TWI901889B

TWI901889B - 胱胺的用途

Info

Publication number: TWI901889B
Application number: TW111119134A
Authority: TW
Inventors: 山下哲郎; 尾拓
Original assignee: 國立大學法人岩手大學
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2022-05-23
Publication date: 2025-10-21
Also published as: TW202312986A; WO2022249942A1; JPWO2022249942A1; JP2024032794A; JP7427308B2

Abstract

本發明之課題為提供一種以視網膜神經節細胞或視網膜視細胞為代表的視網膜之神經細胞的保護劑。就其解決手段而言，本發明之視網膜之神經細胞的保護劑係以通式：R₁-(CH₂)_m-SR₂表示之化合物或其藥學上容許之鹽作為有效成分(式中，R₁表示-NR₃R₄或碳數1至6之烷基，R₂表示氫原子或-S-(CH₂)_n-NR₅R₆，R₃至R₆為相同或不同，表示氫原子或乙醯基，m與n為相同或不同，表示2至4之整數)。

Description

胱胺的用途

本發明係關於一種以視網膜神經節細胞或視網膜視細胞為代表的視網膜之神經細胞的保護劑。

於日本，中途失明原因的第1名為青光眼。亦有40歲以上的20人中有1人罹患青光眼之報告，預期隨著高齡化社會之進行，今後青光眼病患會增加。青光眼為由於眼壓上昇(21mmHg以上)引起視網膜神經節細胞(Retinal Ganglion Cell：RGC)壞死，導致視神經異常，招致視力降低或視野狹窄，最終導致失明之疾病。因此，於對於青光眼之治療，主要採用滴眼降眼壓藥使眼壓下降之方法。惟，已知有即使在正常範圍之眼壓(未達21mmHg)亦病發青光眼之病患存在，青光眼病患全體約7成為正常眼壓青光眼(Normal Tension Glaucoma：NTG)。於正常眼壓青光眼，眼壓在正常範圍。因此，對於正常眼壓青光眼，即使進行降低眼壓之治療，其效果未必充分。從此等臨床背景而言，對於青光眼之治療方法著眼於藉由保護視網膜神經節細胞之方法，例如於專利文獻1中報導吡咯并喹啉醌具有視網膜神經節細胞的保護作用。惟，至今尚未確立藉由保護視網膜神經節細胞之青光眼之治療方法。又，視網膜色素變性或老年性黃斑變性為起源於視網膜視細胞之視網膜神經變性疾病，對於藉由保護視網膜視細胞之此等疾病之治療方法亦為相同之狀況。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特開2018-035076號公報

本發明之目的係提供一種以視網膜神經節細胞或視網膜視細胞為代表之視網膜之神經細胞的保護劑。

本發明人等以上述之點作為借鏡進行深入檢討之結果發現胱胺或半胱胺具有視網膜之神經細胞的保護作用，對於起源於視網膜神經節細胞之青光眼、起源於視網膜視細胞之視網膜色素變性或老年性黃斑變性等之視網膜神經變性疾病之預防或治療有效。

以上述見解為基礎之本發明之視網膜之神經細胞的保護劑為如請求項1所述，將通式：R₁-(CH₂)_m-SR₂表示之化合物或其藥學上容許之鹽作為有效成分(式中，R₁表示-NR₃R₄或碳數1至6之烷基，R₂表示氫原子或-S-(CH₂)_n-NR₅R₆，R₃至R₆為相同或不同，表示氫原子或乙醯基，m與n為相同或不同，表示2至4之整數)。

又，請求項2所述之視網膜之神經細胞的保護劑為於請求項1所述之視網膜之神經細胞的保護劑，化合物為下列(a)至(c)中之任一種(a)R₁為-NH₂，R₂為-S-(CH₂)₂-NH₂，m為2之胱胺、(b)R₁為-NH₂，R₂為氫原子，m為2之半胱胺、(c)R₁為-NHAc(Ac：乙醯基)，R₂為氫原子，m為2之N-乙醯基半胱胺。

又，請求項3所述之視網膜之神經細胞的保護劑為於請求項1所述之視網膜之神經細胞的保護劑，視網膜之神經細胞為視網膜神經節細胞及/或視網膜視細胞。

又，本發明之視網膜神經變性疾病之預防及/或治療劑為如請求項4所述，將通式：R₁-(CH₂)_m-SR₂表示之化合物或其藥學上容許之鹽作為有效成分(式中，R₁表示-NR₃R₄或碳數1至6之烷基，R₂表示氫原子或-S-(CH₂)_n-NR₅R₆，R₃至R₆為相同或不同，表示氫原子或乙醯基，m與n為相同或不同，表示2至4之整數)。

又，請求項5所述之視網膜神經變性疾病之預防及/或治療劑為於請求項4所述之視網膜神經變性疾病之預防及/或治療劑，視網膜神經變性疾病為青光眼、視網膜色素變性、老年性黃斑變性中之至少一種。

又，本發明之轉錄因子C/EBP同源蛋白質(CHOP)表現抑制劑為如請求項6所述，將通式：R₁-(CH₂)_m-SR₂表示之化合物或其藥學上容許之鹽作為有效成分(式中，R₁表示-NR₃R₄或碳數1至6之烷基，R₂表示氫原子或-S-(CH₂)_n-NR₅R₆，R₃至R₆為相同或不同，表示氫原子或乙醯基，m與n為相同或不同，表示2至4之整數)。

根據本發明，可提供一種以視網膜神經節細胞或視網膜視細胞為代表之視網膜之神經細胞的保護劑。

圖1為表示於實施例1中胱胺對於神經細胞(屬於源自小鼠海馬迴之神經細胞株之HT22細胞)之保護作用之圖表。

圖2為表示於實施例4中，藉由對正常眼壓青光眼模型小鼠點眼胱胺，保護視網膜神經節細胞之圖表。

圖3為表示於實施例4中抑制內網狀層變薄之圖表。

圖4為表示於實施例4中抑制視網膜變薄之圖表。

圖5為表示於實施例5中，藉由對正常眼壓青光眼模型小鼠中點眼半胱胺，保護視網膜神經節細胞之圖表。

圖6為表示於實施例5中抑制內網狀層變薄之圖表。

圖7為表示於實施例5中抑制視網膜變薄之圖表。

圖8為表示於實施例6中，藉由對視網膜色素變性模型小鼠點眼胱胺，抑制視網膜外顆粒層變薄之圖表。

圖9為表示於實施例7中，藉由對老年性黃斑變性模型小鼠點眼胱胺，抑制源自視網膜色素上皮細胞層之沉澱物數量增加之圖表。

圖10為表示於實施例7中抑制視網膜變薄之圖表。

圖11為表示於實施例8中，藉由對老年性黃斑變性模型小鼠點眼胱胺，抑制源自視網膜色素上皮細胞層之沉澱物數量增加之圖表。

圖12為表示於實施例9中，藉由對老年性黃斑變性模型小鼠點眼半胱胺，抑制源自視網膜色素上皮細胞層之沉澱物數增加之圖表。

圖13為表示於實施例10中，藉由對正常眼壓青光眼模型小鼠點眼經長期保存之胱胺或半胱胺之溶液，保護視網膜神經節細胞之圖表。

圖14為表示於實施例10中抑制內網狀層變薄之圖表。

圖15為於實施例11中，藉由對正常眼壓青光眼模型小鼠點眼胱胺，顯示抑制CHOP表發現之螢光免疫組織像。

圖16為表示於實施例12，胱胺抑制由毒胡蘿蔔素所誘導之神經細胞中之CHOP表現之圖表。

本發明之視網膜之神經細胞的保護劑為將通式：R₁-(CH₂)_m-SR₂表示之化合物或其藥學上容許之鹽作為有效成分(式中，R₁表示-NR₃R₄或碳數1至6之烷基，R₂表示氫原子或-S-(CH₂)_n-NR₅R₆，R₃至R₆為相同或不同，表示氫原子或乙醯基，m與n為相同或不同，表示2至4之整數)。

此處，碳數1至6之烷基可為直鏈狀，亦可為支鏈狀，具體而言可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、正己基等。

又，藥學上容許之鹽於化合物為酸性時可列舉：銨鹽、鈉鹽或鉀鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽或鎂鹽等鹼土類金屬鹽；精胺酸鹽或離胺酸鹽等胺基酸鹽等。於化合物為鹼性時可列舉：無機酸鹽(鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等)；有機酸鹽(乙酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、草酸鹽等)等。

上述之通式表示之化合物之具體例可列舉：R₁為-NH₂，R₂為-S-(CH₂)₂-NH₂，m為2之胱胺；R₁為-NH₂，R₂為氫原子，m為2之半胱胺；R₁為-NHAc(Ac：乙醯基)，R₂為氫原子，m為2之N-乙醯基半胱胺。又，亦可為R₁為-NH₂，R₂為氫原子，m為3之3-胺基-1-丙硫醇等。

本發明之視網膜之神經細胞的保護劑之保護對象為參與視覺信號向腦之傳達之視網膜之神經細胞，具體而言為視網膜神經節細胞或視網膜視細胞等。因此，本發明之視網膜之神經細胞的保護劑可作為起源於此等視網膜之神經細胞之視網膜神經變性疾病之預防及/或治療劑使用。視網膜神經變性疾病之具體例可列舉：起源於視網膜神經節細胞之青光眼、起源於視網膜視細胞之視網膜色素變性或老年性黃斑變性。本發明之視網膜之神經細胞的保護劑對人類或人類以外之動物之投予可為非經口投予，亦可為經口投予，可以本身已知之方法進行適合於投予方法之形態的製劑化，製劑形態以點眼劑為較佳。

點眼劑係可於溶劑中將作為有效成分之上述通式表示之化合物或其藥學上容許之鹽與緩衝劑、溶解補助劑、張力劑、穩定化劑、保存劑、黏稠劑、螯合劑、pH調整劑、清涼化劑等各種添加劑一起調配，於無菌環境下進行無菌過濾，填充於適當之滅菌容器中調製。緩衝劑之具體例可列舉：硼酸或其鹽(硼砂等)、檸檬酸或其鹽(檸檬酸鈉等)、磷酸或其鹽(磷酸一氫鈉等)、酒石酸或其鹽(酒石酸鈉等)、葡萄糖酸或其鹽(葡萄糖酸鈉等)、乙酸或其鹽(乙酸鈉等)、各種胺基酸或此等之組合。溶解補助劑之具體例可列舉：聚氧乙烯氫化蓖麻油(聚氧乙烯氫化蓖麻油60等)、聚乙二醇(macroglycol 4000等)、聚氧乙烯山梨糖醇酐高級脂肪酸酯(聚山梨酸酯80等)、聚氧乙烯(POE)-聚氧丙烯(POP)嵌段共聚物(泊洛沙姆(Poloxamer)407等)、丙二醇。張力劑之具體例可列舉：無機鹽類(氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等)、糖類(甘露醇、葡萄糖等)、多元醇(丙三醇、丙二醇等)。穩定化劑之具體例可列舉：乙二胺四乙酸鈉、環糊精、亞硫酸鹽、檸檬酸或其鹽、丁基羥基甲苯。保存劑之具體例可列舉：苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、芐索氯銨(benzethonium chloride)、葡萄糖酸氯己定(Chlorhexidine)、氯丁醇、山梨酸、山梨酸鉀、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、聚季銨鹽-1(polyquartenium-1)、聚胺基丙基雙胍(polyaminopropylbiguanide)、烷基胺基乙基甘胺酸鹽酸鹽、氯化十六烷基吡啶鎓、硫柳汞(thimerosal))。黏稠劑之具體例可列舉：聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、硫酸軟骨素鈉、玻尿酸鈉、羧甲基纖維素、羧乙烯基聚合物。螯合劑之具體例可列舉：乙二胺四乙酸鈉、檸檬酸鈉。pH調整劑之具體例可列舉：鹽酸、檸檬酸或其鹽、硼酸或其鹽、磷酸或其鹽、乙酸或其鹽、酒石酸或其鹽、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉。清涼化劑之具體例可列舉：薄荷醇、冰片、樟腦、香葉醇、檸檬烯、丁香油酚、薄荷油、桉樹油、茴香油、佛手柑油。溶劑之具體例可列舉：滅菌精製水、精製水、生理食鹽液。點眼劑之pH值只要為眼科容許之範圍，則無特別限制，通常為pH4至9之範圍，較佳為pH5至8之範圍。

作為有效成分之上述通式表示之化合物或其藥學上容許之鹽於每點眼劑1mL調配0.00001至100mg，每次1至數滴，每日1至數次點眼，藉由保護視網膜之神經細胞，對於青光眼、視網膜色素變性、老年性黃斑變性等視網膜神經變性疾病發揮預防效果或治療效果。

此外，點眼劑亦可調配其他藥學成分，例如拉坦前列素(Latanoprost)或曲伏前列素(Travoprost)等前列腺素製劑、馬來酸噻嗎洛爾(Timolol maleate)或鹽酸卡替洛爾(Carteolol)等β受體阻斷劑、鹽酸多佐胺(Dorzolamide HCl)或布林佐胺(Brinzolamide)等碳酸酐酶抑制藥之點眼用降眼壓藥等。

[實施例]

以下，藉由實施例詳細地說明本發明，惟本發明不為限定於下列之記載者。

實施例1：胱胺對於神經細胞之保護作用

(實驗方法)

使用藉由麩胺酸誘發細胞凋亡(細胞壞死)之源自小鼠海馬迴之神經細胞株之HT22細胞，評估胱胺對於神經細胞之保護作用。具體而言，對於播種於96孔盤之HT22細胞(每1孔為1.2×10³cells)，，以使最終濃度成為10μM、5μM、2μM、1μM之方式，於添加有10%FBS之DMEM培養基中添加胱胺。4小時後，以使最終濃度成為4mM之方式添加麩胺酸，於37℃、5%CO₂培養箱內培養20小時。接著，於各孔中添加細胞毒性分析試藥(細胞計數套組-8(Cell Counting Kit-8)，Dojindo公司製)10μL產生呈色反應，於3小時後測定吸光度(490nm)，將未添加麩胺酸之對照細胞之生存率作為100%，計算出細胞生存率(%)。

(實驗結果)

表示於圖1。從圖1可知，胱胺係以濃度依存地抑制HT22細胞之細胞凋亡，因此對於神經細胞具有保護作用。又，藉由其他實驗可確認胱胺阻礙由麩胺酸所誘導之細胞凋亡誘導因子(Apoptosis-inducing Facto：AIF)向核之移動，因而推測阻礙細胞凋亡誘導因子向核之移動為胱胺抑制HT22細胞之細胞凋亡的作用機制之一。

實施例2：半胱胺對於神經細胞之保護作用

進行與實施例1相同之實驗並評估之。結果為如下述，由於半胱胺亦以濃度依存地抑制HT22細胞之細胞凋亡，可確認半胱胺對於神經細胞之保護作用。

實施例3：N-乙醯基半胱胺對於神經細胞之保護作用

進行與實施例1相同之實驗並評估之。結果為如下述，由於N-乙醯基半胱胺亦抑制HT22細胞之細胞凋亡，可確認N-乙醯基半胱胺對於神經細胞具有保護作用(由於n數不足，因而未進行顯著差異檢定)。

實施例4：對正常眼壓青光眼模型小鼠點眼胱胺所致之效果

(實驗方法)

使用於正常眼壓青光眼模型實驗系被廣泛使用之N-甲基-D-天門冬胺酸(NMDA)投予小鼠(Investigative Ophthalmology & Visual Science,40,1004-1008,1999)，評估胱胺之點眼效果。具體而言，以成為40mM之方式，將NMDA溶解於生理食鹽水，將經過濾滅菌之溶液於小鼠(C57BL/6J,7週齡)兩眼之玻璃體內各投予2μL，製作正常眼壓青光眼模型小鼠。NMDA溶液於玻璃體內之投予係依照嶋澤人等之方法(日藥理誌，129,445-450,2007)，對小鼠使用異氟烷導入麻醉，藉由導管，使用連結牙科用注射針(33G)之10μL微量注射器，從角膜輪部之鞏膜進行。拔針後點眼抗炎症劑之克拉維特(Cravit)點眼藥。於玻璃體內投予NMDA溶液後立刻於兩眼，以1日3次，每次2μL點眼7日溶液，該溶液為以成為10mM之方式，將胱胺溶解於生理食鹽水並經過濾滅菌者。7日後將小鼠安樂死，取出兩眼球，以4%聚甲醛固定，切除前眼部及水晶體。接著，製作組織之凍結切片載玻片，進行蘇木精/伊紅(Hematoxylin/Eosin)染色，以相位差顯微鏡觀察，進行存在於視網膜神經節細胞層中之細胞數之計測、內網狀層厚度之測定、視網膜厚度之測定。

(實驗結果)

圖2表示存在於視網膜神經節細胞層(GCL)中之細胞數之計測結果，圖3表示內網狀層(IPL)厚度之測定結果，圖4表示視網膜(Retina)厚度之測定結果(胱胺/NMDA)。於圖2至4中，合併顯示於玻璃體內投予NMDA溶液之後立刻於兩眼，以1日3次，每次2μL點眼7日經過濾滅菌之生理食鹽水時之結果(生理食鹽水/NMDA)、以及於健康小鼠之兩眼，以1日3次，每次2μL點眼7日經過濾滅菌之生理食鹽水時之結果(對照組)(任一個之結果皆為來自3隻小鼠之兩眼之檢體(n=6)之平均值)。從圖2可知，由於胱胺有效地抑制存在於視網膜神經節細胞層之細胞數之減少，因而對於視網膜神經節細胞具有保護作用。又，從圖3及圖4可知，胱胺具有抑制內網狀層變薄之作用，抑制視網膜變薄。從以上之結果可確認胱胺之點眼對正常眼壓青光眼之預防或治療有效。

實施例5：對正常眼壓青光眼模型小鼠點眼半胱胺所致之效果

進行與實施例4相同之實驗並評估之。圖5表示存在於視網膜神經節細胞層中之細胞數之計測結果，圖6表示內網狀層厚度之測定結果，圖7表示視網膜厚度之測定結果。從圖5可知半胱胺亦有效地抑制存在於視網膜神經節細胞層中之細胞數之減少，對於視網膜神經節細胞具有保護作用。又，從圖6及圖7可知半胱胺亦具有抑制內網狀層變薄之作用，抑制視網膜變薄。從以上之結果可確認半胱胺之點眼於正常眼壓青光眼之預防或治療亦有效。

實施例6：對視網膜色素變性模型小鼠點眼胱胺所致之效果

(實驗方法)

使用作為視網膜色素變性之模型實驗系被廣泛使用之投予甲基亞硝基脲(MNU)之小鼠(Experimental Eye Research,167,145-151,2018)，評估胱胺之點眼效果。具體而言，對於小鼠(C57BL/6J,7週齡)，於腹腔內投予於生理食鹽水溶解有MNU並經過濾滅菌之溶液，藉此製造投予了MNU 60mg/kg之視網膜色素變性模型小鼠。於投予MNU後立刻於兩眼，以1日3次，每次各2μL點眼7日溶液，該溶液係以成為40mM之方式，於生理食鹽水溶解胱胺並經過濾滅菌者，。7日後將小鼠安樂死，以與實施例4相同之方法製作視網膜組織之凍結切片載玻片，進行蘇木精/伊紅染色，以相位差顯微鏡觀察，進行視網膜視細胞所存在之視網膜外顆粒層厚度之測定。

(實驗結果)

圖8表示視網膜外顆粒層(ONL)厚度之測定結果(胱胺/MNU)。於圖8合併顯示將NMDA溶液投予後立刻於兩眼，以1日3次，每次各2μL點眼7日經過濾滅菌之生理食鹽水於兩眼，1日3次時之結果(生理食鹽水/NMDA)、以及於健康小鼠之兩眼，以1日3次，每次各2μL點眼7日經過濾滅菌之生理食鹽水時之結果(對照組)(任一個之結果皆為來自6隻小鼠之兩眼之檢體(n=12)之平均值)。從圖8可知胱胺抑制由投予MNU導致視網膜視細胞變性所引起之視網膜外顆粒層變薄。從以上之結果可確認胱胺之點眼對視網膜色素變性之預防或治療有效。

實施例7：對老年性黃斑變性模型小鼠點眼胱胺所致之效果(之1)

(實驗方法)

使用作為萎縮型老年性黃斑變性之模型實驗系被廣泛使用之投予碘酸鈉(SI)之小鼠(Investigative Ophthalmology & Visual Science,58,2239-2249,2017)，評估胱胺之點眼效果。具體而言，於小鼠(C57BL/6J,8週齡)之兩眼，以1日3次，每次各2μL進行前點眼7日溶液，該溶液係以成為1mM之方式，於生理食鹽水溶解胱胺並經過濾滅菌者。前點眼後，於腹腔內投予於生理食鹽水溶解有SI並經過濾滅菌之溶液，藉此投予SI 25mg/kg，進一步，於兩眼，以1日3次，每次2μL各點眼7日溶液，該溶液係以成為1mM之方式，於生理食鹽水溶解胱胺並經過濾滅菌者。7日後將小鼠安樂死，以與實施例4相同之方法製作視網膜組織之凍結切片載玻片，進行蘇木精/伊紅染色，以相位差顯微鏡觀察，進行源自視網膜色素上皮細胞層之沉澱物(經變性之視網膜色素上皮細胞集中，並表現為色素沉澱者)數量之計測。又，取得從視神經乳頭中心部分別於鼻側及耳側約300、600、900、1200、1500μm之位置之影像，進行視網膜厚度之測定。

(實驗結果)

圖9表示源自視網膜色素上皮細胞層之沉澱物數量之計測結果(1mM胱胺/SI處理)。於圖9合併顯示於SI投予前後於兩眼，以1日3次，每次各2μL點眼7日經過濾滅菌之生理食鹽水時之結果(生理食鹽水/SI處理)、以及於健康小鼠之兩眼，以1日3次，每次各2μL點眼7日經過濾滅菌之生理食鹽水時之結果(無處置)(任一個之結果皆為來自5隻小鼠之兩眼之檢體(n=10)之平均值)。從圖9可知胱胺有效地抑制作為老年性黃斑變性之特徵標記之源自視網膜色素上皮細胞層沉澱物數之增加，藉由保護視網膜色素上皮細胞而對於視網膜視細胞具有保護作用。又，圖10表示從視神經乳頭中心部，分別於鼻側及耳側約300、600、900、1200、1500μm之位置之視網膜厚度之測定結果(1mM胱胺)。於圖10合併顯示於SI投予前後，於兩眼，以1日3次，每次2μL各點眼7日經過濾滅菌之生理食鹽水時之結果(生理食鹽水)、及以於健康小鼠之兩眼，以1日3次，每次各2μL點眼7日經過濾滅菌之生理食鹽水時之結果(無處置)(任一個之結果皆為來自5隻小鼠之兩眼之檢體(n=10)之平均值)。從圖10可知胱胺抑制視網膜變薄。從以上之結果可確認胱胺之點眼對老年性黃斑變性之預防或治療有效。

實施例8：對老年性黃斑變性模型小鼠點眼胱胺所致之效果(之2)

除了將對小鼠之SI投予量作成12.5mg/kg之外，其餘與實施例7進行相同之實驗並評估之。圖11表示源自視網膜色素上皮細胞層之沉澱物數量之計測結果。從圖11可之，對小鼠之S1投予量即使為實施例7中之投予量之1/2，胱胺亦有效地抑制作為老年性黃斑變性之特徵標記之源自視網膜色素上皮細胞層沉澱物數之增加。

實施例9：對老年性黃斑變性模型小鼠點眼半胱胺所致之效果

進行與實施例8相同之實驗並評估之。圖12表示源自視網膜色素上皮細胞層之沉澱物數量之計測結果。從圖12可知半胱胺亦有效地抑制作為老年性黃斑變性之特徵標記之源自視網膜色素上皮細胞層沉澱物數量之增加，藉由保護視網膜色素上皮細胞，對於視網膜視細胞具有保護作用。從以上之結果可確認半胱胺之點眼對於老年性黃斑變性之預防或治療亦有效。

實施例10：對正常眼壓青光眼模型小鼠點眼經長期保存之胱胺或半胱胺之溶液所致之效果

除了以成為10mM之方式，於生理食鹽水溶解胱胺或半胱胺溶解並經過濾滅菌而製成溶液，將該溶液放入聚丙烯製之1.5mL微管，蓋上蓋子，纏繞封口膜密封之，將經室溫保存6個月後之溶液對小鼠點眼之外，其餘與實施例4進行相同之實驗並評估之。圖13表示存在於視網膜神經節細胞層中之細胞數之計測結果，圖14表示內網狀層厚度之測定結果。從圖13及圖14可知，經長期保存之胱胺及半胱胺之任一溶液有效地抑制存在於視網膜神經節細胞層中之細胞數目之減少，並且具有抑制內網狀層變薄之作用。從以上之結果可確認於正常眼壓青光眼之預防或治療中，胱胺及半胱胺之點眼藥之便利性。

實施例11：檢討於正常眼壓青光眼模型小鼠中，胱胺對於視網膜神經節細胞保護效果之作用機制

(實驗方法)

已知於投予NMDA之小鼠誘發之視網膜神經節細胞壞死中，表現屬於內質網應激相關蛋白質之轉錄因子C/EBP同源蛋白質(CHOP)，以及藉由抑制CHOP之表現而抑制視網膜神經節細胞壞死(Journal of Neurochemistry,96,43-52,2006)。此處，為了確認是否藉由胱胺抑制CHOP之表現，而抑制於投予NMDA之小鼠中所誘發之視網膜神經節細胞壞死，進行免疫組織化學實驗。具體而言，於以與實施例4相同之方法製作之正常眼壓青光眼模型小鼠之兩眼，將於生理食鹽水溶解有成為10mM 之胱胺並經過濾滅菌之溶液，在下列時刻合計3次，每次各點眼2μL點眼：將NMDA溶液剛投予於玻璃體內後、將NMDA溶液投予於玻璃體內4小時後、將NMDA溶液投予於玻璃體內8小時後。在將NMDA溶液投予於玻璃體內12小時後使小鼠安樂死，以與實施例4相同之方法製作視網膜組織之凍結切片載玻片。針對製成之凍結切片載玻片進行細胞膜穿透處理後，使其與作為一次抗體之屬於抗CHOP抗體之Anti-CHOP/GADD153 polyclonal antibody 15204-1-AP(Thermo)及作為二次抗體之Polyclonal Goat Anti-Rabbit antibody Alexa Fluor 546 A11035(Thermo)進行反應，並以螢光顯微鏡觀察之。

(實驗結果)

圖15表示螢光免疫組織影像(胱胺10mM/NMDA)。於圖15合併顯示，在將NMDA溶液剛投予於玻璃體內之後、將NMDA溶液投予於玻璃體內4小時後、將NMDA溶液投予於玻璃體內8小時後合計3次，將經過濾滅菌之生理食鹽水於兩眼各點眼2μL時之結果(生理食鹽水/NMDA)、及於健康小鼠之兩眼，於小鼠安樂死之12小時前、8小時前、4小時前合計3次，將經過濾滅菌之生理食鹽水各點眼2μL時之結果(對照組)。從圖15可知於將胱胺點眼時未觀察到點眼生理食鹽水時所觀察到之視網膜神經節細胞層中由CHOP之表現所致之螢光。從以上之結果可知CHOP之表現抑制作用係作為胱胺對於視網膜神經節細胞之保護效果之作用機制。

實施例12：確認於神經細胞中胱胺之CHOP表現抑制作用

(實驗方法)

使用屬於源自小鼠海馬迴之神經細胞株之HT22細胞，確認胱胺之 CHOP表現之抑制作用。具體而言，將播種於100mm盤之HT22細胞(8.0×10⁵cells/mL)以添加了10%FBS之DMEM培養基，於37℃、5%CO₂培養箱內培養24小時後，與添加了最終濃度成為5μM之胱胺之培養基交換，再培養24小時。接著，將屬於內質網應激誘導物質之毒胡蘿蔔素，以最終濃度成為0.1μM之方式添加於培養基中，培養6小時後將細胞回收。對回收之細胞進行為了將蛋白質可溶化之音振作用(sonication)後，將利用離心分離獲得之離心上清液(可溶化蛋白質)20μg之西方墨點法，使用屬於抗CHOP抗體之Anti-CHOP/GADD153 polyclonal antibody 15204-1-AP(Thermo)進行，藉由獲得之信號之影像分析調查CHOP之表現量。

(實驗結果)

圖16表示CHOP之信號強度(胱胺/毒胡蘿蔔素處理、無處理之HT22細胞中CHOP之信號強度作為1(對照組)之相對值)。於圖16合併顯示為了添加胱胺使用之經過濾滅菌之生理食鹽水、以及相同容量之經過濾滅菌之生理食鹽水替代胱胺添加時之結果(生理食鹽水/毒胡蘿蔔素處理)。從圖16可知胱胺有效地減弱由毒胡蘿蔔素所致之CHOP信號強度之上昇。從以上之結果可確認於神經細胞中胱胺之CHOP表現抑制作用。

[產業上之可利用性]

本發明於可提供以視網膜神經節細胞或視網膜視細胞為代表之視網膜之神經細胞的保護劑，就此點而言具有產業上之可利用性。

無。

Claims

一種胱胺的用途，係用於製造青光眼或老年性黃斑變性之預防及/或治療劑。
一種胱胺的用途，係用於製造轉錄因子C/EBP同源蛋白質(CHOP)表現抑制劑。