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TWI818598B - 用於緩解腎臟疾病與器官纖維化的方法 - Google Patents

用於緩解腎臟疾病與器官纖維化的方法 Download PDF

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TWI818598B
TWI818598B TW111123398A TW111123398A TWI818598B TW I818598 B TWI818598 B TW I818598B TW 111123398 A TW111123398 A TW 111123398A TW 111123398 A TW111123398 A TW 111123398A TW I818598 B TWI818598 B TW I818598B
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Abstract

本發明揭示一種用於緩解在一個體中之腎臟疾病或者一器官的纖維化的方法，其包括對該個體投藥以一含有一胺基酸亞鐵螯合物之組成物，該胺基酸亞鐵螯合物包括亞鐵離子與一胺基酸。

Description

用於緩解腎臟疾病與器官纖維化的方法
本發明是有關於一種用於緩解腎臟疾病的方法以及一種用於緩解一器官的纖維化的方法，特別是有關於使用一胺基酸亞鐵螯合物來緩解腎臟疾病的方法以及緩解一器官的纖維化的方法。
纖維化疾病(fibrotic disorders)是常見的，具有多種形式，並且可能會危及生命。不存在有比伴隨著所有慢性和/或急性腎臟疾病的漸進性纖維化(progressive fibrosis)更好的纖維化疾病例子。腎臟纖維化是受傷後腎臟的有限再生能力的直接結果。腎臟結瘢(renal scarring)導致腎臟功能的漸進性喪失，最終招致末期腎衰竭(end-stage renal failure)以及對於透析或腎臟移植的需求。因此，存在有一迫切的需要去發展出用於緩解腎臟纖維化以及與此有關的腎臟疾病之藥劑與方法。
發明概要
本發明提供一種用於緩解在一個體中之腎臟疾病的方法，其包含對該個體投藥以一含有一胺基酸亞鐵螯合物之組成物，該胺基酸亞鐵螯合物包括亞鐵離子與一胺基酸。
本發明亦提供一種用於緩解在一個體中之一器官的纖維化的方法，其包含對該個體投藥以一含有一胺基酸亞鐵螯合物之組成物，該胺基酸亞鐵螯合物包括亞鐵離子與一胺基酸。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。
一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
由於申請人意外地發現：胺基酸亞鐵螯合物在緩解腎臟腫脹與腎臟纖維化上是有效的，因此本發明提供了一種用於緩解在一個體中之腎臟疾病的方法，其包含對該個體投藥以含有一胺基酸亞鐵螯合物之組成物，該胺基酸亞鐵螯合物包括亞鐵離子和一胺基酸。
另外，由於胺基酸亞鐵螯合物對緩解腎纖維化上是有效的，申請人推測這種胺基酸亞鐵螯合物可用於緩解一器官中的纖維化。因此，本發明提供了一種用於緩解在一個體中之一器官的纖維化的方法，其包含對該個體投藥以上述含有胺基酸亞鐵螯合物之組成物。
在某些實施例中，該器官是選自於由下列所構成之群組：腎臟、肺臟、肝臟、睪丸，以及它們的組合。在一個示範性具體例中，該器官是腎臟。
如本文中所使用的，術語“腎臟疾病(kidney disease)”意指腎功能在數天、數月或數年的一段時間內的漸進性喪失(progressive loss)。腎臟疾病具有其在本領域中的通常含意，並且用於歸類數種對影響腎臟、腎臟器質性(renal parenchyma)的破壞以及功能性腎元(nephrons)或腎小球(glomeruli)的喪失之疾病。應特別注意的是，腎臟疾病可能由不同的因素所導致，但最終途徑仍然是腎臟纖維化。腎臟疾病病因的例子包括，但不限於：心血管疾病、高血壓、糖尿病、腎絲球腎炎(glomerulonephritis)、多囊性腎病(polycystic kidney diseases)，以及腎臟移植排斥。
術語“纖維化(fibrosis)”意指纖維組織的異常進程，或者類纖維瘤(fibroid)或纖維變性(fibrous degeneration)。纖維化可由各種不同急性或慢性的損傷或疾病所引起，以及經常可能由與各種不同器官的移植有關的移植排斥反應所引起。纖維化通常涉及細胞外基質成分(extracellular matrix components)的異常產生、累積或沉積，包括例如膠原蛋白與纖維接合素(fibronectin)的過度產生與沈積增加。如本文中所使用的，術語“腎臟纖維化(kidney fibrosis)”、“腎纖維化(renal fibrosis)和“腎臟的纖維化(fibrosis of the kidney)”意指與細胞外基質組分(特別是膠原蛋白)的過量產生或異常沉積相關的疾病(diseases)或障礙(disorders)，其導致腎功能的退化或損害。
如本文中所使用的術語“緩解(alleviating)”意指降低(lessening)、誘發停滯(inducing stasis)或者延後(postponing)或減少(reducing)疾病或病況(condition)的進展(progression)、發展(development)、發作(onset)或嚴重性(severity)，或者與本文中所描述的疾病或障礙或病況相關的一或多個症狀(symptoms)的嚴重性，或者改善(ameliorating)現有之不受控制或非所欲的症狀、預防額外的症狀，或者緩解或預防(prevent)症狀的潛在代謝因素。因此，這些術語表示有益的結果已被賦予給一帶有一疾病或症狀或具有發展出此類疾病或症狀的可能性之個體。當該個體經歷疾病、病況或病症(illness)的一種或多種病徵(signs)或症狀之部分或全部的緩解或減少時，反應被實現。
如本文中所使用的，術語“個體”意指任何感興趣的動物，諸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、綿羊(sheeps)、馬(horses)、豬(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。在某些具體例中，該個體可為人類。
依據本發明，該胺基酸亞鐵螯合物中該亞鐵離子與該胺基酸的螯合比例是落在1：1至1：4的範圍內。在某些具體例中，該胺基酸亞鐵螯合物中該亞鐵離子與該胺基酸的螯合比例是落在1：1.5至1：2.5的範圍內。
用於製備該胺基酸亞鐵螯合物的方法已被揭示在，例如，US 2017/0224727 A1中，並且包括在加熱下使一亞鐵化合物與一胺基酸混合的步驟。在某些具體例中，該混合步驟可在一範圍落在60℃至90℃的溫度下被進行。在某些具體例中，該混合步驟可被進行歷時8小時至48小時。
依據本發明，在該製備方法中所使用的亞鐵化合物與胺基酸的重量比例是介於1：1.2與1：1.5之間。在本發明的一具體例中，該亞鐵化合物與該胺基酸的重量比例為1：1.3。
在某些具體例中，該亞鐵化合物可為硫酸亞鐵(ferrous sulfate)、氯化亞鐵(ferrous chloride)、焦磷酸亞鐵(ferrous pyrophosphate)，或者它們的組合。
在某些具體例中，該胺基酸可為甘胺酸(glycine)。亦即，該胺基酸亞鐵螯合物可為甘胺酸亞鐵螯合物(ferrous glycinate chelate)。
依據本發明，該組成物可被製備成一藥學組成物(pharmaceutical composition)或一食物組成物(food composition)的形式。
若該組成物被製備成藥學組成物的形式，該組成物可進一步包含一藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)，並且利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥(oral administration)的劑型(dosage form)。該劑型的實例包括，但不限於：溶液(solution)、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、糖漿(syrup)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(capsule)、濃漿(slurry)以及類似之物。
適用於本發明之藥學上可接受的載劑的實例可包括，但不限於：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agents)、分解劑(decomposers)、黏結劑(binding agents)、賦形劑(excipients)、安定劑(stabilizing agents)、螯合劑(chelating agents)、稀釋劑(diluents)、膠凝劑(gelling agents)、防腐劑(preservatives)、潤滑劑(lubricants)、吸收延遲劑(absorption delaying agents)、脂質體(liposomes)，以及它們的組合。
依據本發明，該組成物可呈一食品添加物(food additive)的形式(食品組成物的一示範性實例)，其可以被添加至一可食性材料(edible material)中以製備一供人類或動物食用的食品產品。依據本發明，該食物產品的實例可包括，但不限於：流體乳品(fluid milk products)，例如，牛奶(milk)以及濃縮牛奶(concentrated milk)；發酵乳品(fermented milk)，例如，優酪乳(yogurt)、酸乳(sour milk)以及冷凍優格(frozen yogurt)；奶粉(milk powder)；冰淇淋(ice cream)；乳酪(cream cheeses)；乾酪(dry cheeses)；豆奶(soybean milk)；發酵豆奶(fermented soybean milk)；蔬果汁(vegetable-fruit juices)；果汁(fruit juices)；運動飲料(sports drinks)；甜點(confectionery)；果凍(jelly)；糖果(candies)；健康食品(health foods)；動物飼料(animal feeds)；以及膳食補充品(dietary supplements)。
依據本發明，該組成物的投藥劑量與頻率可視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，以及要被治療的個體之體重、年齡、身體狀況以及反應。舉例來說，依據本發明，該組成物的每日劑量可以是每kg體重12至36 mg，並且可以單一劑量或數個劑量而被投藥。
本發明將透過下列的實施例而被進一步說明。然而，應瞭解的是：下列的實施例僅是意欲供例示說明之用，而不應被解釋為本發明於實施上的限制。 實施例 一般實驗材料： 1. 胺基酸亞鐵螯合物的製備：
胺基酸亞鐵螯合物是根據在例如US 2017/0224727 A1中所描述的操作程序而被製備。具體而言，硫酸亞鐵與甘胺酸(高於98%的純度)以一為1：1.3的重量比例而被混合，繼而自60℃加熱至90℃歷時8小時至48小時，藉此而得到胺基酸亞鐵螯合物。在所得到的胺基酸亞鐵螯合物中亞鐵離子與胺基酸的螯合比例是介於1：1與1：4之間。 2. 實驗小鼠
購自於國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center)(台北，台灣)的雄性C57BL/6J小鼠(具有約為25公克的體重)是被養飼養在下列實驗條件下的動物房中：約24℃的溫度以及12小時光照/12小時黑暗的週期。飼料與水份被任意採食地( ad libitum)提供給所有的實驗動物。 3. 人類腎臟上皮細胞株 (HK-2) 的來源與培養
在下列實驗中所使用的人類腎臟近端小管表皮細胞株(human kidney proximal tubular epithelial cell line) HK-2[來自正常成年人類腎皮質(renal cortex)]是得自於食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。
HK-2細胞被培養在10-cm培養皿(petri dish)中，各個培養皿含有補充以HyCloneTM 1% (v/v)盤尼西林-鏈黴素(penicillin-streptomycin)(製造商：Cytiva；貨號：SC30010)之杜貝可氏改良的依格氏培養基/Ham氏營養混合物F-12 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s Nutrient Mixture F-12, DMEM/F12)(製造商：Thermo Fisher Scientific，WA，USA；貨號：12500062)。之後，在一個培養條件設為37℃與5%CO2的培養箱中進行培養。每隔2天更換培養基。當細胞密度達到約85%匯聚(confluence)時，所培養的細胞被進行繼代培養(sub-culturing)。 一般實驗方法： 1. 單側輸尿管阻塞 (Unilaterial ureter obstruction, UUO) 手術
UUO手術是依據實驗動物的照護與使用準則(Guidelines for Care and Use of Laboratory Animals)來進行。具體而言，在UUO手術期間，各小鼠透過以大約每kg體重60 mg的劑量之戊巴比妥(pentobarbital)(製造商：Merck KGaA，達姆施塔特，德國；貨號：P3761)的腹膜內注射(intraperitoneal injection)被麻醉。在腹中線(abdominal midline)的左側之皮膚組織與皮下肌肉層(subcutaneous muscle layer)被切開，而使得左腎被露出，並且左側的輸尿管被辨識與分離。左輸尿管在距腎門(renal hilum)約1 cm的上游位置和距腎門約1 cm下游位置使用剪刀而被剖開並且使用絲質手術縫合線(尺寸：4-0)來結紮。確認無出血與無漏尿發生後，所切開的皮下肌肉層與皮膚組織被縫合。 2. 統計學分析 (statistical Analysis)
在下面所述的所有實驗均被進行三重複。所有測試組別的實驗數據是以平均值(mean)±標準誤差(standard deviation, SD)來表示，並且是使用GraphPad Prism 4 軟體(開發商：GraphPad Sofware, Inc.，聖地牙哥，CA)與SPSS 12.0(International Business Machine Corporation)而以非成對雙尾史徒登氏t-試驗(unpaired two-tailed Student’s t-test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。統計學顯著性(statistical significance)是以 p＜0.05來表示。 實施例 1. 胺基酸亞鐵螯合物在緩解腎臟纖維化上的效用評估 A. 血液與尿液樣品的生化分析 實驗方法：
將“一般實驗材料”的第2項中所述的雄性C57BL/6J小鼠隨機分為5組，亦即，一個假手術組(sham-operated group, SOG)、一個病理對照組(pathological control groups, PCG)以及三個實驗組[亦即，實驗組1 (experimental group 1, EG1)、實驗組2 (experimental group 2, EG2)與實驗組3 (experimental group 3, EG3)](每組 n=3)。在動物房飼養歷時一週後，對PCG以及EG1至EG3的小鼠進行如在“一般實驗方法”的第1項中所述的UUO手術。對SOG的小鼠進行了類似的手術操作，除了SOG中的小鼠的輸尿管沒有被阻塞，亦即左輸尿管沒有被剖開與結紮。手術後，在整個歷時7天的實驗過程中，所有的小鼠都被置於鐵籠中。
EG1至EG3的小鼠分別經由口服胃管灌食法(oral gavage)而被投藥以呈5 mg/kg體重、125 mg/kg體重以及250 mg/kg體重的劑量之“一般實驗材料”的第1項中所述的胺基酸亞鐵螯合物，每天一次(在早上)，歷時7天。在第7天結束時，從EG1至EG3的每隻小鼠取得血液樣本和尿液樣本，每個樣本的體積為0.2 mL。SOG的小鼠與PCG的小鼠沒有接受任何處理(亦即0 mg/kg的亞鐵胺基酸螯合物)，而在第7天結束時，從每隻小鼠取得血液樣本和尿液樣本，每個樣本的體積為0.2 mL。
對各小鼠的血液樣本進行丙胺酸轉胺酶(alanine transaminase, ALT)、天冬胺酸轉胺酶(aspartate transaminase, AST)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)和肌酸酐(creatinine)的位準測量，以評估腎臟健康。對各小鼠的尿液樣品進行尿素氮(urea nitrogen)與肌酐酸的位準定量，以評估腎臟健康。對於上述參數中的各者，根據如在“一般實驗方法”的第2項中所述的方法來分析各組之間的差異。 結果：
圖1顯示了UUO手術後7天各組小鼠血液樣品中之ALT、AST、尿素氮和肌酐酸的位準(上區)，以及尿液樣品中之尿素氮和肌酐酸的位準(下區)。如圖1的上區所示，PCG的血液尿素氮位準顯著地高於SOG所具者，表示：UUO手術負面地影響了小鼠的腎功能。此外，與PCG所具者相較之下，在EG1至EG3中的各者所測得的血液尿素氮位準有顯著地減低，甚至近似於SOG所具者。而且，在EG1至EG3之間的血液尿素氮位準沒有觀察到顯著的差異。再者，對於血液樣本中ALT、AST與肌酐酸水平的各者，在SOG、PCG以及EG1至EG3之間沒有觀察到顯著的差異。
如圖1的下區所示，PCG的尿液肌酐酸位準和尿素氮位準顯著地高於SOG所具者，表示：UUO手術負面地影響了小鼠的腎功能。此外，與PCG所具者相較之下，EG2與EG3所測得的尿液肌酐酸位準有顯著地減低，而在PCG、EG1、EG2以及EG3的尿液尿素氮位準之間沒有觀察到顯著的差異。
這些結果顯示：本發明的胺基酸亞鐵螯合物在緩解UUO手術所引起的腎臟纖維化和改善腎功能上是有效的。 B. 腎臟形態學的觀察 實驗方法：
收集血液與尿液樣品後，犧牲本實施例第A項中所述的各組小鼠。收集各小鼠的左腎與右腎。將PCG以及EG1至EG3的阻塞左腎與SOG所具者進行關於腎臟形態學觀察的視覺比較。 結果：
圖2顯示UUO手術後7天各組小鼠的腎臟形態學。如圖2所示，在UUO手術後7天，與SOG的小鼠所具者相較之下，PCG的小鼠的阻塞左腎展現出更高程度肉眼上的形態學變異[例如肥大(hypertrophy)、水腎(hydronephrosis)、腎小管擴張(tubular dilation)以及間質性擴張(interstitial expansion)]，表示：腎臟纖維化已藉由UUO手術而被誘發。 C. 腎臟組織的組織學分析 實驗方法：
從各組中所選定的一隻小鼠之阻塞左腎來分離出腎臟組織。使用10%福馬林(formalin)進行固定，並且使用一系列梯度的酒精(從低至高濃度)和二甲苯(xylene)進行脫水，然後包埋在石蠟中。得到4 mm的組織切片並且置於載玻片上，然後在37℃的烘箱中加熱過夜以熔化石蠟(paraffin)。使用二甲苯來去除熔化的石蠟，並且使用梯度的酒精(從高至低濃度)來進行復水(rehydration)。使用1% H 2O 2來去除內生性過氧化酶(endogenous peroxidase)，然後使用磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate-buffered saline, PBS)洗滌，藉此提升滲透性。將組織切片與胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)培育以防止一些非特異性抗原(non-specific antigens)結合後，透過負壓來去除水份。
為了α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, SMA)的染色，在室溫下對組織切片添加抗α-平滑肌肌動蛋白(SMA)(α-SMA)的一次抗體(primary antibody)(製造商：Abcam PLC；貨號：ab5694)以1：400的稀釋比例，並且使反應在室溫下進行2小時。此後，使用PBS洗滌兩次以去除未結合的一次抗體。加入聚合物-HRP二次抗體(Polymer-HRP secondary antibody)(製造商：Golden Bridge International Inc., USA)。反應一小時後，使用PBS進行洗滌兩次。加入卵白素-生物素複合物(avidin-biotin complex, ABC)溶液，並且使反應在室溫下進行歷時45分鐘，然後使用PBS洗滌兩次。α-平滑肌肌動蛋白(SMA)是基於經染色的組織切片中的棕色分佈來進行識別。
核染色(nuclear staining)是藉由將組織切片浸入基質緩衝液中歷時10分鐘來進行。在反應被抑止(quenched)後，加入Surgipath® Hematoxylin Gill II溶液(製造商：Leica Biosystems Inc.；貨號：3801522)和Surgipath® Eosin Y溶液(製造商：Leica Biosystems Inc.；貨號：3801602)，接而施用ddH 2O來清洗多餘的染色溶液。使用酒精來進行脫水(dehydration)，然後將封固劑(mounting medium)逐滴添加至載玻片上並使用蓋玻片來覆蓋該載玻片。細胞核是基於經染色的組織切片中的藍色分佈來進行識別。
間質膠原纖維(interstitial collagen fibers)和肌肉纖維(muscle fibers)的染色是使用三色染色套組(Trichrome Stain Kit)[改良的馬森氏(Modified Masson's)](製造商：ScyTek Laboratories, Inc.；貨號：TRM-2-IFU)並根據製造商的指南來對組織切片進行。膠原纖維和肌肉纖維是基於經染色的組織切片中的藍色與紅色分佈分別來進行識別。
針對可供作細胞在病理情況(特別是經歷纖維化)下的標記--中間絲蛋白(vimentin)染色，在Rapid Science Co. Ltd. (台灣)的人員所提供的幫助下對組織切片進行免疫組織化學分析(immunohistochemical analysis)。具體而言，在室溫下以1：50的稀釋比例來添加抗中間絲蛋白的一次抗體(製造商：Cell Signaling Technology, Inc.；貨號：#5741)，且使反應在室溫下進行歷時2小時。此後，使用PBS進行洗滌兩次以去除未結合的一次抗體。加入聚合物-HRP山羊抗-兔子IgG H&L二次抗體(polymer-HRP goat anti-rabbit IgG H&L secondary antibody)(製造商：Abcam PLC，劍橋， UK；貨號：ab214880)。反應一小時後，使用PBS進行洗滌兩次。中間絲蛋白是基於染色組織切片中的棕色分佈來進行識別。
各個經染色的組織切片是使用螢光顯微鏡[製造商：Carl Zeiss Microscopy, LLC, USA；型號：Axio Imager. A2 (490022-0009-000)]在100X的倍率下來進行成像(imaging)和攝影。 結果：
圖3顯示了UUO手術後7天各組所選定的小鼠之腎臟組織切片的組織學分析。如圖3所示，UUO手術後7天，與所選定的SOG小鼠所具者相較之下，所選定的PCG小鼠之阻塞左腎的組織展現出更高程度的腎小管擴張[如蘇木素和伊紅(H＆E)染色所示]，增多的膠原纖維與肌肉纖維之間質沉積(interstitial deposition)(如馬森氏三色染色所示)，增加的肌動蛋白纖維量(如α-SMA染色所示)以及增加之經歷纖維化的細胞數量(如中間絲蛋白染色所示)，這證實：腎小管間質纖維化已藉由UUO手術而被誘發。此外，與PCG所具者相較之下，在EG1至EG3中的各者腎小管擴張、膠原纖維和肌肉纖維的間質沉積、肌動蛋白纖維量以及經歷纖維化的細胞數量皆顯著地減少，而與EG1所具者相比，EG2和EG3在腎小管擴張以及膠原纖維和肌肉纖維的間質沉積上的減少程度更多。這些結果顯示：本發明的胺基酸亞鐵螯合物能夠緩解腎纖臟維化。 D. 腎臟組織的蛋白質表現分析 實驗方法：
從各組中所選定的一隻小鼠之阻塞左腎分離出腎臟組織，然後在冰上使用NETN溶解緩衝液(NETN lysis buffer)(20 mM Tris、150 mM氯化鈉、1 mM EDTA與0.5% NP-40)來予以溶解。將所形成的細胞溶解物離心，並且收集上清液以供作為總蛋白樣品。
將由布拉福分析法(Bradford assay)所測定之呈等量(亦即20 μg)的蛋白質樣品在8%或10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide, SDS-PAGE)凝膠中來進行解析，然後進行免疫墨點分析(immunoblot analysis)。具體而言，將經分離的蛋白質轉移至Immobilon®-P聚二氟亞乙烯膜(polyvinylidene difluoride membranes, PVDF membranes)(製造商：Merck Millipore, NJ, USA)。將由此而獲得之經印漬的PVDF膜在室溫下使用Tris緩衝生理鹽水(Tris-buffered saline, TBS)與含有5%脫脂奶粉的0.1% (vol/vol)聚山梨醇酯20(polysorbate 20)(也被稱為Tween 20)來進行封組歷時1小時，繼而使用TBST來洗滌3次，每次歷時10分鐘，然後使用指定的一次抗體來進行探測(probing)過夜。將經探測的膜使用TBST緩衝液(TBS與聚山梨醇酯20的混合物)來洗滌3次，每次歷時5分鐘，接而在室溫下與二次抗體[諸如辣根過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)-綴合的抗-小鼠抗體或HRP-綴合的抗-兔子抗體]進行培育歷時60分鐘。HRP是使用ECL檢測試劑(Merck Millipore，達姆施塔特，德國)來進行偵測，而條帶強度(band intensity)是藉由ImageQuant™ LAS-4000冷光影像分析儀(luminescence image analyzer)(GE Healthcare)來進行測定。
用於偵測各個蛋白質的一次抗體和二次抗體被顯示於表1中。抗-甘油醛3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)被用作為加載對照。 表 1
蛋白質 一次抗體；稀釋因數 二次抗體
中間絲蛋白 兔子多株抗-中間絲蛋白抗體(製造商：BioVision, Inc.，米爾皮塔斯，CA，USA；貨號：#3634);1:1000 AffiniPure山羊抗-兔子IgG (H+L)，HRP-連結的抗體(製造商：Jackson ImmunoResearch Laboratories，西格羅夫，PA，USA；貨號： 111-035-003)
α-平滑肌肌動蛋白 小鼠單株抗-SMA抗體 (製造商：Santa Cruz Biotechnology, Inc.， CA，USA；貨號：sc-32251);1:500 AffiniPure山羊抗-小鼠IgG (H+L)，HRP-連結的抗體(製造商：Jackson ImmunoResearch Laboratories，西格羅夫，USA；貨號：115-035-003)
膠原蛋白I型 兔子單株抗-膠原蛋白I型抗體(製造商：Cell Signaling Technology, Inc.，丹佛斯，MA，USA；貨號：#72026); 1:1000 AffiniPure山羊抗-兔子IgG (H+L)，HRP-連結的抗體(製造商：Jackson ImmunoResearch Laboratories，西格羅夫，USA；貨號：111-035-003)
甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 小鼠單株抗-GAPDH抗體(製造商：Santa Cruz Biotechnology, Inc.，CA，USA；貨號：sc-32233); 1:5000 AffiniPure山羊抗-小鼠IgG (H+L)，HRP-連結的抗體(製造商：Jackson ImmunoResearch Laboratories，西格羅夫，USA；貨號：115-035-003)
結果：
圖4顯示UUO手術7天後各組腎臟組織中纖維蛋白(亦即α-SMA、膠原蛋白I型以及中間絲蛋白)的西方墨點法(Western blot)結果。如圖4所示，與SOG相較之下，PCG的中間絲蛋白、α-SMA和膠原白I型的表現有增加，表示：UUO手術後腎臟纖維化發生。此外，與PCG所具者相較之下，中間絲蛋白的表現位準從EG1至EG3依次地降低，並且與PCG所具者相較之下，EG2與EG3在表現位準上展現出顯著的降低。此外，與PCG所具者相較之下，EG3的α-SMA與膠原蛋白I型的表現顯著地降低，而在EG1、EG2與PCG之間沒有觀察到顯著差異。這些結果顯示：本發明的胺基酸亞鐵螯合物當以250 mg/kg的劑量來投藥時能夠降低腎臟中纖維蛋白的表現。
總而言之，這些結果表示：本發明的胺基酸亞鐵螯合物在緩解腎臟纖維化上是有效的。 實施例 2. 胺基酸亞鐵螯合物的細胞毒性分析 實驗方法：
首先，將一般實驗材料的第3項中所描述的HK-2細胞以每井2×10 4個細胞的濃度接種到6-井培養盤的井中，各井均含有補充有1%(v/v)盤尼西林-鏈黴素的DMEM/F-12，然後分為7組，亦即一個對照組(CG)與6個實驗組[亦即實驗組1至6 (EG1至EG6)]，繼而在培養箱中以設置在37℃與5% CO 2的培養條件下來進行培養歷時24小時。接著，對EG1至EG6中的各個細胞培養物處理以具有50、100、250、500、750以及1000 μg/mL的濃度中之一對應者的亞鐵胺基酸螯合物，而CG的細胞培養物沒有接受任何處理。培養24小時後，移除各組培養基，並使用磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)來洗滌細胞二次，接而使用濃度為0.5 mg/mL的MTT試劑來進行培育歷時4小時。之後，移除MTT試劑，並且在室溫下將細胞培育以1 mL的異丙醇歷時5分鐘。接著，收集各組的培養基並使用分光光度計在570 nm (OD 570)的波長下來進行吸光度測量。
各組的細胞可活性比率(%)是使用下面的公式(I)而被計算： A=(B/C)×100                    (I) 其中A=細胞可活性比率(%) B=各組的OD 570值 C=對照組的OD 570值 根據一般實驗方法的第2項中所述的方法來對各組之間的差異進行統計分析。 結果：
圖5顯示了各組HK-2細胞在處理以胺基酸亞鐵螯合物後的細胞可活性比率。如圖5所示，EG1至EG6中各組HK-2細胞的可活性相較於CG所具者沒有顯著地影響，表示：使用本發明的胺基酸亞鐵螯合物來處理腎小管上皮細胞後沒有誘發細胞毒性。 實施例 3. 胺基酸亞鐵螯合物在緩解 TGF-β1 所誘發的腎臟纖維化上的效用評估 實驗方法：
首先，將一般實驗材料的第3項中所述的HK-2細胞以每井4x10 4個細胞的濃度接種到6-井培養盤的井中，各井含有補充有1%(v/v)的盤尼西林-鏈黴素的DMEM，然後分成4組，亦即一個對照組、一個比較組1、一個比較組2與一個實驗組，繼而培養至90%匯聚。接著，藉由使用200 μL的量吸管尖管(pipette tip)沿相應孔的直徑刮除各組的細胞培養物，以產生約50 μm的無細胞傷口區域(cell-free wound area)。然後，移除培養基，並且將新鮮培養基(亦即無血清DMEM)與2 μg/mL的絲裂黴素c (mitomycin c)(供作為細胞增生抑制劑)添加至各組的細胞中。之後，對比較組1的細胞處理以50 ng/mL的轉化生長因子β-1 (transforming growth factor beta-1, TGF-β1)(來源：購自於R&D systems, Inc.的重組型人類TGF-β1蛋白質；貨號：240-B)，對比較組2的細胞處理以100 μg/mL的胺基酸亞鐵螯合物，以及對實驗組的細胞處理以50 ng/mL的TGF-β1與100 μg/mL的胺基酸亞鐵螯合物。對照組的細胞沒有接受任何處理。細胞遷移是在第0小時與第24小時使用倒立式光學顯微鏡來進行評估。 結果：
圖6是顯示各組HK-2細胞的遷移之光學顯微鏡影像。如圖6所示，在24小時，與對照組相較之下，比較組1的HK-2細胞得到了經提升之進入無細胞傷口區域的遷移行為(亦即遠離其上皮細胞群落移動)，證實：HK-2細胞已藉由TGF-β1而被誘發去經歷上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程。相對地，與比較組1所具者相較之下，實驗組的HK-2細胞顯示出經減低之遷移到無細胞傷口區域的能力，表示：本發明的胺基酸亞鐵螯合物能夠抑制由TGF-β1所誘發的EMT過程。由於EMT在諸如纖維化的病理情況下被重現，此結果暗示：本發明的胺基酸亞鐵螯合物能夠緩解腎臟纖維化。
綜上所述，這些結果證明了本發明的胺基酸亞鐵螯合物對腎臟纖維化的治療效果。因此，本發明的胺基酸亞鐵螯合物被預期可用於緩解腎臟疾病(例如，急性腎臟疾病)與器官(諸如腎臟)的纖維化。
於本案說明書內所引述的所有專利案與文獻資料以及其中所描述的參考資料是以它們的整體在此被併入以作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參照被認為是示範性的具體例而被描述，應被瞭解的是：本揭露內容不限於所揭示的具體例，而意欲涵蓋被包括在最廣泛的解釋之精神與範疇中之各種不同的配置，俾以包含所有這類的修改以及等效的配置。
本揭露內容之其他的特徵以及優點將在下列參照隨文檢附的圖式之具體例的詳細說明中變得明顯，其中： 圖1顯示在下面實施例1的各組中，小鼠血液樣品中肝臟酵素(liver enzymes)、尿素氮(urea nitrogen)與肌酸酐(creatinine)的位準，以及小鼠尿液樣品中尿素氮與肌酸酐的位準，其中符號“**”表示與假手術組(sham-operated group, SOG)作比較， p＜0.01，以及符號“#”表示與病理對照組(pathological control group, PCG)作比較， p＜0.05； 圖2顯示在下面實施例1的各組中小鼠的腎臟形態學； 圖3顯示在下面實施例1的各組中所選定的小鼠之腎臟組織切片的組織學分析； 圖4顯示在下面實施例1的各組中，腎臟組織中α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin)、膠原纖維(collagen fibers)以及中間絲蛋白(vimentin)的蛋白質表現位準，其中GAPDH供作為一加載對照； 圖5顯示在下面實施例2的各組中HK-2細胞的可活性百分比；以及 圖6顯示在下面實施例3的各組中HK-2細胞的遷移。

Claims (3)

  1. 一種甘胺酸亞鐵螯合物供應用於製備一用來緩解在一個體中之腎臟纖維化之組成物的用途。
  2. 如請求項1的用途，其中在該甘胺酸亞鐵螯合物中該亞鐵離子與該甘胺酸的螯合比例是落在1：1至1：4的範圍內。
  3. 如請求項1的用途，其中該組成物是被口服投藥。
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