[go: up one dir, main page]

UA99766C2 - НОВИЙ ФУНКЦІОНАЛЬНО АКТИВНИЙ, ВИСОКООЧИЩЕНИЙ, СТАБІЛЬНИЙ КОН'ЮГАТ ІНТЕРФЕРОНУ АЛЬФА З ПОЛІЕТИЛЕНГЛІКОЛЕМ, ПРЕДСТАВЛЕНИЙ ОДНИМ ПОЗИЦІЙНИМ ІЗОМЕРОМ ПЕГ-NαH-ІФН, ЗІ ЗМЕНШЕНОЮ ІМУНОГЕННІСТЮ, ІЗ ПРОЛОНГОВАНОЮ БІОЛОГІЧНОЮ ДІЄЮ, ПРИДАТНИЙ ДЛЯ МЕДИЧНОГО ЗАСТОСУВАННЯ, І ІМУНОБІОЛОГІЧНИЙ ЗАСІБ НА ЙОГО ОСНОВІ - Google Patents

НОВИЙ ФУНКЦІОНАЛЬНО АКТИВНИЙ, ВИСОКООЧИЩЕНИЙ, СТАБІЛЬНИЙ КОН'ЮГАТ ІНТЕРФЕРОНУ АЛЬФА З ПОЛІЕТИЛЕНГЛІКОЛЕМ, ПРЕДСТАВЛЕНИЙ ОДНИМ ПОЗИЦІЙНИМ ІЗОМЕРОМ ПЕГ-NαH-ІФН, ЗІ ЗМЕНШЕНОЮ ІМУНОГЕННІСТЮ, ІЗ ПРОЛОНГОВАНОЮ БІОЛОГІЧНОЮ ДІЄЮ, ПРИДАТНИЙ ДЛЯ МЕДИЧНОГО ЗАСТОСУВАННЯ, І ІМУНОБІОЛОГІЧНИЙ ЗАСІБ НА ЙОГО ОСНОВІ Download PDF

Info

Publication number
UA99766C2
UA99766C2 UAA201015114A UAA201015114A UA99766C2 UA 99766 C2 UA99766 C2 UA 99766C2 UA A201015114 A UAA201015114 A UA A201015114A UA A201015114 A UAA201015114 A UA A201015114A UA 99766 C2 UA99766 C2 UA 99766C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
ifn
peg
conjugate
formula
hepatitis
Prior art date
Application number
UAA201015114A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Татьяна Вениаминовна Черновская
Лев Александрович Денисов
Дмитрий Валентинович Морозов
Елена Георгиевна Руденко
Ангелина Всеволодовна Кленова
Original Assignee
Зао "Биокад"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45497062&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA99766(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Зао "Биокад" filed Critical Зао "Биокад"
Publication of UA99766C2 publication Critical patent/UA99766C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Винахід належить до нового функціонально активного, високоочищеного, стабільного кон'югата інтерферону альфа з поліетиленгліколем, представленого одним позиційним ізомером ПЕГ-NH, зі зменшеною імуногенністю, із пролонгованою біологічною дією, придатного для медичного застосування, з поліпшеними фармакокінетичними параметрами, загальної формули:, (І)де:n - цілі значення від 227'до 10000 так, що молекулярна маса ПЕГ складає приблизно 10000-40000 Da;m - ціле число ≥ 4;IFN - природний або рекомбінантний поліпептид, що має активність ІФН-альфа,та до імунобіологічного засобу на його основі. Також винахід належить до лікарських засобів, що містять заявлений кон'югат формули (І), фармацевтичних композицій, придатних для лікування вірусних і онкологічних захворювань і захворювань, що супроводжуються первинними або вторинними імунодефіцитними станами, що містять заявлений кон'югат ПЕГ-ІФН і терапевтично прийнятні допоміжні компоненти.

Description

Даний винахід належить до фармацевтики і медицини, а саме, до нових фізіологічно активних кон'югатів інтерферону, зокрема, до нових кон'югатів інтерферону з поліетиленгліколем, що можна використовувати в медицині, наприклад, для лікування вірусних, імунних і онкологічних захворювань.
Інтерферони (ІФН) - це група біологічно активних білків або глікопротеїдів, що продукуються різними клітинами у відповідь на вірусну інфекцію або при впливі на клітини деяких хімічних і біологічних речовин (Ізаас5 8 І іпдетап, 1957; Ревзіка еї аї., 2007). Зв'язування ІФН із клітинними рецепторами приводить до індукції синтезу цілого ряду внутрішньоклітинних білків, що опосередковують противірусну, імуномодулюючу та антипроліферативну дію ІФН (РезікКа еї аї., 2004;
Веків2, 2004).
Гени різних ІФН людини були клоновані і експресовані в бактеріальних і тваринних клітинах, в результаті було отримано та очищено багато рекомбінантних ІФН (РебікКа еї а!., 2004; Ревзіка, 2007).
Лікарські препарати, що містять рекомбінантні ІФН, застосовуються в клінічній практиці для лікування цілого ряду вірусних, онкологічних і імунних захворювань (РебзікКа еї аї!., 2004; Спемаїіе? 5. РаулоївКу, 2009).
На даний час препарати на основі ІФН застосовуються в клінічній практиці для лікування цілого ряду вірусних, онкологічних і імунних захворювань (Ревзіка еї аї., 2004). Найбільш широке використання препарати ІФН одержали для лікування вірусних гепатитів (Спемаїіе? 5. Раулої5Ку, 2009), що представляють одну з найбільш серйозних соціальних проблем. На даний час у світі нараховується близько 350 млн. хронічно хворих гепатитом В та 170 млн. хворих гепатитом С (МагсейПп, 2009). Захворювання гепатитом С в більшості випадків набуває хронічного плину з формуванням тяжких наслідків - цирозу печінки і гепатоцелюлярної карциноми (Мод 5. Гіапоу, 2008). За даними ВООЗ з 1961 року в США і країнах Західної Європи хронічні гепатити і цирози печінки, як причина смерті, перемістилися з 10 на 5 місце (МагсейПп, 2009). Відомо також застосування препаратів, що містять ІФН-с для лікування ряду лейкозів і солідних пухлин, у тому числі рецидивної меланоми (Викому»зкКі еї аї., 2002; Оесапігів еї аї., 2002; Оіпа5-Сагдата єї а!., 2006).
Ефективність дії препаратів нативних ІФН обмежена швидким усмоктуванням з підшкірних тканин, великим об'ємом розподілу, відносно низькою стабільністю, коротким періодом напіввиведення, високою імуногенністю і токсичністю (УМіЇ5, 1990). В результаті, протягом декількох годин після введення спостерігається швидке падіння концентрації ІФН у плазмі крові, при цьому інтерферон не визначається в плазмі вже через 24 години після ін'єкції (Спагеїці еї аїЇ., 1999). Зниження концентрації інтерферону створює умови для поновлення реплікації вірусу і збільшення концентрації вірусних частинок (Гат еї аї., 1997). Тому виникає необхідність частих введень препарату для досягнення ефективних терапевтичних концентрацій у плазмі крові, що призводить до виникнення дозозалежних побічних ефектів. Внаслідок зазначених особливостей монотерапія хронічного гепатиту С (ХГС) ІФН- а265 протягом 12 міс. приводила до стійкої вірусологічної відповіді усього у 15-20 Фо пацієнтів, у хворих з генотипом їв і високим вірусологічним навантаженням ефективність препарату не спостерігалася зовсім (МеНиїспіпзоп еї аї., 1998).
Терапевтична ефективність ІФН може бути підвищена при використанні препаратів пролонгованої дії, зокрема, "ПЕГильованих" ІФН (Маптрз еї а!., 2001; Надлуаппізв еї аї., 2004; 7ец?ет еї аї., 2001).
Одержання ПЕГильованих ІФН полягає в хімічному зв'язуванні молекули інтерферону з полімером - монометоксиполіетиленгліколем (МПЕГ), що складається з повторюваних субодиниць етиленоксиду з метоксигрупою на одному кінці і гідроксильною групою - на іншому. Молекула мПЕГ може мати різну молекулярну масу і стереохімічну структуру (лінійна або розгалужена). Для проведення реакції
ПЕГилювання гідроксильну групу на кінці мпПЕеЕГ активують різними реактивними функціональними групами. Активований мПЕГ може ковалентно зв'язуватися з білком в одному або в кількох місцях, що залежить від природи активованої групи та умов реакції (7аїїр5Ку 8 Ниггі5, 1997; Кобегів еї аї., 2002).
ПЕГилювання ІФН приводить до поліпшення фармакокінетики, збільшення часу напіввиведення з крові, зниження коливань концентрації в крові, зниження імуногенності і токсичності, збільшення активності іп мімо (при зниженні активності іп міїго); збільшення стабільності (січе еї аї., 2000; Кедау еї а!., 2001).
Зниження активності в системі іп міо прямо залежить від молекулярної маси використовуваного
ПЕГ. Приєднання невеликих молекул ПЕГ з молекулярною масою х 5000 Да викликає незначні зміни активності іп міго (Огасе еї аї., 2005). Фармакодинамічні і фармакокінетичні властивості ПЕгГИЛЬОВаНнИХ білків, що містять ПЕГ з такою масою, і немодифікованих білків практично не відрізняються.
Приєднання ПЕГ з більшою молекулярною масою і множинними ділянками приводить до значного зниження біоактивності іп міо, в результаті неефективного зв'язування з рецептором, однак у цьому випадку спостерігається поліпшення фармакокінетичних і фармакодинамічних властивостей
ПЕГильованих білків (Оеєеїдадо еї аїІ., 1992), що в результаті приводить до збільшення біологічної активності іп мімо (Вайоп 8 ВепйпоЇїд, 1998). Форма ПЕГ також впливає на біоактивність і фармакокінетичні властивості - кон'югат з лінійним ПЕГ поширюється на більший об'єм, ніж з ПЕГ, що має розгалужену структуру (Саїсеї еї аї., 2003).
Противірусна активність і біологічні властивості кон'югатів ПЕГ-ІФН у значній мірі залежать також від використовуваних активованих мПЕГ, функціональні групи яких відрізняються за здатністю модифікувати різні амінокислотні залишки білка і за типом утворених з білком хімічних зв'язків (Корегіб еї аІ., 2002). При одержанні ПЕГильованих білків найбільш широке застосування знайшли активовані
МПЕГиИ, здатні зв'язуватися з вільними аміногрупами білків (сукцинімідилкарбонатні, сукцинімідилсукцинатні, трезилатні, триазинові, гідроксисукцинімідні ефіри, ацетальдегіди та ін.).
З рівня техніки відомі різні кон'югати ПЕГ-ІФН.
Відомий кон'югат ПЕГ-ІФН-ага з лінійним ПЕГ з молекулярною масою 1-5000 Да (патент США Мо 5382657, 1995). Для кон'югації використовували етандіольні похідні МПЕГ, реакцію проводили при рн-т0 при кімнатній температурі протягом 0,5-4 годин. Для проведення реакції ПЕГилювання ІФН використовували Зх кратний надлишок ПЕГ. У використовуваних умовах зв'язування ПЕГ з ІФН відбувалося через стерично доступні вільні аміногрупи різних лізинів (ІГу5-31, І уз133, І уз134, І уз23,
Губз131, Гуз121, Гувз70, І уз83, І уз49 і Гу 112) з утворенням карбамідного зв'язку (МопкКаїгепП еї аї., 1997). Таким чином, отриманий кон'югат ПЕГ-ІФН-о2а складався із суміші позиційних ізомерів, де кожний ізомер містив один ПЕГ. В порівнянні з немодифікованим ІФН питома противірусна активність ізомерів варіювала від 6 95 (для І у5112) до 40 95 (для Гуз133). Сумарна питома активність отриманого кон'югата, що складається з 11 ізомерів, складала 34 95 від немодифікованого ІФН. Активність отриманих кон'югатів іп міго також залежала від молекулярної маси ПЕГ і варіювала від 45 95 (для
ПЕГ - 2500 Да) до 25 95 (у випадку ПЕГ - 10000 Да). Недоліками отриманого кон'югата є: 1. використання етандіол-активованих мПЕГ з низькою молекулярною масою (х:5000 Да), в результаті чого фармакокінетичні параметри отриманого кон'югата ПЕГ-ІФН і немодифікованого ІФН відрізнялися незначно, у зв'язку з чим даний кон'югат не знайшов застосування в клініці; 2. утворення великої кількості позиційних ізомерів з різною питомою активністю, у яких ПЕГ був зв'язаний з молекулою ІФН через вільні аміногрупи різних лізинів.
Відомі кон'югати ПЕГ-ІФН-о2Б, отримані при кон'югації нативного ІФН-а260 з лінійною (патент Росії
Мо 2311930, 2004) або розгалуженою (патент Росії Мео2382048, 2008) похідною мПЕГ з молекулярною масою 13000-17000 Да. Реакцію проводили при рН 9,5 протягом 60 годин (для лінійного МПЕГ) або при рН 7,5 протягом 12 годин (для розгалуженого мПЕГ), використовуючи 50-100 кратний молярний надлишок активованого ПЕГ. В результаті були отримані кон'югати ПЕГ-ІФН, сумарна противірусна активність якого варіювала від 29 до 38 95 від активності немодифікованого ІФН. Дані про стабільність зв'язку, кількість позиційних ізомерів і їх питому противірусну активність не приведено. Недоліками отриманих кон'югатів є: 1. використання трезил-похідних активованого мПЕГ з часом напівжиття у водних розчинах - менше 20 хв. Раніше було показано, що при взаємодії трезилат-похідних ПЕГ з білками, крім стабільних амідних зв'язків через аміногрупи, утворяться також нестабільні сульфаматні зв'язки (саї5 а Вирреїі, 1995); 2. зв'язування трезил-активованих ПЕГ з білками відбувається через усі стерично доступні вільні аміногрупи лізину (Кобегіз еї а!., 2002), що приводить до утворення декількох позиційних ізомерів; 3. проведення реакції ПЕГилювання ІФН при високих значеннях рН (рн-10) протягом тривалого часу (60 годин) може привести до зміни структури ІФН; 4. значний надлишок активованого ПЕГ при проведенні реакції ПЕГилювання ІФН (молярне співвідношення ПЕГ/білок складало 50-100/1) приводить до високої вартості отриманого продукту.
Відомий кон'югат ПЕГ-ІФН-а2Б6, отриманий при зв'язуванні нативного ІФН-а26 з розгалуженою триазиновою похідною мПЕГ з молекулярною масою 7500-35000 Да (патент Росії Мо 2298560, 2004), сумарна противірусна активність якого складала 6,4 95 від активності немодифікованого ІФН. Даних про стабільність зв'язку, кількість позиційних ізомерів і їх питому противірусну активність не приведено.
Недоліками отриманого кон'югата є: 1. використання триазин-хлорид похідних активованого мПЕГ, що крім вільних аміногруп здатні зв'язуватися з функціональними групами інших амінокислот - серину, тирозину, треоніну і гістидину, що приводить до появи ряду ізомерів, частина з яких характеризується нестабільним зв'язком. Більш того, триазинові похідні на даний час не використовуються через їх високу токсичність (Мегопезе 5
Разиї, 2005); 2. низька питома активність кон'югата ПЕГ-ІФН.
Відомий кон'югат ПЕГ-ІФН-с2а, отриманий при кон'югації ІФН-а2а з розгалуженим ПЕГ з молекулярною масою 40 кДа (патент Росії Мо 2180595, 1997). Для кон'югації використовували М- гідроксисукцинімід-ефірну похідну МПЕГ, що вибірково взаємодіє з доступними вільними аміногрупами білка з утворенням стабільного амідного зв'язку. Реакцію проводили при рН 9 при 4 "С протягом 2 годин при співвідношенні мПЕГ/білок рівному трьом. Реакцію зупиняли та очищення отриманого кон'югата проводили на сорбенті Ргасіоде ЕМО СМ 650 (М). Вихід очищеного кон'югата складав 40- 4595. У цьому випадку був отриманий кон'югат ІФН-ПЕГ, що складається з 6 позиційних ізомерів, кожний з який був зв'язаний з однією молекулою ПЕГ стабільним зв'язком через вільні аміногрупи лізинів - Гу531, Губ121, Гуз131, Гуз134, І уз70 і І уз83 (Вайоп еї аї., 2001; Еозег еї аї., 2003). Ізомери,
зв'язані з ПЕГ через лізини в положенні 31, 121, 131 і 134, у сумі складали 94 95. Активність сумарного кон'югата, що складається з 6 позиційних ізомерів, складала 1-7 95 від нативного ІФН-сг2а (Ваїйоп еї аї., 2001; Вошезійп еї аї., 2006). Незважаючи на низьку противірусну активність іп міго, даний кон'югат в порівнянні з немодифікованим ІФН мав поліпшені фармакокінетичні властивості (5іїма еї аї., 2006,
Вошевзіїйп еї аї., 2006), і на даний час використовується в клініці під назвою "Пегасис" (виробництво фірми "Хоффманн-Ля Рош).
Недоліками отриманого кон'югата є: 1. використання М-гідроксисукцинімід-ефір активованого ПЕГ, що зв'язується з усіма стерично доступними аміногрупами, в результаті отриманий кон'югат представляв суміш з 6 ізомерів, що відрізняються питомою активністю. 2. низька противірусна питома активність отриманого кон'югата іп міо.
Прототипом даного винаходу є кон'югат ПЕГ-ІФН-са2р, описаний у патенті США Мо 5951974, 1999).
Для реакції ПЕГилювання використовували лінійний мПЕГ, активований сукцинімідил карбонатною групою (5С-ТРЕС) з молекулярною масою від 5000 до 12000Да. За описаним методом був отриманий кон'югат ІФН із ПЕГ з молекулярною масою 12кДа, що на даний час застосовується в клініці для лікування вірусних гепатитів - препарат "Пегінтрон" (фірма "ЗПпегіпд-Ріосдп", США).
Встановлено, що отриманий кон'югат ПЕГ-ІФН-с26 (препарат "Пегінтрон") складається з 13 позиційних ізомерів, кожний з який містить одну молекулу ПЕГ, приєднану до різних ділянок молекули білка (У/апод еї аї. 2000; Сгасе еї аї., 2001; Моипдвіег єї аї.,, 2002). Було показано, що молекула ПЕГ була зв'язана з інтерфероном не тільки через вільні аміногрупи лізинів (І у531 Гуз 49, І уз83, І уг121,
Гуз131, Гуз133, Губ134 і І уз164) і М- кінцевого цистеїну (Субі), але і через імідазольне кільце гістидину (Ніз7, Ніз34), тирозину (Туї129) ії ОН-групу серину (5ег163). Вміст окремих ізомерів варіював від 0,8 (Тупт29) до 47 95 (Ніх34). Противірусна активність сумарного препарату Пегінтрону, що складається з 13 позиційних ізомерів, складала 2895 від нативного білка. Питома активність окремих ізомерів варіювала від 11 до 37 95 від нативного ІФН-а2Ь (уоипозгег еї аї., 2002). Найбільша питома активність була в основного ізомеру, скон'югованого з ПЕГ через Ніз34, що складала 37 95 від нативного білка.
Вільні аміногрупи ІФН були з'єднані з ПЕГ через стабільний зв'язок, тоді як в основному ізомері, що складає приблизно 4795, ПЕГ був з'єднаний з імідазольним кільцем гістидину (Ніз34) через нестабільний (у водних розчинах) карбаматний зв'язок (Корбегіз еї аї!., 2002).
Фармакокінетичні параметри отриманого кон'югата були краще, ніж у немодифікованого ІФН (5іїма еїа!., 2006).
Недоліками отриманого кон'югата є: 1. використання сукцинімідил карбонат активованого ПЕГ, що зв'язується не тільки з вільними аміногрупами ІФН, але і з функціональними групами інших амінокислот. В результаті отриманий кон'югат складався із суміші 13 позиційних ізомерів, що відрізняються противірусною питомою активністю; 2. утворення нестабільного імідазол-карбонатного (карбаматного) зв'язку в основному (Нівб-34) ізомері кон'югата ПЕГ-ІФН приводить до того, що при потраплянні в організм препарату "Пегінтрон" гідролізується і вивільняється нативний ІФН, що чинить біологічну дію. Таким чином, препарат "Пегінтрон" найкраще розцінювати як про-ліки, які після введення в організм розщеплюються з утворенням активного інтерферону (Розіег, 2004). Через нестабільність ПЕГ-ІФН у розчині, лікарська форма "Пегінтрону" зберігається тільки у вигляді ліофільно-висушеного порошку.
Задача даного винаходу полягала в одержанні нового стабільного кон'югата ПЕГильованого ІФН, з активністю ІФН альфа, що складається з одного позиційного ізомеру, з поліпшеною стабільністю, зі зниженої імуногенністю, з поліпшеними фармакокінетичними параметрами, з оптимальним поєднанням параметрів молекулярної маси ПЕГ і противірусної активності, придатного для створення лікарського препарату медичного призначення, що сприяє розширенню арсеналу лікарських засобів заданої спрямованості, фармацевтичної композиції на основі отриманого ПЕГ-ІФН.
Поставлена задача вирішується створенням нової молекули функціонально активного кон'югата
ПЕГ-ІФН з активністю інтерферон-альфа, у якому лінійна молекула ПЕГ з молекулярною масою від 10 до 40000 Да зв'язана з молекулою ІФН-са стабільним зв'язком строго через альфа аміногрупу М- кінцевого цистеїну так, що загальна формула кон'югата ПЕГ-ІФН із лінійним мПЕГ являє собою наступну сполуку (1):
СН, Я о-сни-снА-ро Я снд-к «НА -ІЕМ (І), п т де: п - цілі значення від 227 до 10000; т - ціле число 24;
ІЕМ - природний або рекомбінантний поліпептид, що має активність ІФН-альфа.
В отриманому кон'югаті лінійний ПЕГ з молекулярною масою 10000-40000Да зв'язаний з альфа аміногрупою М- кінцевої амінокислоти ІФН.
Вибірковість модифікації ІФН строго за альфа-аміногрупою М- кінцевої амінокислоти досягається за рахунок використання альдегід-активованих мПЕГ загальної формули (ІІ) і проведення реакції
ПЕГилювання при рНеб: сн. Я о-сни-сн-о Ясно (І) п т1 нн де: п - цілі значення від 227 до 10000, так що молекулярна маса ПЕГ складає приблизно 10000- 40000 Да; т - ціле число 24.
Оптимальне співвідношення параметрів молекулярної маси ПЕГ і противірусної активності досягається за рахунок використання активованого мПЕГ (Ії) зі значенням тг24.
Зниження імуногенності, токсичності і поліпшення фармакокінетичних параметрів досягається за рахунок збільшення молекулярної маси приєднаного ПЕГ.
Новим в порівнянні з прототипом є: 1. для одержання кон'югата ПЕГ-ІФН використані альдегідні похідні активованих мПЕГ; 2. структурна формула кон'югата ПЕГ-ІФН; 3. отриманий кон'югат ПЕГ-ІФН представлений одним позиційним ізомером; 4. стабільний зв'язок між молекулою ПЕГ і молекулою ІФН; 5. збільшення молекулярної маси кон'югата ПЕГ-ІФН за рахунок розміру приєднаного ПЕГ, 6. поліпшені фармакокінетичні параметри.
Для одержання заявленого кон'югата ПЕГ-ІФН був використаний рекомбінантний ІФН-с20 людини (виробництво ЗАТ "Біокад") і бутир- або пентальалдегідні похідні мПЕГ формули (ІІ) з молекулярною масою 20000 Да.
Реакцію кон'югування проводили при рН нижче 6,0 у присутності агента, що відновлює, при температурі, рівній або нижче 20 "С. Молярне співвідношення ПЕГ/білок складало 2,5-5/1. Контроль утворення кон'югата ПЕГ-ІФН проводили за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ) у присутності додецилсульфату натрію (ДДС) в умовах, що відновлюють, і зворотно-фазної високоефективної хроматографії (З3Ф ВЕРХ). Очищення моноПЕГ-ІФН від продуктів реакції, немодифікованого ІФН і від небажаних форм ПЕГ-ІФН, що містять дві і більше молекул ПЕГ на молекулу білка, проводили за допомогою хроматографії на катіонообмінних сорбентах. Елюцію мОонНОоПЕГ-ІФН проводили градієнтом концентрації хлористого натрію від 0,05 до 0,2 г в буферному розчині з рН нижче 6. Очищений препарат моноПЕГ-ІФН діалізували проти 10-50 мМ буферного розчину з рН 4-5, додавали солі або полісахариди, або багатоатомні спирти, або полівінілпіролідони, або моносахариди, або аміносахари, або білки, або амінокислоти та неіонні детергенти і зберігали в пластикових або скляних флаконах із силіконізованою поверхнею при температурі 4:52 "С.
Для характеристики отриманого кон'югата моноПЕГ-ІФН-о2ор досліджували його чистоту, гомогенність, фізико-хімічні, біологічні ії фармакокінетичні параметри в порівнянні з немодифікованим
ІФН.
Пропонований винахід ілюструється фігурами графічного зображення, де представлені:
Фіг 1. Кінетика утворення кон'югата ІФН-о2р при проведенні реакції з використанням бутиральдегідної похідної МПЕГ.
Фіг. 2. Зворотнофазна ВЕРХ кон'югата ПЕГ-ІФН-о2Б5 на колонці "Зуттеїгу С18" (4,6 х 150 мм).
Фіг. 3. Електрофоретичний аналіз кон'югата ПЕГ-ІФН-о2Б в порівнянні з немодифікованим ІФН-с26.
Фіг. 4. МАГОЇ мас-спектри немодифікованого ІФН-с265 і кон'югата ПЕГ-ІФН-о2б.
Фіг. 5. Локалізація сайту ПЕГилювання в кон'югаті ПЕГ-ІФН-с2Б. Порівняння мас-спектрів триптичних пептидів немодифікованого ІФН-со2б (А) і кон'югата ПЕГ-рчІФН-а2 (У) у діапазоні т/2 1200- 1400.
Фіг. 6. Термостабільність кон'югата ПЕГ-ІФН-О2.
Фіг. 7. Протеолітична стабільність кон'югата ПЕГ-ІФН-а25 при обробці трипсином.
Фіг. 8. Імуногенність кон'югата ПЕГ-ІФН-а2Б в порівнянні з немодифікованим ІФН-а2б.
Фіг. 9. Фармакокінетика кон'югата ПЕГ-ІФН-о25 в порівнянні з немодифікованим ІФН-а26.
Приклади конкретного виконання способу одержання ПЕГ-ІФН-о2оЬ і дослідження його властивостей приведені нижче.
Кон'югати ПЕГ-ІФН-а2 формули (І), що є об'єктом даного винаходу, можуть бути використані для одержання лікарських засобів для профілактики і/або лікування вірусних захворювань, оскільки крім високої стабільності і зниженої імуногенності мають високе значення противірусної активності. Також фармацевтичні композиції, що містять в якості активного інгредієнта ефективну кількість кон'югата формули (І) і отримані відомими методами, що застосовують у фармацевтиці, можуть використовуватися як окремо, так і разом з іншими терапевтичними засобами (наприклад, рибавірин) для профілактики і/або лікування вірусних захворювань (хронічний активний гепатит (зокрема,
гепатити В і С) (дау єї аї.,, 2006; МеНиїспізоп еї аї!., 2009). Об'єктом даного винаходу також є спосіб профілактики і/або лікування вірусних захворювань, наприклад, гепатиту С і гепатиту В, що включає введення терапевтично ефективної кількості заявленого кон'югата формули (1).
З рівня техніки відомо також використання ІФН-є і ПЕГильованих інтерферонів-а в якості імуномодуляторів для лікування онкологічних захворювань, зокрема, волосатоклітинного лейкозу, папіломатозу гортані, меланоми, ниркової карциноми, мієлолейкозів, саркоми Капоши (Оесаїгі5 еї аї., 2002; ВикомувкКі єї аї!., 2002; Оіпіаз-Сагдата єї аї., 2006; І одцаї еї а!., 2008; КаєнНіег єї аї., 2010). На підставі відомого з рівня техніки етіопатогенеза даних захворювань і застосування ІФН-а, а також з кон'югатів для їх профілактики і/або лікування, об'єктами даного винаходу є також лікарські засоби і фармацевтичні композиції, що містять заявлений кон'югат ПЕГ-ІФН-Яй в ефективній кількості, що мають антипроліферативну і імуномодулюючу дію, що можуть застосовуватися для профілактики і/або лікування онкологічних захворювань і захворювань, що супроводжуються первинними або вторинними імунодефіцитними станами, а також об'єктом даного винаходу є спосіб профілактики і/або лікування онкологічних захворювань і захворювань, що супроводжуються первинними або вторинними імунодефіцитними станами, що включає введення терапевтично ефективної кількості кон'югата ПЕГ-
ІФН-а формули (1).
Кон'югат формули (І) з необов'язковим фармакологічно прийнятним наповнювачем, розріджувачем іМабо фармацевтично прийнятними допоміжними речовинами вводять внутрішньовенно, підшкірно, внутрішньом'язово або яким-небудь іншим придатним способом, наприклад, у вигляді капсул, сиропу, спрея, краплин, ін'єкції або супозиторія. Шлях введення змінюють в залежності, наприклад, від симптомів і віку, частоту введення та інтервал між введеннями змінюють в залежності від захворювання і його тяжкості або від мети (терапевтичне або профілактичне використання), ефективна кількість активного початку ПЕГ-ІФН-й вибирається з урахуванням вищевикладених факторів.
У якості фармацевтично прийнятних допоміжних компонентів, що можуть входити у фармацевтичну композицію з ПЕГ-ІФН-а2, можна використати: буферні солі (наприклад, ацетатний, цитратний, водень-карбонатний, фосфатний буфери), стабілізатори (наприклад, полісорбати, ЕДТА, полівінілпіролідони, декстрани, ЧСА, ефіри параоксибензойної кислоти, спирти (наприклад, бензиловий спирт), феноли, сорбінова кислота), компонент, що знезаражує (наприклад, бензиловий спирт), регулятор осмотичного тиску (наприклад, хлорид натрію, хлорид калію, поліоли, наприклад, гліцерин, арабітол, сорбітол, »манітол, лактоза, декстран), сурфактанти (наприклад, ЧСА, полівінілпіролідон, лецитин, Твін 80, поліоксіетилен-поліоксипропілен сополімер, казеїн), поверхнево- активні речовини (наприклад, блок-сополімери етиленоксиду і пропіленоксиду, пропіленоксиду і етиленоксиду, сорбітанмонолаурат, складний ефір сорбіту, складний ефір жирної кислоти полігліцирину, кокамід ОЕА лаурилсульфат, алканоламід, стеарит поліоксіетиленпропіленгліколю, лауриновий ефір поліоксіетилену, цетиловий ефір поліоксіетилену, полісорбат, моностеарат гліцерину, дистеарат гліцерину, монопальмітат сорбіту, сорбітанмоноолеат поліоксіетилену, сорбітанмонолаурат поліоксіетилену і моностеарат пропіленгліколю), антиоксиданти (наприклад,
Трилон Б, І-цистеїн, сульфіт натрію, аскорбат натрію, глутатіон, 2-меркаптоетанол, дитіотриїтол, цистеїнгідрохлорид моногідрат, аскорбінова кислота) і розріджувачі (наприклад, вода).
Приклад 1
Одержання кон'югата ПЕГ-ІФН-а2Ь з використанням бутиральдегідної похідної МПЕГ
До 785 мл буферного розчину (100 мМ натрій-ацетату, 150 мМ натрію хлористого, рН 5,0), що містить рекомбінантний ІФН-а2 в концентрації 1,7 мг/мл, додавали 16 мл 1М розчину ціаноборгідриду натрію, перемішували і додавали 5 г сухої бутиральдегідної похідної ПЕГ з молекулярною масою 20000 дальтон. Суміш ретельно перемішували і інкубували протягом 22 годин при температурі 1753 "С. Через різні проміжки часу з реакційної суміші відбирали аліквоти по 50 мкл і аналізували кінетику утворення кон'югата ПЕГ-ІФН-а2 за допомогою методу електрофорезу в ПААГ у присутності
ДДС. Для цього до відібраної проби додавали 1/3 об'єму буфера, що містить 125 мМ Трис-НСЇ, рН 6,8, 95 гліцерин, З 96 ДДС, 0,005 95 бромфеноловий синій, і нагрівали З хв. на киплячій водяній бані.
Проби в об'ємі 5 мкл вносили в лунки підготовлених пластин ПААГ і проводили електрофорез у 12,5 95
ПААГ у присутності ДДС. По закінченні електрофорезу гель офарблювали за допомогою Кумасі К-250.
Кінетика утворення кон'югата ПЕГ-ІФН-о2 представлена на фіг. 1. У момент часу, коли вміст ПЕГ-ІФН складав більше 70 95, реакційну суміш розводили в 10 разів 5 мМ натрій-ацетатним буфером, рН 5,0.
Приклад 2
Одержання кон'югата ПЕГ-ІФН-а265 з використанням пентальальдегідної похідної МПЕГ
До 100 мл буферного розчину (100 мМ натрій-ацетату, 150 мМ натрію хлористого, рН 5,5), що містить рекомбінантний ІФН-4250 в концентрації 2,2 мг/мл, додавали 2,05 мл 1 М розчину ціаноборгідриду натрію, перемішували і додавали 0,9 г сухої пентальдегідної похідної ПЕГ з молекулярною масою 20000 дальтон. Суміш ретельно перемішували і інкубували протягом 24 годин при температурі 622 "С. Через різні проміжки часу з реакційної суміші відбирали аліквоти по 50 мкл і аналізували кінетику утворення кон'югата ПЕГ-ІФН за допомогою методу електрофорезу в ПААГ, як описано в прикладі 1. У момент часу, коли вміст ПЕГ-ІФН складав більше 70 95, реакційну суміш розводили в 10 разів 5 мМ натрій-ацетатним буфером, рН 5,0.
Приклад З
Очищення кон'югатамоноПЕГ-ІФН-Я25 за допомогою іонообмінної хроматографії на катіонообмінному сорбенті
Розведений розчин, отриманий у прикладі 1, наносили на колонку з катіонообмінним сорбентом (СМ-сефароза, 300 мл), врівноваженим 5 мМ натрій-ацетатним буфером, рН 5,0, (буфер А) зі швидкістю 5 мл/хв. Колонку із сорбентом промивали послідовно буфером А і буфером А, що містить градієнт концентрації Масі від 0,05 до 0,2 М. З кожної фракції відбирали аліквоти для аналізу проб методом електрофорезу в ПААГ, як описано в прикладі 1. Фракції, що містять моноПЕГильований кон'югат ПЕГ-ІФН-а2, поєднували, діалізували проти 10 об'ємів 20 мМ натрій-ацетатного буфера, що містить 150 мМ натрію хлористого, проводили стерильну фільтрацію і зберігали при температурі 42 26.
Приклад 4
Очищення кон'югатамоноПЕГ-ІФН-Я25 за допомогою іонообмінної хроматографії на катіонообмінному сорбенті
Розведений розчин, отриманий у прикладі 2, наносили на колонку з катіонообмінним сорбентом (5Р-сефароза, 50 мл), врівноваженим 5 мМ натрій-ацетатним буфером, рН 5,0, (буфер А) зі швидкістю мл/хв. Колонку із сорбентом промивали послідовно буфером "А" і буфером А, що містить градієнт концентрації Масі від 0,03 до 0,3 М. З кожної фракції відбирали аліквоти для аналізу проб методом електрофорезу в ПААГ, як описано в прикладі 1. Фракції, що містять моноПЕГильований кон'югат
ПЕГ-ІФН-а2, поєднували, діалізували проти 10 об'ємів 20 мМ натрій-ацетатного буфера, що містить 150 мм натрію хлористого, проводили стерильну фільтрацію і зберігали при температурі 4ж2 "б.
Приклад 5
Аналіз кон'югата ПЕГ-ІФН-а26 за допомогою методу зворотно-фазної високоефективної рідинної хроматографії
Кон'югат ПЕГ-ІФН-о2, отриманий за п. 3, розводили 20 мМ натрій-ацетатним буфером, рН 5,0, до концентрації 0,1 мг/мл ії 100 мкл отриманої проби вносили на колонку Зуттеїгу С18 (4,6 х 150 мм).
Дослідження проводили на хроматографі "Вгееле" фірми МУМаїег при 214 нм. З результатів, представлених на фіг. 2, випливає, що за даними ЗФ ВЕРХ чистота заявленого кон'югата ПЕГ-ІФН-а2 складає більше 99 95.
Приклад 6
Визначення рівня ендотоксинів
Вміст бактеріальних ендотоксинів (БЕ) у пробах кон'югата ПЕГ-ІФН-а2, приготовлених зап. Зіп. 4, визначали іп міго за допомогою ЛАЛ-теста (модифікація гель-тромб тест) відповідно до вимог ЗФС 42- 0002-00. У роботі використовували діагностичний багатокомпонентний набір фірми Авзосіа(е5 ої САРЕ
СОЮ, Іпс. ЛАЛ-реактив РУКОТЕЇ ІФ с чутливістю 0,03 ЕЕ/мл, контрольний стандарт ендотоксину (КСЕ, 0,5 мкг у флаконі), воду для ЛАЛ-теста. З результатів, представлених у табл. 1, видно, що вміст
БЕ в пробах кон'югата складає менше 1,5 одиниць ендотоксину (ОЕ) на мг білка, що набагато нижче рівня БЕ, припустимого для медичних препаратів на основі рекомбінантних білків.
Таблиця 1
Вміст бактеріальних ендотоксинів у кон'югаті ПЕГ-ІФН-а2
Приклад 7
Електрофоретичний аналіз кон'югата ПЕГ-ІФН-са2Б в порівнянні з немодифікованим ІФН-саБ
Пробу кон'югата ПЕГ-ІФН, отриману за п. 3, аналізували методом електрофорезу в ПААГ, як описано в п. 1. Електрофорез проводили з навантаженням на лунку 40 мкг білка в умовах, що не редукують. Фарбування білків у гелі проводили барвником Кумасі К-250. Одночасно проводили електрофорез немодифікованого ІФН-а2. Кон'югат ПЕГ-ІФН був представлений однією смугою (фіг. З, трек 1). З електрофореграм кон'югата ПЕГ-ІФН-о2 і немодифікованого ІФН-а2, представлених на фії 3, видно, що кон'югат ПЕГ-ІФН-са має більш високу молекулярну масу, ніж рчІФН-а (фіг. З, треки 1 і 2).
Слід зазначити, що методом ЕФ точне значення молекулярної маси для ПЕГильованих білків визначити не можна, тому що приєднання гідрофільної молекули ПЕГ до білка значно збільшує радіус
Стокса комплексу, що утворився. В результаті просування комплексу ПЕГ-білок у гелі сповільнюється, і значення його молекулярної маси виявляється значно вище, ніж сума молекулярних мас білка і ПЕГ.
Приклад 8
Визначення молекулярної маси кон'югата ПЕГ-ІФН-о2 в порівнянні з немодифікованим ІФН-с2 методом мас-спектрометри 1 мкл проби кон'югата ПЕГ-ІФН, отриманої за п. 3, і 0,3 мкл розчину 2,5-дигідроксибензойної кислоти (Аїагісй, 10 мг х мл" у 20 95 ацетонітрилі у воді з 0,595 ТФО) змішували і висушували на повітрі. Аналогічним способом готували пробу немодифованого ІФН-а2.
Мас-спектри були отримані на МАГ ОіІ-час-пролітному мас-спектрометрі ОКгайех І! ВКОКЕК (Німеччина), оснащеному УФ лазером (Ма). Мас-спектри отримані в режимі позитивних іонів, у лінійному режимі, погрішність виміру середньої маси не перевищує 10-15 Да.
Результати з мас-спектрометричного аналізу немодифікованого рчІФН-о2 і кон'югата ПЕГ-ІФН-о2 у діапазоні т/7 від 10000-50000 приведені на фіг. 4. З фіг. 4А видно, що мас-спектр рчІФН-о2 містить основний пік, що відповідає однозарядному іону (МІ" з молекулярною масою 19295 Да.
У мас-спектрі кон'югата ПЕГ-ІФН-о2, приведеному на фіг. З В, представлений розмитий основний пік, що відповідає однозарядному іону МІ" з молекулярною масою 40498 Да. Розмитість піка пов'язана з гетерогенністю препаратів монометоксиПЕГ. Для кон'югата ПЕГ-ІФН виміряне значення т/: у максимумі піка (40498 Да) збігається з розрахунковими даними по сумі молекулярних мас ІФН-о2 (19295 Да) і приєднаного ПЕГ (20000 Да).
Приклад 9 Локалізація сайту ПЕГилювання в кон'югатіпЕ Г-ІФН-о2Ь
До 5 мкл проби кон'югата ПЕГ-ІФН, отриманої за п. 3, додавали 5 мкл розчину модифікованого трипсину (Рготеда) у 0,05 М МНАНСО:» з концентрацією 15 мкг х мл". Гідроліз проводили протягом 16 годин при 37 "С, потім до розчину додавали 10 мкл 0,5 95 ТФО в 10 95 розчині ацетонітрилу у воді і ретельно перемішували. Аналогічним способом готували пробу немодифованого ІФН. Отримані розчини використовували для одержання МАГ ОІ-мас-спектрів.
Локалізацію сайту зв'язування ПЕГ з молекулою ІФН визначали шляхом порівняння мас-спектрів триптичного гідролізату кон'югата ПЕГ-ІФН-о2 і немодифікованого рчіІФН-а2. У триптичному гідролізаті кон'югата ПЕГ-ІФН-а2 повинний бути відсутнім пептид, що відповідає ділянці білка, по якому відбулася модифікація. У табл. 2 представлені мас-спектри експериментальних триптичних пептидів для немодифікованого ІФН-Яй і кон'югата ПЕГ-ІФН-42. З таблиці видно, що мас-спектри триптичних пептидів немодифікованого ІФН-425 практично збігаються з мас-спектрами триптичних пептидів кон'югата ПЕГ-ІФН-а2 (табл. 2), але в триптичному переварі кон'югата ПЕГ-ІФН-а2 відсутній пептид з молекулярною масою 1313,649, що є присутнім у триптичному переварі немодифікованого рчІФН-а2 (див. також фіг. 5). Відповідно до аналізу теоретичних мас триптичного гідролізату ІФН-а2 пік з т/7 1313,649 відповідає М- кінцевому пептиду білка (табл. 2). Його відсутність у триптичному переварі кон'югата ПЕГ-ІФН-о2 свідчить про модифікацію М- кінцевого пептиду, що, ставши важче на масу ПЕГ, перебуває за межами досліджуваної області спектра. Зв'язування ПЕГ з молекулою ІФН відбулося по єдиній вільній аміногрупі, що присутня у цьому пептиді - по аміногрупі М- кінцевого цистеїну.
Таблиця 2
Експериментальні мас-спектри триптичних пептидів кон'югата ПЕГ-ІФН-а2 і немодифікованого
ІФН-а2 в порівнянні з теоретичними значеннями
Експериментально виявлені пептиди г. 131349 | -:Б - 1/ 1313,6266 | 1-12 |СОІРОТНІОВЗАЇ Г-З:З
Приклад 10 Визначення специфічної противірусної активності кон'югата ПЕГ-ІФН-с2р
У пробах, отриманих за п. З і за п. 4, досліджували противірусну специфічну активність відповідно до протоколу, описаного в Європейській фармакопеї з використанням культури клітин, що перевиваються, МВОК, чутливих до інтерферону альфатипу і вірусу везикулярного стоматиту (М5М). У табл. З представлені результати дослідження противірусної активності. Як стандарт був використаний міжнародний референс стандарт. З табл. З видно, що, незважаючи на приєднання молекули ПЕГ з молекулярною масою 20000 Да, противірусна активність отриманих кон'югатів складає 42-45 905 від активності немодифікованого ІФН-а2. Слід зазначити, що кон'югат ПЕГ-ІФН, описаний у способі- прототипі, що містить ПЕГ з молекулярною масою 12000 Да, мав більш низьку активність (28-30 9).
Таблиця З
Питома противірусна активність кон'югата ПЕГ-ІФН-о2 в порівнянні з немодифікованим ІФН-а2 до від активності немодифікованого мою Р роя
Приклад 11 Дослідження термостабільності кон'югата ПЕГ-ІФН-а25 мл проби кон'югата ПЕГ-ІФН, отриманого за п. 3, поміщали у водяну баню при температурі (50:-2)7С і через різні інтервали часу досліджували появу мутності в розчині білка, вимірюючи оптичну густину при 340 нм. Аналогічно проводили дослідження термостабільності немодифікованого ІФН-а2.
Утворення нерозчинних агрегатів білка приводило до появи мутності і до збільшення оптичної густини при 340 нм. На фіг. 6 представлені результати дослідження. За період спостереження (28 годин) кон'югат ПЕГ-ІФН-а42 залишався стабільним, тоді як немодифікований ІФН-а25 через 28 годин практично весь випав в осад.
Таким чином, отримані дані дозволяють зробити висновок про значне збільшення термостабільності кон'югата ПЕГ-ІФН-а2 в порівнянні з немодифікованим білком.
Приклад 12
Дослідження протеолітичної стабільності кон'югата ПЕГ-ІФН-о260 при обробці трипсином
До 1 мл кон'югата ПЕГ-ІФН, отриманого за п. 3, додавали 150 мкл М трис-НСІ буфера, рН 8,5, 2 мкл 0,5 М розчину Сас» і 15 мкл трипсину (Рготеда) з концентрацією 20 мкг/мл. Проби інкубували при 37 "С. Через певні проміжки часу відбирали аліквоти в 100 мкл і додавали 150 мкл 0,5 95 розчину трифтороцтової кислоти для зупинки реакції. Аналогічно готували проби, що містять немодифікований
ІФН-а2. Далі проби аналізували за допомогою зворотно-фазової ВЕРХ і визначали площу основного піка. Результати дослідження, приведені на фіг. 7, показують, що при обробці трипсином протеолітична стабільність кон'югата ПЕГ-ІФН-а2 вище, ніж у немодифікованого ІФН-а26.
Приклад 13 Визначення стабільності кон'югата ПЕГ-ІФН-а265 при зберіганні
З проби, отриманої за п. 3, відбирали аліквоти в стерильні пробірки з кришками, типу "Еппендорф".
Концентрація білка в кон'югаті ПЕГ-ІФН-42 складала 1 мг/мл. Проби поміщали в холодильник при температурі (б-2)"С. Через певні проміжки часу відбирали проби та аналізували специфічну противірусну активність і гомогенність препарату за допомогою ЗФ ВЕРХ і електрофорезу (ЕФ) у ПААГ у присутності ДДС в умовах, що не редукують, як описано в п. 1.3 даних табл. 4 видно, що при зберіганні при температурі (6:22)"С кон'югат ПЕГ-ІФН-а2 стабільний протягом, щонайменш, 24 місяців.
Таблиця 4
Стабільність кон'югата ПЕГ-ІФН-о26 при температурі (622370 мети Го 13 1 6 1 9 1 12 1 18 | 24
Гомогенність, 90
Си зав зле |за сао сое | ол зол
Гомогенність, 9о
Приклад 14 Дослідження імуногенності кон'югата ПЕГ-ІФН-а2Б
Кон'югати ПЕГ-ІФН, отримані за п. З і за п. 4, розводили до концентрації 5 млн. МО/мл і вводили по 200 мкл (1 млн. МО/миша) внутрішньом'язово мишам ІСК з масою тіла 20-22 г 1 раз на тиждень, протягом 5 тижнів (5 груп по 5 мишей у групі). Паралельно готували пробу немодифікованого ІФнН і вводили аналогічним образом мишам також у дозі 1 млн. Наприкінці п'ятого тижня у тварин відбирали кров за допомогою ретроорбітальної пункції. Сироватку крові отримували стандартним методом. Титр антитіл у сироватках, отриманих в результаті імунізації мишей немодифікованим ІФН і кон'югатами
ПЕГ-ІФН, визначали за допомогою прямого твердофазного імуноферментного методу (ІФА). Для цього в лунки мікропланшета вносили по 100 мкл розчину немодифікованого ІФН-42 у концентрації 200 нг/100 мкл. Антисироватки, отримані від різних груп тварин, вносили в лунки планшета в серії з послідовних розведень у два рази. Для детекції імунного комплексу, що утворився, використовували антимишачі імуноглобуліни, скон'юговані з пероксидазою. Титр антисироватки після введення немодифікованого ІФН складав 1/1024. Титр антисироваток після введення кон'югатів ПЕГ-ІФН складав 1/128. Результати дослідження представлені на фіг. 8.
Таким чином, з отриманих результатів випливає, що імуногенність отриманих кон'югатів ПЕГ-ІФН- а2 у 8 разів нижче, ніж у немодифікованого ІФН.
Приклад 15 Дослідження фармакокінетики кон'югата ПЕГ-ІФН-а2р
Пробу ккон'югата ПЕГ-ІФН, отриманого за прикладом 3, у дозі 1 млн. МО вводили внутрішньочеревно мишам-самцям. Паралельно іншій групі мишей вводили немодифікований ІФН-а2.
Через певні проміжки часу у тварин відбирали кров за допомогою ретроорбітальної пункції. Сироватку крові одержували стандартним методом. Наявність інтерферону в сироватці визначали за противірусною активністю. Результати фармакокінетики представлені на фіг. 9. З результатів випливає, що заявлений кон'югат ПЕГ-ІФН-42 має значний пролонгований ефект. При введенні нативного ІФН-а2 його вміст у крові тварин досягав максимуму через 1 годину після введення, а потім дуже швидко знижувався. При введенні кон'югата ПЕГ-ІФН, максимальний вміст ІФН у крові тварин спостерігався через 12 годин (фіг. 9), і цей рівень зберігався протягом 50 годин, і тільки потім відбувалося повільне зниження вмісту ІФН-а2 протягом 350 годин.
Площа під кривою (АОС) для заявленого кон'югата ПЕГ-ІФН більш ніж у 50 разів перевищувала відповідне значення для немодифікованого ІФН. Потрібно відзначити, що для описаного в способі- прототипі кон'югата ПЕГ-ІФН-а2р, зв'язаного з ПЕГ з молекулярною масою 12000 Да, величина АОС перевищувала величину АОС для ІФН усього в 3-10 разів.
Виходячи з отриманих результатів (фіг. 9), були розраховані основні фармакокінетичні параметри для заявленого кон'югата ПЕГ-ІФН-о2. Результати показали, що всмоктування з місця введення, об'єм розподілу, кліренс кон'югата ПЕГ-ІФН значно уповільнені в порівнянні з немодифікованим ІФН, що і забезпечило тривалу циркуляцію заявленого кон'югата ПЕГ-ІФН у крові (більше 14 днів).
Приклад 16
Порівняльна характеристика заявленого кон'югата ПЕГ-ІФН-с2Б в порівнянні з кон'югатом ПЕГ-
ІФН-а2Б0, що описаний в способі-прототипі
Проведено порівняння структури, основних фізико-хімічних та фармакокінетичних параметрів заявленого кон'югата ПЕГ-ІФН-а25 в порівнянні з кон'югатом ПЕГ-ІФН-са2р, що описаний в способі- прототипі (табл. 5). Дані, що представлені в табл. 5, свідчать про значне покращення властивостей заявленого кон'югата ПЕГ-ІФН в порівнянні з кон'югатом зі способу-прототипу.
Таблиця 5
Основні фізико-хімічні і фармакокінетичні параметри заявленого кон'югата
ПЕГ-ІФН-о2 в порівнянні з кон'югатом ПЕГ-ІФН-а2, що описаний в способі-прототипі (патент США Мо 5951974)
Кон'югат, що описаний в способі-
Заявлений кон'югат ПЕГ-ІФН прототипі (патент США Мо 5951974)
Молекулярна маса
Структурна формула дет тот Інтерферон їе ак Х кон'югата ПЕГ-ІФН"У З альфагр НС о; Інтерферон альфа 2р
Питома активність, 90 ізомерів
Тип зв'язку ПЕГ з стабі Й Нестабільний (для основного біпком табільний ізомеру, зв'язаного з ПЕГ через
Ніз34 розчинах
Відношення АОС ПЕГ- х- Структурна формула кон'югата ПЕГ-ІФН, що отриманий за способом-прототипом, дана за посиланням "МНО Огид Іпгоптайоп", 2001, м. 15, М. 3-4, р. 206.
Приклад 17
Приклади фармацевтичних композицій на основі заявленого кон'югата ПЕГ-ІФН-а2р (А)
ПЕГ-ІФН-а2Б за п. З 10-500 мкг
Натрій-ацетат тригідрат 1-5 мг
Оцтова кислота крижана до рн 5,0
Натрій хлористий 8-9 мг
Полісорбат 80 0,01-0,1 мг
ЕДТА динатрієва сіль 0,01-0,1 мг
Вода для ін'єкцій 1,0 мл (Б)
ПЕГ-ІФН-о2Б за п. 4 10-500 мкг
Натрій-ацетат 0,4-2,0 мг
Оцтова кислота до рН 5,5
Манітол 50 мг
Декстран 15-30 мг
Полісорбат 80 0,01-0,1 мг
ЕДТА динатрієва сіль 0,01-0,1
Вода для ін'єкцій 1,0 мл (В)
ПЕГ-ІФН-о2Б за п. 4 10-500 мкг
Натрій-ацетат 0,4-2,0 мг
Оцтова кислота до рН 5,5
Манітол 50 мг
Альбумін людини 10-12,5 мг
Полісорбат 80 0,01-0,1 мг
ЕДТА динатрієва сіль 0,01-0,1
Вода для ін'єкцій 1,0 мл
Приклад 18 Упакування в контейнер лікарського засобу, що містить ПЕГ-ІФН-а2р
Лікарський засіб, що включає ефективну кількість заявленого ПЕГ-ІФН-а25 (Приклад 17), розливають у стерильних умовах по 0,5, 0,8, 1,0 і 1,2 мл (для дозування 100 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,75 і 0,9 мл (для дозування 200 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,8, 1,0 їі 1,2 мл (для дозування 300 мкг/мл) у шприци з нейтрального скла | гідролітичного класу, з упаяними голками, покритими ковпачками захисними еластичними або твердими, закупорені наконечниками на поршні з бутилкаучуку, ламінованого фторполімером.
Приклад 19 Упакування в контейнер лікарського засобу, що містить ПЕГ-ІФН-с2Ь
Лікарський засіб, що включає ефективну кількість ПЕГ-інтерферону альфа-25 (Приклад 17), розливають у стерильних умовах по 0,5, 0,8, 1,0 і 1,2 мл (для дозування 100 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,75 і
0,9 мл (для дозування 200 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,8, 1,0 і 1,2 мл (для дозування 300 мкг/мл) у флакони з нейтрального скла І гідролітичного класу, закупорені фторгумовими або бутилгумовими пробками з тефлоновим покриттям, обтиснутими алюмінієвими ковпачками.
Приклад 20
Набір, що включає упакований в контейнери лікарський засіб, який містить ПЕГ-ІФН-а25
Набір містить по 1 або 4 шприци в комплекті з поршнем (1 або 4, відповідно) /флакона в контурному комірковому упакуванні з плівки полімерної разом з інструкцією по застосуванню, що поміщають у пачку з картону.
Джерела інформації:
Патент Росії Ме 2311930, 2004; Патент Росії Мо 2382048, 2008; Патент Росії Мо 2298560, 2004;
Патент Росії Мо 2180595, 2005; Патент США Мо 5951974, 1999;
Вайоп Р., Вепйоїа мМУ., (1998), "Роїуєїпуїєпе аїусо!І-сопішдаїєд рпаптасецшісаї! ргоїєїпв", РНагт., Зсі.
Тесппої. Тодау, 1,352-356.
Ваїйоп Р., Раїегопі А., 5спапйег С. А., єї аї., (2001). "Вайопаї девзідп ої а роїепі, Іопд-Іавіїпд Топт ої іпїепйегоп: а 40-КОа Бргапсней роїуєїпуієпе діусоІ-сопішдаїєд іпіепегоп аірнпа-га їопйпе Неаїтепі ої
Пераїййів С". Віосопіца. Спет. /12:195-202.
Веківл, у)., Зсптеівзег, Н., Негпапаеєл, У., Соідтап, М. О., 7о00п К. С., (2004), "Нитап Іпіепегопе
АІрпа, Веїа апа Отеда". СтоулА Расіогв, Мої. 22 (4), рр. 243-251.
Вошезіїп А., Катаг М., Запагез-зацйпе К, єї аї. (2006). "Редуїайоп ої ІРМ-а апа Апіїміга! Асіїмйу", /
Іпіенегоп «СуїоКіпе ВНез. 26:849-853.
ВикКомувкі В., Ег5іоїй М. 5., Сіоге М. Е., Метипаїйїв .). у)., Атаїйо В., Сиріа 5. К., Тепаїег С. І. (2002). "Реауїаїед іпіепегоп аМйа-2Б інєаїтепі ог раїйєпів м/йй 5оїїй Шштоге: а рпазе ІІ зішау", Сііп. Опсої., 2002:20(18):3841-3849.
Саїїсеїї Р., Мегопезе ЕР. М (2003), "РпаптасокКіпеїїс апа бБіодівзійршіоп ргорепіє5 ої роїу(еїпуієпе діусої)-ргоївіп сопійдаїев", Адм. ЮОга. Оеєїїм. Нем.;55(10): 1261-77.
СНагеїші Е., Вовіаїпа І., Стедоіге М., Рауєп У. І., Рциіо! А., Ігореї у., Ноціп Сс., Сапа! Р. А. (1999) "Рпаптасокіпеїїс тоаве! гог аІрна іпіептегоп адтіпівієтед зирбсшапеоивіу". ВГ. у. Сііп. Рпагтасо).; 47: 365- 371.
Спемаїгег 5., РаулоївКу у. М., 2009, "Іпіепегопз апа іНеїг изе іп регвівіепі міга! іптесіопв".
Напар. Ехр. Рпагтасої.; (189):203-41.
Оесайв М., Запіпнапат 5., О'Вуте К (2002). "Роїепіа! ої іпїепегоп-аІрна іп зоїїй штоигв: рай 17",
Віобгодв. 2002;16(4):261-81.
Оеїдадо С., Егапсів 0., Різпег С. Е (1992) "Тне изез апа ргорепіевз ої РЕС-ІпкКеа ргоївїп5", Стії. Неу.
Тег. Огид Саїтіег Бузі, 9 (1992) 249-304.
Еозег 5, Зспаспег А, Ууеуег КА, Вгиддег О, Оіеїе! Е, Мапі 5, ЗспгейтіиПег Т. (2003), "ІбоЇІайоп, втисішга! спагасієгігайоп, апа апіїміга! асіїмпу ої розпйопаї! ізхотег5 ої топоредуїаїей іпіепегоп аІрпа-га (РЕСАБУ5Б)". Ргоївіп Ехрг. Ритії., 30(1):78-87.
Еовієї Са. В. (2004) "Редуїаїєд іпіепегопе: спетісаї апа сіїпіса! аїйегепсев". АІйтепі Рпаптасої. ТНег.; 20: 825-830.
Се Р., Рапд 9. МУ., Вошгієг-Рапів В., єї а. (2000) "Редуїаїєд іпіепегоп-аірнагр: рнаптасокіпеїїсв, рпаптасодупатісв, заїеїу, апа ргеїїтіпагу ейПісасу даїа". Сіп. Рнагтасої. ТНег.; 68: 556-67.
Стасе М., Моипдбієг 5., СіЩШіп (з., єї аі. (2001) "Змисіига! апа Біоіодіс сНагасієгіганоп ої редуїаїєйд гесотбіпапі ІРМ-аІрнагрь". у. Іптепегоп СуюкКіпе Нев., 21: 1103-1115.
Стасе, М. 9., І ее, 5., Вгад5Нам, 5., Спартап, »., єї аї., (2005) "Зйе ої РЕСуїЇайоп апа роїуєїпуїепе діусо! тоїЇесціеє 5і7е айепиаїе іпіепегоп-а апіїмігаІ! апа апііргоїїегайме асіїмціеєв ІШгоцди те ЧАК/5ТАТ відпаїїпу раїймау", у. Віої. Снет., 280 6327 6336.
Ізаасв, А. апа Гіпаептапи, у. (1957), "Мігив іптепПегепсе: пе іпіепегоп", Ргос. В. ос. Меад., 147: 258- 267.
Уау Н. еї аї., (2006) "Редіпіенегоп апа Вірамігіп ог Спгопіс Нераїйів С", Те Мем Епдіапа 4. ої теаїсіпе, том 356, стор. 1269-1271, 2006.
Каєніег К. С., зопаак У. К., Зспадепаоті 0., Наизсніга А. (2010), "Редуїаїей іпіепегопе: ргозресів ог
Те изе іп їйе адіимапі апа раїІайїме ІНегару ої теїавзіаййс теІапота", Єиг. У. Сапсег. 2010,46(1):41-6.
Іат М. Р., Ріїтак 0., Зрегаїаків В., І а А. Н, М/пПєу Т. Е., І аудеп Т. У). (1997), "ЕНесі ої орезйу оп рпаптасокіпеїйсз апа Біоіодіс епесі ої іпіїепПегоп-аїІрна іп Нераїйів С", бід. бів. 5сі.; 42(1): 178-85.
Мапп5 М. Р., МеНиїспізоп У. Сї., Сбогаоп 5. С, еї а. (2001) " Редіпіенегоп аїга-2Ь ріив тірамігп сотрагед мій іпіенегоп ага-2ь рів пірамітп ог іпіна! ігеаїтепі ої спгопіс пераїййів С: а гапдоті ва ігіа!".
І апсеї, 358: 958-65.
Магсеїіїп Р. (2009) "Нераййів В апа пераййів С іп2009", І імег Іпіегпаййопаї!., 29(51): 1-8.
МопкКагзй 5. Р., Ма У., Адііопе А., Вайоп Р., еї а!., (2007), "Розйопа! Ізотег5 ої Мопоредуїаївй
Іпіепегоп со-га: ІзоЇайоп, СНагасієгігайоп, апа Віоіодіса! Асіїмпу", Апа|уііса! Віоспетівігу, 247:434-440.
МеНшисніпзоп у., (зогадоп 5. С., ЗСПІН Е. В. єї а!., (1998), ""піенегоп аїГа-2Ь аіопе ог іп сотбріпайоп м/їй пірамігіп ав іпіна! ігеаїтепі юг спгопіс перайів С" ТМ. Епа). У. Мед. Мої. 339, 21,1485-1492.
МеНиїснізоп .. еї аї., (2009) "Редіпіенегоп АїГа-25 ог АІга-2а м/йп Ківамігіп тог Тгеайтепі ої Нерайіз С
Іптесіоп", Те Мем Епдіапа .). ої тедісіпе, том 361, стор. 580-593, 2009.
Моаі А. А., Папа Т. у. (2008), "Нераїйів С: а сіїпіса! гтеміем", Огаї. Оів.м. 14(1): 10-4.
РезіКа, 5., Кгаизе, С. О., УМакег М. К (2004), "І"птепегопв, іпсегегоп-ІїКе суїоКіпев, апа ІНеїг тесеріогв",
Іттипоіодіса! Неміємв, 202: 8-32.
Резіка, 5. (2007). "ТНе іпіенегопе: 50 уєагв апйег іІНеїг аізсомегу, ІШТеге ів тис тоге Юю Івагп", у. Віої.
Спет., 135;282(28):20047-51.
Резіка, 5. (2007). "Ринітісаноп апа сіопіпа ої іптепегоп аІрна", Ст Тор Містобвіо! Іттипої.; 316:23-37.
Оціпіаз-Сагдата А., Капіагціап Н. М., Сіїез Е., Мегзіомзек 5. (2006), "Редуїаївд іпіепегоп Іегару ог раїйєепів мій РНийЙадеїрніа спготовзоте-педаїїме туеіІоргоїНегаїйме аібзогдегв". Зетіп Тптотр Нетозві., 2006;32(4 РІ 2):409-16.
Ведау К. К., УупднІ Т. Г., РосКгоз Р. 9., З5пйтап М., Емегзоп 0. еї а!., 2001, "Епісасу апа заїеїгу ої редуїаїєа (40-Ка) іптепегоп о-г2а сотрагей ул іпіепегоп со-г2а іп попсіг"поїїс раїїєепібв мій спгопіс пераїййів
С", Нерайіоаду, 33, 433-438.
Вобепз М. у., ВепіЧем М. 0., Наїтіз У. М. (200239" Спетівігу тог реріїде апа ргоївіп РЕСуїЇайоп". Адм
Огиг2 Овіїм ВНем., 54(4):459-76.
Зіма М., Роо у)., ММадпег Р. еї аї. (2006) "А гтапдотівзей Ша! (о сотраге рНаптасокКіпеїс, рпаптасодупатіс, апа апіїміга! еПесів редіпіепйегоп аїга-25 апа редіпіенегоп аїга-га іп раїепів м/п спгопіс пера С (СОМРАКЕ)", Уоитаї Нераїйоіоду, 45: 204-213.
М/апод, У. -5., Моиповівг 5., Ваийвсй 9., 2папд В., МеМетаг С, Муз 0. Р. (2000), "Ідепійісайноп ої Те та)цог розійопаї ізхотег ої редуїаїед іпіепегоп аірна-2р" Віоспетівігу, 2000, 39(35): 10634-10640.
М в В. 9. "Сіїпіса! Рнаптасоіоду ої іпіепПегопв". Сіїп Рнаптасокіп. 1990; 19:390-399.
Уоипдвівї 5., Мапд У. 5., Ссгасе М, Вайзспі .., Вогаєпз В., МУувзз 0. Б. (2002). " Бігисішиге, Біоіоаду, апа
Іегареціїс ітріїсайоп5 ої реадуїаїед іпіенегоп аіїрпа-25" Сит Ріапт Оезв.:8(24):2139-2157. гаїрзКу 5 (1995). "Рипсійопаїїгед роїу(еійпуієпе діусої) їТог ргерагайоп ої бБіоіодісаПу геїємапі сопійдаїев", Віосопі. Снет. 6, 150-165. 7ейгет 5., Неаїйсоїе У. Е., Майіп М., Мієтопи К., Моді М. (2001), "Редіпїіепнегоп ага-га (40 Коба) топоїПпегару: а помеї адепі г спгопіс пераїййі5 С «(Пегару", Ехреп Оріп Іпмевіїд ЮОгидв, 10 (12):2201-2213.
Час ПЕ млювання содина) клан х Е ес щи ко й в зей
Ж сних НН
Кінетика утворення кон'югата ІФН-а2і при проведенні реакції їз застосуванням бутиральдегідної похідної мПпЕГ
Фіг. 1 і ї Я К 4 ї х 7 ЕК дек ї | й - х ВОЮ щ ва . ші ше НІ ве ї ! днини А КМ дя я и ! Ї у. г
Кн ши а | я о «а Ї НН ї- З вл ! щі ща В ; | ся ШЕ кшщ кВ ще ЇЇ жов є і : у ово. 1 аю
ОА ей вдо воб оюдб зап. лу озвля ЗБ звоб до ФМю а
КТ (хва Площа за Млоші о ВасеіУї 5 Ва ї р і й СУК !
ЗиЯ оо 186 ою 2 11367 | ЯМІ | 9957 | 96735 | 530 «фіг. 5. Зворотно-фазова ВЕРХ кон'югата ПЕГ-НОН оо яз колові "бувивену СІ (4бх 150 мм)
Ва о
ШОК я - под
ПЕГАФН що о в - с. в ше 000000 ша ша че 0! ни ши ОО що нн вх
ВК А
. й ИН и М
ОЖММ . 3 СО я
Фіг. 3, Електрофоретичний аналіз ков'ютата ПЕГ-ІФН-яов к порівнянні з немодифікованим ІФІ-аов, Зпектрофорез проводили з умовах, що не рудукують.
Фарбовування пластин ПААГ проволиля барвником Кумассі К-250,
Треки:
Мік - Шики-ствидарти молекулярних мас; трек 1 - в лунку внесено ЧО мкг кон'ютата НЕГАФН-аді; трек 2 - в лунку внесено 40 мкг немодифікованого ФН-агів.
т спе нини о пил п в і ві пі пи п пп в й і. !
Ж 7 Нативний т : 1 вва : їх КЕ ї : хі Н і ;
Я і :
І : 3 Я : ї : як Ей
В й Е
ШУ в г
С шШьК Я Е
ЖЕ В У ; я. і і ї г НЕРАВН х Ї
Ж ще 3 Я
З хх ї і. щ 8 ЩЕ
ВК Є 5 З
ТЕ В ї :
Е Бах ОеЙ е ї її ! ї о вена они Ши і: ре пулу дну ек ооо в вис днк и ни в З вн ки нн оон ТІТКА тки -
У ще я а ж як що ще о.
ЩЕ
Янг; Я, МАТОМ мас-снектри вемодифікованого НОН-В Її ков ютата ПЕСАФИ В
А) -немолицнковцнни вененНяХВ (83 -кон'югає ПЕГ- БНО,
!
Ей Е; А
ЩО а в 5 М й «Е Во- Й ее 5
Й я г ад я
З в що в | : й :
З | | т
М. т ! ; І . й ї
І Й нн чи н ши й
З їй що х Б г
Фон й й
ТЕ ї - «е .
Е.. І :
Гн і я а. о 5 юю | І- : і є : а Гой й 2. ч | х : т В : - у ї. і Й; Н ! ' ! о: 29 ЯБО01580 1661 130 136001980
ПиЯ
Фіг. 5. Локалізація сайту ПЕГилювання: в ков'югаті ПЕТ Н-о20. Порівняння мас- ецпектрів триптичних пептидів немонифікованого ФН-азЬ (А і кон'югата ПЕГУрчЧІЮН- 26 ЄВ) в дизхвалові пх 1200-1900 реквВНе та ра ад , и 5 і ва в
З хо ПА: : З ван пр фноеть ії о 5 ЕТ. т 20 25 30
Че інкубиції (годнне «Віки. Доспідженві термастабічьності кон 'юваха ПЕ ФВ пра темперітурі (03 ИЄ зло. - о. ее ак ов - шина о ПЕС ес»
ВМО шо Ше щ в 704 Я
Е Сени, ТФІТчХЛЬ "м ше жк ж ШТ ще РМ, С З З
Час (сода
Фіг. 7, Дослідження протеолітичної скабільності кон'ютата ПЕГАФНАООВ при обробці трипенномМ
Зелена лінія « конлогат ПЕР-АФНЯЮЬ;
Червова лінія « немодифікований ФЕН егВ тав 1. ад ПЕРЧФеНоЬ
Шу з "ж я. у Дис 8020000 МО млуголама
З 04 ск 5 о ТФІнсЬ ви
КЗ Ти й АС БОЮ Цю Ма роди сн, ці
Є : Їх вах -ї ; Ку й 0) 5О 100 150 200 250 Д300 350
Час (години) «іт, 8 Фармакокінетика ксн'ютата ПЕР-ФН-аОЬ ово порівнянні З немодифікованим ФЕВ

Claims (25)

1. Стабільний кон'югат ПЕГильованого інтерферону-й формули (І), що являє собою один позиційний ізомер СНУ ї- сн.-сн.-о Я свд-к х НА-ІЕМ І й Ф. де: п - цілі значення від 227 до 10000; т - ціле число 2 4; М'Н-їеМ. інтерферон-а.
2. Кон'югат за п. 1, у якому т являє собою ціле число рівне 4.
3. Кон'югат за п. І, у якому інтерферон-й являє собою природний або рекомбінантний інтерферон-а-2Ь.
4. Кон'югат за п. 1, у якому середня молекулярна маса поліетиленгліколю складає від 10 до 4А4ОкДа.
5. Кон'югат за п. 1, у якому М-кінцева група представлена залишком цистеїну (Суб).
б. Фармацевтична композиція, що має противірусну, антипроліферативну 1 імуномодулюючу активність, що містить кон'югат загальної формули (І) в ефективній кількості і фармацевтично прийнятні допоміжні компоненти.
7. Фармацевтична композиція за п. б для застосування як лікарського засобу для лікування вірусних і онкологічних захворювань і захворювань, що супроводжуються первинними або вторинними імунодефіцитними станами.
8. Фармацевтична композиція за п. 7, де вірусне захворювання являє собою гепатит С або гепатит В.
9. Фармацевтична композиція за п. 7, де онкологічне захворювання являє собою мієлолейкоз.
10. Фармацевтична композиція за п. 7, де онкологічне захворювання являє собою меланому.
11. Лікарський засіб, що включає конюгат формули (1) що має противірусну, антипроліферативну і імуномодулюючу активність.
12. Лікарський засіб за п. 11, що включає буфер, ізотонуючий агент, стабілізатор 1 воду.
13. Лікарський засіб за п. 12, що включає тригідрат ацетату натрію, оцтову кислоту, натрію хлорид, полісорбат 80, ЕДТА, воду для ін'єкцій.
14. Застосування кон'югата формули (І) для одержання лікарського засобу, що має противірусну, антипроліферативну і імуномодулюючу активність.
15. Застосування за п. 14 для одержання лікарського засобу, що має противірусну активність у відношенні гепатиту С або гепатиту В.
16. Спосіб профілактики і/або лікування вірусних захворювань, при якому вводять терапевтично ефективну кількість кон'югата формули (1).
17. Спосіб за п. 16, де вірусне захворювання являє собою гепатит С або гепатит В.
18. Спосіб за п. 16, при якому додатково вводять терапевтично ефективну кількість рибавірину.
19. Спосіб профілактики 1/або лікування захворювань, що супроводжуються первинними або вторинними імунодефіцитними станами, при якому вводять терапевтично ефективну кількість кон'югата формули (1).
20. Спосіб профілактики і/або лікування онкологічних захворювань, при якому вводять терапевтично ефективну кількість кон'югата формули (1).
21. Спосіб за п. 20, де онкологічне захворювання являє собою мієлолейкоз.
22. Спосіб за п. 20, де онкологічне захворювання являє собою меланому.
23. Контейнер, герметично запаяний у стерильних умовах, що відповідають зберіганню перед застосуванням, який включає фармацевтичну композицію за п. 6.
24. Контейнер за п. 23, де зазначений контейнер являє собою попередньо заповнений шприц, флакон або автоїнжектор.
25. Набір, що включає контейнер за п. 24 1 інструкцію по застосуванню.
Тве іпуепноп геїЇаге5 ю похуе!ї ГппсйопаПу асиуе, Пігу ригіНей, «габіе РЕС-іпгепегоп аїЇрва соп)йраге гергезептейд бу опе розійопаї! ізотег РЕС-МУН міф тедисей іттипорепігу, ргоЇопреай БіоіІорісаї аспоп, ивейи! Гог тедісіпаї иве, ж ітргоуей ррагтасоКіпейс рагатегет», ої репега! Тгтиа: сну ї- сн.-сн.-о Я свд-к хН-- ЕМ п т мкВ)
хуВегеїп: п - іпгерег уаїшев їїгот 227 тю 10000, во ваг тоІесшаг хуеі й ої РЕС атоипів тю ароші 10000-40000 Ба; т - ап ш(ерег 2 4; ІЕМ - пашгаї ог тесотбріпапі роЇІурерінде ехвірбціпе ТЕМ -аІрвба аснуу, апа сю іттипорбіоІорісаї арепі разей Фегеоп.
Те іпуепцоп ТгШег геЇаге5 то тедісіпа! арепі5 сотргівіпе Ше соп)йрагсе ої Тогтша (І), ррпагтасешіса! сотровійопе ивейі ог Ше їтеантепі ої хіга! апа опсо1Іорісаї дізеазев, ав ме ав дізеаве5 ассотрапігйа хИиВ ргітагу ог зесопдагу іттиподейсіепсу дізогдете апа сотргівіп» пе РЕО-ІЕМ соп)йрагсе апа «пегарешісаПу ассеріаріє адуиуапв.
UAA201015114A 2010-07-20 2010-12-15 НОВИЙ ФУНКЦІОНАЛЬНО АКТИВНИЙ, ВИСОКООЧИЩЕНИЙ, СТАБІЛЬНИЙ КОН'ЮГАТ ІНТЕРФЕРОНУ АЛЬФА З ПОЛІЕТИЛЕНГЛІКОЛЕМ, ПРЕДСТАВЛЕНИЙ ОДНИМ ПОЗИЦІЙНИМ ІЗОМЕРОМ ПЕГ-NαH-ІФН, ЗІ ЗМЕНШЕНОЮ ІМУНОГЕННІСТЮ, ІЗ ПРОЛОНГОВАНОЮ БІОЛОГІЧНОЮ ДІЄЮ, ПРИДАТНИЙ ДЛЯ МЕДИЧНОГО ЗАСТОСУВАННЯ, І ІМУНОБІОЛОГІЧНИЙ ЗАСІБ НА ЙОГО ОСНОВІ UA99766C2 (uk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010129824/10A RU2447083C1 (ru) 2010-07-20 2010-07-20 НОВЫЙ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫЙ ВЫСОКООЧИЩЕННЫЙ СТАБИЛЬНЫЙ КОНЪЮГАТ ИНТЕРФЕРОНА α С ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ ОДНИМ ПОЗИЦИОННЫМ ИЗОМЕРОМ ПЭГ-NαH-ИФН, С УМЕНЬШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ, С ПРОЛОНГИРОВАННЫМ БИОЛОГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, ПРИГОДНЫЙ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ, И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA99766C2 true UA99766C2 (uk) 2012-09-25

Family

ID=45497062

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201015114A UA99766C2 (uk) 2010-07-20 2010-12-15 НОВИЙ ФУНКЦІОНАЛЬНО АКТИВНИЙ, ВИСОКООЧИЩЕНИЙ, СТАБІЛЬНИЙ КОН'ЮГАТ ІНТЕРФЕРОНУ АЛЬФА З ПОЛІЕТИЛЕНГЛІКОЛЕМ, ПРЕДСТАВЛЕНИЙ ОДНИМ ПОЗИЦІЙНИМ ІЗОМЕРОМ ПЕГ-NαH-ІФН, ЗІ ЗМЕНШЕНОЮ ІМУНОГЕННІСТЮ, ІЗ ПРОЛОНГОВАНОЮ БІОЛОГІЧНОЮ ДІЄЮ, ПРИДАТНИЙ ДЛЯ МЕДИЧНОГО ЗАСТОСУВАННЯ, І ІМУНОБІОЛОГІЧНИЙ ЗАСІБ НА ЙОГО ОСНОВІ

Country Status (20)

Country Link
KR (1) KR101586372B1 (uk)
CN (1) CN102617736B (uk)
AR (1) AR087227A1 (uk)
BR (1) BRPI1101565A2 (uk)
CO (1) CO6680611A2 (uk)
CR (1) CR20130021A (uk)
CU (1) CU24193B1 (uk)
DO (1) DOP2013000002A (uk)
EA (1) EA020257B1 (uk)
EC (1) ECSP13012398A (uk)
MX (1) MX2011007458A (uk)
MY (1) MY168784A (uk)
NI (1) NI201300008A (uk)
PE (1) PE20131034A1 (uk)
PH (1) PH12012502425A1 (uk)
RU (1) RU2447083C1 (uk)
SG (1) SG187117A1 (uk)
UA (1) UA99766C2 (uk)
UY (1) UY33525A (uk)
WO (1) WO2012011836A1 (uk)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2515913C1 (ru) * 2013-03-22 2014-05-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОЛОНГИРОВАННЫМ ДЕЙСТВИЕМ, НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2 ЧЕЛОВЕКА (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ШТАММ Saccharomyces cerevisiae ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ЭТОГО СПОСОБА (ВАРИАНТЫ)
EA021643B1 (ru) * 2013-03-28 2015-07-30 Илья Александрович МАРКОВ Монопегилированный интерферон-альфа линейной структуры и фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа
EA021610B1 (ru) * 2013-03-28 2015-07-30 Илья Александрович МАРКОВ Жидкое противовирусное лекарственное средство
CN103463623B (zh) * 2013-09-03 2015-09-09 长春海伯尔生物技术有限责任公司 一种聚乙二醇干扰素注射液及其制备方法
RU2554761C1 (ru) * 2014-05-13 2015-06-27 Закрытое акционерное общество "Сибирский центр фармакологии и биотехнологии" Противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство
RU2572800C1 (ru) * 2014-09-22 2016-01-20 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Новый состав, содержащий конъюгат пэг и интерферон-альфа-2бета, обладающий сниженной болезненностью при введении
EA029498B1 (ru) * 2015-11-24 2018-04-30 Учреждение Белорусского государственного университета "Научно-исследовательский институт физико-химических проблем" (НИИ ФХП БГУ) ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b В ВИДЕ МИКРОЧАСТИЦ ДЛЯ ПАРЕНТЕРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
RU2678332C1 (ru) 2017-09-08 2019-01-28 Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" (ООО "СФМ") Пегилированный интерферон лямбда, обладающий высокой биодоступностью при пероральном применении, и способ его получения
AU2021258734A1 (en) * 2020-04-20 2023-01-05 Altum Pharmaceuticals Inc. Recombinant interferon
CN114392237B (zh) * 2021-12-28 2024-02-02 上海允英生物医药科技有限公司 一种冻干病毒制剂及其制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US20030053982A1 (en) * 1994-09-26 2003-03-20 Kinstler Olaf B. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
TW426523B (en) * 1995-04-06 2001-03-21 Hoffmann La Roche Interferon solution
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
EA200500475A1 (ru) * 2002-09-09 2005-10-27 Нектар Терапеутикс Ал, Корпорейшн Водорастворимые полимерные алканалы
RU2311930C2 (ru) * 2004-04-30 2007-12-10 Закрытое акционерное общество "ВЕРОФАРМ" Пэгилированный интерферон для борьбы с вирусной инфекцией
EP1771197A2 (en) * 2004-06-30 2007-04-11 Egen Corporation Pegylated interferon alpha-1b
DE602006013151D1 (de) * 2005-07-19 2010-05-06 Nektar Therapeutics Verfahren zur herstellung von polymermaleimiden
WO2007149594A2 (en) * 2006-06-23 2007-12-27 Quintessence Biosciences, Inc. Modified ribonucleases
CN101491682A (zh) * 2008-04-30 2009-07-29 北京凯正生物工程发展有限责任公司 聚乙二醇化重组人干扰素ω偶合物及其制备工艺
CN101591387A (zh) * 2008-05-28 2009-12-02 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 聚乙二醇化重组人干扰素ω偶合物
CN101514229B (zh) * 2009-04-03 2012-05-09 海南四环心脑血管药物研究院有限公司 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物

Also Published As

Publication number Publication date
EA201100809A1 (ru) 2012-01-30
CU24193B1 (es) 2016-09-30
MX2011007458A (es) 2012-01-19
CN102617736A (zh) 2012-08-01
BRPI1101565A2 (pt) 2012-12-04
MY168784A (en) 2018-12-04
RU2447083C1 (ru) 2012-04-10
DOP2013000002A (es) 2013-09-15
CN102617736B (zh) 2015-11-25
CO6680611A2 (es) 2013-05-31
KR20130056885A (ko) 2013-05-30
SG187117A1 (en) 2013-02-28
AR087227A1 (es) 2014-03-12
CU20130013A7 (es) 2013-04-19
ECSP13012398A (es) 2013-05-31
EA020257B1 (ru) 2014-09-30
UY33525A (es) 2012-02-29
KR101586372B1 (ko) 2016-01-18
HK1170504A1 (zh) 2013-03-01
CR20130021A (es) 2013-02-20
RU2010129824A (ru) 2012-01-27
WO2012011836A1 (en) 2012-01-26
PH12012502425A1 (en) 2013-07-08
NI201300008A (es) 2014-05-26
PE20131034A1 (es) 2013-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA99766C2 (uk) НОВИЙ ФУНКЦІОНАЛЬНО АКТИВНИЙ, ВИСОКООЧИЩЕНИЙ, СТАБІЛЬНИЙ КОН'ЮГАТ ІНТЕРФЕРОНУ АЛЬФА З ПОЛІЕТИЛЕНГЛІКОЛЕМ, ПРЕДСТАВЛЕНИЙ ОДНИМ ПОЗИЦІЙНИМ ІЗОМЕРОМ ПЕГ-NαH-ІФН, ЗІ ЗМЕНШЕНОЮ ІМУНОГЕННІСТЮ, ІЗ ПРОЛОНГОВАНОЮ БІОЛОГІЧНОЮ ДІЄЮ, ПРИДАТНИЙ ДЛЯ МЕДИЧНОГО ЗАСТОСУВАННЯ, І ІМУНОБІОЛОГІЧНИЙ ЗАСІБ НА ЙОГО ОСНОВІ
AU656212B2 (en) Asialoglycoprotein-conjugated medicinal agent
US6583267B2 (en) Chemically modified polypeptides
JP2980569B2 (ja) インターフェロン複合体
RU2446173C1 (ru) Новый функционально активный, высокоочищенный стабильный конъюгат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (г-ксф) с полиэтиленгликолем с пролонгированным биологическим действием, пригодный для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе
JP2002540065A (ja) Ｇｃｓｆコンジュゲート
JPH0770195A (ja) 糖修飾インターフェロン
WO2015090162A1 (zh) 一种含有阿达木单抗的药物组合物
JP7801104B2 (ja) ポリエチレングリコール（ｐｅｇ）－インターロイキン１１（ｉｌ－１１）コンジュゲートを生成するための反応中間体、および、ｐｅｇ－ｉｌ－１１コンジュゲートを精製する方法
US8597634B2 (en) Interferon alpha-2a modified by polyethylene glycol and methods of preparation thereof
CN103228792A (zh) PEG-干扰素λ1结合物
Jo et al. Long-acting interferon-α 2a modified with a trimer-structured polyethylene glycol: Preparation, in vitro bioactivity, in vivo stability and pharmacokinetics
BRPI0622128A2 (pt) conjugado de polietileno glicol-g-csf
EA006368B1 (ru) Химически модифицированные конъюгаты прогенипоэтина
RU2576372C2 (ru) МОЛЕКУЛА ИНТЕРФЕРОНА-β-1а ЧЕЛОВЕКА, МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВОВИРУСНОЙ, ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ И АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТЯМИ, С ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ, УМЕНЬШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ, УЛУЧШЕННЫМИ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИМИ И ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКИМИ ПАРАМЕТРАМИ, ПРИГОДНАЯ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕЕ ОСНОВЕ
CN103694335A (zh) 一种具有长连接桥的聚乙二醇化ω-干扰素及其制备工艺
EA022617B1 (ru) Монопегилированный интерферон-альфа разветвленной структуры и фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа