TWI826421B

TWI826421B - 利用營養性萌發因子組成物及細菌孢子改良水產養殖池水品質之方法

Info

Publication number: TWI826421B
Application number: TW108105090A
Authority: TW
Inventors: 查理斯格林沃; 加百利伊佛瑞; 茱蒂普魯特; 阿曼達羅斯瑪琳; 喬登雀奇; 丹尼爾艾柏立; 喬治亞博吉; 史蓋勒懷特; 海寶高; 克里斯多夫沙納; 凱莉吉雷斯皮
Original assignee: 美商Ｎｃｈ公司
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2019-02-15
Publication date: 2023-12-21
Also published as: CA3088139C; EP3758475A1; MX2020008635A; BR112020013121A2; CA3088139A1; TW201940063A; PH12020500607A1; BR112020013121B1; CN111770681A; MY207568A; NZ765729A; CO2020011856A2; EP3758475A4; WO2019168627A1

Abstract

一種改良用於水產養殖應用之池水品質之方法，其係藉由於該池水中添加活性細菌(這些活性細菌較佳為使用營養性萌發因子組成物以及用於增加孢子萌發效率的培育方法在現場從孢子萌發)，結合如碳酸鈣或鈣化海藻之硝化作用增進劑，以及任選的反應表面積修飾劑，例如鈣化海藻或塑膠或金屬顆粒或斷片。營養性萌發因子組成物包括L-胺基酸、D-葡萄糖與/或D-果糖、磷酸鹽緩衝液、工業防腐劑，並且可包含細菌孢子(較佳為一或多種芽孢桿菌屬菌種)或是它們可個別組合用於萌發。培育方法包括將營養性萌發因子組成物與細菌孢子加熱至35℃至60℃的溫度範圍約2至60分鐘，以產生培育的細菌溶液，其排放至該水產養殖應用。

Description

利用營養性萌發因子組成物及細菌孢子改良水產養殖池水品質之方法

本發明是關於以營養性萌發因子組成物中萌發的細菌以及利用使用點(point-of-use)孢子培育法處理水產養殖池水以減少水生家畜應用中的有機廢物、氨與病害壓力且對於水產養殖物種提供益生菌。

水產養殖係指飼養用作為人類或動物食物來源的水生物種。該技術將一些類型的控制運用到所飼養物種的自然環境以改善整體的產量。此可包含在野外人工孵化物種以增加動物的商業化產量、在圈圍池中孵化及飼養物種、以及在鄰近海岸線潮汐排洩之封閉區域孵化及飼養物種。伴隨此方法的問題包含：飼養設施所排出的污染物並將惡化附近水的品質；由於飼養設施中惡化的水質造成產物損失；以及伴隨著飼養設施中病原微生物增加的病害壓力。此等問題可通過測試或監測各種參數，包含pH、傳導性、氨、硝酸鹽、磷酸鹽及鹼度來界定。傳導性為鹽含量的指標，量大於1200ppm就不再被認為是淡水；理想的量為700ppm及300-1200ppm的範圍。氨的程度測量魚可利用的氧量。高量的氨阻止氧在魚中從鰓轉移到血液；然而，其亦為牠們代謝廢物的產物。雖然來自魚的廢物的氨本身通常不足以濃縮到有毒，但是因為每池魚的高濃度，養魚人必須密切監測氨的程度。氧係被池中的硝化菌消耗(其將有毒氨分解成無毒的形式)；然而，氧的此大量使用減少了供魚攝取之可利用的氧。氨的程度>1ppm被認為對魚的生存有毒。此外，檢驗硝酸鹽的程度來測定在水中植物肥料的量。硝酸鹽係可從周圍土壤高度浸出的，且會對小孩和懷孕婦女有害。硝酸鹽在胃腸道中變成亞硝酸鹽，並與血液攜帶氧的能力交互作用。硝酸鹽之最大污染程度為10ppm。鹼度係測量池或湖泊之中和酸而不改變pH的能力。鹼度會因為細菌而隨著時間減少；然而理想的程度為100ppm，以50-200ppm為可接受的範圍。存在於池及湖泊中的磷酸鹽大部分是來自人類及動物廢物。肥料逕流(fertilizer run-off)為存在於高爾夫球場及觀賞池中之磷酸鹽的主要來源。升高的程度導致優養化(eutrophication)速率增加，進而增加污泥的產生。適度的磷酸鹽程度能促進植物生長，導致藻類生產的增加；程度>0.1ppm為加速植物生長的指標，且被認為超出可接受的程度。

現行解決這些問題的技術包含生物整治(bioremediation)、抗生素及化學添加劑。典型的生物整治技術包含於水中施用補充的細菌以增強微生物活性來改善水的品質。亦已知使用硝化劑(nitrifier)來增強硝化過程以將有毒氨轉換成無毒硝酸鹽。添加化學添加劑來改善水的品質，並藉由提供額外的營養素及鹼度以有助於微生物活性。添加抗生素來抑制病原微生物的生長。與現行技術相關的問題包含：用非活性補充細菌之高成本及低的水品質改善表現、因為有機廢物的存在及缺乏硝化劑生長位置所導致的低的硝化作用活性、以及抗生素在所飼養的水生物種中之生物累積。

根據美國專利申請案第14/720,088號揭露的較佳方法，使用生物產生器可在現場(on-site)產生活性細菌，從固體細菌起始材料中將細菌培育成有用的族群(population)。而後，活性細菌可從一或多個生物產生器排放至水產養殖應用中。例如，美國專利第6,335,191、7,081,361、7,635,587、8,093,040、與8,551,762號揭露此等生物產生器及其使用方法，其內容藉由引用併入本揭露中。然而，在水產養殖應用中在使用時有另一種從孢子產生活性細菌的方法是有用的。

孢子萌發是多步驟致使過程，其中孢子有效地喚醒或從休眠狀態恢復到營養生長狀態。第一步是藉由稱為萌發因子的環境訊號活化孢子並誘導其發芽的步驟。此訊號為營養素，例如L-胺基酸。營養性萌發因子結合至孢子之內膜中的受體以起始萌發。此外，已經顯示糖增加L-胺基酸對其同源受體的結合親和力。

萌發因子信號而後啟動級聯(cascade)，其導致吡啶二甲酸(Dipicolinic Acid，DPA)的釋放，其與Ca²⁺以1：1的比例(CaDPA)儲存在孢子核心中。CaDPA的釋放是快速的過程，通常在2分鐘內完成>90%。CaDPA釋放代表孢子致力於萌發過程的不歸點(point of no return)。該技藝中有知識的人稱此步驟為「承諾(commitment)」步驟。

在CaDPA釋放之後，孢子局部水合，且核心pH升至約8.0。而後，孢子的核心膨脹，且皮質(主要由肽聚醣(peptidoglycan)組成)被核心溶解酶降解。孢子吸收水分，因而失去其折射率。此折射率損失一直到萌發過程結束使得經由相差顯微鏡監測孢子萌發。

萌發的第二階段是向外生長(outgrowth)步驟，其中孢子的代謝、生物合成和DNA複製/修復途徑開始。向外生長期間有幾個相。第一個被稱為成熟期，其中不發生形態變化(例如細胞生長)，但孢子的分子機制(例如轉錄因子、轉譯機制、生物合成機制等)被活化。此期間的長度可依據孢子形成過程中與孢子包裝的初始資源而變化。例如，一些芽孢桿菌屬菌種(包含枯草芽孢桿菌)的較佳碳源是蘋果酸(malate)，芽孢桿菌孢子通常含有大池(large pool)的蘋果酸，其是使用於恢復(revival)過程中。有趣的是，無法利用蘋果酸池的缺失突變展現延長的成熟期，這表示孢子蘋果酸池足以供給初始向外生長過程的能量。此外，孢子儲存小的酸溶性(acid-soluble)蛋白質，這些蛋白質在復甦的前幾分鐘內被降解，作為蛋白質合成的胺基酸之立即來源。在向外生長步驟之後，孢子恢復完全，細胞被認為是營養生長(vegetatively growing)。

已知可經由熱活化而誘導孢子萌發。已於菌株特定的溫度下熱活化各種芽孢桿菌屬菌種的孢子。例如，於75℃下將枯草芽孢桿菌(B.subtilis)孢子熱活化30分鐘，而於65℃下將地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)孢子熱活化20分鐘。已顯示熱活化造成孢子外殼蛋白質的短暫可逆的展開(unfolding)。熱活化的孢子可在萌發緩衝液(含有營養性萌發因子，例如L-丙胺酸)中萌發更長的時間。然而，如果沒有營養性萌發因子存在，則孢子將返回它們的加熱前非萌發狀態。

亦已知可在環境溫度(接近典型的室溫)下沒有熱活化且用含有營養素的萌發緩衝液發生萌發，但是該過程通常比用熱活化需要更長的時間。例如地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)孢子分別在35℃或37℃萌發，但在含有營養性萌發因子的萌發緩衝液中需要較長的時間(例如2小時)。此外，已經知道枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的非熱活化的孢子已在非營養性萌發因子條件(例如CaCl₂+Na₂DPA)中萌發一段延長的時間。

亦已知在實驗室裝置中以兩步驟方法結合使用熱活化與營養性萌發因子以萌發孢子。首先藉由在65-75℃的溫度下培育一段時間(例如30分鐘)來熱活化孢子(此特定溫度取決於物種)。而後，將孢子轉移至含有營養性萌發因子(例如L-丙胺酸)的緩衝液溶液中。亦已知，在16-40℃(更佳為在29-32℃之間)的受控溫度範圍，在位於使用位置附近的生長室中，藉由將粒狀營養物質(含有醣、酵母菌萃取物、以及非直接孢子萌發因子的其他營養素)、細菌起始子(bacteria starter)和水饋入到生長室中培育細菌如美國專利第7,081,361號中所揭露的生長期間為約24小時。

需要快速孢子培育與活化方法，其將允許於使用點位置(point-of-use location)在單一步驟中產生活性細菌(例如芽孢桿菌屬菌種)，其中細菌將被排放至水產養殖應用中。據此，本發明描述用於水產養殖應用中孢子萌發的簡單方法，該方法使用營養性萌發因子濃縮物結合孢子組成物、或使用營養性孢子組成物，在單一步驟中同時熱培育。

本發明之方法提供一種成本有效的方法以遞送活性細菌至水產養殖設施中的池水(或是生長池)，以降解有機廢物並抑制病原微生物的生長而沒有生物累積。本發明的方法降低水家畜中的疾病壓力，導致改善水產養殖操作中飼養的物種的收穫。添加本文所述之硝化作用增強劑作為該方法的一部分，為硝化劑提供穩定的鹼度來源與額外的生長位置，以促進硝化作用活性與氨還原。

本發明之方法理想地包含遞送活性細菌至水產養殖應用中，該活性細菌任選地包含益生菌細菌，最佳是使用液體營養性萌發因子濃縮物與孢子形式的細菌從現場培育器產生的。根據本發明之一較佳實施例的營養性萌發因子組成物包括許多L-胺基酸中的一種或組合、任選地D-葡萄糖(其增加L-胺基酸對孢子外殼中它們的同源受體的結合親和力)、及中性緩衝液，例如磷酸鹽緩衝液，以及工業防腐劑，例如市售可得之Kathon/Lingaurd CG(其具有包括甲基氯異噻唑啉酮(methyl chloro isothiazolinone)與甲基異噻唑啉酮(methyl isothiazolinone)之活性成分)。根據本發明之另一較佳實施例的營養性萌發因子組成物包括一種或二種或多種L-胺基酸的組合、任選地D-葡萄糖(其增加L-胺基酸對孢子外殼中它們的同源受體的結合親和力)、HEPES溶液鹽(生物緩衝液，對孢子萌發提供適當的pH)、以及工業防腐劑，例如對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben)與對羥基苯甲酸甲酯(methylparaben)的組合或是其他美國聯邦GRAS(一般認為安全(Generally Regarded As Safe))防腐劑。根據另一較佳實施例，孢子組成物亦包括鉀離子的來源，例如氯化鉀或磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀。根據另一較佳實施例，孢子組成物包含D-葡萄糖與D-果糖二者。

根據另一較佳實施例，營養性萌發因子組成物亦包括一或多種細菌菌種的孢子，較佳為芽孢桿菌屬菌種，但亦可使用其他細菌，並且包含萌發抑制劑(例如 NaCl、工業防腐劑、或D-丙胺酸)，結合前述孢子組成物成分中的任何一者。萌發抑制劑防止孢子在營養性萌發因子組成物中提早萌發。萌發抑制劑可包含防止孢子萌發的化學物，例如NaCl、工業防腐劑、或D-丙胺酸。

或者，可分別提供細菌孢子，並且在使用點與培育時添加至根據本發明之營養性-萌發因子組成物。當分別添加時，較佳為提供穩定的孢子懸浮液孢子組成物，其包括一或多種細菌菌種，較佳為芽孢桿菌屬菌種。根據一較佳實施例，孢子組成物包括細菌孢子、約0.00005至3.0%重量的界面活性劑、約0.002至5.0%重量的增稠劑、以及任選地約0.01至2.0%重量的酸化劑、酸或酸的鹽類(包含作為防腐劑或穩定劑的那些)，餘量為水。根據另一較佳實施例，孢子組成物包括細菌孢子、約0.1至5.0%重量的增稠劑、約0.05至0.5%重量的酸或酸的鹽類、任選地約0.1-20%重量的水活性減少劑、以及任選地約0.1%至20%的額外酸化劑(酸或酸的鹽類)，餘量為水。

最佳地，在兩個較佳的孢子組成物實施例中的細菌孢子是40-60%鹽(食鹽)與60-40%細菌孢子(在添加至孢子組成物之前)的乾燥粉末混合物，其組合佔孢子組成物重量的約0.1至10%。孢子組成物較佳包括約1.0×10⁸至約3.0×10⁸cfu/ml的孢子組成物(孢子懸浮液)，當用飲用水將其稀釋(用於動物灑水應用)時，在飲用水中提供約10⁴至10⁶cfu/ml細菌菌株。最佳地，在兩個較佳實施例中的增稠劑為亦作為益生素(例如三仙膠)以提供額外的效益。雖然可使用其他市售可得的孢子產品，但用於本發明之較佳的孢子組成物係如2014年10月27日申請之美國專利申請案第14/524,858號所揭露的，該揭露內容藉由引用併入本文。

根據另一較佳實施例，根據本發明之營養性萌發因子組成物為濃縮形式並且在使用點將其在水或另一種稀釋劑中稀釋至0.01%至10%濃度。使用濃縮配方減少運送、儲存與包裝成本，並且使得在使用點投予孢子組成物更為容易。最佳地，濃縮的孢子組成物為液體形式，其在使用點與稀釋劑混合更容易且更快，但亦可使用固體形式，例如小丸或磚或粉末。在孢子組成物中包含一般的工業防腐劑有助於長期儲存和/或萌發抑制，這在當孢子組成物為較佳的濃縮形式時特別有用。

在另一較佳實施例中，本發明包括萌發芽孢桿菌屬菌種之孢子的方法，其使用營養性萌發因子組成物結合孢子組成物或在升高的溫度(較佳為35-60℃的範圍中，更佳為38-50℃的範圍中，以及最佳為41℃至44℃的範圍中)使用營養性孢子組成物一段時間(培育期間)。培育期間的範圍較佳為2-60分鐘，或較長，取決於應用。最佳地，在本發明的培育/萌發方法中使用根據本發明較佳實施例之濃縮形式的營養性-萌發因子組成物或營養性孢子組成物，但亦可使用其他的營養性-萌發因子組成物與孢子組成物。較佳地，該培育方法在使用點或使用點附近進行(該使用點為萌發的孢子將被使用或消耗之水產養殖位置或接近水產養殖位置)並且進一步包括將萌發的孢子分散至使用點/消耗。本發明之較佳的方法可在任何培育裝置中進行，該培育裝置具有可容納一定體積的孢子(如果分別添加)、液體(通常是水作為稀釋劑)、營養性萌發因子組成物，並且能夠在培育期間加熱混合物的儲存庫(reservoir)。最佳地，該方法在可混合這些成分、在培育期間結束時自動關閉加熱且將包括細菌之培育的細菌溶液分散至水產養殖使用點/消耗的裝置中進行。較佳的方法亦可用批次程序或連續程序進行。雖然較佳為使用根據本發明之孢子組成物，但各種孢子形式或產品(例如乾燥粉末形式、液體懸浮液、或重組的水性混合物)可與本發明之方法一起使用。

本發明之較佳實施例使得可在水產養殖使用點快速萌發芽孢桿菌屬菌種的孢子。從培育器排放之活性營養細菌可直接提供至生長池，或是在將它排放至生長池之前，可累積且用池水或另一類似合適的稀釋劑(例如來自市政水系統的水)稀釋。或者，培育器可經配置以加熱營養性萌發因子組成物與孢子、或營養性孢子組成物，用於將在休眠孢子與營養細菌之間的亞穩狀態產生細菌之培育期間與溫度範圍。而後，將亞穩細菌溶液排放至生長池中，在那裡細菌可變成活性營養細菌。如果培育器與生長池相距一些距離，則稀釋可有助於將處理溶液從培育器遞送至生長池。活性細菌將降解有機廢物並且抑制水產養殖設施中的水中之病原微生物的生長，而不需要添加(或減少用量)生長池中使用的化學處理與抗生素。

本發明亦理想地包含同時施加至少一種硝化作用增強劑至生長池。硝化作用增強劑增加在水中天然發現的硝化細菌之活性以降低氨程度。由於硝化細菌生長為生物膜且需要它們可附著的表面，因此這些硝化作用劑包括鹼度增強劑，其增加水的鹼度，這是硝化作用(7份鹼度對一份氨)與/或表面積修飾劑增加硝化細菌生長之表面所需要的。鹼度增強劑可包含例如碳酸鈣、鈣化海藻或其他類似的有效添加劑。這些試劑可以以高於溶解量的量加入，以於它們緩慢溶解時提供持續的鹼度來源。一些硝化作用劑(亦如鈣化海藻)藉由提供鹼度與高表面積而作為鹼度增強劑與表面積修飾劑二者，為硝化劑的生物膜提供支撐表面以生長。鈣化海藻亦作為細菌微量的來源。其他的硝化作用增強劑僅作為表面積修飾劑，例如塑膠或金屬片，或其他類似的有效材料，以增加可發生有利反應和相互作用的表面積。一種或多種僅作為表面積修飾劑(而非鹼度增強劑)的試劑也可單獨或較佳與一種或多種鹼度增強劑結合添加至生長池；然而，僅作為表面積增強劑的試劑在生長池中不會降解，並且不會與每批次的細菌溶液一起添加。僅用作表面積修飾劑的此等試劑較佳為僅添加至生長池一次。基於週期性基礎，例如季節性(每季一次或是每個夏天一次、一年兩次等)或如果需要，將作為鹼度增強劑的試劑與批次的細菌同時添加至生長池。如本文所用，用語「同時」意指「在或約」時間將批次的營養細菌和其他成分或試劑添加至生長池或其他生長培育基中，其中水生物種在水產養殖設施中生長。

10:現場培育器系統

12:營養性萌發因子組成物

14:孢子組成物

16:水的來源

18:培育器

20:培育的細菌溶液

22:生長池

110:培育器系統

24:濃縮的營養性萌發因子組成物

26:水/稀釋劑

28:工作營養性萌發因子組成物

30:濃縮的孢子組成物

32:工作孢子組成物

210:系統

34:濃縮的營養性孢子組成物

36:工作營養性孢子組成物

於以下圖式中進一步描述與說明本發明之系統與方法。

圖1為根據本發明之較佳實施例的培育系統與方法之流程圖。

圖2為根據本發明之另一較佳實施例的培育系統與方法之流程圖。

圖3為根據本發明之另一較佳實施例的培育系統與方法之流程圖。

圖4為實驗室研究中硝酸鹽程度的圖式。

圖5為實驗室研究中正磷酸鹽程度的圖式。

圖6為實驗室研究中濁度的圖式。

圖7為顯示相較於控制組載玻片之使用根據本發明較佳實施例的孢子組成物與方法的細菌載玻片之照片。

圖8為顯示pO₂測試數據以證實相較於控制組測試之使用根據本發明較佳實施例之孢子組成物與方法的萌發程度的圖式。

圖9為顯示pO₂測試數據以證實相較於控制組測試之使用根據本發明較佳實施例之孢子組成物與變化的方法的萌發程度之圖式。

圖10顯示三種水族箱的影像，各自為控制組(左)、僅碳酸鈣處理(中間)、或用活化的營養性-孢子配方處理(右)。

水產養殖處理方法

根據一較佳實施例，較佳為使用培育器系統與如下所述之較佳的萌發方法，從營養性萌發因子組成物結合孢子組成物或從預先混合的營養性孢子組成物，在現場(on site)產生活性細菌，並且將活性細菌週期性地饋入水產養殖應用中的生長池中。亦將一種或多種硝化作用增強劑同時添加至具有活性細菌的生長池中。

用於本發明之方法中的令人滿意的細菌生長及遞送裝置將包含現場培育器系統，例如空氣培育器、水培育器、或提供均勻恆熱的任何其他腔室或類似裝置，在需要的給定溫度範圍內使孢子萌發以排放至水產養殖應用中。參閱圖1，較佳為現場培育器系統10含有一或多個槽或容納容器，用於容納營養性萌發因子組成物12的初始體積與細菌孢子溶液14(如果細菌孢子未包含在營養性萌發因子組成物中)的初始體積。這些孢子組成物亦可在容器中到達使用位置，該容器可與培育器流體連通地連接，在這種情況下，不需要個別的槽或容器。在水產養殖位置或其附近的水16之來源亦任選地，但較佳為可與培育器系統流體連通地連接。井、市政供水源或生長池可向培育器18 提供水16。培育器系統10亦較佳地包括腔室或容器18經配置以接收一部分的營養性萌發因子組成物與孢子，並且允許它們加熱以萌發孢子；加熱器；閥、管子、以及幫浦(根據需要，如果重力流量不足)使得營養性萌發因子組成物12、細菌孢子溶液14與任選的水16從它們的儲存容器/來源流至加入腔室或容器18中，並且將培育的細菌(或活化的細菌)溶液20從加熱腔室或容器18排出並將其遞送至生長池22；在加熱腔室或容器18內之任選的混合器、以及控制器或計時器以啟動該閥、幫浦、任選的混合器、及加熱器以控制營養素和孢子組成物流入加熱腔室中、培育時間和溫度，並且排放至生長池。最佳地，現場培育器系統10使用營養性萌發因子組成物結合細菌孢子組成物(如下所述)或是使用營養性孢子組成物(與細菌孢子預先混合的營養性萌發因子組成物，亦如下所述)(在本文中亦稱為「起始材料(starter material)」)，以產生所培育的細菌容器20而被排放至生長池22中。

或者，根據圖2所示之另一較佳實施例，培育器系統110使用濃縮的營養性萌發因子組成物24與濃縮的孢子組成物30，將其從容器/來源26用稀釋劑或水稀釋以形成工作營養性萌發因子組成物28與工作孢子組成物32，將各自的一部分饋送至培育器18中以產生批次的活化細菌20。亦可使用來自來源16的水作為代替來源26或除了來源26之外的稀釋劑來源。此外，只有一種營養性萌發因子組成物24或孢子組成物30可為濃縮形式，並且在饋入培育器18之前需要稀釋。根據另一較佳實施例，當只有一者為濃縮時，可使用非濃縮的組成物作為除了來源26與/或來源16的水/稀釋劑之外用於濃縮的組成物的稀釋劑。根據另一較佳實施例，濃縮的營養性孢子組成物34與系統210一起使用，如圖3所示。在將濃縮的營養性孢子組成物饋入至培育器18之前，用來自來源26與/或來源16的水/稀釋劑稀釋以形成工作營養性孢子組成物36來產生批次的活化細菌20。或者，營養性孢子組成物可以不是濃縮形式且在饋入至培育器18之前不需要任何稀釋劑(類似於圖1中直接饋入營養性萌發因子組成物12)，在此情況下，不需要水/稀釋劑來源26。在此替代實施例中，根據需要，來自來源16的水仍可任選地饋入至培育器18中。用培育細系統實施例中的任何一者，可將稀釋劑饋入至培育器18中以於培育器中而非在饋入至培育器前稀釋濃縮的組成物。該技藝中具有通常技術之人士將理解可將來自系統10、110與210的元件之任何組合一起使用。

較佳地，根據本文所述之較佳萌發方法，在培育器18或其他合適的加熱裝置中萌發細菌孢子。根據一較佳實施例，在培育器18中將營養性萌發因子組成物與孢子組成物(或營養性孢子組成物)加熱至溫度為35-55℃的範圍，較佳為38-50℃的範圍，以及最佳為41℃至44℃的範圍。培育期間可依照終端使用應用而改變，但對於水產養殖應用產生活性細菌較佳為約20分鐘至60分鐘，且對於益生菌應用最佳為約2分鐘至5分鐘以產生亞穩狀態 (metastable state)細菌。為了對於營養細菌(vegetative bacteria)提供額外的生長時間，培育期間可為約4至6小時。

依照在水產養殖應用中所需要的細菌用途，例如用以處理水或是用於水生物種的益生菌，不同的培育期間可用以提供培育的細菌溶液，其主要仍為孢子形式細菌，主要為亞穩狀態細菌(其中孢子既不是休眠也不在營養生長相，在本文中亦稱為活化狀態)，或是主要為完全營養細菌(fully vegetative bacteria)。此外，當需要完全營養細菌時，在培育期間之後，細菌溶液可保持在培育器18或另一個中間容器內一段時間，以使細菌在排入水產養殖應用之前繁殖。最佳地，細菌溶液將可維持在30至45℃之間的溫度，更佳地，根據需要，將營養細菌溶液加熱以將溶液的溫度維持在33至42℃的範圍中，且最佳為36°至39℃的範圍中，以利於此後培育生長期間的生長。當需要益生菌應用時，當藉由使用較短的潛伏期排放到水產養殖應用中時，細菌主要保持在孢子狀態或亞穩狀態，這使細菌有更好的機會存活到水生物種的腸道，在那裡它們作為益生菌最有利。在培育期間結束時，培育的細菌溶液20被排放至生長池。取決於使用的細菌種類、培育溫度、培育時間、以及使用的營養素含量，培育的細菌溶液20可包括完全營養細菌、亞穩狀態細菌、孢子、或其組合。

每一批次之培育的細菌溶液20包括約1x10⁸-1×10¹⁰cfu/mL的亞穩狀態、營養細菌種類與/或孢子。一旦排放至生長池22中，基於生長池中的水量而稀釋每一批次的細菌量。最佳地，添加足夠量的細菌溶液20至生長池22，以基於生長池中的稀釋而提供有效量的活化細菌。在此文中，「有效量」可指細菌與/或營養性組成物在投予之後有效改良植物或動物之效能的量。可藉由監測一或多個特性，包含但不限於水質：水的清澈度、氨程度、亞硝酸鹽程度、硝酸鹽程度、疾病發生率、死亡率、收穫重量、肉質、個體動物大小、優質重量(premium weight)、抗生素使用、以及添加劑使用來測量或評估效能的改良。「有效量」亦可指可減少動物的腸中一種或多種病原菌(包含但不限於大腸桿菌(Escherlchia coli)與沙門氏菌(Salmonella)的量、競爭性地排除和/或消除一種或多種病原菌的量。「有效量」亦可指可減少NH₃和/或H₂S程度的量，例如可由動物排泄到其環境中的量。

根據用於蝦水產養殖應用中的一較佳實施例，在生長成中的細菌之有效量可為約1至約9×10²CFU/mL。根據另一較佳實施例，用魚蝦水產養殖應用的有效量為約1至約9×10²至約10⁸CFU/mL。根據另一較佳實施例，在生長池中，培育的細菌之有效量可為生長池中水的總量的約0.001%至約2% v/v，以及其中的任何範圍或值。作為另一實例，對生長池投予約500mL培育的細菌溶液(包含約1×10⁹-1×10¹⁰cfu/mL的細菌菌種)每天四次將足以處理含有100,000加侖水的生長池。可使用其他體積的細菌溶液與劑量間隔以處理生長池，取決於池的大小、基於池條件、水生物種、池的溫度、以及其他因子，以達成池中所需的細菌之有效量，如該技藝中具有通常技術之人是所理解的。

可提供多個培育器系統10、110或210以提供較大量之培育的細菌溶液至生長池以達到加入池之需要的有效量，以提供不同的細菌種類至生長池或以不同時間或速率、和/或隔開在生長池周圍附近之培育的細菌溶液的排出以幫助細菌分散通過該池。亦可添加幫浦或其他混合裝置至生長池(如果尚未到位)以幫助分散培育的細菌溶液(以及硝化作用增強劑或是表面劑增強劑)於整個生長池。

現場培育器較佳為經配置以從營養性萌發因子組成物/孢子組成物或營養性孢子組成物培育多批次之培育的細菌溶液，使得在需要補充起始材料之前，可在很長一段時間內於週期性間隔排出多批次的細菌。例如，營養性萌發因子組成物12的容器初始可容納0.3至3公升的營養性萌發因子組成物，其可每1至24小時以約10至100mL的遞增量饋入至培育器。濃縮的營養性萌發因子溶液24的容器可初始容納0.2至1公升的溶液，用來自來源26或16的水/稀釋劑稀釋至濃縮物對水/稀釋劑的比率為約1：50至約1：10，以每1至24小時將約0.1至200mL之工作營養性萌發因子溶液28的量饋入培育器。分別饋入營養性發芽因子組成物的細菌孢子溶液14的容器可初始容納0.6至6公升的溶液，可將該溶液以每1至24小時約20至200mL的遞增量饋入至培育器。濃縮的細菌孢子溶液30的容器可初始容納 0.15至6公升的溶液，用來自來源26或16的水/稀釋劑稀釋至濃縮物對水/稀釋劑的比率為約1：10至約1：3，以將工作孢子溶液32以每1至24小時約5至200mL的遞增量饋入至培育器。營養性孢子組成物的容器可初始容納3至6公升的營養性萌發因子組成物，可將其以每1至24小時約100至200mL的遞增量饋入至培育器。濃縮的營養性孢子溶液34的容器可初始容納0.3至3公升的溶液，用來自來源26或16的水/稀釋劑稀釋至濃縮物對水/稀釋劑的比率為約1：10至約1：50，以將工作營養性孢子溶液36以每1至24小時約10至100mL的遞增量饋入至培育器。而後，將每一批次的營養性萌發因子組成物/細菌孢子或營養性孢子組成物培育在培育器中，如本文所述，以形成培育的細菌溶液，其被排放至水產養殖應用。

在處理循環(treatment cycle)的過程中，培育的細菌溶液20較佳為每4至6小時從一個或多個培育器18排放至生長池22一次。取決於池的大小、池/水生物種的條件、以及應用的種類，可使用其他的劑量間隔。藉由改變添加成分至培育箱的時間和/或培育時間，可根據需要而改變劑量之間的時間。培育的細菌溶液可更頻繁地排放至較大的池(例如，2000萬加侖)。關於水產養殖水處理應用，較佳為排放具有營養細菌之培育溶液。為了達成營養細菌，較佳為在排放至生長池之前培育至少4至6小時，儘管亦可使用更長的培育時間以使細菌繁殖更多時間。關於用於水產養殖應用中之水生物種的益生菌應用，較佳為培育約2至5分鐘。在該應用中，如果大池需要，可每天多次排放培育的細菌溶液20，甚至頻繁地每4至6分鐘一次。根據需要，週期性更換或補充饋入培育器之營養性萌發因子組成物/孢子組成物或營養性孢子組成物的體積。在全年運作的培育器中，處理循環較佳為連續進行(除了定期關閉以保養或補充營養性萌發因子組成物)。

如下所述的各種芽孢桿菌屬菌種(Bacillus species)較佳為與根據本發明的水產養殖處理方法一起使用，但也可以使用其他細菌。例如，適合用於本發明之方法中的細菌屬被認為包含芽孢桿菌屬(Bacillus)、擬桿菌屬(Bacteriodes)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、白念珠菌屬(Lueconostoc)、小球菌屬(Pediococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、巨球形菌屬(Megasphaera)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和丙酸桿菌屬(Propionibacterium)中的任何一種或多種。可現場產生的益生菌包含以下的一種或多種：嗜澱粉芽孢桿菌(Bacillus amylophilus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、棲瘤胃擬桿菌(Bacteriodes ruminocola)、棲瘤胃擬桿菌(Bacteriodes ruminocola)、豬擬桿菌(Bacterioides suis)、青少年雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、動物雙歧桿菌 (Bifidobacterium animalis)、兩叉雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophilum)、乳脂腸球菌(Enterococcus cremoris)、二丁酮腸球菌(Enterococcus diacetylactis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、中間腸球菌(Enterococcus intermedius)、乳酸腸球菌(Enterococcus lactis)、嗜熱腸球菌(Enterococcus thermophiles)、短乳酸桿菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳酸桿菌(Lactobacillus buchneri)、保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei)、纖維二糖乳酸桿菌(Lactobacillus cellobiosus)、彎曲乳酸桿菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbruekii)、香腸乳酸桿菌(Lactobacillus farciminis)、發酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus)、乳酸乳酸桿菌(Lactobacillus lactis)、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)、腸膜白念珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdennii)、乳酸小球菌(Pediococcus acidilacticii)、啤酒小球菌(Pediococcus cerevisiae)、戊糖小球菌(Pediococcus pentosaceus)、產丙酸丙酸桿菌(Propionibacterium acidipropionici)、費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、及謝氏丙酸桿菌 (Propionibacterium shermanii)。

用排放至生長池的至少一劑量(或批次)之培育的細菌溶液，較佳是同時添加一或多種硝化作用增強劑。可週期性地(例如季節性或根據需要)添加鹼度增強劑(包含碳酸鈣或鈣化海藻)以減少磷酸鹽，但不是與每一劑量的細菌一起添加。可以添加高於溶解量的量之試劑，以在它們緩慢溶解時提供持續的鹼度來源。緩慢溶解鹼度增強劑(例如鈣化海藻)亦作為表面積修飾劑，為硝化細菌的生物膜提供支持表面以生長，並且它們亦有助於營養素遞送。此外，可根據需要向生長池中添加僅作為表面積修飾劑(例如金屬片或塑膠片)的試劑以減少氮或磷，以及一批次或劑量之培育的細菌溶液和一或多種鹼度增強劑，但較佳為僅添加一次而不是與每一劑量之培育的細菌溶液一起添加。這些表面增強劑類似地為添加的細菌之生物膜提供支持表面，這有助於有益細菌的更快發育。最佳地，每750萬加侖的生長池中加入約100磅的此種硝化作用增強劑，且此量可依其他生長池體積進行調整。用於硝化作用增強劑之較佳分散方法可包含使用自動化裝置或手動應用於生長池中的水。可用於以小球、小丸(pellet)或顆粒的形式傳播或以其他分散至少一種硝化作用增強劑的自動或手動操作之裝置為市售的並且對於本技藝之技術人員為公知的。此外，可使用自分散添加劑系統和方法而將這些硝化作用增強劑分散在池中，該系統和方法在水溶性包裝中使用泡騰劑材料(effervescent material)和處理劑，其描述於 2015年4月17日申請之美國專利申請案第14/689,790號，該申請案經由引用併入本文。

用於本發明之方法的合適應用包含例如但不限於各種類型的水產養殖應用，例如孵化場、池和潮汐流水產養殖。結合使用萌發或營養細菌，較佳為在現場生長，以及至少一種硝化作用增強助劑，如碳酸鈣、鈣化海藻或其他材料，對於水產養殖應用中使用的水的成本有效處理同樣有效，以解決有機廢物、氨和病原微生物以及一般水質問題。相信藉由添加鈣化海藻或其他塑膠或金屬片、顆粒或斷片來增加可發生相互作用或反應的可用表面積，進一步增強用於實現這些目的之主題方法的有效性。

進行實驗室研究以評估將有益細菌和硝化作用增強劑添加至池水的益處。該研究的一個目標是評估添加的細菌(可從EcoBionics市售獲得的池混合物)作為對藻類生產的抑制或除草的功效。此研究使用6個2L燒杯，每個燒杯中裝滿1.5L來源水，該來源水是取自於存在藻類之已建立的魚缸。每個燒杯亦含有來自來源缸的一條金魚、空氣石、交替12小時開啟而後12小時關閉的光源、以及觀察玻璃蓋以減少蒸發損失。在使用37g的Pond Plus小丸之BIO-Amp^TM生物產生器中產生池混合物細菌溶液，而非使用根據下述之本發明的較佳實施例的培育器和營性養萌發因子組成物。在生物產生器中生長24小時後，獲得等分的細菌溶液並稀釋以維持3L的池混合物：579024加侖的池水之比率，然而，在該領域中使用的較佳比率為3L的池混合物：100,000加侖的池水。基於此比率，將約0.4μL的池混合物細菌溶液添加至具有1.5L的魚缸水之特定燒杯。根據製造商的說明，基於澄清速率將鈣化海藻添加至特定燒杯；這相當於每1.5公升的水中0.045g的鈣化海藻。將等量的碳酸鈣添加至該等燒杯中的一些燒杯。每一個燒杯中的添加劑如下所示：

根據將在本領域中使用的一種較佳劑量時間表處理每個測試燒杯。將具有池混合物的燒杯1、3和5每週以額外之0.4μL的池混合物處理(投予)一次。取決於生長池條件，該領域中可使用其他劑量時間表。在此研究開始時僅添加鈣化海藻和碳酸鈣一次，然而，可在該領域中使用額外的劑量。

從每個燒杯取出一個預處理樣品(在添加池混合物細菌溶液、鈣化海藻或碳酸鈣之前)並分析以獲得用於與處理後結果比較的基線。使用來自每個燒杯的200-300mL的樣品每週進行一次化學分析。這些每週測量包含 pH、電導率、硝酸鹽、正磷酸鹽、總鹼度和氨程度的分析。每月檢測一次濁度並且拍攝照片，以評估藻類生長和總體澄清度的變化。燒杯的處理和分析持續總共三個月；再次反映現場研究的長度。

使用Excel 2003進行數據分析，使用兩個採樣的雙尾t測試，比較處理前與處理後數值的95%可信度(confidence level)。兩個樣本雙尾t測試測試了處理前與處理後之均值無差異的虛無假設(null hypothesis)與均值存在差異的另一種假設。

H_O=μ處理前=μ處理後

H_A=μ處理前≠μ處理後

基線讀值表示所有燒杯中的磷酸鹽程度升高，超過表示加速藻類生長的程度的40倍。所有其他的測量皆在可接受的範圍內。

僅含有細菌混合物小丸的測試燒杯在三個月的研究期間沒有顯示出統計學上顯著的變化。兩週後磷酸鹽水平下降，但在一個月內回復到處理前程度。硝酸鹽程度反映了磷酸鹽的程度。在所有測試燒杯中，只有燒杯1具有與負控制組相似的硝酸鹽和磷酸鹽程度上升。這表示單獨使用細菌時對池健康之主要化學指標的最小影響。

含有鈣化海藻的兩個燒杯在處理前與處理後裝置中顯示統計學上顯著的變化。燒杯2和3中硝酸鹽程度分別顯著下降79%和76%，p值分別為0.01和0.04。燒杯2中磷酸鹽程度亦顯著下降74%，p值為0.02。含有鈣化海藻和小丸的燒杯顯示磷酸鹽減少66%，然而，此值不顯著(參見表2)。重要的是注意此缺乏統計學意義可能會受到這項研究的低樣本量限制。此研究未測試樣品中病原菌的變化，但預期添加池混合物細菌溶液會經由競爭而減少這些數量。此外，相信根據本發明之較佳實施例，將來自使用營養性萌發因子組成物之培育器的細菌溶液添加至實際生長池中會達到比在實驗室研究更佳的結果，這是由於細菌溶液中的細菌可與已經存在於生長池中的硝化細菌協同作用，並且細菌溶液中添加的細菌可幫助消耗水中的廢物以降低氨程度。類似鈣化海藻燒杯，含有碳酸鈣的兩個燒杯顯示在處理前與處理後均值有顯著差異。在燒杯4中，硝酸鹽程度下降77%，p值為0.03。而含有碳酸鈣和細菌小丸的燒杯5顯示磷酸鹽程度顯著降低72%的，p值為0.02(參見表2)。在水產養殖處理中，碳酸鈣可為鈣化海藻的合適替代品。具有鈣化海藻或碳酸鈣的燒杯表現超出沒有鈣化海藻或碳酸鈣的燒杯。含有細菌混合物小丸與碳酸鈣的燒杯5具有顯著較低之磷酸鹽程度的處理後均值及對pH的最小影響。然而，燒杯2和5具有統計學上顯著的磷酸鹽程度下降。

在整個此研究中檢測的濁度顯示在所有的測試燒杯中持續降低。當比較處理前後的照片時，所有燒杯中的藻類的存在增加，然而，在第二個月有兩個燒杯中的藻類死亡證據。含有碳酸鈣的燒杯4與燒杯6(控制組)皆呈黃色，表示正在死亡的藻類系統。藻類死亡是在最初的藻類生長茂盛後經歷的常見問題，因為水中的氧氣被耗盡；儘管有空氣石存在。隨著藻類死亡，硝酸鹽程度顯著增加。這在本月上述處理前的硝酸鹽程度增加是明顯的，燒杯4和6分別增加14%和38%。到最後一個月，燒杯4中的硝酸鹽程度回復且降低，儘管該系統仍呈深綠色、黃色。硝酸鹽持續增加至燒杯6中污染程度的6倍。圖4至圖6為說明此實驗室研究的結果之圖式。

亦在各種池上進行專注於改善一般池健康和透明度同時減少污泥之現場研究。儘管此研究不是水產養殖特定的(因為研究中的池是觀賞性的或娛樂性的，而不是用於飼養和收穫水生物種)並且使用生物產生器而不是根據本發明較佳實施例的培育器和營養性萌發因子組成物，其仍提供關於添加細菌和硝化作用增強劑的一些有用資訊。該研究包含在德州Irving與Irving附近的五個池；該五個池經辨識為池1-5，範圍從23,400ft³至720,131ft³。此研究的長度為七個月。每週一至二次，從每個池的岸邊取出200-300mL的地表水(surface water)樣品。分析這些樣品的pH、鹼度、硝酸鹽、磷酸鹽、氨、電導率、濁度和E.coli spp濃度。使用Hach DR890比色計(colorimeter)進行磷酸鹽、氨和濁度分析。使用用於大腸桿菌生長的專用培育基(3M Petrifilm 6404)在35℃下培育48小時進行測定E.coli spp。

每月一次對每池取樣以獲得污泥深度(sludge depth)、透明度和溶解氧(dissolved oxygen，DO)。這些測量是從兩個到四個位置的小船上進行的，用GPS坐標標記以獲得代表性的採樣。使用污泥判斷以英吋為單位測量污泥深度；每個GPS位置採樣三至四次，取平均值。使用具有Hach HQ30d計的Hach LDO探針，從底層且再次在距表面18”處測量溶解氧，以ppm為單位。使用Secchi Disk以%/英呎測定澄清度(Clarity)，這給出了經驗測量(empirical measurement)。此外，每月一次在每池拍攝兩至四個地點的照片，再次用GPS坐標標記，為資助者(patron)提供整體表面狀況。

在每個位置安裝BioAMP^TM 750氣候控制生物產生器，用於給特定池每日現場投予細菌混合物。使用修飾的FREE-FLOW^TM配方將Bacillus spp.孢子小丸化(pelletized)；將小丸饋入生長容器中，它們在最佳條件下生長24小時，然後直接分散至池中。必須從標準方案進行修改BioAMP 750的維護，因為次氯酸鈉(漂白劑)被認為對地表水有毒，Irving城市不允許使用。為了獲得與標準漂白劑處理相似的漂白效果，使用155g的碳酸氫鈉(小蘇打)除去過量的生物膜並且清理生長容器。除了每月維護，儘管環境溫度超過100℉，仍監測生物產生器的任何故障且維持編程溫度(programmed temperature)的能力。

伴隨細菌處理，亦施加鈣化海藻至每池。依照100磅對1,000,000立方英呎水的體積比率而給出鈣化海藻的量。如美國專利申請案第14/689,790所述，使用含有泡騰劑對(effervescent couple)和鈣化海藻的水溶性包裝投予鈣化海藻。

每日給每一研究池相同量的細菌(30兆CFU)。關聯矩陣顯示污泥深度與投予率(dose-rate)成反比。觀察到兩個較小的池之污泥程度和澄清度減少最多，以及每日最高的細菌劑量分別為2×10⁷CFU/L與7×10⁶CFU/L。觀察到的澄清度對所有池都有正影響，無論大小如何。此研究的三個最小池中，澄清度約為100%。相反地，在此研究結束時，兩個最大的池僅達到20%的澄清度。

使用單側2樣品t-測試來評估處理後之污泥程度是否顯著降低。p值為0.006，發現統計學上顯著的平均降低為31%。H₀：μ處理前=μ處理後，H_A：μ處理前>μ處理後。觀察到的平均減少量相當於污泥層平均減少3英吋。此外，當相較於處理前，此研究中的每池都經歷污泥程度降低(參見表3)。

E.coli spp.之平均觀察到的變化為減少59%。重要的是注意的是全範圍包含增加145%至減少 100%。如此寬的範圍加上小的樣本量使得難以確定處理E.coli spp.濃度的有效性。五個研究池中的三個經歷E.coli spp.濃度增加；然而，另外兩池急劇減少；然而，該增加被認為是雨水徑流入池中的結果。

檢測此處理對磷酸鹽濃度的整體影響，比較處理前和處理後程度。發現數據是非參數的並且採用單側Mann-Whitney測試來確定處理後磷酸鹽濃度是否顯著降低。H₀：μ處理前=μ處理後，H_A：μ處理前>μ處理後。獲得0.0000的p值表示處理後磷酸鹽程度整體降低52%是統計學上重要的。對池之磷酸鹽程度變化的詳細檢測亦顯示出有意義的降低。每個處理過的池的磷酸鹽濃度降低範圍從19%至77%(參見表3)。平均降低52%與此研究階段I(phase I)觀察到之降低57%相似。這表示細菌投予頻率的增加可能與磷酸鹽濃度的降低無關。再者，在施加鈣化海藻後直接觀察到磷酸鹽程度顯著降低。在春季投予第一劑量，在6月磷酸鹽程度開始上升後，在夏季投予第二劑量。粉末狀產品的非化學、環保友善性質為磷酸鹽濃度的控制提供有希望的結果。

同樣地，使用單側Mann-Whitney測試檢測硝酸鹽程度，以評估處理後硝酸鹽濃度是否顯著降低。H₀：μ處理前=μ處理後，H_A：μ處理前>μ處理後。p值為0.0000時，確定濃度降低91%為統計學上重要的(參見表3)。為此，基線硝酸鹽濃度低於建議程度，因此預計不會降低，遑論統計學上顯著降低91%。再者，每個具有可偵測的硝酸鹽之研究池在第4個月顯著降低至低於0.01ppm的偵測極限。這相對於在階段I中觀察到的降低(~69%)是巨大的改進，並且表示細菌投予增加的頻率對這些濃度具有直接影響。整體而言，這項研究證實藉由化學替代(chemical proxies)和污泥程度的降低來測量，用細菌和鈣化海藻的增強處理增加池健康。

營養性萌發因子組成物

根據本發明之一較佳實施例的營養性萌發因子組成物包括一或多種L-胺基酸、D-葡萄糖(其增加L-胺基酸對孢子外殼中它們的同源受體的結合親和力並且是任選的)、D-果糖(任選的，取決於細菌種類)、生物緩衝液以提供適當的pH值用於孢子萌發(如HEPES鈉鹽、磷酸鹽緩衝液或Tris緩衝液)、鉀離子的任選來源(例如KCl)和工業防腐劑。在另一較佳實施例中，營養性萌發因子組成物進一步包括D-葡萄糖與D-果糖二者。當使用D-葡萄糖與D-果糖二者時，最佳為包含鉀離子的來源，例如KCl。如該技藝中具普通技術之人士所理解的，D-果糖、D-葡萄糖和D-果糖的組合以及鉀離子來源的使用是取決於細菌的種類。較佳是使用與孢子組成物pH相容的防腐劑，其具有相對中性的pH。根據另一較佳實施例，營養性孢子組成物亦包括一或多種芽孢桿菌屬菌種以及較佳一或多種萌發抑制劑。包括孢子的營養性萌發因子組成物在本文稱為營養性孢子組成物、配方或溶液。或者，可在使用點(point-of-use)將孢子個別添加至根據本發明的營養性萌發因子組成物。當個別添加時，孢子較佳為本文所述之孢子組成物或孢子配方的部分，但亦可使用其他市售可獲得之孢子產品。根據另一較佳實施例，營養性萌發因子或營養性孢子組成物為濃縮形式，最佳為濃縮液體，並且於使用點稀釋。

較佳的L-胺基酸包含L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-纈胺酸、L-半胱胺酸中的一或多種。可用任何合適的來源形式提供L-胺基酸，例如它們的純形式和/或大豆蛋白質的水解產物。在濃縮營養性萌發因子組成物的另一實施例中，可提供L-胺基酸為大豆蛋白質的水解產物。當為濃縮形式時，孢子組成物較佳為包括一或多種上述L-胺基酸的溶液，其重量範圍各自為約8.9至約133.5g/L，較佳為約13.2至約111.25g/L，且最佳為約17.8至約89g/L；D-葡萄糖(任選的)和/或D-果糖(任選的)，其重量範圍各自為約18至約54g/L，較佳各自為約27至約45g/L，以及最佳各自為約30至約40g/L；KCl(任選的，作為鉀離子的來源)，其重量範圍為約7.4至約22.2g/L，較佳為約11.1至約18.5g/L，以及最佳為約14至約16g/L；生物緩衝液，例如磷酸二氫鈉，其重量範圍為約10至約36g/L，較佳為約15至約30g/L，以及最佳為約20至約24g/L和/或磷酸氫二鈉，其重量範圍為約30至約90g/L，較佳為約21.3至約75g/L，以及最佳為約28.4至約60g/L。一種或多種生物緩衝液有助於將營養性萌發因子組成物維持在用於孢子萌發之適當的pH值，約pH 6-8。除了或替代磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩衝液，孢子組成物可包括其他磷酸緩衝液，Tris鹼，其重量範圍為約15至約61g/L，較佳為約24至約43g/L，以及最佳為約27至約33g/L；或HEPES緩衝液，其重量範圍為約32.5至約97.5g/L，較佳為約48.75至約81.25g/L，以及最佳為約60至約70g/L。任選地，亦可使用磷酸二氫鉀作為鉀離子的來源，較佳重量範圍為約13.6至約40.8g/L，較佳為約20.4至約34g/L，以及最佳為約26至約29g/L。任選地，亦可使用磷酸氫二鉀作為鉀離子的來源，較佳重量範圍為約8.7至約26.1g/L，較佳為約13至約21.75g/L，以及最佳為約16至約19g/L。根據另一較佳實施例，可調整KCl、磷酸二氫鈉和/或磷酸氫二鈉的量，使得營養性萌發因子溶液和/或營養性孢子溶液中的pH可為約6、約7、或約8。

在另一較佳實施例中，營養性萌發因子組成物進一步包括一或多種工業防腐劑，其最終(總)重量範圍為0.8-3.3g/L，較佳為1.2-2.7g/L，最佳為1.6-2.2。該防腐劑可有利於長期儲存。合適的防腐劑包含NaCl、D-胺基酸、山梨酸鉀、以及化學防腐劑。化學防腐劑可為具有甲基氯異噻唑啉酮(methyl chloro isothiazolinone)(約1.15%至約1.18% v/v)和甲基異噻唑啉酮(約0.35-0.4% v/v)之活性成分的防腐劑；具有二唑烷基脲(diazolidinyl urea)(約30%)、對羥基苯甲酸甲酯(methylparaben)(約11%)和對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben)(約3%)之活性成分的防腐劑；以及僅具有對羥基苯甲酸甲酯之活性成分的防腐劑；以及具有對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、及二唑烷基脲的其他防腐劑。具有甲基氯異噻唑啉酮與甲基異噻唑啉酮作為活性成分的化學防腐劑之非限制實例為Linguard ICP與KATHON^TM CG(其具有包括約1.15-1.18%的甲基氯異噻唑啉酮與約0.35-0.4%的甲基異噻唑啉酮之活性成分)。具有二唑烷基脲、聚對羥基苯甲酸酯(polyparaben)、及對羥基苯甲酸甲酯作為活性成分的化學防腐劑之非限制實例包含Germaben II。在化學防腐劑的活性成分為甲基氯異噻唑啉酮與甲基異噻唑啉酮之情況下，化學防腐劑可以以約0.8至約3.3g/L，較佳為從約1.2至約2.7g/L，以及最佳為從約1.6至約2.2g/L包含在濃縮營養性溶液中。在化學防腐劑的活性成分為二唑烷基脲、對羥基苯甲酸甲酯、與/或對羥基苯甲酸丙酯之情況下，化學防腐劑可以以約0.3至約1%(wt/wt)包含在濃縮營養性溶液中。在一些方面，具有二唑烷基脲、對羥基苯甲酸甲酯、與對羥基苯甲酸丙酯的化學防腐劑可以以約10g/L之量包含在營養性配方中。在對羥基苯甲酸甲酯的情況下，防腐劑可以以約0.27至約1.89g/L，較佳為從約0.81至約1.35g/L，以及最佳為從約1.0至約1.18g/L包含在濃縮營養性溶液中。根據另一較佳實施例，在營養性配方可用於產生有效用於與蝦或其他貝類有關的水產養殖應用的營養性孢子配方之情況下，防腐劑可包含對羥基苯甲酸甲酯和山梨酸鉀的量。根據另一較佳實施例，營養性萌發因子溶液可用以產生有效用於植物與/或廢水的營養性孢子配方，營養性孢子配方可包含Linguard ICP或KATHON^TM CG的量。

根據另一較佳實施例，營養性萌發因子組成物可進一步任選地包括滲透保護劑(osmoprotectant)化合物。在一較佳實施例中，可包含甲基四氫嘧啶羧酸(ectoine)(由一些細菌種類產生的天然滲透保護劑)。在濃縮營養性萌發因子組成物中，甲基四氫嘧啶羧酸(ectoine)(任選的)的量之範圍可從約0.625至約4.375g/L，較佳為從約1.875-3.125g/L，以及最佳的量為約2-3g/L。根據另一較佳實施例，營養性萌發因子組成物可進一步包括另一標準成分，其包含但不限於有助於活性成分分散的界面活性劑、確保孢子組成物的儲存壽命之額外的防腐劑、緩衝液、稀釋劑、與/或通常包含在營養性配方與/或孢子配方中的其他成分。

上述成分的量是本發明的重要方面，因為較高濃度會使一些成分不溶，而較低濃度對萌發孢子無效。

根據另一較佳實施例，根據本發明之實施例的營養性萌發因子濃縮組成物為濃縮形式，並且進一步如下所述，在使用點於萌發之前，在水、孢子組成物、或任何其他合適的稀釋劑、或其組合中，稀釋為工作溶液。根據各種較佳實施例，可藉由用水或其他合適的稀釋劑稀釋根據本文較佳實施例的濃縮營養性萌發因子組成物，以濃縮營養性萌發因子組成物對稀釋劑為0.01%至50%(v/v)的比例製備工作營養性萌發因子溶液，但亦可使用其他的量。根據本發明的濃縮營養性萌發因子組成物可稀釋2至 1×10⁶倍或其中的任何範圍或值，以產生工作營養性萌發因子溶液。最佳地，稀釋為濃縮物和餘量水或其他合適稀釋劑的約0.1至約10%的範圍中。基於稀釋因子與上述的濃縮量，可計算存在於工作營養性溶液(來自濃縮配方的稀釋溶液)中的上述成分之量。

濃縮營養性萌發因子組成物的使用降低運輸、儲存和包裝成本，並且使得孢子組成物在使用點的投予較容易。最佳地，濃縮營養性萌發因子組成物為液體形式，其在使用點與稀釋劑混合更容易且更快，但亦可使用固體形式，例如小丸或磚或粉末。在營養性萌發因子組成物中包含一般的工業防腐劑有助於長期儲存。

最佳地，根據本發明的營養性萌發因子組成物中的所有成分或與本發明之方法一起使用的所有成分皆符合美國聯邦GRAS標準。

營養性孢子組成物

根據另一較佳實施例，組成物為營養性孢子組成物，其包括用於營養性萌發因子組成物的上述成分與孢子預先混合在一起。根據一較佳實施例，營養性孢子組成物較佳包括10%至90%重量的一或多種芽孢桿菌屬孢子或是孢子混合物(包括40-60%孢子粉末與一或多種芽孢桿菌屬菌種及60-40%鹽)。根據另一較佳實施例，營養性孢子組成物包括約5%重量的一或多種芽孢桿菌孢子或孢子混合物。在營養性孢子組成物中的孢子總濃度範圍可為約 1×10⁵CFU/mL或孢子/g至1×10¹⁴CFU/mL或孢子/g或在其中的任何特定濃度或範圍。

營養性孢子組成物較佳亦包括一或多種萌發抑制劑與/或防腐劑。用於濃縮營養因子孢子組成物之較佳的萌發因子或防腐劑包含範圍從約29至約117g/L，較佳為從約43至約88g/L，以及最佳為從約52至約71g/L之相對高濃度的NaCl；及/或範圍從約8至約116g/L，較佳為從約26至約89g/L，以及最佳為從約40至約50g/L之量的D-丙胺酸；及/或範圍從約1.25至約8.75g/L，較佳為從約3.75至約6.25g/L，以及最佳為從約4.5至約5.5g之量的山梨酸鉀。上述其他化學防腐劑與較佳營養性萌發因子組成物亦可與根據本發明的營養性孢子組成物一起使用。這些萌發抑制劑或防腐劑將孢子維持在不活化狀態，並且防止孢子在其稀釋與在使用點活化之前提早萌發。當根據本實施例的孢子組成物與本發明的較佳方法一起使用時，特別較佳使用萌發抑制劑，其中萌發在使用點發生。當包含孢子時，上述營養性萌發因子組成物的其他成分(例如L-胺基酸、生物緩沖液等)的量形成孢子組成物的平衡，其成比例地減少以對應於上述的較佳範圍。較佳的營養性孢子組成物亦為濃縮形式並且相對於營養性萌發組成物如上所述在使用點稀釋為工作溶液，且進一步描述如下。

用於根據本發明之較佳實施例的營養性孢子組成物中的較佳芽孢桿菌孢子包含以下種類：地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)、蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、緩慢芽孢桿菌(Bacillus lentus)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、乳芽孢桿菌(Bacillus lactis)、側孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)、左旋乳酸芽孢桿菌(Bacillus laevolacticus)、多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、單純芽孢桿菌(Bacillus simplex)以及球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)。如本技藝中普通技術人士所理解的，亦可使用其他芽孢桿菌孢子種類。較佳地，營養性孢子組成物包括1至20種或更多種的芽孢桿菌屬菌種，較佳為3至12種之間的芽孢桿菌。根據另一較佳實施例，營養性孢子組成物包括3種芽孢桿菌菌株，最佳地2種芽孢桿菌菌株可分別為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)菌株，第三種菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。根據另一較佳實施例，孢子混合物中的孢子包括約80%地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)(每種菌株40%)以及20%枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

在另一較佳實施例中，使用作為益生菌的營養性孢子組成物包括一或多種芽孢桿菌菌株，其本質上是益生菌，因為它們有助於消耗者消化道中營養素的分解。該菌株較佳產生以下酶中的一或多種：水解蛋白質的蛋白酶、水解澱粉和其他碳水化合物的澱粉酶、水解脂肪的脂肪酶、協助水解複合糖中之糖苷鍵及協助纖維素降解的糖苷酶、降解纖維素成為葡萄糖的纖維素酶，酯酶(esterase)(其是類似脂肪酶的酶)，以及降解木聚醣(xylan)的木聚醣酶(xylanases)(木聚醣是植物細胞壁中發現的多醣)。產生這些酶的芽孢桿菌菌株是本領域熟知的。

根據另一較佳實施例，營養性孢子組成物為濃縮形式，並且如下所述在使用點於萌發之前，在水或任何其他合適的稀釋劑、或其組合中，稀釋為工作溶液。根據各種較佳實施例，可藉由用水或其他合適的稀釋劑稀釋根據本文較佳實施例的濃縮營養性孢子組成物，以濃縮營養性孢子組成物對稀釋劑為0.01%至50%(v/v)的比例製備工作營養性孢子溶液，但亦可使用其他的量。根據本發明的濃縮營養性孢子組成物可稀釋2至1×10¹³倍或其中的任何範圍或值，以產生工作營養性萌發因子溶液。最佳地，稀釋為濃縮物和餘量水或其他合適稀釋劑的約0.1至約10%的範圍中。基於稀釋因子與上述的濃縮量，可計算存在於工作營養性溶液(來自濃縮配方的稀釋溶液)中的上述成分(如L-胺基酸及萌發抑制劑)之量。

最佳地，根據本發明的營養性孢子組成物中的所有成分或與本發明之方法一起使用的所有成分皆符合美國聯邦GRAS標準。

孢子組成物

根據本發明的一較佳實施例之益生菌孢子組成物包括一或多種細菌種類、任選的界面活性劑、增稠劑、以及任選的一或多種酸化劑、酸、鹽或酸以作為防腐劑。根據另一較佳實施例，增稠劑並非也為益生素(prebiotic)，或是除了是益生素的增稠劑之外，孢子組成物進一步包括一或多種益生素。根據另一較佳實施例，孢子組成物進一步包括一或多種水活性減少劑(water activity reducer)。最佳地，根據本發明的孢子組成物包括各種懸浮的益生菌孢子，更加詳述如下。以孢子形式使用這些物種增加了在水產養殖應用場所附近可能發現的惡劣環境條件下之益生菌的穩定性。孢子組成物中孢子的總濃度範圍可為約1×10⁵CFU/mL或孢子/g至1×10¹⁴CFU/mL或孢子/g或其中的任何特定濃度或範圍。

根據較佳實施例，孢子組成物包含合適的增稠劑。增稠劑較佳是在非氣候受控的水產養殖環境中通常發現的不同溫度下不分離或降解的增稠劑。增稠劑有助於穩定懸浮液，因此細菌混合物保持均勻且分散在一體積的孢子組成物中，並且不會從懸浮液中沉澱出來。當與根據本文所述之本發明的較佳實施例之培育系統與水產養殖處理方法一起使用時，這確保益生菌材料的濃度均勻分佈在整個容器中，使得遞送至培育器的孢子劑量在整個處理循環中保持一致或相對一致(取決於特定的遞送方法與所使用的控制機制)。

最佳的增稠劑為三仙膠(xanthan gum)，其是由葡萄糖、甘露糖和葡萄醣醛酸的五糖重複單元與已知的益生素(prebiotic)所組成的多醣。與一些其他的膠不同，三仙膠在寬廣的溫度與pH範圍下是非常穩定的。另一較佳增稠劑是阿拉伯樹膠(acacia gum)，其亦為已知的益生素。其他的較佳增稠劑包含刺槐豆膠(locust bean gum)、瓜爾膠(guar gum)與阿拉伯膠(gum arabic)，其亦被認為是益生素。除了益生素益處之外，這些纖維不與礦物質和維生素結合，因此，不限制或干擾它們的吸收，且甚至可改善水生物種對某些礦物質(例如鈣)的吸收。亦可使用不被認為是益生素的其他增稠劑。

較佳的實施例可任選遞包含一或多種益生素，如果所用的增稠劑不是益生素，則較佳使用該一或多種益生素，但也可在除了益生素增稠劑之外使用。益生素分為二醣、寡醣和多醣，並且可包含菊糖(Inulin)、寡果糖(Oligofructose)、果寡醣(Fructo-oligosaccharide，FOS)、半乳寡醣(Galacto-oligosaccharide，GOS)、反式半乳寡醣(trans-Glacto-Oligosaccharide，TOS)與短鏈果寡醣(Short-Chain Fructo-oligosaccharide，scFOS)、大豆果寡醣(soy Fructo-oligosaccharide，soyFOS)、葡萄寡醣(Gluco-oligosaccharide)、糖寡醣(Glyco-oligosaccharide)、乳糖醇(Lactitol)、麥芽寡醣(Malto-oligosaccharide)、木寡醣(Xylo-oligosaccharide)、水蘇糖(Stachyose)、乳酮糖(Lactulose)、棉子糖(Raffinose)。甘露寡醣(Mannan- oligosaccharide，MOS)為益生素，可能不會增進益生菌細菌群，但會結合病原菌且將病原菌自腸道移除，並且被認為可刺激免疫系統。

較佳實施例亦較佳包含一或多種酸化劑、酸、或酸的鹽類，用以作為防腐劑或用以酸化孢子組成物。較佳的防腐劑為乙酸、檸檬酸、反丁烯二酸(fumaric acid)、丙酸、丙酸鈉、丙酸鈣、甲酸、甲酸鈉、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸(sorbic acid)、山梨酸鉀以及山梨酸鈣。亦可使用其他已知的防腐劑，較佳通常被認為是安全的(GRAS)食品防腐劑。較佳地，孢子組成物的pH是在約4.0與約7.0之間。較佳地是在約4.0至5.5之間，且最佳是在約4.5以防止孢子在使用前提早萌發或如下所述添加至培育器。降低孢子組成物的pH也可對酵母菌、黴菌和病原菌具有抗微生物活性。

根據任一較佳實施例，孢子組成物中任選地包含一或多種水活性減少劑，例如氯化鈉、氯化鉀或玉米糖漿(70%的玉米糖漿溶液)。水活性減少劑有助於抑制微生物生長，使得當孢子組成物在待處理的動物或植物排出到消耗點或排放到生長池的使用點之前儲存孢子組成物時，細菌孢子不會提早萌發。它們亦有助於抑制污染微生物的生長。

儘管其他界面活性劑可與其他應用一起使用(例如遞送至植物)，任選的界面活性劑較佳為對於動物腸道安全的界面活性劑。最佳地，該界面活性劑為 Polysorbate 80。雖然任何GRAS或AAFCO核准的界面活性劑或乳化劑可與任何實施例一起使用，但仍擔心一些動物可能無法很好地耐受所有核准的界面活性劑。由於界面活性劑在穩定懸浮液的益處使得細菌混合物保持均勻並且不會沉澱出來，亦可藉由使用增稠劑來實現，添加界面活性劑不是必需的。如果根據此第二實施例在孢子組成物中使用界面活性劑，則較佳是使用與在第一實施例中相同的重量百分比範圍。

與根據本發明的孢子組成物一起使用的較佳細菌與上述用於較佳營養性孢子組成物的細菌相同。最佳地，用於孢子組成物中的細菌菌種為孢子桿菌屬中的一或多種菌種。益生菌細菌的最佳菌種包含以下：短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、嗜澱粉芽孢桿菌(Bacillus amylophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、馬鈴薯芽孢桿菌(Bacillus mesentericus)、枯草芽孢桿菌納豆變種(Bacillus subtilis var.natto)、或東洋芽孢桿菌(Bacillus toyonensis)，但亦可使用在使用國核准作為益生菌的任何芽孢桿菌屬菌種。較佳為細菌為孢子形式，因為孢子形式對環境波動較穩定，例如環境溫度變化。最佳地，用於根據本發明之孢子組成物的孢子為乾粉末混合物，其包括約40-60%的鹽(食鹽)與60-40%的細菌孢子。孢子較佳為來自液體發酵濃縮物的噴霧乾燥形式。鹽用於將純噴霧乾燥的孢子粉末稀釋至最終孢子粉末混合物中的標準孢子計數。在生產發酵過程中，不同的芽孢桿菌菌株將以不同的速率生長，導致發酵批次液的最終計數變化。將發酵液離心，濃縮液中的孢子。而後，將濃縮液噴霧乾燥，形成僅含有芽孢桿菌孢子的粉末。添加鹽至噴霧乾燥的芽孢桿菌孢子粉末有助於將每批次的每克中的孢子混合物計數標準化。亦可使用其他的型式的細菌孢子或孢子混合物。最佳地，乾的孢子混合物與用於孢子組成物中之一部分的水(總水的約3-30%)預先混合，將所得到的細菌孢子溶液添加至其他成分(包含剩餘的水)。這有助於將細菌孢子分散於整個孢子組成物中。

根據本發明之第一較佳實施例的益生菌孢子組成物較佳地包括細菌孢子，該細菌孢子提供10⁸cfu/ml的孢子懸浮液(最佳約1.0×10⁸至約3.0×10⁸cfu/ml的孢子組成物，當其稀釋於生長池時提供約10¹至10⁴cfu/ml池水)、0.00005至3.0%的界面活性劑、及0.002至5.0%的增稠劑，以及任選地約0.01至2.0%的一或多種酸或酸的鹽類作為防腐劑，所有的百分比皆以該孢子組成物的重量計。根據本發明之另一較佳實施例的益生菌孢子組成物包括細菌孢子，該細菌孢子提供10⁹cfu/ml的孢子懸浮液(當其稀釋於池水中時提供約10¹至10⁴cfu/ml池水)、約0.1至5.0%的增稠劑(較佳為亦作為益生素的增稠劑)、約0.05-0.5%的一或多種防腐劑、任選地約0.1-20%的一或多種水活性減少劑、以及任選地0.1-20%的一或多種酸化劑，所有的百分比皆以該孢子組成物的重量計。這兩個較佳實施例中的孢子組成物之餘量是水，在本文中的百分比是以重量計。較佳是使用去離子水或蒸餾水以去除鹽或外部細菌，但亦可使用自來水或其他水源。

根據另一較佳實施例，孢子組成物包括約1%至10%的細菌孢子混合物，其含有鹽以及孢子形式的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、嗜澱粉芽孢桿菌(Bacillus amylophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、馬鈴薯芽孢桿菌(Bacillus mesentericus)、枯草芽孢桿菌納豆變種(Bacillus subtilis var.natto)、或東洋芽孢桿菌(Bacillus toyonensis)中的一或多種；總共約0.3%至1%的一或多種酸或酸的鹽類；約0.2%至0.5%的增稠劑；約0.1-0.3%的氯化鈉、氯化鉀、或其組合；約0.00005%至3.0%的界面活性劑；以及86.2%至98.4%的水。根據另一較佳實施例，孢子組成物包括約0.01%至10%的細菌孢子混合物；約0.1-0.33%的山梨酸(sorbic acid)、其鹽或其組合；約0.1-0.34%的檸檬酸、其鹽或其組合；約0.1-0.33%的苯甲酸、其鹽或其組合；約0.2-0.5%的三仙膠(xanthan gum)；約0.00005%至3.0%的界面活性劑；以及約0.1-0.3%的氯化鈉、氯化鉀、或其組合，所有的百分比皆以組成物的重量計。根據另一較佳實施例，孢子組成物包括約5%的細菌孢子或孢子混合物；約0.25%的增稠劑；總共約0.3%的一或多種酸或酸的鹽類；約0.1%界面活性劑；約0.2%的氯化鈉、氯化鉀、或其組合(除了該孢子混合物中的任何鹽之外)；以及水。根據另一較佳實施例，該酸或酸的鹽類是山梨酸鉀、苯甲酸鈉和無水檸檬酸中的一或多種。

製備根據本發明之較佳實施例的益生菌孢子組成物的一些實例並且測試不同參數。這些孢子組成物如以下表4所示。

每種孢子組成物的餘量是水(在這些樣品中約1L)。除了1號孢子組成物(其使用自來水)之外，在每一個孢子組成物中使用去離子水。百分比是表示重量百分比。每種配方的目標是具有在約4.0和5.5之間的pH，但發現一些配方具有的實際pH值遠低於預期。1號配方的目標是具有在5.0與5.5之間的pH，但其實際pH為約2.1-2.3，此值太低且可能對於孢子有害、產生包裝的穩定度問題、並且受制於較嚴格的運輸規範。1號配方亦展現弱的增稠。2號配方與1號配方相同，差別在於水源不同。2號配方的實際pH為約2.2-2.3，並且展現弱的增稠。將3號配方中的酸與酸的鹽類之量減少以提高pH並且確定在使用與1號和2號中相同量的增稠劑時厚度是否改善。雖然3號配方是對1號和2號的改良，但它仍然展現弱的增稠，其實際pH為6.6，超過目標值範圍。對4號配方加入其他的酸以降低pH，並且添加其他的增稠劑。4號配方的增稠效果已改良，但進一步改良增稠是有益的。5號配方中的酸量顯著增加，這導致實際pH值為約1.0。6號配方中的酸量減少並且增稠劑增加，這導致孢子組成物太稠而不能下降。7號配方增加增稠劑與水活性減少劑的量，但展現出混合苯甲酸與山梨酸的問題。8號配方中移除苯甲酸與山梨酸。1-7號配方提供2×10¹¹cfu/gm且8號提供1×10¹¹cfu/gm細菌孢子。在這些樣品配方中，8號是最佳的，因為它展現足夠的增稠且具有約4.5 +/- 0.2的實際pH並且使用較少的孢子混合物。

較佳為根據本發明的孢子組成物使用約0.01%至約0.3%的細菌孢子混合物，並且更佳為在約0.03%與0.1%之間的細菌孢子混合物。所使用的孢子混合物之量的減少顯著降低孢子組成物的成本。取決於最終使用應用，在根據本發明的之孢子組成物中可使用不同量的孢子混合物。例如，較小百分比的孢子混合物可用於與雞一起使用的孢子組成物中，而較大百分比的孢子混合物可用於與豬一起使用的孢子組成物中。

在各種溫度下測試根據8號配方的孢子組成物的儲存壽命。將8號配方的樣品密封在塑料袋中，例如在如下所述之較佳遞送系統中使用的塑料袋中，並在約4-8℃(39-46℉)、30℃(86℉)和35℃(95℉)的溫度下儲存兩個月，以模擬可儲存和使用益生菌孢子組成物的農業環境之典型溫度範圍。在儲存期的第一個月結束時，觀察並測試每個樣品。所有三個樣品的pH皆為約4.5，並且在三個樣品中的任何一個中沒有沉澱、分層或外觀變化，表示在儲存期間細菌孢子維持懸浮並分散在整個孢子組成物中。沒有樣品含有任何真菌污染或革蘭氏陰性(gram-negative)細菌污染。在時間計數為零時(當樣品最初儲存時)，每個樣品含有約2.12×10⁸cfu/mL的細菌孢子。在一個月的儲存期結束時，樣品含有約2.09×10⁸cfu/mL孢子懸浮液(最低溫度樣品)的細菌孢子、1.99×10⁸cfu/mL(中溫樣品)的細菌孢子和2.15×10⁸cfu/mL(高溫樣品)的細菌孢子。細菌計數在不同樣品中有所變化，尤其是增稠樣品；然而，這些被認為是可比較的計數。在儲存兩個月之後，再次測試每個樣品。該等樣品含有約2.08×10⁸cfu/ml(最低溫度樣品)的細菌孢子；2.01×10⁸cfu/mlL(中溫樣品)的細菌孢子；以及2.0×10⁸cfu/ml(高溫樣品)的細菌孢子。目標儲存壽命為約 2×10⁸cfu/ml的孢子懸浮液，因此樣品在儲存兩個月後處於目標儲存壽命內。這些測試結果顯示根據本發明之較佳實施例的益生菌孢子組成物在溫度範圍內是穩定的，細菌孢子維持有活力、懸浮且分散在整個孢子組成物中。每個樣品中所使用的孢子混合物(40-60%的孢子粉末與60-40%的鹽)是相同的，提供至少約2×10¹¹孢子/克。混合物中的孢子菌種為多種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)與地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)菌株。將孢子混合物粉末與100mL的水預先混合攪拌30分鐘，而後加至其它成分。與水預先混合有助於將孢子混合物與其他成分混合並且將孢子分散在整個孢子組成物中。

雖然較佳為使用包括一或多種芽孢桿菌屬菌種的益生菌孢子組成物，如根據本發明的孢子組成物，然而本發明的方法可與包括其他細菌屬與其他菌種的孢子組成物一起使用。例如，來自以下屬的一或多種菌種：芽孢桿菌屬(Bacillus)、擬桿菌屬(Bacteriodes)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、小球菌屬(Pediococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和丙酸桿菌屬(Propionibacterium)(包含短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、嗜澱粉芽孢桿菌(Bacillus amylophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、馬鈴薯芽孢桿菌(Bacillus mesentericus)、枯草芽孢桿菌納豆變種(Bacillus subtilis var.natto)或東洋芽孢桿菌(Bacillus toyonensis)、棲瘤胃擬桿菌(Bacteriodes ruminocola)、棲瘤胃擬桿菌(Bacteriodes ruminocola)、豬擬桿菌(Bacterioides suis)、青少年雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、兩叉雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophilum)、乳酸小球菌(Pediococcus acidilacticii)、啤酒小球菌(Pediococcus cerevisiae)、戊糖小球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳脂腸球菌(Enterococcus cremoris)、二丁酮腸球菌(Enterococcus diacetylactis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、中間腸球菌(Enterococcus intermedius)、乳酸腸球菌(Enterococcus lactis)、嗜熱腸球菌(Enterococcus thermophilus)、德氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbruekii)、發酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus)、乳酸乳酸桿菌(Lactobacillus lactis)、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)、短乳酸桿菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳酸桿菌(Lactobacillus buchneri)、保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei)、香腸乳酸桿菌 (Lactobacillus farciminis)、纖維二糖乳酸桿菌(Lactobacillus cellobiosus)、彎曲乳酸桿菌(Lactobacillus curvatus)、產丙酸丙酸桿菌(Propionibacterium acidipropionici)、費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)以及/或以下菌種中的一或多種：腸膜白念珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdennii)可與本發明的組成物與方法一起使用。

孢子組成物亦可為濃縮形式，使用較少的水，成比例增加上述之其他成分的量。在萌發之前，可於使用點用營養性萌發組成物、水、其他合適的稀釋劑或其組合將此等濃縮孢子組成物稀釋。最佳地，根據本發明之孢子組成物中的所有成分或與本發明之方法一起使用的所有成分皆符合美國聯邦GRAS標準。

萌發的方法

根據一較佳實施例，根據本發明之在使用點萌發孢子的方法包括提供營養素與孢子(較佳為提供營養性萌發因子組成物與孢子組成物或提供根據本發明之營養性孢子組成物，但亦可一起或個別使用含有孢子與營養素之其他市售可得的產物)並且將它們加熱至升高的溫度或溫度範圍，並將它們保持在該溫度或該範圍內一段時間(培育期間)，以使得在靠近消耗點的使用點位置萌發。培育期間中的加熱與營養素與孢子一起發生在單一步驟中。該方法亦較佳包括將萌發的孢子分散至水產養殖應用，如前所述。較佳地，將營養性萌發因子組成物與孢子組成物(或營養性孢子組成物)加熱至35-55℃的溫度範圍中，較佳為38-50℃的範圍中，且最佳為41℃至44℃的範圍中。培育期間可依照終端使用應用而改變。對於益生菌應用，具有消化系統的水生物種(例如魚或鰻魚)將消化該細菌的情況下，較佳為培育期間持續不超過10分鐘。最佳地，在益生菌應用中，培育期間是在2-5分鐘之間。在此方式中，在孢子完全萌發之前，孢子被釋放至生長池中，並且更有可能存活至水生物種的腸道，在那裡它們是最有益的。關於處理水產養殖應用中的水，例如用蝦水產養殖應用，較佳的培育期間為至少一小時，使得孢子在排放至水之前完全萌發，更佳為4至6小時以使得細菌在排放至水之前變成營養細菌。最佳地，將營養性萌發因子組成物與孢子組成物(或營養性孢子組成物)，較佳為根據本文所述之本發明的實施例，添加至培育器以將孢子培育於上述的較佳溫度範圍與期間，以產生具有營養狀態的細菌之細菌溶液。該培育可在空氣培育器、水培育器、或在給定的溫度範圍內提供均勻、恆定的熱量之任何其他的腔室中。而後，將細菌溶液排放至水產養殖應用中，如前所述。如果使用濃縮的營養性萌發因子組成物，則較佳是將稀釋劑水與營養性萌發因子組成物一起添加至培育器。

根據本發明之較佳方法，測試根據本發明之較佳實施例的各種營養性萌發因子組成物。組成物、方法與結果如下所述。

實例1-為了萌發孢子，將FreeFlow LF-88益生菌(可從NCH Corporation市售取得的孢子液體配方)添加至1mL的自來水中，終濃度為約1×10⁹CFU/mL，其中CFU代表菌落形成單位。將根據本發明之較佳實施例的營養性萌發因子濃縮組成物(其包括L-丙胺酸(89g/L)、磷酸二氫鈉(20g/L)、磷酸氫二鈉(60g/L)、以及Linguard CP(總共1.6g/L))添加至水與細菌混合物，以提供基於混合物之總重的4%最終濃度的營養性萌發因子組成物。為了比較，用相同量的FreeFlow LF-88益生菌和水製備負控制組反應，但不添加營養性萌發因子濃縮組成物。將兩種混合物(沒有營養性萌發因子組成物的萌發因子與負控制組)混合並且在設定為42℃或環境室溫(約23℃)的預先培育熱塊中培育60分鐘。

使用相差顯微鏡觀察來自每個反應的孢子。使用標準程序製備載玻片。在Olympus BX41顯微鏡(100X油浸物鏡)上觀察孢子，並使用由cellSens Dimension軟體包控制的Olympus UC30相機成像。

拍攝影像並計數萌發的孢子成為視野中總孢子的百分比。對於每種條件(測試混合物)分析總共10個代表性影像。萌發的孢子由於水的流入而失去它們的折射率並且是相暗的(phase-dark)，而未萌發的孢子是相亮的(phase-bright)。

圖7顯示來自這些測試的代表性影像。影像A 代表根據本發明之較佳孢子組成物與較佳方法而使用營養性萌發因子組成物且在培育期間於42℃加熱之已經萌發的孢子。較暗的斑點顯示萌發的孢子，較淡的斑點顯示非萌發的孢子。影像B代表根據本發明之較佳實施例而使用營養性萌發因子組成物但培育於環境溫度(23℃)之已經萌發的孢子。影像C-D代表未以根據本發明之營養性萌發因子組成物處理的控制組孢子，一者是於42℃培育且一者是於環境溫度(23℃)培育。

如圖7中可見，影像「A」顯示比其他影像顯著更多的萌發孢子(暗斑點)。用根據本發明之較佳實施例的營養性萌發因子組成物結合根據本發明之較佳實施例的萌發方法所培育的孢子顯示明顯的萌發效率為96.8%(實例1，圖7A)。已經用根據本發明之較佳實施例的營養性萌發因子組成物但未使用根據本發明之較佳實施例的萌發方法所培育的控制組孢子顯示明顯的萌發效率為2.3%(實例1，圖7B)。同樣地，未用本發明之營養性萌發因子組成物培育的孢子顯示於42℃與23℃之明顯的活化效率分別為1.2%與2.6%(實例1，圖7C與7D)。未藉由本發明之方法的較佳實施例處理的樣品中的萌發孢子代表在FreeFlow LF-88益生菌溶液中已經萌發的小百分比的孢子。此實例證實當根據本發明之較佳實施例的營養性萌發因子組成物和培育方法一起使用時，孢子萌發顯著增加。

實例2-使用如上述實例1所述之相同的測試混合物/培育方法(使用相同的營養性-萌發因子組成物和加熱的培育，「處理的孢子，42℃」)和控制組混合物/培育方法(沒有營養性-萌發因子組成物，沒有加熱，「未處理的孢子，23℃」)進行另一組培育測試，但與控制組混合物相比，進行不同的測試以比較根據本發明之較佳實施例的測試混合物的功效。此外，測試兩種其他的混合物-一種是使用實例1之營養性萌發因子組成物但沒有加熱(「處理的孢子，23℃」)及另一種是未使用營養性萌發因子但加熱孢子(「未處理的孢子，42℃」)。簡而言之，於42℃或23℃培育孢子1小時，用或未用較佳的營養性-萌發因子組成物處理。在培育之後，將來自1mL每個反應的孢子於23℃以14K RPM沉澱(pelleted)3分鐘且重新懸浮於1mL的Butterfield緩衝液中。將約6×10⁵CFU(0.02mL)添加至含有過多D-丙胺酸之0.980mL的Davis基本培育基(含有3%葡萄糖作為碳源與微量元素)。D-丙胺酸是L-胺基酸媒介之萌發的有效抑制劑。

將約1.2×10⁵CFU添加至PreSens OxoPlate之四個槽中的每一個。PreSens OxoPlates使用光學氧感測器使用兩個濾光片對(激發：540nm，發射：650nm以及激發：540，發射：590nm)螢光測量樣品的氧含量。如製造商所述進行控制組，並在BioTek 800FLx螢光板讀取器上進行測量。於37℃每10分鐘進行24小時的時間點連續搖動，並且使用以下公式處理數據以確定氧氣分壓(pO₂)：pO₂=100*[(K₀/IR)-1(K₀/K₁₀₀)-1]

已經萌發並且繼續分裂並生長作為營養細胞的孢子消耗氧氣作為其代謝生長的一部分。氧氣消耗由pO₂下降表示。據推測，觀察到的生長是由於本發明萌發的孢子的之向外生長(outgrowth)及營養生長。這些測試的pO₂程度如圖8所示。

如圖8所示，用根據本發明之較佳實施例的測試混合物和方法(處理的孢子42℃，使用營養性萌發因子組成物與加熱)一起培育導致孢子比未用根據本發明之較佳實施例處理或加熱或是已用營養性萌發組成物處理或加熱但不是兩者一起的對照組孢子混合物快4小時開始營養生長。在對照組實驗中看到的生長可能代表存在FreeFlow LF-88益生菌中約2%的萌發孢子(參見實例1)。此實例進一步表示當使用根據本發明之較佳實施例之營養性萌發因子組成物與培育方法時，孢子萌發顯著增加。

實例3-使用如上述實例1中所述的類似測試和對照組混合物及培育方法進行另一組培育測試。簡而言之，將LF-88添加至10nL的蒸餾水，最終濃度為約10⁸CFU/mL。於各種溫度培育樣品，以顯示與對照組混合物相比之根據本發明之較佳實施例的測試方法的功效。用實例1所述之營養性萌發因子組成物製備反應(圖9中之「處理的孢子」)並且於23℃(環境溫度，未加熱)、32℃、42℃或60℃培育。未用營養性萌發因子組成物於環境室溫培育控制組反應。在培育一小時之後，將1mL的每一反應於23℃以14K RPM沉澱3分鐘並且重新懸浮於Butterfield緩衝液中。將約6×10⁵CFU(0.02mL)添加至含有過多D-丙胺酸之0.980mL的Davis基本培育基(含有3%葡萄糖作為碳源與微量元素)。

將約1.2×10⁵CFU添加至PreSens OxoPlate之四個槽中的每一個。如製造商所述進行控制組，並在使用兩個濾光片對(激發：540nm，發射：650nm以及激發：540，發射：590nm)之BioTek 800FLx螢光板讀取器上進行測量。於37℃每10分鐘進行24小時的時間點連續搖動，並且處理數據以確定氧氣分壓(pO₂)。這些測試的pO₂程度如圖9所示。

如圖9所示，用根據本發明之較佳實施例的營養性萌發因子組成物與加熱的培育導致孢子在控制組之前開始營養生長。用營養性萌發因子組成物處理但未加熱的孢子與對照組混合物相當。用低於根據本發明之一實施例的範圍為35-55°之較佳範圍以下之溫度所培育之營養性-萌發因子組成物處理的孢子(由「處理的孢子32℃」曲線表示)比控制組實驗更快開始營養生長，但不如在根據本發明之較佳範圍內之升高溫度下處理的孢子快。用根據本發明之實施例之營養性-萌發因子組成物所處理的且於41℃至44℃之最佳範圍內的溫度所培育的孢子顯示最佳結果，最先開始營養生長並且比控制組快4小時開始生長。如前述實例中可見，在沒有處理的控制組實驗中所見的生長可能代表存在FreeFlow LF-88益生菌中約2%的萌發孢子(參見實例1)。此實例進一步表示當使用根據本發明之較佳實施例之營養性萌發因子組成物與培育方法時，孢子萌發顯著增加。

使用營養性萌發因子組成物與孢子組成物之水產養殖研究

用根據本發明之較佳萌發與水產養殖處理方法進行另一研究以評估較佳之營養性萌發因子與孢子組成物的用途。此研究使用三種水產養殖作為代表性的水產養殖應用。各自容納55加侖的水與25隻馬來西亞蝦以模仿商業養蝦場的放養密度。每個水族箱含有相同類型的網與由PVC管組成的基質，用於蝦的棲息和休息。所有水族箱皆內襯加勒比海活沙以阻止藻類生長、減少硝酸鹽、幫助緩衝水族箱系統、並且確保更安全的水族箱循環。在所有三個水族箱中使用通氣石以改善生物過濾並且增加蝦和有益細菌的溶氧量。所有三個水族箱皆使用相同類型的過濾器，並且根據需要沖洗過濾器並重複使用。根據需要，所有三個水族箱皆用去離子(deionized，DI)水重新填充。DI水用於控制水中的礦物質含量。

當需要從水族箱取出大量的水時，從所有水族箱取出相同量的水並用相同量的DI水替換。在水族箱2和3中使用碳酸鈣進行水替代以模擬池粉末(pond powder)(例如可從NCH Life Science獲得的ECOCharger^TM池粉末)的使用。當在水族箱2或3中更換水時，添加約0.5g的碳酸鈣至槽水(tank water)中。每週一至週五每天一次將約1mL的培育或活化的細菌溶液施加至水族箱3。水族箱1 為控制組水族箱。簡而言之，將20μL的初始孢子溶液(starting spore solution)(含有約10¹⁰CFU/mL)和20μL的初始濃縮營養素溶液及960μL的水混合以形成工作溶液，其含有約2×10⁸CFU/mL孢子(表6)。初始孢子溶液含有來自孢子混合物之約10¹⁰CFU/mL孢子。孢子混合物含有3種芽孢桿菌屬細菌菌株：2種菌株各自為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)之菌株，第三種菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。孢子混合物配方中約80%為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)(每種菌株40%)孢子以及孢子混合物配方中20%的孢子為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。根據上述的較佳實施例，孢子組成物亦包含水、增稠劑、以及有機鹽。

將組合的工作溶液(含有營養性萌發因子組成物、孢子組成物和水)於約42℃培育約1小時以產生活化的細菌溶液。在此培育之後，將整個活化的細菌溶液(約1mL)添加至水族箱3中。藉由混合石頭進行通氣來完成混合。表5顯示初始營養性萌發因子配方之組成物。表6顯示所培育之工作溶液的組成物。在將培育的細菌溶液混合至55加侖的水族箱3之後，細菌的濃度為約9.6×10²CFU/mL且水族箱3中的營養性萌發因子組成物之最終百分比為約9.6×10^-6% v/v。每一個水族箱在已經應用它們的個別處理之後的含量係如表7所示。試驗持續120天。

表8顯示平均的試驗組之最終重量與體測量以及標準偏差。相較於水族箱2與3中的處理組，水族箱1 中的控制組具有最小的蝦重量與體測量。相較於水族箱2與1的蝦，水族箱3具有最大的蝦並且在蝦尺寸方面具有最佳的結果。水族箱3中的蝦的平均最終重量為6.48g。水族箱2中的蝦的平均最終重量為4.87g。水族箱1(控制組)中的蝦的平均最終重量為3.43g。水族箱3中的蝦的平均總長度也是最大的7.98cm。水族箱2中的蝦的平均總長度為7.41。水族箱1(控制組)中的蝦的平均總長度為6.95。水族箱3中的蝦的平均尾部長度為4.67cm。水族箱2中的蝦的平均尾部長度為4.26cm。水族箱1(控制組)中的蝦的平均尾部長度為3.87cm。

圖10顯示三種水族箱的影像，其可顯示在120天試驗結束時之每一組的水澄清度。在水澄清度方面，觀察到水族箱3最乾淨。觀察到相較於水族箱2與3，水族箱1(控制組)具有最大量的藻類生長覆蓋水族箱壁。觀察到相較於控制組與水族箱3，水族箱2在水族箱壁上僅具有中等的藻類生長。

在120天試驗過程中，三種水族箱皆是在水族箱側面幾乎沒有藻類的情況下開始的。隨著試驗進行，控制組水族箱(水族箱1)在水族箱的側面累積較多的藻類生長(參見例如圖10)。相較於水族箱1，水族箱2具有較少的藻類生長。相較於水族箱1與2，水族箱3幾乎沒有藻類生長。

在整個試驗中，水參數是一致的。三個水族箱的胺程度皆為零。在試驗期間，亞硝酸鹽/硝酸鹽亦在安全範圍內。所有水族箱的pH亦停留在約7.5至8.5的正常範圍內。由於水族箱循環安全地發生並且在120天的整個試驗中參數保持一致，因而沒有觀察到水參數峰值對蝦造成傷害。

該技藝中具有通常技術之人士在閱讀此說明書與本文之較佳實施例的說明後將亦理解可在本發明的範圍內進行方法與營養性萌發因子及孢子組成物的修飾與變化，並且本文所揭露之本發明的範圍僅限於發明人合法享有的所附申請專利範圍之最廣泛的解釋。