UA80091C2 - Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist - Google Patents

Description

класифікацією АРВА - системні і багатосуглобові; за 15. Застосування за п. 14, де антитіло до рецепто- класифікацією ЕЦГ АК - системні і багатосуглобові; ра ІС-6 є моноклональним антитілом до рецептора за класифікацією ІАЕ - системні, багатосуглобові І--6 людини. (АВЕ-позитивні), багатосуглобові (КЕР-негативні) і 16. Застосування за п. 14, де антитіло до рецепто- розширений олігоартрит; за класифікацією авторів ра ІС-6 є моноклональним антитілом до рецептора даного винаходу - первинні дитячі хронічні артрит- І/-6 миші. ні захворювання (синдром 5РКАБН, ідіопатичні 17. Застосування за будь-яким з пп. 13-16, де ан- дитячі хронічні артритні захворювання - а) позити- титіло до рецептора 1-6 є рекомбінантним антиті- вні на ревматоїдний фактор (КЕ-позитивний тип), лом.

Б) позитивні на антиядерні антитіла (апа- 18. Застосування за п. 15, де антитіло до рецепто- позитивний тип). ра І--6 людини являє собою антитіло РМ-1. 12. Застосування за будь-яким з пп. 1-9, де дитячі 19. Застосування за п. 16, де антитіло до рецепто- хронічні артритні захворювання являють собою: за ра І--6 миші являє собою антитіло МЕ 16-1. класифікацією АРВА - системні і багатосуглобові; за 20. Застосування за будь-яким з пп. 13-15, де ан- класифікацією ЕЦГ АК - системні і багатосуглобові; титіло до рецептора І//-6 є химерним антитілом, за класифікацією ІАЕ - системні, багатосуглобові гуманізованим антитілом або антитілом людини до (Аг-позитивні) і розширений олігоартрит; за кла- рецептора 1-6. сифікацією авторів даного винаходу - первинні 21. Застосування за п. 20, де гуманізоване антиті- дитячі хронічні артритні захворювання (синдром ло до рецептора ІЇ/-6 являє собою гуманізоване

ЗРЕАБН, ідіопатичні дитячі хронічні артритні за- антитіло РМ-1. хворювання - а) позитивні на ревматоїдний фактор 22. Застосування за будь-яким з пп. 13-21, де хво- (АБ-позитивний тип). роба Стілла являє собою дорослу форму хвороби 13. Застосування антитіл до 1І-6Е або антитіл до Стілла.

І/-6 для одержання терапевтичного агента для 23. Застосування за будь-яким з пп. 13-21, де хво- лікування хвороби Стілла. роба Стілла являє собою дитячу форму хвороби 14. Застосування за п. 13, де антитіло до рецепто- Стілла. ра 1--6 є моноклональним антитілом до рецептора

І -6.

Даний винахід стосується лікарського засобу ко 130 кД, що бере участь у передачі сигналу. 1-6 для "захворювань, споріднених з дитячим хроніч- і рецептор І--6 утворюють комплекс ІІ-б/рецептор ним артритним захворюванням", що включає як І/-6, з яким зв'язується одрізЗзо, і наступним чином активний інгредієнт антагоніст інтерлейкіну-б (ПІ - біологічна активність І/-6 передається всередину 6). Захворювання, споріднені з дитячим хронічним клітини (Тада еїаї!., СеїІ (1983) 58, 573-581). артритним захворюванням, включають власне Антагоністи І--6 - це речовини, що інгібують дитячі хронічні артритні захворювання, хворобу передачу біологічних активностей І/-6. До цього

Стілла та їм подібні. часу відомі антитіла до 1-6, антитіла до рецептора

Цитокін 1-6 називають стимулюючим В- І/-6, антитіла до одріЗзо, перебудований 1-6, част- клітини фактором-2 (В5Е2) або (З-інтерфероном. кові пептиди 1-6 або рецептора І1І--6 і т.п.

І/-6 був відкритий як фактор диференціювання, Антитіла до рецептора 1І/-6 описані у ряді відповідальний за активацію лімфоїдних В-клітин оглядів (Моміск 0. еї аїІ., Нубгідота (1991) 10, 137-

ІНігапо Т. єї аї., Машге (1986) 324, 73-76). Після 146; Ниапу УЛ. еї а!ї., Нуріідота (1993) 12., б21- цього було виявлено, що він є багатофункціональ- 630; Іпіегпайопа! Раїепі Арріїсайоп УУО 95-09873; ним цитокіном, що впливає на функції різних клі- Егепсі Раїєепі Арріїсайоп ЕВ 2694767; Опіеа 5іагез тин (АКіга 5. еї аї., Адм. іп Іттипоїіоду (1993) 54, 1- Раїепі 5 5216128). Гуманізоване антитіло РМ-1 78)|. Повідомлялося, що 1-6 індукує дозрівання було одержане шляхом уведення ділянки компле- лімфоїдних Т-клітин (Гої7 М. еї аї., У. Ехр. Мей. ментарності (СОК) мишачого антитіла РМ-1 (одно- (1988) 167, 1253-1258). го з антитіл до рецептора 1-6, Нігага еї аї., 9.

І--6 здійснює свою біологічну активність за до- Ітітипоіоду (1989), 143, 2900-2906) в антитіло лю- помогою двох білків на поверхні клітини. Одним з дини (піегпайопа! Раїепі Арріїсайоп УМО 92- них є ліганд-зв'язуючий білок, рецептор 1І--6, моле- 19759). кулярна вага якого складає близько 80 кД, з яким Дитячі хронічні артритні захворювання в осно- зв'язується 1-6 (Тада Т. еї аї., У. Ехр. Мей. (1987) вному представлені хронічними артритами, що 166, 967-981; МатазакКі К. еї аї., бсіепсе (1987) виникають до 16-річного віку, які є найбільш поши- 241, 825-828). Рецептор 1І--6 існує не тільки в мем- реними захворюваннями з колагенових захворю- брано-зв'язаній формі, яка пронизує клітинну мем- вань, що виникають у дітей. На відміну від ревма- брану та експресується на ній, але також у вигляді тоїдного артриту (КА) у дорослих вони не розчинного рецептора 1-6, який в основному вважаються однорідним захворюванням і пред- складається з позаклітинної частини. ставлені кількома типами, тому їх звичайно розг-

Іншим білком є не зв'язуючий ліганди мем- лядають, як захворювання, відмінні від ревматоїд- бранний білок дрізО з молекулярною вагою близь- ного артриту у дорослих.

Стосовно дитячих хронічних артритних захво- "Адуапсев іп гесепі (пегарешіс темштоав г спгопіс рювань в Японії застосовується назва "юнацький апнийідев аїзеазевз ої спідпооа", АНештаїйізт, 39: ревматоїдний артрит" відповідно до діагностичних 860 (1999)|. критеріїв Сполучених Штатів, тоді як в Європі в Повідомлялося, що у дитячих хронічних арт- основному застосовують термін "юнацький хроніч- ритних захворюваннях відіграють роль різні цито- ний артрит". Нещодавно стали застосовувати і такі кіни. Зокрема, вважають, що з цим захворюванням терміни, як ідіопатичний хронічний артрит (ІСА) та пов'язані порушення балансу запальних цитокінів юнацький ідіопатичний артрит (ЛА). ІС-1, 1С-6, 1-12, ТМЕ-о; і протизапальних цитокінів

Типи дитячих хронічних артритних захворю- ІП -га (антагоніст рецептора 1-1), 11-10, 11-13, вань класифікували різним способом. Відповідно 5ТМЕРЕ (розчинний рецептор ТМЕ). до Американської колегії ревматології (АСК), вони, Для лікування дитячих хронічних артритних тобто артритні захворювання, що виникають у ді- захворювань застосовувалися нестероїдні проти- тей до 16 років і тривають протягом 6 тижнів та запальні засоби, кортикостероїди, протиревматич- більше, поділяються на 3 типи: 1) системні, 2) ба- ні засоби (сполуки золота та ін.), імунодепресанти, гатосуглобові, 3) малосуглобові (КА Стгійегіа метотрексат (МТХ та ін.). Однак оскільки лікуваль-

Зйирсоттійеє ої Ше Оіадповзіїс апа Тнегареціїйс ні ефекти відрізняються у кожного пацієнта, слід

Соттінеє ої (пе Атегісап АНештаїййзт Аззосіайоп, очікувати розробки більш ефективних терапевтич-

Апіпгйі5 КПпецшт 20 (Зиррі): 195, 1977). В Європі них схем.

Європейська ліга проти ревматизму (БШГАК) Хвороба Стілла, вперше описана британським склала класифікацію, яка хоча й відрізняється від педіатром Стіллом у 1897р., має клінічну картину, вищенаведеної класифікації АКА тим, що трива- чітко відмінну від ревматоїдного артриту у дорос- лість артриту складає З місяці і більше та тим, що лих, і являє собою захворювання, що зустрічаєть- з неї виключені артрити, викликані псоріазом, анкі- ся і у дітей, і у дорослих (особливо у підлітків), при лозивним спондилітом та ін., проте вона визнає ті цьому основні симптоми -лихоманка, еритема, ж З типи захворювань (ВшиПеїйп 4, Мотепсіашге апа артрит, серозит і т.п. Виникаючий у дорослих тип

Сіаззійсанйоп ої Ап іп Спіідгеп. Вазеї, Майопаї називають дорослою формою хвороби Стілла. 7ешпад Аа, 1977). При хворобі Стілла аналіз на ревматоїдний фак-

Нещодавно була зроблена спроба перегляду тор звичайно негативний. класифікації і Міжнародна ліга Асоціацій з ревма- У дітей хвороба Стілла є іншою назвою юна- тології (ІГАК) запропонувала у 1995 р. проект кла- цького ревматоїдного артриту системного типу (він сифікації дитячих ідіопатичних артритних захво- же юнацький ревматоїдний артрит (КА), юнаць- рювань ІРіпк СМУ, Ргорозаї! тог їпе демеюртепі ої кий хронічний артрит (СА), юнацький ідіопатичний сіаззійсайоп спїепйа ог ідіораїіс апнійіде5 ої артрит (ЛА)), який являє собою хронічний артрит, спідйпоод. 9. КПпешйтаїйо!., 22: 1566 (1995)), а у що виникає у дітей до 16 років. Як причини хворо- 1997р. цей варіант був висунутий як проект І АВ би Стілла називали такі екологічні фактори, як (бБошймжооа ТА, Сіаззіїуіпд сппанпоса апнитйів, Апп. віруси, такі фактори організму, як антигени НГА, і

КПпеийт. Оів5. 56: 79 (1997)). Ця класифікація перед- імунологічні розлади, проте етіологія все ще за- бачає поділ на 1) системний артрит, 2) ЕЕ- лишається незрозумілою. позитивний поліартрит, 3) КЕ-негативний поліарт- Хвороба Стілла у дорослих і хвороба Стілла у рит, 4) олігоартрит, 5) розширений олігоартрит, 6) дітей вважаються майже однаковими захворюван- артрит, зв'язаний з ентезитом, 7) псоріазний арт- нями, хоча й спостерігаються незначні відмінності рит і 8) інші. у клінічній картині, разом з віком виникнення хво-

Крім того, автори даного винаходу пропонува- роби. Хвороба Стілла у дітей означає УКА систем- ли спосіб класифікації дитячих хронічних артрит- ного типу, як описано вище. Проте УКА і ревматої- них захворювань на: дний артрит (КА) у дорослих відрізняються 1) первинні дитячі хронічні артритні захворю- клінічно за багатьма ознаками і розглядаються як вання, у тому числі: різні захворювання, тому хвороба Стілла у дорос- (1) синдром ЗРКАБЗН (гострі напади лихоман- лих часто розглядається як особливе незалежне ки, перикардит, висип, артрит, спленомегалія, ге- захворювання серед ревматичних хвороб. патомегалія). Розпочинається з підвищення тем- Діагностичні критерії хвороби Стілла у дорос- ператури при розслабленні і появи висипань, лих відомі в описанні Матадиспі Уоцгпа! ої спостерігається серозит та гепатомегалія з одно- АПештайюіІоду 19(3): 4424-30, 1992), Недіпаю часним або відстроченим виникненням артриту, (Зетіпаге іп Аппгйв 8 АНешйтайвт 17(1): 39-57, хоча іноді артрит й не спостерігається; 1987Ї, Сбивп (Впейтаююду Стапа /Вошпав, (2) ідіопатичні дитячі хронічні артритні захво- Опімегейу ої Рійеригой Медіса! Сепіег; Чап. 30, рювання. Відсутнє основне захворювання, головна 1984), Соїдтап (Зоцінегп Меадіса! Чоигпа! 73: 555- патологія - артрит; 563, 19801 та ін. а) позитивні на ревматоїдний фактор (КЕ- Що стосується взаємозв'язку між хворобою позитивний тип) Стілла і цитокінами, то були повідомлення про

Б) позитивні на антиядерні антитіла (АМА- зв'язок з такими цитокінами, як 1І--1, 1-2, 11.-4, 1-6, позитивний тип) 1-7, 1С-8, 11-10, ТМЕ-о, ІЕМ-у, а такі запальні цито- с) АР/АМА-негативний тип; кіни, як І--1, 1-6, ТМЕ-о, ІЕМ-у, вважаються залу- 2) вторинні дитячі хронічні артритні захворю- ченими в патологію хвороби Стілла. вання. Артрит може супроводити первинні спадко- Стосовно 1-6 було повідомлення де Вепедейі ві або неспадкові захворювання |(Зпипреї МокКоїа, еї аі. про те, що рівень 1-6 підвищується при хво-

робі Стілла у дітей (Аппгйі5 ЕПпейт. 34: 1158, терапії класифікація типів дитячих хронічних арт- 1991), а у сироватці дітей, що страждають на хво- ритних захворювань зараз піддається перегляду у робу Стілла, виявлено високий вміст комплексу ІІ - всьому світі, можна сказати, вона знаходиться у б/розчинний рецептор 1--6 (51 -6К) і спостерігаєть- стані невизначеності. Переважними предметами ся кореляція між рівнем цього комплексу і рівнем лікування за допомогою терапевтичного засобу

С-реактивного білка (СЕР) |У. Сііп. Іпмеві. 93: 2114, даного винаходу є: за класифікацією АКА - систе- 19941. Крім того, Коопеу еї аї. повідомляли, що мні, багатосуглобові і малосуглобові; за класифі- рівні І--6 і ТМЕ-а у плазмі підвищуються у дітей, кацією ЕШГАЕ - системні, багатосуглобові і оліго- що страждають на хворобу Стілла |Вг. 9. суглобові; за класифікацією АК - системні,

Апеитай!і. 34: 454, 1995). багатосуглобові (КЕ-позитивні), багатосуглобові

Як спосіб лікування хвороби Стілла застосову- (АЕ-негативні), олігоартрит і розширений олігоарт- валися нестероїдні протизапальні засоби, корти- рит; за класифікацією авторів даного винаходу - костероїди, протиревматичні засоби (сполуки зо- первинні дитячі хронічні артритні захворювання лота та ін.), імунодепресанти, композиції у- (синдром ЗРЕАФБН, ідіопатичні дитячі хронічні арт- глобуліну, метотрексат (МТХ та ін.). Однак оскіль- ритні захворювання - а) позитивні на ревматоїдний ки лікувальні ефекти відрізняються у кожного паці- фактор (КЕ-позитивний тип), Б) позитивні на анти- єнта, слід продовжити розробку більш ефективних ядерні антитіла (АМА-позитивний тип), с) КР/АМА- терапевтичних схем. негативний тип); а найбільш переважними пред-

Отже, даний винахід передбачає новий тера- метами лікування є: за класифікацією АКА - певтичний засіб для захворювань, споріднених системні і багатосуглобові; за класифікацією дитячим хронічним артритним захворюванням, ЕЦАВ - системні і багатосуглобові; за класифіка- причому даний засіб належить до іншого типу, ніж цією АВ - системні, багатосуглобові (РКЕ- традиційні терапевтичні засоби для захворювань, позитивні), багатосуглобові (КЕ-негативні) і роз- споріднених дитячим хронічним артритним захво- ширений олігоартрит; за класифікацією авторів рюванням. Відповідно до даного винаходу захво- даного винаходу - первинні дитячі хронічні артрит- рювання, споріднені дитячим хронічним артритним ні захворювання (синдром ЗРКАЗН, ідіопатичні захворюванням, включають власне дитячі хронічні дитячі хронічні артритні захворювання - а) КЕ- артритні захворювання і хворобу Стілла. позитивний тип, Б) АМА-позитивний тип). Ще більш

Після інтенсивного та всебічного дослідження переважними предметами лікування є: за класифі- цих проблем автори даного винаходу виявили, що кацією АРВА - системні і багатосуглобові; за класи- антагоніст інтерлейкіну-б (1/-6) має лікувальний фікацією ЕЦІАК - системні і багатосуглобові; за ефект при захворюваннях, споріднених дитячим класифікацією І АК - системні, багатосуглобові хронічним артритним захворюванням, і створили (АЕ-позитивні) і розширений олігоартрит; а за кла- даний винахід. сифікацією авторів даного винаходу - первинні

Отже, даний винахід передбачає терапевтич- дитячі хронічні артритні захворювання (синдром ний засіб для захворювань, споріднених дитячим ЗРЕАБН, ідіопатичні дитячі хронічні артритні за- хронічним артритним захворюванням, що включає хворювання - а) КЕ-позитивний тип). антагоніст інтерлейкіну-б (ІІ-6) як активного інгре- Антагоністи І--6 для даного винаходу можуть дієнта. бути будь-якого походження, будь-якого типу і

Зокрема, даний винахід передбачає терапев- будь-якого виду, якщо тільки вони мають терапев- тичний засіб для дитячих хронічних артритних за- тичний ефект на захворювання, споріднені дитя- хворювань, що включає антагоніст інтерлейкіну-б чим хронічним артритним захворюванням. (І--6) як активного інгредієнта. Антагоністи І--6 - це речовини, які блокують

Даний винахід також передбачає терапевтич- передачу сигналу від 1-6 і інгібують біологічну ний засіб для хвороби Стілла, що включає антаго- активність 1І--6. Антагоністи 1--6 - це речовини, які ніст інтерлейкіну-6 (ІІ -6) як активного інгредієнта. переважно мають інгібувальну дію на зв'язування

Вищезазначений антагоніст І/-6 переважно є самого І--6, зв'язування з рецептором 1-6 або з антитілом до рецептора 1-6, переважно монокло- арізо. Як приклад антагоністів ІЇ-6 можна навести нальним антитілом до рецептора І/-6 людини або антитіла до 1І--6, антитіла до рецептора І--6, анти- моноклональним антитілом до рецептора 1-6 ми- тіла до др130, перебудований 1-6, розчинний пе- ші. Як приклад моноклонального антитіла до ре- ребудований рецептор 1-6, часткові пептиди 1-6 цептора І--6 людини можна навести антитіло РМ- або рецептора 1І/-6, а також низькомолекулярні 1, а як моноклональне антитіло до рецептора 1-6 речовини, що мають схожу активність. миші можна навести антитіло МК 16-1. Антитіла до І--6 для даного винаходу можна

Вказане антитіло переважно являє собою хи- одержати у вигляді поліклональних або монокло- мерне антитіло, гуманізоване антитіло або антиті- нальних антитіл, використовуючи один з відомих ло людини, наприклад, гуманізоване антитіло РМ- методів. Як антитіла до 1-6 для даного винаходу 1. переважні моноклональні антитіла, особливо які

До дитячих хронічних артритних захворювань, походять від ссавців. Моноклональні антитіла, що які є предметом лікування за допомогою терапев- походять від ссавців, включають антитіла, одер- тичного засобу даного винаходу, належать всі за- жані у гібридомі, і антитіла, одержані методами хворювання у вищенаведених класифікаціях АКА, генної інженерії в організмі хазяїна, трансформо-

ЕШГАК і ГАК, а також у класифікації авторів дано- ваного експресійним вектором, що містить ген ан- го винаходу. З подальшим прогресом у методах титіла. Такі антитіла за допомогою зв'язування 1--6 серологічної діагностики і прогресом у методах блокують зв'язування 1-6 з рецептором 1-6 і тим самим блокують поширення біологічної активності за умовами Будапештського договору у вигляді

ІІ -6 у клітині. гібридоми пацюк/миша МЕ 16-1 в Міжнародний

Приклади таких антитіл включають антитіло депозитарій патентованих організмів у Національ-

МНІ166 (Маїзида еї а!., Єиг. 9. Іттипоїоду (1998) ному інституті промислової науки та технології 18, 951-956), або антитіло 5К2 (За еї аІ., Тпе 2151 ІСепіга! 6, 1-1-1 Нідазпї, Теикиба Сіїу, Ібагакі Ргеї.,

СепегаІ Мееєїйпуд ої Ше дарапезе Босієїу юг 305-5466 Чдарап| як РЕЕМ ВР-5875.

Іттипоїіоду, Саки)ши Кігоки (1991) 21, 1661 та ін. Гібридому, що продукує моноклональні антиті-

Гібридому, що продукує антитіла до 1-6, по ла до рецептора 1-6, по суті можна створити од- суті можна створити одним з відомих методів, як ним з відомих методів, як описано нижче. Так, ре- описано нижче. Так, І--6 використовують як сенси- цептор І/-6 використовують як сенситизуючий тизуючий антиген для проведення імунізації стан- антиген для проведення імунізації стандартним дартним методом імунізації, а одержані при цьому методом імунізації, а одержані при цьому імунні імунні клітини зливають з відомими батьківськими клітини зливають з відомими батьківськими кліти- клітинами стандартним методом злиття клітин, нами стандартним методом злиття клітин, після після чого скринують клітини, що продукують мо- чого скринують клітини, що продукують монокло- ноклональне антитіло, стандартним методом нальне антитіло, стандартним методом скрину- скринування. вання.

Зокрема, антитіла до І--6 можна одержати на- Зокрема, антитіла до рецептора І/-6 можна ступним чином. Наприклад, 1-6 людини, що вико- одержати наступним чином. Наприклад, рецептор ристовується як сенситизуючий антиген для одер- І--6 людини, що використовується як сенситизую- жання антитіл, можна одержати за допомогою гена чий антиген для одержання антитіл, можна одер- або амінокислотної послідовності ІІ -6, які описані жати за допомогою гена або амінокислотної послі- в (Ешг. 9. Віоспет. (1987) 168, 543-550; 9. Іттипо|. довності рецептора 1-6, описаної в (Еигореап (1988) 140, 1534-1541; Адг. Віої. Спет. (1990) 54, Раїепі Арріїсанйоп Мо. ЕР 325474), а рецептор 1І--6 2685-2688. миші можна одержати за допомогою гена або амі-

Після уведення послідовності гена 1-6 у відо- нокислотної послідовності рецептора 1-6, описа- мий експресійний вектор і трансформації придат- них в Чарапезе Опехатіпей Раїепі Рибіїсайоп них клітин хазяїна білок 1-6 можна виділити з клі- (КокКаї) Мо. 3-155795). тин хазяїна або з супернатанта його культури Існує 2 типи рецепторів І--6: рецептор 1-6, одним з відомих методів і використати очищений експресований на клітинній мембрані, і І--6, відо- білок 1-6 як сенситизуючий антиген. Як альтерна- кремлений від клітинної мембрани розчинний ре- тива можна використовувати злитий білок, що цептор І--6, |"азиКамжма еї аї., У. Віоспет. (1990) складається з білка 1-6 і ще одного білка як сен- 108, 673-676). Розчинний рецептор 1І--6 в основно- ситизуючого антигена. му складається з позаклітинної частини рецептора

Антитіла до рецептора І/-6 для даного вина- І/-6, зв'язаного з клітинною мембраною, і відрізня- ходу можна одержати у вигляді поліклональних ється від мембрано-зв'язаного рецептора 1-6 тим, або моноклональних антитіл, використовуючи що у нього відсутня трансмембранна частина або і один з відомих методів. Як антитіла до рецептора трансмембранна частина, і внутріклітинна частина.

І/-6 для даного винаходу переважні моноклональ- Білок рецептора 1-6 може бути будь-яким з реце- ні антитіла, особливо які походять від ссавців. Мо- пторів І--6, аби його можна було використовувати ноклональні антитіла, що походять від ссавців, як сенситизуючий антиген для одержання антитіл включають антитіла, одержані у гібридомі, і анти- до рецептора 1-6 для даного винаходу. тіла, одержані методами генної інженерії в органі- Після уведення гена, що кодує рецептор І/--6, у змі хазяїна, трансформованого експресійним век- відомий експресійний вектор і трансформації при- тором, що містить ген антитіла. Такі антитіла за датних клітин хазяїна необхідний білок рецептора допомогою зв'язування 1-6 блокують зв'язування І--6 можна виділити з клітин хазяїна або з супер-

І/-6 з рецептором 1-6 і тим самим блокують по- натанта його культури одним з відомих методів і ширення біологічної активності ІІ--6 у клітині. використовувати очищений при цьому білок реце-

Приклади таких антитіл включають антитіло птора 1І--6 як сенситизуючого антигена. Як альтер-

МА16-1 |(Татига Т. еї а!ї., Ргос. Маї!. Асайд. 5сі. ОБА натива можна використовувати клітини, що екс- (1993) 90, 11924-11928), антитіло РМ-1 (Нігайа У. єї пресують білок рецептора 1-6, або злитий білок, а!., У. Іттипоіоду (1989) 143, 2900-2906), антитіло що складається з білка рецептора 1-6 та ще одно-

АК1Т2-20, АШКб4-7 або АШК146-15 (Іпіегпайопаї! го білка, як сенситизуючого антигена.

Раїепі Арріїсайоп УМО 92-19759| та ін. З них най- Клітини Езспегіспіа соїї (Е. соїї), що містять більш переважним є антитіло РМ-1. плазміду ріІВІВ5Е2К, яка несе кКДНК, що кодує ре-

До речі, лінія клітин гібридоми, що продукує цептор 1І--6 людини, були здані 9 січня 1989р. на антитіло РМ-1, була здана 12 липня 1988р. на міжнародне зберігання за умовами Будапештсько- міжнародне зберігання за умовами Будапештсько- го договору у вигляді НВ101-рІВІВ5Р2К в Міжна- го договору у вигляді РМ-1 в Міжнародний депози- родний депозитарій патентованих організмів у тарій патентованих організмів у Національному Національному інституті промислової науки та інституті промислової науки та технології (Сепігаї технології Сепіга! 6, 1-1-1 Нідавні, Тгикира Су, б, 1-1-1 Нідавні, Теикибра Сіїу, Ібагакі Ргеї., 305- Ірагакі Ргеї., 305-5466 Чарап як РЕКМ ВР-2232. 5466 дарап| як РЕМ ВР-2998. Також і лінія клітин Антитіла до одрізо для даного винаходу можна гібридоми, що продукує антитіло МЕ 16-1, була одержати у вигляді поліклональних або монокло- здана 13 березня 1997р. на міжнародне зберігання нальних антитіл, використовуючи один з відомих методів. Як антитіла до рдріЗо для даного винаходу методом виділяють імунні клітини з тварини і під- переважні моноклональні антитіла, особливо які дають злиттю. Як переважний приклад імунних походять від ссавців. Моноклональні антитіла, що клітин, що піддаються злиттю, можна відзначити походять від ссавців, включають антитіла, одер- клітини селезінки. жані у гібридомі, і антитіла, одержані методами Батьківські клітини, з якими проводять злиття генної інженерії в організмі хазяїна, трансформо- вищезазначених імунних клітин, - це клітини міє- ваного експресійним вектором, що містить ген ан- ломи ссавців, до яких переважно належать різні титіла. Такі антитіла за допомогою зв'язування відомі клітинні лінії, такі як Р3ЗХб3А9д8.653 (Кеатеу дріЗзо блокують зв'язування одрізо з комплексом І! - У.Е. ек аї,, у. Іттипої. (1979) 123, 1548-1550), б/рецептор 1-6 і тим самим блокують поширення РЗХхбЗАдви.І (Сцтепі Торісв іп Місгобіоюду апа біологічної активності 1-6 у клітині. Іттипоіоду (1978) 81, 1-7), М5-1 (Копіег 2. апа

Приклади таких антитіл включають антитіло Міївієїп С, Еиг. 9. Іттипої. (1976) 6, 511-519), МРО-

АМб4 Юарапезе Опехатіпей Раїепі Рибіісавноп 11 (Магошієв О.Н. еї аї., Сеї! (1976) 8,405-415), (Кокаї) Мо. 3-219894), антитіло 4В11 і антитіло 2Н4 ЗР2/О (5пцІтап М. еї аї., Машге (1978) 276, 269- (05 5571513))|, антитіло В-512 і антитіло В-Р8 270), БО (де 5. Соїй 5.Е. єї аї., 9. Іттипо).

Чарапезе Опехатіпей Раїепі Рибіїсайоп (Кокаї) Меїподз (1980) 35, 1-21), 5194 (Ттомогіаде 1.5., 9.

Мо. 8-2911991 та ін. Ехр. Мед. (1978) 148, 313-323), 210 (Саце С. єї

Гібридому, що продукує антитіла до одріЗоО, по аі., Машге (1979) 217, 131-133) та ін), які можна суті можна створити одним з відомих методів, як використовувати при необхідності. описано нижче. Так, дріЗО використовують як сен- Злиття між вищезазначеними імунними кліти- ситизуючий антиген для проведення імунізації нами і клітинами мієломи по суті можна проводити стандартним методом імунізації, а одержані при відповідно до одного з відомих методів, напри- цьому імунні клітини зливають з відомими батьків- клад, описаного у |Міїєїеіїп еї аі. Копіег б. апа ськими клітинами стандартним методом злиття Міївієїп С, МеїШтоа» Епгутої. (1981) 73, 3-46) та ін. клітин, після чого скринують клітини, що продуку- Зокрема, злиття вказаних клітин проводять у ють моноклональне антитіло, стандартним мето- стандартному живильному середовищі за присут- дом скринування. ності, наприклад, прискорювача злиття клітин. Як

Зокрема, антитіла до рецептора І/-6 можна прискорювач злиття клітин можна використовува- одержати наступним чином. Наприклад, одріЗзо, що ти, наприклад, поліетиленгліколь (РЕС), вірус Се- використовується як сенситизуючий антиген для ндай (НУ) та ін., ії можна додати ад'ювант типу одержання антитіл, можна одержати за допомогою диметилсульфоксиду для підвищення ефективно- гена або амінокислотної послідовності арізЗо, опи- сті злиття. саних у Європейській патентній заявці Ме ЕР Переважно співвідношення між імунними клі- 411946). тинами і клітинами мієломи складає, наприклад, в

Послідовність гена дрізЗО можна вбудувати у 1-10 разів більше імунних клітин, ніж клітин мієло- відомий експресійний вектор і використовувати ми. Приклади культуральних середовищ для злит- цей вектор для трансформації придатних клітин тя вказаних клітин включають, наприклад, середо- хазяїна. З клітин хазяїна або з супернатанта його вище КРМІ 1640 і культуральне середовище МЕМ, культури можна виділити білок дріЗзо одним з відо- які придатні для вирощування вказаних клітинних мих методів і використати очищений білок 1-6 як ліній мієломи, а також стандартні культуральні сенситизуючого антигена. Як альтернатива можна середовища, що застосовуються для культивуван- використовувати клітини, що експресують арізо, ня клітин цього типу, з додаванням сироватки, на- або злитий білок, що складається з білка одрізЗо та приклад, ембріональної телячої сироватки (ЕС5). ще одного білка як сенситизуючого антигена. При злитті клітин задані кількості вказаних іму-

Переважно ссавців для імунізації сенситизую- нних клітин і клітин мієломи ретельно змішують у чим антигеном обирають з урахуванням їх суміс- зазначеному культуральному середовищі, в яке ності з батьківськими клітинами, що використову- доданий розчин РЕС, попередньо підігрітий приб- ються для злиття клітин, і звичайно до них лизно до 37"С, наприклад, розчин РЕС з серед- належать такі гризуни, як миші, пацюки і хом'яки, ньою молекулярною вагою від 1000 до 6000, в не обмежуючись лише ними. концентрації від 30 до 6095 (ваг/об), і перемішують

Імунізацію тварин сенситизуючим антигеном для одержання необхідних злитих клітин (гібри- проводять відомими методами. Наприклад, зага- дом). Потім, повторюючи по черзі додавання від- льноприйнятий метод включає внутрішньочере- повідного культурального середовища і центрифу- винне або підшкірне уведення сенситизуючого гування з видаленням супернатанта, можна антигена ссавцю. Зокрема, сенситизуючий анти- позбутися тих засобів для злиття клітин, які неба- ген, розбавлений і суспендований у необхідному жані для зростання гібридоми. обсязі фосфатного буфера (РВ5) або фізіологічно- Гібридому піддають селекції шляхом культи- го розчину і т.д., змішують з відповідною кількістю вування у стандартному селективному середови- поширеного ад'юванта, такого як повний ад'ювант щі, наприклад, культуральному середовищі НАТ

Фрейнда. Після емульгування його переважно (воно містить гіпоксантин, аміноптерин і тимідин). вводять ссавцю кілька разів через кожні 4-21 дня. Культивування у середовищі НАТ звичайно продо-

Крім того, можна використовувати придатного но- вжують протягом часу, достатнього для загибелі сія при імунізації сенситизуючим антигеном. всіх клітин, окрім потрібної гібридоми (тобто клі-

Після імунізації і підтвердження підвищення тин, що не злилися), звичайно від кількох днів до рівня необхідних антитіл у сироватці відповідним кількох тижнів. Виконується стандартний метод граничного розведення, при цьому проводиться Мопосіопа! Апііродіеєз, риріззней іп (Ше Опіей скринування та клонування гібридом, що продуку- Кіпддот ру Мастіїап Рибіїзпегв Па. 19901. ють потрібне антитіло. Зокрема, можна виділити мРНК, що кодує ва-

Разом з одержанням гібридоми шляхом імуні- ріабельну зону (мМ-зону) антитіла, з клітин, що про- зації тварини (не людини) антигеном також можна дукують дане антитіло, наприклад, гібридоми. Ви- сенситизувати лімфоцити людини іп міго за допо- ділення мРНК здійснюється шляхом одержання могою потрібного антигенного білка або антиген- тотальної РНК одним з відомих методів, напри- експресуючих клітин і одержати сенситизовані В- клад, гуанідиновим методом з ультрацентрифугу- лімфоцити, потім провести злиття їх з клітинами ванням ІСпігуміп .М. еї а!., Віоспетівігу (1979) 18, мієломи, наприклад, лінії 266, що має здатність 5294-5299), методом АСРС |Спотслупзвкі Р. еї аї., до постійного поділу, і одержати гібридому, що Апаї. Віоспет. (1987) 162, 156-159|, після чого з продукує потрібне антитіло людини, що має здат- тотальної РНК очищають мРНК за допомогою на- ність до зв'язування з потрібним антигеном або бору для очистки мРНК (фірми РПагтасіа) і т.п. З антиген-експресуючими клітинами (Чарапезе Рові- іншого боку, можна одразу одержати мРНК за до- ехатіпейа Раїепі Рибіїсайоп (КокоКи) 1-59878|. Крім помогою набору для очистки мРНК Омпіск Ргер (фі- того, трансгенну тварину з репертуаром генів ан- рми РПагтасіа). титіл людини можна імунізувати антигеном або З одержаної таким чином мРНК можна синте- антиген-експресуючими клітинами і одержати пот- зувати кКДНК У-зони антитіла за допомогою зворо- рібне антитіло людини відповідно до вказаного тної транскриптази. Синтезувати кКДНК можна за методу Ідив. Іпіегпайопа! Раїепі Арріїсайоп5 УМО допомогою набору для синтезу першої нитки кКДНК 93/12227, МО 92/03918, УМО 94/02602, МО зі зворотною транскриптазою АММУ і т.п. З іншого 94/25585, МО 96/34096, УМО 96/337351. боку, для синтезу та ампліфікації КДНК можна ви-

Одержані таким чином гібридоми, що проду- користати набір 5-Атрії Ріпаег КАСЕ (фірми кують моноклональні антитіла, можна підростити у Сіопіесп) і метод 5-КАСЕ (Ггоптап М.А. еї аї., стандартному культуральному середовищі або Ргос. Май). Асад. Осі. ОБА (1988) 85, 8998-9002; зберігати протягом довгого часу у рідкому азоті. ВеїуахуеКу А. еї аї., Мисієїс Асіаз Нез. (1989) 17,

Для того, щоб одержати моноклональні анти- 2919-2932), у якому застосовується ПЦР. Потріб- тіла з гібридоми, можна застосувати метод, у яко- ний фрагмент ДНК очищають з одержаного проду- му гібридому культивують стандартним методом і кту ПЦР і лігують з ДНК вектором. Крім того, з ньо- одержують антитіла у вигляді супернатанта, або го конструюють рекомбінантний вектор і вводять метод, у якому гібридому імплантують ссавцю, його в Е. соїї, колонії яких піддають селекції для сумісному з даною гібридомою, і вирощують в одержання потрібного рекомбінантного вектора. ньому, а антитіла одержують у вигляді асцитів. Послідовність основ даної ДНК можна встановити

Перший метод придатний для одержання антитіл відомим методом, наприклад, методом дидезоксі- високого ступеня чистоти, тоді як другий підходить основ. для широкомасштабної продукції антитіл. Після одержання ДНК, що кодує М-зону необ-

Наприклад, з гібридоми, що продукує антитіло хідного антитіла, її можна лігувати з ДНК, що кодує до рецептора І//-6, можна одержати поліпептид константну зону (С-зону) потрібного антитіла, а способом, розкритим в |арапезе Опехаттей потім вбудувати в експресійний вектор. З іншого

Раїепі Рибіїсайоп (КоКаї) Мо. 3-139293|). Можна боку, кодуючу М-зону антитіла ДНК можна вбуду- скористатися способом, у якому гібридому, що вати в експресійний вектор, що вже містить ДНК, продукує антитіло РМ-1, яка була здана 12 липня кодуючу С-зону антитіла. 1988 р. на міжнародне зберігання за умовами Бу- Для того, щоб одержати антитіло для викорис- дапештського договору в Міжнародний депозита- тання у даному винаході, ген антитіла вбудовують рій патентованих організмів у Національному ін- в експресійний вектор так, щоб він експресувався ституті промислової науки та технології (Сепігаї! 6, під керуванням особливої регуляторної ділянки, 1-1-1 Нідазні, Твикиба Сіїу, Ібагакі Ргеї., 305-5466 наприклад, енхансера і/або промотору. Після цьо-

Уарап| як РЕКМ ВР-2998, вводять внутрішньоче- го експресійний вектор вводять шляхом трансфо- ревинно мишам ВАГ В/с для одержання асцитів, з рмації в клітини хазяїна, які можуть експресувати яких можна виділити антитіло РМ-1, або способом, антитіло. у якому гібридому культивують у середовищі ЕРМІ Відповідно до даного винаходу, з метою зме- 1640, що містить 1095 ембріональної телячої сиро- ншення гетерологічної антигенності щодо людини ватки, 595 ВМ-Содітей Ні (фірми Воепгіпдег можуть застосовуватися штучно модифіковані

Мапппеїт), або у середовищі ЗЕМ для гібридом рекомбінантні антитіла, такі як химерні антитіла, (фірми сірсо ВКІ), середовищі РЕНМ-Ї! (фірми гуманізовані антитіла і антитіла людини. Такі мо- сірсо ВК), і т.п., з супернатанта якого можна виді- дифіковані антитіла можна одержати відомими лити антитіло РМ-1. методами.

Відповідно до даного винаходу, як моноклона- Химерні антитіла можна одержати шляхом лі- льне антитіло можна використовувати рекомбінан- гування вже одержаної ДНК, що кодує М-зону ан- тне антитіло, одержане шляхом клонування гена титіла, з ДНК, що кодує С-зону антитіла людини, а антитіла з гібридоми, вбудовування цього гена у потім вбудувати в експресійний вектор і ввести в відповідний вектор, який вводиться в організм ха- клітини хазяїна для вироблення в них антитіл (див. зяїна для одержання рекомбінантного антитіла Ецгореап Раїепі Арріїсайоп ЕР 125023 і методами генної інженерії, наприклад, (див. Іпіегпайопа! Раїепі Арріїсайоп У/ЛО 92-19759|. За

Вогераєск С.А.К. апа Іапіск .М., Тпегареціїс допомогою цього відомого методу можна одержа-

ти химерні антитіла, які застосовують у даному антигеном. Після з'ясування послідовності ДНК винаході. того 5СЕМ, яке зв'язується з антигеном, цю послі-

Плазміди, що містять М-зону І -ланцюга або М- довність можна використовувати для створення зону Н-ланцюга химерного антитіла РМ-1, одер- відповідного експресійного вектора і одержання жали назву рРРМ-КЗ і рРМ-ПІ, відповідно, і клітини антитіла людини. Такі методи вже відомі і їх можна

Е. соїї, що містять відповідні плазміди, були здані знайти у (МО 92/01047, МО 92/20791, УМО 11 лютого 1991р. на міжнародне зберігання за 93/06213, УО 93/11236, УМО 93/19172, МО умовами Будапештського договору як 95/01438 ії УМО 95/153881.

МСІМВ40366 і МСІМВ40362 в Національну колек- Гени антитіл, створені як описано вище, мо- цію промислових та морських бактерій (МСІМВ жуть бути експресовані і одержані одним з відомих

ІІтйеа). способів. У випадку клітин ссавців експресія може

Гуманізовані антитіла, які також називають пе- здійснюватися за допомогою ДНК, у якій функціо- ребудованими антитілами людини, одержують нально зв'язані один із загальновживаних промо- шляхом пересадження ділянки комплементарності торів, експресований ген антитіла і сигналполі А (СОК) з антитіла ссавця (не людини), наприклад, по 3'-бік від нього, або за допомогою вектора, що антитіла миші, в СОЕК антитіла людини. Загальна містить її. Як промотор/енхансер можна відзначи- технологія рекомбінантної ДНК для одержання ти, наприклад, найбільш ранній промо- таких антитіл також відома (див. Еогореап Раїепі тор/енхансер цитомегаловірусу людини.

Арріїсайоп ЕР 125023 і Іпгегпайопа! Раїепі Крім того, як промотор/енхансер, який можна

Арріїсайоп МО 92-197591. використовувати для експресії антитіла для даного

Зокрема, послідовність ДНК, призначену для винаходу, можна відзначити промотори/енхансери лігування СОК антитіла миші з каркасною ділян- таких вірусів, як ретровіруси, віруси поліоми, аде- кою (ЕК) антитіла людини, синтезують з кількох новіруси і вірус-40 мавп (5М40), і промото- окремих олігонуклеотидів, які частково перекри- ри/енхансери з клітин ссавців, такі як фактор елон- вають один одного на кінцях. Одержану при цьому гації людини 1 (НЕЕТо).

ДНК лігують з ДНК, що кодує С-зону антитіла лю- Наприклад, експресію можна легко здійснити дини, а потім вбудовують в експресійний вектор, за методом Миїїїдап еї а. (Миййдап К.С. еї аї., який вводять в клітини хазяїна для одержання Маїшге (1979) 277, 108-114), якщо застосовується антитіл Ідив. Ецгореап Раїепі Арріїсайоп ЕР промотор/енхансер 5М40, і за методом Мі2изпіта 239400 і Іпіегпайопа! Раїепі Арріїсайоп УМО 92- еї аї. |МігивНпіта 5. апа Мадаїа 5., Мисієїс Асіав 19759). Кев. (1990) 18, 53221, якщо застосовується промо-

Для лігування ЕК антитіла людини з СОК оби- тор/енхансер НЕРІа. рають такий СОЕК, який має придатний антигензв'- У випадку Е. соїї експресія може проводитися язувальний сайт. При бажанні можна замінити шляхом функціонального з'єднання одного із зага- амінокислоти в ділянці ЕК М-зони антитіла з тим, льновживаних промоторів, сигнальної послідовно- щоб СО гуманізованого антитіла міг утворити сті для секреції антитіла і екс пресованого гена відповідний антигензв'язувальний сайт ІЗаю К. еї антитіла з подальшою експресією. Як промотор а!І., Сапсег Вев. (1993) 53, 851-856). можна відзначити, наприклад, промотор іас7 і

Як С-зону антитіла людини можна використо- промотор агав. Можна використати метод Умага еї вувати, наприклад, Суї, Су2, СуЗз або Суд. С-зону аІ. (Мага Е.5. еї аї., Маштге (1989) 341, 544-546; антитіла людини також можна модифікувати для Мага Е.5. еї аі., РАБЕВ 3. (1992) 6, 2422-2427), того, щоб поліпшити стабільність антитіла і його якщо застосовується промотор Іас-, і метод ВенНег вироблення. еї а. (Венег М. єї аї., Зсіепсе (1988) 240, 1041-

Химерні антитіла складаються з М-зони анти- 10431, якщо застосовується промотор агав. тіла, що походить не з людини, і С-зони антитіла Як сигнальна послідовність для секреції анти- людини, а гуманізовані антитіла складаються з тіл, якщо вони продукуються у периплазмі Е. соїї, ділянки комплементарності (СОК) антитіла, що можна використовувати сигнальну послідовність походить не з людини, і каркасної ділянки (ЕВ) реї В (Геї 5.Р. еї аї., 9. Васіегіої. (1987) 169, 4379- антитіла людини, при цьому їх антигенність в ор- 4383). Після виділення антитіл, продукованих у ганізмі людини зменшується, тому вони застосовні периплазмі, структуру антитіл належним чином як антитіла для даного винаходу. відновлюють перед застосуванням, наприклад,

Як переважне втілення гуманізованого антиті- Ідив. УМО 96-30394). ла для даного винаходу можна відзначити гумані- Як початок реплікації можна використовувати зоване антитіло РМ-1 (|див. Іпіегпайопа! Раїепі ті, що походять з 5М40, вірусу поліоми, аденовіру-

Арріїсайоп МО 92-197591. сів, вірусу бичачої папіломи (ВРУ) і т.п. Крім того,

Як метод одержання антитіл людини, разом з для ампліфікації числа копій гена в системі клітин описаними вище, відомий метод одержання анти- хазяїна експресійні вектори можуть включати як тіл людини за допомогою "кадрування". Напри- селектовані маркери ген аміноглікозидтрансфера- клад, варіабельну зону антитіла людини експре- зи (АРН), ген тимідинкінази (ТК), ген ксантин-гуанін сують на поверхні фага методом фагового фосфорибозилтрансферази ЄЕ. соїї (ЕсодрІ), ген дисплея у вигляді одноланцюжкового антитіла дигідрофолатредуктази (ант) і т.п. (5СЕм) і проводять селекцію фага, що зв'язує анти- Для одержання антитіл для даного винаходу ген. Аналізуючи ген відібраного фага, можна іден- можна використовувати будь-які системи продук- тифікувати послідовність ДНК, що кодує варіабе- ції, причому системи продукції для одержання ан- льну зону антитіла людини, яка зв'язується з титіл включають системи продукції іп міго або іп мімо. Як систему продукції іп міго можна відзначити ген потрібного антитіла вбудовують в експресійний системи продукції, в яких застосовуються еукаріо- вектор для рослин, наприклад, РМОМ530, а потім тичні клітини, і системи продукції, в яких застосо- вектор вводять у бактерію типу Адгорасіегйнт вуються прокаріотичні клітини. їштетасіеєп5. Потім бактерію використовують для

При використанні еукаріотичних клітин в сис- інфікування тютюну типу Місойапа їарасит для темах продукції застосовуються клітини тварин, одержання потрібного антитіла з листя тютюну клітини рослин або клітини грибів. Відомі клітини Миїап К.-С. Ма еї аї., Єшиг. У. Іттипої. (1994) 24, тварин включають (1) клітини ссавців, такі як клі- 131-138). тини СНО, клітини СО5, клітини мієломи, ниркові При одержанні антитіл в системі продукції іп клітини хом'яків (ВНК), клітини Нега і клітини Мего; міго або іп мімо, як зазначено вище, ДНК, що кодує (2) клітини амфібій, такі як ооцити Хепорив5; (3) важкий ланцюг (Н-ланцюг) або легкий ланцюг (І- клітини комах, такі як 519, 5121 і Тп5. Відомі клітини ланцюг) антитіла по окремості вбудовують в екс- рослин включають, наприклад, клітини з калюсних пресійний вектор, а клітини хазяїна трансформу- культур Місоїапа їарасит. Відомі клітини грибів ють одночасно, або ДНК, що кодує Н-ланцюг або включають дріжджові клітини, наприклад, з роду І -ланцюг антитіла, вбудовують в один експресій- засспаготусев5, зокрема засспаготусевз сегемізіає, ний вектор і трансформують їм клітини хазяїна або нитчастих грибів, наприклад, з сімейства Ідив. Іпіегпайопаї! Раїепі Арріїсайоп УМО 94-11523).

АзрегодіПи5, зокрема Азрегойи» підег. Антитіла для даного винаходу можуть являти

При використанні прокаріотичних клітин в сис- собою фрагменти антитіл або їх модифіковані ва- темах продукції застосовуються клітини бактерій. ріанти, якщо тільки вони переважно застосовують-

Відомі клітини бактерій включають Е5спегіспіа соїї ся у даному винаході. Наприклад, як фрагменти і ВасшШив 5з,ибійів. антитіл можна відзначити Раф, Е(аб)2, Ем або од-

При уведенні шляхом трансформації гена не- ноланцюжкові Ем (5СЕм), у яких Ем ланцюгів Н ії. обхідного антитіла в ці клітини та культивуванні сполучені через відповідний лінкер. трансформованих клітин іп міго можна одержати Зокрема, антитіла обробляють ферментом, антитіло. Культивування проводиться відомими наприклад, папаїном або пепсином, одержуючи методами. Так, як культуральне середовище для фрагменти антитіл, або конструюють гени, що ко- клітин ссавців можна використовувати ОМЕМ, дують ці фрагменти антитіл, а потім вбудовують в

МЕМ, КРМІ1640, ІМОМ і т.п., у поєднанні з дода- експресійний вектор, який експресують у відповід- ванням сироватки типу ембріональної телячої си- них клітинах хазяїна, наприклад, (див. Со М.5. еї роватки (ЕС5). Крім того, антитіла можна одержу- аі., У. Іттипої. (1994) 152, 2968-2976; Вецег М. апа вати іп мімо, імплантуючи клітини, в які був Нопмії2 А.Н., Меїйпоа5 Епгутої!. (1989) 178, 476- уведений ген антитіла, у черевну порожнину тва- 496; Рішскігп А. апа 5Кеїта А., Меїод»5 Епгутої. рини і т.д. (1989) 178, 497-515; І атоуїі Е., Меїйоаз Епгутої.

Як системи продукції іп мімо можна відзначити (1986) 121, 652-663; Ноиззеаих .). еї аї., Мештоав системи, в яких застосовуються тварини, і систе- Еплутої. (1986) 121, 663-669; Віга К.Б. еї аї., ТІ ми, в яких застосовуються рослини. При викорис- ВТЕСН (1991) 9, 132-137). танні тварин в системах продукції застосовуються ЗсСЕМ можна одержати шляхом лігування М- ссавці або комахи. зони Н-ланцюга з М-зоною І -ланцюга антитіла. У

Із ссавців можна використовувати кіз, свиней, СЕМ М-зона Н-ланцюга лігована з М-зоною І1- овець, мишей і корів |Міскі Сіазег, Зресігшт ланцюга переважно через лінкер, більш прийнятно

Віоїесппоіоду Арріїсакйоп5, 1993|Ї. З комах можна пептидний лінкер (Нивіоп 4.5. еї аї., Ргос. Май. використовувати шовковичних черв'яків, а у випа- Асад. сі. ОБА (1988) 85, 5879-5883). М-зона Н- дку рослин - наприклад, тютюн. ланцюга і М-зона І -ланцюга у 5сЕм можуть походи-

Гени антитіл вводять у такі тварини і рослини, ти з будь-якого з вищезазначених антитіл. Як пеп- в яких їх продукують, а потім виділяють. Напри- тидний лінкер для лігування цих М-зон можна ви- клад, гени антитіл вбудовують посеред гена, що користовувати будь-який одноланцюжковий кодує білок, який неодмінно виробляється у моло- пептид, наприклад, що складається з 12-19 аміно- ці, наприклад, козиний Р-казеїн, і одержують злиті кислотних залишків. гени. Фрагменти ДНК, що містять злитий ген, в ДНК, що кодує зсЕм, можна одержати, викори- який був вставлений ген антитіла, уприскують в стовуючи як матрицю ДНК, що кодує Н-ланцюг або козиний ембріон і вводять його козі. Потрібне ан- МУ-зону Н-ланцюга даного антитіла, і ДНК, що кодує титіло одержують з молока, що виробляється тра- Ї-ланцюг або М-зону І-ланцюга даного антитіла, нсгенною козою, народженою від тієї кози, що ампліфікуючи відрізок ДНК, що кодує необхідну одержала ембріон або його потомство. Для того, амінокислотну послідовність з числа вказаних, щоб підвищити кількість молока, що містить необ- методом ПЦР за допомогою пари праймерів, ви- хідне антитіло, яке виробляється трансгенною значаючих обидва кінці її, а потім ампліфікуючи козою, їй можна вводити гормони за потреби (Ерегі ДНК, що кодує відрізок пептидного лінкера, разом

К.М. еї а!., Віо/Тесппоіоду (1994) 12, 699-702). з парою праймерів, визначаючих, що обидва кінці

При використанні шовковичних черв'яків їх ін- даної ДНК будуть ліговані з Н-ланцюгом і 1- фікують бакуловірусом, у який був вставлений ген ланцюгом, відповідно. потрібного антитіла, і необхідне антитіло можна Після конструювання ДНК, що кодує 5сгЕм, мо- одержати з рідкого середовища організму шовко- жна одержати стандартними методами експресій- вичного черв'яка (Маєда 5. еї аї., Маїшге (1985) ний вектор і клітини хазяїна, трансформовані да- 315, 592-594|. Крім того, при використанні тютюну ним вектором, після чого одержати 5сЕм з клітин Перебудований 1І--6 для даного винаходу яв- хазяїна стандартними методами. ляє собою речовину, що має активність зв'язуван-

Такі фрагменти антитіл можна одержати, ня з рецептором 1-6, але не викликає передачі створюючи їхні гени таким самим способом, як біологічної активності І-6. Так, незважаючи на те, вказано вище, і здійснюючи їх експресію в клітинах що перебудований 1-6 конкурує з І/-6 за зв'язу- хазяїна. "Антитіло" у даному винаході охоплює і ці вання з рецептором 1-6, він не поширює біологіч- фрагменти антитіл. ну активність І--6, тому перебудований 1-6 блокує

З числа модифікованих антитіл можна викори- передачу сигналів 1-6. стовувати антитіла, зв'язані з різними молекулами Перебудований І/-6 можна одержати уведен- типу поліетиленгліколю (РЕб). "Антитіло" у даному ням мутацій шляхом заміни амінокислотних зали- винаході охоплює й ці модифіковані антитіла. їх шків в амінокислотній послідовності І -6. Перебу- можна одержати шляхом хімічної модифікації оде- дований ІЇ/-6 можна одержати з 1-6 будь-якого ржаних антитіл. Такі методи вже визнані у цій га- походження, однак переважно він являє собою ІІ - лузі. 6 людини, враховуючи антигенність і т.п.

Антитіла, експресовані та одержані, як описа- Зокрема, можна встановити вторинну структу- но вище, можна виділити з внутрішнього чи зовні- ру амінокислотної послідовності І--6 за допомогою шнього середовища клітин або хазяїна, а потім однієї з відомих програм молекулярного моделю- очистити до гомогенного стану. Виділення і очист- вання типу М/НАТІЕ |Мгіепа еї аї., У. Мої. Сгарпіс5 ка антитіл для даного винаходу може здійснюва- (1990) 8, 32-56) і оцінити вплив на неї всіх замін тися методом афінної хроматографії. З колонок, амінокислотних залишків. Після визначення при- що застосовуються для афінної хроматографії, датних амінокислотних залишків можна ввести можна відзначити колонки з білком А і колонки з мутації, використовуючи вектор, що містить послі- білком 0. Приклади носіїв для колонок з білком А довність основ 1-6 людини, як матрицю для зага- включають, наприклад, Нурег 0, РОКО5, льновживаного методу ПЦР з тим, щоб здійснити зерпагозе Р.Р. (Рпаптасіа) і т.п. Крім того, можна заміну амінокислот і тим самим одержати ген, що використовувати загальновживані методи виді- кодує перебудований 1-6. Його можна вбудувати лення і очистка білків без будь-якого обмеження. відповідним чином у придатний експресійний век-

Інші методи хроматографії, відмінні від афінної тор для одержання перебудованого 1-6 відповідно хроматографії, фільтри, гель-фільтрацію, висолю- до вказаних вище методів експресії, виготовлення вання, діаліз і т.д. можна обирати і комбінувати і очистки рекомбінантних антитіл. відповідним чином для виділення та очистка анти- Конкретні приклади перебудованих 1-6 розк- тіл для даного винаходу. Хроматографія включає, риті у (Вгакепної єї аї., 9. Віої. Спет. (1994) 269, наприклад, іонообмінну хроматографію, гідрофоб- 86-93; Заміопо єї аІ., ЕМВО 4). (1994) 13, 1357-1367; ну хроматографію, гель-фільтрацію і т.п. Ці різно- МО 96-18648 ії УМО 96-17869). види хроматографії можна застосовувати у вигляді Часткові пептиди І/-6 або часткові пептиди високоефективної рідинної хроматографії (НРІ С). рецептора І--6 для даного винаходу являють со-

Також можна використовувати зворотнофазову бою речовини, що мають активність зв'язування з

НРІ С (ТрНРІ С). рецептором 1-6 або 1-6, відповідно, але не ви-

Концентрацію антитіл, одержаних як описано кликають передачі біологічної активності 1-6. Так, вище, можна визначити шляхом виміру поглинан- часткові пептиди 1-6 або часткові пептиди рецеп- ня або методом ЕГ І5А та ін. Так, при використанні тора І--6 зв'язуються і захоплюють рецептор 1-6 вимірів поглинання одержані антитіла відповідним або 1-6, відповідно, і таким чином специфічно чином розбавляють буфером РВ5(-) і вимірюють інгібують зв'язування І/-6 або рецептора 1-6. В поглинання при 28О0нм, після чого проводять роз- результаті цього вони не дозволяють передачу рахунки, використовуючи коефіцієнт поглинання біологічної активності І/-6 і тим самим блокують 1,35 ОО при ї1мг/мл. При використанні методу передачу сигналів 1-6.

ЕІЗА виміри проводять наступним чином. Так, у Часткові пептиди //-6 або часткові пептиди мікропланшет на 96 лунок (фірми Мипс) вносять по рецептора 1І--6 - це пептиди, що містять частину 100 мкл козиних антитіл проти ІЇДо людини (фірми або всю амінокислотну послідовність, що бере

Тадо), розбавлених до 1 мкг/мл у 0,1М бікарбонат- участь у зв'язуванні 1-6 або рецептора ІІ -6, в амі- ному буфері, рН 9,6, і інкубують при 4"С для імобі- нокислотній послідовності 1-6 або рецептора 1І--6. лізації антитіл. Після блокування додають по 100 Такі пептиди звичайно містять 10-80 амінокислот- мкл розбавлених антитіл для даного винаходу чи них залишків, переважно 20-50 амінокислотних зразків, що містять антитіла, або їЇдо людини (фі- залишків, більш прийнятно 20-40 амінокислотних рми Сарреї) як стандарт, і інкубують при кімнатній залишків. температурі протягом 1 години. Часткові пептиди І/-6 або часткові пептиди

Після відмивання додають 100мкл розбавле- рецептора І/-6 визначаються ділянками, що бе- ного у 5000 разів міченого лужною фосфатазою руть участь у зв'язуванні 1-6 або рецептора 1І--6, в антитіла проти (дО людини (фірми Віозоигсе) і амінокислотній послідовності І--6 або рецептора інкубують при кімнатній температурі протягом 1 І-6, і частину або усю цю амінокислотну послідов- години. Після відмивання додають розчин субст- ність можна одержати одним із загальновідомих рату і інкубують, після чого вимірюють поглинання методів, таких як методи генної інженерії або пеп- при 405 нм на зчитувальному приладі для мікро- тидного синтезу. планшетів Моде! 3550 (фірми Віо-Кад) і розрахо- Для того, щоб одержати часткові пептиди 1-6 вують концентрацію даних антитіл. або часткові пептиди рецептора ІЇ/-6 методами генної інженерії, послідовність ДНК, що кодує не- культуру І--6-залежної лінії клітин мієломи людини обхідний пептид, можна вбудувати в експресійний (56845, КРММ2), Т-лімфоми Леннерта КТЗ або ІІ - вектор таким чином, що їх можна буде одержати б-залежних клітин НМбО, В5Е2, до неї додають ІІ - вказаними вище методами експресії, виготовлення 6 і водночас, за присутності антагоніста І -6, ви- і очистки рекомбінантних антитіл. значають включення міченого ЗН-тимідину 1І--6-

Для того, щоб одержати часткові пептиди 1-6 залежними клітинами. Як альтернатива можна або часткові пептиди рецептора 1І/-6 методами додавати мічений 125І-ІЇ-6 одночасно з антагоніс- пептидного синтезу, можна використовувати один том ІС-6, а потім для оцінки визначати кількість із загальновживаних методів пептидного синтезу, міченого 125І-ІЇ.-6, що зв'язався з експресуючими наприклад, твердофазового синтезу або рідкофа- І/-6 клітинами. У цих системах визначення разом з зового синтезу. групою, у якій присутній антагоніст І-6, також ста-

Зокрема, можна використовувати методи, влять проби на негативний контроль, що не міс- описані в (2оКи Іуакипіппо Каїпаїзи, Мої. 14: тять антагоніста ІЇ/-6, і порівнюють результати,

Реріїде Зупіпевзівз" едієй Натакі Ма)їта, Нігокажа одержані в обох групах, для оцінки інгібування зЗпоїеп, 1991). З методів твердофазового синтезу активності 1--6 антагоністом 1-6. можна використати метод, у якому амінокислоту, Як показують наведені нижче приклади, оскі- що відповідає С-кінцю синтезованого пептиду, льки спостерігалися терапевтичні ефекти при уве- приєднують до основи, не розчинної в органічних денні антитіл до рецептора 1-6 дітям, що страж- розчинниках, а потім проводять реакцію конденса- дають на хронічний артрит, то це свідчить, що ції амінокислот, у яких а-аміногрупа і функціональ- антагоністи І--б6 типу антитіл до рецептора 1-6 на група бічного ланцюга були заблоковані відпо- мають терапевтичний ефект щодо захворювань, відними захисними групами, одну за одною у споріднених дитячим хронічним артритним захво- напрямі від С-кінця до М-кінця, чергуючись з реак- рюванням. цією, у якій група, що блокує а-аміногрупу аміноки- Об'єктами лікування у даному винаході є сса- слоти або пептиду, зв'язаного з смолою, піддаєть- вці. З ссавців об'єктом лікування переважно є лю- ся елімінації, і відбувається подовження ланцюга дина. пептиду. Твердофазовий пептидний синтез орієн- Терапевтичні засоби за даним винаходом для товно поділяється на метод Вос і метод Етос за- захворювань, споріднених дитячим хронічним арт- лежно від типу захисних груп. ритним захворюванням, можна призначати перо-

Після синтезу потрібного пептиду може прово- рально або парентерально для системного чи міс- дитися реакція деблокування або реакція відщеп- цевого застосування. Наприклад, можна обрати лення пептидного ланцюга від основи. Для реакції внутрішньовенне уведення типу краплинного вли- відщеплення пептидних ланцюгів у методі Вос вання, внутрішньом'язове уведення, внутрішньо- застосовується НЕ або трифторметансульфонова черевинне уведення, підшкірне уведення, свічки, кислота, а у методі ЕГтос звичайно застосовується клізми, таблетки з ентеросолюбільним покриттям і

ТЕА. У методі Вое смолу з блокованим пептидом т.д., а дозову схему обирають з обставин залежно обробляють НЕ за присутності анізолу. Після цього від віку та стану пацієнта. Ефективну дозу обира- можна проводити елімінацію захисної групи і від- ють в межах від 0,01мг до 10Омг на кг ваги тіла за щеплення від основи для одержання пептиду. Піс- один прийом. З іншого боку, можна обрати дозу від ля його ліофілізації одержують неочищений пеп- 1 до 1000мг, переважно від 5 до 5Омг, на одного тид. З іншого боку, у методі Етос реакцію пацієнта. деблокування і реакцію відщеплення пептидного Більш прийнятно доза і спосіб уведення, на- ланцюга від основи можна проводити способом, приклад, у випадку антитіл до рецептора 1-6, аналогічним вищеописаному. складають таку ефективну дозу, яка забезпечує

Одержаний неочищений пептид можна піддати вільні антитіла у крові, зокрема від 0,5мг до 40мг,

НРІС для його виділення та очищення. При елю- переважно від їмг до 20мг на кг ваги тіла за 1 юванні можна використовувати розчинник вода- місяць (4 тижні), які можна вводити за один прий- ацетонітрил, звичайно вживаний при очищенні ом або розділити на декілька прийомів, наприклад, білків, в оптимальних умовах. Збирають фракції, 2 рази на тиждень, 1 раз на тиждень, 1 раз на 2 що відповідають пікам на хроматограмі, а потім тижні, 1 раз на 4 тижні і т.д., наприклад, внутріш- ліофілізують. В очищених таким чином пептидних ньовенно, наприклад, краплинним вливанням, або фракціях проводиться визначення молекулярної підшкірно. Схему уведення можна модифікувати, ваги методом мас-спектроскопії, аналіз амінокис- подовжуючи інтервали від 2 разів на тиждень або лотного складу або аналіз амінокислотної послідо- 1 раз на тиждень до 1 разу на 2 тижні, 1 разу на З вності для їх ідентифікації. тижні, 1 разу на 4 тижні і т.д., залежно від спосте-

Конкретні приклади часткових пептидів ІІ-6 і режуваних симптомів та аналізів крові. часткових пептидів рецептора 1-6 розкриті у Терапевтичні засоби за даним винаходом для

Чарапезе Опехатіпей Раїепі Рибіїсайоп (Кокаї) захворювань, споріднених дитячим хронічним арт-

Мо. 2-188600, дарапезе Опехатіпей Раїепі ритним захворюванням, можуть містити фармаце-

Рибіїсайоп (КоКаї) Мо. 7-324097, дарапезе втично прийнятні носії і добавки залежно від спо-

Опехатіпей Рагїепі Рибіїсайоп (КокКаї) Мо. 8-311098 собу уведення. Приклади таких носіїв або добавок і 0.5. Раїепі Рибріїсайоп О5 5210075). включають воду, фармацевтично прийнятні орга-

Інгібування активності сигнального шляху 1-6 нічні розчинники, колаген, полівініловий спирт, антагоністами 1-6 даного винаходу можна оцінити полівінілпіролідон, карбоксивінілові полімери, на- загальновідомими методами. Зокрема, вирощують трієву карбоксиметилцелюлозу, поліакрилат на-

трію, альгінат натрію, водорозчинний декстран, продовжена потрійна терапія: преднізолон натрієвий карбоксиметилкрохмаль, пектин, метил- вфробен ж С5А, але СКР не зменшувався нижче целюлозу, етилцелюлозу, ксантан, гуміарабік, ка- 5мг/дл. зеїн, желатин, агар, дигліцерин, пропіленгліколь, Результат лікування поліетиленгліколь, вазелін, парафін, стеариловий Уведення почали з 2мг/кг. Оскільки не спосте- спирт, стеаринову кислоту, сироватковий альбумін рігалося побічних ефектів, дозу збільшили до людини (В5А), манітол, сорбітол, лактозу, фарма- 4мг/кг за схемою 1 раз на тиждень. Лихоманка, що цевтично прийнятні детергенти і т.п. Фактично ви- спостерігалася до цього, швидко минула, а приб- користовують добавки, обрані з вищеперелічених, лизно через 2 тижні аналіз на СЕР дав негативний не обмежуючись ними, або їх комбінації, залежно результат. Загальне нездужання пройшло і стан від лікарської форми. пацієнта дещо покращався. Стало можливим пос-

Приклади тупове зниження дози преднізолону до 1мг/день.

Даний винахід розкривається більш конкретно Як видно з цих результатів, МКА виявився нижче із залученням Робочих прикладів і Контро- ефективним при лікуванні дитячого хронічного льних прикладів, однак слід мати на увазі, що да- артритного захворювання, симптоми якого не вда- ний винахід не обмежується тільки цими прикла- валося контролювати навіть такими нестероїдни- дами. ми протизапальними препаратами, як аспірин і

Робочий приклад 1 фробен, тривалим прийманням ударних доз стеро-

Лікуванню за допомогою МЕА (гуманізованого їдів (преднізолону і метилпреднізолону) і такими антитіла до рецептора 1-6) піддавали пацієнта (5 імунодепресантами, як циклоспорин А і метотрек- років, чоловічої статі) з юнацьким ревматоїдним сат. Отже, можна стверджувати, що антагоністи ІІ - артритом системного типу з наступною історією 6, зокрема антитіла до рецептора 1-6, ефективні хвороби. як терапевтичний засіб для дитячих хронічних ар-

Історія хвороби до лікування тритних захворювань, зокрема системного типу за

Розвивалися симптоми з підвищенням темпе- класифікацією АКА, системного типу за класифі- ратури при розслабленні (лихоманка з одним під- кацією ЕШГАК, системного типу за класифікацією вищенням температури до 40"С протягом декіль- ІСАК і синдрому ЗРКАЗН за класифікацією авторів кох днів), артралгією в обох колінах і антгемою. даного винаходу.

Після встановлення діагнозу на основі лейкоцито- Робочий приклад 2 зу, негативного аналізу на антиядерні антитіла, Жінка 22 років. У квітні 1998р. виникла плями- негативного аналізу на ревматоїдний фактор, під- ста еритема на стегні, в ділянці серця та на паль- вищеної швидкості осідання еритроцитів, високого цях, а у травні з'явилася артралгія в ділянці плеча, рівня С-реактивного білка (СЕР) і т.д. було розпо- ліктів і колін, а також температура від 38 до 3976. чато уведення аспірину, однак не спостерігалося Незважаючи на приймання нестероїдних протиза- зменшення температури при розслабленні і арт- пальних препаратів (МЗА!ІО5), температура зали- ралгії, і загальний стан погіршився. Тому його за- шалася високою, і у липні з показниками лейкоци- мінили пероральним уведенням ударної дози сте- тів 18 10б0/мкл, СКР 18,Змг/дл і феритину у роїду (преднізолон, 30 мг/день) для більш сироватці 44Онг/мл пацієнтці був поставлений діа- швидкого покращення різних симптомів. Однак при гноз дорослої форми хвороби Стілла. З початку поступовому зниженні дози преднізолону симпто- січня 2000р. з'явилася температура від 39 до 407"С ми поновилися при 10 мг/день, пацієнт знову був і артралгія, що приписали нападу дорослої форми госпіталізований, підданий курсу лікування метил- хвороби Стілла (СКР 15,8мг/дл, феритин преднізолоном (птРБІ) і плазмаферезом, а потім 205,8нг/мл). комбінували з циклоспорином А (С5А) без жодного Оскільки було складно зменшити дозу стерої- поліпшення. Симптоми були тяжкими (лейкоцити дів, їх застосовували в комбінації з метотрексатом 400/мкл, СКР 11,2мг/дл), проводили плазма- (МТХ) і циклоспорином А (С5А), але це не допомо- ферез ж курс лікування тРБї ж С5А і пацієнт пе- гло стримати розвиток хвороби, яка утрудняла рейшов у стан ремісії. Як доліковування вводили дихання, так що над пацієнткою встановили на- преднізолон «-фробен для зменшення температу- гляд на випадок штучного дихання. Незважаючи ри при розслабленні і було клінічно відзначено на те, що стероїдна терапія дещо поліпшила пе- зниження температури, проте пов'язані із запа- ребіг хвороби, було розпочато лікування за допо- ленням аналізи крові залишалися високими могою гуманізованого антитіла до рецептора 1-6 (СЕР»5мг/дл) і після виписування з лікарні періо- внаслідок ускладнення тяжким остеопорозом. дично відзначалося підвищення температури при МЕКА (200мг) вводили шляхом краплинного внут- розслабленні, проте лікування і спостереження рішньовенного вливання через кожні 2 тижні. За- продовжували в основному амбулаторно. Але па- пальна реакція стала негативною на 6-й день піс- цієнт почав скаржитися на болі в спині, які усклад- ля уведення, зниження дози кортикостероїдів нювалися високою температурою, і після ретель- протікало спокійно і не спостерігалося важких по- ного огляду за допомогою МВІ і т.д. були виявлені бічних ефектів. деструктивні пошкодження у 4-у та 5-у грудних Як видно з цих результатів, МКА виявився хребцях, що свідчать про компресійні переломи. ефективним при лікуванні дорослої форми хворо-

Через необхідність полегшити навантаження на би Стілла, симптоми якої не вдавалося контролю- грудні хребці був прописаний постільний режим на вати навіть при комбінованому застосуванні МІХ і 1 рік, внаслідок чого м'язи нижніх кінцівок помітно С5А. Отже, можна стверджувати, що антагоністи ослабіли і ходіння стало зовсім неможливим. Була І--6, зокрема антитіла до рецептора 1-6, ефекти-

вні як терапевтичний засіб для хвороби Стілла, Гібридому, що продукує антитіла до 1-6 лю- зокрема, дорослої форми хвороби Стілла. дини, піддавали аналізу на зв'язування 1-6 насту-

Контрольний приклад 1. Одержання розчинно- пним чином. Так, мікропланшет на 96 лунок (фірми го рецептора І--6 людини Вбупагсеспі І арогаюгіев Іпс., АіІехапагіа, МА) з гнучко-

Розчинний рецептор 1-6 був одержаний мето- го полівінілу покривали протягом ночі 100мкл ко- дом ПЦР за допомогою плазміди рвзЕ2К.236, що зиних антитіл проти дсС миші (1Омкг/мл, фірми містить КДНК, яка кодує рецептор 1-6 і одержана Соорег Віотеадіса! Іпс., Маїмегт, РА) у 0,1М бікар- методом Уатазакі еї аї. (Матазакі еї аї., бсіепсе бонатному буфері (рН 9,6) при 4"С. Потім планшет (1988) 241, 825-828)|. Плазміду рВ5Б2К.236 роз- обробляли 100мкл РВ5, що містить 195 бичачого щеплювали рестрикційним ферментом 5рПї, оде- сироваткового альбуміну (В5А), при кімнатній тем- ржуючи кКДНК рецептора 1-6, яку вставляли в тр18 пературі протягом 2 годин. (фірми Атег5пат). За допомогою синтетичного Після відмивання планшета РВ5 у кожну лунку праймера, створеного для уведення стоп-кодону в додавали 100мкл супернатанту культури гібридо-

КДНК рецептора 1-6, вводили мутацію в КДНК ре- ми і інкубували протягом ночі при 4"С. Після від- цептора І--6 методом ПЦР за допомогою системи мивання планшета у кожну лунку додавали міче- мутагенезу іп міго (фірми Атег5пат). У такий спо- ний ІЛ--6 рекомбінантного типу до сіб був введений стоп-кодон у положенні аміноки- 2000срт/0,5нг/лунку і після відмивання вимірювали слоти 345 і була одержана кКДНК, що кодує роз- радіоактивність у кожній лунці на гамма-лічильнику чинний рецептор 1-6. |Весктап Сатта 9000, ВесКтап Іпевігитепів,

Для експресії розчинного рецептора 1-6 у клі- Ешіегпоп, СА). З 216 клонів гібридоми 32 клона бу- тинах СНО її лігували з плазмідою рем (фірми ли позитивними при аналізі на зв'язування 1-6.

РПпагтасіа), одержуючи плазміду рам! 344. КДНК Нарешті, з цих клонів був відібраний стабільний розчинного рецептора І/-6, розщеплену фермен- клон МНІТ66.В5Е2. Антитіло МНІ166 до 1-6 нале- тами Ніпані-Заї, вбудовували в плазміду жить до підтипу к-ІДа. рЕСЕанпІт, що містить кДНК ап, одержуючи плаз- Потім за допомогою 1 -б-залежного клону міду РЕСЕЯапітЗ344 для експресії у клітинах СНО. МНвбО.В5РЕ2 гібридоми миші досліджували нейтра- 10мкг плазміди РЕСЕапітЗ44 трансфекували у лізуючу активність антитіла МНІ1І6б щодо зростан- клітини апт-СнНоО лінії ЮХВ-11 |Опар с. еї аї., ня гібридоми. Клітини МНбЄО.В5Е2 поділяли на

Ргос. Май. Асад. сі. ОБА (1980) 77, 4216-4220) порції по 1х101/200мкл/лунку, до них додавали методом осадження фосфатом кальцію ІСпеп еї зразок, що містить антитіло МНІ166, і культивували а!., Мої. Сеїї. Віо!. (1987) 7, 2745-2751). Трансфеко- протягом 48 годин. Після додавання 0,5мкКі/лунку вані клітини СНО культивували протягом З тижнів ЗН-тимідину (Мем Епдіапа Мисієаг, Вовіоп, МА) у позбавленому нуклеозидів селективному сере- культивування продовжували ще 6 годин. Клітини довищі амЕМ, що містить 1їмММ глутаміну, 1095 поміщали на скловолоконний фільтр і піддавали діалізованої ЕС5, пеніцилін і стрептоміцин (по обробці на автоматичному маніпуляторі (Гаро 100бод./мл). Мав бсієпсе Со., Токуо, Чдарап). Як контроль ви-

Клітини СНО, що пройшли селекцію, скрину- користовували кроляче антитіло до 1-6. вали методом граничного розбавлення до одер- Результати показали, що антитіло МНІ166 інгі- жання одиничного клону клітин СНО. Клон клітин бувало індуковане 1І/-6 включення ЗН-тимідину

СНО вирощували за присутності 20-200нМ метот- клітинами МНбО.В5Е2 дозозалежним чином. Це рексату для виділення лінії 5ХЕ27 клітин СНО, що свідчить, що антитіло МНІ6б нейтралізує актив- продукує розчинний рецептор 1-6 людини. Клітини ність 1--6.

СНО лінії 5БЕ27 культивували у модифікованому Контрольний приклад 3. Одержання антитіла

Івсом середовищі Дюльбекко (ІМОМ, фірми сірсо) до рецептора 1-6 людини з додаванням 595 ЕС5. Збирали супернатант куль- Антитіло МТ18 до рецептора 1-6, одержане за тури і визначали у ньому концентрацію розчинного методом Нігаїа еї аї. ІНігахта У. еї аї., 9У. Іттипої. рецептора І--6 методом ЕГІЗА. Результати підт- (1989) 143, 2900-2906|, кон'югували з СМВг- вердили присутність розчинного рецептора 1-6 у активованою сефарозою 4В (фірми Рпагтасіа Ріпе супернатанті культури. Спетісаї!в5, Різсаїажау, МУ) для очистка рецептора

Контрольний приклад 2. Одержання антитіла І/-6 |Матавгакі єї а)ї., бсієпсе (1988) 241, 825-828. до І--6 людини Клітини мієломи людини лінії 0266 солюбілізували

Для імунізації мишей ВАГ В/с використовували в дигітоніновому буфері, що містить 1905 дигітоніну 10мкг 1--6 тканинного типу ІНігапо еї аї., Іттипої. (фірми ММУаісо Риге СПпетісаІ5), 1мМ пара-

Гей. (1988) 17, 41| разом з повним ад'ювантом амінофенілметансульфонілфториду гідрохлориду

Фрейнда, повторюючи імунізацію кожного тижня (фірми Умако Риге Спетіса!5), 10мММ триетанола- доти, поки не виявлялися антитіла до 1-6 у сиро- міну (рН 7,8) і 0,15 М Масі, і змішували з антитілом ватці. Імунні клітини виділяли з місцевих лімфати- МТ18, кон'югованим з бусинами сефарози 48. Піс- чних вузлів і зливали з клітинами мієломи лінії ля цього бусини промивали 6 разів дигітоніновим

РЗИ1 за допомогою поліетиленгліколю 1500. Се- буфером перед виділенням частково очищеного лекцію гібридом проводили за методом ої еї а). рецептора 1-6.

ІЗеїІесіїме Меїйой5 іп Сеїшаг Іттипоіоду, У/.Н. Мишей ВАГВ;с імунізували цим частково очи-

Егеетап апа Со., Зап ЕРгапсібзсо, 351, 19801), вико- щеним рецептором 1-6, одержаним з 3х109 клітин ристовуючи культуральне середовище НАТ, щоб Ц266, чотири рази через кожні 10 днів, а потім одержати гібридому, що продукує антитіла до 1-6 одержували гібридому стандартним методом. Су- людини. пернатанти культури гібридоми з позитивних по зростанню лунок аналізували на активність зв'язу- ІМОМ з додаванням 1095 РС5. З супернатанту вання рецептора 1-6 наступним чином. 5х10"7 клі- культури очищали розчинний рецептор 1І/-6 миші тин 0266 мітили З58-метіоніном (2,5мКі) і солюбілі- на колонці для афінної хроматографії, у якій анти- зували у дигітоніновому буфері. Солюбілізовані тіло К512 |див. вище заїюо Т. еї а. до рецептора клітини 0266 змішували з 0,04мл антитіла МТ18, І--6 миші було імобілізоване у гелі Айіде! 10 (фір- кон'юЮгованого з бусинами сефарози 4В, а потім ми ВіокКад). промивали 6 разів дигітоніновим буфером. Міче- 5Омкг одержаного при цьому розчинного реце- ний 358-метіоніном рецептор І/-б6 елюювали за птора І--6 миші змішували з повним ад'ювантом допомогою 0,25 мл дигітонінового буфера (рН 3,4) Фрейнда і вводили внутрішньочеревинно пацюкам і нейтралізували за допомогою 0,025мл 1М трис, Вістар. Через 2 тижні пацюки одержували підкріп- рн 74. лювальну імунізацію з неповним ад'ювантом 0, О05мл супернатанту культури гібридоми змі- Фрейнда. На 45-й день виймали клітини селезінки і шували з 0,00'мл білок (-сефарози (фірми 2Х10 клітин піддавали злиттю з 1х10 клітин мієло-

РПпагтасіа). Після відмивання сефарозу інкубували ми миші лінії РЗО!Т стандартним методом за допо- з 0,005мл розчину міченого 358-метіоніном рецеп- могою 5095 РЕС 1500 (фірми Воепйгіпдег тора І--6. Речовини, що випали при імунопреципі- Мапппеїт), а потім скринували гібридому в сере- тації, аналізували методом 505-РАСЕ для вияв- довищі НАТ. лення супернатанту культури гібридоми, який Після нанесення супернатанту культури на реагує з рецептором 1-6. В результаті цього був планшет, покритий кролячим антитілом проти ДО встановлений позитивний клон гібридоми РМ-1. пацюків (фірми Сарреї), проводили реакцію з роз-

Антитіло, одержане з гібридоми РМ-1, належить чинним рецептором І/-6 миші. Потім проводили до підтипу к-Ідаі. скринування гібридом, виробляючих антитіла до

Активність антитіла, який виробляється гібри- розчинного рецептора 1-6 миші, методом ЕГІЗА із домою РМ-1, в інгібуванні зв'язування 1-6 з реце- застосуванням кролячого антитіла до рецептора птором 1-6 оцінювали за допомогою клітин мієло- І--6 миші та міченого лужною фосфатазою овечо- ми людини лінії 0266. Рекомбінантний 1-6 людини го антитіла проти Ідс кролика. Клони гібридоми, у одержували з Е. соїї ІНігапо еї аї., Іттипої. Гей. яких була підтверджена продукція антитіл, підда- (1988) 17, 41-45| і мітили 125) за допомогою реакти- вали повторному скринуванню ще 2 рази для оде- ву Болтона-Хантера (Мем Епдіапа Мисіеаг, Вовіоп, ржання одиночного клону гібридоми. Цей клон

МА, Тада єї а)., У. Ехр. Мей. (1987)166,967-9811. одержав позначення МК16-1. 4х105 клітин 266 культивували за присутності Нейтралізуючу активність антитіла, що вироб- 7095 (М/М) супернатанту культури гібридоми РМ-! і ляється цією гібридомою, щодо передачі сигналу 1400Осрт міченого 1251-ІЇ -8 протягом 1 години. Від- І/-6 миші досліджували по включенню ЗН-тимідину бирали 7О0мкл і нашаровували на З0Омкл ЕС5 в клітинами МНб6О.в5Е2 ІМаїзида Т. еї аї., 9. поліетиленовій мікроцентрифугувальній пробірці Ітітипої. (1988) 18, 951-956). На 9б-лунковий на 400мкл, центрифугували, а потім визначали планшет наносили клітини МНбЄО.В5Е2 по 1 х 104 радіоактивність клітин. клітин/"200 мкл/лунку. У цей планшет додавали

Результати засвідчили, що антитіло, яке виро- 1О0нг/мл мишачого 1-6 і антитіло МЕ16-1 або 2512 бляється гібридомою РМ-1, інгібує зв'язування 1-6 у кількості від 12,3 до 1000Онг/мл і культивували з рецептором ІІ--6. при 37"С у 595 ССр протягом 44 годин, після чого

Контрольний приклад 4. Одержання антитіла додавали 1 мкКі/лунку ЗН-тимідину. Через 4 години до рецептора 1-6 миші вимірювали включення ЗН-тимідину. Результати

Моноклональне антитіло до рецептора 1-6 показали, що антитіло МЕ 16-1 інгібувало вклю- миші одержували за (методом заїйо Т. еї аї.,». чення Н-тимідину клітинами МНбО.В5Е2.

Іттипо). (1991) 147, 168-173). Таким чином, було показано, що антитіло, яке

Клітини СНО, що виробляють розчинний ре- виробляється гібридомою МЕ 16-1 (РЕКМ ВР- цептор І//-6 миші, культивували у середовищі 5874), інгібує зв'язування 1І--6 з рецептором 1-6.

Комп'ютерна верстка В. Клюкін Підписне Тираж 26 прим.

Міністерство освіти і науки України

Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна

ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601