UA81235C2 - Catheter composition and uses thereof - Google Patents

Description

Опис винаходу

Даний винахід відноситься до області медичних пристроїв для тривалого введення, зокрема, катетерів, а 2 також до області способів і конструкцій для промивки, закріплення, заправляння і нанесення покриття на ці медичні пристрої. Винахід також відноситься до фармацевтичних препаратів, що застосовуються для збільшення потоку в катетері і запобігання виникненню інфекції в катетерах, які схильні до фібринових відкладень або містять згустки на основі фібрину.

Системи доставки широко використовуються в медицині в якості пристроїв для введення рідких речовин, які 70 можуть включати лікарські або поживні речовини, або інші активні речовини, в певну ділянку організму пацієнта. Такі системи часто включають використання катетерів, які в багатьох випадках вводять хірургічним шляхом або внутрішньовенно і вшивають для тривалого застосування бажаної речовини. Типові системи включають центральні катетери, які можуть бути використані для загального парентерального харчування (ТРМ), що використовується, наприклад, при синдромі укороченої товстої кишки (для продовження життя), з ризиком 79 сепсису або ендокардиту. Такі системи також включають катетери і дренажі, що використовуються в перитонеальному діалізі у пацієнтів з термінальною нирковою недостатністю, яка у разі інфікування може призвести до перитоніту з серйозними наслідками.

Інтраваскулярні катетери відносяться до найбільш поширених медичних пристроїв. Такі катетери за допомогою стандартних операцій поміщають у васкулярну систему пацієнта для різних процедур і часто залишають на місці протягом тривалого часу. Один з типів систем доставки, що використовуються протягом декількох років при лікуванні різних розладів у людей, включає резервуар або камеру малого об'єму, що імплантується підшкірно під фасцію з прямим доступом через катетер до кардіоваскулярної системи. Такі системи відомі як системи портів. Оскільки порт і інтраваскулярний катетер є прямими шляхами з навколишнього середовища в кровообіг пацієнта, присутність катетера або порту створює значний і постійний потенціал для с попадання мікроорганізмів в кровообіг пацієнта. Ге)

В наш час загальновизнаним є те, що таке використання постійних катетерів у терапевтичних, хірургічних, гінекологічних, урологічних і інших пацієнтів може призвести до серйозного інфікування сечостатевих шляхів.

Практикуючі лікарі розробили безліч методик, що стосуються введення, використання, прикріплення і видалення пристроїв рідинного регулювання і інших операцій, що проводяться з катетерами. Майже всі ці операції мають на о меті запобігання проникнення мікроорганізмів в кровообіг пацієнта. со

Було розроблено ряд методик для зниження ризику інфікування, які використовують в медичних пристроях антибактеріальні засоби, але жодна з них не показала повністю задовільних результатів в клінічних с випробуваннях. Ці пристрої переважно забезпечують ефективні рівні антибактеріального засобу протягом всього /- пе періоду використання пристрою. Подібне уповільнене вивільнення може бути таким, якого важко досягти, оскільки може бути потрібен спеціальний механізм розподілу антибактеріального засобу протягом тривалого со періоду часу, і введення достатніх кількостей антибактеріального засобу може негативно вплинути на поверхневі характеристики пристрою. Труднощі, що виникають при забезпеченні ефективного антибактеріального захисту, посилюються розвитком патогенів, що мають стійкість до ліків. «

У наш час стандартний догляд за васкулярними катетерами включає промивку порожнини катетера З 50 антикоагулянтом, таким як гепарин, для запобігання коагуляції крові всередині і навколо наконечника катетера с і створення перешкод потоку рідин через катетер. Крім того, гепарин не має антибактеріальної дії і, до того з» ж, при недостатньому контролі, він може завести антикоагуляційний процес дуже далеко, створивши небезпеку кровотечі. Гепарин також може призвести до утворення антитіл, що викликають серйозний розлад, що називається гепарин-індукованою тромбоцитопенією (НІТ), яка виснажує тромбоцити і додатково збільшує небезпеку кровотечі. Таким чином, інфекції і тромбозна закупорка як і раніше становлять поширену проблему, со незважаючи на профілактичне використання гепаринових промивок. Необхідне пильне вивчення патогенезу і - мікробіології інфекцій, зумовлених центральними венозними катетерами, для ефективного усунення цієї проблеми. ді еіарпуіососсив ерідегтідів та 5. ашгенз спричиняють 7595 інфекцій, зумовлених центральними венозними оз 20 катетерами (СМС). Види Сапаіда спричиняють ще 10-1595 таких інфекцій. Було виявлено, що використання антистафілококових антибіотиків для запобігання цим інфекціям знижує СМО-зумовлені бактерійні інфекції, але сл тільки за рахунок збільшення ступеня грибкових (Сапаїда) інфекцій.

Спостерігається також кореляція між тромбоутворенням та інфікуванням. По суті, фібринова оболонка, що поступово покриває внутрішню і зовнішню поверхні катетера, поглинає постійні васкулярні катетери. Ця 29 фібринова оболонка розвиває такі організми, як біарпуіососсі і Сапаіїда з підвищеною здібністю адгезії до

ГФ) поверхні катетера. На відміну від цих мікробних видів, грамнегативні бацили не показують істотного зчеплення з фібрином і фібронектином. Таким чином, склад, що зупиняє утворення фібрину, був би особливо корисний для о запобігання колонізації арпуіососсі, Сапаїада і т.п. на ділянках постійних катетерів.

Після введення лікарського препарату в організм пацієнта через катетер лікар звичайно здійснює введення 60 промивального розчину, який може включати антикоагулянт, такий як гепарин. Промивальний розчин повинен витіснити лікарський препарат з катетера таким чином, щоб забезпечити доставку всієї дози, і залишитися в деякій кількості в катетері, щоб кров пацієнта не проходила в катетер і не утворювала згусток, який може засмітити отвір катетера. Таким чином, коли катетер знадобиться наступного разу, добре промитий катетер буде повністю вільним і готовим для чергового використання. бо ЇКОоїЇ еї аї., Апіїтісгор. Адепіз СПетоїйег.. 32: 1627-1631 (1988) опублікували дослідження дії в катетерах динатрій-етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА), сполуки, що є добре відомою своїми хелатуючими властивостями іп мімо і що широко використовується в якості антикоагулянту іп міго. У Іпатенті США

Мо5,363,754) описане застосування фармацевтичних композицій суміші міноцикліну ії ЕДТА для підтримки порту Катетера порожнім. У (патенті США Мо5,091,4421 описані трубчасті вироби, такі як презервативи і катетери з протимікробними властивостями, зумовлені введенням в них неійонного слаборозчинного протимікробного препарату, такого як триклозан. Цей протимікробний препарат може бути розподілений у всьому виробі або в його покритті. У (патенті США Мо5,362,754)| описаний фармацевтичний препарат, що включає міноциклін і ЕДТА для підтримки катетера вільним. У (патенті США Мо5,362,754| описане використання суміші міноцикліну і ЕДТА 7/0. «М-ЕДТА) для підтримки порту катетера вільним.

У роботі Ригспазе еї аїЇ., Мерпгоп, 58: 119-20 (1991))| для цієї мети описано використання кальцієвих комплексонів, включаючи цитрат. У Іроботі Вишоміс еї аї., Агійї. Огдапв. 22: 945-7 (1998)| показано, що цитрат і полігелін, що є замінником плазми, який отримують з кісток крупної рогатої худоби, мають однакову ефективність з гепарином в підтримці катетера вільним. У лекції на ЗО-му щорічному засіданні Американського

Нефрологічного Товариства, що відбулося 2-5 листопада 1997 в Антоніо, Техас, Зодетапп еї а). повідомили, що видалення катетерів через інфекцію можна уникнути завдяки постійному застосуванню концентрованої суміші гентаміцина/цитрата.

Однак один з цитратних кальцієвих комплексонів для діалізних катетерів, під маркою ТКІСІТКАБОЇ м, має певні недоліки. Деякі пацієнти скаржаться на короткочасну втрату смакових відчуттів відразу після ін'єкції цитрату. Є недавнє повідомлення РОА (Управління по санітарному нагляду за якістю харчових продуктів і медикаментів, США) про випадок смерті пацієнта незабаром після ін'єкції цитрату для блокування катетера |Зіаз еїг а, Мериго! Оіа! Тгаперіапі Я: 1521-1522 (2001); РОСА випустило попередження по застосуванню антикоагулянту ГіСіїгазої (торгова марка) для діалізних катетерів. ЕОА Таїк Рарег Т00-16,14 Аргії 2000.

У ЦІпатенті США Мо5,019,096)| описані стійкі до інфекції медичні пристрої, що включають синергічну с Комбінацію солі срібла (наприклад, сульфадіазину срібла) і хлоргексидіну. У |(патенті США Мо5,772,640| описані полімерні медичні вироби, що включають антибактеріальні засоби, хлоргексидін і триклозан. У (патенті США о

Мо5,362,754) описане запобігання утворенню глікокаліксу на катетері за рахунок нанесення покриття з ЕДТА і/або міноцикліну, що запобігає бактерійним і грибковим інфекціям. У (патенті США Моб,258,797| описаний спосіб запобігання інфекції або сепсису в системах катетерів і портів шляхом використання протимікробного ою блокуючого розчину тауролідина або таурултама.

У Іпатенті США Моб,166,007| описані протимікробні блокуючі речовини, що включають похідні тауринаміду і о карбонові кислоти і/або їх солі для запобігання інфекції і коагуляції крові всередині або поблизу медичного Га протезного пристрою після введення цього пристрою в тіло пацієнта. У (ЕР 1,040,841) описане запобігання тромбозу і/або бактерійному зростанню на контактуючій з рідиною поверхні системи доставки шляхом - Контактування цієї поверхні з рідиною, що запобігає тромбозу, яка містить антикоагулянт тауролідин і/або Ге) таурултам. У (ЕР 882,461) описаний медичний пристрій, що має як фізіологічну, так і протимікробну активність, який включає основний матеріал і плівкове покриття із зшитого полімеру, утворене на поверхні основного матеріалу, при цьому і фізіологічно активна речовина, і протимікробна речовина пов'язані з плівкою покриття.

У Іпублікації Воогди ей оаі, АБАЮ 3), 46 (6) 767-770 (Мом. 2000) описана додаткова « антибіотична/антикоагулянтна блокуюча терапія при лікуванні бактеріємії, пов'язаної з використанням пристроїв шщ с доступу, що імплантуються підшкірно для гемодіалізу. До пристрою прикріпляють два катетери, які імплантують у й верхню порожнисту вену або праве передсердя. Антибіотична/антикоагулянтна блокуюча терапія включає «» вливання антибіотика і антикоагулянту в пристрій. |Див. також Зспуагі еї аї., доигпа! ої Сіїпіса! Опсоіоду.. 8(9):1591-1597 (1990) і Катаї| еї аіІ., "АМА, 265(18):2364-2368 (1991).

ЇММіегпікомузКі еї аЇ, Ат у). Реадіаїг Нетай! Опсої. 11(2): 137-140 (1991)| показують, що бактеріостатичні о промивальні сольові розчини ефективніше запобігають інфекції катетера, ніж звичайний сольовий розчин.

ЇМегсаідпе еї аїЇ., Рпагтасоїйпегару. 20: 394-9 (2000) оцінювали гепарин в поєднанні з антибіотиками як - блокуючий розчин для запобігання інфекції. У Іроботі Раїеї еї аІ., Тпиготр Нетозві. 82: 1205-6 (1999)| описане ко успішне використання слабкодозованого г-гирудіна для рецидивного тромбозу діалізного катетера у пацієнта з 5р гепарин-індукованою тромбоцитопенією. |Оагоцісйе ей а. Миййіоп. 11(4) (виррі): 265-295 (1997) о повідомляють, що запобігання васкулярної катетер-зумовленої інфекції може бути забезпечене шляхом сл використання протимікробних засобів, що включають застосування місцевих дезінфектантів, таких як хлоргексидін, використання насичених сріблом підшкірних манжет (для СМС короткочасного використання), промивку катетерів комбінацією протимікробних і протитромбозних засобів і нанесення на катетери покриття з антисептичних (хлоргексидін і сульфадіазин срібла) або протимікробних засобів (міноциклін і ріфампін).

Антибактеріальні блокуючі розчини використовуються для очищення катетерів. Наприклад, в (патенті США іФ) Моб,174,537)| описано промивальний розчин для катетерів. |Див. також бЗодегтапп еї а!. Віоса Ригії.. 12: 251-254 ко (2001) відносно СІ ОСКтм і СІ 5; Ше ТОВЕХ; тм Нерагіп ГосК Ріизп Зоішіоп (У/уе(п-Ауеге|); і Непгісквоп еї аІ., У. Сійп Опсої.. І5: 1269-1278 (2000)| про запобігання СМОС-зумовлених інфекцій і тромботичних явищ з бо використанням ванкоміцин/ципрофлоксацин/гепаринового промивального розчину.

СМС з м'якою манжетою, що імплантуються, такі як ОШІМТОМ РЕКМСАТН тм СУС (Оціпіоп Іпвігитепі Со.,

Зеаше, МА), все частіше використовуються у пацієнтів з нирковою недостатністю в термінальній стадії, як засіб постійного доступу. Головними обмеженнями їх застосування, крім інфекцій, є тромбоз і неадекватний кровоток. Для запобігання цим ускладненням звичайно використовують гепарин для заправляння центральних 65 венозних катетерів ОШІМТОМ РЕКМСАТНтм між сеансами діалізу. |ЗспепК еї аїЇ., Атег. 9. Кіапеу Оізеазез. 35: 130-136 (дап. 2000)) показали, що рекомбінантний тканинний активатор плазміногену (П-РА) виявився краще за гепарин для заправляння ОШІМТОМ РЕКМСАТН см між сеансами діалізу. Однак Зспепк еї аїЇ. використали 2мг альтеплази в поєднанні з ЗМУРІ (стерильна вода для ін'єкцій, фармакопея США), що не запобігало зростанню бактерій.

Закупорка або блокування центральних венозних пристроїв доступу (СМАВ)) внаслідок утворення кров'яного згустку (тромбу) всередині або у наконечнику катетера СМАЮ являють собою поширену проблему, яка може перешкоджати застосуванню такого виду терапії у пацієнтів. Оцінки показують, що закупорюються 2595 СМАОЮ, при цьому найбільш поширена етіологія включає тромбоз |Наїге еї аІ., Тиготр. Наетові 72: 543-547 (1994);

Кибіп, У. Сійй. Опсої.. 1: 572-573 (1983); ІоКісп еї аї., У. Сііп. ОпсоїЇ.. 2: 710-717 (1985). В 1994 році 70. Наїге еї а!., вище, провели двічі сліпе, перспективне, рандомізоване випробування урокінази в порівнянні з альтеплазою (ЕРА) в дисфункціональних катетерах, які за даними рентгенографії виявилися закупореними тромбом. Катетери обробляли 2мг альтеплази або 10000Од. урокінази, які залишали в пристрої на 2 години.

Після 1-2 обробок альтеплаза відновлювала функцію більшої кількості катетерів, ніж урокіназа (8995 проти 5995 (р-0,013)). 4 вересня 2001р. Управління США по санітарному нагляду за якістю харчових продуктів і медикаментів (ЕСА) схвалило тромболітичний засіб САТНЕЇ Отм АСТІМАЗЕФ (альтеплаза) І1-РА для відновлення функції СМАЮ, що оцінюється за здатністю відбирати кров. САТНЕГО тм АСТІМАБЕФ 1-РА випускається в 2-мг одноразових ампулах, є єдиним тромболітичним препаратом, що серійно випускається, який застосовується для цієї мети, і пропонує медичним працівникам розумний спосіб обробки при ускладненнях СМАО, які можуть ускладнювати догляд за пацієнтом. Одна ампула САТНЕГО тм (РА містить 2,2мг альтеплази, 77мг І-аргінину, 0,2мг емульгатору РОЇ МУБОКВАТЕ 8Отм і фосфорну кислоту для створення рН -7,3.

Т-РА зв'язували з іншими матеріалами, відмінними від васкулярних катетерів. |Див., наприклад, 2пои еї аІ., У. СопігоЇ Кеїеазе. 55: 281-295 (1998); Сгесо еї ам, Апп Мазе. Зигод. 9: 140-145 (1995) і МУоодпоизе еї а!., Віотаїгегіаів. 17: 75-77 (1996). с

У |патенті США Мо5,688,516) описане використання вибраних комбінацій хелатуючого засобу, антикоагулянту, о або антитромботичного засобу, з неглікопептидним протимікробним засобом, таким як тетрациклінові антибіотики, для утворення покриття медичного пристрою і інгібування інфекції катетера. Переважні комбінації включають міноциклін або інший неглікопептидний протимікробний препарат разом з ЕДТА, ЕГТА, ДТПА, ТТГ, гепарином і/або гірудином в фармацевтично прийнятному розріджувачі. У (патенті США Моб,187,768) також т) описане використання протимікробного засобу і антикоагулянту, антитромботичного засобу або хелатуючого с засобу для підтримки вільними постійних медичних пристроїв, таких як катетери, і для запобігання інфекціям, викликаним зростанням бактерій в катетерах. с

Незважаючи на вищеописані досягнення, існує необхідність в нетоксичному способі видалення «- фібрин-зв'язаних кров'яних згустків з катетерів, зокрема, постійних медичних пристроїв. Також існує необхідність в запобіганні утворення і видалення фібрину з таких пристроїв, оскільки певні бактерії містять г) ділянки скріплення, зокрема, схильні до зчеплення з фібрином.

Даний винахід відноситься до розчинів, унікальних по своїй здатності задовольняти вищеописані вимоги, не заснованих на антикоагуляціонної, протитромботичної або хелатуючої дії і без використання антибіотиків, до « яких ссавці можуть розвивати стійкість. Даний винахід вирішує проблеми, викладені вище, шляхом використання активатора плазміногену в поєднанні з дезінфектантом, що використовується в якості консерванту, в основному, т с органічному спирту, що має цю здатність. Отримана композиція не тільки має фібринолітичну активність, але і ч запобігає зростанню патогенів, зокрема, в закупорених катетерах, і відповідає стандартам ОБР (фармакопея ни США).

Область винаходу викладена в формулі винаходу. Зокрема, в першому аспекті даний винахід відноситься до композиції, що застосовується для видалення фібрин-зв'язаних згустків крові з катетера, який містить воду, (ее) фібринолітично ефективну кількість активатора плазміногену і антисептично ефективну кількість - бактеріостатичного органічного спирту, при цьому композиція не включає хелатуючий засіб.

У наступному аспекті винахід відноситься до комплекту, що складається з кількох відсіків, включаючи, ко відсік, який містить фібринолітично ефективну кількість активатора плазміногену, відсік, який містить воду, о 50 що включає антисептично ефективну кількість бактеріостатичного органічного спирту, при цьому жоден із відсіків не містить хелатуючого засобу, і інструкції по змішуванню вмісту обох відсіків і по використанню сл отриманої суміші для видалення фібрин-зв'язаних згустків крові з катетера, що містить такі згустки крові.

У наступному аспекті винахід відноситься до комплекту, що складається з кількох відсіків, включаючи відсік, який містить від 70,1 до «1Омг/мл ЕРА нативної послідовності або тенектеплази і відсік, який містить воду, що включає від 70,5 до «1,295 (об./о6.) бензилового спирту, ізопропанолу або етанолу, при цьому жоден з

Ге! відсіків не містить хелатуючого засобу, і інструкції по змішуванню вмісту обох відсіків і по використанню отриманої суміші для видалення фібрин-зв'язаних згустків крові з катетера, що містить такі згустки крові. де Переважна кількість бензилового спирту, що є тут переважним спиртом, складає біля 0,8-1,195. Цей діапазон ії більш широкий діапазон 0,5-1,295 достатній для інгібування зростання мікробів, але зберігає стабільність і 60 функцію активатора плазміногену. Перевага цих спиртів полягає в тому, що вони не приводять до розвитку стійкості до антибіотиків.

У наступному варіанті здійснення винахід відноситься до способу видалення фібрин-зв'язаних згустків крові з катетера, що містить такі згустки крові, що включає контактування катетера з вищеописаною композицією щонайменше протягом 5 днів. 65 У наступному варіанті здійснення винахід відноситься до катетера, покритого вищеописаною композицією.

Фіг. показує обрізані хроматограми ЗЕС для розведених зразків П-РА (мг/мл в ВМУРІ, ВМ5З і ЗМУРІ) після 14 днів зберігання при 3723 в скляних пробірках.

Визначення

У даному описі вираз "катетер" відноситься до медичного пристрою, що звичайно виготовляється з Конструкційних полімерів, таких як поліуретан, силікон або інші подібні полімери медичного призначення для доставки ліків і відбору крові. Такі катетери включають широку різноманітність постійних медичних пристроїв, таких як сечовий катетер, васкулярний катетер, зокрема, СМС або периферичний внутрішньовенний катетер, артеріальний катетер, трахеальний катетер, катетер Свана-Ганза, гемодіалізний катетер, пупковий катетер, підшкірний нетунельований силіконовий катетер, тунельований центральний венозний катетер з манжетою, 7/0 підшкірний центральний венозний порт і т.п.

Вираз "васкулярний катетер" відноситься до катетера, що вводиться у васкулярну систему, і включає периферичні катетери і СМС, пристрої з манжетами для тривалого застосування і короткострокового застосування, пристрої без манжет і порти, що імплантуються. СУС, або центральні венозні пристрої доступу (СМАЮ), включають центральні катетери, що вводяться периферично (лінії РІСС), зовнішні пристрої з /5 манжетами, катетери без манжет, нетунельовані і підшкірно нетунельовані катетери, гемодіалізні (НО) катетери і порти.

Переважними катетерами в даному винаході є постійні катетери, такі як СМС, переважно тунельований СМС з манжетою, периферичний внутрішньовенний катетер, артеріальний катетер, катетер Свана-Ганза, гемодіалізний катетер, пупковий катетер, підшкірний нетунельований силіконовий катетер або підшкірний центральний го венозний порт. Також переважним є сечовий катетер або перитонеальний катетер. Крім того, переважними є внутрішньовенний катетер, зокрема, виготовлений з біомедичного поліуретану або силікону, або васкулярний катетер.

Вираз "препарат" або "композиція" тут відноситься до композиції, розчину, складу і т.п., що являє собою суміш інгредієнтів, описаних вище. с

Вираз "контакт", "контактування" і т.п. означають вплив на реагент будь-яким способом, наприклад, шляхом покриття, інкубування і т.д. о

Вираз "покриття", "покритий" і т.д. тут відносяться до вмочення, просочення і/або імпрегнування катетеру композицією, описаною тут.

Вираз "бактеріостатичний органічний спирт" означає органічний спирт, що є дезінфектантом, що (юд

Зо використовується як антисептик, і не класифікується як антибіотик або такий, що відноситься до класу антибіотиків. Дезінфектанти, що є хімічними препаратами, які інгібують або вбивають мікроорганізми, визначені і. в |Вазіс апа Сіїпісаї РПагтасоіоду. 80 еайоп (2001), Зесіоп МІ. СПпетоШегареціїс Огадзе. Спаріег 50. щЩ с

МізсеПапеоиз Апіїтісгоріа! Адепів - Оівіптесіапів, Апіізеріїсв, апа З(іепіапів)|!. Консерванти, являють собою хімічні препарати, що використовуються для запобігання псування препаратів мікробами. Дезінфектанти -

Використовуються як антисептики для запобігання надмірного зростання бактерій і грибків в фармацевтичних со препаратах. Вони повинні бути ефективними в запобіганні зростання мікроорганізмів, які можуть в них міститися, і повинні мати достатню розчинність і стабільність, щоб залишатися активними, як описано в (ЄПепіпоглз МедісаІ! Тохісооду 2па Ей (1997), Зесіоп М. СПетісаів. СПаріег 57. Апіізерііїсв апа

Оівзіптесіапіз| Приклади таких органічних спиртів-антисептиків включають етанол, ізопропанол і бензиловий « спирт, що є тут переважними, при цьому бензиловий спирт найбільш переважний. Бензиловий спирт, що є у с гідрофобним, може руйнувати стінки кліток і мембрани мікроорганізмів, денатурувати білки і інактивувати й ферменти. и? Вираз "бактеріостатична вода для ін'єкцій" або "ВМУРІ" відноситься до суміші води і змінних кількостей бензилового спирту, а також до води, що не містить інших інгредієнтів, по визначенню фармакопеї США (О5Р).

Вираз "стерильна вода для ін'єкцій" або "ЗМУР!" тут означає тільки стерильну воду без інших інгредієнтів. о Вираз "нормальний сольовий розчин" або "М" тут означає суміш води з відповідною кількістю (наприклад, з 0,995 (вага/об.)) хлориду натрію, без інших інгредієнтів.

Вираз "бактеріостатичний нормальний сольовий розчин" або "ВМ5" тут відноситься до стерильної води з ка відповідною кількістю (наприклад, 0,995 (вага./об.)) хлориду натрію і з відповідною кількістю (тобто, 5р антисептично ефективним) бактеріостатичного органічного спирту, такого як бензиловий спирт, без інших о інгредієнтів. 4 Вираз "активатор плазміногену" тут означає фібринолітичний одно- або двухланцюговий активатор плазміногену, включаючи активатор сечового плазміногену в нативній або варіантній формі, тканинний активатор плазміногену в нативній формі, такій як альтеплаза РА АСТТМА5БЕ Ф, або у варіантній формі, такій як /-РА (ретеплаза; КЕТАМАЗЕФ, Сепіосог, Іпс.) і тенектеплаза (інваріант ЕРА, який позначається Т10ОЗ3М, М1170,

К296А, Н297А, К298А, К299А, що випускається під маркою ТМКАБЕ тм компанією Сепепіесі, Іпс. і описаний,

Ф, наприклад, в (патенті США Мо5,612,029)), а також урокіназа (наприклад, АВВОКІМАБЕФ; АрроЮ, яка може ко являти собою існуючу в природі нативну молекулу або варіант урокінази, що має фібринолітичну функцію для розчинення згустків в кров і запобігання накопичення і видалення фібрину. Переважно, активатор плазміногену бо являє собою І-РА нативної послідовності, фібринолітичний варіант Е-РА, урокіназу нативної послідовності або фібринолітичний варіант урокінази. Більш переважно, активатор плазміногену являє собою І-РА нативної послідовності, фібринолітичний варіант Ї-РА або урокіназу нативної послідовності. Ще більш переважно, активатор плазміногену являє собою І-РА нативної послідовності або фібринолітичний варіант ЕРА. Ще більш переважно, варіант ЕРА являє собою тенектеплазу або ретеплазу. Найбільш переважно, активатор плазміногену 65 являє собою І-РА нативної послідовності або тенектеплазу.

Вираз "хелатуючий засіб" тут означає засіб, що використовується для хелатування, такий як етілендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТА), ОМ5ЗА (димеркаптосукцинова кислота), дефероксамін, димеркапрол, цитрат цинку, ТКІСІТКАБОЇ тм (цитратний кальцієвий комплексон), комбінації вісмуту і цитрату, пеніциламін, сукцимер або етідронат. Інші хелатуючі засоби включають етіленгликоль-біс-(бета-аміноетіловий ефір)-М,М,М' М'-тетраоцтову кислоту (ЕСТА) і діетілентриамінпентаоцтову кислоту (ОТРА) і її солі, а також динатрію кальцію едетат, триетілентетраміну дигідрохлорід і речовини, що хелатують двовалентні катіони металів, таких як Са, Ма, Мп, Ре і 2п.

Моделі здійснення винаходу

Даний винахід відноситься до композицій, що використовуються для видалення фібрин-зв'язаних згустків 7/0 Крові з катетера, який містять воду, фібринолітично ефективну кількість активатора плазміногену і антисептично ефективну кількість бактеріостатичного органічного спирту. Композиція не містить хелатуючого засобу.

Вода переважно містить, по-перше, бактеріостатичний органічний спирт. Існує чотири основні типи розріджувачів, що використовуються для розбавлення або розведення лікарських препаратів: ВМУРІ, ЗМУРІ, ВМ і 750 М5. Даний винахід включає тільки бактеріостатичні розріджувачі, тобто, ВМУРІ і ВМ5. Переважно, вода, що містить спирт, являє собою бактеріостатичну воду для ін'єкцій або бактеріостатичний нормальний сольовий розчин. рН композиції, що описується тут, повинна бути придатною для біологічного використання. Звичайно композиція або розчин по даному винаходу має рН в діапазоні від «З до 7, переважно від «3,5 до 6,5 і найбільш переважно від 54,5 до 6,5. Композиція звичайно має фізіологічний рівень рН. Якщо необхідно, рН може бути відрегульована доданням кислоти або основи, наприклад, мінеральної кислоти, такої як соляна кислота, або, переважно, кислоти, що не викликає ацидоз, такий як оцтова, яблучна або молочна кислота. Інші способи регулювання рН, відомі фахівцям, також можуть бути використані.

Тест для з'ясування, чи є кількість активатора плазміногену в композиції фібринолітично ефективною, може с бути проведений, наприклад, шляхом іп мйго аналізу розчинення згустку, наприклад, як описано нижче в

Прикладах. і)

Антисептично ефективна кількість спирту може бути визначена, наприклад, шляхом тесту на протимікробну ефективність, викладеного нижче в Прикладах. Переважно, кількість активатора плазміногену складає біля 0,1-10мг/мл, а антисептично ефективна кількість органічного спирту переважно складає біля 0,5-1,295 (об./об.). ю

Більш переважно, фібринолітично ефективну кількість активатора плазміногену складає біля 0,3-5 мг/мл, ще більш переважно біля 0,5-4мг/мл, і найбільш переважно біля 1-Змг/мл. Найбільш переважна кількість і. органічного спирту складає біля 0,8-1,1965 (об./об.). Га

Композицію по винаходу переважно піддають умовам, в яких будь-які мікроорганізми, що містяться в ній стають по суті нежиттєздатними, і заповнюють нею ємність, що герметизується, таку як шприц, пробірку із -- з5 закритою мембраною або ампулу, по суті стійку до проникнення мікроорганізмів. Переважно, ємність, що Ге) герметизується містить аліквоту промивального розчину, достатню для виконання однієї процедури промивки катетера. Для спеціальних цілей може бути переважна загальна ємність, що містить достатню кількість розчину для дозування кількох аліквот, призначених для окремих процедур промивки катетера.

Спосіб промивки внутрішньовенного катетера включає приготування змішаного розчину, описаного вище, і « Контактування катетера з таким розчином щонайменше протягом двох годин. Спосіб включає заповнення 8 с маніпуляційного рідинного пристрою, переважно шприца, аліквотою розчину, достатньої для виконання й процедури промивки катетера. Переважна кількість для промивальної процедури звичайно складає від 1 до Змл. «» Потім виконавець фіксує шприц в цільовому інтраваскулярному катетері, що вимагає промивки, і вводить розчин в катетер, таким чином виконуючи процедуру промивки.

Описаний спосіб може бути використаний для видалення наявних згустків крові практично з будь-якого о тунельованого або нетунельованого катетера. Як частина режиму обслуговування катетера, промивка катетера а найбільш переважно повинна виконуватися з використанням композиції, описаної тут, наприклад, раз в тиждень, один раз в 4 дні, один раз кожні два дні, раз в день (приблизно кожні 24 години), два рази в день, кожні ка чотири години або з потреби, відповідно до потреб пацієнта, відомих досвідченому практикуючому лікареві. 5р Режим промивки катетера може просто перебувати в одній промивці при кожній зміні катетера. У переважному о варіанті здійснення способу катетер повинен промиватися частіше, з 4-ч-асовими інтервалами, композицією, сл описаною тут.

Хоч спосіб по винаходу відноситься до введення композиції в катетери, вже встановлені на цільовій ділянки, досвідченим фахівцям буде зрозуміло, що контактування або покриття катетера композицією поза тілом пацієнта може запобігти відкладенню фібрину на такій поверхні після імплантації катетера і скоротити ділянки бактерійного зростання. Таким чином, поверхні катетерів, наприклад, гемодіалізних катетерів, можуть бути іФ) заздалегідь оброблені композицією, що описується тут. Катетер може бути оброблений композицією заздалегідь, ко а після введення може зазнавати періодичних промивок.

Приватні приклади катетерів, які можуть бути виготовлені і покриті композицією по винаходу, перелічені бо вище. У способі покриття активатор плазміногену, вода і спирт використовуються в таких кількостях, щоб їх комбінація в обробленому виробі мала істотну фібринолітичну і антисептичну активність. В одному з варіантів здійснення катетер являє собою поліуретановий або силіконовий катетер (або виготовлений з подібних полімерів), оброблений (тобто, шляхом вмочення або просочення) просочувальним розчином, описаним вище.

Потім поверхню катетера, що представляє інтерес, піддають впливу композиції протягом періоду часу, 65 достатнього для утворення композицією плівки або покриття на контактуючій з нею поверхні пристрою. Оскільки композиція являє собою рідину, вона повинна висохти на поверхні пристрою протягом достатнього часу для утворення плівки.

Кількість описаної тут композиції що вводиться в катетер, має вистачати для його заповнення. Такі пристрої, якщо вони є гемодіалізними катетерами, звичайно мають внутрішній об'єм в діапазоні від 70,1 до «-1Омл. Ці цифри, безумовно, будуть варіюватися в залежності від довжини і діаметру трубки пристрою, які, серед іншого, можуть залежати від розміру тіла пацієнта.

Якщо з катетера треба видалити фібрин-зв'язані згустки крові, катетер може контактувати з розчином, описаним тут, протягом щонайменше 5 днів, переважно біля 6-15 днів.

У наступному варіанті здійснення винахід відноситься до комплекту або пакету. У одному з варіантів, 7/0 Комплект або пакет включає контейнерний пристрій, такий як шприц з відсіками, що включає щонайменше два окремих відсіки. Один відсік або контейнер містить фібринолітично ефективну кількість активатора плазміногену, такого як І-РА, а другий відсік або контейнер містить воду, що включає антисептично ефективну кількість бактеріостатичного органічного спирту. Як і композиція, жоден відсік не містить хелатуючого засобу.

Пакет також включає інструкції по змішуванню вмісту обох відсіків і по використанню отриманої суміші для /5 видалення фібрин-зв'язаних згустків крові з катетера, який містить такі згустки крові. -РА може мати форму сухого ліофілізованого порошку, який потім розводять водою для отримання зручного для використання розчину.

Комплект може включати додатковий контейнер, адаптований для прийняття вмісту двох відсіків. Пакет, описаний тут, може являти собою комплект, в якому кожний відсік є окремим контейнером, таким як пробірка або ампула, або пакет може являти собою шприц з кількома відсіками.

Різні особливості Її аспекти винаходу додатково представлені в прикладах, описаних нижче. Оскільки ці приклади приведені лише для ілюстрації використання винаходу в межах його області, вони не повинні розглядатися як обмежуючі область винаходу. Всі приведені тут літературні джерела включені в дану заявку у вигляді посилань.

Приклад 1 (Порівняльний) сч

Короткий опис

Тест, описаний нижче, проводили для оцінки протимікробних властивостей 2мг/мл Ї-РА АСТІМАЗЕ Ф, (8) розведеного в ЗМУРІ. Цей зразок показав невідповідність вимогам тесту на протимікробну ефективність ОБР.

Тест на протимікробну ефективність ОБР

Цей тест використовують для оцінки ефективності антисептика в препараті або для оцінки власної ю зо протимікробної здатності активного інгредієнту. Цей тест описаний в (ОБР 24, "Місгоріоіодіса! Тевів/(51)

Апіітісгоріа! ЕПесіїмепевзв Тевііпо, стор.1809-18111. о

А. Матеріали і основне обладнання с 1. Пробні мікроорганізми включали ЕзсПегіспіа соїї, АТСС 8739, Рзепдотопаз аегидіпоза, АТСС 9027, еарпуіососсив ацгеивз, АТСС 6538, Сапаїйда аірісапз, АТОС 10231, і Азрегойизпідег, АТСС 16404. -- 2. Середовища, добавки і основне обладнання включали: со

Соєво-триптиказний агар (ТА)

Декстрозний агар Сабуро (ЗОБА)

Сольовий розчин, буферізований фосфатом (РВ5), стерильний, рН 7,2--0,2

Тільні 50-мл конічні пробірки «

Стерильні тампони і серологічні піпетки шщ с Спектрофотометр й Лічильник колоній мікроорганізмів, Оцебрес або еквівалентний и? Термостати при 2-82С,22,5-2,590, і 32,5--2,5960

В. Методика 1. Отримання інокуляту: (оо) Готували суспензію кожного мікроорганізму для отримання приблизної концентрації 17 х108 - колоніеутворюючих одиниць (СЕШ)умл. Кожну з п'яти конічних пробірок, що містять 1Омл зразку, інокулювали 0,Оо5мл одного з пробних мікроорганізмів з отриманням вихідної концентрації від 1 хХ105СРШ/мл до 1хХ106СЕШ/мл ко тестового препарату. Вихідну популяцію життєздатних організмів в кожному тестовому препараті розраховували сю 50 на основі концентрації мікроорганізмів в кожному стандартизованому інокуляті методом Роиг Ріад(е (глибинного посіву). Цей метод являє собою стандартну мікробіологічну методику визначення кількості мікроорганізмів у сл тестовому зразку. Тестовий зразок розбавляють стерильним сольовим розчином і відмірюють піпеткою в стерильну чашку Петрі. Потім в чашку Петрі наливають розплавлений агар (поживну середу), змішують із зразком і інкубують при стандартизованій температурі і часі. Цей метод забезпечує отримання колоній, які формуються у всьому агарі - не тільки на поверхні. о Біля 10мл зразка залишили неінокульованим в одній конічній пробірці як негативний контрольний досвід. При

Т 2 7 днів, 14 днів і 28 днів популяцію кожного мікроорганізму в інокульованих зразках і в негативному ко контрольному досвіді визначали методом глибинного посіву - підтвердженим методом чашкового підрахунку мікроорганізмів. Умови інкубації для методу глибинного посіву представлені в Табл. 1. 60 2. Перевірка достовірності методу глибинного посіву:

Провели серію розведень зразка 1:10 і 1:100 з отриманням розбавлених концентрацій. 1-мл порцію кожної розбавленої концентрації зразка ввели в кожну з 5 чашок Петрі. Для кожної розбавленої концентрації зразка у відповідну чашку Петрі додали 0,1-мл аліквоти, що містить біля 1Х103СЕШО/мл кожного пробного мікроорганізму.

Паралельно той же об'єм інокуляту кожного мікроорганізму ввели в кожну з двох пластин без розбавлених 65 концентрацій зразка для підтвердження кількості мікроорганізмів. 15-20-мл порції розплавленого агару, що підтримується при «-459С, додали в кожну чашку і обережно перемісили вміст круговими рухами. Чашки залишили для твердіння і інкубували, як показано в Табл.1.

З. Приготування зразка 10мл зразка ввели в кожну з п'яти пробірок. Кожну пробірку позначили "ЕС", "РА", "БА", "СА" або "АМ", так

Щоб для кожного пробного мікроорганізму була призначена одна пробірка. 1Омл зразка ввели в одну пробірку, позначену як негативний контрольний досвід. У альтернативному варіанті, на етапах введення і маркірування в кожну пробірку вводили 2Омл зразка. 4. Визначення біонавантаження

З використанням негативного контрольного досвіду визначали біонавантаження зразка методом глибинного 7/о посіву. Використали умови середовища і інкубації, представлені в Табл.1. 5. Інокуляція зразка

О,О5мл кожної суспензії мікроорганізму інокулювали при 1хХ108СРШ/мл у відповідну пробірку, що містить 1Омл зразка. Об'єм суспензіонного інокуляту становив 0,595 об'єму зразка. Суміш ретельно перемісили шляхом струшування. Кінцева концентрація тестового препарату склала біля 5,0 Х1О05СЕО/мл. У альтернативному 75 варіанті, якщо в кожній пробірці був використаний об'єм 20мл зразка, на етапі інокуляції вводили О,їмл кожної пробної суспензії. 6. Підтвердження вихідної концентрації

Чашковий підрахунок для кожного стандартизованого інокуляту (1,0 х108СЕШО/мл) виконували методом глибинного посіву. Використали умови середовища і інкубації, представлені в Табл.1. Чашковий підрахунок виконували в двох примірниках з отриманням середнього значення для кожного стандартизованого інокуляту.

Вихідну концентрацію кожного пробного мікроорганізму у тестовому препараті розраховували з використанням наступного рівняння: х 1 й сч де

З - середня концентрація мікроорганізму в стандартизованій суспензії (1,0х ТО3СЕО/мл) о

І х об'єм інокуляту (0,05мл)

Р - об'єм тестового препарату (1Омл) 7. Зберігання зразків і тестові інтервали ю

Інокульовані контейнери і негативний контрольний досвід інкубували при 22,5-2,52С із захистом від світла.

З кожного контейнеру відбирали зразки через проміжки часу, вказані в Табл.2. Чашковий підрахунок Шк інокульованих зразків і негативного контрольного досвіду проводили методом глибинного посіву. Чашковий с підрахунок виконували в двох примірниках. Використали умови середовища і інкубації, представлені в Табл.1. - зв со « з з с їз» со а Тов едн я дня звдчь, по ОБР (бактерії. дріжджові плісняві тиви МА ХАМА Я АК з ПовР(атєй 0000000000вікя коі ко я сг По ЕР дріжджові плісняви 00А МАМА Я Я с

С. Критерії відповідності

Ф, 1. Для достовірності випробування пробними мікроорганізмами концентрація пробних мікроорганізмів в ко кожному тестовому препараті складала від їх105СРО/мл до 1х106СЕШМ/мл. У зразках, випробуваних перевіреним методом чашкового підрахунку мікроорганізмів, виявленого біонавантаження не було. 60 2. Для достовірності методу чашкового підрахунку мікроорганізмів середнє підраховане значення здобутого інокуляту при кожному рівні розведення повинно бути більше або рівним 5095 середнього значення для відповідного контрольного досвіду. Якщо середнє підраховане значення отриманого інокуляту при розведенні складає менше ніж 5090, всі підраховані значення при цьому розведенні вважаються недостовірними. р. Інтерпретація 65 1. По О5Р

Для бактерій має спостерігатися зниження по шкалі десятеричного логарифму не менше 1,0 відносно вихідної підрахованої кількості через 7 днів, не менше 3,0 відносно вихідної кількості через 14 днів, а через 28 днів не повинно бути збільшення відносно кількості, визначеної через 14 днів.

Для дріжджових і пліснявих грибів не повинно бути збільшення відносно вихідної підрахованої кількості

Через 7, 14 і 28 днів. "Відсутність збільшення" означає не більше 0,5 логарифмічних одиниць вище попередньої виміряної величини. 2. По ЕР

Критерії оцінки протимікробної активності для парентеральних препаратів представлені в Табл.3 у вигляді логарифмічного зниження кількості життєздатних мікроорганізмів відносно величини, отриманої для інокуляту. 11111110 легарифмчнезнижевння.у//////77777111111111111111 010окритеой 177167 71г1111тане | ляднв 0 овднв/ то обатевї 111ГА112131101111311м

Батевї 11811113 1м бим о ///1А11111128111м тиви ///1В1111м 7 досягнутим, наприклад, через підвищений ризик негативних реакцій, має бути задоволений критерій В.

Тест з ЕРА АСТІМАЗЕФ і ЗМУЕТ с

А. Матеріали. обладнання і методика о

Зразок являв собою 2 г/мл ЕРА альтеплазу АСТІМАЗЕЄ в пробірці з ЗМУРІ, що не містить бензилового спирту.

Пробні мікроорганізми і всі середовища, добавки і основне обладнання відповідали переліченим для попереднього тесту. Методика відповідала методиці, описаній для попереднього тесту, а умови інкубації - приведеним в Табл.1. Критерії відповідності і інтерпретація відповідали описаним для попереднього тесту. що)

Результати со

Розраховані вихідні концентрації пробних мікроорганізмів в кожному тестовому препараті становили від 1х105СЕШ/мл до 1хХ106СЕШ/мл (Табл.4). с

У зразках, перевірених методом глибинного посіву, наявного біонавантаження не було (Табл.б). «-

Метод чашкового підрахунку був підтверджений з використанням методу глибинного посіву. Середнє значення вилікуваного інокуляту при розведенні зразка 1:10 було більше або рівно 5095 середнього значення со відповідного контрольного досвіду (Табл.б).

Для Р. аегадіпоза і 5. ашгеиз логарифмічне зниження відносно розрахованої вихідної концентрації було більше або дорівнює величині 1,3 через 7 днів, менше 3,0 через 14 днів і більше або дорівнює 3,6 через 28 « днів (Табл. 7 і 8). З 70 Для дріжджових і пліснявих грибів логарифмічне зниження відносно розрахованої вихідної концентрації було с більше або дорівнює 0,6 через 7 днів, більше або дорівнює 1,0 через 14 днів і більше або дорівнює 1,6 через

Із» 28 днів (Табл. 7 і 8). 75 со - ю ще с зв щі ю «С ЗНИННИ ПО ня НО нн во /1111о1111111111111111гкю 60 мікроорганізм |інокульоване 1710 (о) бо Р. аегидіпоза 65 АВ 74 й й

Пробний мікроорганізм сч о

Аспдвт 1111061 ло | ле

Висновок юю

У бактерійному тесті на протимікробну ефективність даний зразок показав невідповідність вимогам О5Р. с

Зразок показав логарифмічне зниження відносно розрахованої вихідної концентрації «1,0 через 7 днів для Е. соїї. Через 14 днів логарифмічне зниження мікроорганізмів у всіх трьох бактерійних тестах становило «3,0. Для с дріжджових і пліснявих грибів через 7, 14, і 28 днів не було збільшення відносно розрахованого вихідного «- значення.

Зо Приклад 2 со

Короткий опис

Тестування проводили, як описано вище для протимікробної ефективності, для оцінки ефективності 0,895 бензилового спирту в якості антисептику в 2мг/мл ЕРА АСТІМАЗЕ Є відповідно до вимог ОЗР. Цей зразок « показав відповідність вимогам тесту ОР на протимікробну ефективність.

Матеріали, обладнання і методика о) с Зразок являв собою РА АСТІМАБЕ 9 (2мг/мл) в пробірці з 0,895 бензилового спирту. Зокрема, » роздріджувачем служила стерильна вода з додаванням відповідної кількості бензилового спирту до кінцевої концентрації 0,890.

Пробні мікроорганізми відповідали описаним в Прикладі 1.

Середовища, добавки і основне обладнання відповідали описаним в Прикладі 1. со Методика, що використовується відповідала описаної в Прикладі 1, а умови інкубації відповідали вказаним в - Табл.1. Критерії відповідності і інтерпретація відповідали описаним в Прикладі 1.

Результати ю Результати були ідентичними наведеним в Табл.4 і Табл.5 для розрахованої вихідної концентрації пробних оз 20 мікроорганізмів в кожному тестовому препараті (від 1х105 до 1хХ109СЕО/мл) і для біонавантаження в зразку в методі глибинного посіву (відсутність наявного біонавантаження). Метод чашкового підрахунку мікроорганізмів сл підтверджували з використанням методу глибинного посіву. Середня кількість отриманого інокуляту при розведенні зразка 1:10 було більше або рівно 5095 середнього значення відповідного контрольного досвіду (Табл.9). Для бактерій логарифмічне зниження відносно розрахованої вихідної концентрації було більшим 3,3 59 через 7 днів і більше 4,3 через 14 і через 28 днів (Табл. 10 і 11). Для дріжджових і пліснявих грибів

ГФ) логарифмічне зниження відносно розрахованої вихідної концентрації було більшим або дорівнювало 3,1 через 7 з днів і більше 4,6 через 14 і через 28 днів (Табл. 10 і 11). во мікроорганізм інокульованого 1710 (о)

Боветаляа! 06010119 бе 17800086 бо 8. айгецв 43 55 129 о

Пробний мікроорганізм сч о

Висновок

Цей зразок показав відповідність вимогам тесту ОР на протимікробну ефективність.

Приклад З т)

Короткий опис со

Тестування проводили, як описано вище для тесту на протимікробну ефективність, для оцінки ефективності 0,995 бензилового спирту в якості антисептику в 2мг/мл ЕРА АСТІМАЗЕ ОО відповідно до вимог ОБР. Цей зразок с показав відповідність вимогам тесту ОР на протимікробну ефективність. «-

Матеріали, обладнання і методика

Зо Зразок являв собою РА АСТІМАБЕ 9 (2мг/мл) в пробірці з 0,995 бензилового спирту. Зокрема, со розріджувачем була стерильна вода з додаванням відповідної кількості бензилового спирту до кінцевої концентрації 0,990.

Пробні мікроорганізми відповідали описаним в Прикладі 1. «

Середовища, добавки і основне обладнання відповідали описаним в Прикладі 1.

Методика, що використовується відповідала описаної в Прикладі 1, а умови інкубації відповідали вказаним в о, с Табл.1. Критерії відповідності і інтерпретація відповідали описаним в Прикладі 1. "» Результати " Результати були ідентичними наведеним в Табл.4 і Табл.5 для розрахованої вихідної концентрації пробних мікроорганізмів в кожному тестовому препараті (від 1їх10? до 1х109 СЕШ/мл) і для біонавантаження в зразку в методі глибинного посіву (відсутність наявного біонавантаження). Метод чашкового підрахунку мікроорганізмів со підтверджували з використанням методу глибинного посіву. Середня кількість отриманого інокуляту при - розведенні зразка 1:10 було більше або рівно 5095 середнього значення відповідного контрольного досвіду (Табл.12). Для бактерій логарифмічне зниження відносно розрахованої вихідної концентрації було більшим 3,3 о через 7 днів і більше 4,3 через 14 і через 28 днів (Табл. 10 і 11). Для дріжджових і пліснявих грибів о 20 логарифмічне зниження відносно розрахованої вихідної концентрації було більшим або дорівнювало 3,6 через 7 сл днів і більше 4,6 через 14 і через 28 днів (Табл. 10 і 11). і о мікроорганізм інокульованого 1710 (о) еаешотоа! 6511111 з во бант 00008616 дв

Пробний мікроорганізм Вихідна розрахована кількість (СЕРШ/мл)/7 днів (СРО/мл) 14 днів (СРО/мл) 28 днів (СЕО/мл)

; ді

Пробний мікроорганізм

Висновок

Цей зразок показав відповідність вимогам тесту ОР на протимікробну ефективність.

В одному з пропонованих способів заправлення розчин САТНЕГ О тм АСТІМАЗЕЄ (альтеплази), отриманий шляхом розведення 2,2мг ліофілізованого порошку 2,2мл 0,995 бензилового спирту в стерильної бактеріостатичній воді для ін'єкцій (концентрація мг/мл) може бути введений усередину васкулярного катетеру сч в обсязі, рівному заправному обсягу порожнини катетера. Потім розчин може бути аспірирован з катетераперед.йї /() використанням катетера в медичних цілях

Приклад 4

Короткий опис зо Тестування проводили, як описано вище для тесту на протимікробну ефективність, для оцінки ефективності й 1,095 бензилового спирту в якості антисептику в 2мг/мл РА АСТІМАЗЕФ відповідно до вимог ОБР. Цей зразок. с показав відповідність вимогам тесту ОР на протимікробну ефективність.

Матеріали, обладнання і методика сч

Зразок являв собою АСТІМАЗЕ Ф (1-РА (2мг/мл) в пробірці з 1,095 бензилового спирту. Зокрема, «- роздріджувачем служила стерильна вода з додаванням відповідної кількості бензилового спирту до кінцевої концентрації 1,090. со

Пробні мікроорганізми відповідали описаним в Прикладі 1.

Середовища, добавки і основне обладнання відповідали описаним в Прикладі 1.

Методика, що використовується відповідала описаної в Прикладі 1, а умови інкубації відповідали вказаним в « дю Табл.1. Критерії відповідності і інтерпретація відповідали описаним в Прикладі 1. з

Результати с Результати були ідентичними наведеним в Табл.4 і Табл.5 для розрахованої вихідної концентрації пробних :з» мікроорганізмів в кожному тестовому препараті (від 1х10? до 1Х106СЕШ/мл) і для біонавантаження в зразку в методі глибинного посіву (відсутність наявного біонавантаження). Метод чашкового підрахунку мікроорганізмів підтверджували з використанням методу глибинного посіву. Середня кількість отриманого інокуляту при о розведенні зразка 1:10 було більше або рівно 5095 середнього значення відповідного контрольного досвіду (Табл.15). Для бактерій логарифмічне зниження відносно розрахованої вихідної концентрації було більшим 3,3 - через 7 днів і більше 4,3 через 14 і через 28 днів (Табл. 16 і 17). Для дріжджових і пліснявих грибів г логарифмічне зниження відносно розрахованої вихідної концентрації було більшим або дорівнювало 4,1 через 7 днів і більше 4,6 через 14 днів (Табл. 16 і 17). (95) сл мікроорганізм інокульованого 1710 (о)

Бовежлюя! 06601011111111118511111111010118 о з 60 65 Р. аегидіпоза 3,9х109 «100 10 «10

; то

Пробний мікроорганізм з

Висновок 20 Цей зразок показав відповідність вимогам тесту ОР на протимікробну ефективність.

Приклад 5

Короткий опис

Тестування проводили, як описано вище для тесту на протимікробну ефективність, для оцінки ефективності 1,195 бензилового спирту в якості антисептику в 2мг/мл ІРА АСТІМАЗЕФ відповідно до вимог ОЗР. Цей зразок. СМ 25 показав відповідність вимогам тесту ОБР на протимікробну ефективність. о

Матеріали, обладнання і методика

Зразок являв собою АСТІМАЗЕ 4 РА (2мг/мл) в пробірці з 1,195 бензилового спирту. Зокрема, розріджувачем була стерильна вода з додаванням відповідної кількості бензилового спирту до кінцевої концентрації 1,190. о 30 Пробні мікроорганізми відповідали описаним в Прикладі 1. со

Середовища, добавки і основне обладнання відповідали описаним в Прикладі 1.

Методика, що використовується відповідала описаної в Прикладі 1, а умови інкубації відповідали вказаним в с

Табл.1. Критерії відповідності і інтерпретація відповідали описаним в Прикладі 1. «-

Результати

Зо Результати були ідентичними наведеним в Табл.4 і Табл.5 для розрахованої вихідної концентрації пробних со мікроорганізмів в кожному тестовому препараті (від 1х10? до 1Х106СЕШ/мл) і для біонавантаження в зразку в методі глибинного посіву (відсутність наявного біонавантаження). Метод чашкового підрахунку мікроорганізмів підтверджували з використанням методу глибинного посіву. Середня кількість отриманого інокуляту при « розведенні зразка 1:10 було більше або рівно 5095 середнього значення відповідного контрольного досвіду 7 (Табл.18). Для бактерій логарифмічне зниження відносно розрахованої вихідної концентрації було більшим 3,3 с через 7 днів і більше 4,3 через 14 і через 28 днів (Табл. 16 і 17). Для дріжджових і пліснявих грибів "з логарифмічне зниження відносно розрахованої вихідної концентрації було більшим або дорівнювало 3,6 через 7 днів і більше 4,6 через 14 і через 28 днів (Табл. 19 і 20). ще со з мікроорганізм інокульованого 1710 (о) ю с» сл о ю бо б5 й о

Висновок

Цей зразок показав відповідність вимогам тесту ОР на протимікробну ефективність.

Приклад 6

Короткий опис

Альтеплазу (2мг/пробірку ПАРА) розводили до мг/мл ВМУРІ, ВМ і 5МУРІ. Стабільність протеїну після розведення в скляних пробірках спостерігали при 37 2С протягом 2 тижнів. Після 14 днів збереження при 37 С усі розведені розчини зовні залишалися прозорими і безбарвними. Концентрації протеїну (1,1 --0,02 мг/мл) і рн (Т.2-0,03) не змінилися. Зміст мономера за даними нативної гель-проникаючої хроматографії показав поступове зниження 1-395 і 4-595 через один і два тижні, відповідно, при 372С. Зниження відсотка одиночних ланцюгів і фібринолітичної активності (іп міо) спостерігалося через 1 тиждень при 37 2С. Однак відсоток одиночних ланцюгів і фібринолітична активність (іп міго) різко знизилися через 14 днів при 372С. Для протеїнового розчину, розведеного 5МУРІ, спостерігалася більша кількість протеолітичних обрізків молекули, ніж при розведенні ВУУРІ Ге чи ВМ5. Таким чином, альтеплаза (2мг/пробірку ПАРА), розведена ВМУРІ, ВМЗ чи ЗМУРІ до 1мг/мл була відносно о стабільною при 372С протягом 1 тижня.

Матеріали і методика

А. Матеріали - Альтеплаза (2-мг пробірка п-РА) т) - ВМУРІ, ОБР, 20мл (АБрої) со - бактеріостатичний 0,995 хлорид натрію (вага./про.) (ВМ5) для ін'єкцій, стандарт ОБР, 20мл (Аррої) - ЗМУРІ, стандарт ОБР, 20мл (АБрої) с

В. Методика «-

Альтеплазу (2мг/пробірку пП-РА) розводили до Тмг/мл ВМУРІ, ВМ5 чи ЗМУРІ (у двох екземплярах). Розведені протеїнові розчини зберігали при 372С. Стабільність розведених протеїнових розчинів після збереження (2,0) протягом З годин, 7 днів і 14 днів при 372С оцінювали шляхом аналізів, описаних нижче.

Для визначення кількості часток за допомогою аналізатора НІ АС/КОМСО проводили окремий експеримент.

Альтеплазу (2-мг ПАРА) розводили ВМУРІ, ВМ5 чи ЗМУРІ (у двох екземплярах) до 1мг/мл. Чотири пробірки на групу « для кожної тимчасової точки об'єднали разом в одній пробірці (Зд-мл скляна пробірка приладу). Визначення кількості часток (добір зразків З Х 1 мл, перший прогін не враховується) проводили при Т - 0 годин, З години, но) с 7 днів і 14 днів після збереження при 3720. з» С. Аналітичні показники (1) Колір і прозорість. Кожен зразок у скляній пробірці досліджували у світловому боксі, оснащеному чорним і білим фоном. Відповідно, записували колір і прозорість зразків. (2) НІАС/КОУСО. Для виміру поєднували чотири пробірки з розведеним протеїновим розчином. Процедуру

Ме аналізу твердих часток для кожного з парентеральних препаратів малого обсягу проводили з тією модифікацією, - що обсяг зразка їмл тестували з використанням 1-мл шприцу замість 5-мл обсягу при використанні 10-мл шприцу. Записували кількість часток, яка була визначена в діапазоні розмірів »10 і 5х25мкм. о (3) рН. Визначали рН вибіркових аліквот з використанням рН-метру КАРІОМЕТЕК РНМ 93 м, оснащеного (95) 20 комбінованим рН-електродом (МісгоеІесігодез, Іпс.). рН-метр стандартизували стандартними буферами з рН 4,01 сл і 7,00 (МаїїпсКгодії, Іпс.). Аліквоти 20мкл переносили для виміру в 0,5-мл пробірку Еппендорфа. (4) Концентрації, що визначалися методом УФ-поглинання. Концентрації протеїну визначали шляхом

УФ-поглинання при 280нм. Використовували спектрофотометр (НР8253А) на основі діодної матриці ОМЛ/ІЗ із кварцовою кюветою (довжина оптичного шляху 1см) для виміру. Зразки розбавляли в 10-12,5 разів складеним буфером. Вимір проводили в порівнянні з відповідним еталоном і при УФ-скануванні від 240 до 4О0Онм.

ГФ) Концентрації протеїну розраховували в такий спосіб:

ГФ Конц., мг/мл - (А280-АЗ20)/1,9, де 1,9 - оптична густина (мл/мг-см) пП-РА при 280нм. (5) 95 мономера, визначений нативною ЗЕС. Колонку ТЗК ЗО0005МУХІ тм (ТозоНааз, 300Х7,5мм внутр. діам., во 5-мкм) використовували для рідинної хроматографії НР 1090 тм (ЖХ), у сполученні з детектором на основі діодної матриці. Рухлива фаза включала О0,2М аргініни, 0,12М сульфату амонію, 1095 ізопропанола, рН 7,3.

Швидкість потоку складала Тмл/хв. Зразки (5Омкг гп-РА-еквівалента) вводили в одному екземплярі і збирали хроматограми з виявленням при 28Онм. Відсоток мономера розраховували в такий спосіб: домономера-(площа піка мономера/загальна площа піка протеїну)х100 65 (б) 96 одиночних ланцюгів, визначений скороченою ЗЕС. Використовували колонку ТК ЗО0О00О5МУХІ тм (ТозоНааз, 300Х7,5-мм внутр. діам., 5-мкм) для ЖК НР 1090 тм, у сполученні з детектором на основі діодної матриці. Рухлива фаза включала О0,.2М фосфат натрію, 0,190 505 (додецилсульфат натрію), рН 6,8. Швидкість потоку складала мл/хв. Зразки (12,5мкг г-РА-еквівалента) інкубували з 20мМ ОТ (кінцева концентрація) при 372С протягом 3-5 хвилин і інжектували в одному екземплярі. Хроматограми спостерігали з виявленням при 214нм. Відсоток одиночних ланцюгів (ЗС) розраховували в такий спосіб: доЗС-(площа першого головного піка/сума площ першого і другого головних піків)х 100. (7) Активність розчинення очищеного згустку (фібринолітична активність) для п-РА. Ефективність протеїну оцінювали шляхом аналізу розчинення очищеного згустку (тромбу), описаного нижче в Прикладі 7. Зразки розбавляли в аналітичному діапазоні (200-100Онг/мл) з одержанням двох концентрацій у розріджувачі. 70 Розведення виконували за день до аналізу, і розведені зразки зберігали при 2-82С до проведення аналізу наступного дня. Еталонний матеріал п-РА розбавляли подібним чином як внутрішній еталон.

Результати

Результати дослідження показані в Табл. 21 і 22. Через 14 днів збереження при 372 усі розведені розчини виглядали прозорими і безбарвними. Концентрації протеїну (1,1 ї0,02мг/мл) і рН (7,2-0,03) залишилися 75 незмінними. У Табл.21 показана кількість часток, визначена за допомогою НІАС/КОУСО, в альтеплазі (2мг/пробірку п-РА, п-1) при розведенні ВМУРІ, ВМ5 ії 5МУРІ до мг/мл, після збереження при 3720. У таблиці показане збільшення кількості часток (з розміром 210 і 25мкм) для всіх протеїнових розчинів після розведення, у порівнянні з одним розріджувачем. Однак усі результати знаходяться в межах норм, припустимих по О5Р для ін'єкцій малого обсягу (ЗМІ, див. Табл.23). Спостерігалося деяке зниження кількості часток для розведеного лікарського засобу після збереження при 37 2С. Крім того, отримана кількість часток виявилася більш низьким для протеїнових розчинів, розведених ВМУРІ і ВМ5, ніж для протеїнових розчинів, розведених ЗМУРІ.

Усі розведені розчини містили 94-9595 мономера через 14 днів при 372С (Табл.22). Тести на 95 одиночних ланцюгів і фібринолітичну активність (іп міго) показали зниження через один тиждень при 372С. 95 одиночних ланцюгів виявився вище для протеїнових розчинів, розведених ВМУРІ чи ВМ5, ніж для протеїнових розчинів, сч розведених ЗМУРІ. Не вдаючись у теорію, це можна пояснити присутністю антисептика, який інгибує о протеолітичну активність. Через два тижні при 372 відсоток одиночних ланцюгів для протеїнових розчинів, розведених 5МУРІ, упав до «5095, що нижче показника стабільності (»55905) для одиночних ланцюгів у П-РА.

Крім перетворення одного ланцюга в два, хроматограми скороченої ЗЕС для розведених протеїнових ю зо розчинів через 2 тижні при 372С показали присутність обрізків/фрагментів молекул, що припускає збільшення протеолітичного розщеплення при підвищеній температурі з часом (див. Фіг.). Фіг. ясно показує, що, крім і наявності обрізків або фрагментів, перетворення одноланцюгових гп-РА у двохланцюгові відбувалося більш с інтенсивно для п-РА, розведених 5МУРІ, ніж для розведених ВМУРІ чи ВМ5, після збереження при 372С протягом 14 днів. --

Аналіз фібринолітичної активності (іп мйго) показав, що всі розведені розчини альтеплази (мг/мл) о зберігали ефективність 10095 через З години при 372С (Табл.23). Усі зразки були безбарвними чи прозорими.

Активність почала падати через тиждень збереження при 372С, але залишалася на рівні 9095 (у порівнянні з вихідною, Т-0). Різке зниження активності відбулося через два тижні при 37 2С, зі збереженням всього 44-6595 « активності. - с ;» (ее) - іме) о 50 сл

Ф) іме) 60 б5

ТАБЛИЦЯ 21 й Число часток, обумовлене методом НІАС/КОУСО, у розведеної альтеплазі (1 мг/мл, 2мг/пробірку п-РА) після збереження при 372 протягом З годин, 7 днів і 14 днів

НАСЛКОТСО

210 І 225 225

Ммкм/мл мкм/пробірк МкМм/мМл мкм/пробірк, тТ-0: п-РА/В'ЖКІ 725,5 1596 7. 15

Т-; вк 50 110 7 15 г-РА/ВМ5 474,5 1044 185 19

Т-з ч, 37 п-РА/ВМЕІ 474 948 3,5 с т-3 ч. ис п-РА/ВМ5 200 0440 2 в

ЗУЕІ 10,5 23 0 о Щео,

Ч-РАЛАМНКІ 603 1327 10,5 23 со т-: п-РА/ВМЕІ 877,5 1931. 18,5. | -

Т-й; вм 2 4 0 0 со п-РА/ВМ5 225 495 2,5 6

Т- днів, 3тс: 13,5 30 ї о « ю ЗМЕЇ 302,5 6бб 0 о 2 с п-РА/ЄМЕІ ц Т-7 днів, 377 302,9

Й ' : п-РА/В'УТІ 2 292 І 2 132,5 со Т- 7 днів, - 37 0) (0) вм 0,5 І о г-РА/ВМ5 г т-0; сл ЗУБІ 6,5 І) п-РА/ЗМ І 796,5 ІЗ

Т-о0; ! дв ВХБІ 4,5 ю 0 т. п-ВА/ВМЕІ з64 ГА 13,5 30 » НИ іме) вн І 2 0 0 п-РАЛАМ5 587 1291 4 "ж бо б5

Т- 14 днів, 372С: 4,5 ІО 0

З5МУГІ 491 160 2,5 п-РА/ЗУКІ

Т- 14 днів, У72С: 1,3 3 0

ВЖЕ. 56,3 124 7 п-РА/ВМЕЇ

Т- 14 днів, 70 379: 0,5 | 0) вч 55 121 0 п-РА/ВМ5 с о ю с с - (ее) « - с :з» (ее) шк ко сю 70 сл (Ф) ко 6о 65

ТАБЛИЦЯ 22 й Стабільність альтеплази (2 мг/пробірку п-РА), розведеної до 1 мг/мл В'МЕІ, ВМ5, ім 70 ВН Кінц. Нативна Скоро Розчинення згустк (по ГПЖ (5 | чена (мг/мл) (х 10 95 відн, результ | мономера) | ГПХ І/мг) | активнос атам (о ті?

ГПО 5

Т-0:

ПРА/ВЖМ КА 7,253 ЛІ 98,7 85,5 0,97--0,02 5,07 0

Кі | 98,6 85,2 1,0050,01 5,23 100

ЕСЕ ре

КРА/В А|7ТІВ І 98,4 85,5 1,03--0,02 5,35 100

М5 в/7и19 |1,09 98,3 85.5 0,99-40,05 5,27 100

Т-0; 25 МЕРІ ві725 | Мб. 98,2 85,4 1,04--0,04 548 100

Т-3 ч., о 379с: А | 7,24 1,12 98,3 85,2 1,082-0,005 5,59 119

ВІРА/В ВО 7,25 | 1,08 98,2 98,3 10120,035 | 542 104

МЕ | шк ю 30 Т-4 ч., Ї со 3707 АТ |і 98,0 85,3 1,07-40,01 5,59 104

ЕРА/ВМІВІ 720 | 97,9 85,3 | 1,04-0,015 5,48 104 с , -

Т1-3 мч, 379С: А|725 | 98,2 85,2) 104ж0,04 5,43 96 со

КРАВ в|725 11,0 95,1 85,2 1,110,035 5,85 107

МЕ й т-7 « дней, 7 з7с: | А|725 |з 95,9 72,8 08635003 | 445 58 - с КРА/В В | 7,256 МІ 96,2 73,0 0,92-0,025 А ВІ 92

І» ХЕ

Т-7 що! дней, со 372с. А|720 | ую 96,9 75,1. 10,9130,045 4,0 89

ВІВАВ | 81720 11,07 97,0 74,9 0,89-0,005 4,82 | 91 що М по) т-7 дней, ! о зис: А 728 Мі 01975 68,7 | 00003 15,3 193 сл ВІРА, вл 12 97.2 67,6 0,94-0,01 4,57 89

А

Т-14 99 дней о |37с: А1726 | їмо 94,5 58,0 0,56:20,02 2,95 58

КІРА/В 1727 109 538 584 0,57-0,03 3,03 | 58 о МРІ бо б5

Т-І4 дней с:

КІРА/В А 7 Лі 94,0 62.2 0,6240,015 3,24 6о

М5 ві722 |110 1939 621 06230 |327 62 т-14 дней 379:

ВВА Ат 16 94,0 49,2 07320 3,65 65

ЗУКЕЇ в|729 | 16 93,9 49,0 0.483001 2.40 44 18 ж 05, активності (Пміжнар.од.Умг) щодо вихідної (1-0).

ТАБЛИЦЯ 23

Межі змісту тверлих часток у розчинах для ін'єкцій

Ін'єкції малого обсягу, 2» 10 мкм » 25 МКМ

ЗУ (на 1 контейнер): с - че

Светлозатінюючий 6000 600 (8) - Мікроскопічні 25

Висновок Іо)

Альтеплаза (2мг/пробірку п-РА), розведена ВМУРІ, ВМ чи ЗМУРІ до мг/мл, була відносно стабільною при с 372 протягом тижня в скляній пробірці. Вірогідно, розчин ВМ5 має бути протимікробним, тому що бензиловий спирт є в ньому активним інгредієнтом. Тестування стабільності з використанням ВМ5 було позитивним, тобто, с альтеплаза була стабільною і функціональною. «-

Приклад 7

Короткий опис (ее)

Т-РА, розведений до 0О,01мг/мл у нормальному сольовому розчині, виявився літично активним у тесті на ефективність розчинення згустку. У такому тесті тромбін і фібриноген змішують один з одним з одержанням фібрину; плазміноген і П-РА змішують один з одним з одержанням плазміну; фібрину і плазмін разом розчиняють « згусток. У даному тесті вимірюють здатність ЕРА взаємодіяти з плазміногеном з утворенням плазміну і, таким чином, розчиняти згусток. т с Матеріали і методика ч» А. Матеріали: " Альтеплазу (2мг/пробірку ПАРА) розбавляли до кінцевої концентрації протеїну 0,01, 0,025, 0,05 і О,Тмг/мл у балонах для внутрішньовенного вливання (ІМ-балонах), що містять 0,995 Масі (нормальний сольовий розчин,

МБ) (Вахіег і/чи Арроїї, 250мл). Зокрема, п-РА, протеїн у масі, розбавляли до мг/мл (еквівалент сполуки со 50-мг пробірки, 0,00495 поверхнево-активної речовини ТУУМЕЕМ 80тм) фільтрованою водою МІГ І-С) тм або ж - пробірочний п-РА (100-міліграмова пробірка) розводили до мг/мл (0,008-0,01195 ТУУЕЕМ 8Отм) стерильною водою для ін'єкцій, ОР (5МУЕІ) з використанням б0-см З ВО шприци і голки 180, безпосередньо вставленої в о гумову мембрану пробірки у центра грудки. Вміст пробірки обережно перемішували круговими рухами до о 20 повного розчинення грудки. Видаляли частину внутрішньовенного розріджувача (0,990 масі, М) і заміняли тією сл же кількістю розведеного чи розбавленого 1мг/мл п-РА у такий спосіб: щі

Ф. іме)

Переповнення балона не враховували. во Після розбавлення в ІМ-балонах (п-2 для кожної концентрації) балони обережно перемішували шляхом перевертання (20-24 разів). 10-мл аліквоту відбирали з впускного порту М-балона з використанням 10-см З шприци ВО і голки 220. Аліквоту (1-0) вносили безпосередньо в 20-см? прозору скляну пробірку Типу | для візуального дослідження. Подібному фізичному дослідженню також піддавали плацебо-еквіваленти при 0,025 і

О,О5мг/мл.

В. Аналізи: б5 й й 1. Візуальне дослідження

Кожну аліквоту досліджували у світловому боксі, оснащеному чорним і білим фоном. Аліквоти порівнювали з рівним обсягом ЗМУРІ чи фільтрованої води МІГ І-С)тм у скляній пробірці такого ж обсягу, що служила як контрольний досвід. Відповідно, записували колір і прозорість аліквот. 2. Тест на розчинення очищеного згустку (Мікроцентрифужний аналізатор (Тест 1) і спектрофотометр для зчитування планшетів (Тест 2)):

Ефективність протеїну альтеплази ЕРА оцінювали за допомогою тесту на розчинення очищеного згустку, описаного нижче. Зразки розбавляли в аналітичному діапазоні (200-100Онг/мл) з одержанням трьох чи двох концентрацій у розріджувачі. Розведення проводили за день до аналізу і розведені зразки зберігали при 2-82С 70 до аналізу наступного дня. Еталонний матеріал КІРА розбавляли подібним чином як внутрішній еталон.

Використовували мікроцентрифужний аналізатор І МОМАКСН, модель Мо7бітм, що складається з вузла аналізатора з пристроями флуоресцентного і світлорозсіючого аналізу й убудованим комп'ютером, і завантажувального вузла. р. Реагенти: - 195 (ПРО, /ПРО.) емульгатора РОЇ У5ОКВАТЕ 8О0тм (/1 Вакег). - Аналітичний буфер: 0,006М фосфату натрію (0,0114 Є Ма»РО,.НоО, 0,0486 Є Ма»НРО,) з 0,029о (вагаУоб.)

Маз і 0,0195 (об./о6.) емульгатора РОЇ У5ОКВАТЕ 80м, Р 74-01. - Людський тромбін (30-4бод./мл) (СаІріоспет), збережений у закритій пробірці замороженим при -6092С чи нижче до використання. - Плазміноген, збережений замороженим при -602С чи нижче до використання. - Біоклітинний фібриноген, приготовлений у такий спосіб: Фібриноген і буфер для розчинення згустку довели до кімнатної температури. Загальний обсяг 7мл буфера для розчинення згустку ввели в пробірку. Пробірку закрили й обернули парафільмом. Пробірку поклали на бік у чашку або закріпили в орбітальному шейкері.

Швидкість установили між 4 і 5. Пробірку струшували біля години, перевіряючи, наскільки добре розчиняється с грудка. Коли грудка цілком розчинилася, розчин перенесли в 50-мл пробірку Фалькона. Попередню пробірку Ге) промили мінімум три рази буфером для розчинення згустку і промивні рідини перенесли в пробірку Фалькона, щоб зберегти всі залишкові глобули або частки. Розчин довели до кінцевого обсягу ЗОмл з використанням міток на пробірці. Пробірку обернули парафільмом і помістили в шейкер на 15-30 хвилин. Весь протеїн солюбілізували після струшування. Розчин помістили на водяний лід мінімум на 2-3 години і періодично обережно струшували. З юю використанням папера МУНАТМАМ тм Мої розчин профільтрували шляхом зціджування розчину з осаду. со

Профільтрований розчин тримали на льоді. - Еталонний матеріал (стандартний ЕРА АСТІМАЗЕМ). Усі розчини, що містять ЕРА, тримали в см полістирольних чи поліпропіленових контейнерах. «- с. Готування стандартних розчинів:

З еталонного матеріалу приготували 10-мкг/мл загальний стандартний розчин. Розведення записували в со таблиці аналізу. Інші стандарти готували відповідно до приведеної нижче схемою розведення. Усі стандарти тримали на льоді, і термін придатності для каліброваної кривої складав 12 годин з часу їхнього виготовлення. « зо З с з

Со Готування загального стандартного розчину й інших стандартів повторили для отримання двох каліброваних -к кривих. 4. Готування зразка: о і. Вихідний препарат

Га 50 Якщо зразок являв собою пробірку з ліофілізованим матеріалом, її вміст розводили по обсязі до Тмг/мл водою для ін'єкцій (М/РІ). Якщо зразок являв собою стерильний матеріал у масі, його розводили до 1мг/мл М/РІ. сл ії. Готування основного розчину зразка

За допомогою мікропіпетки 10Омкл 1,0-мг/мл зразка ПАРА ввели в 15-мл полістирольну пробірку. 9,90мл аналітичного буфера додали в пробірку з використанням 10-мл градуйованої полістирольної піпетки або мірної 22 піпетки з мікропіпеткою. Цей розчин позначили як основний розчин зразка.

ГФ) її. Готування робочого розчину зразка

За допомогою мікропіпетки ббОмкл основного розчину зразка ввели в 15-мл полістирольну пробірку. 9,4Омл ді аналітичного буфера додали в пробірку з використанням 10-мл градуйованої полістирольної піпетки або мірної піпетки з мікропіпеткою. Одержали розчин зразка для введення в чашки зразків. Розведені зразки тримали на 60 льоді. їм. Етапи готування основного і робочого розчинів зразків повторили для отримання двох розведень зразків.

М. Готування позитивного контрольного досвіду

Контрольний досвід приготували шляхом розведення зразка пП-РА до 1мг/мл, піпетування 0,5-мл аліквот у пробірки Еппендорфа і заморожування при -602С. Для проведення аналізу розморожували по одній пробірці бо щодня. Контрольний досвід розбавляли з використанням 1ООмкл зразка тим же способом, що і зразок. Розведені контрольні зразки тримали на льоді. е. Методика проведення аналізу в аналізаторі МОМАКСН 2000тм (Аналіз 1):

Даний аналіз проводять у такий спосіб: реагентами є речовини, що додаються в розчин іншої речовини для

Здійснення хімічної реакції. У даному випадку, вміст човника 1 має реагувати з вмістом човника 2 з утворенням стандартизованого згустку. Тромбін (човник 2) при змішуванні з плазміногеном і фібриногеном (човник 1) викликає перетворення фібриногену у фібрин і утворює стандартизований іп міго згусток, що складається з плазміногену і фібрину. Потім на згусток впливають тестовим зразком Ї-РА. Т-РА викликає перетворення плазміногену в плазмін, і плазмін руйнує нитки фібрину. У міру розпаду згустку відбуваються зміни в оптичній 70 густині. Оптичну густину наносять на графік залежності від часу.

Кінчики піпеток аналізатора перевірили на правильність розташування, а водяний резервуар перевірили на заповнення. Видалили пухирці повітря зі шприців, якщо необхідно, і виконали промивний цикл.

Параметри аналізатору приведені в Табл.24. ів сч щі ю зо о сч - зв со « то що - з є (ее) - Човник з реагентом 1 приготували шляхом додавання 200мкл розведеного плазміногену до 10,0мл фільтрованого фібриногену. Суміш обережно перемішали і внесли в човник для реагенту 1. Човник з реагентом іме) 1 установили в перше положення столу аналізатора для реагентів. сю 50 Човник з реагентом 2 приготували шляхом додавання ЗЗод./мл розчину тромбіну, описаного вище, у човник з реагентом 2. Човник з реагентом 2 установили в положення 2 аналізатору. сл 0,25-мл чашки для зразків установили в кільця для зразків. З використанням одноразових піпеток, що переносять, або піпетки РЕРЕТМАМ тм, чашки для зразків заповнили стандартом, контрольним розчином і зразками, як показано в Табл.25, "Зразкова схема завантаження". Якщо випробували менш двох зразків, 5о завантаження проводили, як зазначено в таблиці, а в будь-які проміжні порожні чашки вводили піпеткою

Ге! аналітичний буфер або воду. іме) 60 б5

ТАБЛИЦЯ 25 2 Зразкова схема завантаження

І Зразок. Чашка Мо Кювета Ме 70 200 нг/мл Стандарт (І І 3 400 нг/мл Стандарт й 600 нг/мл Стандарт (І) 800 нг/мл Стандарт (І 4 б контрольний досвід повтор 1 6 кн 200 нг/мл Стандарт (ІЇ 7 еп пен 20 Ї зразок І розведення 2 повтор 1 о сч 2е | контрольний досвід повтор 2 400 нг/мл Стандарт (1) щі зразок І розведення І повтор 2 16 зразок 1 розведення 2 повтор 2 і5 17 юю зо |зразокО розведення! повтор? |16 СІ со сч контрольний досвід повтор 3 18 - 600 нг/мл Стандарт (ТІ 19 21 35 | " г) зразок І розведення | повтор3 20 22 зразок 1 розведення 2 повтор 3 21 23 зразок? розведення | повтор3 29 24 « ло | Зразок? розведення 2 повтор 3 /23 25. 2 с контрольний досвід повтор 4 ру 26 г» 800 нг/мл Стандарт (П со зразок 2 розведення 1 повтор 4 30 т зразок 2 розведення 2 повтор 4 31 юю контрольний досвід повтор 5 с» 77. | 1000 нг/мл Стандарт (І 33 с зразок І розведення | повтор 5.32 зв 34 о 35 37 іме)

Натискали кнопку "Зресіа! гедоеві" ("Спеціальний запит") на аналізаторі МОМАКСН:м, Вводили інформацію 60о чашок зі зразками. Двічі натискали кнопку "Ассері" ("Прийом"). По закінченні піпетування аналізатором

МОМАКСН тм, човники з реагентами знімали і поміщали на лід. Кільце для зразків знімали і поміщали в холодильник при 2-826. і. Визначення кінцевої точки:

Кінцева точка (час розчинення) може бути визначена за допомогою комп'ютерної програми або вручну. Для б5 автоматичного комп'ютерного розрахунку кінцевою точкою є час, необхідний для розчинення згустку, що визначається автоматично. При визначенні вручну, кінцевою точкою вважають першу тимчасову точку нижче

0,03 одиниць оптичної густини, у якій зміна складає менш 0,003 абс. одиниць. Зокрема, при визначенні вручну, кінцеву точку визначали на основі тимчасових даних оптичної густини. Визначали першу точку оптичної густини менш 0,0300. Кінцеву точку визначали як час досягнення першої величини оптичної густини менш 0,0300, при якій зміна в оптичній густині між поточним значенням оптичної густини і наступним значенням оптичної густини складало менш 0,0030. Якщо зміна оптичної густини було більшим 0,0030, переходили до наступного показанню оптичної густини і визначали зміну оптичної густини. Кінцевою точкою вважали перше значення оптичної густини для зазначеної пари (вихідної і наступної величини оптичної густини), при якій зміна оптичної густини складала менш 0,0030. 70 її. Розрахунки:

Розраховували середній час розчинення для кожної точки каліброваної кривої. Стандартні концентрації (нг/мл) і середні значення кінцевих крапок часу (у секундах) перетворювали в логарифмічні величини.

Отримували калібровану криву залежності логарифма концентрації (вісь х) і логарифма часу (вісь у).

З використанням величин кутових коефіцієнтів, отриманих методом лінійної регресії, розраховували 7/5 логарифмічну концентрацію для кожного зразка із логарифму часу розчинення (кінцевих точок). Антилогарифм отриманої логарифмічної концентрації множили на коефіцієнт розведення (наприклад, 1667) для отримання од./мл. (Лог. часу розчинення -- відрізок на осі у) І мг антилогарифм нитлтжЕитнЕаанианананннннннннннннииитттинті нтннвининнн

І кутовий коефіцієнт 1 1000000 нг

Х (розведення зразка) Х (1 од./мг). сч

Системну придатність каліброваної кривої оцінювали з використанням тесту на системну придатність. о

Відповідно до цього тесту, для того щоб дані були достовірними, коефіцієнт кореляції для стандартів повинний знаходитися в межах від -0,997 до -1,000, а контрольного досвіду в межах -1095 від прийнятого значення. Якщо системна придатність не відповідала цим умовам, калібровану криву можна було перевизначити шляхом виконання аналізу лінійної регресії з використанням не менш чотирьох суміжних точок (тобто не враховуючи о перший чи останній стандарт). со

Результати були представлені у вигляді од./пробірку, од./мг, од./мл, Ш (міжнародних одиниць)/пробірку,

ІШ/мг чи ІШ/мл, у залежності від того, що було потрібно в таблицях аналізу. Для контрольного досвіду було с отримано середнє значення з усіх п'яти паралельних досвідів. Системну придатність оцінювали, як описано «- вище. Для пробірочних зразків розраховували середнє з усіх п'яти паралельних досвідів на одне розведення

Зо зразка. Середній результат виводили з двох розведень зразка. Його представляли у виді од./пробірку, де со од./пробірку-порівн.од./мл хмл/пробірку. Для зразків у масі розраховували середнє з п'яти паралельних досвідів на одне розведення зразка. Середній результат виводили з двох розведень зразка. Його представляли у виді од./мг, де: « " питома активність - од. активності/мл ші с (од./мг) мг протеїну/мл . -» "Од./мл або од./мг можуть бути перетворені в міжнародні одиниці (ІШ)умл або ІШ/мг шляхом множення на відповідний коефіцієнт перетворення в міжнародні одиниці.

При тестуванні СОА і стабільності тестування зразка повторювали з використанням одного циклу щодня (ее) протягом трьох днів. Виводили середнє значення з результатів трьох днів. Аналіз може бути проведений - повторно на основі результатів власного контрольного досвіду і/чи на основі систематичної чи невизначеної помилки. Кінцеві результати можуть бути представлені у виді середнього значення безлічі тестів. ко Ї. Методика аналізу з використанням спектрофотометра для зчитування планшетів 2: сю 50 Умикнули спектрофотометр для зчитування планшетів і установили температуру термостата на 2590. Дали прогрітися лампі протягом мінімум З0 хвилин. Ввели тромбін у кількості 20мкл у кожну лунку. Тромбін може бути сл введений з резервуара реагенту або з проміжного планшета з використанням многоканальної піпетки. 20мкл на лунку розбавлених стандартів (у двох екземплярах) додали в лунки В2-В6 і С2-С6. 20мкл на лунку контрольного розчину додали в лунки 02-52 і 20мкл зразків додали в інші лунки в чотирьох екземплярах у вертикальному 22 форматі до максимальної кількості У зразків на планшет. Лунки в рядах В-(, які не містять стандартів, о контрольних розчинів або зразків, повинні містити 20мкл аналітичного розріджувача. Зразки П-РА можуть бути додані по окремості одноканальною піпеткою або з проміжного планшета з використанням многоканальної о піпетки. во

Станд Станд | Станд | Станд | Станд |/|розріджувач |розріджувач |розріджувач Ірозріджувач розріджувач

Станд Станд | Станд | Станд | Станд |/|розріджувач |розріджувач |розріджувач Ірозріджувач розріджувач 65 Контр. Зразок 1 Зразок 2 Зразок З Зразок 4) Зразок 5 Зразок 6 Зразок 7 Зразок 8 Зразок 9 розчин ер

Вис СИ ПОС ПОСИПАННЯ ПОС ОНННЯ КОН ОНЯ ПОН НЯ НО ТН пис с В Я ПО ПО ОНЯ ПОН НО НО ТОННи НОТ 9 Розчину фібриногену дали нагрітися до кімнатної температури перед додаванням плазміногену. 200мкл на лунку фібриногену-плазміногену вносили в планшет настільки швидко, наскільки можливо.

Після додавання фібриногена-плазміногена планшет відразу помістили в пристрій, що зчитує, і почали збір даних. Перше зчитування було зроблено з урахуванням двох хвилин додавання фібриногена-плазміногена в )/о "планшет, для реєстрації максимальної оптичної густини згустку.

Зібрали дані оптичної густини планшета при З4Онм і проводили зчитування через відповідні проміжки часу (звичайно З0 секунд), доки не була досягнута базова оптична густина для всіх лунок (звичайно 1 година). і. Розрахунок:

Визначення кінцевої точки (часу напіврозчинення) здійснювали в такий спосіб: час розчинення розраховували /5 як час досягнення напівмаксимуму оптичної густини. Максимальна оптична густина відповідала максимальної непрозорості згустку, зареєстрованої для даної лунки. Оптична густина фону відповідала мінімальній оптичній густині цілком розчиненого згустку. Точки неопрацьованих даних (час розчинення в секундах) усереднили для кожного стандарту, контрольного досвіду і всіх екземплярів зразків. Розрахували логарифм усередненої величини.

Калібровану криву будували шляхом уведення даних часу розчинення (логарифмічна шкала секунд на осі у) у залежності від концентрації протеїну по каліброваній кривій пП-РА (логарифмічна шкала нг/мл на осі х).

З використанням величин кутових коефіцієнтів, отриманих методом лінійної регресії, розраховували логарифмічну концентрацію для кожного зразка з логарифма часу розчинення. Антилогарифм отриманої логарифмічної концентрації множили на коефіцієнт розведення (наприклад, 1667) для одержання од./мл. сч о (Лог. часу розчинення -- відрізок на осі в | І мг «(од./мл) - | 1 Хх Хх антилогарифм (-ЙЗЙЗ2З« ИТЗИЗ6 ЗИЗЗЗЙ2ВЄФОбПЗ-З8ЗШ8ШБ-ИЗ553773777-733531- ----- ю зо І кутовий коефіцієнт || 1000000 нг со

Х (розведення зразка) Х (1 од./мг). сч

Для пробірочних зразків одиницею виміру служили од./пробірку, де од/.пробірку-порівн.од./мл хмл/пробірку. --

Якщо питому активність визначали для зразків у стерильній масі, то розраховували середнє з усіх п'яти о паралельних досвідів в од./мг, де: " питома активність - од. активності/мл (од./мг) мг протеїну/мл « , , о, що -

Од./мл або од./мг можуть бути перетворені в ІШ/мл чи ІШ/мг шляхом множення на відповідний коефіцієнт с перетворення в міжнародні одиниці. :з» Оцінювали системну придатність каліброваної кривої. Для того щоб дані оцінки були достовірними, коефіцієнт кореляції для стандартів має знаходитися в межах від -0,995 до -1,000, а контрольного досвіду в

Межах -1095 від прийнятого значення. Якщо системна придатність не відповідала цим умовам, калібровану криву со можна було перевизначити шляхом повторного запуску програми розрахунку з використанням не менш чотирьох суміжних точок (тобто, не враховуючи перший чи останній стандарт). - Активність гі-Ра представляли у виді од./пробірку, од./мг, од./мл, ІШ/пробірку, ІШ/мг чи ІШ/мл, у г залежності від того, що було потрібно в таблицях аналізу. Аналіз може бути проведений повторно на основі результатів власного контрольного досвіду і/чи на основі систематичної чи невизначеної помилки. Кінцеві і результати можуть бути представлені у виді середнього значення безлічі тестів. с Результати

При візуальному дослідженні розчини альтеплази Ї-РА при розведенні до 0,01, 0,025 і О,Обмг/мл М5 виглядали безбарвними, прозорими чи злегка опалесцентними на початку дослідження і через 24 години інфузії (без фільтра) при кімнатній температурі. При О,їмг/мл у М розчин альтеплази ІРА виглядав злегка мутним відразу після розведення і залишався таким же протягом періоду інфузії. (Ф. У більшості випадків усі фракції, зібрані за 24 години для всіх концентрацій, показали значення питомої ко активності більш 9095, виходячи з оцінки методом розчинення згустку.

Висновок во Відновлений ЕРА (5мг/мл), розведений до 0,01, 0,02 і 0,0595 мг/мл у ІМ-балонах з 0,995 Масі (500мл) був літично активним після 24 годин збереження при навколишніх умовах.

Приклад 8

Короткий опис

Тенектеплаза, розведена до 0,01мг/мл у нормальному сольовому розчині, показала літичну активність у тесті вв на ефективність розчинення згустку. У такому тесті тромбін і фібриноген змішують один з одним для отримання фібрину; плазміноген і тенектеплазу змішують один з одним для отримання плазміну; фібрин і плазмін разом розчиняють згусток. У цьому тесті вимірюють ефективність взаємодії тенектеплази з плазміногеном для утворення плазміну і, таким чином, розчинення згустку.

Матеріали і методика

А. Матеріали і реактиви - Тенектеплаза, ТМКАБЕтм, 50-мг ампула - 0,995 Масі для ін'єкцій, ОБР, 50Омл (Вахіег) - 10 мл БМУРІ, ОБР (АБрої) - З-см3, 5-смУ, і 10-см? шприци ВО - Голки 220 1,5 - Чисті скляні 5-см3 пробірки МУНЕАТОМ:м Типу І - 20-мм пробки для рідин із сірого бутилкаучуку

В. Методика

Тенектеплазу (ТМКАБЕтм, варіант І-РА), придбану в Сепепіесі, Іпс. |наприклад, патент США Мо5,612,0291 12 (БОмг/пробірку) розвели до мг/мл 10-ю мілілітрами 5МУРІ. З використанням 3- і 5-см З шприців і голки 220 витягли 1, 2 і бмл нормальні сольові розчини (М5) з окремих ІМ-балонів (5Х0О0мл М5, Вахіег), у двох екземплярах. Той же обсяг замінили розведеним лікарським засобом з отриманням кінцевої концентрації тенектеплази в балонах 0,01, 0,02 і 0,О05мг/мл. Вміст балонів обережно перемішали шляхом перекидання. 10-мл аліквоту розведеного розчину тенектеплази взяли через ІМ-порт 10-смЗ шприцом і ввели в двох 5-см? чисті 20 скляні пробірки (бмл в одну й решту в іншу). ІМ-балони, що містять розведену тенектеплазу, помістили на робочу поверхню столу під перпендикулярним флуоресцентним світлом при навколишніх умовах на 24 години.

Додаткові аліквоти (1Омл кожна) з цих ІМ-балонів відбирали через 8 і 24 години збереження.

С Аналіз

Визначення рН виконували з використанням рН-метру КАБІОМЕТЕК РНМ 93 м і мікроелектроду (МІ-41Ом, с 25 МісгоеІесігоде, Іпс.). Перед виміром при навколишніх умовах рН-метр стандартизували стандартними буферами (о) зрнН.11 7,00.

Всі аліквоти тенектеплази піддали аналізу розчинення згустку, описаному вище, для визначення іп мйго біоактивності тенектеплази в цих аліквотах. Зразки розвели розріджувачем до двох чи трьох різних концентрацій ою 30 в аналітичному діапазоні (200-50Онг/мл). Тенектеплазу використовували як внутрішній еталон. Всі отримані величини нормалізували стосовно еталонній тенектеплазі. Біоактивність аналізували методом розчинення (зе) згустку до і після центрифугування. сч

Результати

Зведення результатів наведених в Табл.26. рН (7,1-7,2), що спостерігається для більш високої концентрації - тенектеплази (0,05мг/мл у М5) була небагато вище, ніж для більш низьких концентрацій (рН 6,7-6,8 і рН 6,8-6,9 35 ! | | ши . г) при 0,01 ії О0,02мг/мл, відповідно). Це зумовлено великою кількістю буферизованої тенектеплази (5мг/мл, Р 7,3), що додається безпосередньо в ІМ-балон для первісного розведення. Але усі величини рН залишилися незмінними після 24 годин збереження при навколишніх умовах.

Активність розчинення згустку і концентрації протеїну (обумовлені КР-НРІ С, обернено-фазовою рідинною « 20 хроматографією високого дозволу) визначали до і після центрифугування аліквоти кожного зразка. Це з забезпечувало видалення будь-якого осаду, невидимого неозброєним оком, перед аналізом для більш точної с інтерпретації результатів. В усіх випадках результати після центрифугування як для активності, так і для :з» концентрації були трохи нижче, ніж перед центрифугуванням, що означало присутність невеликої кількості осаду.

У Табл.26 представлене процентна зміна концентрації до і після центрифугування, що показує більш високу втрату протеїну при 0,01 і 0,02мг/мл незабаром після розведення, ніж при більш високій концентрації со (О,5мг/мл). Ця відсоткова зміна при більш низькій концентрації (0,01мг/мл) також збільшується при збільшенні часу збереження. При 0,01мг/мл відсоткова зміна концентрації склала 57905 відразу після розведення і - збільшилася до 7195 через 24 години. При 0,02 і О,О5мг/мл значних змін не спостерігалося. Не вдаючись у т теорію, це явище можна пояснити більш вираженим поглинанням протеїну при низькій концентрації, що звичайно відбувається відразу і згодом досягає межі насичення. (95) 50 У Табл.27 показано, що відсоток відновленого протеїну щодо цільових концентрацій при 0,01, 0,02 і сп О,О5мг/мл складав 40-5095, 6595 і 86-9295, відповідно. Цей відсоток відновленого протеїну був заниженим, оскільки не враховувався обсяг переповнення всередині ІМ-балона, і кількість відновленого протеїну могла бути щонайменше на 1095 нижче, ніж очікувані цільові концентрації (з урахуванням 1095 переповнення ІМ-балона).

Активність розчинення згустку відновленим протеїном (після центрифугування) істотно не змінилася через 24 години збереження при навколишніх умовах. Загальний відсоток питомої активності відновленого протеїну при

ГФ) 0,01, 0,02 і О0,О5мг/мл склав »10095, »9295 і »8095, відповідно (Табл.27). іме) 60 б5

Таблиця 26

Зведення результатів стабільності розведених розчинів тенектеплази в Гу- балонах з 0,975 Масі (500 мл) 7 Час Цільова | рН Розчин | Розчин | Конц.? )Конц.я | 95 конц. ення ення ж Ж зміни (мг/мл) згустку | згустку | (-цент) | (цент) | конц, 18 | (-цент) | Сецент) | (мг/мл) | (мг/мл) | (цент) мг/мл мг/мл т-0 0,01 0,006 0,004 |0,007 (оба ю 17-00 1001 0,006 ом робо? 0,004 157

Й у с дв 909 6,93 0,015 10012 10017 10013 76 о 005 17,12 10040 10037 0,045 10045 194

ІС зо т-0 0,05 7,15 10041 /боз6 0047 !0046 БИ я

Т-8 годин, 0,01 ЩІ 0,007 0,005 10007 10004 57 ся навкл. ум. ! --

Т-8 годин, 0,01 ШІ 0,008 10006 10008 10005 63 со навкл. УМ.

Т-8 годин, | 0,02 15 0012 10016 0013 |81 « навкл. Ум.

Т-8 годин, 0,02 ше 0,012 10016 0013 не - навкл. Ум я Т-8 годин, | 0,05 - 0,039 10,0034 10047 10,045 |96 навкл. ум Й

Фо Т-8 годин, 0,05 - 0,039 10,37 10,047 10,45 /96 а навкл. ум І т-24 0,01 6,77 0007 10005 10007 10005 |71 о години, со 70 навкл. ум сл Т-24 0,01 6,71 0007 10006 10007 10,005 71 години, навкл. ум т-24 0,02 65,86 10015 10013 10016 0013 81 о годин, о навкл. Ум 60 65 тТ-24 0,02 0016 0012 0,16 10013 години, й навкл. ум тТ-24 0,05 7,19 0,043 10040 1004850 10,43 /|90 години, навкл. ум 7 р|т-м 005 1797 10043 10040 0460 | 044 години, навкл. ум ої Цільова концентрація. Переповнення в ІУ-балонах не враховували. жж Концентрація, визначена КР-НРІ.С. -дент - перед центрифугуванням 20. кцент - після центрифугуванням сч о ю с сч - (2,0) « - с ;» со -й

Пе) с 50 сл (Ф,

Пе) 60 б5

Таблиця 27 9 Біоактивність, 5 відновлення протеїну і 95 питомої активності розведеної тенектеплази після збереження

Час Конц.ї |Конц.о? | 95 відновлення Розчинення | 95 (мг/мл) |(їцент) протеїну (від згустку питомої атм) цільової конц.) | (уцент) активності мг/мл

Т-0 0,01 0,004 40 0,004 100

Т-о0 001 0004 40 0,004 се в т-0 0,05 0,045 БІ 0,037 82 о ю зо Т-8 0,01 0,004 0,005 125 со годин, навкл. ум. | с

Т- 0,01 0,005 50 0,006 120 - 35 гОдни, | (се) навкл. ум.

Т-8 0,02 0,013 65 0,012 | 92 годин, : « навкл. ум. Ш | - с Т-6 002 0,013 65 0,012 92 хз» годин, навкл. ум. й

Тв 0,05 0,045 90 і 0,034 76 (ее) хОодин, -з навкл. ум. ю т-8 0,05 0,045 90 0,037 82 годин, о навкл. ум. шо сл т-24 ДІ 0,005 50 0,005 100 години, ря навкл. ум. й

Т-24 0,01 0,005 50 0,006 120 о години, з | навкл. ум. | ше щ бо б5

Т-24 0,02 0013 65 0,013 100 години, навкл. ум. т--4 0,02 0,013 65 0,012 92 години, 70 навкл. ум. | вищ

Т-24 0,05 0,043 56 0,040 93

Години, навкл, Ум. то |Т-24 0,05 0,044 88 0,040 години, навкдл. ум. ж Цільова конпентрація. Переповнення в ІМ-балонах не враховували. жж Концентрація, визначена ЕР-НРІ С кцент - після центрифугування е5 відновлення протеїну - |Конц. (цент), мг/мл / цільова конц., мг/мл) х 10099 сч - . 95 питомої активності - (Розчинення згустку (цент), мг/мл / конц. (цент), (о) мг/млі х 10095

ІС)

Висновок со

Як і ЕРА, результати для якого описані вище, відновлена тенектеплаза (мг/мл), розведена до 0,01, 0,02 і

О,О59омг/мл у ІМ-балонах з 0,995 Масі (500мл), була літично активною після 24 годин збереження при с навколишніх умовах.

Описані вище композиції і препарати мають бути ефективними в запобіганні адгезії і колонізації на - поверхнях катетера інфекційних мікроорганізмів, таких як 5. ацгецв, 5. ерідегтгс ідів і гриби. г о

Claims (1)

1. Формула винаходу «

   1. Композиція для видалення фібрин-зв'язаних згустків крові з катетера, яка містить виключно нехелатуючі 8 с засоби: воду, фібринолітично ефективну кількість активатора плазміногену й антисептично ефективну кількість й бактеріостатичного органічного спирту. "» 2. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що активатор плазміногену являє собою тканинний активатор плазміногену або урокіназу.

   З. Композиція за п. 2, яка відрізняється тим, що активатор плазміногену являє собою Ї-РА нативної Ге | послідовності, урокіназу нативної послідовності, ретеплазу або тенектеплазу.

   4. Композиція за п. З, яка відрізняється тим, що активатор плазміногену являє собою ІРА нативної - послідовності або тенектеплазу. ка 5. Композиція за будь-яким з пп. 1-4, яка відрізняється тим, що органічний спирт являє собою бензиловий спирт, ізопропанол або етанол.

   о 6. Композиція за будь-яким з пп. 1-5, яка відрізняється тим, що органічний спирт являє собою бензиловий 4 спирт.

   7. Композиція за будь-яким з пп. 1-6, яка відрізняється тим, що фібринолітично ефективна кількість активатора плазміногену складає від 0,1 до 10 мг/мл, а антисептично ефективна кількість органічного спирту складає від 0,5 до 1,2 95 (об./об.).

   8. Композиція за будь-яким з пп. 1-7, яка відрізняється тим, що фібринолітично ефективна кількість Ф) активатора плазміногену складає від 0,3 до 4 мг/мл. ко 9. Композиція за будь-яким з пп. 1-8, яка відрізняється тим, що вода, яка містить спирт, являє собою бактеріостатичну воду для ін'єкцій або являє собою бактеріостатичний нормальний сольовий розчин. во 10. Спосіб видалення фібрин-зв'язаних згустків крові з катетера, який містить такі згустки крові, що включає контактування катетера з композицією за будь-яким з пп. 1-9 протягом не менше 5 днів.

   11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що катетер контактує з композицією протягом 6-15 днів.

   12. Катетер, вмочений, просочений і/або імпрегнований композицією за будь-яким з пп. 1-9.

   13. Катетер за п. 12, що являє собою постійний катетер. 65 14. Мультисекційний контейнер, що включає відсік, який містить фібринолітично ефективну кількість активатора плазміногену, відсік який містить воду, яка містить антисептично ефективну кількість бактеріостатичного органічного спирту, причому відсіки містять виключно нехелатуючі засоби; а також містить інструкції по змішуванню вмісту обох відсіків і по використанню отриманої суміші для видалення фібрин-зв'язаних згустків крові з катетера, що містить такі згустки крові.

   15. Контейнер за п. 14, який відрізняється тим, що активатор плазміногену являє собою тканинний активатор плазміногену або урокіназу.

   16. Контейнер за п. 15, який відрізняється тим, що активатор плазміногену являє собою Ї-РА нативної послідовності, урокіназу нативної послідовності, ретеплазу або тенектеплазу.

   17. Контейнер за п. 16, який відрізняється тим, що активатор плазміногену являє собою Ї-РА нативної 70 послідовності або тенектеплазу.

   18. Контейнер за будь-яким з пп. 14-17, який відрізняється тим, що органічний спирт являє собою бензиловий спирт, ізопропанол або етанол.

   19. Контейнер за будь-яким з пп. 14-18, який відрізняється тим, що органічний спирт являє собою бензиловий спирт.

   20. Контейнер за будь-яким з пп. 14-19, який відрізняється тим, що фібринолітично ефективна кількість активатора плазміногену складає від 0,1 до 10 мг/мл, а антисептично ефективна кількість органічного спирту складає від 0,5 до 1,2 95(об./об.).

   21. Контейнер за будь-яким з пп. 14-20, який відрізняється тим, що фібринолітично ефективна кількість активатора плазміногену складає від 0,3 до 4 мг/мл.

   22. Контейнер за будь-яким з пп. 14-21, який являє собою комплект, де кожний відсік являє собою окремий контейнер.

   23. Контейнер за будь-яким з пп. 14-21, який являє собою шприц з кількома відсіками.

   24. Контейнер за будь-яким з пп. 14-23, який відрізняється тим, що вода, яка містить спирт, являє собою бактеріостатичну воду для ін'єкцій або являє собою бактеріостатичний нормальний сольовий розчин. с

   25. Мультисекційний контейнер, що включає відсік, який містить від 0,1 до 10 мг/мл Ї-РА нативної послідовності або тенектеплази, і відсік, який містить воду, яка містить від 0,5 до 1,2 95 (об./об.) о бензилового спирту, ізопропанолу або етанолу, причому відсіки містять виключно нехелатуючі засоби; а також містить інструкції по змішуванню вмісту обох відсіків і по використанню отриманої суміші для видалення фібрин-зв'язаних згустків крові з катетера, що містить такі згустки крові. ю (зе) с «- г)

   - . и? (ее) - іме) (95) сл іме) 60 б5