JP2002540065A

JP2002540065A - Ｇｃｓｆコンジュゲート

Info

Publication number: JP2002540065A
Application number: JP2000596041A
Authority: JP
Inventors: パスカルセバスチャンベイロン，
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2002-11-26
Also published as: HU228488B1; RS50928B; US20080287659A1; US20070219356A1; ZA200105932B; BG105851A; US20030130193A1; ES2204509T3; HUP0203652A3; CZ300546B6; DK1157037T3; EA200400067A1; MXPA01007609A; NZ513113A; AU2618500A; KR100689212B1; NO331787B1; EA200100838A1; BR0007781A; EP1157037B1

Abstract

(57)【要約】以下の化学式(I)、すなわち、【化９】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)は、好中性顆粒球の増殖、分化および機能活性
化を調節する製薬学的に活性なタンパク質である(Metcalf, Blood 67:257(1986)
; Yan et al., Blood 84(3): 795-799(1994); Bensinger et al., Blood 81(11)
: 3158-3163(1993); Roberts et al., Expt'l Hematology 22: 1156-1163(1994)
; Neben et al., Blood 81(7): 1960-1967(1993))。 GCSFは、骨髄から幹細胞
および前駆細胞を可動化させることができ、化学療法によって顆粒球が枯渇して
いる患者を治療するために、または骨髄移植の準備措置として使用されてきた。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】

米国特許第5,214,132号は、第１、３、４、５および17位で天然hGCSFとは相違
するヒトGCSFのムテイン(突然変異タンパク質)を開示しているが、これらの位置
では、ムテインは、天然GCSFアミノ酸の代わりに、各々Ala、Thr、Tyr、Argおよ
びSerを有している（Kuga et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 103-
111(1989)も参照）。 M. Okabe et al.（Blood 75(9): 1788-1793(May 1, 1990
)）は、アミノ酸が、rhGCSFのN-末端領域の５ヶ所の位置で置換されており、２
種の検定において、マウスおよび／またはヒト骨髄前駆細胞中で無傷のrhGCFよ
り高度の比活性を示したrhGCSFの誘導体について報告している。米国特許第5,
218,092号は、第１、３、４、５、17、145および147位で天然hGCSFとは相違する
ヒトGCSFのムテインを開示しているが、これらの位置では、ムテインは、天然GC
SFアミノ酸の代わりに、各々Ala、Thr、Tyr、Arg、Ser、AsnおよびSerを有して
いる。米国特許第5,214,132号および第5,218,092号の内容は、本明細書に参考
までに組み込んでいる。

【０００３】例えば、GCSFのようなタンパク質治療薬のバイオアベイラビリティ(生体内利
用性)は、しばしば、最高臨床的効力を妨げる短い血中濃度半減期とプロテアー
ゼ分解への感受性によって制限される。他の治療用タンパク質に関する試験は
、典型的には、タンパク質およびPEGの両方に共有結合される連結部分によって
、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)のような重合体へタンパク質をコンジ
ュゲート化させることによって、そうした困難を克服できる可能性があることを
証明している。

【０００４】そのようなPEGコンジュゲート化生体高分子が、臨床的に有用な特性を有する
ことが証明されている（Inada et al., J. Bioact. and Compatible Polymers,
5:343(1990); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrie
r Systems, 9:249(1992); and Katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10:91
(1993))。特に有用であるのは、良好な物理的および熱的安定性、酵素分解へ
の感受性に対する保護、溶解性の改善、in vivo血中濃度半減期の延長とクリア
ランスの低下、免疫原性と抗原性の低下および毒性の低下である。

【０００５】本発明のコンジュゲートとは相違する構造を有するPEG-GCSFコンジュゲートは
、欧州特許公報第0 335 423号；欧州特許公報第0 401 384号；R.W. Niven et al
.,J. Controlled Release 32; 177-189(1994);およびSatake-Ishikawa et al.,
Cell Structure and Function, 17:157-160(1992)にて開示されている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】

従って、本発明はGCSFの新規クラスのPEG誘導体である。本発明のコンジュ
ゲートは、以下の説明から明らかなように、アミドリンカーである。

【０００７】未修飾GCSF（すなわち、PEGが付加されていないGCSF）と比較して、本発明の
コンジュゲートは、血中濃度半減期および血中滞留時間の延長、クリアランスの
低下およびin vivo顆粒球生成活性の増大を招く。さらに、PEG-GCSFと比較し
て、本発明のコンジュゲートは、優れた顆粒球生成特性を有する。他のPEG-GC
SFコンジュゲートは、欧州特許公報第0 335 423号；欧州特許公報第0 401 384号
；およびNiven et al.（前記と同じ箇所に）に開示されている。しかし、本発
明のコンジュゲートは、これらコンジュゲートとは相違する構造を有しており、
さらに、特に低用量で長時間持続する高度のin vivo顆粒球生成活性を示す、と
の優れた特性を有している。

【０００８】本発明の好ましいGCSFは、天然GCSFと同等またはそれより優れた特性を有し、
さらにGCSFと同一使用を有するGCSFムテインである。このムテインは、第１、
３、４、５および17位以外ではGCSFと同一のアミノ酸配列を有するが、それらの
位置では、このムテインは、天然GCSFアミノ酸の代わりに、各々Ala、Thr、Tyr
、ArgおよびSerを有している(GCSFムテイン)(図１参照）。このムテインは、
本明細書に参考までに採り入れた、米国特許第5,214,132号に開示されている。

【０００９】本発明の生理学的に活性なPEG-GCSFコンジュゲートは、以下の化学式を有する
。

【００１０】

【化６】

【００１１】さらに本発明の一態様として、組成物中のコンジュゲートのｍおよびｎが相違
する整数である、特許請求の範囲の欄に記載したコンジュゲートの組成物がある
。

【００１２】本発明のコンジュゲートは、GCSFと同じ用途を有する。特に、本発明のコン
ジュゲートは、化学療法によって顆粒球が枯渇している患者を治療するため、ま
たは骨髄移植の準備措置として、これらの状態を治療するためにGCSFが使用され
るのと同様に有用である。しかし、本発明のコンジュゲートは、優れた安定性
、より大きな溶解性、血中濃度半減期および血中滞留時間の延長を含む改善され
た特性を有する。

【００１３】

【発明の実施の形態】

特許請求の範囲の欄に記載の発明とは、以下の化学式、すなわち、

【００１４】

【化７】

【００１５】式中、Ｇは、式Ｉに示されているポリエチレングリコール部分とのアミド結合
に関与しているアミノ基より小さい顆粒球コロニー刺激因子であり、Ｒは低級ア
ルキルであり、ｎは420〜550の整数であり、さらにｍは１〜５の整数である、化
学式を有する生理学的に活性なPEG-GCSFコンジュゲートである。

【００１６】ｎおよびｍの数は、得られる式Ｉのコンジュゲートが、未修飾GCSFに匹敵する
生理学的活性を有しており、その活性が、未修飾GCSFでの対応する活性と同一、
それ以上、または分画となるように選択される。ｎは、PEGユニット中の酸化
エチレン残基数を表している。 OCH₂CH₂の単一PEGサブユニットは、約44ダルト
ンの分子量を有する。ｍは、GCSF分子に付着したPEGユニットの数を表してい
る。本発明のコンジュゲートは、GCSFの分子１個当たり、１、２、３、４、５
または６個のPEGユニットを有している可能性がある。従って、本発明のコン
ジュゲートの分子量（GCSFの分子量を除く）は、ｎおよびｍの数に左右される。

【００１７】ｎは、各PEGユニットが、PEGユニット１個当たり約18キロダルトン〜約25キロ
ダルトンの平均分子量を有するコンジュゲートを産生する420〜550の数値を有し
ている可能性がある。好ましくは、ｎは、各PEGユニットが約20キロダルトン
の平均分子量を有するコンジュゲートを産生する450〜490の数値を有している。

【００１８】ｍは、１、２、３、４または５の数値を有する可能性がある。好ましいｍは
、１〜４であり、さらに特に好ましいｍは２である。本発明のコンジュゲート
のPEG部分の分子量範囲は約18キロダルトン(ｎ＝420、ｍ＝１)〜約125キロダル
トン(ｎ＝550、ｍ＝５)である。ｎが420〜550で、ｍが1〜4の整数であるとき
、本発明のコンジュゲートのPEG部分の分子量範囲は、約18キロダルトン(ｎ＝42
0、ｍ＝１)〜約97キロダルトン(ｎ＝550、ｍ＝４)である。一定の「約」数の
分子量とは、それが従来の分析技法によって測定される数の合理的範囲内にある
ことを意味する。

【００１９】好ましいコンジュゲートにおいて、ｎは450〜490およびｍは１〜４であり、そ
の場合、コンジュゲートのPEG部分の分子量は、約20キロダルトン(ｎ＝450、ｍ
＝１)〜約86キロダルトン(ｎ＝490、ｍ＝４)の範囲である。また他の好ましい
コンジュゲートにおいて、ｎは420〜550およびｍは２であり、その場合には、コ
ンジュゲートのPEG部分の分子量は、約37キロダルトン(ｎ＝420)〜約48キロダル
トン(ｎ＝550)の範囲である。特に好ましいコンジュゲートにおいて、ｎは450
およびｍは２であり、その場合、コンジュゲートのPEG部分の分子量は、約40キ
ロダルトン(ｎ＝450)〜約43キロダルトン(ｎ＝490)の範囲である。

【００２０】Ｒはあらゆる低級アルキルであってよいが、それが意味するのは、例えば、メ
チル、エチル、イソプロピル等の１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である
。分枝アルキル類が含まれる。好ましいアルキルは、メチルである。

【００２１】 GCSFが意味するのは天然もしくは、例えば、組織、タンパク質合成、天然もし
くは組換え細胞を用いた細胞培養のような従来型起源から入手される、好ましく
は、ヒトの組換えタンパク質である。例えば、ムテイン、またはさもなければ
修飾タンパク質のようなGCSFの活性を有するあらゆるタンパク質が包含される。

【００２２】天然または組換え起源からGCSFを入手かつ単離することは、公知の事項である
（例えば、参考までに本明細書に採り入れた米国特許第4,810,643号および第5,5
32,341号を参照）。好ましいGCSFコンジュゲートは、米国特許第5,214,132号
に記載されているGCSFムテインを含むコンジュゲートである。

【００２３】式Ｉの生理学的に活性なコンジュゲートは、当該技術分野において知られてい
る様々な検定法によって測定される既知のGCSF活性のいずれかまたは複数の活性
を意味するGCSF活性を有する。特に、本発明のコンジュゲートは、PMN数を増
加させる能力によって示されるGCSF活性を有する。これは、GCSFの既知の活性
である。コンジュゲートでのそのような活性は、例えば、以下に説明する検定
法など、当該技術分野において公知の検定法によって測定できる（Asano et al.
, Jpn. Pharmacol. Ther. (1991)19:2767-2773; Yamasaki et al., J.Biochem.(19
94) 115:814-819; and Neben et al., Blood(1993) 81:1960も参照）。

【００２４】式Ｉのコンジュゲートは、以下の化学式、すなわち、

【００２５】

【化８】

【００２６】の化学式のスクシンイミジルプロピオン酸(SPA)試薬を用いたGCSFの共有結合
によって製造する。

【００２７】式IIの試薬は、公知の手順に従って、従来の方法によって入手することができ
る（参考までに本明細書に採り入れた米国特許第5,672,662号を参照）。ｎは
、上記の式Ｉにおけると同様であり、望ましい分子量のコンジュゲートを産生す
るために選択される。ｎが、450〜490(分子量＝20kDa)であるような試薬が好
ましい。その他の分子量は、式IIの試薬のためのPEG-アルコール出発物質に関
するｎを従来の方法によって変化させることで入手できる。分子量が５、10、
15および20kDaである式IIのSPA試薬は、シェアウォーター・ポリマーズ社（Shea
rwater Polymers, Inc、ハンツビル、アラバマ州）から入手することができる。

【００２８】式IIの試薬は、従来の方法によって、GCSFへ接合させることができる。結合
は、アミド結合による。詳細には、式IIの試薬は、主としてGCSFの１個以上の
一次アミノ基（例えば、Ｎ-末端およびリシン側鎖）と反応して、GCSFとPEGのポ
リマーバックボーンとの間にアミド結合を形成する。式Ｉに示されているNHは
、式IIの試薬と反応してアミド結合を形成するGCSFでの、これら一次アミノ基か
ら引き出される。少ない頻度ながら、式IIの試薬はまた、GCSFの第66位でセリ
ンのヒドロキシル基とも反応することができ、GCSFとPEGのポリマーバックボー
ンとの間でエステル結合を形成する。反応条件は、当業者に周知のものであり
、以下に詳細に記載されている。

【００２９】 GCSFへ試薬を付着させる工程は、従来の方法によって行うことができる。本
発明では、いずれかの分子量のPEGを選択して使用することができる。例えば
、反応は、４℃〜室温までの温度で、30分間〜20時間にわたって、４：１〜30：
１の試薬対タンパク質のモル比を利用して、pHが５〜10の溶液中で実施すること
ができる。反応条件は、主に、望ましい置換度を産生する方向に反応を導くよ
うに選択することができる。一般に、低い温度、低いpH（例えば、pH５）およ
び短い反応時間は、付着されるPEGの数を低下させる傾向（より小さいｍ）を示
す。高い温度、中性から高いpH（例、pH≧７）、およびより長い反応時間は付着
されるPEGの数を増大させる（より大きなｍ）。例えば、pH7.3および30：１の
試薬対タンパク質のモル比の式IIの５kDaの試薬を使用した場合には、４℃の温
度、および30分間の反応時間は、主として、モノ-PEGコンジュゲートを産生し、
４℃の温度および４時間の反応時間は、ジ-PEGコンジュゲートを産生し、さらに
、室温の温度および４時間の反応時間は、主としてトリ-PEGコンジュゲートを産
生した。反応は、反応混合液を酸化させて−20℃で冷凍することで終了させる
。一般に、７〜7.5のpHおよび４：１〜６：１の試薬対タンパク質のモル比が
好ましい。

【００３０】電荷差によってコンジュゲートを分離するためには、コンジュゲートを、それ
らを様々な分子量へ効果的に分離する陽イオン交換クロマトグラフィーのような
精製法を使用することができる。例えば、陽イオン交換カラムに充填し、その
後、〜20mM酢酸ナトリウム(pH４)を用いて洗浄し、さらにその後、pH３〜5.5、
好ましくは、〜pH4.5で緩衝された線形（０M〜0.5M）NaCl勾配を用いて溶出させ
ることができる。陽イオン交換クロマトグラフィーによって入手された分画の
量は、例えば、質量分析法、SDS-PAGE、またはその他の分子量によって分子体を
分離するための既知の方法など、従来の方法を使用して分子量に基づいて同定す
ることができる。従って、その後に付着されたPEGの望ましい数(ｍ)を有する
式Ｉのコンジュゲートを含んでいる分画が同定され、未修飾GCSFおよび異なる数
のPEGを有するコンジュゲートを除去して精製される。

【００３１】さらに本発明の一態様として、ｍの数値が相違するコンジュゲートが特定比率
で含まれているコンジュゲートの組成物である。本発明の好ましい組成物は、
ｍ＝１、２、３および４であるコンジュゲートの混合物である。ｍ＝１である
コンジュゲートの率（％）は18〜25％であり、ｍ＝２であるコンジュゲートの率
は50〜66％であり、ｍ＝３であるコンジュゲートの率は12〜16％であり、さらに
ｍ＝４であるコンジュゲートの率は５％までである。そのような組成物は、４
〜６：１のモル比（過剰な試薬）で、PEG修飾試薬をGCSFと反応させることによ
って産生させられる。反応は、7.5近くのpHで、20時間に渡って４℃〜８℃で
進行するに任せられる。反応の終了時には、酢酸が添加される。コンジュゲ
ートはその後、残留未修飾タンパク質、過剰なPEG修飾試薬およびその他の不純
物および反応中に存在する緩衝剤成分を除去して精製される。 PEG修飾タンパ
ク質と一緒に、反応副産物としてN-ヒドロキシスクシンイミドおよびポリエチレ
ングリコールカルボン酸が産生する。

【００３２】

【実施例】

ここに記載された発明を例示するために以下の実施例を示すが、これらは決し
て本発明を限定するものではない。これらの実施例では、GCSFムテインが使用
されている。その他のGCSF種もまた、例示した方法によってPEGへ接合させる
ことができる。

【００３３】実施例１ PEG修飾試薬：１．GABAアミドリンカー（P-6GA-1、P-12Ga-1） GABAアミドリンカー試薬は、６または12kDaのどちらかの２本のPEG鎖を含有し
ている。構造については図２−Ａを参照されたい。２．アミドリンカー（P-5am-1、P-10am-1）５および10kDaのアミドリンカーが産生された。構造については図２−Ｂを
参照されたい。３．アミドリンカーこの試薬は５、10、15および20kDaのPEG分子を用いて調製された市販のスクシ
ンイミジルプロピオン酸(SPA)であった。一般構造を、図２−Ｃに示した。４．尿素リンカーこの試薬は５、10および25kDaのPEG分子を用いて調製されており、典型的な構
造を、図２−Ｄに示した。５．ウレタンリンカー 10および20kDaの尿素リンカーが産生され、構造を図２−Ｅに示した。６．ウレタンリンカー市販の調製済み36kDaのPEG試薬の構造を、図２−Ｇに示した。図示されてい
るPEG試薬の１つの端は、t-ブチル基を用いてキャッピングされている。この
試薬は、本実施例で使用された中で最大分子量のPEGであった。７．チオ-ウレタンリンカーこのPEG修飾試薬の構造は、図２−Ｆに見ることができる。本試薬で使用さ
れたPEGの分子量は、20kDaであった。

【００３４】以下の試薬は、協和発酵工業株式会社（東京、日本）によって提供された：1)
G-CSFムテインは、６または12kDaいずれかの2m-PEG連鎖から構成される分岐メト
キシポリエチレングリコール(m-PEG)試薬(PEG-GABA-NHS、図2A参照)へコンジュ
ゲートされているGCSFムテイン、５および10kDa線形エステル/アミドm-PEG試薬
（図２Ｂ参照）にコンジュゲートされているGCSFムテインを意味している。５
、10、15および20kDaの分子量を有するm-PEGスクシンイミジルプロピオン酸-NHS
(PEG-SPA)試薬は、シェアウォーター・ポリマーズ社（Shearwater Polymers、ハ
ンツビル、アラバマ州、図2C参照）から購入した。以下のタンパク質PEG修飾
試薬は、ホフマン-ラ・ロシュ社（Hoffmann-La Roche, Inc）で調製された：1）
m-PEG-尿素リンカー(５、10および25kDa、図2D参照)、2）m-PEG-ウレタンリンカ
ー(10および20kDa、図2E参照)、および3）m-PEG-チオウレタンリンカー（10およ
び20kDa、図2F参照)。 36kDaの平均分子量を有するt-ブチル-m-PEGウレタンリ
ンカー試薬は、DDIファーマシューティカルズ社（DDI Pharmaceuticals, Inc.、
マウンテンビュー、カリフォルニア州、図2G参照）から入手した。

【００３５】 PEG修飾反応： PEG修飾反応に影響を及ぼす因子は、1）pH、2）温度、3）反応時間、4）タン
パク質とPEG試薬のモル比、および5）タンパク質濃度である。これらの因子の
１つ以上を調節することで、反応を、主としてモノ-、ジ-、トリ-その他のPEGコ
ンジュゲートを産生するように方向付けることができる。例えば、シェアウォ
ーター・ポリマーズ社製SPA-PEG 5000（N-ヒドロキシスクシンイミド）試薬のた
めの反応条件は、1）pHが7.3、2）温度がモノ-およびジ-PEGのためには４℃、ト
リ-PEGのためには室温、3）反応時間がモノ-PEGのためには30分間；ジ-およびト
リ-PEGのためには４時間、および4）タンパク質と試薬のモル比が１：30であっ
た。すべての試薬に対して、望ましいPEG種を産生するための至適反応条件が
個別に測定された。それらを表１に示している。反応は、反応混合液を酸化
させて、−20℃で冷凍することで終了する。

【００３６】反応混合液からの修飾および遊離GCSFムテインの分離（スルホプロピル(SP)陽
イオン交換）：約５mgのタンパク質を含有する反応混合液を、水で10〜20倍に希釈し、氷酢酸
を用いてpH 4.5に調整された。希釈サンプルはその後、１〜２mlフラクトゲル
EMD SO₃--650S（EMセパレーションズ社［EM Separations］製、ギブスタウン、
ニュージャージー州）充填カラムへ添加され、10mM酢酸アンモニウム（pH4.5）
を用いて平衡化された。未吸着試薬および反応副産物は、貫流して除去した。
修飾GCSFムテインは、平衡緩衝液中で0.15M NaClを用いた段階的勾配を用いて溶
出された。カラム上に残っている未修飾GCSFムテインは、平衡緩衝液中で0.5M
NaClを用いて段階的に溶出された。分離されたGCSFムテイン-PEGコンジュゲ
ート混合液は、0.2μmフィルターを用いて無菌ろ過され、−20℃で冷凍保存され
た。

【００３７】 GCSFムテイン-PEGコンジュゲートの特徴：タンパク質の測定精製GCSFムテイン-PEGコンジュゲートのタンパク質濃度は、１mg/ml溶液に対
して、0.86のA₂₈₀値に関して測定された。

【００３８】 SDS-PAGE分析この分析は、Laemmli, Nature 227:680-685, 1970に従って、還元条件下で、
12および15％ポリアクリルアミドゲルまたは８〜16％ポリアクリルアミド勾配ゲ
ルを使用して実施した。

【００３９】組成率の測定種々のGCSFムテイン-PEGコンジュゲート反応混合液中の各種（モノ-、ジ-、ト
リ-、等）の組成率は、クーマシーブルー染色SDS-PAGEゲルのデンシトメトリー
測定値から測定された（表２参照）。

【００４０】 GCSFムテイン-PEGコンジュゲート中のPEG質量の測定様々な調製物中の置換されたPEGの総質量は、平均PEG分子量、電気泳動度に基
づいた個々のPEGコンジュゲートの同定(モノ、ジ等)、付着したPEG分子の数およ
びクーマシーブルー染色SDS-PAGEゲルのデンシトメトリー測定値に基づく組成率
から測定した。特定調製物の総PEG質量は、その個別PEG質量の合計である。
個別のPEG質量は、下記の式から計算される： PEG質量＝PEG M.W.（分子量）×PEG分子数×組成率式中、 PEG M.W.（分子量）−5、10、20kDaなど PEG分子数＝モノ、ジ、トリの各々に対して１、２、３総PEG質量測定において、質量スペクトロメトリー（MALDI-TOF）も使用されて
きた。本実施例では、質量スペクトルによって個々のPEGコンジュゲートの同
定および分子量の測定が可能になった。各PEGコンジュゲートに付着されたPEG
分子量は、個別PEGコンジュゲートの総分子量からGCSFムテインの分子量(18.9kD
a)を差し引いたものである。これらの数値に組成率をかけると、個別PEG質量
が得られ、それらの合計が総PEG質量である。

【００４１】両方の方法を使用して様々な調製物のPEG質量が測定されている。その結果
を、表２に示している。

【００４２】エンドトキシンレベルの測定エンドトキシンレベルは、製造業者（アソシエイツ・オブ・ケープ・コッド社
［Associates of Cape Cod, Inc.］、ウッズホップル、マサチューセッツ州）の
取扱説明書に従って、LAL(リムルス・アメーバ様細胞溶解質)法を使用して測定
された。

【００４３】生体活性 M-NFS-60細胞に関するin vitroバイオアッセイ（生物学的検定）および雌C57B
L/6Jマウスにおけるin vivo検定は、以前に報告したようにして実施された（Asa
no et al., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991) 19:2767-2773参照）。

【００４４】結果および考察 PEG修飾反応一般的に、実験の結果は、望ましい量のコンジュゲートを入手するためには、
例えば、尿素リンカーのようなあまり反応性の高くない試薬は、より高いpH、温
度およびタンパク質：試薬のモル比、ならびにより長い反応時間を必要とするこ
とを示している。（表１および２を参照）。

【００４５】反応混合液からの修飾および遊離GCSFムテインの分離典型的な溶出プロフィールを、図４に示している。陽イオン交換クロマトグ
ラフィーに加えて、微量汚染物質およびエンドトキシンを除去するため、および
保管のための最終生成物の緩衝交換を実施するために、例えば、ゲル浸透クロマ
トグラフィーのような追加の工程が必要になる可能性がある。強力な陽イオン
交換分離法は、20kDa SPA（アミド）および20kDaウレタンコンジュゲートに対し
ては、30mg規模に拡大されている。この方法を用いると、ほぼ定量的回収率で
入手できる。

【００４６】組成率およびPEG質量組成率およびPEG質量の測定結果を、表２にまとめている。我々の実験では
、高分子量PEGコンジュゲート(例えば、20kDa SPA diPEGおよび12kDa GABA)の場
合には、反応混合液の組成率を測定するために電気泳動度に基づいてPEG種を同
定する方法の信頼性はあまり高くない。 PEG質量を測定するため、さらに高分
子量および高置換PEGコンジュゲートを同定するためには、SDS-PAGE、SP-HPLCお
よびMALDI-TOF MS分析を併用することが必要とされる。しかし、低分子量PEG
試薬（例えば、５kDa）に由来するモノPEG修飾およびPEGコンジュゲートは、そ
れらの各々のSDS-PAGEプロフィールから相当正確に同定することができよう。

【００４７】エンドトキシンレベル LAS法を用いて、ウレタン試薬由来のものを除く全PEGコンジュゲート中で、＜
１EU/mgのエンドトキシンが検出された。このPEGコンジュゲートでは、エンド
トキシンが希釈後にのみ検出された。そこで、これは希釈中の汚染が原因では
なく、このサンプル中の何らかの未知の物質が、高タンパク質濃度ではLAS検定
における阻害を惹起したのであろうと確証された。サンプルを希釈すると、阻
害物質の希釈に引続いて、陽性エンドトキシンが観察された。

【００４８】生体活性全GCSFムテイン-PEGコンジュゲートのin vitro活性およびin vivo生体活性を
、表２に列挙している。一般に、in vitro活性と置換度ならびにPEGの分子量
との間の反比例関係が観察される。これとは対照的に、置換されたPEGの分子
量の増加に伴って、in vivo活性の増強が観察される。これは他の研究者によ
っても観察されている（Satako-Ishikawa et al., Cell Struct Funct. 17(3):1
57-60, 1992)。 GCSFムテインのポリペプチドバックボーンへのPEG分子の化学
的付着は、受容体／リガンド相互反応に有害に影響を及ぼす。従って、結合親
和性を低下させる何らかの形の構造変化をもたらすものと仮定されている。さ
らに、in vitro検定での相当に短い培養時間は、おそらくピーク活性に到達する
ためには不十分である。他方で、マウスにおけるin vivo検定期間ははるかに
長く（数日間）、薬剤の注入から数日後に終了される。 PEG-GCSFムテインの伸
びた血中濃度半減期と結び付けられたこの長い培養時間は、PEG修飾を原因とす
る結合親和性の損失を補正する。最終成績は、最高のin vivo生体活性の達成
である。もう１つの仮説は、PEG-GCSFムテインが、マウスに注射されたときに
プロドラッグとして作用するというものである。この状況では、PEG-GCSFムテ
インのPEG部分は、幾分かは持続的に開裂されて取り除かれ、結果として、微量
の遊離GCSFムテインの持続性放出を生じさせ、これがin vivo活性の維持および
増強の原因となる。しかし、プロドラッグ仮説では、初期投与から７日後に観
察されたベースライン時でのin vivo活性は説明できない。タンパク質とPEGと
の間のアミド結合は安定で、容易には開裂されないので、プロドラック機序はあ
りそうもない。

【００４９】試験された15種のGCSFムテイン-PEGコンジュゲートの中で、P-12GA-1、20kDa
SPA、20kDaウレタンおよび36kDaウレタンのin vivo活性は、残りの調製物より有
意に高かった（図４および表２を参照）。

【００５０】総合すると、PEG分子の分子量とin vivo活性の増加との比例関係が観察されて
いる。これは、PMN数における増加がアミド(SPA)および尿素結合PEGコンジュ
ゲートでの総PEG質量の関数を表した図５に示されている。

【００５１】 GCSFムテイン-PEGコンジュゲートの選択および特性 15種のPEGコンジュゲート間でのコンジュゲーション化学、生物学的特性およ
び医薬品開発問題について注意深く検討した後に、さらに検討を行うために、次
の３種が選択された：1）P-12GA-1、2）20kDa SPAおよび3）20kDaウレタン。
SP精製反応混合液に存在する20kDa SPA由来モノ-、ジ-およびトリ-PEGコンジュ
ゲートは直接比較で検討され、その結果、３種すべてが25.2μgの単一（単回）
用量で５日間にわたって、雌C57BL/6Jマウスにおいて高度の顆粒球生成活性を維
持することが証明された（表３および図４）。これとは対照的に、未修飾GCSF
ムテインでは、同様の活性を維持するためには１日１回の投与が必要とされた（
データは示さず）。２例（20kDa SPAおよびP-12GA-1）を除く全例において、i
n vivo活性は、マウスに初期投与して７日後には標準値へ戻った（図６)。 20k
Da SPAおよびP-12GA-1コンジュゲートはいずれも、8.4μgの低用量で高い活性を
示したが、７日目に標準レベルへ戻った(表３参照)。組成率データ(表３)は、
20kDa SPAおよびP-12GA-1調製物が、どちらも約50％の二量体を含有しており、
残りの50％が単量体と三量体に分けられることを示している。 20kDaウレタン
試薬は、使用された実験条件下で主としてモノ-PEGを産生する(表３参照)。主
として単量体ウレタン誘導体を含有すると評価された全PEGコンジュゲートのin
vitro活性は、置換度とPEG分子量との間の反比例関係の一般的パターンに従って
いる。評価されたPEGコンジュゲートのin vivo生物学的活性は、評価された分
子量範囲に渡ってPEGの分子量との比例関係を示した(図５)。

【００５２】結論試験された15種のGCSFムテイン-PEGコンジュゲートの中で、P-12GA-1、20kDa
SPAおよび20kDaウレタンリンカー調製物は、良好なin vivo活性プロフィールを
示した。 20kDa PEG- GCSFムテインが生産効率を含む最高の総合特性を示した
。

【００５３】

【表１】

【００５４】

【表２】

【００５５】

【表３】

【００５６】実施例２：rhG-GCSFムテインにコンジュゲート化された20kDa PEGの調製 20kDaメトキシ-PEGスクシンイミジルプロピオン酸(SPA)を用いたG-CSFムテイ
ンの修飾は、以下のように行った。 PEG試薬を、〜200mg/mlの濃度で蒸留水中
に溶解し、４：１〜６：１のモル比(過剰な試薬)でG-CSFムテイン溶液(〜５mg/m
l）に添加された。反応は、〜pH7.5で、20時間にわたって、４℃〜８℃で進行
するに任された。反応の終了時に、反応を停止させるために氷酢酸が添加され
た。 PEG修飾GCSFムテイン(PEGGとも呼ばれる)はその後、残留未修飾ムテイン
、過剰PEG試薬および修飾中に存在するその他の不純物および緩衝成分から精製
された。 PEG修飾タンパク質と一緒に、反応副産物としてN-ヒドロキシスクシ
ンイミドおよびポリエチレングリコール-カルボン酸が産生する。

【００５７】 PEGGは、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびその後に限外濾過を使用して
精製された。陽イオン交換カラムに充填され、20mM酢酸ナトリウム（pH4.0）
を用いて洗浄された。塩化ナトリウム線形勾配を用いた溶出によって、PEGGは
反応混合液中の他の全成分から分離された。引き続いて、限外濾過／ダイアフ
ィルトレーションを使用して、PEGGが、〜4.0mg/mlにまで濃縮され、緩衝液が20
mM酢酸ナトリウム、50mM塩化ナトリウム、pH6.0へ変更された。

【００５８】上記した条件下で実施された５回のPEG修飾および精製を経た産物が、陽イオ
ン交換クロマトグラフィーを使用して分析され、これにより、G-CSFムテインPEG
修飾反応の再現性が証明された。 PEG修飾反応は、以下の至適条件下では、2.5
ｇ(最終PEGG産量)までの生成量において再現性であることが証明された：４〜６
：１の20kDa-SPA-PEG：ムテインの比率；〜pH7.5；４℃、20時間。 PEGGの混合
液の平均組成率は、表４に示したように、モノ-PEGG 21.7％(％RSD［相対偏差率
］＝16.6)、ジ-PEGG 60.3％(％RSD＝6.6)、トリ-PEGG 15.1％(％RSD＝4.0)およ
びテトラ-PEGG 2.9％(％RSD＝26.1)であると測定された。

【００５９】

【表４】

【００６０】実施例３：末梢血幹細胞流動化骨髄から原始幹細胞および前駆体の両方を流動化させるため、および末梢血中
の循環前駆細胞を膨張させるための方法が開発されてきた。刺激されたこれら
細胞は、致命的照射および骨髄もしくは幹細胞移植後の早期および持続性生着を
媒介できる可能性がある（Neben S., Marcus K. and Mauch P.:Mobilization of
hematopoietic stem and progenitor cell subpopulations from the marrow to
the blood of mice following cyclophosphatide and/or granulocyte colony-
stimulating factor.（シクロホスファチドおよび／または顆粒球コロニー刺激
因子投与後のマウス骨髄から血液への造血幹細胞および前駆細胞分集団の流動化
) Blood 81:1960(1993)）。末梢血幹細胞(PBSC)の補充は、化学療法誘発性骨
髄形成不全を有する患者またはその他の微小切除療法を受けた患者において、造
血的回復の所要時間を短縮するのに役立つことがある（Roberts AW and Metcalf
D.: Granulocyte colony-stimulating factor induces selective elevations
of progenitor cells in the peripheral blood of mice.（顆粒球コロニー刺激
因子はマウス末梢血中の前駆細胞の選択的増加を誘発する）Experimental Hemat
ology 22: 1156(1994)）。流動化を刺激するために、成長因子および化学療法
薬の両方が使用されてきた（Bodine D: Mobilization of peripheral blood "st
em" cells: where there is smoke, is there fire?（末梢血幹細胞の流動化：
噂が立つ以上は何らかの事実があるはずだ)Experimental Hematology 23: 293(1
995))。 PBSCを刺激した後、流動化された細胞は、白血球フェレーシスによっ
て収集され、必要になる時点まで低温保存される。現在の臨床プロトコルは、
標準高用量化学療法(CHT)の後に、白血球フェレーシスによるPBSC濃縮液の反復
収集を行うこと、さらに、時には２週間以上持続する成長因子の毎日の反復投与
または持続的輸注を要求している（Brugger W., Bross K., Frisch J., dern P.
Weber B., Mertelsmann R. and Kanz L.: Mobilization of peripheral blood
progenitor cells by sequential administration of Interleukin-3 and granu
locyte-macrophage colony-stimulating factor following polychemotherapy w
ith etoposide, ifosfamide and cisplatin.（エトプシド、イホスファミドおよ
びシスプラチンを用いた多剤併用化学療法後のインターロイキン３および顆粒球
マクロファージコロニー刺激因子の連続投与による末梢血前駆細胞の流動化）Bl
ood 79: 1193(1992))。以下に記載する試験は、まずは正常マウス、そして、
化学療法モデルであるPBSC流動化のための２種類のマウスモデルを用いて実施し
た。この実験は、幹細胞の流動化を達成するためにNEUPOGEN(ノイポゲン)(G-C
SF)と比較して、本発明に従ったPEG修飾G-CSFムテイン(PEGG)の有効性が高いこ
とを証明している。統計的に有意に低い用量、およびさらに効果的な投与レジ
メンでPEG修飾ムテインが優れていることも、同様に明白に立証された。

【００６１】これらの試験は、７日間にわたる寒天コロニー検定において、複数の成長因子
を用いてin vitroで刺激された流動化幼若マウスPBSCの膨張能力を評価した。
全マウスの血液について、コロニー形成能力に加えて、完全血液学的プロフィー
ルと絶対好中球数(ANC)の評価とが実施された。血清G-CSFレベルも、同様に測
定された。検定至適化の後に、数種の経時的実験が実施され、高用量および低
用量のG-CSFについて試験された。実験モデルには、G-CSFおよびシクロホスフ
ァミド(Cytoxan［サイトキサン])誘発性の流動化ならびにCHTおよびサイトカイ
ンの両方を使用する併用療法が含まれていた。

【００６２】材料および方法：全実験において、ジャクソン研究所（Jackson Laboratory
）から購入した６〜10週齢の雌C57BL/6Jマウスが使用された。マウスには、第
１日目にCytoxan 200mg/kgまたはリン酸緩衝生理食塩液(PBS)賦形剤のどちらか
が腹腔内注射された。第０日目に、動物にはNEUPOGEN(GCSF)、PEGG(20kD SPA
結合PEG修飾ムテイン、ロット番号P20W3)、または１％正常マウス血清を含有す
るPBS賦形剤0.1mlが皮下注射された。 Neupogenが投与されたマウスには毎日同
一用量の注射を行ったが、他のすべてのマウスには賦形剤が投与された。屠殺
日には、麻酔をしたマウスの眼窩後洞からEDTAが入った試験管内に末梢血が採取
された。各群に対して、15％ウシ胎児血清および0.35％ Difco寒天が補充され
た計１mlのRPMI 1640培地中に、1,000U/ml組換えマウス(rm)インターロイキン-
３、100ng/ml rm幹細胞因子および1,000U/ml rmインターロイキン-６が入った各
３枚の35mm²の組織培養皿へ、少量のプール全血が添加された。凝固した寒天
培地は、37℃の加湿された５％CO₂を含む大気中で、１週間に渡って、インキュ
ベートした。コロニー数は、暗視野照明下で、立体解剖顕微鏡を使用して計数
された。

【００６３】結果：図示した第１回の試験で、正常マウスは第０〜５日目に25μg/マウ
スの用量でNEUPOGENの注射を毎日、または第０日目に25μg/マウスの注射を一回
受けた。マウスは、第３〜７日目に屠殺された。図７から明らかなように、
コロニー形成によって証明される流動化は、NEUPOGEN注射マウスにおいては第３
および４日目に統計的有意に増加したが、（NEUPOGEN注射は、第５日目まで実施
したにもかかわらず）第５日目までにはベースライン時レベルへ徐々に戻り始め
た。他方で、PEGGが注射されたマウスは、より高度に上昇したコロニー数を示
し、これは第７日目まで引き続いて安定水準期を保っていた。

【００６４】化学療法モデルに関するパラダイムも同様であった。 CHT群におけるマウス
は、第１日目にCytoxanの注射を受けた。一部のマウスはその後、残りの期間
は賦形剤だけが投与されたが、他のマウスは、第０〜５日目に１日１回のNEUOPO
GENの注射、または第０日にPEGGの注射を一回だけ受けた。図８は、第４日目
にCytoxan処置したマウスでのピークを示しているが、その後の数日間にはベー
スライン時レベルへの漸減的復帰が認められた。 NEUPOGENおよびPEGG群のいず
れも、第５日目にはピークに達し、コロニー数は非常に高くなった。しかし
、Cytoxan＋PEGG値は、第６および７日目を通して、Cytoxan＋NEUPOGEN群よりも
極めて有意に上昇したままであった。図９は、CytoxanまたはG-CSF単剤群に比
較して、併用療法の相乗作用が優れていることを示している。

【００６５】図10および11には、２回目の試験が示されている。連続10日間にわたって、
３μg/マウスの低用量のNEUPOGENを毎日注射した正常マウスが、試験期間を通じ
て、低レベルの「多相」流動化を示した。３μg/マウスのPEGGの単一用量を注
射した動物は、第４日目まで、末梢循環において約５倍の流動化前駆細胞数を示
したが、その作用は、本質的に６日間以内にわたる単一の作用であった。

【００６６】 Cytoxan注射したマウスでは、３μg/マウスの用量のPEGGは、10日間にわたっ
て３μg/日の用量でNEUPOGENを注射したマウスにおいて、30μg/マウスとほぼ同
等のPBSC流動化を誘発した（図11）。いずれの群も、前駆細胞の流動化のピー
クを第５日目に示し、ピークの大きさは同一であった。唯一の差は、NEUPOGEN
の残存作用がわずかに長いことであった。 CHTモデルにおけるコロニー数は、
正常マウスモデルにおけるコロニー数の４〜10倍であった。

【００６７】これらの実験では、NEUPOGENに比較して、PEG修飾ムテインが２つの明確な長
所を有することを証明している。第１に、正常マウスおよび化学療法処置マウ
スの双方でのPBSCの流動化誘発能力に関して、NEUPOGENに比較してPEGGの有効性
がはるかに大きいことは明白である。第２に、PEG修飾ムテインは、臨床製品
を用いて現在利用されている用量より低用量で、かつより効果的な投与を行うこ
とで、マウスにおいてNEUPOGENよりはるかに有効であることが証明されている。

【００６８】

【配列表】

S E Q U E N C E L I S T I N G <110> Hoffman-La Roche, Inc. <120> GCSF Conjugates <130> 01017/36785 <140> US 09/487,133 <141> 2000-01-19 <150> US 60/117,917 <151> 1999-01-29 <160> 1 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DISULFID <222> (36)..(42) <220> <221> DISULFID <222> (64)..(74) <400> 1 Ala Pro Thr Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 35 40 45 Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 145 150 155 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170

【図面の簡単な説明】

【図１】 GCSFムテインの一次構造であって、図示したGCSFムテインは、野
生型ヒトGCSFとは第１、３、４、５および17位で相違しており、ムテインは、そ
れらの位置で、天然GCSFアミノ酸の代わりに各々Ala、Thr、Tyr、ArgおよびSer
を有している。

【図２】 PEG修飾した試薬である。

【図３】 20kDaのPEG修飾および未修飾GCSFムテインの分離を示したPEG反
応混合液に対する典型的な溶出プロフィールである。カラムとして、１−２ml
フラクトゲル(Fractogel)(登録商標）EMD SO₃ 650Sを、平衡緩衝液として、10mM
酢酸アンモニウム、pH4.5を、溶出緩衝液１として、平衡緩衝液中の0.15M NaCl
を、そして、溶出緩衝液２として、平衡緩衝液中の0.5M NaClを用いた。

【図４】単回注射して５日後のPEG-GCSFムテイン活性を示している。雌
C57BL/6JマウスにPEG修飾GCSFムテインコンジュゲート25.2μgを皮下注射し、投
与して５日後に眼窩後洞から静脈血サンプルを採取した。クールター式血液検
査および白血球分類分析を行い、得られた好中球数は、各実験について賦形剤対
照に対して標準化された。図示したデータは、１群当たり４匹のマウスの平均
値±S.E.(標準偏差)で表している。

【図５】アミドおよび尿素結合GCSFムテイン-PEGコンジュゲートでのPEG
質量(kDa)の関数としてのPMN数における増加。 SPA試薬を用いて調製されたコ
ンジュゲートは、PMN＝0.277MW＋3.95、そして、尿素試薬を用いて調製されたコ
ンジュゲートは、PMN＝0.152MW＋2.74であった。

【図６】単回注射して７日後のPEG-GCSFムテイン活性を示している。雌
C57BL/6JマウスにPEG修飾GCSFムテインコンジュゲート25.2μgを皮下注射し、投
与して７日後に眼窩後洞から静脈血サンプルを採取した。クールター式血液検
査および白血球分類分析を行い、得られた好中球数は、各実験について賦形剤対
照に対して標準化された。図示したデータは、１群当たり４匹のマウスの平均
値±S.E.(標準偏差)で表している。

【図７】マウスPBSC移動性コロニーアッセイの結果を示す図である。

【図８】マウスPBSC移動性コロニーアッセイの結果を示す図である。

【図９】マウスPBSC移動性コロニーアッセイの結果を示す図である。

【図１０】マウスPBSC移動性コロニーアッセイの結果を示す図である。

【図１１】マウスPBSC移動性コロニーアッセイの結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C084 AA02 AA07 BA03 BA37 CA62 DA19 NA03 ZC022 4H045 AA10 BA57 CA40 DA11 EA28 4J005 AA04 BD03 BD05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の化学式を有する生理学的に活性なコンジュゲート、す
なわち、【化１】式中、Ｇは当該コンジュゲートのポリエチレングリコール部分とのアミド結合
に関与するアミノ基より小さな顆粒球コロニー刺激因子であり、Ｒは低級アルキ
ルであり、ｎは420〜550の整数であり、さらにｍは１〜５の整数である、化学式
を有する生理学的に活性なコンジュゲート。
【請求項２】前記Ｒが、メチルである請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】前記ｎが、450〜490である請求項２に記載のコンジュゲート
。
【請求項４】前記ｍが、１〜４の整数である請求項２に記載のコンジュゲ
ート。
【請求項５】前記ｍが、２である請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】前記顆粒球コロニー刺激因子が、図１に記載の配列を有する
GCSFムテインである請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項７】前記ｎが、450〜490である請求項１に記載のコンジュゲート
。
【請求項８】前記ｍが、１〜４の整数である請求項１に記載のコンジュゲ
ート。
【請求項９】前記ｍが、２である請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】前記顆粒球コロニー刺激因子が、図１に記載の配列を有す
るGCSFムテインである請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】対応する非接合顆粒球コロニー刺激因子よりも循環半減期
が長く、かつin vivo顆粒球生成活性が大きい請求項１に記載のコンジュゲート
。
【請求項１２】前記顆粒球コロニー刺激因子が、図１に記載の配列を有す
るGCSFムテインである請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】以下の化学式を有する生理学的に活性なコンジュゲート、
すなわち、【化２】式中、Ｒはメチルであり、ｎは450〜490の整数であり、ｍは２であり、そして
、Ｇは当該コンジュゲートのポリエチレングリコール部分とのアミド結合を形成
するアミノ基より小さな、図１に記載の配列を有するGCSFムテインである、化学
式を有する生理学的に活性なコンジュゲート。
【請求項１４】以下の化学式を有する生理学的に活性なコンジュゲートを
含む組成物、すなわち、【化３】式中、各コンジュゲートのＧは当該コンジュゲートのポリエチレングリコール
部分とのアミド結合を形成するアミノ基またはそれらの基より小さな顆粒球コロ
ニー刺激因子であり、各コンジュゲートのＲは互いに独立した低級アルキルであ
り、各コンジュゲートのｎは互いに独立した420〜550の整数であり、各コンジュ
ゲートのｍは互いに独立した１〜４の整数であり、ｍが１であるコンジュゲート
の率が18〜25％であり、ｍが２であるコンジュゲートの率が50〜66％であり、ｍ
が３であるコンジュゲートの率が12〜16％であり、そして、ｍが４であるコンジ
ュゲートの率が５％までである、化学式を有する生理学的に活性なコンジュゲー
トを含む組成物。
【請求項１５】各コンジュゲートでのＲがメチルである請求項14に記載の
組成物。
【請求項１６】各コンジュゲートでのｎとＲが同じである請求項14に記載
の組成物。
【請求項１７】前記ｎが、450〜490である請求項14に記載の組成物。
【請求項１８】各コンジュゲートでの顆粒球コロニー刺激因子が、図１に
記載の配列を有するGCSFムテインである請求項14に記載の組成物。
【請求項１９】以下の化学式を有する生理学的に活性なコンジュゲートを
含む組成物、すなわち、【化４】式中、Ｒはメチルであり、各コンジュゲートのｎは450〜490の整数であり、Ｇ
は当該コンジュゲートのポリエチレングリコール部分とのアミド結合を形成する
そのアミノ基より小さな、図１に記載の配列を有するGCSFムテインであり、各コ
ンジュゲートのｍは互いに独立した１〜４の整数であり、ｍが１であるコンジュ
ゲートの率が18〜25％であり、ｍが２であるコンジュゲートの率が50〜66％であ
り、ｍが３であるコンジュゲートの率が12〜16％であり、そして、ｍが４である
コンジュゲートの率が５％までである、化学式を有する生理学的に活性なコンジ
ュゲートを含む組成物。
【請求項２０】対応する非接合GCSFよりも循環半減期が長く、かつ in vi
vo顆粒球生成活性が大きいPEG-GCSFコンジュゲートを製造する方法であって、前
記コンジュゲートを得るために、以下の化学式、すなわち、【化５】の化学式を有する試薬を当該GCSFに共有結合せしめることからなる方法。
【請求項２１】前記GCSFが、図１に記載の配列を有するGCSFムテインであ
る請求項21に記載の方法。