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TWI901797B - 抗-sema3a抗體及其用於治療視網膜栓塞疾病之用途 - Google Patents

抗-sema3a抗體及其用於治療視網膜栓塞疾病之用途

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TWI901797B
TWI901797B TW110139299A TW110139299A TWI901797B TW I901797 B TWI901797 B TW I901797B TW 110139299 A TW110139299 A TW 110139299A TW 110139299 A TW110139299 A TW 110139299A TW I901797 B TWI901797 B TW I901797B
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里歐 湯瑪斯
瑞可 亞力山德 貝克
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德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司
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Abstract

本發明大體上係關於靶向信號素(semaphorin) 3A (Sema3A)之抗體及其片段，其用於治療視網膜栓塞疾病。

Description

抗-SEMA3A抗體及其用於治療視網膜栓塞疾病之用途
本發明大體上係關於靶向信號素(semaphorin) 3A (Sema3A)之抗體及其片段，其用於治療視網膜栓塞疾病。
視網膜靜脈阻塞(RVO)係限制或阻斷血流離開視網膜且係糖尿病性視網膜病變後第二常見的視網膜血管病症。導致不同程度之視力喪失、中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)及分支視網膜靜脈阻塞(BRVO)可因可導致全盲的黃斑水腫而變得複雜。
沒有治療可逆轉視網膜靜脈阻塞。然而，虹膜或視網膜新生血管生成或黃斑水腫可利用抗-VEGF或類固醇注射液來管理。其他治療方法包括使用雷射及手術。然而，對於罹患RVO的患者，現有治療方法無一證明是可靠、安全且成功之結果。因此，對於用於有效治療視網膜栓塞疾病之新治療方法仍有未滿足的需求。
Sema3A係一種屬於3類信號素家族(Sema3)之內源性分泌蛋白，其最初經識別為軸突導向分子且參與血管路徑搜尋及網路形成。神經纖毛蛋白質1及2 (Nrp1及Nrp2)及A/D型叢蛋白(Plxn)充作內皮細胞(EC)之表面上Sema3受體複合體之配位體結合及信號轉導亞單元。作為Sema3家族之特殊成員，Sema3A最初僅結合至Nrp1且然後與叢蛋白A1–4組合為複合體(Nrp1/PlexA1–4)。在此受體複合體中，Nrp1充作結合元件，而PlexA1–4充作信號轉導元件。
人類信號素3A係如揭示於SEQ ID NO: 22中之蛋白質且在NCBI參考序列NP_006071.1下可得。此外，人類Sema3A以基因ID：10371 (NCBI)編碼。
已在腫瘤血管生成及轉移方面研究Sema3A多年，但其於視網膜新生血管生成方面之效應仍不清楚。本發明者已例示，信號素3A由缺氧性視黃基神經節細胞分泌且充作血管排斥(vasorepulsive)提示。Sema3A藉由誘導此等細胞中之細胞骨架塌陷來推開新生血管離開缺血區域。在不希望受理論約束下，本發明者已假設，此將解釋為何缺血區域之血管重建不發生，而相反地，Sema3A之上調會導致病理新生血管生成進入玻璃體區域。
信號素3A由缺血/無血管視網膜中之缺氧性神經元分泌，由此抑制視網膜之血管再生且增強病理性視網膜前新生血管生成。
本發明者已利用其對Sema3A生物學的理解及對於視網膜之影響以開發用於治療視網膜栓塞疾病之新治療策略。因此， 在第一態樣中，本發明提供一種用於治療視網膜栓塞疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： -  重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列(H-CDR3)；及 -  輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 5所示的胺基酸序列(L-CDR2)；SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列(L-CDR3)。
在一個實施例中，該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： -  重鏈可變區，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同之胺基酸序列；及 -  輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同之胺基酸序列； 其中： -  該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列(H-CDR3)；及 -  該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 5所示的胺基酸序列(L-CDR2)；SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列(L-CDR3)。
在另一個實施例中，該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： -  重鏈可變區，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同之胺基酸序列；及 -  輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同之胺基酸序列。
在又另一個實施例中，該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： -  重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10所示的胺基酸序列；及 -  輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列。
在另一個實施例中，該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： a. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列； b. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列； c. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 12所示的胺基酸序列；或 d. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列。
在又另一個實施例中，該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： -  重鏈，其包含SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列，較佳由其組成；及 -  輕鏈，其包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列，較佳由其組成。
在一個特定實施例中，該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： a. 包含SEQ ID NO: 14所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列之輕鏈； b. 包含SEQ ID NO: 16所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列之輕鏈； c. 包含SEQ ID NO: 17所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 18所示的胺基酸序列之輕鏈；或 d. 包含SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列之輕鏈。
在一個特佳實施例中，該抗-Sema3A抗體為人類化抗-Sema3A抗體。
在一個較佳實施例中，該視網膜栓塞疾病係選自由以下組成之群：視網膜靜脈阻塞(RVO) (包括中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、半球視網膜靜脈阻塞(HRVO)、分支視網膜靜脈阻塞(BRVO))及視網膜動脈阻塞疾病。在又一個較佳實施例中，該視網膜栓塞疾病係選自由以下組成之群：視網膜靜脈阻塞(RVO)，包括中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、半球視網膜靜脈阻塞(HRVO)及分支視網膜靜脈阻塞(BRVO)。
在第二態樣中，本發明提供一種用於治療視網膜栓塞疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其結合至如以SEQ ID NO: 22所示之人類Sema3A之胺基酸區域370至382內的至少一個胺基酸殘基。較佳地，該視網膜栓塞疾病係選自由以下組成之群：視網膜靜脈阻塞(RVO) (包括中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、半球視網膜靜脈阻塞(HRVO)、分支視網膜靜脈阻塞(BRVO))及視網膜動脈栓塞疾病。
在一個實施例中，該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段結合至如以SEQ ID NO: 21 (DSTKDLPDDVITF)所示的胺基酸區域內的至少一個胺基酸殘基。在一個較佳實施例中，本發明提供一種用於治療視網膜栓塞疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其結合如以SEQ ID NO: 21所示的胺基酸區域。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-Sema3A或抗原結合片段，其用於藉由抑制SemaA之血管阻遏效應，藉由改良視網膜之血管再生及/或藉由降低血液視網膜屏障之滲透性來治療靜脈阻塞疾病。
在一個較佳實施例中，本發明提供一種抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其用於治療罹患糖尿病性黃斑缺血的患者中之視網膜栓塞疾病，較佳藉由促進缺血性視網膜內的血管再生(血管重建)及預防眼睛玻璃體區域之病理性新生血管生成。
在另一個較佳實施例中，本發明提供一種抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其用於治療罹患糖尿病性黃斑水腫的患者中之視網膜栓塞疾病，較佳藉由降低血液視網膜屏障之滲透性。
在另一個較佳實施例中，本發明提供一種抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其用於藉由抑制Sema3A誘導之血液視網膜屏障之滲透性及/或Sema3A誘導之來自缺血區域之血管退化來治療視網膜栓塞疾病。
在第四態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑，其用於治療視網膜栓塞疾病。
定義
抗體或免疫球蛋白之一般結構為熟習此項技術者所熟知，此等分子為異四聚體糖蛋白，通常為約150,000道耳頓，由兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈組成。各輕鏈經一個二硫鍵共價連接至重鏈以形成異二聚體，及異三聚體分子透過異二聚體之兩條相同重鏈之間的共價二硫鍵聯形成。雖然輕鏈及重鏈經一個二硫鍵連接在一起，但兩條重鏈之間的二硫鍵聯次數因免疫球蛋白同型物而不同。各重鏈及輕鏈亦具有規則間隔之鏈內二硫橋。各重鏈在胺基端具有可變域(V H= 可變重鏈)，接著係三個或四個恆定域(C H1、C H2、C H3及C H4)、以及C H1與C H2之間的鉸鏈區。各輕鏈具有兩個域，即胺基端可變域(V L= 可變輕鏈)及羧基端恆定域(C L)。V L域非共價地與V H域締合，而C L域通常經二硫鍵共價地連接至C H1域。據信，特定胺基酸殘基在輕鏈可變域與重鏈可變域之間形成介面(Chothia等人，1985，J. Mol. Biol. 186:651-663)。
可變域內的某些域在不同抗體之間有很大差異，亦即係「超變」。此等超變域含有直接參與各特定抗體之結合及對其特異性抗原決定基之特異性之殘基。在輕鏈及重鏈可變域中之超變性集中在稱為互補決定區(CDR)或超變迴路(HVL)之三個區段中。CDR藉由在以下中之序列比較經定義：Kabat等人，1991：Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.，而HVL根據可變域之三維結構在結構上定義，如Chothia及Lesk，1987，J. Mol. Biol. 196: 901-917所述。在此兩種方法產生輕微不同的CDR識別之處，以結構定義為較佳。如Kabat所定義，CDR-L1定位在輕鏈可變域中之約殘基24至34處，CDR-L2定位在約殘基50至56處，及CDR-L3定位在約殘基89至97處；CDR-H1定位在重鏈可變域中之約殘基31至35處，CDR-H2定位在約殘基50至65處，及CDR-H3定位在約殘基95至102處。因此，重鏈及輕鏈之CDR1、CDR2、CDR3限定針對於給定抗體具特異性之獨特功能性質。
重鏈及輕鏈中各者內的三個CDR間隔架構區(FR)，該架構區含有傾向於不太可變之序列。從重鏈及輕鏈可變域之胺基端至羧基端，FR及CDR按以下順序配置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。FR之大程度β-摺疊組態使得該等鏈各者內的CDR彼此以及與來自另一鏈之CDR親密接近。所得構象促成抗原結合位點(參見Kabat等人，1991，NIH Publ. No. 91-3242，第I卷，第647至669頁)，儘管並非所有CDR殘基必然直接參與抗原結合。
FR殘基及Ig恆定域不直接參與抗原結合，但有助於抗原結合及/或介導抗體效應功能。一些FR殘基被認為以至少三種方式於抗原結合上具有顯著效應：藉由非共價直接結合至抗原決定基，藉由與一或多個CDR殘基相互作用，及藉由影響重鏈與輕鏈之間的介面。恆定域不直接參與抗原結合但介導各種Ig效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)。
脊椎動物免疫球蛋白之輕鏈基於恆定域之胺基酸序列被指派給兩個明顯不同類別之一：κ (kappa/κ)及λ (lambda/λ)。藉由比較，根據恆定域之序列，哺乳動物免疫球蛋白之重鏈經指派給五個主要類別之一：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgG及IgA進一步分為亞類(同型物)，例如分別為IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA 1及IgA 2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及µ。熟知天然免疫球蛋白類別之亞單元結構及三維組態。
術語「抗體」、「抗-Sema3A抗體」、「人類化抗-Sema3A抗體」及「變異體人類化抗-Sema3A抗體」在本文中在最廣義意義上使用且尤其涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，諸如展現所需生物活性(例如結合至Sema3A)之抗體之可變域及其他部分。
術語「單株抗體」 (mAb)係指實質上同質之抗體群體之抗體；亦即，該群體中之個別抗體係相同的，除了可以少量存在的天然存在之突變。單株抗體係高度特異性的，係針對於單一抗原決定子，「抗原決定基」。因此，修飾語「單株」指示實質上實質抗體群體，其針對於相同抗原決定基且不應被解釋爲需要藉由任何特定方法產生抗體。應理解，單株抗體可藉由此項技術中已知的任何技術或方法來製備；包括例如此項技術中已知的融合瘤方法(Kohler等人，1975，Nature 256:495)、或重組DNA方法(參見，例如美國專利第4,816,567號)、或使用噬菌體抗體庫，使用描述於Clackson等人，1991，Nature 352: 624-628、及Marks等人，1991，J. Mol. Biol. 222: 581-597中之技術重組產生的單株之分離方法。
嵌合抗體由來自一個物種(例如非人類哺乳動物，諸如小鼠)之抗體之重鏈及輕鏈可變區及另一物種(例如人類)抗體之重鏈及輕鏈恆定區組成及可藉由將編碼來自第一物種(例如小鼠)之抗體之可變區之DNA序列連接至來自第二(例如人類)物種之抗體之恆定區之DNA序列且用含有經連接序列之表現載體轉形宿主以允許其產生嵌合抗體而獲得。或者，嵌合抗體亦可係其中重鏈及/或輕鏈之一或多個區或域與來自另一免疫球蛋白類別或同型物或來自一致或生殖系序列之單株抗體中之對應序列相同、同源或為其變異體之抗體。嵌合抗體可包括此類抗體之片段，限制條件為抗體片段展現其親本抗體之所需生物活性，例如結合至相同抗原決定基(參見，例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855)。
術語「抗體片段」、「抗原結合片段」、「抗-Sema3A抗體片段」、「人類化抗-Sema3A抗體片段」、「變異體人類化抗-Sema3A抗體片段」係指全長抗-Sema3A抗體之一部分，其中保留可變區或功能能力，例如特異性Sema3A抗原決定基結合。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab') 2、Fd、Fv、scFv及scFv-Fc片段、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體、微型抗體、由抗體片段形成之雙功能抗體、及由抗體片段形成之多特異性抗體。
可用酵素，諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理全長抗體以產生有用之抗體片段。木瓜蛋白酶消化用於產生兩個稱為「Fab」片段的相同抗原結合抗體片段，各具有單一抗原結合位點、及殘餘「Fc」片段。Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之C H1域。胃蛋白酶處理產生F(ab') 2片段，該片段具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原。
Fab'片段與Fab片段之不同之處在於存在另外殘基，包括來自C H1域的C端處的抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。F(ab') 2抗體片段為經鉸鏈區中之半胱胺酸殘基連接之Fab'片段對。亦已知抗體片段之其他化學偶聯。
「Fv」片段含有完全抗原識別及結合位點，其由一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域呈緊密、非共價締合之二聚體組成。在本組態中，各可變域之三個CDR相互作用以限定V H-V L二聚體之表面上的抗原結合位點。總言之，六個CDR賦予抗體抗原結合特異性。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段係包含抗體之V H及V L域之單鏈Fv變異體，其中該等域存在於單一多肽鏈中。單鏈Fv能夠識別及結合抗原。scFv多肽可視需要亦含有定位在V H域與V L域之間以便促進形成scFv結合抗原所需的三維結構之多肽連接子(參見，例如Pluckthun，1994，The Pharmacology of monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag，New York，第269-315頁)。
其他識別的抗體片段包括彼等包含一對串接Fd區段(V H-C H1-V H-C H1)以形成一對抗原結合區之抗體片段。此等「線性抗體」可係雙特異性或單特異性的，如例如Zapata等人，1995，Protein Eng. 8(10):1057-1062中所述。
人類化抗體或人類化抗體片段係特異性類型之嵌合抗體，其包括免疫球蛋白胺基酸序列變異體或其片段，其能夠結合至預先確定之抗原且其包含一或多個具有實質上人類免疫球蛋白之胺基酸序列之FR及一或多個具有實質上非人類的免疫球蛋白之胺基酸序列之CDR。此種非人類的胺基酸序列(經常稱為「輸入」序列)通常取自「輸入」抗體域，特別是可變域。一般而言，人類化抗體包含非人類的抗體之至少CDR或HVL，其插入在人類重鏈或輕鏈可變域之FR之間。
本發明描述特異性人類化抗-Sema3A抗體，其含有衍生自鼠類或嵌合抗體之插入在人類生殖系序列重鏈及輕鏈可變域之FR之間的CDR。應理解，某些鼠類FR殘基可對人類化抗體之功能重要且因此某些人類生殖系序列重鏈及輕鏈可變域殘基經修飾為與對應鼠類序列之其等殘基相同。
如本文所用，表述「本發明抗體 」及「本發明之抗-Sema3A抗體」係指本文所述的抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。較佳地，該表述係指包含重鏈可變區之任何抗體，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列(H-CDR3)，及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 5所示的胺基酸序列(L-CDR2)；SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列(L-CDR3)。
在一個態樣中，人類化抗-Sema3A抗體包含至少一個(且通常兩個)可變域(諸如包含在例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc及Fv片段中)中之實質上全部，其中所有(或實質上所有)的CDR對應於非人類的免疫球蛋白之其等CDR，且在本文中特別地，CDR為鼠類序列，及FR為人類免疫球蛋白一致或生殖系序列之其等FR。在另一個態樣中，人類化抗-Sema3A抗體亦包含免疫球蛋白Fc區之至少一部分，通常係人類免疫球蛋白之至少一部分。通常，抗體將含有兩條輕鏈以及重鏈之至少可變域。適當地，抗體亦可包含重鏈之C H1區、鉸鏈區、C H2區、C H3區及/或C H4區中之一者或多者。
人類化抗-Sema3A抗體可選自任何類別之免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE、及任何同型物，包括IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA 1及IgA 2。例如，恆定域可係補體固定恆定域，其中期望人類化抗體展現細胞毒性活性，及同型物通常為IgG 1。在此種細胞毒性活性非所需之情況下，恆定域可係另一種同型物(例如IgG 2)的。替代人類化抗-Sema3A抗體可包含來自超過一種免疫球蛋白類別或同型物之序列，及選擇特定恆定域以最佳化所需效應功能在此項技術之尋常技能範圍內。在特定實施例中，本發明提供抗體，其為IgG1抗體且更特別是特徵係減少之效應功能之IgG1抗體。
較佳地，本發明之抗-Sema3A抗體係經形式化為IgG1KO之人類化抗體。
人類化抗-Sema3A抗體之FR及CDR或HVL不需要精確對應於親本序列。例如，輸入CDR或HVL或一致或生殖系FR序列中之一或多個殘基可藉由取代、插入或缺失改變(例如誘變)使得所得胺基酸殘基不再與任一親本序列中之對應位置中之原始殘基相同但抗體卻保留結合至Sema3A之功能。此類改變通常將不會是廣泛的且將係保守改變。通常，人類抗體殘基之至少75%將對應於親本一致或生殖系FR及輸入CDR序列之其等人類抗體殘基，更經常至少90%，且最頻繁大於95%、或大於98%或大於99%。
影響重鏈可變區與輕鏈可變區之間的介面(「V L-V H介面」)之免疫球蛋白殘基係影響兩條鏈相對於彼此之接近或定向之其等免疫球蛋白殘基。可參與鏈間相互作用之某些殘基包括V L殘基34、36、38、44、46、87、89、91、96及98及V H殘基35、37、39、45、47、91、93、95、100及103 (利用Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987)中所述的編號系統)。美國專利第6,407,213號亦討論殘基(諸如V L殘基43及85、及V H殘基43及60)亦可參與此種相互作用。雖然此等殘基僅針對人類IgG指出，但其適用於全部物種。選擇合理預期參與鏈間相互作用之重要抗體殘基以用於取代成一致序列。
術語「一致序列」及「一致抗體」係指胺基酸序列，其包含在任何特定類別、同型物或亞單元結構之所有免疫球蛋白之各位置處最頻繁發生之胺基酸殘基，例如人類免疫球蛋白可變域。一致序列可基於特定物種或許多物種之免疫球蛋白。「一致」序列、結構或抗體應理解為涵蓋如描述於某些實施例中之一致人類序列，及應理解為係指包含在任何特定類別、同型物或亞單元結構之所有人類免疫球蛋白之各位置處最頻繁發生之胺基酸殘基之胺基酸序列。因此，一致序列含有在各位置處具有存在於一或多個已知免疫球蛋白中之胺基酸之胺基酸序列，但其可不完全複製任何單一免疫球蛋白之整個胺基酸序列。可變區一致序列及其變異體並非從任何天然產生之抗體或免疫球蛋白獲得。Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.。重鏈及輕鏈一致序列及其變異體之FR提供用於製備人類化抗-Sema3A抗體之有用序列。參見，例如，美國專利第6,037,454號及第6,054,297號。
人類生殖系序列天然存在於人類群體中。其等生殖系基因之組合產生抗體多樣性。抗體之輕鏈之生殖系抗體序列來自保守之人類生殖系κ或λ v-基因及j-基因。類似地，重鏈序列來自生殖系v-、d-及j-基因(LeFranc, M-P及LeFranc, G，「The Immunoglobulin Facts Book」，Academic Press，2001)。
「經分離」抗體係已識別且從其天然環境之組分分離及/或回收之抗體。抗體的天然環境之污染物組分係可干擾抗體之診斷或治療用途之其等材料，且可為酵素、激素或其他蛋白質或非蛋白質溶質。在一個態樣中，抗體將經純化至按抗體之重量計至少大於95%的分離。
術語「抗體性能」係指促成抗原的抗體識別或抗體在體內之有效性之因子/性質。在一個較佳實施例中，其係指抗體防止視網膜細胞中細胞骨架塌陷之能力。抗體之胺基酸序列之變化可影響抗體性質，諸如折疊，且可影響物理因素，諸如抗體結合至抗原之初始速率(k a)、抗體從抗原之解離常數(k d)、抗體對抗原之親和力常數(Kd)、抗體之構象、蛋白質穩定性及抗體之半衰期。
如本文所用，術語「相同」或「一致性百分比」在兩個或更多個核酸或多肽序列之上下文中係指為相同或當出於最大一致性比較及比對時具有指定百分比之核苷酸或胺基酸殘基為相同之兩個或更多個序列或子序列。為了確定一致性百分比，出於最佳比較目的而比對序列(例如可將間隙引入於第一胺基酸或核酸序列之序列中以與第二胺基或核酸序列最佳比對)。然後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之位置由與第二序列中之對應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在該位置處係相同的。兩個序列之間的一致性百分比係該等序列共有的相同位置數之函數(亦即，一致性% =相同位置數/總位置數(例如重疊位置) x 100)。在一些實施例中，所比較的兩個序列在將間隙引入於序列中後適當地為相同長度(例如排除延伸至所比較的序列以外的另外序列)。例如，當比較可變區序列時，不考慮前導及/或恆定域序列。就兩個序列之間的序列比較而言，「相應」CDR係指兩個序列中相同位置中之CDR (例如各序列之CDR-H1)。
兩個序列之間的一致性百分比或相似性百分比之確定可使用數學演算法來實現。用於兩個序列之比較之數學演算法之一種較佳非限制性實例係Karlin及Altschul，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268之演算法，如Karlin及Altschul，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877中經改良。將此演算法併入至Altschul等人，1990，J. Mol. Biol. 215:403-410之NBLAST及XBLAST程式中。可利用NBLAST程式，分數=100，字長=12進行BLAST核苷酸搜尋，以獲得與編碼所關注蛋白質之核酸同源之核苷酸序列。BLAST蛋白質搜尋可利用XBLAST程式，分數=50，字長=3進行，以獲得與所關注蛋白質同源之胺基酸序列。為了出於比較目的來獲得有間隙比對，有間隙BLAST可如Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402中所述使用。或者，PSI-Blast可用於進行反復搜尋，其偵測分子之間的遠側關係(同上)。當使用BLAST、有間隙BLAST及PSI-Blast程式時，可使用相應程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。用於比較序列之數學演算法的另一個較佳非限制性實例為Myers及Miller，CABIOS (1989)之演算法。將此演算法併入至ALIGN程式(版本2.0)中，該ALIGN程式係GCG序列比對軟體包之一部分。當使用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120加權殘基表、12之間隙長度罰分及4之間隙罰分。用於序列分析之另外演算法為此項技術中已知且包括如Torellis及Robotti，1994，Comput. Appl. Biosci. 10:3-5中所述的ADVANCE及ADAM；及描述於Pearson及Lipman，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8中之FASTA。在FASTA內，ktup為設定搜尋之敏感度及速度的控制選項。若ktup=2，則藉由查看比對的一對殘基來發現所比較的兩個序列中之類似區域；若ktup=1，則檢查單一比對之胺基酸。對於蛋白質序列，ktup可設定為2或1，或對於DNA序列設定為1至6。若未指定ktup，則對於蛋白質預設為2及對於DNA預設為6。或者，可使用CLUSTAL W演算法進行蛋白質序列比對，如Higgins等人，1996，Methods Enzymol. 266:383-402所述。
如本文所用，表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用且所有此類名稱包括其子代。因此，「轉形體」及「轉形細胞」包括初代個體細胞及由其衍生之培養物而無需考慮轉移次數。
術語「哺乳動物」出於治療目的係指歸類為哺乳動物之任何動物，包括人類、飼養及農場動物、及動物園、運動或寵物動物，諸如狗、馬、貓、牛及類似者。較佳地，該哺乳動物為人類。
如本文所用，「栓塞疾病」係指在血管內部形成血塊，從而阻礙血液流過循環系統。較佳地，表述「視網膜栓塞疾病」係指選自以下之視網膜栓塞疾病：視網膜靜脈阻塞(包括中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、半球視網膜靜脈阻塞(HRVO)、分支視網膜靜脈阻塞(BRVO))及視網膜動脈栓塞疾病。在一個較佳實施例中，表述「視網膜栓塞疾病」係指視網膜靜脈阻塞(RVO)。
視網膜靜脈阻塞係糖尿病性視網膜病變後最常見的視網膜血管疾病。取決於被有效堵塞的視網膜靜脈引流面積，其大致歸類為中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、半球視網膜靜脈阻塞(HRVO)或分支視網膜靜脈阻塞(BRVO)中之任一者。已觀測到，此等中之各者具有兩個亞型。RVO之呈現一般伴隨可變之無痛性視力損失，伴隨由視網膜血管扭曲、視網膜出血(斑點及火焰形狀)、棉絮斑、視神經盤腫脹及黃斑水腫組成之眼底發現之任何組合。在CRVO中，視網膜出血會見於眼底之所有四個象限中，而於HRVO中此等受限於上眼底半球或下眼底半球。在BRVO中，出血主要局限於藉由堵塞的分支視網膜靜脈引流之區域。視力損失繼發於黃斑水腫或缺血。
「疾病」或「病症」如本文所用為將受益於用本文所述的人類化抗-Sema3A抗體治療之任何病狀。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易受所討論病症影響之其等病理狀況。
術語「玻璃體內注射」在此項技術中具有其正常含義且係指將抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段引入至患者之玻璃體中。
術語「皮下投與」係指在動物或人類患者之皮膚下，較佳在位於皮膚與底下組織間之空穴(pocket)中，藉由相對緩慢持續地自藥物貯器(receptacle)遞送來引入抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。向上並遠離底下組織捏或拉皮膚來產生空穴。
術語「皮下輸注」係指在動物或人類患者之皮膚下，較佳在位於皮膚與皮下組織間之空穴中，歷時一段時間(包括但不限於30分鐘或更短、或90分鐘或更短)藉由相對緩慢持續地自藥物貯器遞送來引入藥物。視需要，該輸注可藉由皮下植入藥物遞送泵(植入於動物或人類患者之皮膚下)來進行，其中該泵歷時預定時間段(諸如30分鐘、90分鐘或跨越治療方案長度之時間段)遞送預定量之藥物。
術語「皮下速注(bolus)」係指在動物或人類患者之皮膚下方投與藥物，其中速注藥物遞送短於約15分鐘，在另一個態樣中，短於5分鐘，且在又另一個態樣中，短於60秒。在又另一個態樣中，投與係在位於皮膚與皮下組織間之空穴中，其中該空穴可藉由向上並遠離底下組織捏或拉皮膚來產生。
術語「治療有效量」用於指緩解或改善所治療病症之症狀中之一者或多者的抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之量。在如此做時，亦即該量具有有益患者結果。功效可根據待治療的病狀以習知方式測定。例如，在以表現Sema3A之細胞表徵之眼睛/視網膜疾病或病症中，功效可藉由確定反應速率(例如恢復視力)或藉由評估直至疾病進展之延遲時間來測量。
術語「治療(treatment)」及「療法(therapy)」及類似者如本文所用意欲包括針對疾病或病症之治療以及預防或抑制措施，其導致任何臨床上期望或有益效應，包括但不限於緩和或緩解一或多種症狀，消退、減慢或停止疾病或病症之進展。因此，例如，該術語治療包括在疾病或病症之症狀發作之前或之後投與抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段由此預防或去除疾病或病症之一或多種徵兆。作為另一個實例，該術語包括在疾病之臨床症狀表現之後投與抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段以對抗疾病之症狀。此外，在發作之後且在已發展出臨床症狀之後投與抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中投與影響疾病或病症之臨床參數，無論治療是否導致疾病之改善，包括如本文所用的「治療」或「療法」。此外，只要本發明之組合物單獨或與另一治療劑的組合緩合或改善所治療病症之至少一種症狀，與在不使用抗-Sema3A抗體組合物或其抗原結合片段下的該症狀相比，不論病症之所有症狀是否得以緩解，結果應視為對潛在病症之有效治療。
術語「包裝插入物」用於指通常包括在治療產品之市售包裝中之說明書，該說明書包含有關適應症、使用、投與、禁忌症及/或關於使用此類治療產品之警告的資訊。
用於治療視網膜栓塞疾病之本發明抗體
在第一態樣中，本發明係關於一種用於治療視網膜栓塞疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。
在一個較佳實施例中，該視網膜栓塞疾病係選自由以下組成之群：視網膜靜脈阻塞(RVO) (包括中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、半球視網膜靜脈阻塞(HRVO)、分支視網膜靜脈阻塞(BRVO))及視網膜動脈阻塞疾病。
在另一個較佳實施例中，該抗體為人類化抗-Sema3A抗體，更佳為人類化單株抗-Sema3A抗體。
在初始表徵中，藉由將鼠類抗體之CDR放置於人類一致重鏈及輕鏈可變域之FR中且此外藉由工程化具有不同改變之FR來產生靶向Sema3A變異體之抗體文庫。此導致具有如本文所揭示的增強性質之針對於Sema3A之人類化抗體。本發明抗體之序列示於下表1中。
表 1 ：
名稱 胺基酸序列 SEQ ID NO
HCDR1 SYYMS SEQ ID NO: 1
HCDR2 TIIKSGGYAY YPDSVKD SEQ ID NO: 2
HCDR3 GGQGAMDY SEQ ID NO: 3
LCDR1 RASQSIGDYL H SEQ ID NO: 4
LCDR2 YASQSIS SEQ ID NO: 5
LCDR3 QQGYSFPYT SEQ ID NO: 6
VH – 變異體1    SEQ ID NO: 7
VH – 變異體2    SEQ ID NO: 8
VH – 變異體3    SEQ ID NO: 9
VH - 變異體4    SEQ ID NO: 10
VL – 變異體a SEQ ID NO: 11
VL – 變異體b    SEQ ID NO: 12
VL - 變異體c    SEQ ID NO: 13
重鏈 - 純系I    SEQ ID NO: 14
輕鏈 - 純系I    SEQ ID NO: 15
重鏈 - 純系II    SEQ ID NO: 16
重鏈 - 純系III    SEQ ID NO: 17
輕鏈 – 純系III    SEQ ID NO: 18
重鏈 - 純系IV    SEQ ID NO: 19
輕鏈 – 純系IV    SEQ ID NO: 20
在一個實施例中，本發明提供一種用於治療視網膜栓塞疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： -  重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列(H-CDR3)；及 -  輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 5所示的胺基酸序列 (L-CDR2)；SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列(L-CDR3)。
在另一個實施例中，本發明提供一種用於治療視網膜栓塞疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： -  重鏈可變區，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同之胺基酸序列；及 -  輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同之胺基酸序列。
在另一個實施例中，本發明提供一種用於治療視網膜栓塞疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： -  重鏈可變區，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同之胺基酸序列；及 -  輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同之胺基酸序列。 其中： -  該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列(H-CDR3)；及 -  該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 5所示的胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列(L-CDR3)。
在又另一個實施例中，本發明提供一種用於治療視網膜栓塞疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： -  重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10所示的胺基酸序列；及 -  輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列。
在一個較佳實施例中，本發明提供一種用於治療視網膜栓塞疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： -  可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列； -  可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列； -  可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 12所示的胺基酸序列；或 -  可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列。
在又另一個實施例中，本發明提供一種用於治療視網膜栓塞疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： -  重鏈，其包含SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列，較佳由其組成；及 -  輕鏈，其包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列，較佳由其組成。
在一個特定實施例中，本發明係關於一種用於治療視網膜栓塞疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含： a. 包含SEQ ID NO: 14所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列之輕鏈，該抗體稱為「純系I」； b. 包含SEQ ID NO: 16所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列之輕鏈，該抗體稱為「純系II」； c. 包含SEQ ID NO: 17所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 18所示的胺基酸序列之輕鏈，該抗體稱為「純系III」；或 d. 包含SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列之輕鏈，該抗體稱為「純系IV」。
IgG1-KO突變體已藉由在Fc區中引入突變來製備。減少或抑制效應功能之突變為熟練技術者所熟知且充分揭示於先前技術中，例如揭示於Wang等人，Protein Cell 2018，9(1):63–73及Stewart等人，Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2014，2:29中。通常，為了減少Fc之效應功能在IgG1 Fc 區中引入之突變之非限制性清單包括： -L234A及L235A； -L234A、L235A及N297Q； -L234A、L235A及P329G；或 -       L234A、L235A及D265A； 其中該等殘基根據Kabat之EU索引編號。
在一個較佳實施例中，本發明抗體包含位於Fc區中的兩個突變L234A及L235A以減少效應功能。
揭示於本文中且以SEQ ID NO: 1至6描繪之CDR係根據Kabat編號呈現且Kabat位置概述於下表2中。
表 2 ：
CDR Kabat 序列 Kabat 位置 SEQ ID NO:
HCDR1 SYYMS 31至35 1
HCDR2 TIIKSGGYAYYPDSVKD 50至66 2
HCDR3 GGQGAMDY 99至106 3
LCDR1 RASQSIGDYLH 24至34 4
LCDR2 YASQSIS 50至56 5
LCDR3 QQGYSFPYT 89至97 6
本發明之抗-Sema3A抗體以高親和力結合至人類Sema3A。在與本態樣有關的一個實施例中，本發明之抗-Sema3A抗體以K D＜ 50 pM結合至人類Sema3A。在另一個實施例中，本發明之抗-Sema3A抗體以K D＜ 35 pM結合至人類Sema3A，如實例2中所例示。在一個較佳實施例中，本發明之抗-Sema3A抗體以K D＜ 30 pM結合至人類Sema3A。
本發明之抗-Sema3A抗體亦結合至食蟹獼猴-Sema3A、小鼠Sema3A、大鼠Sema3A及兔Sema3A。
本發明之抗-Sema3A抗體以小於100 pM，較佳小於80 pM，更佳小於70 pM之功能效價防止視網膜細胞中Sema3A誘導之細胞骨架塌陷。在一個較佳實施例中，本發明之抗-Sema3A抗體以69 pM之功能效價防止視網膜細胞中Sema3A誘導之細胞骨架塌陷，如 實例 2中所例示。
在另一個態樣中，本發明之抗-Sema3A抗體經證明具有如 實例 3中所述的低免疫原性風險。此仰賴於抗體之免疫原性之電腦模擬預測。免疫原性風險通常藉由熟知的各種方法，諸如藉由用於預測T細胞抗原決定基(一種主要免疫原性影響因子)之電腦演算法來評估。
確實已報告含有存在於所關注蛋白質中之T-細胞抗原決定基之序列可藉由使用基於電腦矩陣方法之演算法來預測，該演算法可以名稱EpiMatrix (由EpiVax生產)可得。熟習此項技術者可參考Van Walle等人，Expert Opin Biol Ther. 2007年3月；7(3): 405-18及Jawa等人，Clin Immunol. 2013年12月；149(3):534-55。
本發明者已顯示，本發明抗體與先前技術提及且在本文中描述之靶向Sema3A之其他抗體或片段相比顯示更有利之性質。
本發明者已將揭示於WO2014123186 (Chiome Bioscience)中之靶向Sema3A之抗體之結合親和力與本發明抗體之親和力進行比較。WO2014123186之抗體經揭示用於治療阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)。本 實例 4顯示，本發明抗體經證明與Chiome Bioscience所揭示的先前技術抗體相比對人類Sema3A具有更高的結合親和力。
本發明者亦已將根據本發明之抗體之性質與如WO2017074013 (Samsung)中所揭示的ScFv片段進行比較。此等片段經揭示用於治療各種癌症。本 實例 5顯示，本發明抗體經證明與WO2017074013所揭示的先前技術抗體片段相比對人類Sema3A具有更高的結合親和力。
較高的結合親和力延長玻璃體內注射抗體之後Sema3A之中和時間且允許降低注射頻率。較高的結合親和力進一步允許投與較低劑量，從而限制潛在副作用。本發明抗體因此提供優於先前技術抗體之技術優點。改良之結合親和力及降低之注射頻率顯著改善有此需要的患者之治療之功效。其亦為患者提供有價值的益處，尤其是改良之藥物遵從及順服性。
人類化及胺基酸序列變異體
其他變異體抗-Sema3A抗體及抗體片段可基於於以SEQ ID NO: 1至6描繪之序列下識別的CDR組經工程化。應理解，在該變異體抗-Sema3A抗體及抗體片段中，CDR之胺基酸序列保持不變，但可工程化周圍區域，例如FR區。可藉由將適宜核苷酸變化引入至抗-Sema3A抗體DNA，或藉由肽合成來製備抗-Sema3A抗體之胺基酸序列變異體。此類變異體包括例如本文實例之抗-Sema3A抗體之胺基酸序列內殘基之缺失、及/或插入及/或取代。進行缺失、插入及取代之任何組合以得到最終構築體，限制條件為最終構築體具有所需特性。胺基酸變化亦可改變人類化或變異體抗-Sema3A抗體之轉譯後過程，諸如改變醣基化位點之數量或位置。
另一種類型之抗體胺基酸變異體涉及改變抗體之原始醣基化模式。術語「改變」在此情況下意指刪除在抗體中發現的一或多個碳水化合物部分，及/或添加先前不存在於抗體中的一或多個醣基化位點。
在一個態樣中，本發明包括編碼本文所描述的抗-Sema3A抗體之胺基酸序列變異體之核酸分子。編碼抗-Sema3A抗體之胺基酸序列變異體之核酸分子藉由此項技術中已知的各種方法來製備。此等方法包括但不限於從天然來源(在天然存在之胺基酸序列變異體之情況下)分離或藉由寡核苷酸介導之(或定點)誘變、PCR誘變及早期製備的抗-Sema3A抗體之變異體或非變異體形式之盒誘變製備。
在某些實施例中，抗-Sema3A抗體為抗體片段。已開發用於產生抗體片段之技術。片段可經由完整抗體之蛋白水解消化來衍生(參見，例如Morimoto等人，1992，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117；及Brennan等人，1985，Science 229:81)。或者，該等片段可直接在重組宿主細胞中產生。例如，Fab'-SH片段可直接從大腸杆菌( E. coli)回收且經化學偶聯以形成F(ab') 2片段(參見，例如Carter等人，1992，Bio/Technology 10:163-167)。藉由另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養物分離F(ab') 2片段。熟練從業者當知曉用於產生抗體片段之其他技術。
抗-Sema3A抗體及其抗原結合片段可包括修飾。
在某些實施例中，可期望使用抗-Sema3A抗體片段，而不是完整抗體。可期望修飾抗體片段以便增加其血清半衰期。此可例如藉由將救援受體結合抗原決定基併入至抗體片段中來達成。在一種方法中，抗體片段之適宜區域可經改變(例如突變)，或可將抗原決定基併入至肽標籤中，然後將該肽標籤在任一端或在中間例如藉由DNA或肽合成融合至抗體片段。參見，例如WO 96/32478。
在其他實施例中，本發明包括抗-Sema3A抗體之共價修飾。共價修飾包括半胱胺醯基殘基、組胺醯基殘基、離胺醯基及胺基端殘基、精胺醯基殘基、酪胺醯基殘基、羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)、麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基、或絲胺醯基、或蘇胺醯基殘基之修飾。另一種類型之共價修飾涉及將糖苷經化學或酶促方式偶聯至抗體。此類修飾可藉由化學合成或藉由抗體之酶促或化學裂解(若適用)進行。抗體之其他類型之共價修飾可藉由使抗體之目標胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或胺基端或羧基端殘基反應之有機衍生化劑反應而引入至分子中。
可經化學或酶促方式實現存在於抗體上之任何碳水化合物部分之移除。Hakimuddin等人，1987，Arch. Biochem. Biophys. 259:52及Edge等人，1981，Anal. Biochem.，118:131描述化學去醣基化。抗體上碳水化合物部分之酶促裂解可藉由使用各種內切-及外切糖苷酶來達成，如Thotakura等人，1987，Meth. Enzymol 138:350所描述。
另一種類型之有用共價修飾包括以陳述於以下中之一者或多者中之方式將抗體連接至各種非蛋白質聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚環氧烷)中之一者：美國專利第4,640,835號、美國專利美國專利第4,496,689號、美國專利美國專利第4,301,144號、美國專利美國專利第4,670,417號、美國專利第4,791,192號及美國專利第4,179,337號。
抗原決定基 結合
在第二態樣中，本發明係關於識別特異性「Sema3A抗原抗原決定基」及「Sema3A抗原決定基」之抗體以用於治療視網膜栓塞疾病。特別地，該抗體或其片段結合至具有SEQ ID NO: 22之人類Sema3A之抗原決定基。
在一個態樣中，本發明係關於一種用於治療視網膜栓塞疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段結合至如以SEQ ID NO: 22所示的人類Sema3A之胺基酸區域370至382內的至少一個胺基酸殘基。
在另一個態樣中，本發明係關於一種用於治療視網膜栓塞疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段結合至SEQ ID NO: 21。
序列SEQ ID NO: 21及22描繪於下表3中。
表 3 ：
名稱 序列 SEQ ID NO:
Sema3A抗原決定基 DSTKDLPDDV ITF 21
人類Sema3A    22
如本文所用，術語「Sema3A抗原抗原決定基」及「Sema3A抗原決定基」係指能夠結合至抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之分子(例如肽)或分子之片段。此等術語進一步包括例如藉由本發明抗體或抗體片段中之任何者識別的Sema3A抗原決定子，其具有選自SEQ ID NO 1至3所示的重鏈CDR及SEQ ID NO: 4至6所示的輕鏈CDR之輕鏈及重鏈CDR組合。
Sema3A抗原決定基可包括在蛋白質、蛋白質片段、肽或類似者中。該等抗原決定基為最常見的蛋白質、短寡肽、寡肽模擬物(亦即模擬Sema3A抗原之抗體結合性質的有機化合物)或其組合。
已發現，本發明抗體或抗體片段結合至人類Sema3A之獨特抗原決定基。較佳地，抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段結合至以SEQ ID NO: 22所示的人類Sema3A之胞外域之胺基酸區域370至382內的至少一個胺基酸殘基。該抗原決定基位於Sema3A及叢蛋白A受體之介面附近。抗體對該抗原決定基的結合會抑制配位體Sema3A、受體叢蛋白A及共受體Nrp1之信號傳導整體受體複合體之形成，從而導致干擾此種信號傳導之生物效應。
在抗原決定基結合之上下文中，片語「在胺基酸區域X-Y…內結合」意指抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段結合至序列中指定的胺基酸區域內的至少一個，較佳全部胺基酸殘基。
在另一個態樣中，抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段結合至以SEQ ID NO: 22描繪的胺基酸序列的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%。較佳地，抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段結合至SEQ ID NO: 22。
治療用途
在一個實施例中，本發明提供一種抗-Sema3A或抗原結合片段，其用於藉由抑制SemaA之血管阻遏效應，藉由改良視網膜之血管再生，及/或藉由降低血液視網膜屏障之滲透性來治療靜脈阻塞疾病。本發明者確實已開發靶向Sema3A之抗體，其對於下列極其有幫助： -  將血管生成再定向於缺血區域，以便改良視網膜之血管再生； -預防玻璃體區域之病理性新生血管生成；及 -防止血液視網膜屏障擊穿。
如先前所提及，Sema3A係暗示由缺氧視網膜神經節細胞分泌之血管排斥。藉由結合至神經纖毛蛋白質-1，其活化內皮細胞上叢蛋白受體之細胞內信號傳導，從而導致肌動蛋白纖維的分解。此導致頂端細胞(其為主導新血管生長且防止視網膜中缺血區域之血管再生之特化內皮細胞)中之絲狀偽足中細胞骨架塌陷。本發明者已顯示，用中和Sema3A-抗體調節血管排斥作用將會增加頂端細胞之數量且將血管生成再導向缺血區域，諸如患有糖尿病性黃斑缺血的人類中之病理腫大中央凹無血管區。
本發明者已在 實例 1中顯示基於使用本發明之抗-Sema3A抗體之治療策略的相關性及優越性。其等確實已顯示，本發明抗體在RVO鼠類模型中改善囊狀水腫且抑制內核層中之視網膜薄化。本發明者已進一步顯示，藉由在RVO鼠類模型中投與本發明之抗-Sema3A抗體，改良眼部血流。最後，本發明者已例示，本發明之抗-Sema3A抗體在RVO鼠類模型中減少視網膜非灌注區域的大小。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-Sema3A或抗原結合片段，其用於藉由抑制SemaA之血管壓制效應，改良視網膜之血管再生及/或藉由降低血液視網膜屏障之滲透性來治療視網膜栓塞疾病。
在一個較佳實施例中，本發明提供一種抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其用於治療罹患糖尿病性黃斑缺血的患者中之視網膜栓塞疾病，較佳藉由促進缺血性視網膜內的血管再生(血管重建)及預防眼睛玻璃體區域之病理性新生血管生成。
在另一個較佳實施例中，本發明提供一種抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其用於治療罹患糖尿病性黃斑水腫的患者中之視網膜栓塞疾病，較佳藉由降低血液視網膜屏障之滲透性。
在另一個較佳實施例中，本發明提供一種抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其用於藉由抑制Sema3A誘導之血液視網膜屏障之滲透性及/或Sema3A誘導之缺血區域之血管退化來治療視網膜栓塞疾病。
在第四態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑，其用於治療視網膜栓塞疾病。
本發明之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物藉由任何適宜方式(包括玻璃體內、口服、非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內)投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。另外，抗-Sema3A抗體適合藉由脈衝輸注，特別是在減少抗體之劑量下投與。在一個態樣中，給藥藉由注射，最佳係靜脈內或皮下注射提供，部分地取決於投與是短暫還是長期。較佳地，抗-Sema3A抗體透過玻璃體內注射至眼睛中提供。
對於疾病之預防或治療，適宜抗體劑量將取決於各種因素，諸如如上文所定義的待治療疾病之類型、疾病之嚴重度及病程、抗體是否出於預防或治療目的投與、先前療法、患者的臨床病史及對抗體之反應、及主治醫師之決策。該抗體適合於一次地或經一系列治療投與給患者。
在一個較佳實施例中，每次注射可施用的本發明抗體之劑量範圍通常為1 mg/眼睛至10 mg/眼睛，較佳在1.5 mg/眼睛至5 mg/眼睛之間，更佳在2 mg/眼睛至3 mg/眼睛之間且甚至更佳為約2.5 mg/眼睛。
術語「抑制」在本文中在與「改善」及「緩和」相同上下文中用於意指減輕或消除疾病之一或多種特性 。
抗體組合物將以符合良好醫學實務之方式經調配、給藥及投與。在該上下文中考慮的因素包括所治療的特定病症、所治療的特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之原因、藥劑之遞送位點、投與方法、投與之時程表及醫學從業者已知的其他因素。待投與的抗體之「治療有效量」將受到此等考量所控制，且為預防、改善或治療藉由本發明抗體所解決的眼睛或視網膜疾病所必需的最小量。
該抗體不必但視需要用目前用於預防或治療視網膜栓塞疾病之一或多種藥劑調配。此類其他藥劑之有效量取決於存在於調配物中之抗-Sema3A抗體之量、病症或治療之類型、及上文所討論的其他因素。此等一般以相同劑量且利用如上文所使用的投與途徑或上文所採用的劑量的約1至99%使用。
各種遞送系統係已知且可用於投與抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。引入方法包括但不限於玻璃體內、滴眼劑、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外及口服途徑。抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段可例如藉由輸注、速注或注射投與，且可連同其他生物活性劑一起投與。投與可為全身或局部。在較佳實施例中，投與係藉由玻璃體內注射。可例如在經預填充之注射器中製備用於此類注射之調配物。
抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段可以包含治療有效量之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段及一或多種醫藥上相容之成分之醫藥組合物投與。
在典型實施例中，醫藥組合物按照例行程序調配為適合於人類的靜脈內或皮下投與之醫藥組合物。通常，用於藉由注射投與之組合物為含在無菌等滲水性緩衝液中之溶液。在必要時，藥品亦可包含增溶劑及局部麻醉劑(諸如利多卡因(lignocaine))以緩解注射部位處的疼痛。一般而言，成分以單位劑型，例如以含在指示活性劑數量之氣密密封容器(諸如安瓿或小袋(sachette))中之乾燥凍乾粉末或無水濃縮物，單獨或混合在一起供應。在醫藥意欲藉由輸注投與之情況下，其可利用含有無菌醫藥級水或鹽水之輸注瓶分配。在醫藥藉由注射投與之情況下，可提供無菌注射用水或鹽水之安瓿使得成分可在投與之前混合。
此外，醫藥組合物可以醫藥套組提供，該醫藥套組包括(a)含有呈凍乾形式之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之容器及(b)含有醫藥上可接受之注射用稀釋劑(例如無菌水)之第二容器。醫藥上可接受之稀釋劑可用於經凍乾之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段的復水或稀釋。視需要，隨附此種容器的可為呈由管制醫藥或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構規定的形式之通知，該通知反映由用於人類投與之製造、使用或銷售之機構批准。
可藉由標準臨床技術來確定有效治療或預防眼睛或視網膜疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之量。另外，可視需要採用活體外檢定以幫助識別最佳劑量範圍。待用於調配物中之精確劑量將亦取決於投與途徑及病症之階段，且應根據從業者之判斷及各患者的情況來決定。有效劑量可自從活體外或動物模型測試系統導出之劑量反應曲線外推出。
例如，抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之毒性及治療功效可在細胞培養物或實驗動物中藉由用於確定ED 50(在50%的群體中為治療有效之劑量)之標準醫藥程序來測定。以展現大的治療指數的抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段為較佳。
自細胞培養檢定及動物研究獲得的數據可用於調配用於人類中之劑量範圍。抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之劑量通常位於包括ED 50而幾乎沒有或沒有毒性之循環濃度範圍內。劑量可在此範圍內變化，端視所採用的劑型及所利用的投與途徑而定。對於用於該方法中之任何抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，可最初自細胞培養檢定評估治療有效劑量。劑量可在動物模型中經調配以達成包括如在細胞培養物中測定的IC 50(亦即，達成症狀之半數最大抑制之測試化合物濃度)之循環血漿濃度範圍。此資訊可用於更準確地確定人類中之有用劑量。血漿中之含量可例如藉由高效液相層析、ELISA及類似者測得。
對於抗-Sema3A抗體之玻璃體內注射，一般更長的各治療間時間間隔為較佳。由於其改良之結合親和力及效價，本發明之抗-Sema3A抗體可以更長時間間隔投與。
在一個實施例中，每6週，較佳每7週，較佳每8週，較佳每9週，較佳每10週，較佳每11週，且更佳每12週投與抗-Sema3A抗體。在又一個較佳實施例中，本發明之抗-Sema3A抗體每3個月投與一次。
由於可投與給眼睛的體積受嚴格限制，因此極其重要的是，抗-Sema3A抗體可經調配物成高濃度。此外，抗-Sema3A抗體之效價非常重要，因為強效抗體可在甚至更低劑量下發揮其效應且由此延長活性亦及各治療間時間間隔。
本發明抗體可經調配物至極高劑量，其包括但不限於20 mg/ml、30 mg/ml、40 mg/ml、50 mg/ml、60 mg/ml、70 mg/ml、80 mg/ml、90 mg/ml或100 mg/ml。較佳地，本發明抗體可以約50 mg/ml之液體調配物調配。
可投與至患者的典型劑量為約2.5 mg/眼睛。可用於此種調配物的典型緩衝組分包括例如乙酸鈉、PS20及海藻糖二水合物。
在一個實施例中，抗-Sema3A抗體在pH 5.5下用10 mM組胺酸緩衝液、240 mM蔗糖、0.02 w/v%聚山梨醇酯20調配，最終蛋白質濃度為60 mg/mL。
在一些實施例中，包含抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物可進一步包含結合或未結合至結合劑之治療劑。
關於用於組合投與之治療方案，在一個特定實施例中，抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段係與治療劑同時投與。在另一個特定實施例中，在投與抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之前或之後投與治療劑，在投與抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之前或之後相隔至少一小時且至多幾個月，例如至少一小時、五小時、12小時、一天、一週、一個月或三個月。
治療方法
在另一個態樣中，本發明亦涵蓋用於治療或預防有此需要的患者之視網膜栓塞疾病之任何方法，其中該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段包含，該方法包括投與本發明之抗-Sema3A抗體。
較佳地，本發明係關於一種用於治療或預防視網膜栓塞疾病之方法，該方法包括向有此需要的患者投與醫藥有效量之根據本發明之抗體。
本文所描述的所有所揭示技術特徵適合於該治療方法。
製品
在另一個態樣中，包括含有可用於治療上文所描述的病症之材料之製品。製品包括容器及標籤。適宜容器包括例如瓶、小瓶、注射器及試管。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。該容器容納有效治療病狀之組合物且可具有無菌存取口。例如，該容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子之靜脈內輸液袋(intravenous solution bag)或小瓶。組合物中之活性劑為抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。該容器上或與該容器相關聯之標籤指示，該組合物用於治療所選擇的病狀。製品可進一步包括包含醫藥上可接受之緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液之第二容器。其可進一步包括從商業及使用者角度所需之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、注射器及具有使用說明之包裝插入物。
本發明在以下實例中進一步描述，該等實例無意限制本發明之範疇。 實例
實例 1 ：抗 -Sema3A 抗體在視網膜靜脈阻塞模型小鼠中之效應
在本研究中，使用小鼠之視網膜靜脈阻塞模型評估根據本發明之示例性抗-Sema3A抗體之在視網膜缺血上之玻璃體內抗體療法。此外，為了區分來自VEGF/Nrp1軸線之Sema3A/Nrp1信號傳導軸線之中和，亦評估利用抗-Sema3A抗體之單藥療法及其與抗-VEGF抗體之組合。
I. 材料
A. 研究設計
本研究設計說明於圖1中。本實例包括如下4個步驟： ●      步驟1：水腫及損傷(組織學分析、光學同調斷層掃描(OCT)) ●      步驟2：血流(雷射散斑血流成像) ●      步驟3：視網膜非灌注區域(經螢光素染色之平固式視網膜) ●      步驟4：蛋白質表現(WB)
B. 測試 / 參考化合物
本發明者測試根據本發明之示例性抗體：純系I。該抗體包含包含SEQ ID NO: 14所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列之輕鏈。
本發明者已測試且比較該抗-Sema3A抗體與市售抗-VEGF阱Eylea®。 將該等化合物用阿伐司汀(Avastin)緩衝液(60 mg/ml α,α-海藻糖脫水合物、5.8 mg/ml磷酸鈉(一元，單水合物)、1.2 mg/ml磷酸鈉(二元，無水)、0.4 mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.2)稀釋至10 mg/mL之濃度。
C. 組別及協定
下表4概述不同組別及用於各個組別之協定類型。
表 4 ：
誘導 參考 / 測試試劑 劑量 ** (mg/kg) 給藥途徑 動物數量
1 正常 媒劑    IVT 5x2
2 RVO 媒劑    IVT 5x2
3 RVO 本發明之抗-Sema3A 10 µg/眼睛 IVT 5x2
4 RVO 抗-VEGF (Eylea®) 10 µg/眼睛 IVT 5x2
5 RVO 本發明之抗-Sema3A 抗-VEGF (Eylea®) 10 µg/眼睛 10 µg/眼睛 IVT 5x2
RVO，視網膜靜脈阻塞；IVT，玻璃體內注射
D. 試劑
所使用的各種試劑概述於下表5中。
表 5 ：
試劑名稱 供應商 目錄號
Rose Bengal Wako 184-00272
Immuno Star® LD Wako 290-69904
螢光素結合之聚葡萄糖 Sigma-Aldrich FD2000S-5G
磷酸氫二鈉12-水：Na2HPO3･12H2O Nacalai Tesque 31723-35
二氫磷酸鈉二水合物：NaH2PO4･2H2O Nacalai Tesque 31718-15
多聚甲醛 Nacalai Tesque 162-16065
ketalar Daiichi Sankyo Propharma GYA0038
甲苯噻嗪 Bayer Healthcare KP0C7DJ
蘇木精560MX Leica 3801575
醇性伊紅Y515 Leica 3801615
氯化鉀 Wako 160-22115
氯化鈉 Kishida Chemical 008-71265
二氫磷酸鉀 Nacalai Tesque 28720-65
E. 用於蛋白質表現之西方墨點分析 的 抗體
最後，特異性用於藉由西方墨點法進行蛋白質表現之活體外分析之抗體概述於下表6中。
表 6 ：
名稱 / 標靶 起源 供應商 目錄號 批次號
Nrp1 兔 abcam ab81321 GR212288-38
TNFα 小鼠 Santa Cruz Biotechnology sc-52746 J1317
叢蛋白A1 兔 abcam ab23391 GR285914-16
β肌動蛋白 小鼠 Sigma-Aldrich A2228 067M4856V
II. 方法
A. 動物及 RVO 鼠類模型：
所有動物實驗均根據視力及眼科研究協會(Association for Research in Vision and Ophthalmology；ARVO)針對於動物在眼科及視力研究中之使用的聲明進行，且該等實驗已獲得岐阜醫藥大學動物照護及使用委員會機構(Institutional Animal Care and Use Committee of Gifu Pharmaceutical University)的批準及監測。
8週齡ddY雄性小鼠從Japan SLC (Shizuoka，Japan)獲得且在23 ± 3℃下在12小時明/暗循環(08:00至20:00照明)下圈養。用氯胺酮(120 mg/kg)及甲苯噻嗪(6 mg/kg)之混合物麻醉小鼠。RVO藉由以下發展：在i.v.注射8 mg/mL孟加拉玫瑰紅(Rose Bengal)後，使用附接至Micron IV視網膜成像顯微鏡(Phoenix Research Laboratories，Inc.)之影像引導之雷射系統，對各動物右眼之三個視網膜分支靜脈進行雷射光凝固(532 nm，50 mW功率，5000毫秒持續時間，50 μm光斑尺寸)。
本發明之抗–Sema3A抗體及/或抗-VEGF阱在雷射照射後立即或7天後以10 µg/眼睛之劑量及2 µL之注射體積經玻璃體內注射至各小鼠右眼中。
B. 組織學
進行蘇木精及伊紅染料(H&E)染色以可視化小鼠眼睛切片之組織學變化。將用於組織學分析之眼睛在4℃下在4%多聚甲醛(PFA)中保持浸漬至少48小時。六個石蠟包埋切片(5 μm)係穿過各眼睛之視盤切割而得到且用蘇木精及伊紅染色。用螢光顯微鏡(BZ-710；Keyence)拍攝影像。利用Image J (國家健康研究院(National Institutes of Health)，Bethesda)測定每240 μm從視盤朝向周邊之照片上內核層(INL)之厚度。求取各眼睛之隨機從六個切片選擇的三個切片之數據的平均值。
C. 利用雷射散斑血流成像測 量 血流：
使用雷射散斑血流成像裝置(LSFG；Softcare)在約4秒之時段內以30幀/秒之速率連續採集平均模糊率(MBR)影像(一種相對血流速度之指數)。測得的眼底面積為約3.8 × 3 mm (寬度 × 高度)，估算的組織穿透為0.5至1 mm。採集影像後，藉由LSFG Analyzer軟體(版本3.1.14.0；Software Co.，Ltd.)，使用所謂的血管提取功能自動偵測視神經頭部區域上之血管及組織區域。
D. 視網膜非灌注區域之成像：
在採樣之前，小鼠經注射0.5 mL之經溶解於PBS中之20 mg/mL螢光素結合之聚葡萄糖至尾靜脈中。摘除眼睛並在4% PFA中固定7小時，且製備平固式視網膜。用Metamorph (Universal Imaging Corp)拍攝平固式視網膜之影像且使用ImageJ處理軟體分析以確定視網膜非灌注區域之大小。
E. 用於 蛋白質表現之西方墨點分析藉由標準方法進行西方墨點分析。藉由Immuno Star® LD使免疫反應帶可見，且用LAS-4000發光影像分析儀(Fuji Film Co. Ltd.)測量其密度。對於定量分析，使用總蛋白質信號作為磷蛋白信號之負載控制。
III. 結果
A. 本發明之抗 -Sema3A 抗體改善 RVO 鼠類模型之內核層中之囊様水腫及視網膜薄化。
本發明者研究藉由RVO誘導之囊様水腫是否可藉由投與本發明之抗-Sema3A抗體來改善。
本實驗之治療協定包括雷射照射後之早期階段投與及雷射照射後7天時之後期階段投與。基本上，將抗-Sema3A抗體及/或抗-VEGF阱在雷射照射後立即或7天時以10 µg/眼睛之劑量經玻璃體內注射至各小鼠右眼中。
在雷射照射後1天，內核層(INL)之視網膜薄化厚度顯著增加，且此種增加受到投與本發明之抗-Sema3A抗體的抑制。本發明抗體與抗-VEGF阱之組合以及單獨抗-VEGF阱在RVO誘導後在此早期階段達成相同效應。
為了檢查抗-Sema3A抗體在RVO誘導後在後期階段對於內核層(INL)之視網膜薄化之效應，將小鼠在雷射輻射後7天時經玻璃體內注射本發明之抗-Sema3A抗體及/或抗-VEGF阱。
在經媒劑處理組中，在雷射照射後8天時，INL之厚度顯著減小。投與抗-VEGF阱增加視網膜薄化之程度。然而，在雷射照射後7天時，藉由玻璃體內注射本發明之抗-Sema3A抗體抑制該視網膜薄化。
結果顯示，本發明抗體抑制視網膜薄化，從而確認其於治療視網膜栓塞疾病(諸如RVO)中之有益用途。結果亦將本發明抗體與用抗-VEGF阱之治療進行區分，因為後者在RVO誘導後並未在所有階段中達成有益效應。
B. 藉由在 RVO 鼠類模型中投與本發明之抗 -Sema3A 抗體來改良眼部血流。
本發明者在雷射照射後1或8天時利用雷射散斑血流成像來檢查藉由本發明之抗-Sema3A抗體之眼部血流之變化。
本實驗之治療協定包括雷射照射後之早期階段投與及雷射照射後7天時之後期階段投與。基本上，將抗-Sema3A抗體及/或抗-VEGF阱在雷射照射後立即或7天時以10 µg/眼睛之劑量經玻璃體內注射至各小鼠右眼中。
本發明者已顯示，在經媒劑處理組中，在雷射照射後1天時，血流顯著減少。
在雷射照射後的早期階段投與下，在投與本發明之抗-Sema3A抗體及投與後1天時，血流之減少降低。投與抗-VEGF阱達成對於血流之相同效應。雷射照射後立即投與本發明之抗-Sema3A抗體及抗-VEGF阱之組合導致RVO誘導後此早期階段中血流減少更顯著地降低( 圖 2A)。
本發明者研究在雷射照射至各小鼠右眼後7天時利用抗-Sema3A抗體及/或抗-VEGF阱以10 µg/眼睛之劑量(在雷射照射後的後期階段投與)的眼部血流。在經媒劑處理組中，在雷射照射後8天時，血流顯著減小。
結果顯示，注射抗-VEGF阱增加視網膜血流減少之程度。相反地，投與本發明之抗-Sema3A抗體時之血流顯著好於經媒劑處理組。在RVO誘導後在此後期階段時投與本發明之抗-Sema3A抗體與抗-VEGF阱之組合中和本發明之抗-Sema3A抗體之有益效應( 圖 2B)。
此等資料顯示，本發明抗體在RVO誘導後在所有階段顯著改良血流。其進一步顯示，當與基於單獨抗-VEGF之治療策略相比時，本發明抗體於改良血流方面之優越性。
C. 本發明之抗 -Sema3A 抗體減少 RVO 鼠類模型中視網膜非灌注區域 之大小 。
為了研究抗-Sema3A抗體對於非灌注區域的大小方面之效應，本發明者在雷射照射後立即或7天時經玻璃體內注射根據本發明之抗-Sema3A抗體及/或抗-VEGF阱。
在雷射照射後立即投與抗-Sema3A抗體導致在雷射照射後1天時非灌注區域的大小與經媒劑處理組相比顯著減少。投與抗-VEGF阱、或本發明之抗-Sema3A抗體與抗-VEGF阱之組合達成約相同效應。
關於雷射照射後的後期階段投與，本發明者已顯示，藉由在雷射照射後7天投與抗-VEGF阱來增加非灌注區域的大小。相反地，本發明者已顯示，與經媒劑處理組相比，在雷射照射後7天時投與本發明之抗-Sema3A抗體導致非灌注區域的大小減少。投與本發明之抗-Sema3A抗體與抗-VEGF阱之組合中和本發明之抗-Sema3A抗體之有益效應。
此等結果指示，本發明之抗-Sema3A抗體在7天後以與基於抗-VEGF阱之治療用途之策略相比更佳延伸之方式減少非灌注區域的大小。此確認本發明抗體於治療栓塞疾病(諸如RVO)中之有益用途。
D. RVO 鼠類模型中 之 TNF-α 及 Sema3A 有關受體 ( 叢蛋白 A1 及神經纖毛蛋白 1) 之表現因抗 -Sema3A 抗體而降低。
研究TNF-α及Sema3A有關受體(叢蛋白A1及神經纖毛蛋白1)之蛋白質表現。
在雷射照射後立即或7天時經玻璃體內注射本發明之抗-Sema3A抗體及/或抗-VEGF阱後測定TNF-α及Sema3A有關受體組分(叢蛋白A1或神經纖毛蛋白1)之表現。
在雷射照射後1天時，在媒劑處理組中，TNF-α及叢蛋白A1之表現均增加。與媒劑處理組相比，本發明之抗-Sema3A抗體的早期注射強烈降低表現程度。本發明之抗-Sema3A與抗-VEGF阱之組合達成相同效應。雖然在RVO誘導後此早期階段中單獨抗-VEGF阱亦減少TNF-α，但其並不顯著影響叢蛋白A1之表現。
在雷射照射後8天時，在經媒劑處理組中，TNF-α及神經纖毛蛋白1增加。然而，本發明之抗-Sema3A抗體的投與降低後期階段中之彼等因子。另一方面，在RVO誘導後此後期階段中抗-VEGF阱注射不會影響Nrp1表現且與經媒劑處理組相比增加TNF-α。本發明之抗-Sema3A抗體與抗-VEGF阱之組合減弱本發明之抗-Sema3A抗體之效應。
IV. 結論
總體而言，此等資料顯示，在患有RVO的眼睛中，Sema3A有關受體及發炎因子之表現程度增加。
在RVO誘導後早期階段中注射根據本發明之抗-Sema3A抗體顯著減少視網膜水腫、非灌注區域的大小及血流的減少。此外，增加的TNF-α及Sema3A有關受體(叢蛋白A1)之表現降低。
此外，在RVO誘導後後期階段時注射抗-Sema3A抗體亦改良彼等病理症狀且增加的TNF-α及Sema3A有關受體(神經纖毛蛋白1)之表現降低。
TNF-a及Sema3A有關受體(神經纖毛蛋白1及叢蛋白A1)的下調可促成在投與本發明之抗-Sema3A抗體後RVO鼠類模型中病理症狀之改善。
本資料證實，本發明抗體對於治療罹患視網膜栓塞疾病(尤其是RVO)的患者而言非常有前景。特別地，本發明之抗-Sema3A抗體在RVO誘導後的所有階段中顯示有益效應，此將其與抗-VEGF阱區分開。
實例 2 ：親和力及細胞效價
A) 親和力
本實驗之運行緩衝液及所有稀釋液(除註明情況外)在具有0.01% Tween 20之PBS-T-EDTA [將100 μl 100% Tween 20添加至2 L PBS-T-EDTA以製備0.01%之最終Tween 20濃度]中進行。按照製造商的建議，將GLM感測晶片標準化及預先調整(pre-conditioned)。感測晶片用等量的EDC/s-NHS混合物在水平方向上以30 µl/min之流速活化300秒且用人類Fab結合子(10 µg/ml含在10 mM乙酸鹽pH 5.0中)在水平方向上以30 µl/min之流速固定300秒而在表面上得到約6739至7414 RU之人類Fab結合子。感測晶片用1M乙醇胺HCl在水平方向上以30 µl/min之流速去活化300秒。感測晶片以100 µl/min的流速用18秒10 mM甘胺酸pH 2.1穩定水平1次及垂直1次。
本發明者測試根據本發明之示例性抗體(純系I)。該抗體(0.5 µg/ml)以25 µl/min之流速垂直捕獲於人類Fab結合子表面上300秒而得到約180 RU捕獲程度。藉由以40 µl/min之流速經水平注射PBS-T-EDTA 60秒來使基線穩定。將分析物以40 µl/min之流速經水平注射於所捕獲的抗體上600秒且解離7200秒。分析物之濃度為0 nM、0.625 nM、1.25 nM、2.5 nM、5 nM及10 nM。藉由以100 µl/min的流速經水平一次及經垂直一次注射10 mM甘胺酸pH 2.1 18秒來再生表面。以25 µl/min之流速經垂直注射PBS-T-EDTA 60秒一次。 從原始數據減去點間(interspot) (與感測器表面相互作用)及空白(具有0.01%Tween 20或0 nM分析物之PBS-T-EDTA)。然後將感應圖全局擬合至1:1朗謬(Langmuir)結合以提供結合速率(ka)、解離速率(kd)及親和力(K D)值。
B) 細胞效價
為了測定細胞骨架塌陷檢定中之功能效價，將Sema3A濃度反應曲線與漸增濃度之抗體組合作為IC50位移實驗。進行Gaddum Schild圖以計算pA2值(位移Sema3A濃度反應曲線2因子所需的抗體濃度之負對數)。以pM計之效價從pA2值計算為=效價(10；-X)。
該等結果概述於下表7中。
表 7 ：
分子 親和力 (K d) [pM] 細胞骨架塌陷檢定中之功能拮抗作用 (A 2) [pM]
人類 食蟹獼猴 小鼠 大鼠 兔 人類
本發明抗體 ( 純系 I) 29 28 27 27 42 69
實例 3 ：本發明抗體之免疫原性之評估
本發明者已評估根據本發明之示例性抗體純系I之預測免疫原性。該抗體包含分別包含SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列之重鏈及輕鏈。
出於此目的，其已使用電腦模擬工具來預測T細胞抗原決定基(由EpiVax開發的EpiMatrix)。
藉由篩選許多人類抗體分離株之序列，EpiVax已識別出幾種高度保守的HLA配位體，咸信其具有調節潛力。實驗證據表明，許多此等肽事實上在大多數個體中具有主動耐受原性。此等高度保守、調節及雜亂之T細胞抗原決定基現稱為調節性T細胞表位(Tregitopes) (De Groot等人，Blood. 2008年10月15日；112(8):3303-11)。包含在人類化抗體中之新抗原決定基(neo-epitope)之免疫原性潛力可在大數目之調節性T細胞表位存在下得以有效控制。
出於抗體免疫原性分析之目的，EpiVax已開發出調節性T細胞表位調整之EpiMatrix評分及抗治療性抗體反應之相應預測。為計算調節性T細胞表位調整之EpiMatrix評分，從EpiMatrix蛋白質評分推導出調節性T細胞表位之評分。已顯示調節性T細胞表位調整之評分與一組23種市售抗體之所觀測到的臨床免疫反應具良好相關性(De Groot等人，Clin Immunol. 2009年5月；131(2):189-201)。
基於EpiMatrix量表之結果概述於下表8中。
表 8 ：
分子 重鏈 ( 人類 %) Epivax (VH) Epivax (Vκ ) 輕鏈 ( 人類 %)
FR V 基因 FR V 基因
本發明抗體 (純系I) 97 91 -27.27 -21.79 98 88
本發明抗體之序列基於EpiMatrix量表之低端進行評分，指示本發明抗體具有極其有限的免疫原性潛力。該EpiMatrix量表為熟習此項技術者所熟知且可尤其見於出版物Mufarrege等人，Clin Immunol. 2017年3月；176:31-41之圖2中。
實例 4 ：本發明抗體與 Chiome 抗體之間的結合親和力 的 比較
出於比較目的，本發明者已開發出針對於揭示於WO2014123186 (Chiome Bioscience)中之Sema3A之人類化抗體，其具有以下特徵： -  重鏈係如以WO2014123186中之SEQ ID NO: 11所示，及 -  輕鏈係如以WO2014123186中之SEQ ID NO: 12所示。 本發明者已開發出2種形式之此種抗體： -  一種基於IgG1KO Fc上形式化，在下文中稱為「Chiome抗體A」及 -  一種基於IgG1KO-FcRn空上形式化，在下文中稱為「Chiome抗體B」。
根據BioRad製造商手冊，於GLM晶片(BioRad)之上經由於6個水平通道上的直接胺偶聯固定高表面密度之抗人類Fab抗體(GE Healthcare)。
於6個垂直通道中的5個上在動力學結合檢定之最小表面密度下於抗人類Fab抗體表面上捕獲本發明抗體(純系I)及Chiome抗體。在PBS-T-EDTA緩衝液(BioRad)中以100、50、25、12.5、10、6.25、5、2.5、1.25、0.625及0 nM之濃度製備人類Sema3A。PBS-T-EDTA緩衝注射液用作用於動力學資料分析之雙重參考。將人類Sema3A溶液及PBS-T-EDTA緩衝液中之各者以40 µL/min之流速於6個水平通道上同時注射10分鐘，接著2小時解離期。藉由以100 µL/min之流速進行18秒的10 mM pH 2.1甘胺酸HCl (GE Healthcare)注射而再生表面接著以25 µL/min之流速注射PBS-T-EDTA 60秒。將結合感應圖擬合至1:1朗謬模型以計算結合速率、解離速率及親和力。
本發明抗體及Chiome抗體結合至人類Sema3A之動力學及親和力數據列於下表9中。
表 9 ：
樣本名稱 對 HuSema3A 之 KD
Chiome抗體A 56.4 nM
Chiome抗體B 55.9 nM
本發明抗體(純系I) 32.0 pM
結論該等結果顯示，與揭示於WO2014123186 (Chiome Bioscience)中之先前技術抗體相比，本發明抗體經證明對人類Sema3A具有優異結合親和力。
實例 5 ：本發明抗體與 Samsung scFv 之間的結合親和力 的 比較
已對如WO2017074013 (Samsung)中所揭示之scFv片段進行比較。
出於比較之目的，本發明者已開發3種所揭示的scFv片段(「Samsung scFv」)，其具有揭示於下表10中之特徵。
表 10 ：
抗體名稱 序列 如 WO2017074013 中所述 的 SEQ ID NO
Samsung scFv 1 重鏈 19
輕鏈 20
Samsung scFv 2 重鏈 21
輕鏈 22
Samsung scFv 3 重鏈 23
輕鏈 24
根據BioRad製造商手冊，於GLM晶片(BioRad)上於6個水平通道上經由直接胺偶聯固定高表面密度之抗-His抗體(GE Healthcare)。於6個垂直通道中的5個上在用於動力學結合檢定之最小表面密度下於抗-His抗體表面上捕獲Samsung scFv抗體。在PBS-T-EDTA緩衝液(BioRad)中以100、50、25、12.5、10、6.25、5、2.5、1.25、0.625及0 nM之濃度製備人類Sema3A。PBS-T-EDTA緩衝注射液用作用於動力學數據分析之雙重參考。將人類Sema3A溶液中之各者及PBS-T-EDTA緩衝液以40 µL/min之流速於6個水平通道上同時注射10分鐘，接著1小時解離期。藉由以100 µL/min之流速進行18秒的10 mM pH 2.1甘胺酸HCl (GE Healthcare)注射而再生表面接著以25 µL/min之流速注射PBS-T-EDTA 60秒。將結合感應圖擬合至1:1朗謬模型以計算結合速率、解離速率及親和力。
本發明抗體對人類Sema3A (純系I)的結合使用類似方法進行，但使用山羊抗-人類IgG (Invitrogen)以捕獲本發明抗體。本發明抗體及Samsung ScFv對食蟹獼猴、小鼠、大鼠或兔Sema3A的結合亦使用相同方法進行。
本發明抗體及Samsung scFv之動力學及親和力數據列於下表11中。
表 11 ：
抗體之名稱 對 HuSema3A 之 K D(pM) 對食蟹獼猴 Sema3A 之 K D(pM) 對小鼠 Sema3A 之 K D(pM) 對大鼠 Sema3A 之 K D(pM) 對兔 Sema3A 之 K D(pM)
Samsung scFv 1 359 89.0 105 ＜ 20 112
Samsung scFv 2 359 118 117 ＜ 20 122
Samsung scFv 3 296 68.0 88.8 ＜ 20 59.5
本發明抗體(純系I) 34.7 35.0 35.0 23.5 40.1
結論
本發明抗體對人類、食蟹獼猴、小鼠或兔Sema3A之結合親和力高於如WO2017074013中所揭示的3種Samsung scFv。
圖 1 ：研究設計
本圖描繪使用小鼠之視網膜靜脈阻塞模型經由玻璃體內注射在視網膜缺血中使用本發明抗體之研究之協定。治療協定包括雷射照射後的早期階段投與(研究1)及雷射照射後第7天時的後期階段投與(研究2)。基本上，抗-Sema3A抗體及/或抗-VEGF阱在雷射照射後立即(研究1)或在雷射照射後7天(研究2)經玻璃體內注射至小鼠眼睛中。
本研究包括如下4個步驟；
步驟1係關於水腫及損傷分析，包括組織學分析(蘇木精及伊紅染料或H&E)及光學同調斷層掃描(OCT))。
步驟2係關於利用雷射散斑血流成像之血流研究。
步驟3係關於螢光素-聚葡萄糖注射後平固式視網膜中之視網膜非灌注區域研究。
步驟4係關於蛋白質表現(利用西方墨點(western blot))。
圖 2 ：利用雷射散斑血流成像 之 眼部血流
該圖例示在雷射照射後1天或8天時藉由媒劑、本發明之抗-Sema3A抗體、VEGF-阱Eylea®或本發明之抗-Sema3A抗體及VEGF-阱Eylea®之組合經雷射散斑血流成像之眼部血流的變化。圖2A描繪雷射照射後早期階段投與之結果，圖2B描繪雷射照射後後期階段投與之結果。數據顯示為平均值 ± S.E.M (n = 5)。## P ＜ 0.01 (相對經媒劑處理之組)。
 
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15      Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr             20                  25                  30          Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val         35                  40                  45              Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val     50                  55                  60                  Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65                  70                  75                  80  Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys                 85                  90                  95      Val Arg Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr             100                 105                 110         Val Thr Val Ser Ser         115         <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 117]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人造序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
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          <![CDATA[<400> 9]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Leu Gly Gly 1               5                   10                  15      Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr             20                  25                  30          Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val         35                  40                  45              Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val     50                  55                  60                  Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65                  70                  75                  80  Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys                 85                  90                  95      Val Lys Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr             100                 105                 110         Val Thr Val Ser Ser         115         <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 117]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人造序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
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          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1               5                   10                  15      Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr             20                  25                  30          Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile         35                  40                  45              Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly     50                  55                  60                  Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65                  70                  75                  80  Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr                 85                  90                  95      Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys             100                 105         <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 107]]>
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          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1               5                   10                  15      Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr             20                  25                  30          Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile         35                  40                  45              Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly     50                  55                  60                  Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65                  70                  75                  80  Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr                 85                  90                  95      Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys             100                 105         <![CDATA[<210> 14]]>
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15      Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr             20                  25                  30          Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val         35                  40                  45              Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val     50                  55                  60                  Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65                  70                  75                  80  Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys                 85                  90                  95      Val Arg Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr             100                 105                 110         Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu         115                 120                 125             Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys     130                 135                 140                 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145                 150                 155                 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser                 165                 170                 175     Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser             180                 185                 190         Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn         195                 200                 205             Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His     210                 215                 220                 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225                 230                 235                 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr                 245                 250                 255     Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu             260                 265                 270         Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys         275                 280                 285             Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser     290                 295                 300                 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305                 310                 315                 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile                 325                 330                 335     Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro             340                 345                 350         Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu         355                 360                 365             Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn     370                 375                 380                 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385                 390                 395                 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg                 405                 410                 415     Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu             420                 425                 430         His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly         435                 440                 445     <![CDATA[<210> 15]]>
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          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1               5                   10                  15      Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr             20                  25                  30          Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile         35                  40                  45              Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly     50                  55                  60                  Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Pro 65                  70                  75                  80  Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr                 85                  90                  95      Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala             100                 105                 110         Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly         115                 120                 125             Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala     130                 135                 140                 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145                 150                 155                 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser                 165                 170                 175     Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr             180                 185                 190         Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser         195                 200                 205             Phe Asn Arg Gly Glu Cys     210                 <![CDATA[<210> 16]]>
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          <![CDATA[<400> 16]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15      Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr             20                  25                  30          Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val         35                  40                  45              Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val     50                  55                  60                  Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65                  70                  75                  80  Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys                 85                  90                  95      Val Arg Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr             100                 105                 110         Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu         115                 120                 125             Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys     130                 135                 140                 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145                 150                 155                 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser                 165                 170                 175     Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser             180                 185                 190         Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn         195                 200                 205             Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His     210                 215                 220                 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225                 230                 235                 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr                 245                 250                 255     Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu             260                 265                 270         Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys         275                 280                 285             Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser     290                 295                 300                 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305                 310                 315                 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile                 325                 330                 335     Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro             340                 345                 350         Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu         355                 360                 365             Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn     370                 375                 380                 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385                 390                 395                 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg                 405                 410                 415     Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu             420                 425                 430         His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly         435                 440                 445     <![CDATA[<210> 17]]>
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Leu Gly Gly 1               5                   10                  15      Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr             20                  25                  30          Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val         35                  40                  45              Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val     50                  55                  60                  Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65                  70                  75                  80  Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys                 85                  90                  95      Val Lys Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr             100                 105                 110         Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu         115                 120                 125             Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys     130                 135                 140                 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145                 150                 155                 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser                 165                 170                 175     Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser             180                 185                 190         Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn         195                 200                 205             Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His     210                 215                 220                 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225                 230                 235                 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr                 245                 250                 255     Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu             260                 265                 270         Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys         275                 280                 285             Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser     290                 295                 300                 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305                 310                 315                 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile                 325                 330                 335     Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro             340                 345                 350         Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu         355                 360                 365             Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn     370                 375                 380                 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385                 390                 395                 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg                 405                 410                 415     Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu             420                 425                 430         His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly         435                 440                 445     <![CDATA[<210> 18]]>
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          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1               5                   10                  15      Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr             20                  25                  30          Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile         35                  40                  45              Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly     50                  55                  60                  Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65                  70                  75                  80  Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr                 85                  90                  95      Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala             100                 105                 110         Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly         115                 120                 125             Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala     130                 135                 140                 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145                 150                 155                 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser                 165                 170                 175     Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr             180                 185                 190         Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser         195                 200                 205             Phe Asn Arg Gly Glu Cys     210                 <![CDATA[<210> 19]]>
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          <![CDATA[<223> 重鏈 - 純系IV]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Leu Gln Leu Gly Gly 1               5                   10                  15      Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr             20                  25                  30          Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val         35                  40                  45              Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val     50                  55                  60                  Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65                  70                  75                  80  Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys                 85                  90                  95      Val Lys Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr             100                 105                 110         Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu         115                 120                 125             Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys     130                 135                 140                 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145                 150                 155                 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser                 165                 170                 175     Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser             180                 185                 190         Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn         195                 200                 205             Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His     210                 215                 220                 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225                 230                 235                 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr                 245                 250                 255     Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu             260                 265                 270         Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys         275                 280                 285             Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser     290                 295                 300                 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305                 310                 315                 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile                 325                 330                 335     Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro             340                 345                 350         Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu         355                 360                 365             Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn     370                 375                 380                 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385                 390                 395                 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg                 405                 410                 415     Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu             420                 425                 430         His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly         435                 440                 445     <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 214]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人造序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 輕鏈 – 純系IV]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1               5                   10                  15      Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr             20                  25                  30          Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile         35                  40                  45              Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly     50                  55                  60                  Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65                  70                  75                  80  Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr                 85                  90                  95      Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala             100                 105                 110         Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly         115                 120                 125             Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala     130                 135                 140                 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145                 150                 155                 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser                 165                 170                 175     Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr             180                 185                 190         Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser         195                 200                 205             Phe Asn Arg Gly Glu Cys     210                 <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 13]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人造序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 抗原決定基]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          Asp Ser Thr Lys Asp Leu Pro Asp Asp Val Ile Thr Phe 1               5                   10              <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 751]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 現代人]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
          Asn Tyr Gln Asn Gly Lys Asn Asn Val Pro Arg Leu Lys Leu Ser Tyr 1               5                   10                  15      Lys Glu Met Leu Glu Ser Asn Asn Val Ile Thr Phe Asn Gly Leu Ala             20                  25                  30          Asn Ser Ser Ser Tyr His Thr Phe Leu Leu Asp Glu Glu Arg Ser Arg         35                  40                  45              Leu Tyr Val Gly Ala Lys Asp His Ile Phe Ser Phe Asp Leu Val Asn     50                  55                  60                  Ile Lys Asp Phe Gln Lys Ile Val Trp Pro Val Ser Tyr Thr Arg Arg 65                  70                  75                  80  Asp Glu Cys Lys Trp Ala Gly Lys Asp Ile Leu Lys Glu Cys Ala Asn                 85                  90                  95      Phe Ile Lys Val Leu Lys Ala Tyr Asn Gln Thr His Leu Tyr Ala Cys             100                 105                 110         Gly Thr Gly Ala Phe His Pro Ile Cys Thr Tyr Ile Glu Ile Gly His         115                 120                 125             His Pro Glu Asp Asn Ile Phe Lys Leu Glu Asn Ser His Phe Glu Asn     130                 135                 140                 Gly Arg Gly Lys Ser Pro Tyr Asp Pro Lys Leu Leu Thr Ala Ser Leu 145                 150                 155                 160 Leu Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Ser Gly Thr Ala Ala Asp Phe Met Gly                 165                 170                 175     Arg Asp Phe Ala Ile Phe Arg Thr Leu Gly His His His Pro Ile Arg             180                 185                 190         Thr Glu Gln His Asp Ser Arg Trp Leu Asn Asp Pro Lys Phe Ile Ser         195                 200                 205             Ala His Leu Ile Ser Glu Ser Asp Asn Pro Glu Asp Asp Lys Val Tyr     210                 215                 220                 Phe Phe Phe Arg Glu Asn Ala Ile Asp Gly Glu His Ser Gly Lys Ala 225                 230                 235                 240 Thr His Ala Arg Ile Gly Gln Ile Cys Lys Asn Asp Phe Gly Gly His                 245                 250                 255     Arg Ser Leu Val Asn Lys Trp Thr Thr Phe Leu Lys Ala Arg Leu Ile             260                 265                 270         Cys Ser Val Pro Gly Pro Asn Gly Ile Asp Thr His Phe Asp Glu Leu         275                 280                 285             Gln Asp Val Phe Leu Met Asn Phe Lys Asp Pro Lys Asn Pro Val Val     290                 295                 300                 Tyr Gly Val Phe Thr Thr Ser Ser Asn Ile Phe Lys Gly Ser Ala Val 305                 310                 315                 320 Cys Met Tyr Ser Met Ser Asp Val Arg Arg Val Phe Leu Gly Pro Tyr                 325                 330                 335     Ala His Arg Asp Gly Pro Asn Tyr Gln Trp Val Pro Tyr Gln Gly Arg             340                 345                 350         Val Pro Tyr Pro Arg Pro Gly Thr Cys Pro Ser Lys Thr Phe Gly Gly         355                 360                 365             Phe Asp Ser Thr Lys Asp Leu Pro Asp Asp Val Ile Thr Phe Ala Arg     370                 375                 380                 Ser His Pro Ala Met Tyr Asn Pro Val Phe Pro Met Asn Asn Arg Pro 385                 390                 395                 400 Ile Val Ile Lys Thr Asp Val Asn Tyr Gln Phe Thr Gln Ile Val Val                 405                 410                 415     Asp Arg Val Asp Ala Glu Asp Gly Gln Tyr Asp Val Met Phe Ile Gly             420                 425                 430         Thr Asp Val Gly Thr Val Leu Lys Val Val Ser Ile Pro Lys Glu Thr         435                 440                 445             Trp Tyr Asp Leu Glu Glu Val Leu Leu Glu Glu Met Thr Val Phe Arg     450                 455                 460                 Glu Pro Thr Ala Ile Ser Ala Met Glu Leu Ser Thr Lys Gln Gln Gln 465                 470                 475                 480 Leu Tyr Ile Gly Ser Thr Ala Gly Val Ala Gln Leu Pro Leu His Arg                 485                 490                 495     Cys Asp Ile Tyr Gly Lys Ala Cys Ala Glu Cys Cys Leu Ala Arg Asp             500                 505                 510         Pro Tyr Cys Ala Trp Asp Gly Ser Ala Cys Ser Arg Tyr Phe Pro Thr         515                 520                 525             Ala Lys Arg Arg Thr Arg Arg Gln Asp Ile Arg Asn Gly Asp Pro Leu     530                 535                 540                 Thr His Cys Ser Asp Leu His His Asp Asn His His Gly His Ser Pro 545                 550                 555                 560 Glu Glu Arg Ile Ile Tyr Gly Val Glu Asn Ser Ser Thr Phe Leu Glu                 565                 570                 575     Cys Ser Pro Lys Ser Gln Arg Ala Leu Val Tyr Trp Gln Phe Gln Arg             580                 585                 590         Arg Asn Glu Glu Arg Lys Glu Glu Ile Arg Val Asp Asp His Ile Ile         595                 600                 605             Arg Thr Asp Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ser Leu Gln Gln Lys Asp Ser     610                 615                 620                 Gly Asn Tyr Leu Cys His Ala Val Glu His Gly Phe Ile Gln Thr Leu 625                 630                 635                 640 Leu Lys Val Thr Leu Glu Val Ile Asp Thr Glu His Leu Glu Glu Leu                 645                 650                 655     Leu His Lys Asp Asp Asp Gly Asp Gly Ser Lys Thr Lys Glu Met Ser             660                 665                 670         Asn Ser Met Thr Pro Ser Gln Lys Val Trp Tyr Arg Asp Phe Met Gln         675                 680                 685             Leu Ile Asn His Pro Asn Leu Asn Thr Met Asp Glu Phe Cys Glu Gln     690                 695                 700                 Val Trp Lys Arg Asp Arg Lys Gln Arg Arg Gln Arg Pro Gly His Thr 705                 710                 715                 720 Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu Gln Glu Asn Lys Lys Gly                 725                 730                 735     Arg Asn Arg Arg Thr His Glu Phe Glu Arg Ala Pro Arg Ser Val             740                 745                 750

Claims (12)

  1. 一種抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段於製造用於治療視網膜靜脈阻塞(RVO)之藥物中之用途，其中該抗體或其片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列(H-CDR3)；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 5所示的胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列(L-CDR3)。
  2. 如請求項1之用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10相同之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列相同之胺基酸序列。
  3. 如請求項1之用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10相同之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列相同之胺基酸序列；其中：該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列(H-CDR3)；及該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 5所示的胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列(L-CDR3)。
  4. 如請求項1之用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10所示的胺基酸序列及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列。
  5. 如請求項1之用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列；b. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列；c. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 12所示的胺基酸序列；或d. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列。
  6. 如請求項1之用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含：重鏈，其包含SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列；及輕鏈，其包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列。
  7. 如請求項1之用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a. 包含SEQ ID NO: 14所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列之輕鏈；b. 包含SEQ ID NO: 16所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列之輕鏈；c. 包含SEQ ID NO: 17所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 18所示的胺基酸序列之輕鏈；或d. 包含SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列之輕鏈。
  8. 如請求項1至7中任一項之用途，其中該視網膜靜脈阻塞(RVO)係選自由以下組成之群：中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、半球視網膜靜脈阻塞(HRVO)、分支視網膜靜脈阻塞(BRVO)及視網膜動脈栓塞疾病。
  9. 一種抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段於製造用於治療視網膜栓塞疾病之藥物中之用途，其中該抗體或其片段結合至如以SEQ ID NO: 22所述的人類Sema3A之胺基酸370至382之區域內的至少一個胺基酸殘基。
  10. 如請求項9之用途，其中該抗體或其片段結合至SEQ ID NO: 21。
  11. 如請求項1至7、9及10中任一項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段係藉由非經腸投與途徑、靜脈內投與途徑、玻璃體內投與途徑或皮下投與途徑投與。
  12. 如請求項1至7、9及10中任一項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段係藉由玻璃體內途徑投與。
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