚 発明 の名称
起炎性フ ォ ス フ ォ リ パ ー ゼ A 2 阻害活性を有 す る蛋 白 技術分野
本発 明 は 、:起炎性 フ ォ ス フ ォ リ パ ー ゼ A 2 ( P し A 2 ) 阻害活性を有 す る蛋 白 に 関 す る 。
更 に 詳 し く は 、 ダル コ コ ル チ コ イ ド投与 に よ り 、 細胞 か ら 誘導さ れ 、 起炎性 P L A 2 阻害活性を有す る蛋 白 に 関 す る あ ので あ る 。
背景技術 - ダル コ コ ルチ コ イ ド は 、 慢性関節 リ ウマ チ ， 身性ェ リ テマ 卜一デス ， 気管支喘息等の種々 の炎症性 ， ア レル ギ ー 性疾患の治療薬 と し て 、 今 日 最ぁ有効性の高い 医薬 品 の ひ と つ と し て 幅広 く 用 い ら れて い る 。 そ の作用 メ カ ニ ズ ム は 、 グル コ コ ルチ コ イ ド の抗炎症作用 ， 抗浮腫作 用 ， 免疫抑制作用 な ど に 由 来 し て い る 。 そ の 中で抗炎症 効 果の発現 は 、 炎症関連物質で あ る ロ イ コ 卜 リ エ ンゃプ ロ ス タ グラ ン ジ ン の前駆体で あ る ァ ラ キ ド ン酸の 、 遊離 を抑制 す る こ と に 関連す る 。 即 ち 、 ァ ラ キ ド ン酸 を リ ン 脂質か ら 直接切 り 出 す酵素 、 P L A 2 を 阻害す る と の 説 が近年 F lower ( N ature 278 ： 456 , 1979 ) .に よ り 提唱 さ れ て い る 。 グル コ コ ルチ コ イ ド の作用 機序 に つ い て は 、 細胞内 に 入 っ た グル コ コ ルチ コ ィ ド は最初 に 胞体内受容 体と結合 し 、 こ の複合体が核内へ と輸送さ れて 、 遺伝子 発現の制御が働き、 最終的に は蛋白合成の誘導が行なわ れる 。 事実、 鶴藤ら （ N ature 280： 408 , 1979 ) は、 蛋 白合成阻害剤シ ク ロ へキシ ミ ド と W R N A合成阻害剤ァ ク チノマイ シン D とが、 セ ロ 卜 ニンに よ り惹起される足 踱浮腫 （実験的炎症.動物モデル に対する、 ダルコ コル チコ イ ドの治療効果を抑制するこ と を示した。 これら の 結果よ り 、 グルココルチコ イ ド抗炎症作用 は、 P L A 2 阻害活性のある蛋白 の合成誘導を介 して行なわれると考 え られる。
ダルココルチコ ィ ドに よ り合成が誘導され、 in vitro で P L A 2 活性を阻害 し、 in vivo でプ ロ スタ ラ ンジ ン生成を抑制するよう な蛋白を分離する試みは、 こ れま で数グループよ り なされている 。 これ らの試みはいずれ も 、 その評価系にプタ脬臓 P L A 2 を用いて いる 。
と こ ろが、 一般的に腌藏の P L A 2 は消化酵素的役割 を果す と考え られるのに対 し 、 それと は性質の異なる起 炎性 P L A 2 が存在する。 最近、 井上ら はカ ゼイ ン投与 時のラ ッ 卜 腹腔中に見い出さ れる P L A 2 を単離 ♦ 精製 し 、 その性質を調べて いる （ 生化学， V ol 58, No.8 , 766, 1986 ) 。 それに よれば、 精製酵素 100ngをラ ッ 卜 背 部皮内に接種する と 、 あ らかじ め静脈投与 したエバンス ブルーが漏出 し 、 局所での血管透過性が亢進 している こ とを観察し ている。 一方膊朦由来の P L A 2 は、 この活 性を示 さ な い こ と も確認 し て い る 。 ま た V adasら は 、 リ ゥ マ チ患者の 関節内 P L A 2 活性が 、 亢進 し て い る こ と を報告 し て お り 、 更 に そ の酵素を精製 し そ の性質を調 べ た と こ ろ 、 ヒ 卜 脬臓 P L A 2 の抗体 と は反応 し な い こ と を報告 し て い る （ J . B iochem. 100, 1297 - 1303,
1986 ) 。 こ の よ う に脾臓由来 P L A 2 と 起炎性 P L A 2 は そ の蛋 白 の一次及び高次構造が異 な り 、 な お かつ 生体 内 に 於け る役割 が明確 に 異な る も の と 思わ れる 。
発明 の 開示
こ の よ う な背景 のも と に 、 本発明者 ら は 、 上記 カ ゼィ ン投与時の ラ ッ 卜 腹腔中 に 見い ださ れる起炎性 P L A 2 を用 い 、 本酵素を特異 的 に 阻害 す る蛋 白 を鋭意 索 し 、 本発明 に 到 つ た 。
即 ち 、 本発 明 は 、 起炎性 フ ォ ス フ ォ リ パ ー ゼ A 2 阻害 活性を有す る蛋 白 で あ る 。 本発明 の蛋 白 は 、 グル コ コ ル チ コ イ ド投与 に よ り 、 細胞か ら 誘導 さ れる と い う 性質を 有す る 。 そ し て 、 特 に 好 ま し い の は 、 グル コ コ ル チ コ ィ ド投与後 、 ラ ッ 卜 腹腔よ り 精製 さ れ、 分子量 40K で N 端 部の ア ミ ノ 酸配列 が 、 N 端部 ア ミ ノ 酸 — A sp— V al— P ro— A I a - A la- A sp- L eu— S er— A sp— よ り な る 起炎性 P L A 2 阻害活性を有 す る 蛋 白 、 又 は ダル コ コ ル チ コ イ ド投与後 、 ラ ッ 卜 腹腔 よ り 精製 さ れ 、 分子量 35 で N 端部の ア ミ ノ 酸配列 が N 端部 ア ミ ノ 酸— G lu— A rg 一 L eu— L ys— H i s— L eu— I le— V al— よ り な る 、 起 炎性 P L A 2 阻害活性を有する蛋白である 。
図面の簡単な説明
第 1 図 は、 ァニオン交換 H P L Cを甩いた 目 的蛋白の 溶出パタ ー ンを示す。
第 2 図は、 ゲル瀘過 H P L Cを用いた 目 的蛋白の溶出 パタ ー ンを示す。 - - 第 3 図は、 ァニオン交換 H P し Cを用いた目 的蛋白の 溶出パタ ー ンを示す。
第 4図は、 逆相 H P L Cを用いた目 的蛋白 （ 40 K ) の 溶出パタ ーンを示す。
第 5 図 は、 逆相 H P L Gを用いた目的蛋白 （ 35 K ) の 溶出ノ タ ー ンを示す 。
第 6図、 目 的阻害蛋白の動力学デー タ を示す。
発明を実施するための最良の形態
まず本発明の蛋白の、 単離精製方法につ いて述べる 。 本蛋白 は、 ステ ロ イ ドの投与によ り生体内で合成される 蛋白であるこ とか ら 、 その誘導法と し て は、 直接ステロ イ ドを生体内 に投与 し 、 本蛋白 を誘導して も よいが、 正 常細胞あるいは棟化細胞を用 いて 、 i n Vは roで直接ステ ロ イ ド と接触させて誘導させる方法もある 。 一例 と し て は-、 ラッ 卜背部皮下にデキサメ サゾンを投与 し 、 1。 5時 間後に ドライ ア イ ス にて炭酸ガス下窒息死させ、 腹腔を V ン酸， へパ .リ ン及び P M S F ( P heny imethy I- sulphonylf luoride ) 加生理食塩水にて よ く 洗淨後、 洗 浄 液を 回収 す る 。 こ の洗净液を醉酸 ア ン モ ニ ゥ ム緩衝液 に て よ く 透析後 、 凍結乾燥 す る 。 1 匹 の ラ ッ 卜 よ り 、 約
20 の ラ ッ 卜 腹腔洗净凍結標品 を得 る 。 こ の標品 を 出発 材料 と し て 、 例 え ば 、 以下の如 き方法で本蛋 白 は精製単 離 さ れる 。
起炎性 P L A 2 を 阻害する活性を指標 に し て 、 例 え ば ァ ニ オ ン交換高速液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に 標品 を ァ プ ラ イ し 、 各画分の起炎性 P L A 2 阻害活性を測定 し 、 活 性 ピ ー ク を得た 。 活性 ピ ー ク を S D S ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド電気泳動で調 べ た と こ ろ 、 多数の蛋 白 の混合物で あ る こ と を認め た 。 更 に こ の活性画分 をゲル濾過高速液体 ク ロ マ 卜 グラ フ ィ 一 に かけ た 。 こ こ に 於い て も 活性画分 は 得'ら れた が 、 ま だ単一蛋 白 に は精製 さ れて お ら ず 、 更 に 逆相髙速液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る精製 を行な い 、 活性 ピ ー ク を得た 。 こ の活性 ピ ー ク は 、 S D S ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド電気泳動 か ら 単一蛋 白 で あ る こ と がわ か っ た 約 2 の 標品 か ら 、 起炎性 P L A 2 阻害蛋 白 を約 100 ng単離 し た 。
以上 、 ス テ ロ イ ド誘導ラ ッ 卜 腹腔か ら 、 本発明 の起炎 性 P L A 2 阻害活性を有す る蛋 白 を 、 精製 * 単離 す る方 法 を 中心 に 説明 し た が 、 本発明 に お い て 、 蛋 白 の起源や 蛋 白 の製法 は何 ら 限定 さ れる ので は な い 。 ヒ 卜 ゃ他 の 動物 か ら 抽 出 ♦ 精製単離 し て も よ く 、 ま た 遺伝子 工学的 手法で微生物 あ る い は動物細胞か ら 製造 し て も よ い 。 起 炎性 P L A 2 阻害活性を有する蛋白である限 り 、 本発明 に含ま れるちのである 。
本発明において用い ら れた各種試験， 測定法は以下の 通り である。
(1) 起炎性 P L A 2 阻害活性の測定法
- .カ ゼイ ン誘導ラ ッ 卜腹腔浸出液よ り 単離精製 し た起 炎性 P L A 2 を用い、 基質 と して は14 C酢酸を E。； C 0 I i に取り込ませ、 14 Gでラベル化されたホスフ ァ チジルエタ ノ ールア ミ ンを抽出 し て用 いた 。 標準の反 応系は、 130 ϋの試料あるい は対照 （ 緩衝液 ） に 50 f ϋの 0.5M T ris 一 H Ci ( H 9。0〉 及び 25 の 40 mM C a Ci z 及ぴ 25 の基質 （ 400di)m n mol , 2 mM ) を入れ混合後、 最後に 20ίί Jlの起炎性 P し A 2 ( 0.1ng/ i , 80U n sZfflg * 蛋白 ） を入れて 混合 し 、 37で に て 10分鬮イ ンキ ュ べ一 卜 する。 その後
D ole 試薬で反応を停止させる。 ホスフ ァ チジルエ タ ノ ールァ ミ ンが加水分解されて生成したラベル化脂肪 酸をヘプタ ンで抽出後、 液体シンチ レー シ ヨ ンカ ウン タ ー にてその量を測定する 。 対照に対する割合 （ 96〉 を起炎性 P L A 2 の阻害率とする。
(2) S D Sポ リ ア ク リ ルア ミ ド電気泳動
各種ク ロマ 卜 的手法によ り 分画 した試料の一部を取 り 、 1 % S D S , 2 —メ ルカ プ ト エタ ノ ール存在下、 100でで 10分間加熟 した。 次いで 、 12.5 %ポ リ アク リ ル ア ミ ドゲル に 試料を ア プ ラ イ し 、 15 m Aで 1.5時 間 電気泳動 し た 。 泳動終了後 、 バ イ オ ラ ッ ド社製シ ルバ ー ス テ ィ ンキ ッ ト で染色 し た 。
(3) 蛋 白 一 次構造の決定法
気相プ ロ テ イ ン シ ー ケ ンサ ー （ アプラ イ ド · バ イ オ シ ス テ ム社， model 470 A ) を用 い て 決定 し た 。 即 ち 単離精製さ れた-サンプル 10 3 を 、 30 £ の 1 % S D S に 溶解 し 、 上記気相プ ロ テ イ ン シ ー ケ ンサ ー に ア ブ ラ イ し た 。 自 動 的 に エ ドマ ン分解 さ れた P T H ( フ エ 二ルチ オ ヒ ダ ン 卜 イ ン ） ア ミ ノ 酸誘導体 は 、 そ の後 、 高速液体 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に て 各 ア ミ ノ 酸 と し て 分 析 さ れた 。 ： - < 実施例 >
以下 、 実施例 に よ り 本発明 を詳述 す る 。 実施例 Ί
(1) ラ ッ 卜 腹腔洗浄液凍結標品 の作成
S D 系ラ ッ 卜 8 週令 ， 雄 50匹を 用 い て 、 デキ サ メ サ ゾ ン を 1. / ^ と な る よ う に 背部皮下 に 注射 し 、 1.5時間後 に ド ラ イ ア イ ス に て 炭酸 ガ ス下窒息死さ せ 腹腔を 1 匹当 り 12 ^の 2 U n の へパ リ ン及び 50 M の P M S F ( phenylmethyl su l phonyi f luoride ) 加生理食塩水 に て よ く 洗淨後 、 洗净 液約 500 を 回収 し た 。 こ の洗淨液を 、 40倍量の 10 mM醉酸 ア ン モ ニ ゥ ム緩衝液 （ PH 7.4) に て 、 2 回透析後、 凍結乾燥 し - 約 940ffl?のラ ッ 卜腹腔洗浄凍結乾燥標品を得た。
— (¾— 分取用 カラムを用 いた ァニオン交換髙速液体ク ロマ . 卜 グラ フ ィ 一 （ H P L C ) に よる 目 的蛋白の分離精製 氷冷下、 200 のラッ 卜腹腔洗淨凍結乾燥標品を 50 の 20' niM T Pi s - H C5 ( pH 8,0〉 に溶解させ、 0.45 M embrane F i 11 e r にて濾過 し た後に 、 直接 S 750 H P L C用ポンプでカ ラム （ T S K G el D E A E — 5 P W ) にアプラ イ した。 吸着 し た試料は 流速 2. m i n で 、 第 1 図破線で示す N a C 直接濃 度勾配にて溶出させた 。 第 1 図の実線は、 U V 280顯 に於ける吸収で蛋白量を表わ し たものである 、 起炎 性 P L A 2 に対する阻害活性が F ]: 〜 F r. IVに認め られた 。 各々の画分は S D S電気泳動の結果、 多く の 分子量の異なる蛋白 の混合物であ っ た 。 第 1 図一 は、 起炎性 P L A z 阻害活性の測定法に よ り 測定 したラぺ ル化脂肪酸の量を示す。
(3) ゲル濾過カ ラムを用 いた高速液体ク ロマ 卜 グラフ ィ 一 に よる 目 的蛋白の分錐精製
更に起炎性 P L A 2 阻害分画 （ F r. IV ) を精製する ため に、 限外瀘過 （ セ ン ト リ カ ツ 卜 10 X 3000 G ) で濃 縮 した 。 約 0。 に濃縮された分画を、 0.1M
T r i s — H , .0Μ N a C , p H 7.7で平衡化 し たゲル濾過カ ラム （ T S K G el G 3000 S W ) にァ プ ラ イ し 、 流速 Ο.δ Ζ ηιί η で溶出 さ せ た 。 起炎性 Ρ L A 2 阻害活性 は 2 ピ ー ク 得 ら れ た （ 第 2 図 の斜線 部 ） 。 保持時間 37分〜 44分 に 溶出 さ せ る分画 に 着 目 し 更 に 精製 を進め た 。
(4) 分析用 カ ラ ム を用 い た ァ ニ オ ン 交換高速液体 ク ロ マ 卜 グ ラ フ ィ 一 に よ る 目 的蛋 白 の分離精製 - ゲル濾過 カ ラ ム に て 保持時間 40分前後 に 溶出 さ れた 活性分画を集め 、 25 mM T ri s — H CS ( PH 7.7) のバ ッ フ ァ ー に 対 し 透析 し 、 同バ ッ フ ァ ー で平衡化 し た ァ ニ オ ン'交換 カ ラ ム （ T S K G el D E A E - 5 W ) に ア プラ イ し た 。 流速 I .O^ Z mi n , N a C 濃 度勾配下 、 目 的蛋 白 の分離を行な っ た 。
起炎性 P L A 2 阻害活性は 、 保持時間 26分〜 36分の 分画 に 認め ら れた （ 第 3 囱 の斜線部 ） 。
(5) 逆相高速液体 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー に よ る 目 的蛋 白 の 分離精製
分析用 ァ ニ オ ン交換 H P L C に て 起炎性 P L A 2 に 阻害活性 を示す 活性分画 は 、 S D S ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動 よ り 、 主 に 40 K と 35 K よ り 成る こ と が 判 っ た 。 そ こで こ れ ら を単一蛋 白 と す る 目 的で 、 そ れ ぞれ逆相 H P L C に よ る精製を行な っ た 。 0.1% T F Aで平衡化 し た カ ラ ム （ B io— R ad H i - pore R P — 304 ) に 、 第 3 図 の活性 ピ ー ク を各々 アプラ イ し た 。 40 K の蛋 白 は 、 流速 Ι .Οβώ Ζ πιί η に て 、 第 4 図破 線で示すァ セ 卜 二 卜 リ ル直線濃度勾配に て溶出させた
U V 210nmで吸収を検出 し た画分 につ いて 、 25 mM T ri s — H C ， H 9.0に対 し て透析 し た後、 起炎性 P L A 2 に対する阻害活性を測定 した。 その結果、 第 4 図 に示す保持時藺 59分の単一な画分に 、 顕著な阻害 活性を検出 し た 。 S D S ポ リ ア ク リ ルア ミ ド電気泳動 で 、 この蛋白は単一で分子量が約 40， 0(H)である こ とが 判明 した。 ま た 35 Kを主に含む画分を周様に逆相 H P L C に て精製 し 、 同様に蛋白画分の起炎性 P L A 2 に 対する阻害活性を調べた結果、 第 5 図に示す よ う に保 持時間 59分の単一な画分に、 著明な阻害活性が検出さ れた 。 この蛋白は、 S D S ポ リ ア ク リ ルア ミ F 電気 泳動で、 単一で分子量約 35 , 000である こ とが判明 した 実施例 2
35K蛋白の起炎性 P L A 2 に対する阻害様式を知る目 的で、 以下の実験を行な っ た 。 即ち 、 反応系に於ける酵 素濂度及び阻害蛋白 の濃度を一定 に し 、 基質濃度を変化 させて反応速度を測定 し た。 その結果を 、 逆数プ ロ 卜 で第 6 図に示した （ 白 ぬきは阻害蚤白を含まない系での -酵素反応を示し 、 黒ぬきは一定量の阻害蛋白存在時の酵 素反応を示す ） 。
第 6 図よ り 、 本蚤白の阻害様式は穽拮抗阻害 （ 基質と 阻害 « "が"^拮抗的に作用 する ） であ り 、 阻害定数は 4.5 X 10 M と算 出 さ れた 。 実施例 3 ,
実施例 Ί で単離精製 し た サ ンプルの 、 蛋 白 一 次構造の 一 部を決定 し た 。 そ の結果 、 40K蛋 白 は以下 の通 り で あ つ た 。 即 ち 、 N 端部 ア ミ ノ 酸 は G luか A sf)か決定 さ れ て い ないが 、 2 番 目 か ら は 、 A sp— V al— P ro— A la— A la— A sp— L eu— S er— A sp—で あ つ た 。
ま た 、 35 K蛋 白 の一次配列 は 、 Ν 端部 ア ミ ノ 酸 は G ly か A s pか決定 さ れ て い な い が 、 2 番 目 か ら は 、 G I u—
A rg- L eu- L ys - H i s— L eu- I le— V al— で あ つ た 。 産業上の利用可能性 :
本発明 は 、 起炎性 P L A 2 阻害活性を有 す る蛋 白 に 関 す る 。 従 っ て 、 炎症時 に お け る ァ ラ キ ド ン酸か ら の炎症 関連物質の遊離を促進す る起炎性 P L A 2 を 阻害す る こ と に よ り 、 慢性関節 リ ウ マ チ， 全身性エ リ テ マ 卜 一デス ， 気管支喘息等の種々 の炎症、 ア レル ギ ー性疾患を治療 す る た め の抗炎症剤 ， 免疫抑制剤 等 と し て 利用 す る こ と が で き る 。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 起炎性フ ォ スフ オ リ パ ーゼ A 2 阻害活性を有する
¾日 。
2 . ダルコ コ ルチコ ィ ド投与に よ り 細胞か ら誘導され る という 性質を有 し 、 起炎性フ ォ ス フ ォ リ パ一ゼ
' A 2 阻害活性を有する請求の範囲第 Ί 項記載の蛋白
3. グルコ コルチコ ィ ド投与後、 ラ ッ 卜腹腔よ り 精製 さ れ、 分子量 40 で N端部のア ミ ノ 酸配列が、 N端 部ア ミ ノ酸 - A sp- V al- P ro- A I a- A I a - A s p 一 し eu— S er— A sp— よ りなる、 起炎性フ ォ ス フ ォ リ パ一ゼ A 2 阻害活性を有する請求の範囲夢 1 項ま た は第 2項記載の蛋白 。
4， ダルコ コルチコ ィ ド投与後、 ラ ッ 卜腹腔よ り精製 さ れ、 分子量 35Kで N端部のアミ ノ 酸配列が、 N端 部アミ ノ 酸 - G I u - A rg - L eu- し ys— H is— し e u 一 I le- V al—よ り なる 、 起炎性フ ォ ス フ ォ リ ノ 一 ゼ A 2 阻害活性を有する請求の範囲第 1 項また は第 2項記載の蛋白 。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5264550A (en) * 1985-04-15 1993-11-23 Scios Nova Inc. Human anti-inflammatory phospholipase inhibitor protein
JPH0365187A (ja) * 1989-08-03 1991-03-20 Teijin Ltd 起炎性ホスホリパーゼａ↓２阻害蛋白、その製造方法およびその遺伝子
WO1991001999A1 (fr) * 1989-08-03 1991-02-21 Teijin Limited Proteine d'inhibition de la phospholipase a2 naissant dans une region inflammee, sa production et gene prevu a cet effet
US5344764A (en) * 1989-08-03 1994-09-06 Teijin Limited Protein inhibitors of phospholipase A2 purified from inflammatory sites and production process
EP0558751B1 (en) * 1990-11-20 2000-02-02 Kowa Co. Ltd. Therapeutic agent for the treatment of wounds

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1986004094A1 (en) * 1985-01-10 1986-07-17 Biogen .N.V. Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human lipocortin-like polypeptides
WO1986006100A1 (en) * 1985-04-15 1986-10-23 Biotechnology Research Partners, Limited Human anti-inflammatory phospholipase inhibitor protein
JPS6256429A (ja) * 1985-09-04 1987-03-12 Teijin Ltd フオスフオリパ−ゼａ↓２阻害活性を有する蛋白

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4874743A (en) * 1985-01-10 1989-10-17 Biogen, Inc. DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor-like polypeptides
US4879224A (en) * 1985-01-10 1989-11-07 Biogen, Inc. DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor polypeptides
US4937324A (en) * 1987-02-06 1990-06-26 Zymogenetics, Inc. Chromatographic purification of human proteins having anticoagulant and anti-inflammatory activity

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1986004094A1 (en) * 1985-01-10 1986-07-17 Biogen .N.V. Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human lipocortin-like polypeptides
WO1986006100A1 (en) * 1985-04-15 1986-10-23 Biotechnology Research Partners, Limited Human anti-inflammatory phospholipase inhibitor protein
JPS6256429A (ja) * 1985-09-04 1987-03-12 Teijin Ltd フオスフオリパ−ゼａ↓２阻害活性を有する蛋白

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEMICAL ABSTRACTS, Vol. 100, No. 9, 27 February 1984 (27. 02. 84) (Columbus, Ohio, U.S.A.) "Further Characterization of the Glucocorticoid-Induced Antiphospholipase Protein "Renocortin" ", page 76, see Abstract No. 62061n, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1983, 117(3), 878-84 *
CHEMICAL ABSTRACTS, Vol. 101, No. 13 24 September 1984 (24. 09. 84) (Columbus, Ohio, U.S.A.) "Macrocortin and the Antiphospholipase Proteins", page 70, see Abstract No. 104127s, Adv. Inflammation Res., 1984, 8, 1-34 *
CHEMICAL ABSTRACTS, Vol. 104, No. 11, 17 March 1986 (17. 03. 86) (Columbus, Ohio, U.S.A.) "Background and Discovery of Lipocortins", page 76, see Abstract No. 82112r, Agents Actions, 1985, 17 (3-4), 255-62 *
CHEMICAL ABSTRACTS, Vol. 97, No. 9, 30 August 1982 (30. 08. 82) (Columbus, Ohio, U.S.A.) "Glucocorticoids Induce the Formation and Release of Antiinflammatory and Antophospholipase Proteins into the Peritoneal Cavity of the Rat", page 87, see Abstract No. 66596h, Br. J. Pharmacol, 1982, 76(1), 185-94 *

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