[go: up one dir, main page]

UA129144C2 - T-клітинний рецептор - Google Patents

T-клітинний рецептор Download PDF

Info

Publication number
UA129144C2
UA129144C2 UAA201810441A UAA201810441A UA129144C2 UA 129144 C2 UA129144 C2 UA 129144C2 UA A201810441 A UAA201810441 A UA A201810441A UA A201810441 A UAA201810441 A UA A201810441A UA 129144 C2 UA129144 C2 UA 129144C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
variable domain
toc
chain
Prior art date
Application number
UAA201810441A
Other languages
English (en)
Inventor
Конор Гейз
Лінда Гібберт
Линда Гибберт
Натаніел Лідді
Натаниел Лидди
Тейра Ман
Тэйра Ман
Марін Раман
Марин РАМАН
Original Assignee
Іммунокор Лімітед
Иммунокор Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Іммунокор Лімітед, Иммунокор Лимитед filed Critical Іммунокор Лімітед
Publication of UA129144C2 publication Critical patent/UA129144C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується Т-клітинного рецептора (TCR), який зв'язує рестриктований по HLA-A*02 пептид GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1), що отриманий з ракового антигена зародкового типу MAGE A4. Вказаний TCR може містити неприродні мутації в межах варіабельних доменів альфа- та/або бета-ланцюгів відносно нативного TCR для MAGE A4. TCR придатний для застосування як імунотерапевтичний реагент для лікування злоякісного захворювання.

Description

Даний винахід стосується Т-клітинних рецепторів (ТОР), які зв'язують рестриктований по
НІГА-А"02 пептид СММОСАВЕНТМ (5ЕБО ІО МО: 1), що отриманий з ракового антигена зародкового типу МАСЕ А4. Вказані ТСА можуть містити неприродні мутації в межах варіабельних доменів альфа- та/або бета-ланцюгів відносно нативного ТОЕ для МАСЕ А4. ТОВ заданим винаходом є особливо придатними для застосування у ролі нових імунотерапевтичних реагентів для лікування злоякісного захворювання.
Передумови винаходу
Т-клітинні рецептори (ТСЕ) в природних умовах експресуються СО4- та СОВ8" Т-клітинами.
ТОВ призначені для розпізнавання коротких пептидних антигенів, які представлені на поверхні антигенпрезентувальних клітин у комплексі з молекулами головного комплексу гістосумісності (МНС) (у людини молекули МНС також відомі як антигени лейкоцитів людини або НІ А) |Оамів, єї а!., (1998), Аппи Вем Іттипої! 16: 523-544. СО8- Т-клітини, які також називають цитотоксичними
Т-клітинами, специфічно розпізнають пептиди, зв'язані з молекулами МНС класу І, та загалом відповідають за виявлення та опосередковування руйнування уражених захворюванням клітин.
СВ: Т-клітини здатні руйнувати ракові, а також інфіковані вірусом клітини; проте афінність ТОВ, які експресуються специфічними щодо раку Т-клітинами у природному репертуарі, як правило, є низькою внаслідок тимусної селекції, це означає, що ракові клітини часто уникають виявлення та руйнування. Нові імунотерапевтичні підходи, спрямовані на поліпшення розпізнавання раку
Т-клітинами, є дуже перспективною стратегією для розробки ефективних протиракових засобів лікування.
МАСЕ А4 належить до ракових антигенів родини МАСЕ, які кодуються генами зародкової типу (Ое Ріаєп, еї аї., (1994), Іттиподепеїййсв 40(5): 360-369), і має номер доступу Опіргої
Р43358. Було з'ясовано, що такі антигени часто експресуються в різних типах раку, в той час як їхня експресія у нормальних тканинах обмежується дорослими сім'яниками та іншими імунно- привілейованими частинами, включаючи плаценту. Специфічний зв'язок цих генів із типами раку робить їх ідеальними мішенями для протиракових терапевтичних препаратів. Точна функція МАСЕ А4 залишається невідомою, але вважається, що він бере участь в ембріональному розвитку. Повідомлялося про високий рівень експресії МАСЕ А4 в пухлинах деяких типів, включаючи меланому, типи ракових пухлин стравоходу, голови та шиї, легені, молочної залози та сечового міхура (Вегдегоп, (2009), Іпії ) Сапсег 125(6): 1365-1371; Сарегоп, еї а!., (2013), Мої Сеї| Ргоїеотісв 12(2): 381-394; Синеї, еї аї!., (2011), Іпї У Сапсег 128(11): 2625- 2634; ЕогоНапігага, еї аї., (2011), Сапсег Віо! ТНег 12(3): 191-197; Каїіті, єї а!., (2012), Сіїп Її шпд
Сапсег 13(3): 214-219; 5мородома, еї аї., (2011), Єиг ) Сапсег 47(3): 460-469). 10-мерний пептид а,МмравЕНТУМ (5ЕО ІО МО 1) відповідає амінокислотам 230-239 повнорозмірного білюьа МАСЕ
А4. Цей пептид зв'язується з НІ А-А"02, та, як було показано, комплекс пептид-НІ А стимулює цитотоксичні Т-клітини, що спричиняє лізис МАСЕ А4 позитивних, НІ А-А"02 позитивних пухлинних клітин (|ОиНоиг, еї аї., (1999), Єишг у) Іттипої 29(10): 3329-3337, та МО2000020445).
Отже, комплекс ШМУОСОНЕНТМУ-НІ А-А"02 забезпечує застосовний цільовий антиген для імунотерапевтичного втручання.
Ідентифікація конкретних послідовностей ТОВ, що зв'язуються з комплексом ОУУОСАЕНТУ-
НІГА-А"02 з високою специфічністю, сприяє розробці нових видів імунотерапії. Терапевтичні
ТСА можуть застосовуватися, наприклад, як розчинні націлювальні засоби, призначені для доставления цитотоксичних або імунних ефекторних агентів у пухлину (Гів5іп, еї аї., (2013). "Нідп-Айіпйу Мопосіопса! Т-сеїЇ гтесеріог (тТСА) Ривіоп5. Ривіоп Ргоївіп Тесппоіодіе5 ог
ВіорпатасешіїсаіІв: Арріїсайопе апа СНаПепде5". 5. В. Зсптіай! УМпеу; ВошпПег, еї аї., (2003),
Ргоївіїп Епду 16(9): 707-711; ІП ідау, еї а!., (2012), Маї Меа 8: 980-987), або, як альтернатива, їх можна застосовувати для конструювання Т-клітин, призначених для адоптивної терапії Шипе, еї аі.,, (2014), Сапсег Іттипо! Іттипоїйег 63(9): 969-975). Проте, з рівня техніки невідомі такі послідовності ТОВ, а способи ідентифікації ТОВ з характеристиками специфічності, придатними для терапевтичного застосування, мають високий показник відсіювання і, таким чином, не забезпечують фахівця обгрунтованим очікуванням успіху.
Насамперед фахівець повинен ідентифікувати придатну вихідну або каркасну послідовність.
Як правило, такі послідовності отримують з природних джерел, наприклад, з антигенреактивних
Т-клітин, екстрагованих з крові донора. Зважаючи на рідкість специфічних щодо раку Т-клітин у природному репертуарі, часто потрібно проводити скринінг багатьох донорів, наприклад, 20 або більше, перед тим, як можна буде знайти реактивну Т-клітину. Процес скринінгу може тривати кілька тижнів або місяців, та, якщо реактивна Т-клітина навіть виявлена, вона може бути непридатною для імунотерапевтичного застосування. Наприклад, відповідь може бути занадто слабкою та/або може бути неспецифічною щодо цільового антигена, як альтернатива, може 60 бути неможливим створення клональної популяції Т-клітин, розмноження або підтримування лінії даних Т-клітин, щоб отримати достатню кількість матеріалу для ідентифікації правильних послідовностей ланцюга ТС. Крім того, оскільки ТСА є виродженими та, як було прогнозовано, здатні зв'язувати приблизно один мільйон різних НІ А-пептидів (Муооіагіаде, еї аї., (2012), У Віої
Спет 287(2): 1168-1177), навіть досвідченим фахівцям надзвичайно важко визначити, чи має конкретний ТОВ профіль специфічності, який зробить його придатнім для конструювання засобу для терапевтичного застосування.
Послідовності ТОВ, що є придатними як вихідні або каркасні послідовності, повинні характеризуватися задовільною афінністю щодо цільового комплексу пептид-НІА, що становить, наприклад, 200 мкМ або більше, демонструвати високий рівень специфічності щодо мішені, наприклад, виявляти відносно слабке зв'язування або відсутність зв'язування з комплексами альтернативний пептид-НІ А, піддаватися змінам для застосування у дисплейних бібліотеках, таких як фаговий дисплей, і бути здатними до рефолдингу та очищення з високим виходом.
ТОВ, що існують у природі, характеризуються слабкою афінністю щодо цільового антигена (у низькому мікромолярному діапазоні) порівняно з антитілами, а ТОВ проти ракових антигенів, як правило, характеризуються більш слабким розпізнаванням антигена, ніж ТОВ, специфічні щодо вірусу |Аекзвіс, єї аї. (2012). Єи У Іттипої., 42(12), 3174-3179). Така слабка афінність разом із зниженням експресії НІ А на ракових клітинах означає, що терапевтичні ТСА, призначені для імунотерапії раку, потребують конструювання, щоб підвищити їхню афінність щодо цільового антигена і, таким чином, спричинити більш потужну відповідь. Для розчинних націлювальних засобів на основі ТСА необхідна афінність зв'язування з антигеном ТСА у діапазоні від наномолярної до пікомолярної, при цьому напівперіод зв'язування має становити декілька годин. Поліпшена активність, зумовлена розпізнаванням антигена з високою афінністю у разі невеликої кількості епітопів, наведена як приклад на фігурах Те та 1 з І ідау еї а!. (Піаау, еї аї. (2012), Маї Мед, 18(6), 980-987). Дозрівання афінності, як правило, передбачає, що фахівець має ідентифікувати специфічні мутації та/або комбінації мутацій, включаючи без обмеження заміни, вставки та/або делеції, які можуть бути введені до вихідної послідовності ТОВ, щоб підвищити ефективність розпізнавання антигена. Способи ідентифікації мутацій даного ТОВ, які забезпечують посилення афінності, відомі з рівня техніки, наприклад, застосування дисплейних бібліотек (Її еї аї., (2005) Маї Віоїеснпої. 23(3):349-354; Ноїег єї аї., (2000). Ргос Маї! Асай Зсі
ИБА; 97(10):5387-5392|. Однак, щоб забезпечити значне підвищення афінності даного ТОВ проти даної мішені, фахівець має вибирати специфічні мутації та/або комбінації мутації з великого пулу можливих альтернатив. Специфічні мутації та/або комбінації мутацій, які забезпечують значне підвищення афінності, не є прогнозованими, та спостерігається високий показник відсіювання. У багатьох випадках може бути неможливо досягти значного підвищення афінності із застосуванням даної вихідної послідовності ТОВ.
У процесі дозрівання афінності необхідно також враховувати необхідність збереження антигенної специфічності ТОВ. Підвищення афінності ТСОА щодо його цільового антигена призводить до суттєвого ризику прояву перехресної реактивності з іншими непередбачуваними мішенями внаслідок притаманної виродженості розпізнавання антигена в ТСА |М/ооіагідде, еї а!І., (2012), У Віої Снет 287(2): 1168-1177; М/іІзоп, еї а!., (2004), Мо! Іттипої 40(14-15): 1047- 1055; 7нао еї аї., (2007) 9У.Іттипої, 17959, 5845-5854) На природному рівні афінності розпізнавання перехресно реактивного антигена може бути занадто слабким для забезпечення відповіді. Якщо перехресно реактивний антиген представлений на нормальних здорових клітинах, цілком ймовірним є нецільове зв'язування іп мімо, що може проявлятися як клінічна токсичність. Таким чином, окрім забезпечення підвищення ефективності зв'язування з антигеном фахівцю необхідно вибирати мутації та/або комбінації мутацій, які дозволяють ТОВ зберігати високу специфічність щодо цільового антигена та демонструвати задовільний профіль безпеки в доклінічному тестуванні. До того ж, такі мутації та/або комбінації мутацій не є прогнозованими. Показник відсіювання на цій стадії є навіть більшим, і в багатьох випадках можна зовсім не досягти успіху, виходячи з даної вихідної послідовності ТОВ.
Мутації, необхідні для забезпечення високої афінності та високої специфічності, також повинні забезпечити ТСА, який може піддаватися експресії, рефолдингу та очищенню з припустимим виходом та який є дуже стабільним в очищеній формі.
Незважаючи на описані вище труднощі ідентифікації послідовностей ТОВ з відповідними характеристиками для терапевтичного застосування, автори даного винаходу несподівано виявили послідовність ТОВ, яка забезпечує ідеальну відправну точку або каркас для одержання терапевтичних ТОВ. Крім того, автори даного винаходу несподівано ідентифікували придатні мутації, які можуть вводитися в альфа та бета варіабельні домени каркасу, щоб одержати послідовності ТОВ з ідеальними характеристиками для імунотерапії на основі ТСА, що націлюється на типи раку, які експресують МАСЕ АХ.
Короткий опис винаходу
У першому аспекті даного винаходу передбачений Т-клітинний рецептор (ТСН), який характеризується властивістю зв'язування з ОСМУООИВЕНТУМ (5ЕО ІО МО: 1) у комплексі з НІ А-
А"02 та містить варіабельний домен альфа-ланцюга ТОВ та/або варіабельний домен бета- ланцюга ТСВ, при цьому варіабельний домен альфа-ланцюга містить амінокислотну послідовність, яка характеризується щонайменше 90 95 ідентичністю з послідовністю амінокислотних залишків 1- 113 з БЕО ІО МО: 2, та/або варіабельний домен бета-ланцюга містить амінокислотну послідовність, яка характеризується щонайменше 90 95 ідентичністю з послідовністю амінокислотних залишків 1- 1163 5ЕО ІО МО: 3.
Варіабельний домен альфа-ланцюга може містити амінокислотну послідовність, яка характеризується щонайменше 91 95, 92 95, 93 Ув, 94 ФУ, 95 У, 96 У, 97 9», 98 У», 99 95 або 100 95 ідентичністю з амінокислотами 1-113 з 5ЕО ІО МО: 2, та/або варіабельний домен бета-ланцюга може містити амінокислотну послідовність, яка характеризується щонайменше 91 95, 92 95, 93 9, 94 95, 95 У, 96 95, 97 У, 98 У, 99 У5 або 100 95 ідентичністю з амінокислотами 1-116 з ФЕО
ІО МО: 3.
У другому аспекті даного винаходу передбачений ТСА, що зв'язується з комплексом а,МмравЕНТМ (5ЕО ІО МО: 1)-НІ А-А"02 з афінністю, яка перевищує 200 мкМ, при цьому СОВ 1,2 ії 3 альфа-ланцюга містять 5ЕО ІО МО 6, 7 і 8 відповідно, та/або СО 1, 2 і З бета-ланцюга містять 5ЕО ІЮО МО 11, 12 їі 13 відповідно; тал"або щонайменше одна з СОЕ містить одну або декілька консервативних замін відносно 5ЕО І1О МО: 6-8 і 11-13; та/лабо щонайменше одна з СОВ містить не більше трьох допустимих замін відносно 5ЕО ІЮ МО: 6-8 і 11-13.
Афінність ТОВ за даним винаходом щодо комплексу ШСМУОСАЕНТУ-НІ А-А"02 може бути в діапазоні від 200 мкМ до 1 пМ. Переважно вказані заміни не змінюють афінність зв'язування більше ніж на ж/- 50 95 або більш переважно не більше ніж на ж/-20 95 відносно ТОВ, що не містить замін. Переважно вказані заміни не підвищують афінність зв'язування комплексів альтернативний пептид-НІ А.
Каркасний ТОВ характеризується застосуванням наступних варіабельних альфа-та бета- ланцюгів: альфа-ланцюг: ТНАМ1ТО"01/Т Або бета-ланцюг: ТАВМ28"01/ТАВО1701/ТАВ.2-7701/ (слід зазначити, що термін "01" указує на алельний варіант цієї послідовності, як зазначено в номенклатурі ІМСТ); та наступні послідовності СОВЗ альфа- і бета-ланцюгів: альфа-ланцюг: МИМНЗИаСеМмІРТЕ (5ЕО ІО МО: 8) бета-ланцюг: АБ5РЇ МТ ЗООРМЕОМЕ (5ЕО ІО МО: 13)
Термін "каркасний ТСЕ: або "вихідний ТСЕ: застосовують у даній заявці як синоніми термінів
ТСА дикого типу, або "М/Т ТОВ", або "не підданий мутації ТОВ", або "нативний ТОВ", або первісний ТОВ для позначення ТСА з варіабельний доменом альфа-ланцюга, що містить залишки 1-113 з 5ЕО ІО МО: 2, та варіабельний домен бета-ланцюга, що містить залишки 1-116 з ЗЕО ІЮ МО: 3. Константний домен М/УТ ТСА може бути повнорозмірним, або може бути усіченим та/або підданим мутації для утворення розчинного ТСН. У будь-якому випадку у ділянки ТВАС та ТАВС можуть вводитися цистеїнові заміни, за рахунок яких може утворюватися ненативний дисульфідний зв'язок між ланцюгами. Придатні положення для розташування вказаних цистеїнових замін описані у У/003020763. На фігурі 2 супутніх графічних матеріалів показані відповідно позаклітинні послідовності альфа- та бета-ланцюгів
ТСА дикого типу в розчинному форматі. 5ЕО ІО МО: 4 ідентична нативній позаклітинній послідовності альфа-ланцюга під 5ЕО ІО МО: 2, за винятком того, що цистеїн у положенні 48 константного домену був заміщений треоніном. Подібним чином, 5ЕО ІО МО: 5 ідентична нативній позаклітинній послідовності бета-ланцюга під 5ЕО ІО МО: 3, за винятком того, що цистеїн у положенні 57 константного домену був заміщений серином, цистеїн у положенні 75 константного домену був заміщений аланіном, та аспарагін у положенні 89 константного домену був заміщений аспарагіновою кислотою. Розчинний ТОВ дикого типу може застосовуватися для забезпечення еталону, з яким можна порівнювати профіль зв'язування підданих мутації ТОВ за даним винаходом.
Послідовності ТСЕ, визначені в даному документі, описані із посиланням на номенклатуру 60 ІМСТ, яка широко відома та доступна тим, хто працює в галузі ТОВ. Див., наприклад, (І еЕтапс апа ГеБгапс, (2001). "Т сеїЇ Весеріог РасізроокК", Асадетіс Ргев5; І езапс, (2011), Соїй бргіпд
Нагб Ргоїюс 2011(6): 595-603; І еїгапс, (2001), Си Ргоїос Іттипої! Аррепаїх 1: Аррепаїх 100; і
Ї ептапс, (2003), Її ешКетіа 17(1): 260-266)|. Коротко, 1П ТОВ складаються з двох ланцюгів, зв'язаних дисульфідним зв'язком. Зазвичай вважається, що кожний ланцюг (альфа та бета) має два домени, а саме варіабельний та константний домен. Коротка з'єднувальна ділянка сполучає варіабельний та константний домени і зазвичай розглядається як частина варіабельної ділянки альфа-ланцюга. Крім того, бета-ланцюг зазвичай містить коротку ділянку різноманітності поруч зі з'єднувальною ділянкою, яку, як правило, також розглядають як частину варіабельної ділянки бета-ланцюга.
Варіабельний домен кожного ланцюга розташований на М-кінці та містить три ділянки, що визначають комплементарність (СОВ), вбудовані в каркасну послідовність. СОВ містять сайт розпізнавання для зв'язування пептиду-«молекули МНС. Існують декілька генів, що кодують варіабельні ділянки альфа-ланцюга (Ма), та декілька генів, що кодують варіабельні ділянки бета-ланцюга (МР), які відрізняються їхніми каркасними послідовностями, послідовностями
СОН ї СОВ2 та частково визначеною послідовністю СОВЗ. За номенклатурою ІМОТ гени Маї
Мр називаються за допомогою префіксів ТВАМ ї ТАВМ відповідно (Роїсп апа І еїтапс, (2000), Ехр
Сіїй Іттиподепеї 17(1): 42-54; бсаміпег апа І еїтапс, (2000), Ехр Сіїп Іттиподепеї 17(2): 83-96;
ІеНгапс апа Гегапс, (2001), "т сеї Весеріог РасізроокК", Асадетіс Ргев55|. Подібним чином, існують декілька генів з'єднувальних ділянок або /, які називають ТНАУ або ТРАВ) у випадку альфа- і бета-ланцюгів відповідно, та у випадку бета-ланцюга, ген ділянки різноманітності або
О, який називають ТАВО (Роіїсп апа І еїгапс, (2000), Ехр Сіїп Іттиподепеї 17(2): 107-114; зЗсаміпег апа І еїгапс, (2000), Ехр Сіїп Іттиподепеї 17(2): 97-106; І еЕгапс апа І еРгапс, (2001), "т сеї! РКесеріог Расіб5роокК", Асадетіс Ргевз5|. Величезна різноманітність ланцюгів Т-клітинних рецепторів зумовлена комбінаторними перегрупуваннями між різними генами УМ, ./ та О, які включають алельні варіанти та множинність .)-сегментів (Ага, еї а!., (1999), 5сіепсе 286(5441): 958-961; Нобіпз еї аї!., (2009), Віоса 114(19): 4099-4107.) Константні або С ділянки альфа- і бета- ланцюгів ТСВ називають ТВАС і ТАВС відповідно (І еїтапс, (2001), Ситг Ргоїос Іттипої Аррепаїх 1: Аррепаїх 10).
Варіабельний домен альфа-ланцюга за першим або другим аспектом може мати мутацію щонайменше в одному з наступних положень із посиланням на нумерацію залишків 1-113 з БЕО
ІО МО: 2: М50, Т51, 52, 553, Е54, НО4, 595, (596, 598. Мутації можуть бути вибрані з наступних амінокислот із посиланням на нумерацію залишків 1-113 ЗБЕОІЮОМО: 2:
Таблиця 1 211111 тю 1.01
ЕМ 7 1111111
Додатково або як альтернатива варіабельний домен бета-ланцюга за першим або другим аспектом може мати мутацію щонайменше в одному з наступних положень із посиланням на нумерацію залишків 1-116 з БЕО ІЮ МО: 3: М27; 028; Н29, ЕЗО, М31, М50, 051, У52, К5З, М54,
Е95, 196, М97, Т98. Мутації можуть бути вибрані з наступних амінокислот із посиланням на нумерацію залишків 1-116 з ФБЕО ІО МО: 3:
Таблиця 2 21111 рев |.) ССС
Таблиця 2
Бо 77711111 |В пев вс ме? 7777 /.Я1
Варіабельний домен альфа-ланцюга може мати 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або 9 з мутацій, показаних у таблиці 1, та/(або варіабельний домен бета-ланцюга може мати 1,2,3,4,5,6,7,8,9 або 10 з мутацій, показаних у таблиці 2.
Варіабельний домен альфа-ланцюга може мати щонайменше одну з наступних груп мутацій: група 1: М5БОЇ,, Т510, Е52У, 55ЗА, Е541; група 2: НО45, 595А, 596М, 5981; група 3: НОЯ4А 595А, (5960, 5981; група 4: М5БОЇ, Т510, Е52У, 553А, Е54І, НОЯ4А 595А, 12960, 5981; група 5: М5БОЇ, НЗО45, 595А, 1965, 5981; група 6: МБО! НЗО45, 595А, 1960, 5981; та/або варіабельний домен бета-ланцюга може мати щонайменше одну з наступних груп мутацій: група 1: М27А, р28Р, Н29І, Е305, МЗІ1К Е955, І 960, М97О, Т98М; група 2: УБ5ОВ, 051Е, М52А, К5ЗТ, М54С, Г955, І 960, М970О, Т98М; група 3: Е955, І 960, М97О, Т98М; група 4: М27І, "508, 051, М52А, К5ЗТ, М54С, Е955, І 960, М97О, Т98М група 5: М27А, р28Р, Н29І, ЕЗ305, МЗ1К, М541, г955, І 960, М97О0, Т98М.
Наприклад, варіабельний домен альфа-ланцюга може мати мутації групи 4, а варіабельний домен бета-ланцюга може мати мутації групи 1; варіабельний домен альфа-ланцюга може мати мутації групи 4, а варіабельний домен бета-ланцюга може мати мутації групи 5; варіабельний домен альфа-ланцюга може мати мутації групи 2, а варіабельний домен бета-ланцюга може мати мутації групи 2; варіабельний домен альфа-ланцюга може мати мутації групи 6, а варіабельний домен бета-ланцюга може мати мутації групи 4; варіабельний домен альфа- ланцюга може мати мутації групи 5, а варіабельний домен бета-ланцюга може мати мутації групи 4.
Додатково або як альтернатива мутації можуть бути здійснені поза межами СОВ; при цьому такі мутації можуть поліпшувати зв'язування, та/або специфічність, та/або стабільність, та/або вихід очищеної розчинної форми ТОВ. Наприклад, ТСА за даним винаходом додатково або як альтернатива може містити варіабельний домен альфа-ланцюга, який має наступні мутації із посиланням на нумерацію залишків 1-113 з ФЕО ІО МО: 2:
Таблиця З 111
У варіабельному домені альфа-ланцюга послідовність амінокислотних залишків 27-32, 50-56 і 91-103 може бути вибрана з наступних:
Таблиця 4
Варіабельний домен альфа-ланцюга ТОВ може містити амінокислотну послідовність, яка характеризується щонайменше 90 95 91 9», 92 У, 93 У, 94 95, 95 У, 96 У, 97 9Уо, 98 У, 99 95 або 100 95 ідентичністю з будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 16-24 або 46-64.
У варіабельному домені бета-ланцюга послідовність амінокислотних залишків 27-31, 49-54 і 92-107 може бути вибрана з наступних:
Таблиця 5
Варіабельний домен бета-ланцюга ТОВ може містити амінокислотну послідовність, яка характеризується щонайменше 90 95 91 9», 92 У, 93 У, 94 95, 95 У, 96 У», 97 9Уо, 98 У, 99 95 або 100 95 ідентичністю з будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 25-29 або 65-81.
Послідовність амінокислотних залишків 27-32, 50-56 і 91-103 варіабельного домену альфа- ланцюга та послідовність амінокислотних залишків 27-31, 49-54 і 92-107 варіабельного домену бета-ланцюга можуть бути вибрані з наступних
Таблиця 6 11111111 Альфаланцюг/////// | о Беталанцюб./
Варіабельний домен альфа-ланцюга може містити амінокислотну послідовність будь-якої з
ЗЕО І МО: 16-24 або 46-64, та/"або варіабельний домен бета-ланцюга може містити амінокислотну послідовність будь-якої з ФЕО ІЮ МО: 25-29 або 65-81.
Наприклад, варіабельний домен альфа-ланцюга може містити амінокислотну послідовність під 5ЕО ІО МО: 22, а варіабельний домен бета-ланцюга може містити амінокислотну послідовність під 5ЕБЕО 10 МО: 26; варіабельний домен альфа-ланцюга може містити амінокислотну послідовність під 5ЕО ІО МО: 22, а варіабельний домен бета-ланцюга може містити амінокислотну послідовність під 5ЕО ІО МО: 27; варіабельний домен альфа-ланцюга може містити амінокислотну послідовність під 5ЕО ІО МО: 20, а варіабельний домен бета- ланцюга може містити амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 28; варіабельний домен альфа-ланцюга може містити амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 24, а варіабельний домен бета-ланцюга може містити амінокислотну послідовність під 5БЕО 10 МО: 29; варіабельний домен альфа-ланцюга може містити амінокислотну послідовність під 560) 10 МО: б
23, а варіабельний домен бета-ланцюга може містити амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ
МО:29.
ТСВА за даним винаходом може являти собою альфа-бета гетеродимер з послідовністю константного домену альфа-ланцюга ТАС та послідовністю константного домену бета- ланцюга ТАВСІ або ТАВС2.
ТОВ за даним винаходом може мати одноланцюговий формат, включаючи без обмеження мМма-І -МіВ, МВ-І -Ма, Ма-Са-І -МД, Ма-І -М-СВД, де Ма та МД являють собою варіабельні ділянки с- та
В-ланцюгів ТОВ відповідно, СВ та СВД являють собою константні ділянки а- та В-ланцюгів ТОВ відповідно, а Ї являє собою лінкерну послідовність.
ТОВ за даним винаходом може бути асоційованим з детектовною міткою, терапевтичним засобом або фрагментом, що модифікує РК.
ТОВ за даним винаходом може містити антитіло до СОЗ, ковалентно з'єднане з С-або М- кінцем альфа- або бета-ланцюга ТОВ. Такий ТСАЕ може містити варіабельний домен альфа- ланцюга, вибраний з будь-якої з 560) ІЮО МО: 16-24 або 46-64, та варіабельний домен бета- ланцюга, вибраний з будь-якої з БЕО ІЮО МО: 25-29 або 65-81, злитий з антитілом до СОЮЗ. Бета- ланцюг можуть бути з'єднаний з послідовністю антитіла до СОЗ за допомогою лінкерної послідовність; при цьому лінкерна послідовність може бути вибрана з групи, що складається з сассесаз5(ЗЕОЮ МО: 30), Слава (5ЕО Ір МО: 31), ФаБИаС (5ЕО І МО: 32), ОБОСІ (ЗЕО І
МО: 33), ОБОаСОР (5ЕО ІЮ МО: 34), ВОСЕРБ (5ЕО ІЮО МО: 35), ОСЕСССР (5ЕО ІО МО: 36) та саєсвсавЕсаиаз5(5ЕО 1 МО: 37).
Переважні варіанти здійснення злитої молекули з ТСА та антитіла до СОЗ містять амінокислотну послідовність альфа-ланцюга, вибрану з послідовностей під 5ЕО ІЮ МО: 38-41, або послідовність, яка характеризується щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 Уо, 96 95, 97 95, 98 95, 99 Уо або 100 95 ідентичністю з амінокислотною послідовністю, викладеною під 5ЕО
ІО МО: 38-41, та амінокислотну послідовність бета-ланцюга, вибрану з послідовностей під 5ЕО
ІО МО: 42-45, або послідовність, яка характеризується щонайменше 90 95, 91 95, 92 95, 93 9, 94 95, 95 95, 96 9У5, 97 У, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичністю з амінокислотною послідовністю, викладеною під 5ЕО ІО МО: 42-45.
ТОВ за даним винаходом можуть бути включені у бібліотеку частинок. Для таких цілей ТОВ може бути представлений, наприклад, на поверхні бактеріофага, дріжджової клітини, клітини ссавців або рибосоми. ТСА може бути виділеним, позаклітинним та/або розчинним, тобто він може не являти собою ТОВ, який зустрічається у своєму природному стані в межах Т-клітини організму людини.
ТСА за даним винаходом можуть бути такими, що не зустрічаються у природі, та/або очищеними, та/або сконструйованими. ТСА за даним винаходом можуть мати більше ніж одну мутацію, що присутня у варіабельному домені альфа-ланцюга та/або варіабельному домені бета-ланцюга, порівняно з нативним ТСА для МАСЕ АХА.
ТОВ за даним винаходом може містити каркасну ділянку 2 (ЕН2) альфа-ланцюга та каркасну ділянку З (ЕКЗ) альфа-ланцюга, де ділянки ЕН2 і ЕАЗ містять 5ЕО ІО МО: 9 ї 10 відповідно та/або мають одну або декілька, наприклад, одну, дві або три, консервативних замін та/або не більше трьох допустимих замін.
ТСВА за даним винаходом може містити ділянку ЕН2 бета-ланцюга та ділянку ЕКЗ бета- ланцюга, де ділянки ЕН2 і ЕВЗ містять 5ЕО 10 МО:14 ї 15 відповідно та/або містять одну або декілька, наприклад одну, дві або три, консервативних замін та/або не більше трьох допустимих замін.
ТСА за даним винаходом може містити амінокислоти 1-113 з 5ЕБЕО ІЮО МО: 2 та/або амінокислоти 1-116 з 5БО ІО МО: 3, кожна з яких може містити одну або декілька консервативних замін, та/або не більше трьох допустимих мутацій, та/або одну або декілька з мутацій, викладених в таблицях 1, 2 і 3. "Сконструйований ТОВ" та "мутантний ТОВ" застосовують у даному документі як синоніми для позначення ТСВ, який має одну або декілька введених мутацій порівняно з нативним ТС для МАСЕ А4, зокрема, у своєму варіабельному домені альфа-ланцюга та/або варіабельному домені бета-ланцюга. Мутація(іїї), як правило, поліпшує афінність зв'язування ТСЕ з комплексом
СУМравВЕНТМ (5БО 10 МО: 1)-НГА-А"О2, але додатково або як альтернатива може забезпечувати інші переваги, такі як поліпшена стабільність у виділеній формі та поліпшена специфічність. Мутації в одному або кількох положеннях додатково або як альтернатива можуть впливати на взаємодію суміжного положення з когнатним комплексом рМНС, наприклад, шляхом створення більш сприятливого кута для взаємодії. Для поліпшення зв'язування ТСА з комплексом СУМОСАЕНТМ (5ЕО ІО МО: 1)-НІ А-А"02 мутації переважно створюють в межах бо однієї або кількох ділянок СОВ.
У деяких варіантах здійснення в СОВА альфа-ланцюга міститься 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8 або 9 мутацій, наприклад, 4, 5 або 9 мутацій, та/або в СОВ бета-ланцюга міститься 1,2, 3,4,5,6, 7,8, 9 або 10 мутацій, наприклад, 4, 9 або 10 мутацій.
У деяких варіантах здійснення варіабельний домен а-ланцюга ТСЕ за даним винаходом може містити амінокислотну послідовність, яка характеризується щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 96, щонайменше 94 95, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 9895 або щонайменше 99 95 ідентичністю з послідовністю амінокислотних залишків 1-113 з 5ЕО ІО МО: 2, за умови, що варіабельний домен а-ланцюга має щонайменше одну з мутацій, наведених вище, наприклад, в таблиці 1 або таблиці 3. У деяких варіантах здійснення варіабельний домен (З-ланцюга ТОВ за даним винаходом може містити амінокислотну послідовність, яка характеризується щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 96, щонайменше 93 95, щонайменше 9495, щонайменше 95595, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 98595 або щонайменше 99 95 ідентичністю з послідовністю амінокислотних залишків 1-116 з ФЕО ІО МО: З, за умови, що варіабельний домен (З3-ланцюга має щонайменше одну з мутацій, наведених вище, наприклад в таблиці 2.
Мутації відносно первісного ТОВ (або дикого типу) можуть включати такі, що здатні підвищувати афінність зв'язування (Ко та/або напівперіод зв'язування) ТОВ з ЧСМУМОСВЕНТУ.
Мутації можуть включати такі, що здатні знижувати кількість неспецифічного зв'язування, тобто знижувати зв'язування з антигенами окрім зв'язування з СУУООВЕНТУ. Мутації можуть включати такі, що підвищують ефективність фолдингу та/або виготовлення. Деякі мутації можуть сприяти кожній з цих характеристик, інші можуть сприяти, наприклад, афінності, але не специфічності, або специфічності, але не афінності тощо.
У межах обсягу даного винаходу перебувають фенотипово мовчазні варіанти будь-якого
ТСВА за даним винаходом, розкритого в даному документі. Як застосовується у даному документі, вважається, що термін "фенотипово мовчазні варіанти" відноситься до ТСЕ, який включає одну або декілька додаткових змін амінокислот, включаючи заміни, вставки та делеції, окрім викладених вище, при цьому такий ТСА має фенотип, подібний до фенотипу відповідного
ТС без вказаної зміни(змін). Для цілей даної заявки фенотип ТСОА передбачає афінність зв'язування з антигеном (Ко та/або напівперіод зв'язування) та антигенну специфічність.
Фенотипово мовчазний варіант може характеризуватися Ко та/або напівперіодом зв'язування з комплексом СУУрОАЕНТМ (5ЕО ІО МО: 1)-НГА-А"0О2 в межах 50 95, або більш переважно в межах 20 95 від вимірюваних Ко та/або напівперіоду зв'язування відповідного ТОВ без вказаної зміни(змін), у разі вимірювання за ідентичних умов (наприклад, 25 "С та/або однаковому чипі
ЗРЕА). Придатні умові додатково наведені в прикладі 3. Антигенна специфічність додатково визначена нижче. Як відомо фахівцям у даній галузі, можна створювати ТОВ, які включають зміни в своїх варіабельних доменах порівняно з докладно описаними вище, без зміни афінності взаємодії з комплексом ЗММОСВЕНТМ (5ЕО ІО МО: 1)-НІ А-А"02. Зокрема, такі мовчазні мутації можуть бути введені в межах частин послідовності, які, як відомо, безпосередньо не беруть участь у зв'язуванні з антигеном (наприклад, СОМ або частин СОВ, які не контактують з пептидним антигеном). Такі тривіальні варіанти включені в обсяг даного винаходу.
Фенотипово мовчазні варіанти можуть містити одну або декілька консервативних замін та/або одну або декілька допустимих замін. Допустимі та консервативні заміни можуть приводити до зміни Ко та/або напівперіоду зв'язування комплексу СМУВОаВЕНТМ (5ЕО І МО: 1)-НГА-А"02 у межах 50 95, або більш переважно у межах 20 95, ще більш переважно у межах 1095 від вимірюваних Ко та/або напівперіоду зв'язування відповідного ТОВ без вказаної консервативної та/або допустимої заміни(замін), у разі вимірювання за ідентичних умов (наприклад, 25 "С та/або однаковому чипі РЕА), за умови, що зміна у Ко не веде до афінності, меншої (тобто більш слабкої) ніж 200 мкМ. Допустимими замінами вважаються такі заміни, які не підпадають під визначення консервативних замін, як представлено нижче, але, незважаючи на це є фенотипово мовчазними.
ТСА за даним винаходом можуть включати одну або декілька консервативних замін, які мають подібну амінокислотну послідовність та/або які зберігають таку саму функцію (тобто є фенотипово мовчазними, як визначено вище). Фахівець усвідомлює, що різні амінокислоти мають подібні властивості й, таким чином, є "консервативними. Одна або декілька таких амінокислот у білку, поліпептиді або пептиді часто можуть бути заміщені однією або кількома іншими такими амінокислотами без втрати необхідної активності цього білка, полипептиду або пептиду.
Отже, амінокислоти гліцин, аланін, валін, лейцин та ізолейцин часто можуть заміщувати 60 одна одну (амінокислоти з аліфатичними бічними ланцюгами). Серед цих можливих замін переважно, щоб гліцин і аланін застосовувалися для заміщення одна одної (оскільки вони мають відносно короткі бічні ланцюги), і щоб валін, лейцин та ізолейцин застосовувалися для заміщення одна одної (оскільки вони мають більш великі аліфатичні бічні ланцюги, які є гідрофобними). Інші амінокислоти, які часто можуть заміщувати одна одну, включають фенілаланін, тирозин і триптофан (амінокислоті з ароматичними бічними ланцюгами); лізин, аргінін і гістидин (амінокислоти з основними бічними ланцюгами); аспартат і глутамат (амінокислоти з кислотними бічними ланцюгами); аспарагін і глутамін (амінокислоти з амідними бічними ланцюгами) та цистеїн і метіонін (амінокислоти з сірковмісними бічними ланцюгами).
Слід враховувати, що амінокислотні заміни в межах обсягу даного винаходу можна здійснювати із застосуванням амінокислот, що зустрічаються у природі або не зустрічаються у природі.
Наприклад, у даному документі передбачається, що метильна група на аланіні може бути заміщена етильною групою, та/або що незначні зміни можна здійснювати у пептидному остові.
Незалежно від того, які амінокислоти використовуються, природні або синтетичні, переважною є присутність тільки І -амінокислот.
Заміни такої природи часто називають "консервативними" або "напівконсервативними" амінокислотними замінами. Отже, даний винахід поширюється на застосування ТСВ, що містить амінокислотну послідовність, описану вище, але з однією або кількома консервативними замінами та/або з однією або декількома допустимими замінами у послідовності, внаслідок чого амінокислотна послідовність СА характеризується щонайменше 9095 ідентичністю, наприклад, 90 95, 91 9», 92 95, 93 У, 94 95, 95 У, 96 9, 97 У, 98 У, 99 95 або 100 95 ідентичністю з ТСЕ, що містить амінокислоти 1-113 з 5ЕО ІО МО: 2, 16-24 або 46-64 та/або амінокислоти 1- 116 з БЕО ІОМО: 3, 25-29 або 65-81.
Як відомо з рівня техніки "ідентичність" означає взаємозв'язок між двома або більше поліпептидними послідовностями або двома або більше полінуклеотидними послідовностями, що визначений шляхом порівняння послідовностей. У рівні техніки ідентичність також означає, залежно від випадку, ступінь спорідненості послідовності у поліпептидних або полінуклеотидних послідовностей, що визначений за збігом між нитками таких послідовностей. Хоча існує низка способів для вимірювання ідентичності між двома поліпептидними або двома полінуклеотидними послідовностями, способи, які зазвичай використовуються для визначення ідентичності, кодифіковані в комп'ютерних програмах. Переважні комп'ютерні програми для виявлення ідентичності між двома послідовностями включають без обмеження пакет програм оса |Оемегеих, еї аї., Мисівєїс Асіайз Везеагсі, 12, 387 (1984), ВІ А5ТР, ВГА5ТМ та РГА5ТА (Аї5СПи!Ї еї аї., У. Моїес. Віої. 215,403(1990)|.
Для порівняння амінокислотних послідовностей можна застосовувати таку програму, як програма СІ О5ТАЇ. Ця програма порівнює амінокислотні послідовності і виявляє оптимальне вирівнювання, у випадку необхідності вставляючи пробіли в одній з послідовностей. Для здійснення оптимального вирівнювання можливим є розрахування ідентичності або подібності (ідентичність, а також збереження типу амінокислоти) амінокислот. Програма, така як ВІ АТХ, буде вирівнювати найдовший відрізок подібних послідовностей та призначати значення відповідності. Таким чином, можна отримати порівняння, за якого виявлено кілька ділянок подібності, кожна з яких має окремий бал. Обидва типи аналізу ідентичності передбачені у даному винаході.
Відсоток ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох послідовностей нуклеїнової кислоти визначають за допомогою вирівнювання послідовностей, маючи на меті оптимальне порівняння (наприклад, у першу послідовність можуть вводитися гепи для найкращого вирівнювання з послідовністю), та порівняння амінокислотних залишків або нуклеотидів у відповідних положеннях. "Найкращим вирівнюванням" є вирівнювання двох послідовностей, що веде до найвищого відсотку ідентичності. Відсоток ідентичності визначають за числом ідентичних амінокислотних залишків або нуклеотидів у послідовностях, які порівнюють (тобто 95 ідентичності - число ідентичних положень/загальне число положень х 100).
Визначення відсотка ідентичності між двома послідовностями може виконуватися із застосуванням математичного алгоритму, відомого фахівцям в даній галузі. Прикладом математичного алгоритму для порівняння двох послідовностей є алгоритм за |Каїпіп апа АїЇївспиїЇ (1990) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 87:2264-2268, модифікований за Каїїп апа Айвеспи! (1993) Ргос.
Май. Асай. 5сі. ОБА 90:5873-5877|. Програми МВІ А5Т і ХВІ А5Т з АЇїв5спиЇї, еї аї. (1990) 9. Мої.
Віої. 215:403-410, включали такий алгоритм. Нуклеотидні пошуки на основі ВІА5Т можна виконувати за допомогою програми МВІА5Т, бал - 100, довжина слова - 12, з одержанням нуклеотидних послідовностей, гомологічних молекулам нуклеїнової кислоти. Білкові пошуки на 60 основі ВІ А5ЄТ можна виконувати за допомогою програми ХВІ А5Т, бал - 50, довжина слова - 3,
з одержанням амінокислотних послідовностей, гомологічних білковим молекулам для застосування у даному винаході. Для отримання вирівнювань з гепами, маючи на меті порівняння, може застосовуватися ВІ А5Т з гепами, як описано в Ц(АЇївбспи! еї аї. (1997) Мисівіс
Асіаз Вез. 25:3389-3402)|. Як альтернатива, можна застосовувати РОБЇІ-Віазі для здійснення ітеративного пошуку, який виявляє віддалені взаємозв'язки між молекулами (там же). Під час застосування програм ВІ А5Т, ВІ А5Т з гепами та РБІ-Віазі можна використовувати параметри за замовчуванням відповідних програм (наприклад, ХВІАЄТ і МВІА5БТ). Див.
ІпНр/Лимлу. порі. піт.пій.дом|. Іншим прикладом математичного алгоритму, що застосовують для порівняння послідовностей є алгоритм (Муег5 та МіПег, САВІО5 (1989))Ї. Програма АГІСМ (версія 2.0), яка є частиною пакету програм для вирівнювання послідовностей СОС, включає такий алгоритм. Інші алгоритми для аналізу послідовності, відомі з рівня техніки, включають
АРМАМСЕ і АВАМ, описані в |ТГогеїї5 апа Вобойі (1994) Сотриї. Аррі. Віовсі., 10:3-5; та ЕА5ТАЇ, описаний у (Реагзоп апа Ііртап (1988) Ргос. Маї). Асай. 5сі. 85:2444-8|. В межах ЕА5ТА опцією керування є Кір, що встановлює чутливість та швидкість пошуку.
Мутації, включаючи консервативні та допустимі заміни, вставки та делеції, можуть вводитись у надані послідовності із застосуванням будь-якого приданого способу, включаючи без обмеження способи на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), процедур клонування на основі ферменту рестрикції або безлігазного клонування (ІС). Ці способи докладно описані у багатьох текстах зі стандартної молекулярної біології. Додаткову інформацію щодо полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та клонування на основі ферменту рестрикції див. у
ІЗатьгоок а Виззеїї, (2001) МоїІесшаг Сіопіпа-А Іарогаїту Мапиа! (39 Ей.) С5НІ Ругеззі.
Додаткову інформацію щодо процедури безлігазного клонування (ГІС) можна знайти в
ІВазпісніап, (1995) Сцт Оріп Віоїеснпо! 6(1): 30-6Ї. Послідовності ТОА за даним винаходом можна отримувати за допомогою твердофазного синтезу або будь-якого іншого придатного способу, відомого з рівня техніки.
ТОВ за даним винаходом мають властивість зв'язування комплексу СМУРОИВЕНТУ (5ЕО ІЮ
МО: 1)-НГА-А"02. Як було з'ясовано, ТОВ за даним винаходом надійно розпізнають даний епітоп у порівнянні з іншими, невідповідними епітопами і, таким чином, є особливо придатними у ролі векторів націлювання для доставки терапевтичних засобів або детектовних міток у клітини та тканини, в яких представлені ці епітопи. Специфічність у контексті ТОВ за даним винаходом стосується їхньої здатності розпізнавати цільові клітини з НІ А-А"02, які є антигенпозитивними, при цьому з мінімальною здатністю розпізнавати цільові клітини з НІ А-А"02, які є антигеннегативними.
Специфічність може бути виміряна іп мйго, наприклад, у клітинних аналізах, таких як аналізи, описані в прикладі 6. Під час тестування специфічності ТОВ можуть перебувати в розчинній формі, та/або можуть бути злитими з імунним ефектором, та/або можуть бути експресовані на поверхні клітин, таких як Т-клітини. Розпізнавання може бути визначено шляхом вимірювання рівня активації Т-клітин у присутності ТСА за даним винаходом та цільових клітин. Мінімальне розпізнавання антиген негативних цільових клітин визначене як рівень активації Т-клітин, що становить менше ніж 20 96, переважно менше ніж 10 95, переважно менше ніж 5 95 та більш переважно менше ніж 1 95 рівня, який одержують у присутності антигенпозитивних цільових клітин у разі вимірювання за однакових умов та за терапевтично релевантно! концентрації ТОВ.
Для розчинних ТОВ за даним винаходом терапевтично релевантна концентрація може визначатися як концентрація ТСВ, що становить 10""М або менше, та/або концентрація, що не більше ніж у 100, переважно не більше ніж у 1000 разів перевищує відповідне значення ЕС5О.
Антигенпозитивні клітини можуть бути отримані шляхом інкубації з пептидами із застосуванням придатної концентрації пептидів для отримання рівня антигенної презентації, аналогічного такому в ракових клітин (наприклад, 10" М пептиду, як (описано в Вов5і еї а/., (2013)
Опсоіїттипої. 152 (11)хе26840)), або вони можуть природним чином презентувати вказаний пептид. Переважно, як антигенпозитивні, так і антигеннегативні клітини є клітинами людини.
Переважно, антигенпозитивні клітини є раковими клітинами людини. Антигеннегативні клітини переважно включають клітини, що отримані зі здорових тканин людини.
Додатково або як альтернатива специфічність може стосуватися здатності ТСЕ зв'язуватися з комплексом СУУРОВЕНТМ (5ЕБО ІО МО: 1) НІА-А"О2, а не з панеллю комплексів альтернативний пептид-НІ А. Наприклад, це можна визначати за методом Віасоге з прикладу 3.
Вказана панель може містити щонайменше 5 та переважно щонайменше 10 комплексів альтернативний пептид-НІ А-А"02. Альтернативні пептиди можуть мати низький рівень ідентичності послідовності з 5ЕО ІО МО: 1 та можуть бути присутніми в природних умовах.
Альтернативні пептиди можуть бути отримані з білків, що експресуються в здорових тканинах 60 людини. Зв'язування з комплексом СШУМравЕНТМУ-НІ А-А"02 може щонайменше у 2 рази перевищувати зв'язування з іншими презентованими в природних умовах комплексами пептид-
НА, більш переважно перевищувати щонайменше в 10 разів, або щонайменше в 50 разів, або щонайменше в 100 разів, ще більш переважно перевищувати щонайменше в 400 разів.
Альтернативним або додатковим підходом для визначення специфічності ТОВ може бути ідентифікація мотиву розпізнавання пептиду в ТСЕ із застосуванням послідовного мутагенезу, наприклад, аланінового сканування. Залишки, що утворюють частину мотиву зв'язування, є залишками, за якими заміна неможлива. Неприпустимі заміни можуть бути визначені як такі положення пептиду, за яких афінність зв'язування ТОВ знижується щонайменше на 50 95 або переважно щонайменше на 80 95 порівняно з афінністю зв'язування з не підданим мутації пептидом. Такий підхід додатково описаний у (Сатегоп еї аї, (2013), сі ТкапеіІ Мей. 2013 Аца 7; 5 (197): 197та103, та у М/О2014096803). У такому випадку специфічність ТСА може визначатися шляхомідентифікації пептидів, що містять альтернативний мотив, зокрема, пептидів, що містять альтернативний мотив, в людському протеомі, та тестування цих пептидів щодо зв'язування з
ТОВ. Зв'язування ТСВ з одним або декількома альтернативними пептидами може вказувати на відсутність специфічності. У такому випадку може бути необхідним додаткове тестування специфічності ТОВ за допомогою клітинних аналізів.
Як відомо фахівцям у даній галузі, пептиди, отримані з представників родини МАСЕ, можуть мати високий рівень ідентичності послідовності з пептидами, отриманими з інших представників родини МАСЕ. Наприклад, існують пептиди, отримані з МАСЕ-АВ8 і МАСЕ-В2, що відрізняються лише двома залишками з 5ЕО 00 МО 1 (БММрОВЕНТУМ). Вказані пептиди та клітини, що експресують вказаних представників родини МАСЕ, можуть бути виключені з визначення специфічності, наведеного вище, зокрема, якщо відомо, що вказані представники родини МАСЕ є раковими антигенами, такими як МАСЕ-АВ і МАСЕ-В2. Отже, ТОВ за даним винаходом можуть розпізнавати пептиди з високим відсотком ідентичності послідовності, які отримані з інших представників родини МАСЕ, включаючи МАСЕ-АВ і МАСЕ-В2, та представлені у контексті НІ А
А"02. Розпізнавання вказаних пептидів за участі ТСА за даним винаходом може відбуватися на подібному або нижчому рівні, ніж розпізнавання СМУрОИВЕНТУМ (5ЕО ІЮ МО: 1)-НІ А-А"02.
Деякі ТСВ за даним винаходом можуть мати ідеальний профіль безпеки для застосування як терапевтичні реагенти. У такому випадку ТСА можуть перебувати в розчинній формі та переважно можуть бути злитими з імунним ефектором. Ідеальний профіль безпеки означає, що крім демонстрування задовільної специфічності ТСОА за даним винаходом можуть пройти подальші доклінічні випробовування безпеки. Приклади таких тестів включають аналізи цільної крові, щоб підтвердити мінімальне вивільнення цитокінів у присутності цільної крові та, таким чином, низький рівень ризику можливого виникнення синдрому вивільнення цитокінів іп мімо, а також тести на алореактивність, щоб підтвердити низьку ймовірність розпізнавання альтернативних типів НІ А.
Деякі розчинні ТОВ за даним винаходом можуть бути придатними для очищення з високим виходом. Високий вихід означає вихід більше ніж 1 95, або більш переважно більше ніж 10 95, або більше.
ТОВ за даним винаходом можуть характеризуватися Ко щодо комплексу СУУравЕНТУ-
НІГ А-А"02, що перевищує (тобто є сильнішою за) 200 мкМ, наприклад, від 1 ПМ до 200 мкм.
Деякі ТСВ за даним винаходом можуть мати Ко щодо комплексу, що становить від приблизно 1
ПМ до приблизно 400 нМ, від приблизно 1 пМ до приблизно 200 пМ, від приблизно 1 пМ до приблизно 100 пМ. Деякі ТОВ за даним винаходом можуть характеризуватися Ко щодо комплексу, що становить приблизно 20-80 пМ. ТСА за даним винаходом можуть мати напівперіод зв'язування (Т'/г) з комплексом в діапазоні від приблизно 1 сек. до приблизно 60 год., від 1 хв. до приблизно 60 год., від приблизно 20 хв. до приблизно 50 год. або від приблизно 2 год. до приблизно 35 год. Деякі ТСА за даним винаходом може характеризуватися Т14 щодо комплексу, що становить від приблизно 8 год. до 35 год. ТСН, які передбачені для застосування як розчинні терапевтичні препарати та/або діагностичні препарати, у разі приєднання до детектовної мітки або терапевтичного засобу, переважно характеризуються Ко щодо комплексу, що становить від приблизно 1 пМ до приблизно 100 пМ або від приблизно 20 пМ до приблизно 80 пМ, та/або напівперіодом зв'язування з комплексом, що становить від приблизно 2 год. до 60 год. або від приблизно 8 год. до приблизно 35 год. Деякі ТОВ за даним винаходом можуть бути придатні для видів застосування в адоптивній терапії; такі ТОВ можуть характеризуватися Ко щодо комплексу, що становить від приблизно 50 нМ до приблизно 200 мкМ або від приблизно 100 нМ до приблизно 1 мкМ, та/або напівперіодом зв'язування з комплексом, що становить від приблизно З сек. до приблизно 12 хв.
Деякі переважні ТСА здатні викликати високоефективну Т-клітинну відповідь іп мйго проти бо антигенпозитивних клітин, зокрема, тих клітин, на яких типовий для ракових клітин антиген представлений на низькому рівні (тобто приблизно 50 антигенів на клітину (Воз55і еї аї., (2013)
Опсоїттипої. 1522 (11)х:е26840; Ригрпоо еї а/.(2006). у Іттипої 176(12): 7308-7316.)). Такі ТСВА можуть перебувати в розчинній формі та бути з'єднані з імунним ефектором, таким як антитіло до СО3. Т-клітинна відповідь, яка є вимірюваною, може являти собою вивільнення маркерів активації Т-клітин, таких як інтерферон у або гранзим В, або загибель клітин, або інший показник активації Т-клітин. Переважно, високоефективною відповіддю є відповідь зі значенням
ЕсСобхо у пМ діапазоні, наприклад, 100 пМ або менше.
Деякі переважні ТСА за даним винаходом характеризуються афінністю зв'язування та/або напівперіодом зв'язування з комплексом СУМраИавВЕНТУ-НІ А-А"02, що суттєво перевищують такі показники в нативного ТОВ. Збільшення афінності зв'язування нативного ТСА часто зменшує специфічність ТОА щодо його ліганду пептид/МНе, і це продемонстровано в (7Нао єї а/., (2007) 9.Іттипої, 179:9, 5845-5854). Проте такі ТОВ за даним винаходом залишаються специфічними щодо комплексу ОМУРОИВЕНТУ-НІ А-А"02, незважаючи на суттєво більш високу афінність зв'язування, ніж у нативного ТОВ.
Афінність зв'язування (обернено пропорційна константі рівноваги Ко) та напівперіод зв'язування (виражений як МА) можуть бути визначені із застосуванням поверхневого плазмонного резонансу (ВіАсоге) та/або методу Осієї з прикладу З у даному документі. Буде зрозуміло, що внаслідок подвоєння афінності ТСА вдвічі зменшується Ко. ТУг розраховується як Іп2, поділений на швидкість дисоціації (Кої). Отже, внаслідок подвоєння ТУ» вдвічі зменшується Коїк. Значення Ко і Коє для ТОВ звичайно вимірюють для розчинних форм ТОВ, тобто таких форм, які є усіченими для видалення залишків цитоплазматичного та трансмембранного доменів. Переважно афінність зв'язування або напівперіод зв'язування даного ТСВ вимірюють кілька разів, наприклад, З або більше разів, із застосуванням однакового протоколу аналізу та беруть середнє результатів.
У випадку застосування як націлювальний засіб для доставки терапевтичних засобів у антигенпрезентувальну клітину ТСА може перебувати в розчинній формі (тобто не мати трансмембранного або цитоплазматичного доменів). Для забезпечення стабільності ТОВ за даним винаходом і переважно розчинні ар-гетеродимерні ТСА можуть мати дисульфідний зв'язок, введений між залишками відповідних константних доменів, як описано, наприклад, у
МО 03/020763. Один або обидва позаклітинні константні домени, присутні в а(З-гетеродимері за даним винаходом, можуть бути усіченими з С-кінця або С-кінців, наприклад, не більше ніж на 15, або не більше ніж на 10, або не більше ніж на 8, або менше амінокислот. С-кінець позаклітинного константного домену альфа-ланцюга може бути усіченим на 8 амінокислот.
Один або обидва позаклітинні константні домени можуть містити одну або декілька мутацій.
Внаслідок природного поліморфізму позаклітинний константний домен альфа-ланцюга в положенні 4 може мати залишок аспарагіну (М) або лізину (К). Для застосування в адоптивній терапії а(3-гетеродимерний ТОВ, наприклад, можна піддавати трансфекції як повнорозмірні ланцюги, що мають як цитоплазматичний, так і трансмембранний домени. ТСА для застосування в адоптивній терапії можуть містити дисульфідний зв'язок, що відповідає зв'язку, який зустрічається в природі між відповідними константними доменами альфа- та бета- ланцюгів, при цьому додатково або як альтернатива може бути присутнім ненативний дисульфідний зв'язок.
ТОВ за даним винаходом можуть являти собою ср-гетеродимери. ТСЕ за даним винаходом можуть мати одноланцюговий формат. Одноланцюгові формати включають без обмеження поліпептиді «Д-ТСЕА наступних типів Мо-І -Ур, Мр-І-Ме;, Мо-Со-І -Мр, Ме-І -Мр-СВ або Ме-Се-І -УрД-
СВ, де Мо і МД являють собою варіабельні ділянки со- і Д-ланцюгів ТСА відповідно, Со і Ср являють собою константні ділянки с- і ВД-ланцюгів ТОВ відповідно, а Ї являє собою лінкерну послідовність (М/еїдап? еї а/., (1998) У Іттипої Меїйоавз. Оес 1221 (1-2):59-76; Ереї еї а/., (2002),
Сапсег Іттипо! Іттипоїйег. Мом;51(10):565-73; МО 2004/033685; М/09918129|. Один або обидва константні домени можуть бути повнорозмірними, або вони можуть бути усіченими, як описано вище, та/або можуть містити мутації. Внаслідок природного поліморфізму позаклітинний константний домен альфа-ланцюга в положенні 4 може мати залишок аспарагіну (М) або лізину (К). У деяких варіантах здійснення одноланцюгові ТСА за даним винаходом можуть мати дисульфідний зв'язок, введений між залишками відповідних константних доменів, як (описано в УУО 2004/033685|. Одноланцюгові ТСА додатково описані в (М/О02004/033685;
М/О098/39482; МО01/62908; М/відапг еї аї. (1998) У Іттипої Меїнодз 221(1-2): 59-76; Ноо еї аї. (1992) Ргос Маї! Асай 5сі ОО 5 А 89(10): 4759-4763; 5сподіп (1996) Мої Іттипої! 33(9): 819-829.
Фахівцям в даній галузі буде зрозуміло, що можна здійснювати усічення наведених послідовностей на їхньому С-кінці та/або М-кінці на 1, 2, 3, 4, 5 або більше залишків, не впливаючи суттєво на характеристики зв'язування ТОВ. Усі такі тривіальні варіанти охоплені даним винаходом.
Альфа-бета-гетеродимерні ТОВ за даним винаходом звичайно містять послідовність константного домену альфа-ланцюга ТВАС та/або послідовність константного домену бета- ланцюга ТАВСІ1 або ТАВС2. Послідовності константних доменів альфа- і бета-ланцюга можуть бути модифіковані шляхом усічення або заміни з видаленням нативного дисульфідного зв'язку між Суз4 екзона 2 в ТВАС та Субз2 екзона 2 в ТАВСІ або ТАВС2. Послідовністьс(ості) константних доменів альфа- та/або бета-ланцюга може бути модифікованою шляхом заміни на цистеїнові залишки Тпг48 з ТВАС та бег57 з ТАВСІ або ТАВСг, при цьому вказані цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок між константними доменами альфа- та бета-ланцюга ТОВ.
ТАВСІ або ТАВС2 можуть додатково включати мутацію цистеїну на аланін у положенні 75 константного домену та мутацію аспарагіну на аспарагінову кислоту в положенні 89 константного домену.
Додатково або як альтернатива, константний домен може містити додаткові мутації, заміни або делеції відносно нативних послідовностей ТВАС та/або ТАВС1/2. Термін ТВАС та ТАВС1/2 охоплює натуральні поліморфні варіанти, наприклад, К замість М у положенні 4 в ТВАС
ІВгадасдо еї а! Іпї Іттипої. 1994 Рер;б(2):223-301.
Також в обсяг даного винаходу включені варіанти, фрагменти та похідні ТСА, наведених у даному винаході.
У даному винаході також передбачені частинки, на яких представлені ТСОА за даним винаходом, та включення вказаних частинок у бібліотеку частинок. Такі частинки включають без обмеження фаг, дріжджові рибосоми або клітини ссавців. Спосіб отримання таких частинок та бібліотек відомий з рівня техніки (див., наприклад, УУО2004/044004; М/О01/48145, Снеп/п еї аї. (2008) 9. Іттипо. Меїнпоаз 339.2: 175-184).
У додатковому аспекті даного винаходу передбачена нуклеїнова кислота, що кодує ТОВ за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення нуклеїнова кислота являє собою кКДНК. У деяких варіантах здійснення даного винаходу передбачена нуклеїнова кислота, що містить послідовність, яка кодує варіабельний домен а-ланцюга ТСА за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення даного винаходу передбачена нуклеїнова кислота, що містить послідовність, яка кодує варіабельний домен (З-ланцюга ТСВА за даним винаходом. Нуклеїнова кислота може бути такою, що не зустрічається в природі, та/"або очищеною, та/або сконструйованою. Послідовність нуклеїнової кислоти може бути піддана кодон-оптимізації відповідно до системи експресії, що застосовується.
В іншому аспекті даного винаходу передбачений вектор, який містить нуклеїнову кислоту за даним винаходом. Переважно вектор являє собою вектор експресії ТОВ.
У даному винаході також передбачена клітина, що несе вектор за даним винаходом, переважно вектор експресії ТОВ. Вектор може містити нуклеїнову кислоту за даним винаходом, що кодує альфа-ланцюг та бета-ланцюг, закодовані в одній відкритій рамці зчитування або двох окремих відкритих рамках зчитування відповідно. В іншому аспекті передбачена клітина, що несе перший вектор експресії, який містить нуклеїнову кислоту, що кодує альфа-ланцюг ТСЕ за даним винаходом, та другий вектор експресії, який містить нуклеїнову кислоту, що кодує бета- ланцюг ТСА за даним винаходом. Такі клітини особливо застосовні в адоптивної терапії.
Клітини за даним винаходом можуть бути виділеними, та/або рекомбінантними, та/або такими, що не зустрічатися у природі, та/або сконструйованими.
Оскільки ТОВ за даним винаходом є застосовними в адоптивній терапії, даний винахід включає клітину, що не зустрічається у природі, та/або очищену, та/або сконструйовану клітину, зокрема, Т-клітину, на якій присутній ТСОА за даним винаходом. У даному винаході також передбачена розмножена популяція Т-клітин, на яких присутні ТСА за даним винаходом. Існує низка способів, придатних для здійснення трансфекції Т-клітин нуклеїновою кислотою (такою як
ДНК, кДНК або РНК), що кодує ТСЕ за даним винаходом |(див., наприклад, Коббіпз еї аї., (2008)
У Іттипої. 180: 6116-6131). Т-клітини, що експресують ТОВ за даним винаходом, будуть придатними для застосування в лікуванні раку на основі адоптивної терапії. Як відомо фахівцям в даній галузі, існує низка придатних способів, за допомогою яких можна здійснювати адоптивну терапію (див., наприклад, Нозепбего еї аї., (2008) Маї Вем Сапсег 8(4): 299-308.
Розчинні ТСА за даним винаходом є застосовними для доставки детектовних міток або терапевтичних засобів у антигенпрезентувальні клітини та тканини, які містять антигенпрезентувальні клітини. Отже, вони можуть бути асоційованими (ковалентно або іншим чином) з детектовною міткою (маючи на меті діагностику, якщо ТСА застосовують для виявлення присутності клітин, що презентують комплекс СпУМравЕНТУ-НІ А-А"Оог), 60 терапевтичним засобом або фрагментом, що модифікує РК.
Приклади фрагментів, що модифікують РК, включають без обмеження РЕ |Оо?ієг є еї аї., (2015) Іпї у Мої 5сі. Осі 28;16(10):25831-64, та деуземаг еї аї!., (2010) Віотесппої У.дап;5(1):1113- 28), послідовність РАБ (5спіарзспу еї аїЇ., (2013) Ргоївіп Епя Оез 5еї. Аца;26(8):489-501), альбумін (Оеппів еї аї!., (2002) У Віої Спет. зер 20:277(38):35035-43| та/або неструктуровані поліпептиди (ЗспеПепрегодег" еї а!., (2009) Маї Віоїеснпої. Оес:27(12): 1186-90.
Детектовні мітки для діагностичних цілей включають, наприклад, флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, ферменти, зонди на основі нуклеїнових кислот та контрастні реагенти.
Терапевтичні засоби, які можуть бути асоційовані з ТОВ за даним винаходом, включають імуномодулятори, радіоактивні сполуки, ферменти (наприклад, перфорин) або хіміотерапевтичні засоби (наприклад, цисплатин). Щоб гарантувати те, що токсичні ефекти проявляються у необхідному місці, токсин може перебувати всередині ліпосоми, з'єднаної з
ТОВ, внаслідок чого сполука вивільняється повільно. Це дозволить запобігти шкідливим ефектам під час транспорту в організмі та гарантувати максимальний ефект токсину після зв'язування ТОВ з релевантними антигенпрезентувальними клітинами.
Інші придатні терапевтичні засоби включають: низькомолекулярні цитотоксичні засоби, тобто сполуки зі здатністю спричиняти лізис клітини ссавців із молекулярною масою, що становить менше ніж 700 Дальтон. Такі сполуки також можуть містити токсичні метали, здатні спричиняти цитотоксичний ефект. Крім того, слід розуміти, що такі низькомолекулярні цитотоксичні засоби також включають проліки, тобто сполуки, що розкладаються або перетворюються за фізіологічних умов із вивільненням цитотоксичних засобів. Приклади таких засобів включають цисплатин, похідні майтанзину, рахелміцин, каліхеаміцин, доцетаксел, етопозид, гемцитабін, іфосфамід, іринотекан, мелфалан, мітоксантрон, сорфімер натрійфотофрин ІІ, темозолмід, топотекан, 21арбор21ат триметреат, ауристатин Е, вінкристин і доксорубіцин; пептидні цитотоксини, тобто білки або їхні фрагменти зі здатністю спричиняти лізис клітин ссавців; Наприклад, рицин, дифтерійний токсин, бактеріальний екзотоксин А з Рзейдотопав,
ДНКаза та РНКаза; радіонукліди, тобто нестабільні ізотопи елементів, які руйнуються з одночасною емісією однієї або декількох с- або р-частинок, або у-променів. Наприклад, йод-131, реній-186, індій-111, іїтрій-90, вісмут-210 і 213, актиній-225 та астат-213; при цьому для полегшення асоціації цих радіонуклидів з високоафінними ТСЕ або їхніми мультимерами можна застосовувати хелатори; імуностимулятори, тобто імунні ефекторні молекули, які стимулюють імунну відповідь;
Наприклад, цитокіни, такі як ІІ -2 і ТЕМ-у; суперантигени та їхні мутанти; злиті молекули ТСВ-НІ А, наприклад, злиту молекулу з комплексом пептид-НІ А, де вказаний пептид отриманий зі поширеного людського патогена, такого як вірус Епштейна-Барр (ЕВМУМ); хемокіни, такі як ІІ -8, тромбоцитарний фактор 4, білок, що стимулює ріст меланоми тощо; антитіла або їхні фрагменти, включаючи антитіла проти детермінант Т-клітин або МК-клітин (наприклад, антитіла до СОЗ, антитіла до СО28 або антитіла до СО16); альтернативні білкові каркаси з антитілоподібними характеристиками зв'язування; активатори комплементу; домени ксеногенних білків, домени алогенних білків, домени вірусних/бактеріальних білків, вірусні/бактеріальні пептиди.
В одному переважному варіанті здійснення передбачений ТСА за даним винаходом, асоційований (зазвичай за допомогою злиття з М- або С-кінцем альфа- або бета-ланцюга) з антитілом до СОЗ або функціональним фрагментом або варіантом вказаного антитіла до СОЗ (такі злиті молекули ТОВАВ-антитіло до СОЗ можуть називатися молекулами ІттТАС"М). Як застосовується у даному документі, термін "антитіло" охоплює такі фрагменти та варіанти.
Приклади антитіл до СОЗ включають без обмеження ОКТЗ3, ЮСНТ-1, ВМА-0О31 і 12Е6. Фрагменти та варіанти/аналоги антитіл, які придатні для застосування у композиціях та способах, описаних у даному документі, включають, , серед багатьох інших, мінітіла, Рар-фрагменти, Р(аб')»- фрагменти, азгум- ії 5сЕм-фрагменти, Мапородіє5 м (ці конструкції, які продає Абіупх (Бельгія), містять єдиний синтетичний варіабельний домен важкого ланцюга імуноглобуліну, отриманий з антитіла верблюдових (наприклад, верблюда або лами)) та доменні антитіла (від Юотапії5 (Бельгія), що містять єдиний варіабельний домен важкого ланцюга або варіабельний домен легкого ланцюга імуноглобуліну, піддані дозріванню афінності) або альтернативні білкові каркаси, які виявляють антитілоподібні характеристики зв'язування, такі як, наприклад,
Аніродієз (Апнібоду (Швеція), що містить сконструйований каркас білка А) або Апіїсаїїп (Рієгів (Німеччина)), що містять сконструйовані антикаліни).
ТОВ й антитіла до СЮОЗ можна сполучати за допомогою ковалентного або нековалентного зв'язку. Ковалентний зв'язок може бути прямим або опосередкованим через лінкерну послідовність. Лінкерні послідовності зазвичай є гнучкими, оскільки вони складаються, головним чином, з таких амінокислот, як гліцин, аланін і серин, які не мають великих бічних ланцюгів, які можуть обмежувати гнучкість. Можна легко визначити зручну або оптимальну довжину лінкерних послідовностей. Часто довжина лінкерної послідовності становитиме менше ніж приблизно 12, наприклад, менше ніж 10 амінокислот або 2-10 амінокислот. Придатні лінкери, які можна застосовувати в ТОВ за даним винаходом, включають без обмеження: (0005 (5ЕО 10
МО: 30), асава (5ЕО І МО: 31), СБС (ЗЕО ІЮ МО: 32), СБС (5ЕО І МО: 33), ОБОСИОР (5ЕО ІО МО: 34), ВСОЕРБ (5ЕО ІЮ МО: 35), СЕСССОР (5ЕО ІО МО: 36) та ОСєССОБЕСОО5 (5ЕО ІО МО: 37) (як описано в М/О2010/133828).
Специфічні варіанти здійснення конструкцій злитих молекул антитіло до СОЗ-ТСА за даним винаходом включають такі пари альфа- та бета-ланцюгів, в яких альфа-ланцюг складається з варіабельного домену, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІЮ МО: 16-24 або 46-64, та/лабо бета-ланцюг складається з варіабельного домену, що містить амінокислотну послідовність під 5ЕО ІО МО: 25-29 або 65-81. Вказані альфа- та бета-ланцюги можуть додатково містити константну ділянку, що містить ненативний дисульфідний зв'язок. М- або С- кінець альфа- та/або бета-ланцюга може бути злитим з зсЕм фрагментом антитіла проти СОЗ через лінкер, вибраний з 5ЕО ІО МО: 30-37. Деякі переважні варіанти здійснення таких конструкцій злитої молекули антитіло до СОЗ-ТСЕ наведені нижче:
Таблиця 7
МО МО
Кожний лінкер під 5ЕО ІЮ МО: 30-37 можна застосовувати з кожним або будь-яким з переважних варіантів здійснення конструкцій злита молекула антитіло до СОЗ3З-ТОСВ. Наприклад, злита молекула антитіло до СОЗ-ТСЕВ, що містить альфа-ланцюг під 5ЕО ІО МО: 24 та бета- ланцюг під ФЕО ІО МО: 29, де бета-ланцюг злитий з 5сЕм антитіла до СОЗ через лінкер під будь- якою з 5ЕО ІЮО МО: 31-37, є включеним у даний винахід.
Для деяких цілей ТОВ за даним винаходом можуть бути зібрані у комплекс, що містить декілька ТСЕ, з утворенням мультивалентного комплексу ТОВ. Існує низка людських білків, що містять домен мультимеризації який можна застосовувати в одержанні мультивалентних комплексів ТСВ. Наприклад, домен тетрамеризації з р53, який був застосований для одержання тетрамерів із зсЕм-фрагментів антитіла, які демонстрували підвищену стійкість у сироватці та значно знижену швидкість дисоціації порівняно з мономерним 5сЕм фрагментом ГіїШада еї аї. (2001) 9. Віої. Спет. 276 (17) 14385-14392). Гемоглобін також має домен тетрамеризації, який можна використовувати для цього виду застосування. Мультивалентний комплекс з ТСА за даним винаходом може характеризуватися посиленою здатністю до зв'язування з комплексом аУмравЕНТУ-НІ А-А"02 порівняно з немультимерним гетеродимером Т-клітинного рецептору дикого типу або гетеродимером за даним винаходом. Таким чином, мультивалентні комплекси
ТОВ за даним винаходом також включені в даний винахід. Такі мультивалентні комплекси ТСВ за даним винаходом є особливо застосовними для відстеження або націлювання на клітини, що презентують конкретні антигени іп міїго або іп мімо, і також є застосовними як проміжні сполуки для отримання додаткових мультивалентних комплексів ТСВ, що мають такі застосування.
Як добре відомо з рівня техніки, ТСАВ можуть піддаватися післятрансляційним модифікаціям.
Глікозилювання являє собою одну таку модифікацію, яка передбачає ковалентне приєднання олігосахаридних фрагментів до певних амінокислот в ланцюзі ТОВ. Наприклад, добре відомими місцями для приєднання олігосахаридів є аспарагінові залишки або серинові/гтреонінові залишки. Статус глікозилювання конкретного білка залежить від низки факторів, включаючи послідовність білка, конформацію білка та доступність деяких ферментів. Крім того, статус глікозилювання (тобто тип олігосахариду, ковалентний зв'язок та загальна кількість приєднаних фрагментів) може впливати на функцію білка. Отже, під час отримання рекомбінантних білків часто є бажаним контроль глікозилювання. Контрольоване глікозилювання застосовували для поліпшення терапевтичних препаратів на основі антитіл. (ЧеМПегів еї а/., (2009) Маї Нем Огид
Оівсом Маг; 8(3):226-34Ї. Для розчинних ТОВ за даним винаходом глікозилювання можна контролювати іп мімо, наприклад, шляхом застосування конкретних ліній клітин, або іп міко за допомогою хімічної модифікації. Такі модифікації є бажаними, оскільки глікозилювання може поліпшувати фармакокінетичні показники, знижувати імуногенність та краще імітувати нативний людський білок Ібіпсіаїг апа ЄЕПой, (2005) Рнагт 5сі.Ацо9; 94(8): 1626-35).
Для здійснення введення пацієнтам ТСОА за даним винаходом (переважно асоційовані з детектовною міткою або терапевтичним засобом, або експресовані на трансфектованій Т- клітині), злиті молекули ТОВ-антитіло до СОЗ, нуклеїнові кислоти, вектори експресії або клітини за даним винаходом можуть забезпечуватися у фармацевтичній композиції разом з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями або допоміжними речовинами. Терапевтичні або візуалізаційні ТОВ або клітини за даним винаходом звичайно забезпечують як частину стерильної фармацевтичної композиції, яка в нормі буде включати фармацевтично прийнятний носій. Така фармацевтична композиція може мати будь-яку придатну форму (залежно від необхідного способу її введення пацієнту). Вона може забезпечуватися в одиничній дозованій формі, при цьому у більшості випадків вона буде забезпечуватися в герметично закритому контейнері та може забезпечуватися як частина набору. Такий набір, як правило (хоча не обов'язково), включатиме інструкції із застосування. Він може включати декілька вказаних одиничних дозованих форм.
Фармацевтичну композицію можна адаптувати для введення за допомогою будь-якого придатного шляху, такого як парентеральний (включаючи підшкірний, внутрішньом'язовий або внутрішньовенний), ентеральний (включаючи пероральний або ректальний), інгаляційний або інтраназальний шляхи. Такі композиції можна отримувати будь-яким способом, відомим у галузі фармацевтики, наприклад, шляхом змішування активного інгредієнта з носієм(іями) або допоміжною речовиною(ами) в стерильних умовах.
Дозування речовин за даним винаходом можуть варіювати у широких межах залежно від захворювання або порушення, що підлягає лікуванню, віку та стану індивідуума, що підлягає лікуванню тощо, при цьому придатний діапазон доз для розчинного ТСА за даним винаходом, асоційованого з антитілом до СОЗ, може становити від 25 нг/кг до 50 мкг/кг. У кінцевому підсумку лікар визначатиме придатні дози для застосування.
ТОВ, фармацевтичні композиції, вектори, нуклеїнові кислоти та клітини за даним винаходом можуть забезпечуватися у практично чистій формі, наприклад, з чистотою, що становить щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 956, щонайменше 91 95, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95.
Також у даному винаході передбачені:
ТОВ, злита молекула ТСВ-антитіло до СОЮЗ, нуклеїнова кислота, фармацевтична композиція або клітина за даним винаходом для застосування у медицині, переважно для застосування у способі лікування раку або пухлини; застосування ТС, злитої молекули ТСЕ-антитіло до СОЗ, нуклеїнової кислоти, фармацевтичної композиції або клітини за даним винаходом у виготовленні медикаменту для лікування раку або пухлини; спосіб лікування раку або пухлини у пацієнта, що включає введення пацієнту ТОРА, злитої молекули ТСВ-антитіло до СОЗ, нуклеїнової кислоти, фармацевтичної композиції або клітини за даним винаходом; ін'єкційний склад для введення суб'єкту-/людині, що містить ТОВ, злиту молекулу ТОСВ- антитіло до СОЗ, нуклеїнову кислоту, фармацевтичну композицію або клітину за даним винаходом.
Рак може являти собою рак молочної залози, стравоходу, голови та шиї, легені, яєчника або сечового міхура. Пухлина може експресувати МАСЕ А4 та/або може являти собою солідну пухлину. ТОВ, злиту молекулу ТОВ-антитіло до СОЗ, нуклеїнову кислоту, фармацевтичну композицію або клітину за даним винаходом можна вводити шляхом ін'єкції, такої як внутрішньовенна або пряма внутрішньопухлинна ін'єкція. Суб'єкт-людина може мати молекули субтипу НІ А-А"02.
Переважні ознаки кожного аспекту даного винаходу є такими самими, як у кожному з інших аспектів тиїаййв тшиапаі5. Документи попереднього рівня техніки, згадані у даному документі, включені в найповнішому обсязі, дозволеному законом.
Опис графічних матеріалів
На фіг. 1 наведена амінокислотна послідовність позаклітинних ділянок альфа- та бета- бо ланцюгів нативного ТСА для МАСЕ АА4.
На фіг. 2 наведена амінокислотна послідовність позаклітинних ділянок альфа- та бета- ланцюгів розчинного нативного ТСЕ для МАСЕ АХ.
На фіг. З наведений приклад амінокислотних послідовностей варіабельних ділянок підданого мутації альфа-ланцюга ТСА для МАСЕ А4.
На фіг 4 наведений приклад амінокислотних послідовностей варіабельних ділянок підданого мутації бета-ланцюга ТСЕ для МАСЕ АХА.
На фіг. 5 наведений приклад амінокислотних послідовностей альфа-ланцюга злитих молекул ТСЕ для МАСЕ А4-антитіло до СОЮЗ.
На фіг. Є наведений приклад амінокислотних послідовностей бета-ланцюга злитих молекул
ТСЕ для МАСЕ А4-антитіло до СОЗ.
На фіг. 7 наведені дані клітинного аналізу, що демонструють активність і специфічність злитих молекул ТОВ для МАСЕ А4-антитіло до СОЗ.
На фіг. 8 наведені дані клітинного аналізу, що демонструють активність і специфічність додаткових злитих молекул ТСА для МАСЕ А4-антитіло до СОЗ.
На фіг. 9 наведений додатковий доказ специфічності злитих молекул ТСА для МАСЕ А4- антитіло до СОЗ.
На фіг. 10 наведені додаткові дані щодо специфічності злитих молекул ТОВ для МАСЕ А4- антитіло до СОЗ.
На фіг. 11 наведений додатковий доказ того, що злиті молекули ТСЕ для МАСЕ А4-антитіло до СОЗ призводить до загибелі ракових клітин.
Даний винахід додатково описаний у наступних необмежувальних прикладах.
Приклади
Приклад 1. Експресія, рефолдингта очищення розчинних ТСА
Спосіб
Послідовності ДНК, що кодують позаклітинні ділянки альфа- і бета-ланцюгів розчинних ТОВ за даним винаходом, клонували окремо у плазміди експресії на основі РаМТ7 із застосуванням стандартних способів (як описано в Затргоок, еї а). МоІесшаг сіопіпд. Мої. 2. (1989) Мем Могк:
Соа 5ргіпуд Нагбоитг Іарогаїогу ргез5)|. Плазміди експресії трансформували окремо у штам Козена
Е. соїї (ВІ 21рІ уз5), та одиночні стійкі до ампіциліну колонії вирощували за 37 "С у середовищі
ТУР (ї- 100 мкг/мл ампіциліну) до ОЮвоо, що становила -«-0,6-0,8, перед тим, як здійснювати індукцію експресії білка за допомогою 0,5 мМ ІРТО. Клітини збирали шляхом центрифугування через три години після здійснення індукції. Клітинні осади лізували реагентом для екстракції білків ВидВивіег (Мегок МійПіроге) згідно з інструкціями виробника. Осади тілець включення одержували шляхом центрифугування. Осади промивали двічі у буфері Тийоп (50 мМ Ттіз-НСЇ, рН 8,1, 0,5 95 Тійоп-Х100, 100 мм масі, 10 мм мМаєйтА) і наприкінці повторно суспендували у буфері без поверхнево-активних речовин (50 мМ Ттіз-НСІ, рН 8,1, 100 мМ Масі, 10 мм
МаєЕртА). Вихід білка тілець включення визначали кількісно шляхом солюбілізування за допомогою 6 М гуанідину-НСІ та вимірювання ООгво. Потім розраховували концентрацію білка із застосуванням коефіцієнта екстинкції. Чистоту тілець включення вимірювали шляхом солюбілізування за допомогою 8 М сечовини та завантаження -2 мкг на 4-20 95 505-РАСЕ за відновлювальних умов. Потім чистоту оцінювали або розраховували із застосуванням програмного забезпечення для денситометрії (Спетіаос, Віогад). Тільця включення зберігали за --4 С у випадку короткого терміну зберігання і за -20 "С або -70 "С у випадку більш тривалого терміну зберігання.
Для рефолдингу розчинного ТСА тільця включення, що містять а- і В-ланцюги, спочатку змішували та розводили в 10 мл буфера для солюбілізування/денатурації (б М гуанідину гідрохлориду, 50 мМ Тіз НОСІ, рН 8,1, 100 мМ Масі, 10 мм ЕОТА, 20 мм ОТ) з подальшою інкубацією протягом 30 хвилин за 37 "С. Потім ініціювали рефолдинг шляхом подальшого розведення в 1 л буфера для рефолдингу (100 мМ Тті5, рН 81, 400 мМ І! аргініну НСІ, 2 мМ
ЕОТА, 4 М сечовини, 10 мМ цистаміну гідрохлориду та 2,5 мМ цистаміну дигідрохлориду) та розчин добре перемішували. Суміш, яку піддавали рефолдингу, діалізували проти 10 л НгО протягом 18-20 годин за 5 "С-3 "С. Після цього діалізний буфер двічі міняли на 10 мМ Ттів, рН 8,1 (10 л) та діаліз тривав ще 15 годин. Суміш, яку піддавали рефолдингу, потім фільтрували крізь 0,45 мкм целюлозні фільтри.
Очищення розчинних ТОВ ініціювали шляхом застосування діалізного рефолдингу в аніонообмінній колонці РОВО5О 50НО та елюювання зв'язаного білка за допомогою градієнта 0-500 мМ Масі в 20 мМ Тітїз, рН 8,1, за допомогою 50 об'ємів колонки, із застосуванням очисника АКіаф (СЕ НеайНсагеє). Пікові фракції ТОВ ідентифікували за допомогою 505 РАСЕ, а потім об'єднували та концентрували. Потім концентрований зразок вносили в гель-фільтраційну 60 колонку 5ирегадех? 75НЕА (СЕ Неаїйїйсаге), попередньо урівноважену за допомогою РВ5 буфера
Дульбекко. Пікові фракції ТСЕ об'єднували та концентрували, а також розраховували кінцевий вихід очищеного матеріалу.
Приклад 2. Експресія, рефолдинг та очищення молекул ІттТАС (злитих молекул розчинний
ТОВ-антитіло до СОЗ)
Спосіб
Одержання ІттТАС здійснювали, як описано в прикладі 1, за винятком того, що бета- ланцюг ТОВ зливали за допомогою лінкера з одноланцюговим антитілом до СОЗ. Крім того, під час очищення після аніонного обміну виконували стадію катіонного обміну. У цьому випадку пікові фракції з колонки для аніонного обміну розбавляли в 20 разів у 20 мМ МЕЗ5 (рН 6,5) та вносили у катіонообмінну колонку РОНОБФ 50Н5. Зв'язаний білок елюювали за допомогою градієнта 0-500 мМ Масі у 20 мМ МЕЗ5. Пікові фракції ІттТАсС об'єднували та регулювали за допомогою 50 мМ Ттів, рН 8,1, а потім концентрували та наносили безпосередньо на гель- фільтраційну матрицю, як описано в прикладі 1.
Приклад 3. Визначення характеристик зв'язування
Аналіз зв'язування очищених розчинних ТСЕ та молекул ІттТАсС з відповідним комплексом пептид-НІ А виконували за допомогою поверхневого плазмонного резонансу із застосуванням пристрою ВіАсоге 3000 або ВіІАсоге Т200 або за допомогою інтерферометри біошарів із застосуванням пристрою Еопевіо Осіе). Біотинільовані молекули НІ А-А"02 класу І піддавали рефолдингу з пептидом, що представляє інтерес, та очищали із застосуванням способів, відомих фахівцям даної галузі (О'СаІПаднап еї аї. (1999). Апа! Віоспет 266(1): 9-15; Сатбостлі, еї а!. (1992). Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 89(8): 3429-3433). Усі вимірювання виконували за 25 "С в РВ5 буфері Дульбекко, доповненому за допомогою 0,005 95 Р20.
Спосіб ВІіАсоге
Біотинільовані мономери пептид-НІ А іммобілізували на сенсорних чипах СМ-5 зі зв'язаним стрептавідином. Рівноважні константи зв'язування визначали із застосуванням серійних розведень розчинного ТСВ/ІтттТАС, які вводили за константної швидкості потоку ЗО мкл хв." через проточну кювету, вкриту 7200 одиницями відповіді (НО) комплексу пептид-НІ-А-А"02.
Рівноважні відповіді нормалізували для кожної концентрації ТСА шляхом віднімання відповіді на об'єм буфера у контрольній проточній кюветі, що містить невідповідний пептид-НІ А. Значення
Ко отримували за допомогою апроксимації нелінейної кривої із застосуванням програмного забезпечення Ргіїзт та ізотерми зв'язування Лангмюра, зв'язування - С"Мах/(С-КО), де "зв'язування" означає рівноважне зв'язування в БІО за введеної концентрації ТОВ С, а Мах означає максимальне зв'язування.
У випадку високоафінних взаємодій параметри зв'язування визначали за допомогою одного аналізу кінетики реакції. П'ять різних концентрацій розчинного ТОВ/тттТАсС вводили в проточну кювету, вкриту -100-200 ВИ комплексу пептид-НГ А, із застосуванням швидкості потоку 50-60 мкл хв.7. Як правило, вводили 60-120 мкл розчинного ТСВ/тттТАС за найбільшої концентрації 100-200 нМ, при цьому для інших чотирьох введень застосовували послідовні 2-кратні розведення. Першою вводили найнижчу концентрацію. Потім для вимірювання фази дисоціації вводили буфер, доки не досягали дисоціації 210 95, як правило, протягом 1-3 годин. Параметри кінетики реакції розраховували із застосуванням програмного забезпечення ВіАемаїЧаїйопФ.
Фазу дисоціації апроксимували до рівняння одного експоненціального розпаду, що дозволяє розраховувати напівперіод. На основі Кокм/Коп розраховували рівноважну константну Ко.
Спосіб Осієї
Біотинільовані мономери пептид-НІА захоплювали до концентрації 1 нм на стрептавідинових (ЗА) біосенсорах (Рай РопеВіо) з попередньо іммобілізованим стрептавідином. Сенсори блокували за допомогою вільного біотину (2 мкМ) протягом 2 хвилин.
Рівноважні константи зв'язування визначали шляхом занурення завантажених біосенсорів в розчинний ТСВ/тттТАС, серійно розведений в 96-лунковому або 384-лунковому планшеті для зразків. Струшування планшета здійснювали за 1000об./хв. У випадку низькоафінних взаємодій (діапазон мкм) застосовували короткий час асоціації (-2 хвилини) та короткий час дисоціації (2 хвилини). Криві зв'язування обробляли шляхом віднімання подвійного еталону із застосуванням еталонних біосенсорів, завантажених невідповідним рНІА, із застосуванням програмного забезпечення Осієї Оаїа Апаїузів (Раї! РопевВісо). Рівноважні відповіді (НМ) застосовували, щоб оцінити значення Ко за графіками стаціонарного стану, апроксимованих до рівняння: Відповідь - ВтахКОНМ./КоОхконц.), де "відповідь" означає рівноважне зв'язування в нМ для кожної концентрації ТСА (конц.), а Атах означає максимальну відповідь зв'язування за умови насичення рНІ А.
У випадку високоафіннних взаємодій (діапазон нМ - пМ) параметри кінетики реакції 60 визначали на основі кривих зв'язування, побудованих за 53 концентраціями ТСВ/ттТАсС, як правило, 10 нМ, 5 нМ і 2,5 нМ. Час асоціації становив 30 хвилин, а час дисоціації становив 1-2 години. Криві зв'язування обробляли шляхом віднімання подвійного еталону із застосуванням еталонних біосенсорів, завантажених невідповідним рНІі А та блокованих біотином. Параметри кінетики реакції Коп і Коє розраховували шляхом загальної апроксимації безпосередньо до кривих зв'язування із застосуванням програмного забезпечення Осієї Оаїа Апаїузіз (РаїЇ РопеВіо). ка вираховували на основі Кок/Коп, а напівперіод дисоціації на основі 11/72-:0,693/Кок.
Приклад 4. Визначення характеристик зв'язування нативного ТСА
Розчинний нативний ТС одержували згідно зі способом, описаним у прикладі 1, а зв'язування з рНі А аналізували згідно з прикладом 3. Амінокислотні послідовності альфа- і бета-ланцюгів відповідали послідовностям, показаним на фіг. 2. Розчинний біотинільований
НІ А-А"02 одержували з пептиду МАСЕ А4, СУМравВЕНТУ, та іммобілізували на сенсорному чипі ВІАсоге.
Результати
Зв'язування визначали за різних концентрацій, та визначили, що значення Ко для взаємодії становить 142 мкМ. Перехресну реактивність (специфічність) оцінювали за панеллю з 15 невідповідних комплексів пептид-НІ А-А"02 із застосуванням рівноважного способу ВіАсоге з прикладу 3. 15 невідповідних рНІ А об'єднували у три групи та завантажували в одну з трьох проточних кювет, щоб отримати приблизно 1000 ВИ кожного рНІ А на проточну кювету. В усі проточні кювети вводили по 20 мкл розчинного ТОВ дикого типу за концентрації 73 мкМ зі швидкістю 20 мкл/хв. За будь-якої концентрації не виявлено значного зв'язування, що вказує на те, що нативний ТСЕ є специфічним щодо комплексу СММОСВЕНТУ-НІ А-А"О02.
Ці дані вказують на те, що цей ТСЕА зв'язується з мішенню за придатної афінності та специфічності й, отже, надає застосовну вихідну послідовність для терапевтичних ТОВ.
Приклад 5. Визначення характеристик зв'язування розчинних підданих мутації ТОВ та молекул ІттТАС за даним винаходом
Розчинні піддані мутації ТСОА та молекули ІттТАсС одержували на основі послідовностей, наведених на фіг. 2. Зразки одержували, як описано в прикладах 1 і 2, а характеристики зв'язування визначали згідно з прикладом 3.
Результати
Виявили, що єдина точкова мутація з заміною цистеїну на валін у положенні 19 альфа- ланцюга (5ЕО ІО МО: 6), поліпшує рефолдинг та вихід під час очищення, не впливаючи на афінність або специфічність (зареєстрували Ко, що становить 145 мкМ, та не спостерігали перехресної реактивності у відношенні тієї ж панелі з 15 комплексів альтернативний пептид-
НГА, які тестували з М/Т).
Ідентифікували альфа- та/або бета-ланцюги ТСА, що містили мутації щонайменше в одній ділянці СОВА відносно послідовностей СОВА, показаних на фіг. 2 (ЗЕО ІО МО: 4 ї 5). Такі послідовності ТСОА розпізнавали комплекс СММООВЕНТУ-НІ А-А"02 із особливо придатною афінністю та/або напівперіодом зв'язування. У деяких випадках ідентифікували додаткові мутації, які поліпшували стабільність талабо вихід ТОВ, включаючи мутацію КТА в альфа- ланцюзі (із посиланням на нумерацію за 5ЕО ІЮ МО: 4). Амінокислотні послідовності деяких варіабельних ділянок альфа- і бета-ланцюгів підданого мутації ТСОА за даним винаходом представлені на фігурах 4 і 5 відповідно. В таблиці нижче наведені характеристики зв'язування для розчинних ТОВ або молекул ІттТАС (злитих молекул розчинний ТСВ-антитіло до СОЮЗ), що містять позначені варіабельні ділянки альфа- і бета-ланцюгів.
Таблиця 9
Альфа-ланцюг ланцюг Формат (розчинний Спосіб // Параметри зв'язування (5ЕО ІЮ МО) ЕО Ір МО ТОВ або ІттТАС),| (Віасоге/Осієї)
Таблиця 9
Альфа-ланцюг ланцюг Формат (розчинний Спосіб (5ЕО ІЮ МО) ЕО Ір МО ТОВ або ІттТАС),| (Віасоге/Осієї) па - не визначали а Відповідає ІттТАСЗ з прикладу б, послідовності повнорозмірних альфа- і бета-ланцюгів наведені під БЕО ІО МО: 39 і БЕО ІЮО МО: 44 відповідно. Значення базуються на середньому за 7 незалежними вимірюваннями. ь Відповідає ІттТАСІ з прикладу б, послідовності повнорозмірних альфа- і бета-ланцюгів наведені під БЕО ІЮ МО: 38 і БЕО ІЮО МО: 42 відповідно. Значення базуються на середньому за 7 незалежними вимірюваннями. с Відповідає ІттТАС2 з прикладу 6, послідовності повнорозмірних альфа- і бета-ланцюгів наведені під ХЕО ІЮ МО: 38 і 5ЕО І МО: 43 відповідно. а Відповідає ІттТАС4 з прикладу 6, послідовності повнорозмірних альфа- і бета-ланцюгів наведені під 5ЕО ІЮ МО: 40 ії БЕО ІЮО МО: 45 відповідно. Значення базуються на середньому за 4 незалежними вимірюваннями. е Відповідає ІттТАС5 з прикладу 6, послідовності повнорозмірних альфа- і бета-ланцюгів наведені під 5ХЕО ІЮ МО: 41 ії 5ЕО І МО: 45 відповідно.
Додаткові комбінації варіабельних ділянок альфа- та бета ланцюгів, що містять мутації за даним винаходом, тестували щодо зв'язування з комплексом СУМОСАЕНТУ-НІ А-А"02. Дані, представлені в таблиці нижче, отримували із застосуванням Віасоге, як описано вище.
Зазначені послідовності варіабельних доменів альфа- та бета-ланцюгів одержували як молекули ІттТАсС.
Таблиця 10
Таблиця 10 па - не визначали
Дані, представлені в таблицях 9 і 10, вказують на те, що деякі послідовності варіабельних ділянок ТСА за даним винаходом мають високу афінність зв'язування та тривалий напівперіод зв'язування для комплексу ССМУРОВЕНТМ-НІ А-А"О2 й, отже, є особливо придатними для застосування як розчинні терапевтичні реагенти.
Крім зв'язування з когнатним комплексом СУМравВЕНТМ-НІА-А"02 ТСА за даним винаходом також оцінювали щодо зв'язування з подібними пептидами, отриманими з МАСЕ Аві
МАСЕ В2 та презентованими за допомогою НІ А-А"02. Числа у таблиці нижче представляють дані зв'язування Віасоге для трьох молекул ІттТАС, що містять зазначені послідовності варіабельних доменів альфа- і бета-ланцюгів. Усі три молекули ІттТАсС розпізнають пептид
МАСЕ-АВ8 на рівні, подібному розпізнаванню когнатного пептиду, а пептид МАСЕ-В2 на більш слабкому рівні.
Таблиця 11 11111111 ко | т» | ко | Те а Відповідає ІттТАСІ з прикладу 6, послідовності повнорозмірних альфа- і бета-ланцюгів наведені під ХЕО ІЮ МО: 38 і 5ЕО ІО МО: 42 відповідно. ь Відповідає ІттТАСЗ з прикладу 6, послідовності повнорозмірних альфа- і бета-ланцюгів наведені під ХЕО ІЮ МО: 39 і БЕО І МО: 44 відповідно. с Відповідає ІттТАС4 з прикладу 6, послідовності повнорозмірних альфа- і бета-ланцюгів наведені під ХЕО ІЮ МО: 40 ії БЕО І МО: 45 відповідно.
Приклад 6. Активне та специфічне переадресування Т-клітин молекулами ІттТАС
Молекули ІттТАС, що містять послідовності підданих мутації варіабельних ділянок альфа- і бета-ланцюгів з особливо високою афінністю щодо цільового антигена, тестували на їхню здатність опосередковувати активне та специфічне переадресування СОЗ- Т-клітин за допомогою аналізу ЕПІЗРОТ із застосуванням секреції інтерферону-у (ІЕМ-у як показник активації Т-клітин.
У даному прикладі послідовність варіабельної ділянки альфа-ланцюга вибирали з 5ЕО ІЮ
МО: 20-24, а послідовність варіабельної ділянки бета-ланцюга вибирали з 5ЕО ІЮО МО: 26-29.
Послідовності варіабельного домену піддавали злиттю з відповідними послідовностями позаклітинного константного домену альфа- або бета-ланцюга, які містили ненативний дисульфідний зв'язок. У кожному випадку бета-ланцюг зливали за допомогою лінкера з 5сЕх- антитілом до СОЗ; при цьому лінкер вибирали з 5ЕО ІО МО: 30-37. Повнорозмірні послідовності молекул ІттТАС, які піддавали тестуванню, наведені під 5ЕО ІО МО, викладеними у наступній таблиці:
Таблиця 12 71111111... | Альфаланцю,ЗЕОІЮ МО | Беталанцю,ЗЕОЮ МО
Спосіб
Аналізи виконували із застосуванням набору ЕГПІЗРОТ для аналізу на ІЕМ-у людини (ВО
Віозсієпсев). Цільові клітини готували за щільності 1х106/мл в середовищі для аналізу (ВРМІ 1640, що містить 10 95 термоінактивованої ЕВ5 та 1 95 пеніциліну-стрептоміцину-і -глутаміну) та висівали з розрахунку 50000 клітин на лунку в об'ємі 50 мкл. Як ефекторні клітини застосовували мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМО), виділені зі свіжої крові донора, та їх висівали з розрахунку 10000-50000 клітин на лунку в об'ємі 50 мкл (точна кількість клітин, які застосовують у кожному експерименті, залежить від донора та може бути відрегульована для забезпечення відповіді в межах діапазону, придатного для аналізу).
Застосовували перемінні концентрації ІттТАС, що охоплюють передбачуваний клінічно релевантний діапазон, та додавали до лунки в об'ємі 50 мкл.
Планшети готували згідно з інструкціями виробника. У релевантні лунки додавали цільові клітини, ефекторні клітини та молекули ІттТАС та кінцевий об'єм доводили до 200 мл за допомогою середовища для аналізу. Усі реакції виконували у трьох повторностях. Також готували контрольні лунки без додавання ІттТАсС, ефекторних клітин або цільових клітин.
Потім планшети інкубували протягом ночі (37 "С/5 95 СбОг). Наступного дня планшети тричі промивали буфером для промивання (саше з ї1хРВ5, що містить 0,05 95 Р20О, розведене в деіонізованій воді). Потім у кожну лунку додавали первинне детекторне антитіло в об'ємі 50 мкл.
Планшети інкубували за кімнатної температури протягом 2 годин, а потім знову тричі промивали. Вторинне виявлення виконували шляхом додавання в кожну лунку 50 мкл розбавленого стрептавідину-НАР та інкубування за кімнатної температури протягом 1 години та стадію промивання повторювали. Не більше ніж за 15 хв. до застосування додавали одну краплю (20 мкл) хромогену АЕС на кожний 1 мл субстрату АЕС, змішували та по 50 мкл додавали в кожну лунку. Появу плям контролювали через однакові проміжки часу та планшети промивали у водопровідній воді для припинення ходу реакції. Потім планшети залишали сушитися за кімнатної температури протягом щонайменше 2 годин, а потім підраховували плями із застосуванням аналізатора СТІ із програмним забезпеченням Іттипозрої (Сеїїшаг
Тесппооду І ітіїед).
Результати
Дані, представлені на фігурах 7 і 8, верхні панелі, показують, що молекули ІттТАС 1-2 і 3-5 відповідно, здатні опосередковувати активне (тобто з ЕС5о, меншою за 100 пМм) переадресування Т-клітин на ракові клітини, що експресують цільовий антиген (МСІ-НІ1703 - клітинна лінія раку легені людини). Активації Т-клітин проти антигеннегативних ракових клітин (клітинної лінії папілярної аденокарциноми людини МСІ-Н441 у випадку молекул ІттТАС 1-2 та клітинної лінії раку молочної залози людини САМА-1 у випадку молекул ІттТАС 3-5) в межах клінічно релевантного діапазону концентрацій (ї-1 НМ) не виявляли, що демонструє специфічність відповіді.
Молекули ІттТАС тестували на специфічність із застосуванням клітин, що отримані з нормальних тканин здорової людини, як цільових клітин. На нижній панелі фігури 7 продемонстровано, що молекули ІттТАС 1-2 характеризуються мінімальною реактивністю щодо клітин судин шкіри людини за клінічно релевантно!" концентрації. Подібним чином, на нижніх панелях фігури 8 продемонстровано, що молекули ІттТАС 3-5 характеризуються мінімальною реактивністю щодо клітин судин шкіри людини та клітин нирки людини за клінічно релевантно! концентрації.
Молекули ІттТАС 1 ї З додатково тестували на специфічність із застосуванням панелі клітин людини, отриманих із нормальних здорових тканин, застосовуючи той самий метод
ЕПЗРОТ, що описаний вище. Дані, представлені на фігурі 9, показують обмежену активацію Т- клітин у межах клінічно релевантного діапазону концентрацій («1 НМ) щодо здорових тканин, включаючи тканини судин шкіри, серця, скелетних м'язів, печінки та легені.
Крім того, молекули ІтттТАС 1 і 4 тестували на реактивність із застосуванням розширеної панелі, що включала »10 типів нормальних клітин, із застосуванням того самого методу
ЕПЗРОТ, що описаний вище, та діапазон концентрацій Ітт ТАС з меншими значеннями (0,01
НМ, 01 НМ, 0,2 НМ, 0,3 нМ, 0,5 нМ ії 1 нМ). На фігурі 10 представлені репрезентативні дані, отримані для клітин скелетних м'язів, серця та нирок. У кожному випадку антигенпозитивні клітини (МСІ-Н1703) й антигеннегативні клітини (МСІ-Н441) включали як контролі. Дані демонструють незначну реактивність щодо нормальних клітин порівняно з антигенпозитивними клітинами в межах клінічно релевантного діапазону концентрацій (51 НМ).
Ці дані вказують на те, що молекули ІттТАС демонструють високий рівень активності та специфічності й, отже, є особливо придатними для терапевтичного застосування.
Приклад 7. Активна загибель пухлинних клітин під дією Т-клітин, переадресованими за допомогою ІттТАС
Здатність молекул ІттТАС за даним винаходом опосередковувати активну загибель антигенпозитивних пухлинних клітин під дією переадресованих Т-клітин досліджували із застосуванням платформи ІпсиСуїє (Евзеп Віобсіеєпсе). Цей аналіз забезпечує можливість виявлення вивільнення каспази-3/7, маркера апоптозу, за допомогою мікроскопії у режимі реального часу.
Спосіб
Аналізи виконували із застосуванням набору для аналізу апоптоза за вивільненням каспази- 3/7 із застосуванням 9б-лункового формату СеїІРіауєег (Еззеп Віобсіепсе, Мо за каталогом 4440) та виконували його згідно з протоколом виробника. Коротко, цільові клітини (МСІ-НІ703 - антиген "НІ А А"02-е та МОСІ-Н4і41 - антиген"е НІ А А"02-е) висівали із розрахунку 5000 клітин на лунку та інкубували протягом ночі, щоб забезпечити їхнє прилипання. Готували розчини
ІттТАС з концентраціями від 0,5 нМ до 0,01 нМ та по 25 мкл кожної концентрації додавали у відповідну лунку. Ефекторні клітини застосовували з розрахунку відношення ефектори/цільові клітини 10:1 (50000 клітин на лунку). Також готували контрольний зразок без ІттТАсС. Реагент для аналізу МисМієм/у готували за концентрації 30 мкМ та 25 мкл додавали в кожну лунку, а кінцевий об'єм доводили до 150 мкл (з одержанням кінцевої концентрації 5 мкМ). Планшет розміщали у пристрої ІпсиСуїе та отримували зображення через кожні 2 години (1 зображення на лунку) протягом З діб. Визначали кількість апоптозних клітин на кожному зображенні та реєстрували число апоптозних клітин на мм". Аналізи виконували у трьох повторностях.
Результати
Дані, представлені на фігурі 11, показують загибель пухлинних клітин під дією Т-клітин, переадресованих за допомогою ІттТАсС, у режимі реального часу. Результати представлені для ІттТАСІ1 і ІттТАС4. У випадку обох молекул ІттТАС з концентрацією 0,01 нм продемонстрована загибель антигенпозитивних пухлинних клітин під дією переадресованих Т- клітин. Загибель антигеннегативних клітин не спостерігали навіть за найвищої концентрації (0,5
НМ).
Ці дані підтверджують, що ІттТАСіІ ії ІттТАС4 опосередковують активну загибель антигенпозитивних пухлинних клітин під дією переадресованих Т-клітин.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105» ІММУНОКОР ЛІМІТЕД «120» Т-клітинні рецептори 5О0 -130» РІ0145ОМО -1505» 1606009.7 -1515» 2016-04-08 -160» 81 «170» Раїепінп версія 3.5 60 «2105 1
«212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005» 1
СНУ УВЕ ТУ, Аво СМУ Аа СНИ Мі ТТ МВ 1 5 т -21052 «2115 207 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «40052 ув дат зт Уді Зі біз Зег бо СМ хим бе На не ее СНО СНУ уз Ази Сув ТПгізи б Сув Авп Гм ТНе Уві бек то вне ет Ави се Аг ТО ТуУг був СИ Ав Тк СПУ Ага СУ Ро Ві Зегіеи ТВ 5 о ча пе Мет Бе его ав Тв ув СН Ав му Ап ГУ Тк А
Те гбец ар Ав Аво ПЕ бух СНАа Б Зег бе є Пе Те ів Баг
Суп ви с Ащо бег Аба зе пу Не був Уві мВ Ави Мі 5егсму
Су Баг Буг Пе Бо ТВг Не Сну МО СНУ 15 Зег бец Не Уві вне то 1о5 о
Фе де пф вжи Кн о Ку й хо Ж сн хв ск й жи ку Ку
Кто тує Не сій бук Ро дер Кто Ага Уві Ту т Гео Алі Ар бен ї 5 ке КУ
ТВ 120 т г" я г те с Як с ше Ку Жан Кін Клум ух іч ет Ое АКроЇУув сег Уві Су ви Єна ТАг АЗО ВН Аврозег С та ЗОНУ 148 ік си щі У Мих Су с Ах Є гук й Сумі зи а ЖКізу баку не
ТагАзп У Бен ЄМ ЗОг уч лов не АЗОВ УВІ Гук Пе ТА АЕС УуЄ 5. ж ко Зк тав 35 155 150 з «гії 7 з с Тих Ж охи В Я захо Ку й Коси міс 3 й
Пе уві ву зо Ме Алі шаг Ме! Ав бле був Ще Ав мега Уві ди а А 1 ТО 175
ИН г з г «дону Ки іч хи ді жу Міс СУ Ат дзу
Ав то Бег Ав був З Ав Ре Ав був АФ Аа А Не дал Ах
Хати сх іс» Ше СХ; ду Ми су (Зі с СНУУ Как Ач ТО; Кз к Су хн Не не то 3 Ав Пи Бве БНе Бгто сег ЄтТа си кає она «210» З «2115 246 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005 З вро вух УВГ СНчп его Ага Буг бе у ув Ага ТК СЄМу си був Ма неї ви С ств У СЛ АВО Ме АвО Ні Са Ави Ме
Бре їго бугАга СЯ Авр бте СПУ Се У Се Ага Кеи Не Туг ве
Бег Ту Аар УВК ув МОСК ув НЕ ук МУ Ар в бе ємо СНУ Бу! ща 55 ЩО
Зег Ущ ег Аг Си увів СВ АР пе кн бе Не бе ми сг
Аве Ав со ТЕ Бег Ме Тугі ви був Ав Бек бек Ре ев
Мет Бе сНу хр то Тут СНО а Тут КвБе сну Кто У Пи АгО 00 то5 110 : М: РК М Х ї : М жу Мах КЗБех ГЗуєу КЗ З; іі іх
Сец те ма гг іш Аво во був Ав У пе то Бро СНО Уві АВ
Уві ве єни ето аг СИ АБ СИ Пе сег іч Тв са був АВГ В 180 155 140 іа Уа ув ви Ав ТОМУ Бе о ТУук Кто дво Міз Уві СВ бе ет
То УВЕ АВ СОУ КУБ СНО УВЕБНх Зеб СНУ У Зак Те АЮ то
З Ето бец а СН Сл Ето лів бен Аа Ар мет АТ Буг ув бу зва ТЕХ 150
Мег баг Аг ес АМО УВІ Зег А Те Бе Тр сг АН ОТО Агу Аве а я Б
Мі ре Ага Су СЯ ма сна не ту СЯу Сем одеє СИ АБИ АВ ЄНИ
Трек Ку Кі А зу кит й тт Кок а ви ік її «і ких Мі Ех го Те СНИ АК ка від і ув те щі вів Не Ма Сет АВ СНИ
АВ то СНУ АТО АБ Ав
Я
«2105» 4 «2115 207 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «400» 4
Му дана ма СМИ СМ ще из сно Зег ей Не опе ец Єна Му
З З 16 а ї а ех зх іди ЕЛЬ ех Й ух бут тв «х ді См та Ка сег де Не ух Ав СУБ Пе ев і сСув Аа Тут Те Уві ет Бгто Ва ет ап ех у -Е с ІУ
З я З ; Же житі че ЕН й і З; ее ЕМ; З ре йй Єоакі вч Ті мву Ак їв Туг бух Св Ав Тв СНУ Аг СНУ то ан вет бе ТВ
ЗВ що ве : с ОК р Се ТЕ: лом Те ск оз ве Ку я Тк Ме діа
Не Ме Тева ет сни ва" ТВ бух Баг АВА СМу ям Тут ТРАВ щі ЗО ЗО ке х кі кола ЕМ сек Жан км Зі: Нав Діз Є тегам Авр Аа Аею Те ув С Бе Жег ви Вів Не ТВ Ав НВ ща т 5 5 хі : ; Ск Кі Се Трек у хі дат их Жах
Суп ен ще Авр ек Ареег Тує Не Су мак АВТ М ЗЕ СМу ке скік с» ее тм Но ЕМ ех и Кк ак дп Ниві Бех
Ну Баг Тук Пе то г Мне у Ага СНУ ГМО а НЕ ВІ, кре о Не 3
Кто бек Песни ух Ес АБО ЕТО Аа Уві Ту біт и Ага Аереї мув Бегнм Авріув сег ув сув Цео БВ ТВА Не Аврощег СН 13О 155 140
ТвЕАви Уві З Са баг у Авробег Ахо Уві Тут Не Тит дар ув
Шуг УВІ дви Авр Мей Ага бен Ме Авр Бе ук Бек Аж де від а 155 170 175
Кі тт баг Ал ув БЕг АВ ве А був Ав Ап Аа не АВ АВ 10 155 І хмаг в На бо СПО АБО ТР На не Бо аг га СН бен ех 195 ЩО 05 «2105 5 «2115 246 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005 5 гії КЕ зу М Ким і; Й км Ех. Дж ХК муз іш Й Мих КУ
СБ ух Ма ве йо ЄМО був Уві і Аюо МЕ АБО Мі СІ лап Ме
МВ я Не ЗО
Га Тих і А укук А дахи Ки Кг ОМ ска бути ов вії: біс» іх КУ
Мне то Тк Ат СМ Аво то Су Ге СУ фе Аг бец пе Ту Єна
Се в А уух У й вом - мих КМ жо ік су іс Ше КІ Му т
Ще ТУ бер УВІ ув Ме ув Сни ув СМуУ Авр Не Бус и СУ Гу)
Ск й Ки Кох З ге хи КЗ: нн ЗР ху єм: ем В г 215 ЖЖ ак уві ее АК СНИ ук Був СНИ Аво кн омек се не се сен хі Се Тр о ох іа Же ди а Кі су как и сві Кн Кри жі:
Ав бег Твг Ав сив ге Ме тугі ув Ай Зег бе ие Си
Мети Бе см АБО ТО Ту сна ТУ Ве му Ро Ну ПАТО 1 че не тями Гуз іч сті бо зді сю Кт зі З дУ КВуз КОриу іі Ве
Тев'тнУВІ ТВ ОВ Аерієціує Аа Уві вне кто Кто Спо мі Ар
Хтею ЕЗзхУ ЕХ: Ме цк КЗ: ді КМ Жах п у дк уко Же
У Ве с го дег Ми Афа СНИ Не Зеєр Са був Ма Те
Зо ів Уа Суз сво Аа Тег су ва Ту то Авр Ні Учню бе сег
Те го Ві Аа СУ Бу СНО Уві Ні Зак сМу МВ СУ ТВ Ахо Ето щі бто ви бує СНО СНО Рто АВ бе Ав АБО Заг А Ту АВ ву що тв ню щеговгАга сец А Уві ОБ Аа ТВЕР Ва Тр іт Ав го Ага Аа 95 що кВ
Нв не Ага Суб Сп Уві З ве тує СЛу де Зег СПО Ав Аве ЄМ
Те тег СН Ако Ага лів ув то ма Тв і Не мі ек ків СНО а Ттресну Аго АВ АБО «2105 6 «21156 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005» 6
Марс вто не Бех Ай «2105 7 «2115 7 «212» Білок
«213» Ното зарієп5 «4005 7
МЕТА не маг о Ах ГНЕ «2105» 8 «2115 13 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «400» 8 чагруві Ава На бек сну СПУ Беж Тут По Ре Пе Не
Ї 5 10 «2105» 9 «2115 17 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005» 9 сви Аг То Бук у соми дар ТВг МУ АТО ЄМУ Рто Уві зЗегівц г
З 5 15 тв
Не «210» 10 «2115» 34 «212» Білок «213» Ното зарієп5
Зо «4005 10 і ув ог Аж У Ато Туг нг Айва ТВг гео дев Аа Аве Тег ух СНИ і В зо 15 мет це ів Не Те Аа сне ІЙ Бец Зег Аз Б АВ сек тує
Ме о КВ. «2105 11 «-2115 5 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005 11
Мен Ар ВН СМ Акт «2105 12 «-21156 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005 12
Заг Ту Авр УЗ ув МО «2105 13 «211516 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005 13
Ав бе: бегва сви Ме Тв ет Су Аво го губ омо СЗ Туг ве «2105 14 «211517 «212» Білок
«213» Ното зарієп5 «400» 14
Ме бе То Туг Аа ій дво бо Сну Ге СНУ Сен Ат ви пе Туг в Мне «210» 15 «2115 37 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005» 15
Ку Сни ув СПУ АБО Пе Миз си СМу Губна хм Ага Сни Ку 1 5 За 15
Ку С: Ага Не Заг і ви Пе во Смо Беб А бе Тр Ав і Тв
Ка жо ЗО ще АН Гук Ге ук «2105» 16 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (с19м) «4005 16 і ув Ап Уві Спо Ма Зег Кто С Зеріви Пе Пе в со СНУ 1 З то 15
Сув дан Уа ТР ее Сни ув Аа тує Тр Уві кг Бгто Не хм Авт еп Ал ТО тугі тую СИ АЮ ТУ СТУ Аг СНУ го ма кн це ТВ
З «ФО 45
Не Ме Тр Ен ЗегсмМо Ав ТВгф ук г А МУ АК Туг ТВ КАТЯ
ТВггрви Ар Ав АВО ТВі ув і его Бе бе Та А бег спец бег дав Зег Аз его Туг пе був уві у АВ НВ Бе СНУ
СМу Же Туг Пе Рго Тег Рене слу Аг СМу ТВ Зеє беи Пе Уві Ні з 15 я че «210517 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (а7)
«4005 17 ув Ал ча СНИ Сн Бе то См Бег ви Не Пе цем Сн СМу і 5 ЕЕ 15 уз дви У Гог ес сце бух Ав Туг ТТ Уві Зег го ВБе Зак Ав о ко я іеч Ан іт Туг бу СА АБО ПЕ СЧМУ Ага СУ ТО Уа Бен бе ГНу
За З Ба
Пе фенч АВо Гує Дів По Ав Перу У Ав сну Аг Гуг ТВ АВ
Твггец Авр Аа Авр ТК ув ів Заг ее ка Не Тв; А ще 55 ТО 75 що
Співи сег Ар Зег Афв сег тугНе був Уа МВ АБИ МІ бБег Му
Сму Заг тугі бро Тиг не му дерму Трек бе Не ма нів ю що о ге «2105 18 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (а12)
«4005» 18 ув АВА НІ УВІ ЄМ СМИ сег Ко со Зег меу Не пе бе СПО СЄму
З Б 10 15 ї х жу і Кк ямі КЗ ж пе бак юку Я ие Зк Зо Со шу ува УЗ ЕР Кец сп Сук Ав Туб гне Уві хек чо ре є Ави о не в
Свеиц Аг іт Тут) у Сп Дар Те СЯУ Ага Сну Кто уд бебі тв
Пе меє Твена Заг Си Аа Тв? ув Зег Ап СПУ Ага Ту ТВА ща 55 що
ТагізиАВО А Ахо ТВ був і зе бе и Мі Пе Ту ліз аг 55 ТО тв но
Оп ев его Бог Ав Бег Туг Пе був Уа Уві Аа АТО АВ Азо а НВ ТУ
Ст ец Туб пе то Те ве Су Ага СмуУ ТР бег бе бе ВЕН
НЕ що о те «2105» 19 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність
«223» Мутантний альфа-ланцюг (а13) «400» 19 ув деп аз ма Єна СИ бег Бго Спи Зег і ео йе Пе уец СНИ ЄМу зуб АВ УВІ гів Оз су Ази ТУ ТВг ув ще го ве сн Ах
Кей Ас тю Буг уз ій АЗОВ сМУ Апу су Ро Уа Бебі Те о 30 з
Не Ай Тек Нео бег СНО аг Аг ув бог Аагьочу Ага Бук ГВт АВ
Тегі Азо Аа Аво Тегі ув КМ бе БЗеггецй Мі: Пе гне АрЯ Сет ці ЕВ 75 що
Сійієц бегАвев бег Аа нн Тує Не Сув ме Ущ Ав ее АВ АВР «Му ен Туг Пе Бгто Ж Єне Спу Ато СУ Пі баг ву Пе ма Нв ще 305 110
Ето «2105» 20 «2115113 «212» Білок
«213» Штучна послідовність «223» Мутантний альфа-ланцюг (а1ЗКа) «400» 20
Ав Ава бів Уві сни Са бе го Са Бет Се пе Пе бен с Ну 1 5 т їв ув Авт мВ гі ви ів Су Ав Бук Грг уві Бег Кто па ен Ав
КО 5 З івана ТО Бугіув С АВО ТВ ОМУ АГе Сну Мо Уві бек ев ТЕ 35 Я 45
Пе ме Тр бе бег СЯ Ава тег ух Заг Ап у Аг Туг Тег оАмча
Тег Аве Ав Ар я уз Сів Заг бе бен ів Пе Тв АВ бНх
За ви Заг Аве Ав МОГ Буг Це ув УВІ У Аг ЗВ АВ Вал щу ОЗ Ні
СМУ ев ТУ бе бто ТВ не Сну го СУ Те егіеи в ді у
Ек ки «2105 21 «2115113
«212» Білок «213» Штучна послідовність «223» Мутантний альфа-ланцюг (а19) «400» 21 ув Авп сна Магоїін Сип ян Бгто Са дн Бех Не пе во СНО сну
Гук вип уві бвгбео сна бух Авпо Тут Тг Уві бес бто на Бег Ав ев Ага тр Туг бух Сни Авр п Му Агу СТУ Рго Уві Мет ен ТВ зо я 45
Небви во Туг Ав ів деп Тегі тв хни вагу Ага Ту ТВг Ав
Б 5 ЩО
Тв ецо Аз Ав Авр Тегі ув Спа бек Зак бе Ні Пе Ве Аа бю по Та Та о сна ен сег АБО Ве АЕС Тут Не Су Уві УВІ Ал Аг Ав АЕр а що 5
С во тує Це Уо н БпЕ СНУ АТО МУ Тх Заг і во Не Уві Нр ще 135 1 їто «2105» 22
«212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг(а19ка) «400» 22 віза Ави сна ма сни Си дег бто Сма Баг бен Не Не ви БА ЄМу ! ЩЕ 19 15 іувАВа Ма тпруви с Сув Аза Буг Пе Уді бегб Кто Крок АВІ іеи Ат то Туру СП АВО ТЕ СНУ АпРСНУ Кто МВ Бе ву Тег
Пебеви дер т АВ ев Аве ТЕ і ув Єег Два Се Аг Ту ТНгОАВа
Твг гео Авр Ав Ар ТНгі ую і Бег бегіви Мі Пе ТЕ АБ аг
Сп фен сне Аво Бек Ав ще Туг Пе Су Уві УВІ Ап Аг А Аяюр слу ви Ту Пе го Тв ве СУ Агу СПУ Тег ек бво Не сУвіЕ Ні 10 ТОБ 115
Ето м
«2105» 23 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (а1ЗкКаї 5) «400» 23 фа Авт СНА МВ СНЬ ЄМ Зек то С се а Не пе Сей ЄМО СНУ
Бук ап уві ТНгбево сни сук АБИ ТУ ВЕ ма чего Юре ог ви
Сем Аг тт Туб був Сни Авр Тег СНУ Ага СНУ Кто Уві чег ео Тег
Не бец Те Ре Чек Сб Аво ТІ Гуз бег деп СТУ Аго Тук Те Ав
Тетіви Ар АВ Або пн був Ні ер бек ге Ні пе ТВ АТ Бег
Ст ієец Бег Аве ек Аа бег Туга Су УВУ Аа Бе АФ хе су цеи Ту Пе бо Те реа СЛУ Агу СНУ Тв бегіви Пе уві М
ТО то те «210» 24 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (аї1ЗкКа! О) «400» 24
Аа АВ і У СН СИ Заг здій За бе Пе Пе ви З СН;
І ув Ав Уві Ті Сів Сук дв Тує Те уві Зак го пе Зег Дей ів Аг тро гук був ій Авр Пе СНУ Апо су та уд Заг во г
Це жо Пе ре бег Ми деп Тг ух Мег оАат СПУ Ага Туг ТВг дів
Тео Ахр АВ АЮ ГГ ув СН бе Бе ец Ні Нео Тер Аа щег
Из ву бег Ав оЗег АВ Заг Туг Не був уві ві Аби Заг АВ Сп
СПУ ви Буг Не вто ТЕ Мне сну Ага У Тег Бебьеи Це ме Не 100 т о
Кто «2105» 25 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (Ьї) «4005 25
АвроУВ Був Ущі Т СуМ см Бен Агу Тугбец мМагбухвАт Т Ну
Спа був ма бе сво СНИ Су У СМ АЗО Ме Аве Нів слу Ав Ме! ие тр Ту че суп Або Кто Су кеш у кецА М ВО Не Туг Єна
Зег Ту Авр Уві у Мерсув СЗін був СПУ Аво Пе то на Сну Тут в 55 що
Бег уві бег ат си ув був СНО Ага пе дет кец Пе ви Су ож ага бег Тел си Ге г Ме Буг во Су А БегВг бег АО 55 о 5 сна Ал а СПУ Аве Бгто Тут СНИ СО Тут Ве чу Рус Сну Тв Ага
Кіа т УВ ТВЕ «2105» 26 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (БіІ4) «400» 26 дар Уа ув Уві Те Зег Баг АгО Туг Пе Уві ук Ат ВГ У син був У Не бе сни ув УВС дао Ав ето Єви бег уз МеЗ
КАе го губ А Ота о У Бе СПУ бе Аг ем це ТУЄБве аг ТугАвр УВІ Су Ме ув СО був СЛУ Во Пе Бо СМ МУ Гух
Заг уві бегоема си був бує у Алі пе Бегіви Пе фе бог
Ав Ка ПАЗА СНИ ТВ? Заг Ме: Туг і ер ув Аа ще сег кет ЄМО
ЕК що 5 й Ав Зег пу яму Ро Ту ся Са ТУуг БНе спу то МУ ПЕ АгО а ще а
Се Тег ма Тег 3435 кх «2105 27 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність
«223» Мутантний бета-ланцюг (Б141) «400» 27
Авр Уві ув Мі ТПг СНИ дет аг Аг Гугіви У ув Ач ТИг ЄНу
См ув Уві Мне ву СЯИ Су Уві сх Дар АВ те бе сег ув Ме не лбто Те Ага сна Аяо кто Сну во СНУ Си Аг ви Пе Тує Ева ег Туга зії Уві вні ч Зі Уч СНУ АВ Не че СНО СМУ ТУ с Еш я УК І Су В Би СУ ГУ 3 МУ5 С Ж У ї ТК су хх що о БО щег уві хна Аг Сни КуУВ Ку Сич Аа Не Бег зу Не цу 5ег дів чес ГТ Ааа сни ТТ ет Ме Туг ем Суб Ача бег аг щег АБО сна Ав хм у Авр Бгто Ту Спа С Тут Ве спр то НУ ТА АгО то ТОВ 115
Це Те Уві тн «2105» 28
«212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (021) «400» 28
Акро Уві ув Ма Те Са Заг Бер Ап угіео Уві був Аг ТЕ ЄУ і 5 ї1а 15 і їув уві Єна ем С ув МВ СО Ав Ме Аво Ні Ми Ав Мої хо й Зо пе їтр Буг Агу бій аАвр ен У мео сну Це Ага бо Не Тук Не
Бег А гу не Аа Те Су був СНН Сук Су еру мто Сію Му Ту
Ба Б г що ха МУ
Забув Берг АТ со був ув Со Ав ее Загін і аб СО Оюх
Аванті Аа са Твгег Мей Тугієн Сув Аа бег Кн Сет Ар
ОМ Авп Бег Су АБ то Туг ЧО Ма Туг пану Ето СНУ ТЕ Аг у К Х З З оту ш 105 105 іо ви Тема Тег тв «2105» 29 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (211) «400» 29
Аво уві був ма! тя Спа Бе бег Аг Гугіви ма! ув Ако Твг Су с ув УВІ Рна ев Су Уа З АВМ ей Аво Ні СМЦ Ак Ме що 5 І пе Тур Ту Ас ЗВ Авто СТУ ви сну Дені аа бе Де Буг Єна
З АгГЯ пе АВ ТВ Оу су І ув СОУ Авро Пе РТМ а СНУ Гук
Щег Уві Бег Ага СНО був Су смю Аг не бегі ви в сви СПИ ет
Ав Заг ТВ Ав ів Тргобег Ме Тут бе уз Ав вес ет ег АЗОВ
КА Авп о бег іу Аво Єто Тут Сни З Тут Ре сМу го Ну тт АГ цей ТР УВІ ТЕ «210» 30 «2115 5 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Лінкерна послідовність «400» 30
СУ Се ЗУ СНУ Бег «210» 31 «2115 5 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Лінкерна послідовність «400» 31
СНУ МУ СПУ Бе СНУ «2105» 32 «2115 5
«212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Лінкерна послідовність «400» 32 «210» 33 «2115 5 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Лінкерна послідовність «4005» ЗЗ3
СО ще НУ СНУ СУ «210» 34 «21156 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Лінкерна послідовність
Зо «400» 34
СНУ Бек су СНУ СЛУ Ето «210» 35 «2115 5 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Лінкерна послідовність «4005» 35
Су Су СН Ето ВГ
«2105» 36 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Лінкерна послідовність «400» 36
СНУ СНУ ЗВ СНУ СНУ СНУ РО
«210» 37 «211512 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Лінкерна послідовність «4005» 37
СНУ НУ СНО ТУ СНУ ЗУ зе СПИ СНУ СНУ СНУ аг «2105» 38 «2115» 199 «212» Білок «213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» Альфа-ланцюг(а19ка) «400» 38 іх йому Як й. уч ну інки і Жах ямі зіих ВіЖ В ж тку: Сх вів Ат сив УВІ Са Смп ето Сх ме па пе ви З СМУ і 5 15 15
Ку Аа Уа Пец сни Суха Туг Тема баг го Не сег ал сн У сту ко У БЕ
Кео Аг тв усі уз Бі дав ТР СНУ Ага сСмНу РО УВе рені ТЕ ів іецАво тугАВ ПееАлаМ ТВгСув сег АВ МУ АВ ГУСТЕ АНІ
Збру їх йсхех Міо ун М В охак ках Кн ак сх: Вієта
Пр бео Азю Аа Ар Твгфує ма хег баг Кей Мі Не Тег Аба ке
ТО 75 во
Хе зр; Кок Дек Мавки Мі Же ак Ба їх а Зі пу Дим Аіх ом ство Бе" Аве ет Ав ег тує Не Су Уві Уві Ав АгО Ав Аз
Се ва Тук Пе бто Те бе Спу Ага СНУ ТвгоЗег беи Не Уві Не то Гук Пе ЗТ ув сг Ав то Аа Ук Ту ОВ ем АгУ яв БЕ ув СН ОО Аяр уз Бег УВІ Су ец ВНе пт АВ МВ Аве ет СА
ТЕ Ах УщІ Зег Сів Зегі ув Аво баг Лео М Тує Не Тег АЗО С ув
Слів МВ рео АВО МЕ А сег Ме АБр Ве ув Ще Ав КН Аа ма 155 170 1755
Дід Го Берг АВ ук Бек АБО Не А Су АВ Аа А КН АЙ Ки 1 їВ5 150 зе це Пе Кто СНУ Аа Ну
ТОБ
«2105» 39 «2115 199 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Альфа-ланцюг (а1ЗКа) «400» 39 кі сіут Я йкві я Кв ще Су Ку Ку В які: Вс фік в мі ЄВ КТ,
Ав Аза С Уві сСиц Сни баг го Сів бен во бе Не ви Син Су ї 5 10 їв ії. ще дю В, іс бі Аа Кок Біг и хе ких На Мак ше
Гук АЙ ВН ТВ ви СУ вна Ту Пр ла ще Бгто Бе зе АВ сур ЗЕ "уга
КВ ко м шті фе Тим Кз В зх КЗ А жов Кі 3 Ду КНУ Вияв Се в мірі іде із Аг то ТУугі ув Са АВО Пе ОТ. АГРО У ЕТО Уагббег сем Ті
ВІ «5
Па Масть Їм оч Ж А шу вк се Св дю МУ Вуз не Тк Діє
Пе Ме ін еве бегсо Аза гу ЗБг АВи СМУ Аг тут ТИ АН
Ба 55 що ер сг. щі іх й же зе Ля Сохк Кт сзк мі Біо їй Же міс ук
Тпгбео Аве Аз АБО Тг ів сут ег бе Мі ПЕ ГВС АНІ ЗЕ сп во сег Аво Бег Ав бег Ту Це був Уві Мі Ав Бе А Аа. 5 ЗО зв
Су цец Ту Пе то Тв Ре Су Ат СНУ Тв оЗае бе пе ма Ме
То 105 т
Рго Тег Пе Со ух Ро Авр Ето Ав маг Тує НА Сеи Ага Авщраг 115 ЗО 15 іУуБег жнег лорі жа уд сув ец пе тн Аво Бе Авр сег С)й
Твсежен Уві БегіЗі Зег ув дер маг Аве УВІ Гук НО ТОК Аюю Кув суб У сви Аво Ме Ап се Ме Аво пе ую їет бі хна Аа МВ
Ав тро бег Ав бує Заг Або РНе Аа Су Ав Акп А РВЕ дає ви
Звг Не Не то СО АЗОТ 195 «Р10» 40 «2115 199 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Альфа-ланцюг(а1ЗКа! 0) «400» 40
Аз дяп з ма с сип рег Кто ма Бег бео Не йе се сче СНУ
Кіз б іхух З бе Же ша Ку зго ак кю Ж хв се не ЄЮ щи Моє
Гу Ада Ущі Твг беи З Сук А Тут т Узі бБегРто ЄВе 5 Ави : у нн в и Чи и у и А и У кг ік мец Ата ПО тугу мап бар ТВг СУ ГО Му ТО УщЕ ХМ ВО ПІ гу сії ЖЄіе З ну опе КЛ: ду Же сек Сахк із ЗУ Де Сук вк ія
Не бер Те бе цен СН А ТВг ух ЗВк АВ ЗУ Аа ТУ Ге Аа 5 що
Зк Б Аіч ікону жів ої зв Кін у хв Ки й дузі КЕ філ їі Щі ах
Гег ре Аве АВ А ТНК ув Сум бег ха Кец Не Не Рг АН КЕ "хін ії сурі ЖШочу й КЮЖлує із ее Бугу фісх ік Хор Ук ук г Кол ім
Смп бе Б АБО ет Аа Бен Гу На Суб жи ен ям Не АВ СМ сну кеш гук Пе бус ре пе Му атрену Трек ме Пе ма кна юЮ НЕ 1
Мт тує Не іп був МР) Ааю то Аа УВЕ т уг ій З ец Ам Аз ет вуз ЕН ог Ар ув Заг У уві во Бе Трав пе Аве Бе ЄМ
ТВ АВа Уві За Сп зе ув Ав ег Азю І Тут Не ТВг АВО Му
Су Ма ец Аве Меї Ага ме Ме А ВНе ів бег Аша сне Аа УВІ
Аів їто Баг хв бує Заг АЖ пе АВ СУБ АВ Аа АВ пе Ав АВМ
То «2105» 41 «2115 199 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Альфа-ланцюг(а1ЗКа! 8) «4005» 41
Хі бики у Мк и хз де Ки а тю екв: ВК се Я сі Му
Ав Азп ів Уві СУ сп ек го Сни Бег бе Не Пе бе СМ у
Кя Гн ЗЕ Зх ! 5 НН 15 зна сах й Січ 3 жі ка жін дак Ж Ж і ху ех Зо шк ме
Її Аа мВ тні еи Сп Су Ази Тугб ТВ ув е Рг Єлв оег АБИ м о З
Ї сеї Ко дк Ж у В их Ж Ху Кри ЕХ доме і КБ га Ки ще ери
Кви жа бго Гб бук СНИ Аа ТВ СНУ АРКУ Кто Ма! зЗегец тн в ска ку Кри коки Км ки М кокос ду М ту Ж Ки міх
Пе бец т ене Заг сли аа ТИ бує баг ва СНУ Ат Тег Тег АВ те се сих
Во кі сі ще іє йог ісу і но ЄМ Кочур жнива а Же віт де гів АЗО Діа Аоав гг у Сім бек ог а а Пе ТР АВ ЕНЕЇ 5 то ТВ В жк у ха дно Ж іє ие Кук вну кю КК «355 ух чо А ке
С ієв щегАво Щеганча ек Гук о Суз Уві УВІ Ава ек Аа се а Сх к в що ОК
ЖЖ сії ою фісу боку СК и и Ах о те Ки В нм бі ті і сте туге бо Тиг бВе су Аг См Те ха Ма Пе АВ БВ
Ягнх Ззгх а х 105 1
Ета Ту Пе Зі ув Кт бар бо Ана Ущі Туб ЄЯВЗ Деу АМО Аяр дет
Чув ен заг АВКіт и УВІ су іец не ТВ АВ пе Аво аг и 15 1585 1
ТАКА Ущі ям ОЙ егі ув Аар Зег АКО УВІ Туг Пе ТВ АОС ую
Суб ун ву Аво Ме Аг Зег МЕ Або Неї у бег Ав Заг Аа В іде 17 ТВ ді то нн ап ув Сн аа Не Аа Суб Аа Ай АБ СНе ака АВ 180 їв 150
Зег Пе Це то СВ АВ ТВ 155 «2105» 42 «2115 504 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Бета-ланцюг (014). «400» 42 і хх я Тве ЗВ ек Бгто Зег Зюрі во аг ДІВ Хе з СпУ
Аа не сни Метт сип 5ег то Бег хна цер се ів Бе ВЕ Су
З В 16 15 , щі Те Бе Те Су Ак вів Зевс Аз Пе Авз аа Ту
Аврага Уа Тег Не Тв Су Аг АВ Зег сн АВОо Пе ду АВ Ту без аап то Туга Суп був Кто МУ уз Аа Бгто був бец цен Не ізо аа го тугі Чи ув го СМУ Був А ето у і С Ен ЄМ ман Ето аг Ага Се Заг СУ
Турбує Твбоег ами бе сно бен ЄМУ Уві Кто ог Ага несе с,
З 5 с ін Кави Еф, Тк одесгу Тер вк вні ТВе в КЖаште Ємвк і З Е щегОе Бебі Тв Аво тує твгіеи Твг е зе Зег бе о Ре що Зк вк що НЕ а що
Но Аврбва АБО Те Туб Буг ух Са Сн у дав б Цеб бте ге й в що пе 1, СБ СМ Тк і се хи ВІВ: ев ув ЗБК ЕМО СНО ЗКУ Бе
ТВгбенесму я сну ТАг ув ві СЯЦ Не був СМУ СЛУ ЄМУ СНУ ХМ та НІЖ 1 ями п ко ух Ху й ху й в: її КК НИ г 3 : КЕ з СНУ киУ КНУ КНУ СНУ маг СИМ Сну Сну ЄМЛУ Бех СНУ СМУ СНУ СНУ Маг Сну в пк їн 115 Т-О 1-5
СНУ Спу сег СТЬ Ма п ее У СНО ет СПУ СПУ СНУ Се М СНИ
Су Як Я
І 15 їн)
ТУ. Я их Ху - ке «ЖК Се ак й А я у и М нку ВО те Му СЛУ Сет і ви Ага ів аг СУ АВ АВ че СПУ Тут Баг на его Тут те ЖЕНЯ Аа то ма Аме СЯп діа вто У був СНУ ЦОМ
За юка Я ска ві Ма З ати і з З у и не аг А ен
Кто магів ев йе два т Гукі ув Су Ущі ж ТпР.ГУГ АВ
АН змо Кам ха они Кінь іс БУ Кок ух Ми в хну Се «ки ке са бук ре ув АБ Аг пе т Пе зе Уві Аво бух Зег бух Ав
Ту іс Же які Кі. Ка и С дюу у же фі є р уух Ух Які
НКАУ Бе От Ме АВ Бе ре АЛ АН УВІ АЮ ГАК Аа Уа ів 215 як
Тут Туг Сув Аів Ага Зег зі Туб Туголу дерокни Аве їто Тук На ут мех ху Ук й
М ОО КЕ яні
Авр тв спесна су Твг зо Уві Твен бег бе? СНУ СПУ СУ 45 -Ю а в2
СМу Бег ля У ув Ма тп сег кН Ам Буг це Уві ув АТ че мк у хе Ен дві ЮК туз я ви я г іх Му і дум; Же
Пе СУ січ був УВІ не зво СО ув ма Сип Аве АТО Ма ХН ї вже Чу Ті Арея Зі ши КЗуе рожеві ре схії Па
Суб Мега Тло Гук Ага СНп Аве то Сім Се СНУ Сео Ага кеш пе ка «ЕК ЗО
ТубБАе бетг Тут даю Уві ув Мен бух СНО ув СУ АЮ НЕ го СЗШ
ОБ За З ЗО су ТУ шт Уві Сг Ага МИ Су і ую СЯЧ Аа Не баг бе пев бе тії; Ж В Ве іх В УхвАСЖККе Стози Кер в шумі й Аз хи Ка св щеагА Бе ТВ Ав Сцв ТВ бег Мей Тугбец ув Ав бег ов
ЗО За З шаг АВ ОЙ Ази ет СНУ дар Кто Тук СНО МИ Туга СНУ Бто Сну
ЗО ЗО ЗО зуж. соя ру І щі Р чи не МУ А Ки ех КУ
ГеРАТ ВО Ве УВІ Те СЧчо дарів ув Ап Ма еп то КТ СО ча Ав УВІ рве ємо то бег Си Ада Со Не бетг Мі Твен був
За ЗО З 0 ді жін в аі й ік Я сі: Дія Же; их Ток Зк Докхих Вуд Зб Я а Те сео УВІ був во ів ТРУ Не Туг Ба АВо Вих УДСО аа КБ 18 цап бег іт їто Уві Ап сну сук спи Уа! Чі беєЄну Уві ув Пе
Арго і то ее ув СМ п Роз ДІВ во Авп Аво е АГО Туг
Ав ви бег бен ЯМ і ей емо Уві ще АВ ТВ Ве То ій АвО Бга
Ага АВИ НІВ Ве Ага Су с УВС Ре ГУК ОНУ СаО ЗЕ ОО АВ
АСУ ТВ ТВ дар емО А був РО Ма Тегазі пе Уві ег
ХВ Зв Ача То СУ Аго Ав Авор «2105» 43 «2115 504 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Бета-ланцюг(р141).
«400» 43
Ав Неси Мем Тр сна Бе Кто бебхегівц Бег ав Зег УВІ СМу
Ав Аг УВІ ТР Не ВГСУ Ага АВ Зег Р Аз Не Аг АХ ГУГ іх й че Бк Ен ік і зх КУ Й в ху А КК м пуху В олдхкх ВК
Мей Ав ту Ту Са Сп ув Ето і ув Ав Ро був во бе Не
ТЯ ТубТвезегб Ат бен СНО ех Сну Уві ето щег АТ ЄНе бег СНУ
ЗагбснНу Бег у ТВгАЖО ТУ Твен ТВЕ Несе Заг зна СМАК
Сі Ав Ме А ТВ Гук Ту Суб СН СО СНУ Аяи Тег ви Кто то а ЗО 5
Фів ва У Ду ЕВ І за щі ві за СУ У СНУ У Су гваееваєну я сну ТТГ ув У СМу Пе ув ЄМу ЄЯуУ СПУ Су щем
Сі СПУ СНУ СНУ ег СНУ Суу СПУ сну КЕН СНУ КНУ СЛУ СНУ Зак Му
ТВ ТО їх
Та у ак КМ Ан с бі Ел; Сех КЗ; У і щі Кум се му Баг ми УВА Се мен ми ов СУ СНУ СНУ Бе мен СУТ и Сх Кк КМ хоч сії хе іх Кі р и о і Кк СУ
ТО с НУ его Ага се Звг сСув Ар Аз Беж СНу Туг се не з с ше ях ке 145 1 155 ТО кеша; Те й се ху 5 62 Дт ім іх ее у а БЦ; ям
ТОВ Туг Те Ме Аве То Уві АпрЗИ АВ го СНУ Уа СУ ен зх в як 185 176 175
Фу сі хх ем: Те Мк бу в ка КІ Те а У з ши тгО УМ АВ і Пе АВ Ого Гуг ув СУМУ УВІ щег ТВ Туг вав. зах зиж МЕ В долу Мо Моди КО а в Км б оуховм зах Ж А хуж ке спі кла у Вр АКНЕ ТЕ Пе сю Уві Авр і ув БЕР ув Ахп 155 ОО «Це
Грг АВ Ту без Сі Ме Ап бег іви АТО АФ сно лю Тв? АВ Ма 1 15 ЕМ
Буг тТуг Су Аз Аг Бегу Тут Туб Сну яр бег АвВо ТТ буг Не зчуиу жк у Ук Аг каз КІ я «І
Азов УВІ пре в СуУ Твгбец уві Те Удецаг ен СПУ У Ту
СПУ Заг АБО Ма ув МВ ТЕКИ снегоме АТО Туг гео У ув Аг рег чек ща ж к жо ре мМ зе їм ЗК сі Бі и М й ді Крос семи
Тесс вух Уві из і еи СПИ ув У пи Аво АВ Кто Бе км ші КАН ей р Ве ВЗідсу Ку То й нтя КМр Мем ВЗ ее В, Кк КТ ем: Ме її вмі Не
Ку Мене тт Ту Ас БІВ АЗОВ Сму Сеа ОБУ кави Ач ен пе
Ка ьа У ра
КЕ а ю
Пя Не сег Тур АВ УВІ ув ец і ув СУМ ув СУ Ар На ето СО
АХ, ро ер їх жк 05 М ЗІ о 3; с ах их а ую У. мой бух КТЗвчеМ Котли і смрі Б сії
СНУ Гу баг ма ен о Се був ув СЮ Ат Ре нн рео Небо у и сулкт суті ке а 35 кхіз оку іл бан Ме жу ті Гі е Жук В дн Кг які ви Ану ко хх
Спа Бег Аа сна Тк Ап Ге бе? Ме тугі був Хід ет ее
Б хх ши
ХО ХМК МО
ХХ шо М дО ВХ пах Кс жі; Ду Кри Жуоиі КБ Ж но Кі ВЗ щЗег АБО ІВ Аа нер СПУ мав Кто Тур ЗИ Туг Не ЄМ ЕТО МУ
ЮК хургу БІ о с ХО фімозу Ж гу Зв КІ Мах й змі: Кос у кА Же гУ Ки Мо: іх
ТА ец тв Уві Тег ов Азо бе бух дал мене то го Со
ТЕТ Ух уд т 5 ЗВ
Уві Агв уві Ра спо єго Заг о А СО Не бе Мі Те ОТ ув
БУ ЗОВ о вів Тег ген уві був бе АВ ТЕ СМуУ Мре Ту Ето Аво Нів ЗА СТУ іемеє іт т Ма Ап СНУ ув СЮ Ма ів его У УВУ ГГ «а азк 431 ж кожух ку
АвБічто єн Кто во був СПО Аа го АВ бе Ав Ажо Бе Ат тує
Маем мес же гео Аг уз сег Аа ТВ не то З Аво Ко 5 5 мк
Ага Аап Ні ве га Сук Сип УВІ З не Турєму цем ян ЄНи лей я 475 75 «о
Му у Зі Кк ит Ат і В их ет і Ки Ка их з й ух
Ар си тв ТВ СВ Авр Аго Аве су то ув Те Не удо ое дів Аа тт СНУ Аа Ав АВо 5 «210» 44 «2115 504 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Бета-ланцюг(ра1).
«400» 44
Ав Пе ма Меї Твена ет Кто бег бегієц Зег А баг М Су оду ож кВ я ЕК у Ух Мети ді ие ну док іх Де думу ую
Авр Ага УВІ гг е Тр ув Аг АВ Зее сна АЮ Не Аг и Гу! ах ЕЕ хх я «В ЗО ец Аа гро би а Зв ув то слу був ема Ко Бум ев цею Не
М 40 ча
ТугТуєТег баг Ага во СНе Вег ЄпУ Уві Єто Заг Аг Бе Бе СМу ще о БО
Зегозу же СНУ Тк Авр Тук Тв ву Тр пе бе Бег бе СИ го
Си Аврокве Ав Ту Тут Тут Сув с СН У Ав Тв бе бо їтр
Б 5 оо і
Твена єму С СНУ ТВгує МаБСлО Не був СУ СНУ СНУ СНУ ЗЕ
КЯеи ЕЕ я 1 405 11О
ЕЕ ях я
ТІВ Не ТК
Ну Ку ет СНО Усна во Уві Єми Зег му СПУ ЄМУ ВИ Маг ЄМИ
Те 135 14
Риму СТУ Мег бе АТО Сей нн був Аа від жегємМу Гук бен Вп за Кві ЗЕ «ху 145 150 155 150
Пре сму Тує Тог Ме Ази тв УЗ АТ СІВ Аа то слу у СНУ ви шм їтрУВ АН ец еле ето гуру у Магроег ТЕ Туг АВ 150 т 150 це : іа З с, Как дет ВІН ве Па Кок Кк є їх С«(хк і їн Аг
Сі ув Ка бух АВ АТ КН ТНК Не Бег ма Аяо ув г Гу АЗИ
ЗХ мух Ух 155 ОО Кк
ТРАВ УВО Ср Ме Ав Заг сво Ага АВ іш дар ги АВ МВ ху ее у сег хо 1 КО де зах Ку Кл Ку
Ме бак сМе тує Ту СПУ Аво Мет дво т Бут Не
Тує Тук Сух Ав Аг Щек СПУ Туг Туг Ну дез Заг Аво Тер
Туг Туг Суз лоз Ага хг КМУ Туг Тут СНУ АЮ Є тунак зай сут сей зай
Ки ЗО ОО ше
Же дж ; ; т Ко кі лк МЕ СУ Сх СУ ча Ту СУ Сів У ТВгі ви уві Тв Уді бег бек З У МУ В
АВ УВЕ ТТ МУ СН СМУ ТВГ ВИ Уа ЕН З с яке зкЕ є я я
Ма тв бег Заг Ага ТУугбец Ма ув г що З че Же їх х ЗІ се КН КОМУ ло не З
Су ден Ар Уа ую Ма баг оз ес нн Ага ту яку «рт
ЩО КК кої д і джури КЕ зі (уп дав Мей ор Щв СВ хек. м. пах У бен Ся х зії я З: ї ОМ м щі й ВГ МЕ ВО ів щі
ТВО МИ ув У ве Се СНИ Ку Ма СМИ А пах зак й «ЩО с
Же см У СУ і в СУ і и дев ви пе - в п Зв жк тез Сх Дух ре сію МУ іх ЕВ Се р
АВ Ме Ре Кто тує А те ЄМ АЮ то су 1 ; ї
Ху КУ Ск Тан що ше НН) фіерув ю дав Не Бо СЮ рі Й В суду КЕ: зн ва; дах фік та м шк зач Же Я акне сх з кар Не
ТугкваебБегАгт Ве Ав Ти ЄМуУ був сми Сув єму
Ух м З ХЕ пе ї і ; ; кані Ат Звра Ма «ці Це це і шк а мес А Он уві в і зе Та г в ІВ БІ
Му Гуг ег уві ет Абу Со був був Си Ага Не тугу ал ї ; се хі Жука Си ук зх й око ех їЗош дід ЕЕ аг и бег Аа Зег Погоди СО ТВ Заг Ме Туг бе Суб АВ Бех Бе сів Зег Аа бе Тогодвиа СН Тв Зеє МЕ ТУГІ :
У ах 73. г її ? ІК, З
СК ее ам юегА СТВ АБИ с ЄМуУ Аве его Туг Сум а ут пе Му Ето пу же Ки які: Кк й Ск І ня ЧИ її Щоашаиу Я їі «них Кун ю В,
ТВРАг во Тег тв син Азвіво ув Ак У ев его БО СНО аг 375 ЗО ча візу и Ка КМ КЗ Же Ка их М Не Се БА ТУ УК хе
УВА Узі на о Кто не Си АВ СМ Не бег МЧіз Те сна бух
ХЕ сечу ук З
Зв ЗО Зо щюЮ
Ав оТвгіео Уві Сув ец Ата ТСН ве Туг го Авро На В СНИ «о о 1 іецБаг іт То Аза СиУ ув Си У Н Мег сну Ма Су ТВу ях зе Ям чи 25 ЗО
Арт Сн кто и був УЮ СНИ го АВ бе Авг АВ Бег АЛЬ ГУг й за чав
Я їх за ЖК дк дз и зе й ах М бл Ж ни вм Ме Ки Живу вх рус
АвВівобегсег А іо Ат В аг ув Те енНе Грн Аве кто що 455 50 де ше Біт Зі св ок ух є Ми КЕ Тем хи іх с АН
Ага Ава Зв Бе Ага Сув Са Ма! Сл КВе Туг Сіу мен Зег о ваг
АБ СНО То Те Ой Авр Аме Ана був то Уві Тве Сів Пе Уві бах ча Зо ча5
АВ СЯ АНІ ТІВ СУ АТО Ав Аве м «2105» 45 «2115 504 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Бета-ланцюг(ра 11). «400» 45 дів пе бі Ме Твгів Заг го бен бБегієн Бог Ав ет УВГ Му і в 1 15
Ар Ага ма Те пе Тв був Ага Ав Заг ів АБО Пе Ага Ав Гуг
Гео АВ ТВ Тука Сів ув РРО СНУ ув Ав го бух ви ви Не з о 45
ТУТ Те Зег Ага Кави Си Баг ому УЗ бо Зег Ат Мне бе су ті 55 цО хзк іі ув о В ему їх ет. ак ТЕ і З ТЕ Ех фік; Как Кок І щі Ел ЕЕ
ЗВГ ОМУ БЕ му БАГАЖ ТУТ КРОК ЕН Не Ого Де ЄмА кто сви дар впе Ав ТВ Ту Туг був ЗІ СНАа СУ Авт БЄ Цен бо То що 5
Твевва и сли у Тв ув УЗ СМ Ме фу у КУ СНУ СНУ Бен за 35 о сну СНУ СПУ СТУ Бег СТУ МУ СУ Су ХНег ГУ СУ МУ Сну Бе Му п у хи Я й Жив пк З й ки Хо Ко км й іх
Су му ве цу Ма! Спа ен ві Ва бе СНУ МУ ЄНУ Се Ма В
То 135 140 т СУ Му беківи Ага жа дег Су Аа Авіа бен СМу Ту бек ра так 150 155 то
Тему Туг Тех Меса То У Ато Сп АФа то Сну Був Су сво
Са іт Уві бів б ес пе деп го тує уз Су Уві сег ТАгогуг Ав 150 т 190 хіт МУ і ух В че ве ТЕ Пе ех ві давіза Хегі че ди сп ув ре ую Ав АРІ ре Тер ет ВІ Аво бух ВК ув А т ях ж ам КЕ 155 ОО «М й КУ я 5 св Каже Ух Ме вах Ка де Труд; де
ТВгАЇВ Тут бец Зі Ме дай Заг во Ап ав СНО Аво Тег віз Уді - ху їх ту кі 15 ше
ТУ Буг САН АВ Ага Заг СНУ Тут Гуг СМуУ Ар Бех АВ То Туг Ба
ТУг Буг СУБ Ага Ага Зегоу Тут Ту СМу Аврозег Ар то Ту
В зо з35 в
М ж М Я х ; зі ТУ Се «а СУ Те іні ві Твг мВ б Мат СПО СНУ С
Ав ма Пт сну Суп Му ТІ бе Ум ТАгОУмі Кнею ау Сну СНУ ЄМу ав 5 еВ по чаїв Уві ТВ СМа За бег Ата Тут і в Ав і Ук Ага су БОГ Ар Мі ув УВІ ТМ сна бен бегемоа Гугіво Уві у АТ
ОО ОВ ей с 3. ув ік ск Ки й ВХ й шу ані бук х Ме НЕ
ТВО со був УВІ на ви Ну Су мі СА Аво бво АВ ВНІ СНО
Ап Ме ре то Туг Ав СМАа Аве то Оу Це МУ во Ап ев а ОВ Зо
Гугбве ем Ага Бе АВ Те сну Був Ми бує МУ Аво Не ТО у из си і як жи к ее За 5 че я; Ки Кей ши вих Ж ге се Кі, хи ЄЖічлх Саух х сх
СПУ Тут Заг уві бе Аг Ки був бує СНО Акта Бе Заг іні Не ви иа Ж Дів Хе Гм пак Ма ЖіРКр айш Тіни дні йо «в Си Ку
СМи ег АВ ЕН ПН Аа ЧА ТВг заг Ме Тугіен Сув віз Берг на
ЗАЧ НА се Ми Ки ук Ки Кг Кі сеї Кан Над КМ З
Кг АБО С АВ Заг СНУ АВО РгО Гбуг С а ЄМ Гук РО У То пу ск ках, хи їх в «М За
ТВА аю Тег Ям Тег сп АВТО ее У Ав Уві не еко те ЄМи жо 5 НО ; ді їі Зі ях жи аку кіс, з Бе Ж изи фік Те ЗУ с щі Аа ма па Си Ро Бек сли Аіз ПН Пе сек Бі Тг ув катїніву Уві Су бе Ав Тр ЄмлУ бна Туга Або ів УВЕСТИ і хума Можу Буу Же хі АУБ хе М км Бі чу КК У вх Ж це Енн То То У Аби су ух СН М МБ Бегіну У су ак 5 ЗО дев ій Кто ве був СНИ СІЙ Ето АВ і ви Ав дер се АТО ТУГ
Ав'ішвн ек АТ Бен Аг У ЕНН Аа Гог бе ТТ З АВр ето
Ага АБИ Мів Ве Ага Су С У СМ пе Ту іх Сем Бе СО Ап
Я 470 Я в дер'єми їто ТВ СИН дер Ага Ав ув Бо Маг тв сна Пе уві ет
Ав 'ЄНи АБ ТТ Сну Аг Аа Ар «210» 46 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (аЗб) «400» 46
Ав Авпоз У січ Суп оег его са Зегіви Не Пе ви СМи Є і ув Ав ма! Тв гбею сі ув Ави Гук ТВ Уві ще Ето Не сег Ява ви Ата то Гуг був СНИ Аве ТВг НУ Ага Се Кто Уві бегіви Тр
З Ба 5
Пе Ме ТВг Не же СНИ АВАа ТВгГ ув Баг АБА СНУ АГО Тук ТВ діа
Тнгуви йвр Ав Аве ТВРгув Сп бек Зег ен Ні по Тк Ав Бог сій б ец сег Аво бек Аа бе Буг Не уз мага Ав Баг АВВ що ща що
Му бе Гук Не то Ту бе СПУ АгО СНУ ТВ За? зи Нео уВЕвНе кю не т го «2105» 47 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (аЗ37) «400» 47
АВ АВИ ЦИ УСНО СМ СН то СНИ ет Се Ве Пе ен СПИ Му 1 5 15 та
Му Авп уві Тнгіево ма уз Ав Туг Те Уві Зеє БТ Бе Заг лав 2 я За
Се Ав тро бут був Си Аарон СНУ Ав СНУ Кто Мі сне бе ТА
Ме ец т Тут сег со Авл ГГ Бу Бег АМСУ Ага Туг ТВ Дів
Те Кез Ар АВ Ааю Туз сно себе ме Б Пе Тв АВ саг сіє его сег лів Бет Гук Не Су УВІ Уві Аа Бег Дід с си ен туге его ТВЕР сну Ат СНУ Те Бер ео в Уві МНів зда НК о
Ета «2105» 48 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (аЗ8)
«400» 48
Ав Ава ів УВІ Сни сна Зег та ми Бегіви Пе Не бе Сни СПУ ї 5 о 15
Му аАат Уві ГГ ув Аза ТуК ТК Уві зе кто ве сн дан т я За ів ме то Тугбув БВ АБО ТТ СНУ Аг ЧУ Ро ма! Бе Ге Ту вени г па ває сно Ака Тегі Бег Ав СМУ Аа убачав 5 55 що
Тогівц Аво Аз Аво Т Бук Сни бе Баг ія Ні бе ТВе Ага ку сна еец ее АВОо на Ав ет Гук Не бух Уві ді Ав ра АВ С
СУ ао Туг Пе то Те пе Сму Деу СНУ Те бен Ге Пе Уві вів 120 Та5 о
Кто «210» 49 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220»
«223» Мутантний альфа-ланцюг (а39) «400» 49
Ав Ав Сп Маг ЄМО сна Зег то Б кн Бео Не Не бе сни Сну мув Ав ма! Пе бе си уз Ав Туг Трг Уві бег Єго Бра бен Ап
Кеи му ттрбуг же бів Аво ТВгСНУ Ага СНу то Уді Зегівцу ТАг
З я ах пе бер Пе ба бег сло Аби Твг бух г Ап СНУ Аг Бук ГВеАТя
Тегі Авр Аа Аве ТВе ух сі ет ЕНН ні Ні Пе Ті АВ бе сна цен ек Аао кеє Аа дек Буг Пе ух У Уві Ам его ЄМ
Слу сви Туг Пе бо ТВ не му Ага СНУ ТВГ жен ви Не Ма ВН 1095 105 119 го «2105 50 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність
«223» Мутантний альфа-ланцюг (а40) «4005» 50
Ав дат оо Маг СНО сн зе Ето СНИ Мет бе Пе Не ем ми ЄМУу ї й о ї5 зуб АБИ Уа т бе іп бу Аха ТУуг Пе Уві его Ве о А
Мен Аг тро буг був ій Авю Те Мчу ато СНУ то УВЕ бег бе ТВг 35 48 45
Не бео Тева сег Спо ел ГЕ ук Зег вал СНУ Ага Туг Тег Ав щі Зо що
Тег іво Авор АВ Аве тн ух СМ Се ек і ец Між Це ТВ АВ Баг сп еи Заг Абр ег Ас Туб Пе був Уві ві А Заг АВ СНУ о що За
СУ ец Туг пе бо Те ре Сну днз СНУ Пе бе бе На Уві ів га «2105 51 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність
«223» Мутантний альфа-ланцюг (а41) «4005 51 хадаей в УСНО в зе та п же б ец Не Пе ец ЄМ Му
Був АБ Уві Те Се Св Сув Ан Тує Тег У бат бро не Бег Ав ви АНУ ПО тугу СП АХО ТА Оу Ага СПУ бро Уві Баг ви Те 35 0 БЕ пе бео тт бна бе бо Аби Тег ух Зег Аж СПУ Аго тує Те дів ви 5 БО
Тегіво Авр АВ АВО ТА ук ма Мега ее ів Не Тв АВ ще
Спец Зег Аз Зег Аа ет Ту Ме Сув УВІ Ма ал лег АВ СНА сму жег туге Бгто Ту па Сну Аг му Тк Бебі Не мае 100 105 о ро «2105 52 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність
«223» Мутантний альфа-ланцюг (аЗО) «4005 52
Ав Авт СНИ Уві СМи із Заг бо СНУ Баг Кеш в Пе бец ємо єму
Кув Ава и Твг ви сна був АБИ Гу ВЕ Уа Бер бто Бе бек дл іо Аг Тер Гук ув СВ АВо Те ОМУ Ат МУ бо Ма! Мегіяи Ту в о 48
Не мен Аза Тут дів Пе Ави ТР фу Зег АВ СПУ Ага тує Тв АВ
ОО 5 БО
ТВеуец Авр А Аво Пух Са бе ек бе вне Не ТР А Бе
С ме бегоае оег лів аг тує Пе був УВІ УЗ Азт Аг АВ АБО с еи туге го ТВ Кве Сту Аву ЗУ Тег беи Не Уві Ні
Его «2105 53 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220»
«223» Мутантний альфа-ланцюг (а42) «4005» 53
Аів Авп Сп Ма і СЯй бег те Суп сег бе Не Ме бео СИ СНУ
З В 10 5 іч Ави Уві ТНгівм сна уз Аа Туг Тіт дм Бек бто Не Ку АВ 2 В Б
Кец Аг то губу іп АВО Таб ЄМУу Ате СЛУ го Уві Заг ец Тиг
Не бец Тв Ту Лів їв Ада ТВг ух Баг Аяа СНУ Ага тує Ти Аа 5 кВ що 5
Тигіви Ар Ав Аве тт і ув СН Зег бег ви Мів йе ТАЛА щег
Сп бе цег Азо сег А бег Буг в був Уві УЗ Аяй Кто АВ АВ су еи Ту Пе бт Тег бве єму Ато у Тег хнаг цем Неоуді КН ух ЗЕ 45 щюЮ 305 То
Ма «2105» 54
«212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (аЗ1) «400» 54
АВ АВ Сни Уві а сни Бегеесмна бегівиу Не Не бец си СНУ
З «її Ук к о й 5 «а Ні меш Ала то ТуУгб ув Сп АВ ТВ МУ Агу СУ Рі уві баггі ТТГ
Зо 4 Я
Ме їву Азо не Лів Це АБИ ТВ ув Заг Аал СУ Аг Тут Ту АВ
Тра) Авр Аа Авчо ТР і ую сі ог Вега Ні Пе СТЕ АК Бе ще то ТВ ВО си Сец Бек Авр омега его бук а бук УВІ Ма Авт Ага АВ АВО су ен ТУ бе бу ТВ Внеону Агу СУ Єв бе і во Пе Уді На о не то
«2105 55 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (а43) «4005 55
Ав лав сома Уві СНО сим се то сп чер ім Не Не ву Су Су 1 5 1 15
Суб Ап УВІ ТР бер СН Сув ав Ту ТВ Ма) хг Бгто МБе Бег Ади
Кеш Аг тв Тут був суп АВ ТІ СУ Ага Му Кто Ума мет Се нг
Нв зе Ахо Ту Заг Пе Ал Тв ух Зв Аж СНУ АгЯ Тук Те дів
ТврЕви Авр АВ Авр Па Гув сни хна ек бе ів Не тег АВ ех с ем Заг оАче Бе? Аа Бак Тег Пе був УВІ Уві дам Аг АВ АБО сму Меу Тук Нв обто Твебле СНУ Ага ІМ Те емо бе Уві Ні чо 105 о ге «2105» 56
«212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (аЗ2) «4005» 56
Ав аа Зі Уві Счи Бег бе Сни бен бе Пе Ме бе сни Се
З 5 їй 15 ув Ава ма гг ем суп ув Аа Ту г Уві Чех Кто РНа ег Ав іец Ай то Тук ув Зіз АБО ТВ У Ак СУ Ре уві егіви ТВ;
З5 Б 45
Пе бен Азов тує дів С Ази ТВгі у Баг ва НУ Аа Буг ГГ Аа
Тег увь Аве АВ Ар Гері ух от Бегег ви КН Не тм від г ій бе ег Або Бек діа Заг ТУ Пе бук уві Уві Ав Ана АВ А
Сну баец губ Не кто ТР Кле сМУ Ав ту Тр Зегбеви Не ж Мі 186 105 10
КО
«2105» 57 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (а44) «4005» 57
Ав АВА СМа Уві ів Ємп ж Кто Сл хе Бе Пе Пе бево СН у
А Б то 15
Бук Ав У Тег іен осв Суб кий Губ Те Уві ет Ро ме бег АвА та Ма БІВ
Мей Аг ТО тугі уз Суп дво Тв омуУ Аг СУ то У бет бе ГА
Зо 40 4
Пе їец Аве Туг Аа Не АБИ Тегі ув Зег АВ СУ Атло Туг Те Аа во З що
Теагіви Авр Аів АН ГВт ув сій Зег ег іані Мі5 Пе Тл АВ ат ме рег АВ Баг АВ Баг тує Не ув у У Ав мів Ав Аве
СМУ Кеш ТУ Не бо Тв бе СУ Ат м Те хчак ви Пе ма нів 10о че Зо
Ето
2105» 58 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (аЗ33) «4005» 58 дів Ава ій я СИМ ма жна Вт Сип его Пе не бе СНИ у ів Ави Ма ТвРіви сп Су Ах Туг ТпгоудЕ щен то ре сен АВ
Меи Ато Тто Тут бух бів Азот МУ Аг СНУ то Уві Баг ієц ТНг
Пе ем Авр Гук АіЗ Пе два Тег осує Бег Ав СЛУ А гу ГАГА
Тези Азо Ав АВ Тр уз СМа бен Заг во Ні Не Тег АВ Бег сип ау ет Авр сег АВ бег Буб Не був УВУ АЗИ АТ ЗегАВо
ЩО ЗО Че яму ео Тук Не Бо СВК бра му апа у Тв Заг бе Це мае то 05 то
Кто «2105» 59 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (а45) «4005» 59 дів Ав Ов Уві ЄМО Си Зебра Є ее Бе Пе Це бер Ну
Я В за 15 був дяа жа ТР бе Сип був АВиа Гук Тк Уві сег Бгто Ба ог вхо
Сео Ага те Руб уз іт Ар ТВиСНУ Ауд єму Бто Уді бек іец ТА 5 4 5
Пе ес дер ТУ Ав Не доп п бу шаг АВ СНУ АгО Туг Ту Айва
Тео Авр Ав Ахо Твгбув Сім Бек бегіео Мі Пе Те? Ав Зак сіпівн баг Аве Зег дів ян Туг Пе Суб УВІ Уа АВА Аг Ма СНУ
СНУ ви Тугб Не бо Те Ве сму Ага Су Тег Зег ву Пе ма! нів та ТОБ на те «2105» 60 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (аЗ4) «400» 60
Аз Депо Ман Св Спи без Кто См бебі Не Це бе СМ СНУ іУв Ав УВІ Тег бе в Суб Ав Ту Твг Уві Бег то не баг АБИ -О а КН
Бе ме їв ТУ був Сип АвОо Тему АГО СМУ Ре уві Бег бею ТНу 35 З а ів Ар Гук Аа Не Ави те був ет Авп СНУ АМо Буг Твг Ана
Тег іеу Аво АВ Або Тс ух СНп хног бе еш Не Пе ТРАВ ЗВГ
Піпіво Заг Аво Зег ів Зег Тук Пе Су У Уа АКА АВ АК
Су Заг Буг Не бо Пе Ре Су Ате СНУ Тргозеє бе ПесувЕ нів 1 105 ВШ
Рг «2105 61 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (ам/ТКа)
«4005» 61 аа Аа см мВ СН сна Бер то Сни бен ге Пе Пе бе Сню Су іув А Уві Прі сув Ав Ту Те У бен го Рв цег Ази ке Зо іез а то Тук бу Св Авю ТЕ СНУ Ага Су Кто Узі бен сво ТВ
Не Ме тек те яна СПО А ТР ув Бе АБО СУ А тує Аг АВ
Тигіац Аво ДІВ АВО Те був СА ЗЕ Заг Се БЕ Пе ТР А ЗЕ щі фен нм Аар Зег Аа баг Гуг Пе був Уві Ум Авт Нів бог Су
Сну Заг туге го Пе не СПУ АгО СНУ ТИ бек бе Нема ВН
М
«2105 62 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний альфа-ланцюг (ам501)
«400» 62
Ав Авт с Маг см сп ет бто сни Бег ви Ме пе бе Сни СНУ зу АБ Ма ТЕ бе суп Су Ав Туг Твг У бер Ето Ва Зег Ап
Ме ме їто Ту ув Са Аа ТЕМУ Ага СМу то уд Зег і ви ТВ «а 45 пе ер Тебе бе Сун Аа ТР ув бег Ака СУ Аг тує ТВГ АТ з ще що
Таки Аве Ав дар ТвеБув Ст Бегбегіеви Мів Не ТВгГ АТ бек
Мп ву Зег Ав Баг Аа Ж ТУ Не Сув Узі Уві Ав Мів хм МУ яБ ЗО За «Му ет Ту Пе Бгто Тег бе су Аг іх Тк беєбен Не ма! нів о 15 В
Кто 5 «2105» 63 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220»
«223» Мутантний альфа-ланцюг (а595А) «400» 63
Дів апа масони 3 бег бло СМеа Зак ву Пе пе ем ЄПЬ СУ іув Ап Уві б нів ЗІ Су Ав Тут ТВ Уві Заг обто Бе ет Аяв іец АТ ТО бук бук сна Ах Те МУ Аа Му та Ма бек іву Тв
ЗВ о 45
Ме Мей Те Бе бЗег Со Авг ТР був Заг Авл СУ Ага Туг ТВ АВ
ТТН Гец Ахо Ав Або Тег був Є хна бег бец нів Ме Тк Ав сег біпівц Бег Аве Зег дід Бе Ту Пе був У Уві Ав Мі А СНУ
Сх Бег Гу Пе то Тег еНа СПУ Ага сну Твгозег бе пе уві БВ
Ту
ТО
«210» 64 «2115113 «212» Білок «213» Штучна послідовність
«223» Мутантний альфа-ланцюг (а5981) «400» 64
Ар Авп із Уві Спо Сни Зак го В Бег ви Не Пе ба о СНУ ув Авт Ма Те сп сСув Ав Гу Тег ма бек бо Ре бек Ав
Сер АТ ТО Тугіув з Аве ВР Му Аа Су КО У се ке ТАг
Пе Ме: Те бе Зег см ям Ту на дал сну Алі Тут Тв Ав
Тек Ар яма Авр ТВ був Сип ег Бет Беца Пе ТВ Лів Баг співи бе Ар бег ав Заг тубі був Уві Уві Ав Мі Зег сну
Сну а У Не го їв ве су Ара Му ТАК зе Се Не мі Чіа
Кто «2105» 65 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність
«223» Мутантний бета-ланцюг (641) «400» 65
Авр уві г уз мате Сни Звг бегмо тугі ви Ма був Аг Тв Сну
З 5 ЕВ 15
Сни дя май Ве бе мо Сук УВЕ СНИ Авр Меє Азов СПИ АБ Ме вве лто Туг Ат ій АВ то У ему еп АГ Гео Не Ту Ре кнаг Ага Ме Аа Те СМУ ув СНИ ув МУ Ав Не Бе Сну Тут ще УВІ ЕХ Ага СНО Сув був і Аа пе Бе ео Не сец Со ет
АоБег Те АВ СВ Тр Берг МеєТугі ви Су Аів Заг ЕН бек А іо Ава кн у Ав Бгто Буг Си Ми Тут Ве Сну Бго Сх ТАг Ага що 105 110
Кеш Тв? ма тн «210» 66
«212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (642) «400» 66
Авр'УВЕ ув Маєте сне шег бег Аг Ту Сен У Бук АТО ГВт СНУ 1 їх а 15 іч ув Ум ее ам СМи сузв уві СНИ АВ во Авро ів о лап Ме реа те; Туг Ам іп Аво Без У ба чу ев Ао Сеціе Тук на
В 40 за
За Тує не Ав тв єму був СНІ Ку СТУ Авц Не ето ЄМО СНУ ГУг дег Уві Баг Аг СН Був ув СНИ Ач еле Бег беи пе бе спи Бе дів Баг Тпг Ав і г бе Ме Тут ів Су Аз ет Заг Заг Ар
Ще дал бе Сну Азов Бгто Ту СНО ЗМ Туг Не су Рг ЄМуУ ТВЕ АгУ о 185 110
Сац о твг уві Твг «2105» 67 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (643) «400» 67
Авр Уві ух МВ Те ів Заг ег Аг Туг ів У уз Аг ТВг Му сш ук мі ле бе о Сув УВО АТО ву Ар НЕ СНО АвИ МЕН на Тр туга Єна Аво то єму Гео су во Ат ем Пе Буг ЕНа
За Зо 45 рег АЗОТ СНУ Сув СН був му Авр бе Ето Спи СНУ Тут
Ще УЗН Ага сни Кук кує СНИ Ага Ре бек ви Пе Сеу Зо бат
Ав ет ТВгАял ми ТВг ою Мей Тур ви був Ага мех Бег еч дар
Я Аз бег СЛУ АВ ТО Гуго Сни би бе сну бто СНУ ТР Ак
Тов 05 о ви Те УВІ Тв 115 2105» 68 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (644) «4005» 68
Ах уві і ув Уа ТР Мп оз Зеб А Ту уецу ув був Аго Те Сну
Си був Ма КВе бей юр Су УЗ Сп АВ ев АБО МІВ СПО АБИ МЕ в 5 ЗО
Бее Ттр Тука і Аво то ЄМу сви СНУ ео Ат ви Це Туг ве а що ав щегача не у Тваеєту ув Су Гу сну йо Пе то са МУ Гук
Заг уві бер Ап був ув СИ Ага Не бе ів пе се СНО сн
Ав дет Ті Авл іо Ту зе Ме Тугіву був Аа Заг Бе Бег Або ща ОБ
Сів Ази СНУ АВ го Туг ОВ СНИ Ту Бе сну те СНУ ТВг Ача щю 5 о
Гез тб УВЕ Та 115 5 «2105» 69 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (645) «400» 69
Ав ув Уві Тема Бегбег АЛІ ТУ во Уві уз Ато ТВг Сну і був У Бе вець ув УВО Авоев Азв НІВ ЗІ АВи МЕ 2 ка ЗО
Бне тв Ус Ав ій дво тео му ец СПУ Бе Аго Кава пе бух Не
Бек Аг Бе Аз ув Му ув мн ув СПУ АЮ Пе бе Сну СНУ Тут бег Уві Бег Апу СЮ ув ув іо Ага Бе сет Бен Пе бе ід бен 55 7О т ВО
Аа ще т АБО Те Ме тугі ву Суз Аа г баг БОГ Аве
Сп АВ Бег іУ Аж Кто Буг си Ма Ту ЄБе СНУ Кто СМНу ТОР Ача 10о 105 чо цей твер у Тв «2105 70 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (646)
«400» 70 дво ві ув Уві Те СНИ бег Бег Ага Пи беи уві був Аг ВЕ СНУ 1 У 10 13
Си був УВІ КНе ен СНО був Уві СИ Аво ву Аво Ні Со Ав Ме! ка Ка ЗО не тт Буг А то із Ав ето Сну Се Сну (ані Ага бе пе Туб КНа ет А Ве АВ ТВ Ме СУ сю був МУ Авр Не го см Ну Гуг
Зег Ущі фен АТО СМ ух ух СЗе АТУ Ре бегіви Пе бе СНО Бе с і ж п
Ка т о ВО
Ав оЗег Тв Ав сла Тебе Ме; Ту зи ув Аа Зег ен Берг Аа
Смиа Авлозає му АБО то Тук СНО ЗІ Тут Кле сну Ето Сну Тит Ата то ча не
Кац Тв УТ 115 «2105 71 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність
«223» Мутантний бета-ланцюг (632) «4005 71
Аве Уві ув Уа ВР СНИ сег ет АРО Ту во Мен ух Ага Ве СНУ
Січ ув ЯН пе ме НИ Суб У ОЗ Аво Ме бто бе Че ув Ме
Бнелїтв Тур ато Сни Авр бто пу бе СНУ ви гу сви Ме Туб бе
З чо й
Зег Туг Авр уві був Ме ув З ув МУ Ако Не Его СНО СНУ Тут кн Ма БагА НОМ У ку СНИ Ат ре Зег ем Це бе СО бег ка ще Те АвБа сно Тезе? Ме Тугі в ув Афв ме Баг бег Ав 55 ща З
МИ Авп Бе СПУ ле р бо Буг ма б вне Сну го ЗУ Аг АТ чю Не 118 іви Те Ууві тн 15 «2105 72 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність
«223» Мутантний бета-ланцюг (533) «4005 72 що ма був У ТвР СН сг егАМО Туг Цей ен був Ага ТЕ ому і 5 ве 15
Со був УВІ ре бен в Сув УВО Ав АВ Арі со Бегіф ув Мей вето руб еча ів АЗОВ ЕТО МУ Бе СТУ Се бе бец Не туг ее ке Тут дво УВІ ув Мечі ув НН уз СУ Ав Не то СНИ СМУ Тут 5 5 ВО сег Уві Баг Ат Спо ув ув СПИ Аг ве бе Гео пе без Кег
Во то 75 о
Ав бек Тв Ава ів Тег Беб Ме Тугі ви Су А бе шег а Ар (Ме Авп бе СНУ Аар бто ТУ СНО із ТУ Рве СПУ Рг іх Те Аг що 05 110 іао Тег УМ Тв 15 «2105 73 «2115116 «212» Білок
«213» Штучна послідовність «223» Мутантний бета-ланцюг (634) «4005 73
Аво УщГ ух Уві ТВЕН Зег ЗегАГО Ту се У Був Ага Ге СНУ
СНИ ув уд не во чо сук УВІ СИ вера го Бу Зегі ув Мем нетто Гуг Ага сна Аво Кто сну Гео НУ Се яма ем Пе буббпв 5 Зо 45
Баг би Аер Уві був Мек уз СО у СПУ Азов Пе те СНИ СНУ Тут жн мЩі Бег АТЗ ЗМ ув бух СИ В Ме Зег ей Не бе сна баг
Ав Зак Те Авт ій ТЕ бе Мей Гріє су Аж бе Бегег Яве «М Ал ов му Аве вто Гук сМмо МА Ту ве СНУ Рсесму ТАг Аг
МО 105 1 їж Те уУВЕ ЕВЕ 4 Б 1 0 хо
«2105» 74 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (635) «400» 74 дерУШ і ув у ТИгОю Зег се Аг ТУ Кец М ув АТО ТТ ЄМу сш бфув узі Ве б ем сни бух Уві Єна Азов Ав БО Са СІ був Ме йо м Зо не їто Тут Аг) ІВ Авро то СТУ во му бе АГО Се Не Туг Не 5 Бе 45 пег бут Аво Уві був ВН ух СН бує СНУ Ар Це Без іо СУ уг ща 5
Бегуві Мег Агу ОЗ бух був Со Ач Бе Зег ем пе ви со ще
Авв'каг ТРАВА СВ ПП ет Ме Тугіво був Аа бегег сег Ар
Сип Ав его сму ар ото Туб СЯ Єна ТУ Бе СУ Бо СМу ТР Аг
ТО 105 о ів вро у тв «2105 75 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (636) «4005 75
Дар уві був мВ Те іп бег бн Агу Ту геи Уві ух Аго тн Сну
З В за 15
Сів ув Ома Бец Сни був УВС Авр дів го бео бег Авп Ме
Ві тв Туг Аго із Авробто Су ви МУ ви Ага Се Ле бут ЄВ
Баг Туг Аа Уві ув Ме ув Со ув У Аво Пе то Со СНУ Тут
Маг мі Ще Ага Сми уз ув СНИ Ага Ве Зебіжні Пе зи СО ет
Аіз бек ТВ Ава ів ТВО Ме тугі сСув Аа бег жнаг Се Ав що 5 сів Ав Маг СЛУ ав то Туг СНО СЯ Туг РНе СН то СНУ Тг Ат
Бен Те ув ТВ 1415 «2105 76 «2115116 5 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (637) «400» 76
Азроивії ув Уві Те ія бег Бек Аг ТУкіец Уа ув Ага ТП ЄНУ спо іу УВС йвВ Се спи бух Уві СНИ Ав АВ РО бе маг був ММ
Мпа тт Гу АТ СНАа Аво бго Сну во су Бей Ат бе Це Туг Не
Я А 5
Бег Ту Аво Уві ув Мебі ув Со ув СНУ дер Не Кто СН СТУ БУГ ще мувВі бег Аа Он ув був СИЧ АТО Не Бег ів Пе ву СНО Баг по то ТВ Во
Аів Зег тн АВ НИ ТВЕР Ме ТУ ен Су Аів Бергсона ве лер
Сип Ав аг СПУ Ар КО Тут СН МЕ Ту ВН СНУ Ето Сну ТТГ Ага
Се Те ма гу їв -2105 77 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (638) «4005» 77 дав Уві бу МВТ СИ бе чн Ага Тугі во УВІ був Аго ТВгСМу ! 5 10 15
СНИ бух мВ Бе ісец у уз Уві С) АВОо АТ Ре о сет | ув Мей жо 25 В
Бе тв Туг АТ ЄВ Азот МУ Мви СЯуУ Кец АТ ец Не Туг пв це ТугАво Уа ув Меаї Бук сни ув СБ Аве в Бгто СНИ СМу Тут
БО На ЩО ог У Зег Ап СЮ уз ув СО Аг іа щнег бе Пе Бе Су аг
ОО ТО В о
А бег Те Аа іа ТВ баг Ме Буг бен ув Аа Бе жег Бен ви
Сип Ави Зег сму дер то Туг СИН СН тує Єбе СМУ Бо Сну ТА Аго цю не 113
Сецтвгуді Ти 5 -2105» 78 «2115116 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220»
«223» Мутантний бета-ланцюг (639) «400» 78
Ав Уа ув Уві Твг ма бен Заг Ат би гео Уа ув Ато Тег Счу си бує УЩ пе мар см су У СІЙ Або Ав Кто во аг уз Мем
Ка Те гуг АТОМА АВОо тему Ге СНУ Се АГО Гена Ме Гук На
Беб ГУ Азов У ув Ме гук спи ув СПУ Ар Пе Ба СНО СНУ БУ 5 5 що щег Уві Бек Ага ни ув був Ми Ач Ме сег ви Не ео у З
Абе Тр Ави сі ТЕО Ме тугу був Ага Бет Заг баг Аво
МегАва Бег СНУ Ав пз В ів и Туга су Мо 5 ТАТО 100 15 о івціпеузЗі ТВ тв «210» 79 «2115116 «212» Білок
«213» Штучна послідовність «223» Мутантний бета-ланцюг (540) «400» 79 дво а Уа ма Те сів Чех баг Ага ТуУугі ви Уві ув Ага ТРУ ме Оу Су щі БТ зн ог о ЧО ушу Кум АЧС БЕНОКУ 1 5 то 15
Со був Уді Бе зи ін Су УВО Аво Ав Бо б ецу бе ую Ме
Єме їтв Туг Ага СН Аво то НУ Ме СУ ев Аг ви Не Туг ипе щег ТУГА Ві ув Ме фу СЯ був Му бар Пе те СН Му Рут
НН За що мог уві Бек Ат СН Був ув СИ Ам не Бог ец Пе бе СНО ще
В. ТО їв що
Ав бе ТВ Ав СІВ Тк Баг Ме ТуУг ів Сув дів ще Бе Ен Аве я Зо БО
Сма Те заг сну Або бто Туг См ЗО Туб ле сну ВТО Му ТВГ АК ню 105 о
Кей Тв У п 1 0 х і Би
2105» 80 «212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (БІ 960) «4005» 80
ДВО УВГ у ма т св см жен Ага Буг іви Маі був Ага Те СМу сш ув за ее би о Су УВС Ащо Ме АБО НІВ СНИ Ав Ме
Бра їте губ АтТО ій ав чо У ец су без Ар ем пе Ту КЕ 35 40 Я в Кум шу їй хх сук З зх З око ни Ах а ЗА Кі ІВ ну щег ТУ Аве Уві ув Ме фу СПО тв сну АЗО Пе ВТО СНУ ГУ га бі Мо ям зх см КМ Дйонеж раху пе ко 2 Ті, Ка бег уві Заг Аго Сни був ув СНО Аг бе сне бі Пе ен сем
Аа ет ТРАВА СПА Твг же Мебтує бен Сує Ав оба кг на Аво
Мета сту ер те Туга ЄВ Гук КНе у РУ ЄМУ ГНЕ Ат 180 105 118
Сеат ВЕ ТВ: 115 «210» 81
«212» Білок «213» Штучна послідовність «220» «223» Мутантний бета-ланцюг (БМ97О) «400» 81 дар Уві був Ма ТЕ Ой бебЗег Ага Гук фени Уа ув Ага ТК Оу
Сів був Уві Бов бво Зі був УВІ СН Або Мег Ар Мі ЄНу Ави Мей
ОЇ В КІ
Ве То Туг Ач Св Аве Рг Му сво СНУ сво Ага вена Пе Буг ЕНе
ЗБ 48 45
Бег Ту Ав Уві ув Ме фу СО у Му яр Пе Бгто СБ СНУ Тут аг УВІ Бег Ап СЯ уз Був СНИ АмО Ве Зег бу вів Сів Зег
Її ТО ТВ Й
Аа беє ТЯ Авп сій ТР Бе Мету ец сбуз Або бег С Не Це са те Зег ому во та Ту СМ ОЙ Тут Ва ому Бгто СПУ Ті Ага
Ева Те У ВЕ
Те

Claims (33)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Т-клітинний рецептор (ТОК), який характеризується властивістю зв'язування з комплексом а,ммравЕНТМ (5ЕО ІО МО: 1)-НІ А-А"02 і містить варіабельний домен альфа-ланцюга ТСЕ та варіабельний домен бета-ланцюга ТСК, де (а) варабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:17; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 28; (Б) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 25; (с) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «БО ІЮ МО: 28; (4) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 20; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 28; (є) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 26; (Її варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 27; (9) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 24; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 239; (п) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 23; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 239; () варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 46; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 239; () варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 47; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 239; (Кк) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 48; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: (29; () варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 49; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 239; (т) варіабельний домен альфа-ланцюга ТСЕК містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 50; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 239; (п) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 51; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 239;
(о) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 20; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 65; (р) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 24; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 66; (д) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 24; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 67; (у) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ МО: 24; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 68; (5) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 24; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 69; () варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 24; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮО МО: 70; (и) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 52; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26; (м) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 53; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26; (м) варіабельний домен альфа-ланцюга ТС містить амінокислотну послідовність 5Е0О ІЮ МО: 54; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26; (х) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 55; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26; (у) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 56; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26; (27) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО: 57; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26; (ага) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 58; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ МО: 26; (65) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 59; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26; (сс) варіабельний домен альфа-ланцюга ТСК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 60; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 26; (да) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 71; (єє) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 72; (Ї) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮО МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 73; (99) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 74; (пі) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 60 75;
(ї) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 76; (ї) варіабельний домен альфа-ланцюга ТСЕ містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 7; (КК) варіабельний домен альфа-ланцюга ТСК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 78; або (І) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО:
79.
2. ТОК за п. 1, де варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 24; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 29.
3. ТОК за п. 1, де варіабельний домен альфа-ланцюга ТСК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 26.
4. ТОК, що зв'язується з комплексом СМУОСКЕНТМ (5ЕБЕО ІЮ МО: 1)-НІ А-А"02 з афінністю більше ніж 200 ММ, де у варіабельному домені альфа-ланцюга послідовність амінокислотних залишків 27-32, 50-56 і 91-103 вибрана з наступних: і де у варіабельному домені бета-ланцюга послідовність амінокислотних залишків 27-31, 49-54 і 92-107 вибрана з наступних:
5. ТОВ за п. 4, де послідовність амінокислотних залишків 27-32, 50-56 і 91-103 варіабельного домену альфа-ланцюга та послідовність амінокислотних залишків 27-31, 49-54 і 92-107 варіабельного домену бета-ланцюга вибрані з наступних:
6. ТОК за будь-яким із попередніх пунктів, який являє собою альфа-бета-гетеродимер з послідовністю константного домену альфа-ланцюга ТКАС та послідовністю константного домену бета-ланцюга ТКВСІ1 або ТКВС2.
7. ТОК за п. 6, де послідовності константних доменів альфа- і бета-ланцюгів модифіковані шляхом усічення або заміни з видаленням нативного дисульфідного зв'язку між Суз4 екзона 2 в ТКАС та Суз2 екзона 2 в ТЕВСІ1 або ТЕВС2.
8. ТОК за п. 6 або п. 7, де послідовність (послідовності) константного домену альфа- та/або бета-ланцюга модифікована шляхом заміни на цистеїнові залишки Тпг48 з ТКАС та 5ег57 з ТЕКВС1 або ТКВС2, при цьому вказані цистеїни утворюють ненативний дисульфідний зв'язок між константними доменами альфа- та бета-ланцюгів ТОК.
9. ТОК за будь-яким із попередніх пунктів, який має одноланцюговий формат з типом М Ма-І -МД, МВ-І-Ма, Ма-Са-І-М8В, Ма-І-М8В-СВ, де Ма та МВ являють собою варіабельні ділянки а- та |Д- ланцюгів ТОК, відповідно, Са та СВД являють собою константні ділянки с- та В-ланцюгів ТСЕ, відповідно, а Ї являє собою лінкерну послідовність.
10. ТОК за будь-яким із попередніх пунктів, асоційований з детектовною міткою, терапевтичним засобом або фрагментом, що модифікує РК.
11. ТОК за п. 10, де антитіло до СЮОЗ є ковалентно з'єднаним з С- або М-кінцем альфа- або бета-ланцюга ТОК.
12. ТОК за п. 11, де антитіло до СОЮЗ є ковалентно з'єднаним з С- або М-кінцем бета-ланцюга ТСК за допомогою лінкерної послідовності.
13. ТОВ за п. 12, де лінкерна послідовність вибрана з групи, що складається з СООО5 (5ЕО ІЮ МО: 30), аасава (5ЕО І МО: 31), ас51з:0 (5ЕО Ір МО: 32), ОБОСІ (5ЕО Ір МО: 33), ОБО СОР (ЗЕО ІЮ МО: 34), ОСЕРЗ (ЗЕО ІО МО: 35), ССЕСССР (5ЕО ІО МО: 36) та ОСЕОСО5ЕСОоО5 (ЗЕО ІО МО: 37).
14. Злита молекула ТСК-антитіло до СОЗ, де (а) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 17; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 28; (Б) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 25; (с) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 28; (4) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 20; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЗЕО ІЮ МО: 28; (є) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 26; (Її варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 2; (9) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 24; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮО МО: 29; (п) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 23; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 29; () варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 46; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 29; () варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 47; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 29; (Кк) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 48; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 29; () варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 49; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 29; (т) варіабельний домен альфа-ланцюга ТСЕК містить амінокислотну послідовність зхЕО ІЮ МО: 50; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 29; (п) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 51; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ МО: 29; (о) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 20; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: бо 65;
(р) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 24; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 66; (д) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 24; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 67; (у) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ МО: 24; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 68; (5) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 24; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 69; () варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 24; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 70; (и) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 52; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ МО: 26; (м) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 53; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26; (м) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5Е0О ІЮ МО: 54; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26; (х) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 55; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26; (у) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 56; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26; (7) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 57; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26; (ага) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 58; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 26; (65) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 59; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5Е0О ІЮ МО: 26; (сс) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 60; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 26; (да) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 71; (єє) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 72; (Ї) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮО МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 73; (да) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 74; (пі) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО І МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 75; (ї) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: бо 76;
(ї) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 7; (КК) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 78; або (І) варіабельний домен альфа-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 22; і варіабельний домен бета-ланцюга ТОК містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 79, та де антитіло до СОЗ ковалентно з'єднане з М-кінцем або С-кінцем бета-ланцюга ТСК за допомогою лінкерної послідовності, вибраної з послідовностей під 5ЕО ІЮ МО: 30-37.
15. Злита молекула ТСК-антитіло до СОЗ за п. 14, що містить: (а) амінокислотну послідовність альфа-ланцюга, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 38, та амінокислотну послідовність бета-ланцюга, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 42; (р) амінокислотну послідовність альфа-ланцюга, що відповідає 5ЕО ІЮО МО: 38, та амінокислотну послідовність бета-ланцюга, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 43; (с) амінокислотну послідовність альфа-ланцюга, що відповідає 5ЕО ІЮО МО: 39, та амінокислотну послідовність бета-ланцюга, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 44; (4) амінокислотну послідовність альфа-ланцюга, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 40, та амінокислотну послідовність бета-ланцюга, що відповідає 5ЕО ІЮО МО: 45; або (е) амінокислотну послідовність альфа-ланцюга, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 41, та амінокислотну послідовність бета-ланцюга, що відповідає 5ХЕО ІЮ МО: 45.
16. Злита молекула ТСОК-антитіло до СОЗ за п. 15, що містить амінокислотну послідовність альфа-ланцюга ТСК 5ЕО ІЮО МО: 40 і амінокислотну послідовність бета-ланцюга ТСК 5ЕО ІЮ МО: 45.
17. Злита молекула ТСК-антитіло до СОЗ за п. 15, що містить амінокислотну послідовність альфа-ланцюга ТСК 5ЕО ІЮО МО: 38 і амінокислотну послідовність бета-ланцюга ТСК 5ЕО ІЮ МО: 42.
18. Нуклеїнова кислота, що кодує альфа-ланцюг ТСЕ та бета-ланцюг ТОК, визначені у будь- якому із попередніх пунктів.
19. Вектор експресії, що містить нуклеїнову кислоту за п. 18.
20. Клітина, що несе: (а) вектор експресії за п. 19, що кодує альфа- і бета-ланцюги ТСК, визначені у будь-якому із пп. 1-17, в одній відкритій рамці зчитування або в двох окремих відкритих рамках зчитування; або (Б) перший вектор експресії, який містить нуклеїнову кислоту, що кодує альфа-ланцюг ТОК, визначений у будь-якому із пп. 1-17, та другий вектор експресії, який містить нуклеїнову кислоту, що кодує бета-ланцюг ТОК, визначений у будь-якому із пп. 1-17.
21. Клітина, що не зустрічається у природі, талабо є очищеною, та/або сконструйованою, зокрема Т-клітина, на якій представлений ТОК за будь-яким із пп. 1-13.
22. Фармацевтична композиція, що містить ТСК за будь-яким із пп. 1-13, злиту молекулу ТСК- антитіло до СОЮЗ за будь-яким із пп. 14-17, нуклеїнову кислоту за п. 18 та/або клітину за п. 20 або 21 разом із одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями або допоміжними речовинами.
23. Спосіб лікування суб'єкта-людини, що потребує цього, який включає введення вказаному суб'єкту фармацевтично ефективної дози фармацевтичної композиції за п. 22.
24. Спосіб за п. 23, який додатково включає введення окремо, у комбінації або послідовно антинеопластичного засобу.
25. Спосіб за п. 23 або 24, який відрізняється тим, що людина має рак або пухлину.
26. Спосіб за будь-яким із пп. 23-25, який відрізняється тим, що людина має пухлину, що експресує МАСЕ А4.
27. Спосіб за будь-яким із пп. 23-26, який відрізняється тим, що пухлина є солідною пухлиною.
28. Спосіб за будь-яким із пп. 23-27, який відрізняється тим, що людина має підтип НІ А-А"02.
29. Спосіб за будь-яким із пп. 23-28, який відрізняється тим, що композицію вводять шляхом ін'єкції.
30. Спосіб за п. 29, який відрізняється тим, що композицію вводять внутрішньовенно.
31. Спосіб за п. 29, який відрізняється тим, що композицію вводять шляхом безпосередньої внутрішньопухлинної ін'єкції.
32. Ін'єкційний склад для введення суб'єкту-людині, що містить ТОК за будь-яким із пп. 1-13 або злиту молекулу ТОК-антитіло до СОЗ за будь-яким із пп. 14-17.
33. Спосіб одержання ТОК за будь-яким із пп. 1-13 або злитої молекули ТОК-антитіло до СОЗ за будь-яким із пп. 14-17, що включає а) підтримування клітини за п. 20 за умов, оптимальних для експресії ланцюгів ТС, та Б) виділяння ланцюгів тек. ЩЕ З М У Манн умі й криги ті рУздигіутм гін ісутіачг Злом г БЕ МК 8. ЖУнскистетна посли еть пеки чути дини нативного альсвенаМмцюи в. охо ві іі шкід. хви ММ ЕК схотів ех ТЕЗИ МОУ зуміли МЕТИ Вавріабетина дізанка мити зале ТЛО, СБК підкоренстцані. та СЕМА, я. З пкввчамені як ЗК і вд ДО СТОК г фізи: фіг ВОК І ШУ соді іх фіхх іа о ма семи і в ПОЕТ ГУ МНК В В відповідно, Ділянки ЕМО КА явдавені жирним щока в позначені як ЗЕ 1 ВО І ЗО ановуням Кеонстшетна дінки поважна куМсМВом. кМОоУукОоВро І кокосове нм У КМ КІ КУ татів иа смс Ето ги ВУ лока якесь ТК Миш ОКТАВИ ЗЕМ МС З. Амінохнспотна послідовність позаеунтинної ділянки нативного етану. кава євльна Діанка вити ана 1. СТ підкреслені те неозначені як ОК ЩО МСЕК ОТ ТЕ ТОЖ зі им ки фу ШКТ ТК кад хи! хни зах зів х Кс тічки: смів МІ З Оу ча: ТА відвавідно. Дійннки ЕКО ЕМ виде жмомнеМ шрифтом те позначені як СЯ ЩО МО Я Відпов не. кОнотВНнІне дійвнка показана кУуВсиВО м. пекти ОМ ОМ ММА ЕКО У МКК зеУпУЗвЕКеВК им АВМ ТЕС ККУ КІТТІ БІК ЕКУдеКЕВааІВМ ОКА ДСоАТОКЕ ВИНУ УМО КВУ пато АККВОМиККНЕОоСУ СВУ МАЕ ГОМ ТО І СЕЛЕН
Фіг. 1 х оругеуух ами вики сс нен : ; зклітнинаї віланхи впефалиниюга гозчиннего мк ів кі Хмінокиклотна послідовність поззкліминох пізанхи втняйа вною ЗБЕ ЕН Я. Амінокаолотна поблідовнють пезаклітви но ді ух пн міх ЗІ КИ Кк і вк інакахвна кумом. а чем кВний Вл У Я На ж кочитаніМав пиві КУМ. БОЧЕМаТ явного. СХ підкреслені Константма дитівка показана ку : нате; КУ МИХ підкочолень Конетантма диня . : . бі куту уккиквя і В се пам Веї ДІЛЯНКА, зіїнУу векаазний жионИМ інт оМм у положенні Я кометамтнеї ділянки ІеСТАНМУ ВЕКЗОМИВ ЖИМ ЗОМ ГУ ПОЛОЖК "сежчучч ки КТ МК да ТУ КТ КУ УК ЕВ УТ АГ У зум х 1 ї м БАХ кУМ У Кл МЛК плавок МУ гУвииКи Кого пит ЕМОУМОСВеСеВІ ОМС ЕС ХК ще пектин ТІВ кур р тд У тат ДТ нм пишу комина ві гук аквогА їй МЕККА КІЗ КАЖУ ка ККУ КУКА Хо кА сумку юрчтет МАН м Ас Ти ДОА Т В Оси ВЕК ких ЕК т их Кт ІК т ЩІ МИХ З НІВ КУ ДАЮ КЕ КАХ ЕЛ АНЕТ,К ЕЕ В АМИЯ МКК ОК М М ТК ЕХ, екс М КІМ ХЕ КАІЖТМИК КИМ РНУЧИ У НЯ ВЕ ММА І ЕЕ КЕ т : меж вихо і зоаахлитинне ділянки детеланцкма прачиннее і у ї ласлідДОоВнНЕТе пОоЗахлитинНнаї ділянки петечіВнуюа НУ персик т хх, Ж Інекисвотна ослів поза оя діпанем ; ЗК МЕК 5. бамінокиєвотна послідовність й ' КЕ ща нази показана кУсоввом, а ненативний залицюк вне ГСК ЄМ мідковолені Константа дізянко показана кум, З ненАтТМЕ наївне ГСК. СКК мідковшелені Конетантна й " ду конетантниї пеянкмї. Полуукові ненні й кишним шрам у пеложенн Я? кометантвої ділянки). Додатнв нена цистчму показаний жиКним кумом гу Що х камні ВУ констант звпянке також пекан ЖжеинаМм мінзЕнетити є погані га та пло женні ве кине щи кВ також пекан МЕ ВМІНшФЕВСНИТИ У ПОН КаНМЕ ТІ а КИ оКе супи фмтихК ТЕН ТМ, пор гЗЕшунЕниКеК КЕ ЗВ кижвІцнн и ві Еш Е й ТЕ о ІІ и ІЕЕ ца її їх шк І КІ цех з. «М я АТХ АЮ Ж АТ КАХ є тусвиакри У ем БТР КЕ, МС МаНниМ ему КО КН ж ем, ит тиж ОВБКУ ВЕУ МОНЕ еру ууо ем кн Ти ду еко ОО МАВ В А В КК МОЖ Ен М МАЯ о о НН и М А В НН ОХ КК ХЕ М КО КЕ КОМІ КК п КА У АТ В ЕК мА КН ЕЕ КАМ Ен еці ни М Я ТК У КІ ЕН р БУ ЗК у рат У І Пи : ЕЕМАУЕВЕшКА І юНі кит б М АНА УК І сМмрисвтечтю В ККУ кто уд В жа пс м не вчи птух и і ут А НВ з Так а СА Ух ТЗ ТІшШ М І шЕще,Мш аем МЕМ У У КОМІ НН: : ПМЖ лини КК и я КАМ шим
Фіг. 4
Такому ті Му ук ті спр Мк му рів евіх си. «фі мав МІЗРІ зі чу ТЕЗ їз гомін окиспоТнІ пекти дово аВмКнтьМиХ ДНННОК пгнмОдлиникн а підданого мутація ГОМ СОМ підкроеєтені з муТВНЯ позначені жирним пиУктом.
дет і в Я Вхід ле ЕК
ЖЕО ВС ТЕ.
Мутантний витьсраивнуют ЗИ шле кут и р оу и илІУТ О ВІТ КІ КАО ШИЕМр І ТІК Сг БИК и
БК МАЛ КАМАЗ КОЮ МКМ КАЖЕ меди КА КК КОМ КОК УЗА МКК КМ М тат туди ет ФР ит су В я т уУКИІСТІК І Ж ТИ Іру ТК ТІ
ТАТКО рем Мито ВІ е
ХЕ ФУ Ки Ж о ай емлвитівівко мож ех. ри стих
ЕС МС Я, Мутантний зпосраивнуют ів пи у милі су рим: му вену Ум АК м Хм удІиХ Кусто Ку Тим М кМоУБОошиОоо ЕОМ ЖжасМеаеи М ких КОКО АЖВТВОМОКХ співр гати т пр кит ср К КО Кк ех жі ик ж рр ви ж СК дк МЕМ ом А РМК ХК КО МАМ Кт ЕХ ЗМІ
СКУ мк Йзексзв ті би х сМмУі г
МЕЗО: Я Мутантвий агкфоа- лану ах пи жилет Си Між г Су МІХ МА МТ УМ ЦИ КК ІТ І СТАДА КИ ІК каш ви КК І 1 ХКя КМ зи У УКХ МАК АЛІ КУ ХІМ Х ММК ОЕМ ЕКО сети ту учи ит ві лит Ім в их Се их ул ик ж жо иа сих
ТАТІ ТІК МІК я ТУ МВА ПЕС КМ сет ВНУ.
Я Жакет: РК мову г
ВКМ НМ: ЯЗ.
Мутантний апа ланцюга тн Кт вмер Е мсек макети м рову М КЕН комою КМ сумка КУМ КуУакКУх М АА ЮК МТК слу Кім УК тм ит В шт охоту ру и ж труди УКХ мими у Ку А КАКАО У казан Е
БЕОЗНІМО: Я.
Мутантний альфаланциг візка
ВИШУ КМУ ЕСЕ ГУК КОКО Я СХЕМ КОМИ лпУДСТУу ТІМ ІК УЗ рук ут улов у г уко ау Крут р
ТАКОМУ ТЕшКБЕУКЕ
ФеТОаю Кр шатун ікрі зкахі.Уфіх хз іме св
ВЕН ВК я.
Му знтІнаМ альфа ланцюгіВі
ХК ЛІКА. тр Кит СУКИ КІ УКГ ща БргшшитмриХуіІ у У и б ВІТИ м УК Км о АН АВ М КАМ МК АЖ АВК КН МКК МОЖ АЖМСКИМОКУХ слуху тів гомутии моралі дІ мств ую т кам ісиі У ух
АТМ КОНИКА У УМ СТЕ СсКОгВИТУЄЕ іі М.
У Кафки плевру у дв щі
БО МО СХ.
Мутантнивй але ланцюг іі Зк у Міг Ти КУ ее по БОКУ МІ? Сірет тт ую КиМУ чу ші х ЕІ КУ М и КМУ оф КМ КК УАНМ пана СХ хисту куме рт и шк пе Кут УМ ІК сту У
ГАЕС гасу МАВ ТКС МЕ се ту.
В Дао віхи ТУ сист ниих г щем
МЕС ВО: 93, Мутавитний альфа ланцею ВТК ти ІК уко ВОМ т жу МУК НК гот па вер чи р в чи м ІК ММ і У ККУ жа КАМ туші ЕХ праву КУ МАМІ Ку КУТИ вт ВИК ИК Ст пики Мік ик МК путі Ж ИХ
КАК ЛАМКІ Хм М Милі
ЗЕ ще; 28. Метануний ап пимиим ПК
ЗНА ВО; а МІЖ ВНУ НИМ КУ НМ ГАК ВНОЇ хтів СК алу ЕМ и Кум ка Ми ід ЕІ Кри КК КИМ І КК ау У, мсек см мевомокУхКамакм ТЕМ аХ пуд Му ми их фтгУМИ С ИМИХ ХУ МУ ХК УЄУІІМІЄУ КУ мок ферми ТІ т у патийастюньнІтьнОо шпеошІсуУмавовь ТКУ си і КУ.
Я Дусі жив ок мк дткзу зу ЕК КА
ВЕСНУ ВО; Я, Мутантний алюефнепанцвх ПМ дл ттутттху г тую СМР Мур ЕМ уч У ех УВК МІ ТриА В лиж и КИ аматорам Ек пед у мому жі жу и у ки Ук ТІМ и В г тру ДК СК
ТАТА ТІ КС МАС БУ Ера АМе дУй зх У Ж Каті лУгіх ей гі м ТАМ
ВЕ НІ ВК: Я Муснітний пльс лани п)
хи ттРе а тик от ет УМ ему пі г УМО мир мрихіг іти ж вки Ми КК Морозом смугу УКУС ЗЧоАлут ід УУкчікуз У алу жи сири у Ук имя ТМ у ху
ІА КО БОБИОСТАШВОВОМАНТЕІ УМА ТММ Е
СІ їж Ді.
Я йди хуй меха зм ВК
ВЕСНУ ВК: Я, Мутантмий лу лпанцюг ЗВ соми тт тимус ЕЕ юс ж жмут юн м тих Ук у кт им тузі ІІ ШУ: ТК Бк ВИ МІ у ТІ
ТК ЕЕ. ї ї т.
У УК хи щи Ки ТЕМУ ї А пи мес ОовеіІеснЕМУ Кос ЕТевемоКмЕКОогаковУВМТЕК Ковка перечт гАтУутшУ тк ех шпику гум тІМЧА НЕ М тт т ЖЕО УДЕІСОАСТЕОВВЬНІТлАЕМОВАш СУМИ КНЕУ ке стук були насу хом еф тіхетьм КУ ВВ
ЗЕ З МО 58, Мутантний вльсфи-ліанцня (33 досутт іга ті г ОКХ У КІМ ів ВИ г ум еУур рили тах тер ж у ДИ КІ МИ БУХ Моно ІП ОоОКМУТМУ Уест ЕМукКеМСсВУ тпридтмч пу кутку сиве шим тех Укл ТУЮ ті
КВК КИ АНА ЕМО ДОК.
ВЕЖУ Ся ТОМА КАМ МІ акті: - г ту свіг в я,
ВЕСНИ БО.
Мутанемиє ЗВ НМ ЦцК ЕК ока х шву Сг дп уп мух ук МІ ВІН КК ЕК КК Кг АК КК дим ЕОМ гі мими Кроки им КЕ кдому Кук тот РУТ ДИТ КУТІ хи пр ТК дити я КК уки КІВ
ТАТО КОВКиНІ ТЕ КЕ АОС КНТУ
УЖЕ ІбУ МНТУ.
Я Кук у тугу ик г ма
ЗЕ КИ 53. Мугакнтвий вльсфьиланику пудів г Кир г МТУ МКУ меру в п МЕ ПУ Ки У ПИ КУ УЮВ Ж ПН Коко кр в ше пАКОТВОКеОНЬ ЕТ Ес МУ ТІ МТУ КОМОКяХ КОС КОвУЄБОТ КОГО о м 3 хо Мих У й сзжачЕеи вх КУМ Ук ик пт Ко вого Кук у КІДКК ик руни ум ЖІ сити вк гуде ил вит пОти В ОК Ух ик МД к рути хи таж
МЕЖІ УК и ЕОЗИНОМ КТГ ж дих ДЗ діт ту Км чив ВУ ЗБ МО: БІ.
Мутантнивй кита танцю" В ЖІ К у СК хитрих лизати ус Тир Кит их ци пи АМУЛЕТ ОКУ тітку ГМО АКМІКАМВХ куту ФУ уки Ця ВКМ У ур АХА ХИТ ЕТ УКХ В ке ди КІТ кари КК ТАТО КОоиКнІтаА ОА УМА ГЕ ЕІ ВОК Капу сухо гумі Щи ЗК АК У, Мутантвий апа нцкМ ІВКЕХ) ВКМ у Кох у ХІІ ел УК шкі ОА КТК ІКНІ г ие Жук МОМ АМОЧВОВЕ ЗМІ ІМ ОоКМУ гово Мовям ик А МКМ ТАТА ТАМИ АВУ СУМА СЕС Кн УК сг й 5 А НН ЗЕВС: Я.
Мутантний зпьсдівнуют ВЗ плітки ЗК дере МТВ Кт КІУНТ ТЕ ГАК ПДК ит У РІК У ПК В ут Кк І ке ух аМмачЕсоРОоВИ о ЕБОКМУТЬ СВУ чним тав ОАЕ КеМОКУ сти мусу о БУМ КУ КЗ ТВ КИ У Я о кит УсуКІВ КУ я ЗА у дк тво КІ УК СГЦ КАШ М У ДЕНО педа ТУМАНУ ку З Шо фаху пу оо отче ЕВ КО ЩО МО: А.
Мутантнии аль паницю а зу Сх ох им учи и о МИТІ ВК У ТЕ В УТ У му УФК Ки ря: ЦК АЮ ДОМИ ААУ т ВВЕ МН Ор З ка З ЕНН З А ВО НН ВУ ПТУ ЕМ ТЕКУ квт жук кріт ит ких ши шум пе ке в Тв А ту КІТ ТАЛА ОКО ТІ Н «ЕЕ ій ВЖЕ Жйхлумтх домк Т ЗЕ МКК БВ.
Мутантний альчиеианцюв але) Ту ЕЕ Су МИ ут и ЛК М І ЕТ ККУ. п Ма у КГ ЯМА У МИ В ДЕБОКМУТІ ЗК МТУ ка АЗКАЙ ВУС гІвахаиМІКОаУ гро гуде г КІ Киев Ку хи Кума и ио р СгхУт угон глива СЮ КМ КЕ ях У І Б ДЯ ДасУФУ утіх січі Ех р му ТУЯ БЕН МС ЯК.
Міутантнув звефапвнцютє Я) ОІД Е КІ ет Кр ви и ую Ек КИ МИ МИ Как и ут и у ТИ Кю жуду КЛ МУКИ ях АНЯ ан о Куди ШК КК Ин Я ІБОУАшІКаМСсКУ ях УЖ пк я Кп о ПАК КК УА й ему ду вче мое ДК др у дю гало х Крем уко Ко дк у Ар ра днем т жу АЛІ ВАЮТЕОМВН КАВОВА УМА КК ху 12. ЖІ) Клустсуу тої сдхав: кити зухи фих ле ЗКОНО МО: 58. Мутанунни алюдаетиниуюю ПК шт Ми К Ку Ку Кум т и УАТІТХ АТМ МІУ МІУ І т и ж СК КТК ОО КИТ ВІ МКМ КИМ М БИК І.
ТИС КХ хм МУ КОМ шви ОА КЕ ЛИН Х ХА МЬ таж кукі куту м ри у Кук гуци их УКУВ УЖ хх ж тому КІ г ТАМ БИСТУ ІОН ми мМ Мпа все вк і ще гос Метантний сце ана В МЕ И МУ.
МІжТЕНТнИи В ЗлЛьЬМеЛаМНиМ ВАХ ех му ок тору ут гиИ Кук ую Си Кути т их пут у Пил жди КК ВДТ ди Си вм еовиІкІИиКМУроОсмУ Тео ОАЕ : З Пенн ХМК пт Крит ТЕТУ ЖК МУ СК КН УСТКІВЕ К НЕ хо р тур, у тк р АЛІНА ТІКОЗЕеНІТАВС ПАВУКІВ дк у ух ко ж х, г. ес окт 5. с г ї К. су з «І У за.
Кбхерумавіаїй сіті. сф зв и ви ЗК МО: БО.
Мурат альфа цю БИ хи уци Кт Тоех КМУ прос их Ул су ав ри шу УМГ жу Ку АХ мом ги гом гумок укОоптско еВ БУК ТК КХ ЛІ ХХ сищемт р кит ти у СРС КІ Ето В КЕ т ГИ ОИиз За р СК ХР Я ТАКА ЕКОВВОМ ТАНОК У МКАС КЕ О МУ БІУНЕ ХХ НЯ кіз й Каеимуі ух и В прут РУКА гу ВЕ НА В.
Ме іантниМи альне ланьног вч КВ кит ЕК и Ті я й ХУ МІд УР Ук р ох и СЕК рати кут и пут ТУ МК КАМ ух ТУ вк ких у аМмоЗЕсшЕОоеІ СЕКТ осМжгохиаМоКАУ Корсун гІМТ БМК тож вт уУУКУМИиУ І Ух МІДІ УВК У г хі УТІМ ЖАДАН КМ Ї МЕ ваш Умова МЕ ЗК НІ ще; З Діутантний зпюфіланізог аАЙВО ЖЕО НО КИ БУХ.
Мутантний альфаланьвог СЯМИКН ХАІ и КО т му МІ кт ік Ага МКМ ІК мих ЯКЕ Ж КО МИ КЕ М аМОоУКОовинЕЬІ ик тоскно пудру тех мету тр ши Ура Ж І пт Ки Ке ІВ КУМ ТИМ тт ТАТ ММУС КОВКА В ОКХ ТМ МЕ ТКУ ЗК НМ: Б муси далее ланцює БУКА МАУ Е НВ тет КОЮ и и м Шо МКУ ок КІ ВАТИ АКНЕ АМБСУшОВеСНИІТвЕСКМУТ СМУГУ МокиХ ОО Тсеа УВІ ММ КИМ ту мкм; із умру и Ук ти КУ и у гуси щи руту Тр г УТІХ ТАТАМИ ТАМ Ош им У Е кг кі ка Укра и м мк и КД БИ МК Ба, МутантниВ альсваланцюг (ЗІ міхи а ім Кот у ев ехКУКІЛІМм У оту ВІТ МІК Ми КМи КІ уд У УГА УКІЦ У КУ зМОоУМОовеовиіІБКзМУГТЬОСМУГУувеКЕМекРИ КОНКУ ОІВ КМУ во а нн м о и КЕ и и АТОМАМИ ТАВОСТВІ АЖ СУ МН ОсСв І ЕСЕ (продовження)
; - сві тиху кое : сх г как 15 іди лук саминиВ іга нен МУТНІ ТК З диіноквепстмі постденноесті вир дбельних діло ета-намиима підпаного мутацій ТВОЄ Ааіноквепстм: посадове с варіаювльних філянек Бетони км Пул М я скркдмт уче що каф чекав МУ яАя БУТ тд кмеКаченН.
В мутона жирним МЕ НИ. ау вх ую р Ясзіекикіх В іме і ЗБ НО МО: 5 Мутантннм Вежа манеог прати рЕ кру ки УА МА у АТ М о пт гм м ТУТ Ом юю чле ктів осн мим и ж Км Ге КК МК Кк МАК МК КУМ ща Бе КЕ У АД ИЮТВ АЛ х ВМ ЕУХ сурюЕмуУ СВК юрНІ НУК селі І КУ даному ти Кр т ТІ НІЖКУ ЛІ птн ЛЕМ ЕХ оса СЕН КО под їх 3 ЗА кати Вата А ЗЕБЕНОУ МО: ДО.
Мутанитний Зате аницвх ЗИ
Ху ЕКО УУ КІВ МУР киЕКА Ко ЕМ у и Мр коки иму ВЕНУ ТІ Тука лтТенІ А КЕКВ вл і, КМ БЕЗ ІЕМ ХК М КІЛ КІАКН КХ МУКУТОВЗКУЬУККТОЕКУРСВОУОАВЬВЕМЕН УКОСИ вами зУпотеЕвквИвеї тів УОМУ ВОДІ ДОКа ТУ ОВО ВН спав ГІ КА С ЗМУ А а згхкКух ие ЖКхІ Калі М еКщх ве У Карр хто міри АВ ЗБ НО ВК ЕТ.
Мукантнай бета панцюг ВМ гризе кут тю рев ета жур т уах ти ЗНО АНЯ пек ТОнжиВУУкМІЕУК СУ, АМЕЕНО ОН І КЕ ЗУ В Ома Х дев ше их мк ВЕК сеожЕ ня й кукі Н Ах ня п вух Ми ех Кун х мех петсУмвикеиКве, і ЕЕ рам сви рОМО р НУТУ ет зхшУККЕКЕВКУ М І СЕВАТТКОриМУ СЛОВ ВОМОСИее КОВО Кут» КЗ м. хх тету ті карі БИ БЕСЬНІ МО: 28. Мутвнтний Бета ланцюк а Ва)
: ечу крок УтИМІкХ Міли усе ху мрг склу зв КУТУ В оук тео ші Кт Кі вІ ВКМ МНВК Ео ос ві с еБаввАатикК ТЕ ПКУ саке А КИМ КІВІ МиМеКМХУ й АХ КАТА Км КК ЗКУ.
кахке демії дур ув и Ту ТК гук Кт Ін мот КОКО У вл г Ем Б ую ЕК АІХ Її СЩК пу КА і Ах М «АМОВОИВО Мухи жк Калі Х ща На ух Та КК селі кад ТЕЗЕ ПА ії КО З ще «м. ях антІннМи зе лаЗНЦцюКяК Кі сему КВУ ПИВ КВ еВ ат ії ТУ КОВЕАН НЬЮ пУКУТ ОО УКиТОоККУКІвКуМоннМмин ув ВАТ КЕКСИ Же м кю м КОУТЬМ КД КО У ККУ АОЖАХОХ АЮ М У АКА ЩО ВХ МЕТ - Ко ровами вний : ТИЖ КК Кк У Др р ри них кур т тих Ж сусоповЕкУВКдІ т КЕ УрОМ І ЛВ ВОрММИЛОрУ КО ОСРЕЕх ше ЕМО гам ТО В МЕМ ЕЕ Хіт юшЮ іх ОКУ З ту» ВЕ джаз муснахх хм знак ІНВА ЗКУ МО МС: 35, Мутимтняий бетапамцю ПК ор пи мМ Гек вима у т вк ОКУ КЕ пУуБумкИаве нав воУсиМоекМЕм Осі КВЕСТ МОМ ОЖМ Я КУЄ вах КК А КН КОМ М ХОМ М МУКУ Мою т х З де : суду юри юю хе ЗТ в тик ради г си ки рух ТУ Ки ВК птУсдлошимкнЕщиш котик урсуму а КЕКВ Ку шу кпІшУККАКЕКЕ ма А ТЕЖ о МО КК я КМ, - доза ках Ки Ду пе ініК Как я ВЕ ОО МЕ ОВ.
Мутинінаи бетаеланцкн (ак. стр улітку ЕЕ КК у т кока НЕ ки КУ потік шорти мем ів т УКетУ ВАК пишемо КУ мішку ОНА м ММ Я Ж ЛИКУ сип АК Х КАЖЕ ВИ Ж М КУКИ х ж: х 1 хе ОККО - Б ; ех пове сирі и та р ек яке дм т адек уУТ сини УК юЕ хі ЕМ КЕККЕВІ ТЕМ АМИМУГМУ ОоваВЕе масо у ЕККх
КІ У Ва я вата Кому міки ВЕСНУ ВИ Б.
Мутантний Бета ганикКУ КО кх х Е п древо тиУє КЕ Ук уж БИКА Ат ТЕ І ДУХ р вк ре иур г І ттокінвточі У ті І роли ютер ши у ІЧ ІТС МІ жи ВК МещУ ко ВК ММК КМ КК ММмВиРЕмЕ мука Її АКА кове "хх рук тку тери утіх Ж Кожна кроки Ка им ок ву Ку ЕТ при ри МИ рух гіди лтму шум где Км А М мм ВУЖ ІІ ги птн КО КМОЕ о Не п МІАКХ МУ пу Ці Вас ек паці пек й МЕС НО МО: й.
Мутантний Бетачианнюг (034) теицук тихо с КУ ХЕ их дит и Уж Я о о ЕМ я у оду вия о КУКА МУКУутсовеУУкЕтТоаКЕУВоВОУюльЬоНеММие книжок У ТНК КЕ пососсокнвиу ту Ко вМмеУвм т докум и шен учи шувтТшиЕККЕКЕМЬ Бема ОТВМУ па ОО кМею ЗК З ВК ді фам Вик каміни НАВ КОНЮ МКК Ба.
Мутантнимй суаеиамцют (Я теми др АК ЕТ ек ВУ З кох І ККУ дека ву тити івано вит а ммике си мн и І Уа Ввв ВВ МУК тех а У Ба КВ вУВ их ЖУК АНА КЕ ИЕАКЕЇ УКАЖЛА КЕ гема ни што хв крим ра в шу вим ВО ШИ І ТИ ху нВОІМЕю Мага 7 А Ес ККД ре у ву оче Васі Ка тім АВК ЗК а МУ.
ТО.
МЕТАН бики Сет ЛаВцКМ ЗК не тиж ту КЕ Вин Кир ж КАТА и В ЕХ а То вк тки ГРО Жлрте ут жу пр КТК м Ку мат І ВКА ТИКИ Му их АВ КЕ В А ши ЗАДНЯ ЕК В ОД КОЛ ЮК КК БК г ОХ ЕЕ пУушвоспвекешвикс т Ковш вимУТ ва ВІНКУ УК НУК СуБУДКЕККЕКЕВО ККУ КУМ УСИК Уест І Ех мух у Мем ул КуУКИо чім МІ ЗЕ НІ АКНЕ ТЯ Му затих КЛОН Пл ХЗ я ЗІЗХТ КМТ Ж ЕК ПИ ЕР КАТУВ ФР М ВІ М РУТ Ст ДУ Токар пр КК Юх тУккІктК ти дух злотуюммЕе вими УусиМмни им КІ УВА КМЕ КОС шУКУ МОВУ КЕКВ МеВ Ми ях КОС гь М У КВК т пу ув ге тУСТІТУЮІ и чиї Оу АФ А пн рюв Мих аа ІВ лшувк мус ТМ Ум у МН прдим п ауУМеКЕВЕЕ МОХ вЕВАККМО Камо оссех КОКО У дили і іт ВХ ке інки Вуді рик РУХ ЗК НО МО: ТЯ.
Мутантний веталанцю ПК пек ту У УК КЕ ет ря В ЖУ.
КУРКИ ВИХ Кт КЕР т тов ев у Ки В Ж мМ КІМ ОККО КЕНЕ Мт М и и 7 75 джують пакт котки Ве ж КО в кутках У В ОК ет у у СИ зІвБУсКЕККЕКиХЦК ее свою МО ЕК ТУ ше ВІКУ т Кйхоумтмі Воротін к ПА ВІЗ ВК ТЯ.
Мутантниий безаланцю (ЛА магмоти оту и ми ву гуму и КО тати мит МЕМ КУ Мем ЕК мкА АВК м КА КТК Її їх ау ккетК ОА ЕЛІх УМ гахоудстій о шІТ ІТ т Кури АД І АКНЕ ТТ ИН у КИМ т сЕшуквЕЕЕКиКе ОА Та Тим А МОЕ ПОМ ОСИЛЕХ МКУ ки МІКА ДІ Й Ви ЖК дохо Вих мукіутімне ТКА БНО ВО: ТУЯ.
Метвнтвнй Бетвланцює БО титану ст У р КК Оу МОМЕНТ ху у руку Мить т шУукУБКТОВСВЕЖвУКРКОВКУВКОУМввЕККУКон УКВ 7 кві жк зяжжжжжююяя юю гужкч ср у кю тт в Кум т подат уп рунт р рее Ів КкЕкиВеІеаН МОМ ОВО ух іїг м УК дкожімііжійь Шах ух. тьму ВУЗУ ЗБ МС У Мутантииа сБугеланию ПМ духа и лож и ж руду у тихі им В ВУ ЖИ ТА АТ ВИ КК З КО НВ тА ВИ КУ МУКАТОМЕКУСУ КТК ВХ КОМ ХУ ОМ КЕКВ т тю ють. джжжтіяттттжю т тт тс кути лити ог гос М СО мих хау и М С и КК рН ХЕ ХУ АВМ Я НО АХ ЕМ СА СОМ сх КК ТК СИХеХ З ВО и крему Кутові цк СВ Ж ВЕСНА ТВ, мМутантний сце Іо; З хіх ух уми и их ти В УЖ Ка т КН С КІ Аж І покутсвиЕж Укл сУ аАавьвимниУ киска ВЕ : оксана ХХ укус рф ут В т фКІ А ХУПУКУМКА хи КВ ОКИС р п ДТ топи девУкивЕКнивТилА гом ОНЕУ КК їх ЖК Ж Керн Кк м. се і ТУ ВЕБ ВК У. мутанти е пет циМ ЗК уступу Му ант и гі Куг КК МА Ки ТУГУ НВ я жа СКК ВИК У ек КАСА КО Ж Х БК БИ КЯ ЗІ КЛ ЖЕ КЕ ММ НК КО ЕК ХОМА ХХ сту е і ЖАКЕ КК г ук м КИМ МИ КА ХЕ У В КУ ВЕК УМ ТЯ КУ Ух ситу су схшчанЕКЕинеМЬІ ЕОМ кВ мВ У ЕН МЕ В фетантмиВ бетаеланицв ПО ЕС НІ МКМ 78. АЛутантмиВ етан панцю ЦІ ігру туту ТЕХ ик их Кит в УЖ ФУ КИ ет и ДУ т КК КА ріод тет р МУКАХ мМ КАМЮ В ХА ННЯ ТЕМ КК ТІ ЖЕК У МКМ КК Ех гуску Кота ет ЧИ ші М СНИ их да ит в сп Ку КС І ик Ки КУ х У ЕвБУКККЕКВНЕВО ОЕМ Мо вшениммиооюУ Во Мови Км СІК 5 ЩА І Кекси ом мені м ВИ ВЧ І ВК УВ.
Мутантнаи ветаеланцюг ПМ утік ер тиих жит їпе т Ук Му КК дл нити т та ГСТУ Тим их ММ шегму нок УВУ Кмин х ТКУ КОДАК АК КК ХМ МАТ КЕНЕ МКК ХИЛЬЛЬСТМХ тю тову т фр ю У У Ки тка т Ум о жатки и и пишете ТЕТУ ВБІУУ У ЕгЛИМІ Мк ажжжжаа юю юю юю ню кю ють юю вч вжиття дю юю ках дк В дае тмут хі Фах. мм тік ЇРЯОЗМНИКІ МЕН МОВО.
Мутантнив с арІнанцю БК тА тку хі ут у т и у Гу Ху и и т КО Ки и у М у М М КУКИ ЕУХ ДМ КІС А ХУ ох У ДЯКА ЕММЕУЄ ЛКК БІ КО УКІЦ ЛАЮА жи Ку и М поко шщи тА ті ХИМу и ЕТ І милу Аг» ВУ ил МОМ ТИМ О В шах У Ва М Я Киреху «заі3і3 Кос У: Мч ДИТ ах З Я -КМутамтмив бвтаеплаМцюн БМК ВЕС НЕ МОЯ.
У 3 ; тру рхКЕ ур УттМт МУ Вилки кж Ух та САТ О Ху ВД МЕ у пудУутсешкУгУктТН ЕКО ОНА ММ МУТНІ КОВКИ ТИ Ж чи лк ІУЦТИ МІ КА щи Тк А МИХ УВА УТ г МУЄЖИ сЕвУШКЕЕКНЕВЕКВ ОСА МОМ ОА УКХ
Авінекистутві поспідовності алефванцюів заятах мелекуй ТМ» вмуятнто де СТЮ ЗЕ МК: ЗВ. Альда-панцютівнка) аМОУКОоЛеОоСиІ ЕСЕ МУ ТОМУ ТУ ВИК ЕКО ТКУ ТВІТИ МаКу ТАТОПСАВТКОоВБиСНТТАВОБЕОАХ СУМКА Ки ТЕЛКОТОВКІНеЕ ОКА ТО зкНиказикачсоЕтТаромУ нку током КиМОоК Ки мАМММКИМиАК АМАБКМИ КВУ Х ЗК ЕМО: ЗК Апефжеланию ів Ка АЕОУМОВРОВИХ БЕ ЕМУ ТВОЄМУ КУМ ВМО Котов рУБСТ МТВ ВМТККОВУ ТАТІ ТЕОВиОВ АС ОвООВАНУ КОТУ АМОЬХ ЕР ВОТІ МО СУМеК СОККО Би таті ітм тс ситі луски різ нм міхи КК А МЕеЕсешОКВУкКв Ким ККУ Ак ИОК КОМ МИХ КОМ АМУ МАМ ЕВЕУЄ ЗКОТО МО: 40, Альсфіланцює (в'ТякВоЗ АМОУВОНТЕО ТОМОКМУ ТОМУ ТУВиВМОКМХ КОВО вУни сумка МмаКу ТАТА КОМ МЕТАНУ КО ММОЛЬ ХВ ТЕСОКОУ ТЕНи КОКО АУЖКО папеЕКЕІОвКачсЕ ТОВКИ МУуК Том мно Кама АЄ АМАКММВІІВЕУХ ВЕНУ МК: 44, Альфв-йануюх ВТ ЗНА АМОУКОВІОоВТІБезтмУт смути кети КЕНЕ КаМаКи ТАТОВІ ТАВОСвЕПОЕУ ТОМ ММ Тло І УНеУ ТОК ЕЛеАУХо пЕрозкавокиУсоктОовІмотТМмУ ково тІтТокоУ ОМиВМОвЕаМааУАНаМЕЮВаМС ВМАКММеХІ РЕ
Фіг. 5
АмнеюАєтоні послідовності четаейанцкив зпитях молекуй ПОгОовитиИтіна де СХ ВЕБ КК 35. Катання (513) вебзевнтитнн во ех покемано жУрниМм мазиотом, В лнкею пекааанихй куромвкня кв юонУ Ус Комі осли КУ сови АМКУ ПУЗТЕМОКЕКИКЕТКВУЮВЕВЮМТАХ ОМВО САВВИЧ СК УГБУВЕ НН В У КУТОВУ ТЕКУ КОТУ ЄЮ МЕНУ КОМІ ЖЮУЄ кМкЕКОПСІ слу КЕКЕВК ОБУ КМО ТОМУ ОВЕС ОХОТУ шк АСМОоБУДЬВиКЬУВАТЕМООЕМНКВ ЦО ОЕМ ЕА ТОМА УТОМУЄ ВЕСНУ МЕ: Я Бепелавцим ПКБНО. веб уєантитін до СМ покуюцви жирним рон ен Я лінкОою показання куремвем АТО ВАНУЄСОВУТІТСНАНСВІКМНУ МИМО КРИКАВКВЬКУХТИНОВВИУНИК семонесежУЮТУВИООМмУСКООВНиСАШОЖ ЕТ МНН Вася К ЧУТОК ЕКОЕКТІВУМКОКТАЖСОМИСВЬЕАВО САУ ЮА КОС КД УВО Є» УтУВЕСССТОУКУТОВІЕЖ ОКА ТОВКУ КОВО АВ КМИН Е мне УНІВ УТЕООЕМУКВЕУАУКЕСВКАКІВНІСКАТОУССАТІСВЕВОКУВОСиКМУ МКУ аКОкЕОвАСКОКЕАСЕКОКУДАКТЕНОЦОВИНЕКОСУЕ УСЬОМУ ТОК
Фіг. 6
ЗЕСЦНО МС Я. Бетвепвнівог 58) вебучантнкло до СО показано ження влзевУєм, а інкер пекан кури вс Із тОовЕОвивовнУСЮМУТКЕСВАНОМВІКМвМИООсКесКАвЕоІ КИНУВ НОВ КОВО АТ У МОВ ЕКУу ЕКОН поетесу СВУВИле вини ТММ ОКУ А МВУК СтВЕХКИКЕЕОЕКСІНУ ККУ ОМАНУ КН руш сосок УТОошвихвоУКитТоВКУкЕСУвоМонЕМикУ вом А фетиш ОКА МХ САНОК КОЖ ВВР Кого оон Коло ту М МЕН ОаКииТО ЗБОЮ МО: Я. без аепаницю ЦО. Веб у анти тн виз КЗ показано живним ние втОМ, В ЛіНКер позами урокам жіМтопвисьоавУуюиКУу своим ек ЕВ УвиВЕ зп УСНвУВООЗИОСМУСЗКОСМОВьНИвОЗВК ММС иь ЕЕ штоки КОМАХИ СИВУ ОО КУ МОН УКУКОСО ОКУ ТОМУ УКВ ТОВ Е І ВН ним АК Ед ТОКЕКОСЕрЕОУМУЮККККВКЕВ ТОК АВИ ТОМУ САБИВМОМВХ ВУ КСО КАМЮ ТЕТ, ЕМУКррвИАеКЕрИКа КІН КАТ УЄАТВОВ УЮ ВМ ке сЬИо АКАНШКЕАЮ (продовження)
Фіг. 6
UAA201810441A 2016-04-08 2017-04-07 T-клітинний рецептор UA129144C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB201606009 2016-04-08
PCT/GB2017/050985 WO2017175006A1 (en) 2016-04-08 2017-04-07 T cell receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA129144C2 true UA129144C2 (uk) 2025-01-29

Family

ID=58548761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201810441A UA129144C2 (uk) 2016-04-08 2017-04-07 T-клітинний рецептор

Country Status (31)

Country Link
US (2) US11505590B2 (uk)
EP (2) EP4023668A1 (uk)
JP (1) JP7254519B2 (uk)
KR (1) KR102473964B1 (uk)
CN (1) CN109563148B (uk)
AU (2) AU2017246693B2 (uk)
BR (1) BR112018070741A2 (uk)
CL (1) CL2018002859A1 (uk)
CO (1) CO2018011972A2 (uk)
CR (1) CR20180531A (uk)
CY (1) CY1125331T1 (uk)
DK (1) DK3440105T3 (uk)
ES (1) ES2914648T3 (uk)
HR (1) HRP20220865T1 (uk)
HU (1) HUE059159T2 (uk)
IL (2) IL262144B2 (uk)
LT (1) LT3440105T (uk)
MA (1) MA44608B1 (uk)
MD (1) MD3440105T2 (uk)
MX (1) MX2018012318A (uk)
MY (1) MY198621A (uk)
PE (2) PE20240693A1 (uk)
PH (1) PH12018502158B1 (uk)
PL (1) PL3440105T3 (uk)
PT (1) PT3440105T (uk)
RS (1) RS63371B1 (uk)
SG (1) SG11201808797XA (uk)
SI (1) SI3440105T1 (uk)
SM (1) SMT202200306T1 (uk)
UA (1) UA129144C2 (uk)
WO (1) WO2017175006A1 (uk)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112018070637A2 (pt) * 2016-04-08 2019-02-05 Adaptimmune Ltd receptores de células t
BR112018070600A2 (pt) 2016-04-08 2019-02-05 Adaptimmune Ltd receptores de células t
EP3692063A1 (en) 2017-10-03 2020-08-12 Juno Therapeutics, Inc. Hpv-specific binding molecules
WO2019133443A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Janux Therapeutics, Inc. Modified t cell receptors
GB201803750D0 (en) 2018-03-08 2018-04-25 Immunocore Ltd Method
BR112020020245A2 (pt) * 2018-04-05 2021-04-06 Editas Medicine, Inc. Métodos de produzir células expressando um receptor recombinante e composições relacionadas
BR112021014031A2 (pt) 2019-01-17 2021-09-21 Immunocore Limited Formulação farmacêutica, uso de formulação, e método de preparação de uma formulação farmacêutica aquosa
GB201901305D0 (en) 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Specific binding molecules
GB201901306D0 (en) 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Multi-domain binding molecules
EP3714941A1 (en) * 2019-03-27 2020-09-30 Medigene Immunotherapies GmbH Mage-a4 tcrs
KR20220035387A (ko) * 2019-06-18 2022-03-22 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Mage-a4 t 세포 수용체 및 그의 사용 방법
CN114245807B (zh) 2019-06-25 2025-05-02 吉利德科学公司 Flt3l-fc融合蛋白和使用方法
US12480958B2 (en) 2019-08-13 2025-11-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for the characterization of peptide:MHC binding polypeptides
GB201915282D0 (en) * 2019-10-22 2019-12-04 Immunocore Ltd Specific binding molecules
WO2021122875A1 (en) * 2019-12-18 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a2/mage-a4
AU2021219668B2 (en) 2020-02-14 2025-06-12 Gilead Sciences, Inc. Antibodies and fusion proteins that bind to CCR8 and uses thereof
EP4153618A4 (en) * 2020-05-18 2024-06-26 Board of Regents, The University of Texas System MANIPULATED T-CELL RECEPTORS AND METHODS OF USE
CA3183756A1 (en) 2020-05-19 2021-11-25 Amgen Inc. Mageb2 binding constructs
TW202406932A (zh) 2020-10-22 2024-02-16 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
EP4304726A1 (en) 2021-03-09 2024-01-17 CDR-Life AG Mage-a4 peptide-mhc antigen binding proteins
WO2022190007A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Cdr-Life Ag Rabbit-derived antigen binding protein nucleic acid libraries
US20220389394A1 (en) 2021-05-18 2022-12-08 Gilead Sciences, Inc. METHODS OF USING FLT3L-Fc FUSION PROTEINS
CN118139858A (zh) 2021-10-28 2024-06-04 吉利德科学公司 吡地嗪-3(2h)-酮衍生物
WO2023077030A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
WO2023099606A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 Immunocore Limited Treatment of mage-a4 positive cancer
WO2023122615A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
EP4452414A2 (en) 2021-12-22 2024-10-30 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
ES2999273T3 (en) 2022-03-17 2025-02-25 Gilead Sciences Inc Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
KR20250004824A (ko) 2022-04-21 2025-01-08 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Kras g12d 조절 화합물
CN117106060A (zh) * 2022-05-17 2023-11-24 香雪生命科学技术（广东）有限公司 一种识别mage的高亲和力t细胞受体及其应用
IL317958A (en) 2022-07-01 2025-02-01 Gilead Sciences Inc CD73 compounds
WO2024038193A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Limited Multi-domain binding molecules
AR130245A1 (es) 2022-08-18 2024-11-20 Immunocore Ltd Moléculas de unión multidominio
AU2023326804A1 (en) 2022-08-18 2025-03-06 Immunocore Limited Multi-domain binding molecules
AR130241A1 (es) 2022-08-18 2024-11-20 Immunocore Ltd Receptores de linfocitos t y proteínas de fusión de estos
EP4587046A1 (en) 2022-09-14 2025-07-23 CDR-Life AG Mage-a4 peptide dual t cell engagers
US20240254118A1 (en) 2022-12-22 2024-08-01 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
EP4695260A1 (en) 2023-04-11 2026-02-18 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
KR20250175331A (ko) 2023-04-21 2025-12-16 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Prmt5 억제제 및 이의 용도
US20250042922A1 (en) 2023-06-30 2025-02-06 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
AU2024297978A1 (en) 2023-07-26 2026-02-05 Gilead Sciences, Inc. Parp7 inhibitors
US20250066328A1 (en) 2023-07-26 2025-02-27 Gilead Sciences, Inc. Parp7 inhibitors
US20250101042A1 (en) 2023-09-08 2025-03-27 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
US20250109147A1 (en) 2023-09-08 2025-04-03 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
GB202315181D0 (en) 2023-10-03 2023-11-15 Immunocore Ltd Peptide-HLA binding molecules
WO2025087436A1 (zh) * 2023-10-27 2025-05-01 北京可瑞生物科技有限公司 基于t细胞受体的多特异性多肽分子及其组合物和用途
WO2025094054A1 (en) 2023-11-01 2025-05-08 Immunocore Limited Method for purifying small multi-domain proteins
WO2025096589A1 (en) 2023-11-03 2025-05-08 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
GB202320012D0 (en) 2023-12-22 2024-02-07 Immunocore Ltd Bispecific molecules
WO2025137640A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Gilead Sciences, Inc. Azaspiro wrn inhibitors
WO2025245003A1 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
GB2641580A (en) 2024-06-07 2025-12-10 T Therapeutics Ltd Tumour-transforming multispecific proteins

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6685698A (en) 1997-03-07 1998-09-22 Sunol Molecular Corporation Fusion proteins comprising bacteriophage coat protein and a single-chain t cell receptor
JP2001519143A (ja) 1997-10-02 2001-10-23 スノル・モレキュラー・コーポレーション 可溶性の一本鎖ｔ細胞レセプタータンパク質
EP1117679B9 (en) 1998-10-02 2010-07-07 Ludwig Institute For Cancer Research Tumor antigens and ctl clones isolated by a novel procedure
MXPA02005559A (es) 1999-12-06 2004-09-10 Univ Illinois Proteinas de tcr de alta afinidad y metodos.
WO2001062908A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Ahuva Nissim Chimeric and tcr phage display libraries, chimeric and tcr reagents and methods of use thereof
NZ531208A (en) 2001-08-31 2005-08-26 Avidex Ltd Multivalent soluble T cell receptor (TCR) complexes
WO2004023973A2 (en) * 2002-09-12 2004-03-25 Incyte Corporation Molecules for diagnostics and therapeutics
AU2003271904B2 (en) 2002-10-09 2009-03-05 Adaptimmune Limited Single chain recombinant T cell receptors
PT1558643E (pt) 2002-11-09 2009-08-24 Immunocore Ltd Apresentação de um receptor das células t
GB0304068D0 (en) 2003-02-22 2003-03-26 Avidex Ltd Substances
NZ561338A (en) 2005-04-01 2010-04-30 Immunocore Ltd High affinity HIV T cell receptors
EP1930433B1 (en) 2005-09-13 2016-03-16 Mie University T-cell receptor and nucleic acid encoding the receptor
GB0908613D0 (en) 2009-05-20 2009-06-24 Immunocore Ltd T Cell Reseptors
PL2755997T3 (pl) 2011-09-15 2019-01-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Receptory komórek T rozpoznające MAGE ograniczone do HLA-A1 lub HLA-CW7
SG11201400521PA (en) 2011-10-14 2014-08-28 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd ANTIBODIES TO CD1d
US9113616B2 (en) 2011-10-28 2015-08-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice having humanized TCR variable genes
GB201223172D0 (en) 2012-12-21 2013-02-06 Immunocore Ltd Method
AU2014211454B2 (en) * 2013-01-29 2018-04-05 Max-Delbruck-Centrum Fur Molekulare Medizin (Mdc) Berlin-Buch High avidity binding molecules recognizing MAGE-A1
WO2014160030A2 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Health Research, Inc. Compositions and methods for use of recombinant t cell receptors for direct recognition of tumor antigen
EP3166647A4 (en) * 2014-07-09 2018-02-14 The Regents of the University of California Engineered invariant natural killer t (inkt) cells and methods of making and using thereof
CA2956545A1 (en) 2014-08-04 2016-02-11 Fred Hutchinson Cancer Research Center T cell immunotherapy specific for wt-1
PE20171653A1 (es) 2015-04-13 2017-11-13 Pfizer Receptores del antigeno quimerico dirigidos al antigeno de maduracion de celulas b
CR20220248A (es) 2016-03-16 2022-07-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Células t transfectadas y receptores de células t de utilidad en inmunoterapias contra el cáncer
WO2017173256A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Kite Pharma, Inc. Chimeric antigen and t cell receptors and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
SMT202200306T1 (it) 2022-09-14
SG11201808797XA (en) 2018-11-29
PT3440105T (pt) 2022-05-31
KR20180132844A (ko) 2018-12-12
PL3440105T3 (pl) 2022-08-29
JP2019516357A (ja) 2019-06-20
CN109563148A (zh) 2019-04-02
IL262144A (en) 2018-11-29
RS63371B1 (sr) 2022-08-31
IL262144B2 (en) 2024-04-01
IL308831A (en) 2024-01-01
AU2022256131A1 (en) 2022-11-24
ES2914648T3 (es) 2022-06-15
PH12018502158A1 (en) 2019-07-15
CN109563148B (zh) 2022-10-14
US11505590B2 (en) 2022-11-22
CL2018002859A1 (es) 2019-04-26
CA3020214A1 (en) 2017-10-12
WO2017175006A1 (en) 2017-10-12
BR112018070741A2 (pt) 2019-02-12
RU2018135248A (ru) 2020-05-12
MX2018012318A (es) 2019-07-04
MY198621A (en) 2023-09-11
US20190092834A1 (en) 2019-03-28
EP4023668A1 (en) 2022-07-06
US20230322895A1 (en) 2023-10-12
PE20190335A1 (es) 2019-03-07
IL262144B1 (en) 2023-12-01
PH12018502158B1 (en) 2024-02-02
MA44608A (fr) 2019-02-13
CY1125331T1 (el) 2025-03-28
HUE059159T2 (hu) 2022-10-28
LT3440105T (lt) 2022-05-25
AU2017246693B2 (en) 2022-07-21
MD3440105T2 (ro) 2022-09-30
SI3440105T1 (sl) 2022-07-29
RU2018135248A3 (uk) 2020-09-23
CR20180531A (es) 2019-06-13
HRP20220865T1 (hr) 2022-10-14
EP3440105A1 (en) 2019-02-13
JP7254519B2 (ja) 2023-04-10
PE20240693A1 (es) 2024-04-10
AU2017246693A1 (en) 2018-11-22
KR102473964B1 (ko) 2022-12-06
CO2018011972A2 (es) 2019-02-08
MA44608B1 (fr) 2022-06-30
EP3440105B1 (en) 2022-04-27
DK3440105T3 (da) 2022-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA129144C2 (uk) T-клітинний рецептор
US11932689B2 (en) Engineered T cell receptors and immune therapy using the same
US10526407B2 (en) T cell receptors and immune therapy using the same
AU2017373740C1 (en) Novel T cell receptors and immune therapy using the same
US11939376B2 (en) T cell receptors and immune therapy using the same
US10527623B2 (en) T cell receptors and immune therapy using the same
EP3645573B1 (en) Novel t cell receptors and immune therapy using the same
UA125577C2 (uk) Антигензв'язуюча молекула, які містить тримерний ліганд сімейства tnf
SA516380131B1 (ar) جسم مضاد igf-1r واستخدامه كناقل علاجي لعلاج السرطان
UA127450C2 (uk) Рекомбінантний поліпептид, що зв'язується з cd123
US20210388100A1 (en) Compositions and methods regarding engineered and non-engineered gamma delta t-cells for treatment of hematological tumors
JP7510873B2 (ja) 新規操作ｔ細胞受容体およびそれを使用した免疫療法
CN119604519A (zh) 病毒肽及其用途
TWI790162B (zh) 新穎t細胞受器及使用其之免疫治療
EP4458855A1 (en) Development of novel pdl1 single-domain antibody
HK40071461A (en) T cell receptors and immune therapy using the same
HK40097693A (en) Novel engineered t cell receptors and immune therapy using the same
EA043746B1 (ru) Новые полученные методами генной инженерии t-клеточные рецепторы и иммунная терапия с их использованием
HK40014640A (en) Novel t cell receptors and immune therapy using the same
HK40014640B (en) Novel t cell receptors and immune therapy using the same