TWI811675B

TWI811675B - 一種治療脊髓性肌萎縮症的方法和藥物

Info

Publication number: TWI811675B
Application number: TW110116986A
Authority: TW
Inventors: 李季男
Original assignee: 大陸商深圳瑞健生命科學研究院有限公司
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2021-05-11
Publication date: 2023-08-11
Also published as: JP7624240B2; CA3183106A1; EP4140498A4; CA3182911A1; US20230190891A1; TW202200192A; US20230181699A1; JP2023525256A; WO2021227417A1; EP4144364A4; CN115551535A; JP2023525257A; WO2021228086A1; KR20230005298A; TW202142256A; EP4140498A1; KR20230004752A; CN115697385A; EP4144364A1

Abstract

本發明涉及一種治療脊髓性肌萎縮症（SMA）的方法，包括給藥受試者治療有效量的纖溶酶原途徑激活劑。本發明還涉及用於治療脊髓性肌萎縮症的包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、製品和試劑盒。

Description

一種治療脊髓性肌萎縮症的方法和藥物

本發明涉及一種治療脊髓性肌萎縮症（SMA）及其相關病症的方法，包括給藥患有脊髓性肌萎縮症（SMA）及其相關病症的受試者有效量的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物，例如纖溶酶原，以修復損傷神經，改善臨床症狀和體徵。

脊髓性肌萎縮症（Spinal Muscular Atrophy）簡稱SMA，又稱脊髓性肌萎縮或脊肌萎縮症，是一類由脊髓前角運動神經元變性導致肌無力、肌萎縮的疾病。屬常染色體隱性遺傳病。SMA最常見的形式是由運動神經元生存(SMN)基因中的突變所引起的，嬰兒SMA是這種神經退行性病症的最嚴重形式。症狀包括肌無力、肌張力低下、哭泣無力、跛行或摔倒傾向、吮吸或吞咽困難、肺或咽喉分泌物積聚、攝食困難和易患呼吸道感染。腿部往往比手臂更無力，並且不能達到發育標誌，如抬頭或坐起。一般地，症狀出現得越早，壽命就越短。

SMA的進程與運動神經元細胞惡化速度以及所造成的無力程度直接相關。患有嚴重形式的SMA的嬰兒由於支持呼吸的肌肉無力而經常死於呼吸道疾病。患有較輕形式的SMA的兒童存活時間較長，但是他們可能需要廣泛的醫療支撑。

根據患者的發病年齡和疾病的嚴重程度，脊肌萎縮症分爲5種亞型：

0型患者：一般多見於胎兒或新生兒，胎兒期即發作表現爲胎動減少，新生兒表現爲肌肉反射消失、面部癱瘓、房間隔缺損和關節攣縮，最嚴重的表現爲呼吸衰竭，病兒預期壽命大大縮短，大多數生存期在6個月以內。

I型患者：即嬰兒型，亦稱爲Werdnig-Hoffman病，占SMA患者的50%。患者出生後6個月內出現肌張力低下，頭部控制不佳和肌腱反射減弱或消失。嚴重的肌張力低下，表現爲躺倒時“蛙腿”姿勢，缺乏頭部控制，不能端坐，肋間肌肉薄弱，膈肌相對較小，患者往往出現吞咽功能減弱，呼吸肌無力而産生呼吸衰竭。在無輔助通氣情况下，92%的Ⅰ型SMA患兒通常在20個月前因呼吸衰竭而死亡。

II型患者：即中間型，約占SMA患者的20%，一般在出生後6-18個月內發病，患者可以在發育過程中的某一階段獨坐，但無法獨立行走。該類患者多出現脊柱側凸、關節攣縮和下頜關節强直等併發症，脊柱側凸和肋間肌無力往往導致嚴重的肺部疾病。這些兒童的認知能力是正常的。

III型患者：即少年型，亦稱爲Kugelberg -Welander病，約占SMA患者的30%，患者一般在出生後18個月-5歲內發病，在輔助物支撑的幫助下可行走。與II型SMA不同的是，這些人大多沒有脊柱側彎和呼吸肌無力等併發症，這個群體的認知和預期壽命一般不受疾病的影響。

IV型患者：在少年之後發病，運動能力逐漸降低，大約占SMA患者總數的5%。與III型相似，但是發病在成年期，通常認爲在30歲或更晚時候發病。

SMA是由兩個染色體上基因(SMN1)的端粒拷貝的失活突變或缺失，從而導致SMN1基因功能喪失所引起的。SMN1蛋白在RNA成熟中具有輔助因子的功能，是所有真核細胞存活力所需要的(Talbot and Tizzano(2017)Gene Ther 24(9):529-533)。SMN2蛋白除在RNA信息的剪接中起作用的單突變外與SMN1幾乎相同。所有SMA患者保留了基因(SMN2)的著絲粒拷貝，並且SMA患者中SMN2基因的拷貝數通常與疾病嚴重性負相關，即SMA不太嚴重的患者具有更多的SMN2拷貝。儘管如此，由於外顯子7中翻譯沉默的C向T的突變所引起的外顯子7的選擇性剪接，SMN2不能完全補償SMN1功能的損失。因此，由SMN2産生的大部分轉錄物缺乏外顯子7(Δ7 SMN2)並且編碼具有受損的功能並且被快速降解爲截短的SMN蛋白。SMA的病因在於SMN1基因缺失，而體內存在SMN2基因用以代償SMN1基因功能。SMN2基因和SMN1基因的區別在於外顯子7出現C到T的突變。這種突變的SMN2基因大部分産生截短的SMN基因和SMN蛋白和約10%的全長、正確的SMN基因和SMN蛋白。截短的SMN蛋白雖然亦能發揮類似的全長SMN蛋白功能，但是它的半衰期短，很快就會降解。

每個人體內SMN2的拷貝數不同。在SMN1基因缺失下，體內SMN2基因的拷貝數基本上決定了是罹患I型（2個SMN2拷貝數）、II型（3個SMN2拷貝數）還是III型（4個SMN2拷貝數）SMA。因此，哪怕是增加截短的SMN基因和蛋白，都會對減輕疾病嚴重性起重要作用。

在臨床上，通常通過臨床症狀結合至少一個SMN1基因拷貝的測試診斷SMA。在一些情况下，當SMN1基因測試未顯示異常時，其他測試如肌電描記術(EMG)或肌肉活組織檢查也可以輔助診斷。到目前爲止，SMA的治療僅限於支持療法，包含呼吸、營養和康復的治療和護理，尚無藥物能夠有效治療這種疾病。

本發明研究發現纖溶酶原途徑激活劑例如纖溶酶原可以明顯改善SMA受試者神經損傷症狀、改善肺功能、延長生存期、促進SMN基因的轉錄和表達、提高腦組織和肌肉組織中SMN蛋白水平、促進腦組織和肌肉組織中轉錄因子例如NF-κB蛋白的表達、促進腦組織成熟NGF的形成、改善肺組織損傷，從而有效預防和治療SMA。

一方面，本發明涉及一種治療脊髓性肌萎縮症（SMA）（包括0型、I型、II型、III型、IV型和非5q型SMA）的方法，包括給藥患運動神經元病例如脊髓性肌萎縮症（SMA）的受試者治療有效量的選自如下的一種或多種纖溶酶原途徑激活劑：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

在一些具體實施方案中所述纖溶酶原途徑激活劑對所述患脊髓性肌萎縮症（SMA）（包括0型、I型、II型、III型、IV型和非5q型SMA）的受試者具有選自如下的一種或多種活性：1. 減小或改善SMA的嚴重程度；2. 延遲SMA的發作；3. 抑制SMA的進展；4. 延長受治者的存活時間；5. 提高受治者的生活質量和/或改善受試者精神狀態；6. 減少SMA相關症狀的數目；7. 減小或改善與SMA相關的一種或多種症狀的嚴重程度；8. 縮短與SMA相關的症狀的持續時間；9. 防止與SMA相關的症狀的復發；10. 抑制SMA症狀的發展或發作；11. 抑制與SMA相關的症狀的進展；12. 改善肺功能；13. 提高血氧飽和度；14. 促進SMN基因的轉錄和表達（包括1.促進截斷的SMN2基因的轉錄和/或表達；或2.促進全長SMN基因的轉錄和/或表達）；15. 提高腦組織和肌肉組織中SMN蛋白水平；16. 促進腦組織和肌肉組織中轉錄因子例如NF-κB蛋白的表達；17. 促進腦組織成熟NGF的形成；18. 減輕肺組織損傷；19. 增加肌力；20. 減少肌萎縮；21. 減少運動神經元損失；22. 促進生長、發育；和/或23. 提高運動功能。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑改善受試者的肌肉萎縮、增强肌力、和/或改善肌張力。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑改善受試者選自下組的一項或多項：肌力、肌張力、運動功能、呼吸功能和肌肉萎縮。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑延長受試者生存期。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑促進SMN基因的轉錄和/或表達（包括1.促進截斷的SMN2基因的轉錄和/或表達；或2.促進全長SMN基因的轉錄和/或表達）。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑促進受試者的肌肉功能恢復。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑促進受試者的脊髓前角神經元損傷修復。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑促進受試者轉錄因子例如NF-κB蛋白的表達，例如大腦或脊髓組織中轉錄因子例如NF-κB蛋白的表達。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑促進受試者成熟NGF的形成。所述纖溶酶原途徑激活劑促進受試者成熟NGF的形成。

在一些實施方案中，本申請涉及治療SMA的方法，包括給藥SMA受試者治療有效量的纖溶酶原，所述纖溶酶原具有選自下組的一項或多項活性（作用）：1.促進截斷的SMN2基因的轉錄和/或表達；和2.促進全長SMN基因的轉錄和/或表達。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑進一步具有選自下組的一項或多項作用：

1）促進纖溶酶原透過血-腦屏障和血-脊髓屏障，

2）促進纖溶酶原向SMA受試者大腦和脊髓組織聚集，

3）促進纖溶酶原向SMA受試者損傷組織（例如中樞神經組織（大腦和脊髓）、肺、肌肉組織）聚集，

4）提高SMA受試者大腦和脊髓中纖溶酶原水平，

5）提高SMA受試者損傷組織局部（例如中樞神經組織（大腦和脊髓）、肺、肌肉組織）纖溶酶原水平，

6）減輕SMA受試者損傷組織（例如中樞神經組織（大腦和脊髓）、肺、肌肉組織）損傷，

7) 促進SMA受試者損傷組織（例如中樞神經組織（大腦和脊髓）、肺、肌肉組織）炎症修復，

8）促進SMA受試者大腦和脊髓中SMNΔ7的轉錄，

9）提高SMA受試者大腦和脊髓中SMN蛋白（包括1.截斷的SMN2蛋白；或2.全長SMN蛋白）的水平，

10）促進SMA受試者大腦和脊髓中NGF的表達，和

11）促進SMA受試者生長發育。

在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑與一種或多種其它藥物和/或治療方法聯合施用，較佳地，所述治療方法包括細胞療法（例如幹細胞療法）和基因療法，例如反義 RNA、小分子剪接修飾劑。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑爲纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分。

在一些實施方案中，所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自纖維蛋白溶酶原（簡稱：纖溶酶原）、重組人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、微纖溶酶（micro-plasmin）、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶（delta-plasmin）、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。在一些具體實施方案中，所述纖溶抑制劑的拮抗劑爲PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的拮抗劑，例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體。

在一些具體實施方案中，所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分爲纖溶酶原。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原包含或具有與序列2、6、8、10或12所示氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的氨基酸序列，並且具有纖溶酶原活性，例如蛋白水解活性或賴氨酸結合活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲人全長纖溶酶原或其保守取代變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原的賴氨酸結合活性或蛋白水解活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原包含與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列、並且仍然具有纖溶酶原的蛋白水解活性的蛋白質。在一些實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原的蛋白水解活性的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10、12所示的氨基酸序列或包含序列2、6、8、10、12所示氨基酸序列的保守取代變體。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原的蛋白水解活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原與底物分子的賴氨酸結合活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原的蛋白水解活性和纖溶酶原與底物分子的賴氨酸結合活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且具有纖溶酶原的蛋白水解活性和/或賴氨酸結合活性的蛋白質。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原的蛋白水解活性。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原爲包含纖溶酶原活性片段、並且具有纖溶酶原的蛋白水解活性和/或賴氨酸結合活性的蛋白質。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性片段包含或具有纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶結構域或稱纖溶酶原蛋白酶結構域。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性片段的氨基酸序列如序列14所示。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原（人全長纖溶酶原）、Lys-纖溶酶原（在第76-77位氨基酸之間切割後的人全長纖溶酶原）、小纖溶酶原(包含Kringle 5（K5）和絲氨酸蛋白酶結構域)、微纖溶酶原(包含絲氨酸蛋白酶結構域)、delta-纖溶酶原（包含Kringle 1和絲氨酸蛋白酶結構域）或它們的保留纖溶酶原活性的變體。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原爲人全長纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原的蛋白水解活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原與底物分子的賴氨酸結合活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原的蛋白水解活性和纖溶酶原與底物分子的賴氨酸結合活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原的蛋白水解活性和/或賴氨酸結合活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原包含如序列2、6、8、10或12所示的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。

在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑以全身或局部方式給藥，例如通過靜脈內、肌肉內、鞘內、鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液或滴眼液形式給藥。在一些實施方案中，所述受試者是人。在一些實施方案中，所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。在一些實施方案中，所述缺乏或缺失是先天的、繼發的和/或局部的。在一些實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000 mg/kg、0.001-800 mg/kg、0.01-600 mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg（以每公斤體重計算）或0.0001-2000mg/cm² 、0.001-800 mg/cm² 、0.01-600 mg/cm² 、0.1-400 mg/cm² 、1-200 mg/cm² 、1-100 mg/cm² 、 10-100 mg/cm² （以每平方公分體表面積計算）的劑量，每天、每二天或每三天連續施用。

在一些實施方案中，上述SMA爲0型、I型、II型、III型、IV型或非5q型SMA。

一方面，本申請還涉及用於治療脊髓性肌萎縮症（SMA）的藥物組合物、藥物、製劑、試劑盒、製品，包含以上所述的纖溶酶原途徑激活劑，例如以上所述的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分，例如以上所述的纖溶酶原。

在一些實施方案中，所述藥物組合物、藥物、製劑包含藥學上可接受的載體和纖溶酶原途徑激活劑，例如以上所述的纖溶酶原激活途徑的組分，例如以上所述的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述試劑盒和製品包含一個或多個容器，所述容器中包含所述藥物組合物、藥物或製劑。在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示使用纖溶酶原途徑激活劑，例如以上所述的纖溶酶原激活途徑的組分，例如以上所述的纖溶酶原治療脊髓性肌萎縮症的方法。在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含另外的一個或多個容器，該容器中含有一種或多種其他藥物。在一些實施方案中，上述SMA爲0型、I型、II型、III型、IV型或非5q型SMA。

一方面本申請還涉及用於治療脊髓性肌萎縮症（SMA）的以上所述的纖溶酶原途徑激活劑，例如以上所述的纖溶酶原。在一些實施方案中，上述SMA爲0型、I型、II型、III型、IV型或非5q型SMA。

一方面，本申請還涉及以上所述的纖溶酶原途徑激活劑，例如以上所述的纖溶酶原用於治療脊髓性肌萎縮症（SMA）的用途。在一些實施方案中，上述SMA爲0型、I型、II型、III型、IV型或非5q型SMA。

一方面，本申請還涉及治療有效量的上述纖溶酶原途徑激活劑（例如以上所述的纖溶酶原激活途徑的組分，例如以上所述的纖溶酶原）在製備治療脊髓性肌萎縮症（SMA）的藥物組合物、藥物、製劑、試劑盒、製品中的用途。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑選自如下的一種或多種纖溶酶原途徑激活劑：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

在一些具體實施方案中，所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自纖維蛋白溶酶原、重組人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、微纖溶酶（micro-plasmin）、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶（delta-plasmin）、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。在一些具體實施方案中，所述纖溶抑制劑的拮抗劑爲PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的拮抗劑，例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體。

在一些具體實施方案中，所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分爲纖溶酶原。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原包含或具有與序列2、6、8、10或12所示氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的氨基酸序列，並且具有纖溶酶原活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原的蛋白水解活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原與底物分子的賴氨酸結合活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原的蛋白水解活性和纖溶酶原與底物分子的賴氨酸結合活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且具有纖溶酶原的蛋白水解活性和/或賴氨酸結合活性的蛋白質。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原的蛋白水解活性。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原爲包含纖溶酶原活性片段、並且具有纖溶酶原的蛋白水解活性和/或賴氨酸結合活性的蛋白質。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性片段包含或具有纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶結構域或稱纖溶酶原蛋白酶結構域。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性片段的氨基酸序列如序列14所示。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原（人全長纖溶酶原）、Lys-纖溶酶原（在第76-77位氨基酸之間切割後的人全長纖溶酶原）、小纖溶酶原(包含Kringle 5（K5）和絲氨酸蛋白酶結構域)、微纖溶酶原(包含絲氨酸蛋白酶結構域)、delta-纖溶酶原（包含Kringle 1和絲氨酸蛋白酶結構域）或它們的保留纖溶酶原活性的變體。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原爲人全長纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原的蛋白水解活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原與底物分子的賴氨酸結合活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原活性爲纖溶酶原的蛋白水解活性和纖溶酶原與底物分子的賴氨酸結合活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原的蛋白水解活性和/或賴氨酸結合活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原包含如序列2、6、8、10或12所示的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑，例如上述纖溶酶原激活途徑的組分，例如上述纖溶酶原與一種或多種其它藥物和/或治療方法聯合施用。在一些實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑，例如纖溶酶原激活途徑的組分，例如纖溶酶原通過靜脈內、肌肉內、鞘內、鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液或滴眼液形式給藥。

在一些實施方案中，所述藥物組合物、藥物、製劑包含藥學上可接受的載體和纖溶酶原途徑激活劑，例如纖溶酶原激活途徑的組分，例如纖溶酶原。在一些實施方案中，所述試劑盒和製品包含一個或多個容器，所述容器中包含所述藥物組合物、藥物或製劑。在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示使用纖溶酶原途徑激活劑，例如纖溶酶原激活途徑的組分，例如纖溶酶原治療脊髓性肌萎縮症的方法。

在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含另外的一個或多個容器，該容器中含有一種或多種其他藥物。

本發明明確涵蓋了屬本發明實施方案之間的技術特徵的所有組合，並且這些組合後的技術方案在本申請中已經明確公開，就像上述技術方案已經單獨且明確公開一樣。另外，本發明還明確涵蓋各個實施方案及其要素的之間的組合，該組合後的技術方案在本文中明確公開。

術語“脊髓性肌萎縮（症）”(Spinal Muscular Atrophy，SMA)是指由兩個染色體上SMN1基因的失活突變或缺失，從而導致SMN1基因功能喪失引起的疾病。SMA的症狀包括肌無力、肌張力低下、哭泣無力、咳嗽無力、跛行或摔倒傾向、吮吸或吞咽困難、呼吸困難、肺或咽喉中分泌物積累、緊握的拳頭和汗手、舌頭顫動/振動、常常傾向一側的頭部(即使在躺下時)、傾向於弱於臂部的腿部、經常呈“蛙腿”位置的腿部、攝食困難、對呼吸道感染敏感度提高、腸/膀胱無力、低於正常的體重、不能無支撑坐立、不能行走、不能爬行、和張力減退、反射消失、以及與前hom細胞喪失相關的多發性先天性攣縮(關節攣縮)。

本申請術語“治療脊髓性肌萎縮(SMA)”或“脊髓性肌萎縮(SMA)的治療”包括獲得以下效果中的一個或多個：1. 減小或改善SMA的嚴重程度；2. 延遲SMA的發作；3. 抑制SMA的進展；4. 延長受治者的存活時間；5. 提高受治者的生活質量和/或改善受試者精神狀態；6. 減少SMA相關症狀的數目；7. 減小或改善與SMA相關的一種或多種症狀的嚴重程度；8. 縮短與SMA相關的症狀的持續時間；9. 防止與SMA相關的症狀的復發；10. 抑制SMA症狀的發展或發作；11. 抑制與SMA相關的症狀的進展；12. 改善肺功能；13. 提高血氧飽和度；14. 促進SMN基因的轉錄和表達（包括1.促進截斷的SMN2基因的轉錄和/或表達；或2.促進全長SMN基因的轉錄和/或表達）；15. 提高腦組織和肌肉組織中SMN蛋白水平（包括1.截斷的SMN2蛋白；或2.全長SMN蛋白）；16. 促進腦組織和肌肉組織中NF-κB蛋白的表達；17. 促進腦組織成熟NGF的形成；18. 減輕肺組織損傷；19. 增加肌力；20. 減少肌萎縮；21. 減少運動神經元損失；22. 促進生長、發育；和/或23. 提高運動功能。在一些實施方案中，本申請的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物，例如以上所述的纖溶酶原增强SMN基因轉錄和/或表達。在一些實施方案中，本申請的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物，例如以上所述的纖溶酶原增加SMN蛋白在有此需要的人受試者中的表達。

在一些實施方案中，本申請的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物，例如纖溶酶原可以單獨地或與其他藥物組合地用於治療或預防由SMN基因的失活突變或缺失引起的和/或與SMN基因功能喪失或缺陷相關的疾病。這些疾病包括但不限於脊髓性肌萎縮(SMA)。

在一些實施方案中，本申請涉及一種治療SMN基因的失活突變或缺失引起的和/或與SMN基因功能喪失或缺陷相關的疾病，例如SMA的方法，包括給藥受試者治療有效量的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物，例如纖溶酶原。在一些實施方案中，本申請涉及治療SMA的方法，包括給藥受試者治療有效量的纖溶酶原。

在一些實施方案中，本申請涉及治療SMA的方法，包括給藥受試者治療有效量的纖溶酶原，所述纖溶酶原具有選自以下的一項或多項活性：1. 減小或改善SMA的嚴重程度；2. 延遲SMA的發作；3. 抑制SMA的進展；4. 延長受治者的存活時間；5. 提高受治者的生活質量和/或改善受試者精神狀態；6. 減少SMA相關症狀的數目；7. 減小或改善與SMA相關的一種或多種症狀的嚴重程度；8. 縮短與SMA相關的症狀的持續時間；9. 防止與SMA相關的症狀的復發；10. 抑制SMA症狀的發展或發作；11. 抑制與SMA相關的症狀的進展；12. 改善肺功能；13. 提高血氧飽和度；14. 促進SMN基因的轉錄和表達（包括1.促進截斷的SMN2基因的轉錄和/或表達；或2.促進全長SMN基因的轉錄和/或表達）；15. 提高腦組織和肌肉組織中SMN蛋白水平（包括1.截斷的SMN2蛋白；或2.全長SMN蛋白）；16. 促進腦組織和肌肉組織中NF-κB蛋白的表達；17. 促進腦組織成熟NGF的形成；18. 減輕肺組織損傷；19. 增加肌力；20. 減少肌萎縮；21. 減少運動神經元損失；22. 促進生長、發育；和/或23. 提高運動功能。

在一些實施方案中，本申請涉及治療SMA的方法，包括給藥SMA受試者治療有效量的纖溶酶原，所述纖溶酶原具有選自下組的一項或多項活性（作用）：1.促進截斷的SMN2基因的轉錄和/或表達；和2. 促進全長SMN基因的轉錄和/或表達。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原進一步具有選自下組的一項或多項作用或活性：

1）促進纖溶酶原透過血-腦屏障和血-脊髓屏障，

2）促進纖溶酶原向SMA受試者大腦和脊髓組織聚集，

4）提高SMA受試者大腦和脊髓中纖溶酶原水平，

8）促進SMA受試者大腦和脊髓中SMNΔ7的轉錄，

9）提高SMA受試者大腦和脊髓中SMN蛋白的水平（包括1.截斷的SMN2蛋白；或2.全長SMN蛋白），

10）促進SMA受試者大腦和脊髓中NGF的表達，和

11）促進SMA受試者生長發育。

纖維蛋白溶解系統（Fibrinolytic system）亦稱纖溶系統，爲參與纖維蛋白溶解（纖溶）過程的一系列化學物質組成的系統，主要包括纖維蛋白溶解酶原（纖溶酶原）、纖溶酶、纖溶酶原激活物、纖溶抑制劑。纖溶酶原激活物包括組織型纖溶酶原激活物（t-PA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）。t-PA是一種絲氨酸蛋白酶，由血管內皮細胞合成。t-PA激活纖溶酶原，此過程主要在纖維蛋白上進行；尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）由腎小管上皮細胞和血管內皮細胞産生，可以直接激活纖溶酶原而不需要纖維蛋白作爲輔因子。纖溶酶原（PLG）由肝臟合成，當血液凝固時，PLG大量吸附在纖維蛋白網上，在t-PA或u-PA的作用下，被激活爲纖溶酶，促使纖維蛋白溶解。纖溶酶（PL）是一種絲氨酸蛋白酶，作用如下：降解纖維蛋白和纖維蛋白原；水解多種凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅶ、Ⅺ、Ⅱ等；使纖溶酶原轉變爲纖溶酶；水解補體等。纖溶抑制物：包括纖溶酶原激活物抑制劑（PAI）和α2抗纖溶酶（α2-AP）。PAI主要有PAI-1和PAI-2兩種形式，能特異性與t-PA以1：1比例結合，從而使其失活，同時激活PLG。α2-AP由肝臟合成，與PL以1：1比例結合形成複合物，抑制PL活性；FⅩⅢ使α2-AP以共價鍵與纖維蛋白結合，減弱了纖維蛋白對PL作用的敏感性。體內抑制纖溶系統活性的物質：PAI-1，補體C1抑制物；α2抗纖溶酶；α2巨球蛋白。

本發明“纖維蛋白溶酶原途徑激活劑”或“纖溶酶原途徑激活劑”術語涵蓋纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

本發明的術語“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”或“纖溶酶原激活途徑的組分”涵蓋：

1. 纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、delta-纖溶酶原；它們的變體或類似物；

2. 纖維蛋白溶酶以及它們的變體或類似物；和

3. 纖維蛋白溶酶原激活劑，例如tPA和uPA以及包含一個或多個tPA或uPA的結構域(如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的tPA或uPA變體和類似物。

所述的“纖溶抑制劑的拮抗劑”術語涵蓋PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的拮抗劑，例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及通過添加、删除和/或取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸、仍然具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA活性的蛋白質。例如，纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括通過例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個保守性氨基酸取代獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的“纖溶酶原變體”涵蓋包含或具有與序列2、6、8、10或12所示氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且具有纖溶酶原的蛋白水解活性和/或賴氨酸結合活性的蛋白質。例如本發明的“纖溶酶原變體”可以是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原的蛋白水解活性和/或賴氨酸結合活性的蛋白質。具體地，本發明纖溶酶原變體包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及通過保守性氨基酸取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的纖溶酶原可以爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原的蛋白水解活性和/或賴氨酸結合活性的變體，例如序列2、6、8、10或12所示的纖溶酶原，例如序列2所示的人天然纖溶酶原。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“類似物”包括分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用的化合物。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”。例如，纖維蛋白溶酶原的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖溶酶原結構域(例如一個或多個kringle（k）結構域和蛋白水解結構域(或稱絲氨酸蛋白酶結構域，或稱纖溶酶原蛋白酶結構域）的纖維蛋白溶酶原變體和類似物，例如小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)。纖維蛋白溶酶的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖維蛋白溶酶結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶 “變體”和“類似物”，例如小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)和δ-纖維蛋白溶酶(delta-plasmin)。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的“變體”或“類似物”是否分別具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的活性，或者是否分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用可以通過本領域習知方法進行檢測，例如，通過基於酶譜法(enzymography)、ELISA(酶聯免疫吸附測定)和FACS(螢光激活細胞分選方法)通過激活的纖維蛋白溶酶活性水平來衡量，例如可以參照選自如下文獻中記載的方法測量：Ny，A.，Leonardsson，G.，Hagglund，A.C，Hagglof，P.，Ploplis，V.A.，Carmeliet，P. and Ny，T. (1999). Ovulation inplasminogen-deficient mice. Endocrinology 140，5030-5035；Silverstein RL, Leung LL, Harpel PC, Nachman RL (November 1984). "Complex formation of platelet thrombospondin with plasminogen. Modulation of activation by tissue activator". J. Clin. Invest. 74 (5): 1625–33；Gravanis I, Tsirka SE (February 2008). "Tissue-type plasminogen activator as a therapeutic target in stroke". Expert Opinion on Therapeutic Targets. 12 (2): 159–70；Geiger M, Huber K, Wojta J, Stingl L, Espana F, Griffin JH, Binder BR (Aug 1989). "Complex formation between urokinase and plasma protein C inhibitor in vitro and in vivo". Blood. 74 (2): 722–8.

在本發明的一些實施方案中，本發明的“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”爲纖溶酶原，選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性和/或賴氨酸結合活性的保守突變變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性和/或賴氨酸結合活性的保守突變變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原的氨基酸序列包含或具有如序列2、6、8、10或12所示的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人全長纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是如序列2所示的人全長纖溶酶原。

“能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物”指能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的任何化合物，例如tPA、uPA、鏈激酶、沙蘆普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉諾替普酶、帕米普酶、葡激酶。

本發明“纖溶抑制劑的拮抗劑”爲拮抗、減弱、封閉、阻止纖溶抑制劑作用的化合物。所述纖溶抑制劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶和α2巨球蛋白。所述拮抗劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體，或阻斷或下調例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白表達的反義RNA或小RNA，或占據PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合位點但無PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白功能的化合物”，或封閉PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合結構域和/或活性結構域的化合物。

纖溶酶是纖溶酶原激活系統（PA系統）的關鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶，能夠水解細胞外基質（ECM）的幾個組分，包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖。此外，纖溶酶能將一些金屬蛋白酶前體(pro-MMPs)激活形成具有活性的金屬蛋白酶（MMPs）。因此纖溶酶被認爲是胞外蛋白水解作用的一個重要的上游調節物。纖溶酶是由纖溶酶原通過兩種生理性的PAs：組織型纖溶酶原激活劑（tPA ）或尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）蛋白水解形成的。由於纖溶酶原在血漿和其他體液中相對水平較高，傳統上認爲PA系統的調節主要通過PAs的合成和活性水平實現。PA系統組分的合成受不同因素嚴格調節，如激素、生長因子和細胞因子。此外，還存在纖溶酶和PAs的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α2-抗纖溶酶（α2-antiplasmin）。PAs的活性同時被uPA 和tPA 的纖溶酶原激活劑抑制劑-1（PAI-1）抑制以及主要抑制uPA的溶酶原激活劑抑制劑-2（PAI-2）調節。某些細胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細胞表面受體(uPAR)。

纖溶酶原是一個單鏈糖蛋白，由791個氨基酸組成，分子量約爲92 kDa。纖溶酶原主要在肝臟合成，大量存在於胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約爲2 μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的一個巨大的潜在來源。纖溶酶原存在兩種分子形式：谷氨酸-纖溶酶原（Glu-plasminogen）和賴氨酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個氨基末端（N-末端）谷氨酸，因此被稱爲谷氨酸-纖溶酶原。然而，在纖溶酶存在時，谷氨酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成爲賴氨酸-纖溶酶原。與谷氨酸-纖溶酶原相比，賴氨酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力，並可以更高的速率被PAs激活。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割，導致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成。纖溶酶原的氨基末端部分包含五個同源三環，即所謂的kringles，羧基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringles含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α2-AP特異性相互作用的賴氨酸結合位點。最新發現一個纖溶酶原爲38 kDa的片段，其中包括kringles1-4，是血管生成的有效抑制劑。這個片段被命名爲血管抑素，可通過幾個蛋白酶水解纖溶酶原産生。

纖溶酶的主要底物是纖維蛋白，纖維蛋白的溶解是預防病理性血栓形成的關鍵。纖溶酶還具有對ECM幾個組分的底物特異性，包括層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠，表明纖溶酶在ECM重建中亦起著重要作用。間接地，纖溶酶還可以通過轉化某些蛋白酶前體爲活性蛋白酶來降解ECM的其他組分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纖溶酶可能是細胞外蛋白水解的一個重要的上游調節器。此外，纖溶酶具有激活某些潜在形式的生長因子的能力。在體外，纖溶酶還能水解補體系統的組分並釋放趨化補體片段。

“纖溶酶”是存在於血液中的一種非常重要的酶，能將纖維蛋白凝塊水解爲纖維蛋白降解産物和D-二聚體。

“纖溶酶原”是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源纖溶酶原氨基酸序列（序列4）計算由810個氨基酸組成，分子量約爲90kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中循環的糖蛋白，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域：位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI數據，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。

Glu-纖溶酶原是人天然全長的纖溶酶原，由791個氨基酸組成（不含有19個氨基酸的信號肽），編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纖溶酶原 (δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶域（亦稱蛋白酶結構域（protease domain，PD）），有文獻報導了delta-纖溶酶原的氨基酸序列（序列8），編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7所示。小纖溶酶原（Mini-plasminogen）由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），其氨基酸序列如序列10所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原（Micro-plasminogen）僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報導其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），亦有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），在本專利申請中微纖溶酶原序列參考專利文獻CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

全長纖溶酶原的結構亦描述在Aisina等(Aisina R B , Mukhametova L I . Structure and function of plasminogen/plasmin system[J]. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2014, 40(6):590-605)的文章中。在該文章中，Aisina等描述纖溶酶原包括Kringle1、2、3、4、5結構域和絲氨酸蛋白酶結構域（亦稱蛋白酶結構域（protease domain，PD）），其中，Kringles負責纖溶酶原與低分子量和高分子量的配體結合（即賴氨酸結合活性），導致纖溶酶原轉變成一個更加開放的構型，從而更容易被活化；蛋白酶結構域（PD）爲殘基Val562-Asn791，tPA和UPA特異性切割纖溶酶原的Arg561-Val562位活化鍵，從而使纖溶酶原形成纖溶酶，因此，蛋白酶結構域（PD）是賦予纖溶酶原蛋白水解活性的區域。

本發明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用，含義相同；“纖溶酶原”與“纖維蛋白溶酶原”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用，含義相同。

在本申請中，所述纖溶酶原“缺乏”的含義或活性爲受試者體內纖溶酶原的含量比正常人低，低至足以影響所述受試者的正常生理功能；所述纖溶酶原“缺失”的含義或活性爲受試者體內纖溶酶原的含量顯著低於正常人，甚至活性或表達極微，只有通過外源提供才能維持正常生理功能。

所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶，因此，本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。在循環過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在纖溶酶原激活劑(plasminogen activator，PA)的介導下，其轉變爲呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解爲纖維蛋白降解産物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要決定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。習知多種能夠作爲纖溶酶原激活劑的酶，包括：組織纖溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纖溶酶原活性片段”在本申請中包括1）在纖溶酶原蛋白中，能夠與底物中的靶序列結合的活性片段，亦稱爲賴氨酸結合片段，例如包含Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和/或 Kringle 5的片段（所述纖溶酶原結構參見Aisina R B , Mukhametova L I . Structure and function of plasminogen/plasmin system[J]. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2014, 40(6):590-605所述）；2）在纖溶酶原蛋白中發揮蛋白水解功能的活性片段，例如包含序列14所示的纖溶酶原活性（蛋白水解功能）的片段；3) 在纖溶酶原蛋白中，既具有與底物中的靶序列結合活性(賴氨酸結合活性) 又具有纖溶酶原活性（蛋白水解功能）的片段。在本申請的一些實施方案中，所述纖溶酶原爲包含序列14所示的纖溶酶原活性片段的蛋白質。在本申請的一些實施方案中，所述纖溶酶原爲包含Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和/或 Kringle 5的賴氨酸結合片段的蛋白質。在一些實施方案中，本申請的纖溶酶原活性片段包含序列14、與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列的蛋白質。因此，本發明所述的纖溶酶原包括含有該纖溶酶原活性片段、並且仍然保持該纖溶酶原活性的蛋白。在一些實施方案中，本申請的纖溶酶原包括Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和/或 Kringle 5、或與Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4或 Kringle 5具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性並且仍然具有賴氨酸結合活性的蛋白質。

目前，對於血液中纖溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖溶酶原激活劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖溶酶原激活劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg) 、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法爲發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖溶酶原活性成正比。此外亦可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖溶酶原活性進行測定。

“直系同源物或直系同系物（ortholog）”指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物亦包括DNA同源物，亦稱爲直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代變體”是指其中一個給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性（如酸性，鹼性，疏水性，等）的氨基酸取代親本蛋白質中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質的氨基酸是衆所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性氨基酸並可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水氨基酸，則可被亮氨酸，蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或氨基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN算法的70％至99％的相似度（同一性）。“保守取代變體”還包括通過BLAST或FASTA算法確定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能達 75％以上更好，最好能達85％以上，甚至達90％以上爲最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。

“分離的”纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如通過Lowry法所確定的，例如超過99% (按重量計)，(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原亦包括通過生物工程技術從重組細胞製備，並通過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。

術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物；等等。

關於參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分數（%）”定義爲在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視爲序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。爲測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公衆可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）軟件。所屬技術領域中具有通常知識者能決定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何算法。然而，爲了本發明的目的，氨基酸序列同一性百分數值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2産生的。

在採用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情况中，給定氨基酸序列A相對於給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（或者可表述爲具有或包含相對於、與、或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A）如下計算：

分數X/Y 乘 100

其中X是由序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分爲相同匹配的氨基酸殘基的數目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數。應當領會，在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情况下，A相對於B的%氨基酸序列同一性會不等於B相對於A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2計算機程序獲得的。

術語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠、小鼠)、非人靈長類、人、犬、猫、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、猪、山羊)等。

“治療有效量”或“有效量”指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖溶酶原的量。“治療有效量”會根據所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。

術語疾病狀態的“治療”包括抑制或阻止所述疾病狀態或其臨床症狀的發展，或減輕所述疾病狀態或症狀，使得所述疾病狀態或其臨床症狀暫時或永久性的退去。

術語“肌力”指肢體作隨意運動時肌肉收縮的力量或肌肉主動運動時的力量。根據肌力的情况，通常將肌力分爲以下0--5級：0級，完全癱瘓，測不到肌肉收縮；1級，僅測到肌肉收縮，但不能産生動作；2級，肢體能在床上平行移動，但不能抵抗自身重力，即不能抬離床面；3級，肢體可以克服地心引力，能抬離床面，但不能抵抗阻力；4級，肢體能做對抗外界阻力的運動，但不完全；5級，肌力正常。

術語“肌張力”指肌肉靜止鬆弛狀態下的緊張度。肌張力是維持身體各種姿勢以及正常運動的基礎。肌張力表現爲多種形式，例如人在靜臥休息時，身體各部肌肉所具有的張力稱靜止性肌張力。軀體站立時，雖不見肌肉顯著收縮，但軀體前後肌肉亦保持一定張力，以維持站立姿勢和身體穩定，稱爲姿勢性肌張力。肌肉在運動過程中的張力，稱爲運動性肌張力，是保證肌肉運動連續、平滑（無顫抖、抽搐、痙攣）的重要因素。在病理狀况下，肌張力增高或者減低，影響人體正常的姿勢或運動。

本發明纖溶酶原的製備

纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，亦可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS) (其中將序列的C末端氨基酸附接於不溶性支持物，接著序貫添加序列中剩餘的氨基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis; 第3-284頁於The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield,等 J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewart等, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984);和Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10和Camarero JA等 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複循環後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的氨基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。

可以使用標準重組方法來生産本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啓動子(例如天然關聯的或異源的啓動子)、信號序列、增强子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啓動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水平表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。

合適的表達載體通常在宿主生物體中作爲附加體或作爲宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。

大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於複製纖溶酶原編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，亦可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公知的啓動子，諸如乳糖啓動子系統，色氨酸(trp)啓動子系統，beta-內醯胺酶啓動子系統，或來自噬菌體λ的啓動子系統。啓動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情况中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啓動並完成轉錄和翻譯。

其他微生物，諸如酵母亦可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S. cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啓動子)、複製起點、終止序列等。典型的啓動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啓動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啓動子。

在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)亦可以用於表達並生成本發明的纖溶酶原(例如編碼纖溶酶原的多核苷酸)。參見Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啓動子和增强子(Queen等, Immunol. Rev. 89:49 (1986))，以及必需的加工信息位點，諸如核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啓動子。參見Co等, J. Immunol. 148:1149 (1992)。

一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱，親和柱，柱層析，高效液相層析(HPLC)，凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除纖溶酶原以外的大分子，等等。

藥物配製劑

可以通過將具有所需純度的纖溶酶原與可選的藥用載體，賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版，Osol, A. ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如 TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。

本發明的配製劑亦可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，較佳活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如，抗高血壓的藥物，抗心律失常的藥物，治療糖尿病的藥物等。

本發明的纖溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或界面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)。

用於體內給藥的本發明的纖溶酶原必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。

本發明的纖溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277(1981)；Langer, Chem. Tech., 12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919, EP 58,481)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯－乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間却較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。

給藥和劑量

可以通過不同方式，例如通過靜脈內，腹膜內，皮下，顱內，鞘內，動脈內(例如經由頸動脈)，肌內來實現本發明藥物組合物的施用。

用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。亦可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。

醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取決於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以爲每天約0.0001至2000 mg/kg，或約0.001至500 mg/kg (例如0.02 mg/kg，0.25 mg/kg，0.5 mg/kg，0.75 mg/kg，10 mg/kg，50 mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1 mg/kg體重或50 mg/kg體重或在1-50 mg/kg的範圍，或至少1 mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量亦涵蓋在內，特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量亦包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每周或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天1-10 mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要實時評估治療效果和安全性。

製品或藥盒

本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含可用於治療由糖尿病引起的心血管病及其相關病症的本發明纖溶酶原或纖溶酶。所述製品較佳包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可爲靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑爲纖溶酶原/纖溶酶。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述由糖尿病引起的心血管病及其相關病症。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將纖溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。

實施例

以下所有實施例中使用的纖溶酶原爲人纖溶酶原，來自捐贈者血漿，基於文獻 [1-3]所描述的方法並進行製程優化，從人捐贈者血漿純化獲得，其中人Lys-纖維蛋白溶酶原（Lys-纖溶酶原）和Glu-纖維蛋白溶酶原（Glu-纖溶酶原）＞98%。

以下實施例1-11中所有患者均簽署知情同意書，自願接受上述純化自人血漿的纖溶酶原的治療，並獲得醫院倫理委員會批准。根據病情嚴重程度和病程不同，調節用法用量。給藥方式爲霧化吸入或靜脈注射。霧化吸入、靜脈注射的藥品濃度均爲5mg/ml，以生理鹽水爲溶媒。

實施例

實施例 1 II 型 SMA （患者 1 ）

患者，女，38個月。出生10個月時無法爬行，雙腿無力，1歲以後運動能力幾乎沒有提高。 1歲9個月基因檢測確診爲SMA，肌力二級，下肢不能持重，開始服用沙丁胺醇、甲鈷胺、輔酶Q10，2周歲時已經退化到不能爬，只能短時間坐立。2歲2個月時開始間充質幹細胞治療，平衡力有所好轉，不容易生病，但是仍然無法站立。2歲11個月開始穴位注射鼠神經生長因子，平衡力有所好轉，下肢開始有支撑力，肌力測試達3級。

用藥情况

靜脈注射；劑量：100-200mg/次；頻率：每隔1天一次、每隔2天一次或每隔3天一次；2周爲一個療程；每個療程間隔2-3周。共治療6個療程。

Hammersmith運動功能評分量表（Expanded Hammersmith Functional Motor Scale, HFMSE）專門用以評估II 型和III型 SMA患者運動功能，反映疾病嚴重性。它相較於基線的變化而定義，評估患兒運動功能的變化情况，分值越高，運動功能越好[4-6]。

神經肌電圖檢查是運動神經元病主要診斷和鑒別手段，複合肌肉動作電位波幅反映神經元軸突損傷。SMA是一種運動神經元退行性疾病，運動神經元大量死亡，出現肌無力和複合肌肉動作電位波幅降低甚至無法檢測出[7]。

藥效情况

HFMSE評分：用藥前20分，第1個療程治療後評分爲21分。第2療程治療前評分爲23分，治療後評分爲24分。第6個療程治療後評分爲25分（圖4）。

運動功能評價：治療前患者不能無輔助站立，用藥2個療程後患者能夠輔助站立，用藥3個療程後患者實現輔助行走，並且患者的頭控能力明顯改善。隨著治療的進行，患者的運動功能進一步改善，包括輔助站立時間延長和輔助行走距離增加等。

肌電圖：較用藥前，用藥後雙側脛神經和腓總神經及股神經動作電位波幅明顯升高（圖1）。

此外，用藥後患者的精神狀態明顯改善，活力增加。治療過程中未見藥物相關的副作用。

以上結果說明纖溶酶原可提高Ⅱ型SMA患者HFMSE評分，改善患者運動功能，改善患者的神經肌肉功能和精神狀態。

實施例 2 II 型 SMA 患者（患者 2 ）

患者，男，30個月。出生後，無異常。9個月時，無法獨站，無法自主翻身，雙手偶爾有輕微顫抖，無法抓握，無法抬頭。10個月時基因檢測確診爲II型SMA患者。1-2歲時，開始在康復中心做康復，一周一次，可以保持獨坐，雙手可以抓取輕物，小腿緩慢伸展，輔助下可完成翻身動作。2歲2個月時，靜脈輸注骨髓間充質幹細胞三次，每次兩個單位，改善並不明顯。2歲4個月時，注射了兩次神經幹細胞，每次兩個單位，注射後改善比較明顯。現狀：可以獨坐，獨坐時，身體可以向兩側稍微傾斜，用雙手支撑身體，但雙臂無法舉起。頭部控制有所改善，可以來回快速搖頭，在家長輔助四點支撑的情况下保持抬頭狀態。腿部力量增加，可以坐在座椅上小腿來回踢踹。可以斜靠家長身上保持站立，但需輕微輔助膝蓋。

用藥情况

第一次：靜脈注射，50mg；第二次：靜脈注射，50mg；第三次和第四次：靜脈注射，100mg。用藥頻率爲每隔2天一次或每隔3天一次，共用藥2周。

藥效情况

用藥前HFMSE評分表爲2分，第四次用藥後HFMSE評分爲8分（圖4），患者可獨坐雙手舉起。肌電圖結果顯示，較用藥前，用藥後左側股神經、右側尺神經、腓總神經及脛神經動作電位波幅增加（圖2）。

以上結果說明纖溶酶原可提高II型SMA患者HFMSE評分，改善患者運動功能，改善神經肌肉功能，且治療過程中未見藥物相關的副作用。

實施例 3 II 型 SMA 患者（患者 3 ）

患者，女，24個月。1歲時可扶站，不會四點支撑爬。16個月時肌電圖顯示神經源性受損，基因檢測確診爲II型SMA患者。現狀：獨坐不穩，躺著自己坐不起來，能扶站，靠站，扶走，狀態時好時壞，雙手舉起困難。

用藥情况

靜脈注射；劑量：50mg-100mg每次；頻率：每隔1天一次或每隔3天一次；2周爲一個療程，每個療程間隔3-4周，共治療8個療程。

藥效情况

HFMSE評分：用藥前爲23分，第1個療程用藥後爲24分。患者第1個療程和第2個療程之間間隔了大約兩個月。第2個療程治療前爲23分，治療後爲24分。第8個療程治療後評分爲28分（圖4）。

運動功能：用藥前患者不能將手舉過頭頂。治療兩個療程後，患者實現無輔助站立和輔助行走，並且能夠將手舉過頭頂。經過持續用藥，患者的運動功能進一步改善，獨坐、扶站、扶走平穩且時間逐漸延長。

肌電圖：治療後雙側正中神經、脛神經、腓總神經、尺神經的動作電位波幅均有不同程度增加（圖3）。

此外，治療過程中未見藥物相關的副作用。

以上結果說明纖溶酶原可提高II型SMA患者HFMSE評分，改善患者運動功能，改善神經肌肉功能。

實施例 4 Ⅱ型 SMA 患者（患者 4 ）

患者，男，43個月。12個月大時檢查肌電圖顯示神經源損害，14個月大做基因檢測確診爲II型SMA。到24個月大時已經退化到不能獨坐，只能靠坐。29個月開始吃沙丁胺醇，甲鈷胺，輔酶q10，運動功能逐漸輕微改善。36個月開始用間充質幹細胞治療，共靜脈注射過5針間充質幹細胞，注射間充質幹細胞後患者整體狀態有明顯進步，精神狀態好轉，不容易累，不容易生病，但是仍然不能站立。38個月時穴位注射鼠神經生長因子，未見明顯效果。

用藥情况

第一次：靜脈注射，50mg；第二次：靜脈注射，50mg；第三次：靜脈注射，100mg；第四次：靜脈注射，150mg，每次間隔3天，用藥2周。

藥效情况

患者用藥後右臂功能有所改善，不需借助左手力量可以自行抬起90度，但HFMSE評分沒有提高。治療過程中未見藥物相關的副作用。

實施例 5 II 型 SMA 患者（患者 5 ）

患者，男，26個月。10個月時，基因檢測確定爲SMA，SMN2（運動神經元存活基因2）拷貝數是3。12個月時，失去翻身能力，胳膊無力支撑身體，只能完全趴在床上，手指不能自主用力。13個月時，開始注射臍帶間充質幹細胞，注射幹細胞後，腿部力量增大，呼吸有所改善，睡眠質量有所提高。16個月時，開始服用中藥。在間充質幹細胞、中藥和康復訓練綜合治療後，患者能獨坐並自己掌握平衡，但不能左右轉身或左右撿玩具。能自主連續翻身。腿部力量增加明顯，呼吸有所改善，聲音變大，漏斗胸改善明顯，肋骨外翻跡象好轉，胳膊和手的力量有所增加，但還不能抓著大人的手被拽起來。胳膊抬高有所退化，之前胳膊能自己抬高到頭頂位置，但在下述治療時只能到臉部位置。

用藥情况

靜脈注射兩周，隔天1次，第一周用藥4次，劑量分別爲10mg，20mg，30mg，40mg；第二周用藥4次，劑量分別爲50mg，50mg，100mg，100mg。

藥效情况

第一周第二次用藥後，小腿和脚踝力量有所增强。兩周用藥結束9天後，手和胳膊力量增加，手抓物品力量增加50%。且治療過程中未見藥物相關的副作用。

以上結果說明纖溶酶原可改善II型SMA患者運動功能。

實施例 6 I 型 SMA 患者（患者 6 ）

患者，男，11月齡，6個月時基因檢測確診爲I型SMA；醫生確診時告知此類病患者生存周期平均在2周歲，家屬未採取任何治療措施。症狀：頭支撑無力；上肢雙臂無力、無法抬起，雙手擺動少、抓握無力、中指無力；下肢無力、擺動少，脚趾可動；無法獨坐，不可自主翻身，吮吸力小、吞咽困難，全天24小時進行血氧監測，血氧飽和度爲92-97%，呼吸時胸部起伏弱。

用藥方法

霧化吸入（2-3次/天）+靜脈推注（3天一次），治療周期爲16個療程（2周爲1個療程）。每個療程間隔2周。霧化吸入劑量爲5-10mg，靜脈注射劑量爲50-200mg，由50mg逐漸增加至200mg。

以CHOP INTEND評分表（費城兒童醫院嬰兒神經肌肉疾病測試量表）評估該Ⅰ型SMA患者運動功能改善情况，評分高說明運動功能越好[8]。

治療效果

生存狀態：患者接受16個療程治療後，患者年齡大於30個月，超過了I型SMA患者自然史研究顯示的大多數患者10個月的存活時間 [9]。此外，本研究發現用藥SMA後患者精神狀態和生長發育（身高、體重、胸圍）狀况明顯好轉，且相較於同年齡未用纖溶酶原治療的患者，用纖溶酶原治療患者肌肉萎縮情况亦明顯改善（圖5）。此外，研究中觀察到用藥纖溶酶原後患者睡眠狀態亦明顯改善。

CHOP INTEND評分：治療前CHOP INTEND評分爲30分，用藥5個療程後評分增加到50分。由於一些原因第5個和第6個療程間間隔大約2個月，評分降至36分，第6個療程用藥後評分爲44分。第6個療程和第7個療程間隔大約2個月。第7個療程用藥前爲44分，用藥後爲45分。第10-16個療程治療，評分爲在44-46分之間波動（見圖6）。

運動功能：第1個療程治療後患者可獨坐，頭部支撑約爲30秒。

第4個療程後獨坐時間延長，約爲30秒。隨著治療的進行，患者的運動功能持續改善，手抓握有力，手臂可自主輕微抬起，脚活動、擺動頻率增加。

吞咽功能：用藥後患者吃飯和飲水時嗆咳的次數減少，並且說話功能良好。

呼吸功能：第1個療程用藥第2天患者的血氧飽和度即達到97-98%，偶爾爲95-96%。用藥2個療程後，患者呼吸力量增强。16個療程後，患者已經大於30個月，在無通氣支持的條件下，患者仍保持良好的呼吸狀態。 I型SMA自然史研究顯示，在沒有通氣支持的條件下，20個月時的存活率僅有8% [10]。

以上結果說明纖溶酶原可提高I型SMA患者CHOP INTEND評分，改善患者運動功能，可實現無輔助支撑坐立30秒和頭支撑30秒運動的里程碑式改善；還可改善患者的吞咽功能和說話能力；改善肺部功能，升高血氧飽和度；並可改善患者精神狀態和睡眠。

實施例 7 I 型 SMA 患者（患者 7 ）

患者，女，23個月。出生26 天時出現症狀，後基因檢測診斷爲I型SMA。治療前情况：無法實現無輔助坐立；四肢無抗重力運動。左手手指可活動，右手關節可活動，食指活動幅度大，其他四個手指可輕微活動；左下肢踝關節可活動，右下肢膝關節可輕微活動但不可抬起；頭可以輕微左右晃動；CHOP INTEND評分4分。無自主呼吸，24小時依賴呼吸機，白天血氧飽和度爲95-100%，夜間94-97%。吞咽功能完全喪失，胃造瘻進食。廣泛性神經源性損害雙側正中神經、尺神經、腓總神經、脛神經動作電位波幅降低（80-100%）。每日吸痰40-50次，青白色略粘稠。

用藥方法

靜脈推注50mg，隔天注射，連續用藥3天。

治療效果

運動功能：在接受靜脈注射纖溶酶原 2天後，CHOP INTEND評分從4分增加到5分，增加了1分（圖6）。用藥第2天，仰臥保持中線最長可達30秒；用藥第7天左腿有進步，屈膝堅持能1分20秒。

呼吸功能：用藥前每日吸痰40-50次左右，青白色略粘稠；在霧化吸入用藥第3天，吸痰次數減至30次左右；用藥第9天，可咳出少量粘痰；用藥第13天，痰量減少10%，粘稠度不變；停藥後前幾天雖吸痰次數略有增加，但停藥第12天時，痰量下降10%，吸痰次數進一步減少；第11天，可以自主控制含住口水。

實施例 8 I 型 SMA 患者（患者 8 ）

患者，女，29個月齡。出生5個月時出現症狀，後基因檢測診斷爲I型SMA。治療前情况：偶爾狀態好時可獨坐10-15秒，但不穩；可側翻，不可獨立翻身；坐位無輔助時可抬頭1分鐘，靠坐時3-5分鐘；抱起時可抬頭直立40秒，可搖頭；坐位，上肢可抬高10cm；手有較弱抓握力，可抓勺子、畫筆；下肢無法抬起，可輔助屈膝，左右小幅度搖擺2min。CHOP INTEND評分31分。胸式、腹式呼吸交替出現（1/3胸式呼吸，2/3腹式呼吸）。吞咽功能弱，進食需1小時，只能吃顆粒狀食物，喝水有時會嗆。有間歇性輕微舌顫；睡眠不良，哭鬧。

用藥方案

靜脈推注50mg-100mg/天，第一天50mg，後逐漸增加至100mg，隔天注射，連續用藥14天。

治療效果：

運動功能：用纖溶酶原後第9天實現無輔助獨坐10s。用藥14天後，CHOP INTEND評分從31分增加至40分，增加了9分（圖6）。

實施例 9 I 型 SMA 患者（患者 9 ）

患者，男，10個月齡。出生後42天時出現症狀，後基因檢測診斷爲I型SMA。治療前情况：無頭控能力，無法直立頭和擺頭；無法獨坐及靠坐；無翻身能力；前臂可曲肘抬起；手可抓握，但無力；下肢及脚無活動能力。CHOP INTEND評分31分。無吞咽能力，鼻飼進食。。痰和口水多，每日深部吸痰約10次，口腔吸痰和口水約20次。

用藥方案

霧化吸入，每天2次，每次5mg。靜脈注射，50-100mg/天，第一天50mg，後逐漸增加至100mg，隔天一次。

治療效果

運動功能：用纖溶酶原後第7天，仰臥手臂平放由原來不可動至現可自主內外翻轉；用藥第10天，雙腿屈膝直立維持約2分鐘。用藥14天後，CHOP INTEND評分從31分增加至40分，增加了9分（圖6）。

呼吸功能：用藥前24小時使用呼吸機，呼吸機壓力設置爲15；用藥14天後呼吸機壓力減少至13，偶爾可脫離呼吸機且保持呼吸順暢。

實施例 10 I 型 SMA 患者（患者 10 ）

患者，女，12月齡。出生3個月時出現症狀，後基因檢測診斷爲I型SMA。治療前情况：無頭控能力，頭無法直立、搖頭；無法獨坐及靠坐；無翻身能力；四肢：僅手指、手腕、脚趾可活動。CHOP INTEND評分0分。夜間需使用呼吸機。無吞咽能力，胃管進食。每日吸痰約10次。

用藥方案

靜脈注射，50-100mg每次，第一天50mg，後逐漸增加至100mg，隔天一次，用藥14天。

用藥效果

運動功能：用纖溶酶原後第11天，上肢平放可向外翻45°，下肢屈膝直立能達到2分鐘以上，可輕微點頭。用藥8天後，CHOP INTEND評分從0分增加至8分，增加了8分（圖6）。

實施例 11 非 5q 型 SMA 患者（患者 11 ）

患者，女，40月齡（3歲4個月）。6個月大時發病，1.5歲（18月齡）時經基因檢測確診爲非5q型SMA，具體爲SMA伴呼吸窘迫1型（SMARD1），由與11號染色體相關的編碼IGHMBP2的基因突變引起。因肺感染、排痰困難堵塞呼吸道導致呼吸無力，由間斷使用呼吸機後逐漸自主呼吸衰竭無法離線，使用呼吸機約1.5年。語言功能喪失，面癱，無法活動，肌力0級。症狀表現：使用呼吸機至今，每日使用排痰器、吸痰器、吸氧、霧化（每日2次），鼻飼進食。肌電圖結果顯示，雙側上下肢運動神經元嚴重損傷，未見動作電位。

用藥方案

第一療程（2周）：霧化吸入，10mg/次，3次/天，合併50-100mg靜脈注射給藥，3天一次。

第一療程結束後月2個月進行第二療程。

第二至第四療程（每個療程中間間隔2周）：靜脈注射，每隔2天一次，劑量爲150mg-250mg。

治療效果

第一療程：雙手懸掛晃動時間增長，幅度增大，力度提高，左上臂可以在輔助托起情况下自主向內移動。下肢輔助屈膝立起持續30分鐘，面部表情增多，可眨眼，嘴可自主抽動。

第二療程：偶爾可吞咽湯水，睡眠改善

第三療程：排便正常，頭可左右晃動，有輔助支撑可抬頭維持幾秒。手腕略有力，指尖可循環轉動，左臂可自主晃動，幅度更大。血氧維持在97%，不再輸氧。

第四療程：左臂協調性更好，右臂動作幅度小，但是擺動頻率快。雙下肢肌肉柔軟不僵硬，面部表情增多，可自主排便。

患者治療過程患者的精神狀態明顯改善，呼吸能力明顯改善，對通氣支持需求逐漸減少。

結果表明，纖溶酶原可改善非5q型SMA患者運動功能，包括肢體運動力度、幅度、範圍增加，豐富患者的面部表情；改善患者肺部功能和呼吸功能，減少輸氧，升高血氧飽和度；改善患者的吞咽功能；改善患者睡眠質量。

以下實施例12-31爲對動物模型的用藥研究，所述纖溶酶原仍爲上述從人捐贈者血漿提純的纖溶酶原蛋白。

以下所有實施例中使用的SMNΔ7 SMA小鼠爲FVB.Cg-Grm7Tg(SMN2)89Ahmb Smn1tm1MsdTg(SMN2*delta7) 4299Ahmb/J基因突變小鼠（簡稱SMNΔ7 SMA小鼠）具有SMN1基因純合突變並且表達人的SMN2基因，該小鼠臨床及病理表現類似於人類SMA。種鼠購自美國Jackson Laboratory實驗室 (譜系號：005025)。

實施例 12 纖 溶酶原延長 SMA 模型小鼠生存時間

SMNΔ7 SMA小鼠出生稱量體重，根據體重隨機分爲溶媒組（6隻）和給藥組（5隻）。小鼠出生3天後開始給藥，溶媒組小鼠腹腔每天注射溶媒6ml/kg，給藥組小鼠按照60mg/kg腹腔每天注射給予纖溶酶原。記錄小鼠的存活情况。

生存曲線統計結果顯示，纖溶酶原能夠明顯改善SMNΔ7 SMA小鼠生存曲線，統計差異顯著(P=0.029)。生存時間統計結果顯示，溶媒組小鼠中位生存時間爲14天，所有小鼠在第15天全部死亡；給藥組中位生存時間爲16天，所有小鼠在第17天全部死亡，且統計分析差異顯著（P=0.03）。說明纖溶酶原能夠延長SMA模型小鼠生存時間，見圖7A和7B。

實施例 13 纖 溶酶原促進 SMA 模型小鼠脊髓 SMN 基因轉錄

取出生3天的SMNΔ7 SMA小鼠2隻，一隻爲溶媒組小鼠，每天上、下午各腹腔注射一次給予6μl牛血清白蛋白溶液（5mg/ml）；一隻爲給藥組小鼠，按照30μg/6μl每天上、下午各腹腔注射一次給予纖溶酶原；取野生型(FVB)小鼠一隻做爲空白對照組，每天上、下午各腹腔注射一次給予6μl牛血清白蛋白溶液（5mg/ml）。連續用藥9天。犧牲後取材脊髓，進行所有SMN基因轉錄産物 qPCR檢測，正向引物爲F: GCGGCGGCAGTGGTGGCGGC（序列15）；反向引物爲R: AGTAGATCGGACAGATTTTGCT（序列16）。

結果顯示，空白對照組小鼠脊髓具有一定的SMN基因轉錄水平，溶媒組小鼠SMN基因轉錄水平低於空白對照組小鼠，給藥組小鼠SMN基因轉錄水平明顯高於溶媒組小鼠和空白對照組小鼠（圖8）。該結果提示纖溶酶原能夠促進SMN基因轉錄。

實施例 14 纖 溶酶原促進 SMA 模型小鼠腦 NF-κB 水平增加

取出生3天的SMNΔ7 SMA小鼠7隻，4隻爲溶媒組小鼠，前9天每天上、下午各腹腔注射一次給予6μl牛血清白蛋白溶液（5mg/ml），第10天開始，每天腹腔注射一次給予6μl牛血清白蛋白溶液（10mg/ml）；3隻爲給藥組小鼠，前9天按照30μg/6μl每天上、下午各腹腔注射一次給予纖溶酶原，第10天開始，，每天按照60μg/6μl腹腔注射一次纖溶酶原；取野生型小鼠4隻做爲空白對照組，前9天每天上、下午各腹腔注射一次給予6μl牛血清白蛋白溶液（5mg/ml），第10天開始，每天腹腔注射一次給予6μl牛血清白蛋白溶液（10mg/ml）。第12天，犧牲小鼠取材腦組織，製備腦組織勻漿，進行NF-κB蛋白的Western blot檢測。根據SDS-PAGE凝膠製備試劑盒（Solarbio，P1320）的配膠說明製備10%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑膠30min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到活化的PVDF膜（GE，A29433753）上，電轉條件爲15V，2.5h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔抗小鼠NF-κB抗體（Cell Signaling Technology, 8242）室溫孵育3h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J獲取每個條帶的光密度值，進行定量分析。

核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）是一類關鍵性的核轉錄因子。NF-κB 家族成員主要包括RelA (p65)，c-Rel，RelB，NF-κB1 (p50 蛋白及其前體p105) 和NF-κB2(p52 蛋白及其前體p100)，各成員可形成同源或異源二聚體而行使功能。在哺乳動物細胞中最常見的是p65 與p50 結合形成p65/p50 二聚體。在未受刺激的細胞中，NF-κB 轉錄因子與抑制性IκB (Inhibitor of kappa B)蛋白結合在一起，因而被滯留在細胞質中。上游信號的刺激導致IκB 蛋白在IKK(IκB kinase)的作用下被磷酸化修飾，繼而被泛素連接酶複合體識別，促使IκB蛋白以蛋白酶體依賴的方式被降解，NF-κB 從而被釋放出來，進入細胞核並啓動靶基因的表達[11]。在幾乎所有的動物細胞中都能發現NF-κB，它們參與細胞對外界刺激的響應，在細胞的炎症反應、免疫應答等過程起關鍵性作用。NF-κB亦與突觸的可塑性、記憶有關[12]。

結果顯示，空白對照組小鼠腦具有一定量的NF-κB蛋白，溶媒組小鼠腦NF-κB蛋白水平低於空白對照組小鼠，給藥組小鼠腦NF-κB蛋白水平明顯高於溶媒組小鼠，且統計差異接近顯著（P=0.05）(圖9)。該結果提示纖溶酶原能夠促進SMNΔ7 SMA小鼠腦組織NF-κB蛋白水平增加。

實施例 15 纖 溶酶原促進 SMA 模型小鼠肌肉 NF-κB 水平增加

從上述實施例14的犧牲小鼠取材肌肉，按照上述實施例14所述方法進行NF-κB蛋白的Western blot檢測。

結果顯示，空白對照組小鼠肌肉具有一定量的NF-κB蛋白，溶媒組小鼠肌肉NF-κB蛋白水平低於空白對照組小鼠，給藥組小鼠肌肉NF-κB蛋白水平明顯高於溶媒組小鼠，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）（圖10）。該結果提示纖溶酶原能夠促進SMNΔ7 SMA小鼠肌肉NF-κB蛋白水平增加。

實施例 16 纖 溶酶原促進 SMA 模型小鼠腦組織 SMN 蛋白水平增加

取出生3天的SMNΔ7 SMA小鼠2隻，1隻爲溶媒組小鼠，每天上、下午各腹腔注射一次給予6μl牛血清白蛋白溶液（5mg/ml）；1隻爲給藥組小鼠，按照30μg/6μl每天上、下午各腹腔注射一次給予纖溶酶原；取野生型(FVB)小鼠2隻做爲空白對照組，每天上、下午各腹腔注射一次給予6μl牛血清白蛋白溶液（5mg/ml）。用藥9天後，犧牲小鼠取材腦組織，製備腦組織勻漿，進行SMN蛋白的Western blot檢測。根據SDS-PAGE凝膠配膠說明製備12%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑膠30min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到活化的PVDF膜（GE，A29433753）上，電轉條件爲15V，2.5h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔抗小鼠SMN抗體（Proteintech，11708-1-AP）室溫孵育3h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J軟件獲取每個條帶的光密度值，進行定量分析。

結果顯示，空白對照組小鼠腦表達一定量的SMN蛋白，溶媒組小鼠SMN蛋白表達水平低於空白對照組小鼠，給藥組小鼠SMN蛋白表達水平明顯高於溶媒組小鼠(圖11)。該結果提示纖溶酶原能夠促進SMNΔ7 SMA小鼠腦SMN蛋白表達。

實施例 17 纖 溶酶原促進 SMA 模型小鼠肌肉 SMN 蛋白水平增加

從實施例16所述犧牲小鼠取材後肢肌肉組織，製備組織勻漿，進行SMN蛋白的Western blot檢測，檢測方法如實施例16所述。

結果顯示，空白對照組小鼠肌肉表達一定量的SMN蛋白，溶媒組小鼠肌肉SMN蛋白表達水平低於空白對照組小鼠，給藥組小鼠肌肉SMN蛋白表達水平明顯高於溶媒組小鼠（圖12）。該結果提示纖溶酶原能夠促進SMNΔ7 SMA小鼠肌肉SMN蛋白表達。

實施例 18 纖 溶酶原促進 SMA 模型小鼠腦組織成熟 NGF 形成

取出生3天的SMNΔ7 SMA小鼠7隻，隨機分爲兩組，溶媒組小鼠4隻，給藥組小鼠3隻，溶媒組前10天每天上、下午各腹腔注射給予6μL/g/次牛血清白蛋白溶液（5mg/ml），給藥10天後每天腹腔注射給予6μL/g/次牛血清白蛋白溶液（10mg/ml）；給藥組小鼠前10天按照30mg/kg/次每天上、下午各腹腔注射給予纖溶酶原(5mg/ml)，給藥10天後每天按照60mg/kg/次腹腔注射纖溶酶原(10mg/ml)；取野生型小鼠4隻做爲空白對照組，前10天每天上、下午各腹腔注射給予6μL/g/次牛血清白蛋白溶液（5mg/ml），10天後每天腹腔注射給予6μL/g/次牛血清白蛋白溶液（10mg/ml）。用藥11天後，犧牲小鼠取材腦組織，進行NGF蛋白的Western blot檢測。根據SDS-PAGE凝膠配膠說明製備12%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑30min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到活化的PVDF膜（GE，A29433753）上，電轉條件爲15V，2.5h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔抗小鼠NGF抗體(Abcam，ab52918)室溫孵育3h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J軟件獲取每個條帶的光密度值進行定量分析。

神經生長因子（Nerve growth factor, NGF）是神經營養因子家族中的重要成員。在體內以前體形式合成，包括信號肽、前導肽和成熟肽。研究報導神經生長因子NGF前體（ProNGF）與其裂解形成NGF發揮相反的作用。ProNGF能夠促進神經細胞凋亡。成熟的NGF 參與調節神經細胞的生長、發育、分化、生存和損傷後再修復等過程，對中樞及周圍神經元功能性表達亦有重要調控作用[12]。NGF/ProNGF比值=NGF光密度（OD）/ProNGF光密度（OD）值。

結果顯示，空白對照組小鼠腦組織具有一定NGF/ProNGF比值，

給藥組小鼠腦組織NGF/ProNGF比值明顯高於溶媒組小鼠，且統計差異極爲顯著（***表示P＜0.001）（圖13）。提示纖溶酶原能夠促進SMA模型小鼠ProNGF轉化形成NGF，促進成熟NGF的形成。

實施例 19 纖 溶酶原改善 SMA 模型小鼠肺組織損傷

取出生3天的SMNΔ7 SMA小鼠8隻，隨機分爲兩組，溶媒組小鼠4隻，給藥組小鼠4隻，取同窩野生型7隻小鼠做爲空白對照組。溶媒組及空白對照組小鼠前3天每天上、下午各一次腹腔注射給予3ml/kg溶媒，3天後每天單次腹腔注射6ml/kg溶媒；給藥組小鼠前3天按照30mg/kg/次每天上、下午各一次腹腔注射給予纖溶酶原(10mg/ml)，3天後每天單次腹腔注射60mg/kg 纖溶酶原（10mg/ml）。給藥9天後犧牲小鼠，取材肺組織，在10%中性福爾馬林固定液中固定24小時。固定後的肺組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲5μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(H&E染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，並酒精梯度脫水封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

結果顯示，空白對照組小鼠肺組織終末細支氣管上皮細胞排列整齊，清晰可辨；肺泡腔大小均勻，肺泡間隔未見增厚，血管周圍未見炎細胞浸潤；溶媒組小鼠肺組織呼吸性細支氣管上皮脫落，肺泡管、肺泡囊擴大，肺泡隔增寬，肺泡塌陷至結構紊亂，肺血管周圍伴嗜酸性粒細胞、泡沫細胞、淋巴細胞；給藥組小鼠肺組織呼吸性細支氣管上皮排列有序，肺泡管、肺泡囊擴大，肺泡腔均勻擴大，但可見由單層肺泡上皮組成的肺泡壁（圖14）。提示纖溶酶原能夠改善SMA模型小鼠肺組織損傷。

實施例 20 纖 溶酶原促進 SMA 小鼠肺組織損傷炎症修復

從實施例19的犧牲小鼠取材肺組織，在10%中性福爾馬林固定液中固定24小時。固定後的肺組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片厚度爲4μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories, Inc., USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠F4/80抗體(Abcam, ab100790) 4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

F4/80是一種高度糖基化的G蛋白偶聯受體，一種用於小鼠巨噬細胞的確定標記物。

結果顯示，空白對照組（圖15A）肺組織具有一定水平的F4/80陽性細胞，溶媒組（圖15B）小鼠肺組織F4/80陽性細胞水平明顯增加，給藥組（圖15C）小鼠F4/80陽性細胞水平明顯低於溶媒組小鼠，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）（見圖15D）。說明纖溶酶原能夠顯著促進SMA小鼠損傷肺組織炎症修復。

實施例 21 纖 溶酶原促進 SMA 小鼠 SMNΔ7 基因轉錄

從實施例19的犧牲小鼠取材脊髓組織，進行SMNΔ7 mRNA PCR擴增，擴增樣品使用1.5%瓊脂糖凝膠檢測。引物爲：5’-GCTGATGCTTTGGGAAGTATGTTA-3’（序列17）和 5’-ATTCCAGATCTGTC TGATCG-3’ （序列18）。

有報導增加SMNΔ7的mRNA轉錄可以促進功能性SMN蛋白增加，從而改善病程，延緩病情的發展[13]。

本實施例的研究結果顯示，給藥後小鼠脊髓中SMNΔ7的轉錄水平顯著高於溶媒組，P值爲0.002（圖16）。說明纖溶酶原可促進SMA小鼠脊髓中SMNΔ7的轉錄，促進功能性SMN蛋白的增加。

實施例 22 纖 溶酶原改善 SMA 小鼠肌肉組織損傷

從實施例19的犧牲小鼠取材肌肉組織，在10%中性福爾馬林固定液中固定24小時。固定後的肺組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲5μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(H&E染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，並酒精梯度脫水封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

結果顯示，空白對照組（圖17A）小鼠肌肉組織肌纖維胞體多呈圓形，大小均勻且平行排列，細胞核位於肌膜內側；相較於溶媒組（圖17B），給藥組（圖17C）肌纖維細胞間質較爲緊密。提示纖溶酶原能夠減輕SMA小鼠肌肉組織損傷。

實施例 23 纖 溶酶原改善 SMA 小鼠腦組織損傷

從實施例19的犧牲小鼠取材腦組織，在10%中性福爾馬林固定液中固定24小時。固定後的肺組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲5μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(H&E染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，並酒精梯度脫水封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

結果顯示，空白對照組（圖18A）小鼠大腦皮層各層神經元結構清晰；內錐體細胞層的錐體細胞胞質豐富，頂端可見一條較粗的主樹突，核仁清晰；溶媒組（圖18B）小鼠大腦皮層各層神經元數目減少，結構不大清晰，錐體細胞難辨認，腦組織疏鬆；給藥組（圖18C）與溶媒組相比，各層神經元數目增多，內錐體細胞層可見錐體細胞，多形細胞層亦可見小型錐體細胞，腦組織相對緊密。提示纖溶酶原能夠減輕SMA小鼠腦組織損傷。

實施例 24 給予纖溶酶原促進 SMA 小鼠肺組織中纖溶酶原水平增加

取出生3或7天的SMNΔ7 SMA小鼠8隻和同齡的野生型小鼠4隻，SMNΔ7 SMA小鼠隨機分爲溶媒組和給藥組，每組各4隻，4隻野生型小鼠作爲空白對照組。給藥組小鼠按照60mg/kg/天腹腔注射纖溶酶原，濃度爲10mg/ml，溶媒組和空白對照組小鼠按照6 ml/kg/天腹腔注射溶媒，均給藥到出生後11天。在小鼠出生後11天給藥2小時後犧牲解剖所有小鼠，取材部分肺組織，勻漿後按照Human Plasminogen ELISA Kit（廠家：AssayMax，貨號：EP1200-1）說明書操作進行檢測。以人纖溶酶原工作標準品作爲內標，對每個樣本的濃度進行濃度標定，標定後的濃度除以總蛋白濃度計算出每個樣本單位總蛋白量中纖溶酶原的量並進行統計分析。

結果顯示，空白對照組小鼠肺組織纖溶酶原水平爲1.22±1.12ng/mg；溶媒組小鼠肺組織纖溶酶原水平爲2.36±0.87ng/mg，約爲空白對照組的1.9倍；給藥組小鼠肺組織纖溶酶原水平爲96.94±20.49ng/mg，約爲溶媒組的41倍（圖19）。提示SMA條件下，纖溶酶原會向肺組織聚集，且肺組織纖溶酶原是不足的，補充纖溶酶原能夠進一步地促進纖溶酶原向肺組織聚集。

實施例 25 給予纖溶酶原促進 SMA 小鼠肌肉組織中纖溶酶原水平增加

從實施例24的犧牲小鼠取材肌肉組織，漿後按照Human Plasminogen ELISA Kit（廠家：AssayMax，貨號：EP1200-1）說明書操作進行檢測。以人纖溶酶原工作標準品作爲內標，對每個樣本的濃度進行濃度標定，標定後的濃度除以總蛋白濃度計算出每個樣本單位總蛋白量中纖溶酶原的量並進行統計分析。

結果顯示，空白對照組小鼠肌肉組織纖溶酶原水平爲5.95±3.84ng/mg；溶媒組小鼠肌肉組織纖溶酶原水平爲15.11±10.38ng/mg，約爲空白對照組的2.5倍；給藥組小鼠肌肉組織纖溶酶原水平爲901.30±398.51ng/mg，約爲溶媒組的60倍（圖20）。提示SMA條件下，纖溶酶原會向肌肉組織聚集，且肌肉組織纖溶酶原是不足的，補充纖溶酶原能夠進一步的促進纖溶酶原向肌肉組織聚集。

實施例 26 給予纖溶酶原促進 SMA 小鼠腦組織中纖溶酶原水平增加

從實施例24的犧牲小鼠取材腦組織，勻漿後按照Human Plasminogen ELISA Kit（廠家：AssayMax，貨號：EP1200-1）說明書操作進行檢測。以人纖溶酶原工作標準品作爲內標，對每個樣本的濃度進行濃度標定，標定後的濃度除以總蛋白濃度計算出每個樣本單位總蛋白量中纖溶酶原的量並進行統計分析。

結果顯示，空白對照組野生型小鼠腦組織纖溶酶原水平爲1.18±1.54ng/mg；溶媒組小鼠腦組織纖溶酶原水平爲1.49±1.59ng/mg，與空白對照組相比，溶媒組小鼠腦組織纖溶酶原水平未見明顯變化；給藥組SMA轉基因小鼠纖溶酶原水平爲12.09±5.32ng/mg，約爲溶媒組的8倍（圖21）。提示補充纖溶酶原可以促進SMA疾病條件下血-腦屏障對纖酶原通透性增加，纖溶酶原可通過血-腦屏障，達到腦部。

實施例 27 給予纖溶酶原促進 SMA 小鼠脊髓組織中纖溶酶原水平增加

取出生3或7天的SMNΔ7 SMA小鼠8隻和同齡的野生型小鼠4隻和同齡的SMA雜合小鼠3隻，SMNΔ7 SMA小鼠隨機分爲溶媒組和給藥組，每組各4隻，4隻野生型小鼠作爲空白對照組，3隻SMA雜合小鼠作爲正常給藥對照組。給藥組和正常給藥對照組小鼠按照60mg/kg/天腹腔注射纖溶酶原，濃度爲10mg/ml，溶媒組和空白對照組小鼠按照6 ml/kg/天腹腔注射溶媒，均給藥到出生後11天。在小鼠出生後11天給藥2小時後犧牲解剖所有小鼠，取材部分脊髓組織，勻漿後行纖溶酶原ELISA檢測。

結果顯示，空白對照組野生型小鼠脊髓纖溶酶原水平爲8.51±9.51ng/mg。溶媒組SMA轉基因小鼠脊髓纖溶酶原水平爲19.95±4.06ng/mg，相比於空白對照組稍有增加。正常給藥對照組纖溶酶原水平爲13.03±7.51ng/mg。給藥組SMA轉基因小鼠脊髓纖溶酶原水平爲62.33±17.37ng/mg，約爲溶媒組小鼠的3倍，且給藥組和溶媒組兩組比較統計分析P值爲0.029；約爲正常給藥對照組的4.8倍，且給藥組和正常給藥對照組比較統計分析P值爲0.026（圖22）。說明給藥纖溶酶原可促進SMA條件下血-脊髓屏障對纖溶酶原通透性增加，纖溶酶原可通過血-脊髓屏障，達到脊髓部位。

實施例 28 給予纖溶酶原促進 LPS 誘導的肺炎 SMA 雜合小鼠脊髓組織中纖溶酶原水平增加

取SMA雜合性小鼠（購自Jackson Laboratory ，譜系號：005025）9隻，根據體重隨機分爲2組，空白對照組3隻和模型組6隻。所有小鼠使用舒泰50麻醉後，模型組小鼠氣管滴注2.5mg/ml的細菌脂多糖（LPS）溶液進行造模，造模劑量5mg/kg，空白對照組小鼠管滴注2ml/kg生理鹽水。造模2小時後，模型組所有小鼠根據體重隨機分爲兩組，溶媒組3隻，給藥組3隻；分組完成後開始給藥，給藥組小鼠按照50mg/kg/隻尾靜脈注射纖溶酶原，溶媒組小鼠及空白對照組小鼠按照5ml/kg/隻尾靜脈注射溶媒。給藥2小時後犧牲所有小鼠解剖取材脊髓組織，勻漿後按照Human Plasminogen ELISA Kit（廠家：AssayMax，貨號：EP1200-1）說明書操作進行檢測。以人纖溶酶原工作標準品作爲內標，對每個樣本的濃度進行濃度標定，標定後的濃度除以總蛋白濃度計算出每個樣本單位總蛋白量中纖溶酶原的量並進行統計分析。

結果顯示，空白對照組小鼠脊髓組織勻漿纖溶酶原水平爲2.70±0.74ng/mg；氣管滴注LPS後，溶媒組小鼠脊髓組織勻漿纖溶酶原水平爲3.17±1.51ng/mg，與空白對照組相比未見明顯變化；給藥組小鼠補充2.5倍生理劑量水平的纖溶酶原後，纖溶酶原水平爲121.16±44.68ng/mg，約爲溶媒組小鼠的38.2倍（圖23）。提示補充纖溶酶原能夠促進LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠血-脊髓屏障對纖溶酶原的通透性增加，該條件下纖溶酶原可通過血-脊髓屏障，進入中樞神經系統。

實施例 29 給予纖溶酶原促進 LPS 誘導的肺炎 SMA 雜合小鼠脊髓組織中纖溶酶原水平增加

從實施例28的犧牲小鼠取材脊髓組織，勻漿後進行纖溶酶原的酶底物動力學法檢測。依次向酶標板（廠家：NUNC，貨號：446469）中加入85μL/孔七個不同濃度點的標準品溶液、空白、樣本，然後每孔加入15μL 20mM S-2251溶液（廠家：Chromogenix，貨號：82033239）和100ng/μL uPA溶液的混合物（臨用前按體積比2：1混合），於37℃溫育。從反應0min開始，每隔5min在多功能酶標儀中讀取A405吸光值，至反應90min止。所有的反應以時間爲和吸光值進行直線擬合，得出直線的斜率爲標準品/樣本的反應速率（△A405/min）。最後以標準品的效價值和△A405/min作標準曲線進行計算所測樣本效價。計算出每個樣本單位總蛋白量中纖溶酶原的活性。

結果顯示，空白對照組小鼠脊髓組織纖溶酶原水平爲0.00011±4.51x10^-5 U/mg；氣管滴注LPS後，溶媒組小鼠脊髓纖溶酶原水平爲0.00010±9.72 x10^-6 U/mg，與空白對照組相比，未見明顯變化；給藥組小鼠補充2.5倍生理劑量水平的纖溶酶原後，纖溶酶原水平增加至0.00034±1.04 x10^-4 U/mg，與溶媒相比，統計分析P值爲0.058（圖24）。提示補充纖溶酶原能夠促進LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠血-脊髓屏障對纖溶酶原的通透性增加，纖溶酶原可通過血-脊髓屏障，在脊髓處聚集。

實施例 30 給予纖溶酶原促進 LPS 誘導的肺炎 SMA 雜合小鼠肺組織中纖溶酶原水平增加

從實施例28的犧牲小鼠取材肺組織，勻漿後按照Human Plasminogen ELISA Kit（廠家：AssayMax，貨號：EP1200-1）說明書操作進行檢測。以人纖溶酶原工作標準品作爲內標，對每個樣本的濃度進行濃度標定，標定後的濃度除以總蛋白濃度計算出每個樣本單位總蛋白量中纖溶酶原的量並進行統計分析。

結果顯示，空白對照組小鼠肺組織纖溶酶原水平爲1.49±0.47ng/mg；氣管滴注LPS後，溶媒組小鼠肺組織纖溶酶原水平爲3.67±1.01ng/mg ，約爲空白對照組的2.5倍；給藥組小鼠補充2.5倍生理劑量水平的纖溶酶原後，肺組織纖溶酶原水平爲562.68±102.85ng/mg，約爲溶媒組小鼠的153倍（圖25）。提示補充的纖溶酶原能夠特異性地向損傷部位聚集。

實施例 31 給予纖溶酶原促進 LPS 誘導的肺炎 SMA 雜合小鼠肺組織中纖溶酶原水平增加

從實施例28的犧牲小鼠取材肺組織，勻漿後進行纖溶酶原的酶底物動力學法檢測。依次向酶標板（廠家：NUNC，貨號：446469）中加入85μL/孔七個不同濃度點的標準品溶液、空白、樣本，然後每孔加入15μL 20mM S-2251溶液（廠家：Chromogenix，貨號：82033239）和100ng/μL uPA溶液的混合物（臨用前按體積比2：1混合），於37℃溫育。從反應0min開始，每隔5min在多功能酶標儀中讀取A405吸光值，至反應90min止。所有的反應以時間爲和吸光值進行直線擬合，得出直線的斜率爲標準品/樣本的反應速率（△A405/min）。最後以標準品的效價值和△A405/min作標準曲線進行計算所測樣本效價。計算出每個樣本單位總蛋白量中纖溶酶原的活性。

結果顯示，空白對照組小鼠肺組織纖溶酶原水平爲0.00022±1.31x10^-5 U/mg；用LPS誘導SMA雜合小鼠發生急性肺炎後，溶媒組小鼠肺組織纖溶酶原水平增加至0.00033±3.70x10^-5 U/mg；給藥組小鼠施予2.5倍生理劑量的纖溶酶原2小時後，纖溶酶原水平增加至0.0023±1.78x10^-4 U/mg，約爲溶媒組的7倍（圖26）。說明LPS誘導肺組織損傷後，纖溶酶原向損傷部位聚集，且補充的纖溶酶原可顯著促進損傷部位纖溶酶原水平增加。

實施例 32 給予纖溶酶原促進 SMA 小鼠脊髓 NGF 水平增加

實施例28的犧牲小鼠取材脊髓組織，在10%中性福爾馬林固定液中固定24小時。固定後的脊髓組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片厚度爲4μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories, Inc., USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠NGF抗體(Abcam，ab52918) 4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，空白對照組（圖27A）小鼠脊髓表達一定水平的NGF，溶媒組（圖27B）小鼠脊髓NGF表達水平明顯降低，給藥組（圖27C）小鼠脊髓NGF表達水平明顯高於溶媒組小鼠，且兩組比較統計差異顯著（*表示P＜0.05）（圖27D）。說明纖溶酶原能夠促進SMA小鼠脊髓的NGF表達。

實施例 33 給予纖溶酶原促進 SMA 小鼠脊髓全長 SMN 基因轉錄

取出生3天的SMNΔ7 SMA突變型小鼠8隻，隨機分爲兩組，溶媒組小鼠4隻，給藥組小鼠4隻，取同窩野生型7隻小鼠做爲空白對照組。溶媒組及空白對照組小鼠前3天每天上、下午各一次腹腔注射給予3ml/kg溶媒，3天後每天單次腹腔注射6ml/kg溶媒；給藥組小鼠前3天按照30mg/kg/次每天上、下午各一次腹腔注射給予纖溶酶原(10mg/ml)，3天後每天單次腹腔注射60mg/kg 纖溶酶原（10mg/ml）。用藥9天後即PD11，犧牲小鼠取材脊髓組織，進行SMN mRNA qPCR檢測。

結果顯示，給藥組脊髓組織中全長SMN mRNA水平明顯高於溶媒組，且統計差異顯著（**表示P＜0.01）（圖28）。纖溶酶原能夠促進SMA模型小鼠脊髓全長SMN基因轉錄。

實施例 34 給予纖溶酶原改善 SMA 小鼠運動功能

實施例33中的小鼠，於出生第8天和第10天進行翻正實驗，評價小鼠的運動功能。

翻正實驗被用做幼鼠運動能力的評價。具體操作爲：將小鼠背部朝下仰臥放置，記錄小鼠自發翻正的時間，最長檢測時間爲30s，共測試三次，取平均值[14]。

結果顯示，溶媒組小鼠相比空白對照組小鼠翻正時間顯著延長，說明其運動能力明顯下降，但給藥纖溶酶原後相比溶媒組小鼠可提高運動能力，減少 SMA小鼠翻正時間。儘管P值接近0.05但由於個數問題尚未達到統計差異顯著（圖29）。該結果表明纖溶酶原能夠改善SMA小鼠運動能力，延緩病程惡化。

實施例 35 給予纖溶酶原改善 SMA 小鼠運動功能

實施例33中的小鼠，於出生第10天即PD10進行管測試評分，評價小鼠的運動功能。

管測試評分被用做評估近端後肢的肌肉力量，虛弱和疲勞，以及老鼠的新生情况。此外，它還可以評估一般的神經肌肉功能，身體肌肉的力量。小鼠頭朝下用後爪懸掛在50ml離心管上，三個因素將作爲評估參數：1.懸掛時間；2.拉起的數量（脫離管）；3.後肢評分（HLS評分）。HLS評分：4分：後肢分離正常，尾翹；3分：軟弱明顯，後肢靠的較近，但很少接觸；2分：後肢靠的較近，經常接觸；1分：軟弱明顯，後肢總是處於抱位，尾巴翹起；0分：持續抱住後肢，尾巴下垂；如果幼崽不能抱住試管，則HLS評分爲0分。TTS = (懸掛時間+拉起數量×10) ×（HLS+1）/4[14]。

結果顯示，溶媒組小鼠相比空白對照組野生型小鼠TTS評分顯著降低，給藥組給藥纖溶酶原後可以提高SMA小鼠的評分，改善小鼠運動功能退化這一趨勢（圖30）。該結果表明纖溶酶原能夠改善SMA小鼠神經肌肉功能的退化，延緩病程惡化。

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無

圖1示出實施例1所述Ⅱ型SMA患者治療前和治療後運動神經肌電圖波幅結果。結果顯示，與用藥前相比，患者脛神經、腓總神經動作電位波幅均有不同程度的提高。結果表明，纖溶酶原可改善II型SMA患者周圍神經元傳導功能，改善神經肌肉損傷。

圖2示出實施例2所述患者治療前後上下肢運動神經肌電圖波幅結果。與用藥前相比，患者左側股神經、右側尺神經、雙側腓總神經及脛神經動作電位波幅均有不同程度的提高。結果表明，纖溶酶原可改善II型SMA患者周圍神經元傳導功能，改善神經肌肉損傷。

圖3示出實施例3所述患者治療前後上下肢運動神經肌電圖波幅結果。與用藥前相比，患者雙側正中神經、脛神經、腓總神經、尺神經動作電位波幅均有不同程度的提高。結果表明，纖溶酶原可改善II型SMA患者周圍神經元傳導功能，改善神經肌肉損傷。

圖4示出實施例1-3所述3名患者接受纖溶酶原治療過程中HFMSE評分的變化。

圖5示出實施例6中I型SMA患者接受纖溶酶原治療過程中身高的變化。結果顯示，在用藥期間患者的體重逐漸增加，並且在正常標準範圍內波動。

圖6示出實施例6-10中5名I型SMA患者接受纖溶酶原治療過程中CHOP評分的變化。

圖7A-B 給予纖溶酶原後SMNΔ7 SMA小鼠生存曲線和生存時間統計結果。A爲生存曲線統計結果，B爲生存時間統計結果。生存曲線統計結果顯示，纖溶酶原能夠明顯改善SMNΔ7 SMA小鼠生存曲線，統計差異顯著(P=0.029)。生存時間統計結果顯示，溶媒組小鼠中位生存時間爲14天，所有小鼠在第15天全部死亡；給藥組中位生存時間爲16天，所有小鼠在第17天全部死亡，且統計分析差異顯著（P=0.03）。說明纖溶酶原能夠延長SMA模型小鼠生存時間。

圖8給予纖溶酶原後SMNΔ7 SMA小鼠脊髓SMN基因qPCR檢測結果。結果顯示，空白對照組小鼠脊髓具有一定的SMN基因轉錄水平，溶媒組小鼠SMN基因轉錄水平低於空白對照組小鼠，給藥組小鼠SMN基因轉錄水平明顯高於溶媒組小鼠和空白對照組小鼠。該結果提示纖溶酶原能夠促進SMN基因轉錄。

圖9給予纖溶酶原後SMNΔ7 SMA小鼠腦NF-κB蛋白Western blot 檢測結果和光密度值定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠腦具有一定量的NF-κB蛋白，溶媒組小鼠腦NF-κB蛋白水平低於空白對照組小鼠，給藥組小鼠腦NF-κB蛋白水平明顯高於溶媒組小鼠，且統計差異接近顯著（P=0.05）。該結果提示纖溶酶原能夠促進SMNΔ7 SMA小鼠腦組織NF-κB蛋白水平增加。

圖10給予纖溶酶原後SMNΔ7 SMA小鼠代表性後肢肌肉NF-κB蛋白Western blot 檢測結果和光密度值定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠肌肉具有一定量的NF-κB蛋白，溶媒組小鼠肌肉NF-κB蛋白水平低於空白對照組小鼠，給藥組小鼠肌肉NF-κB蛋白水平明顯高於溶媒組小鼠，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）。該結果提示纖溶酶原能夠促進SMNΔ7 SMA小鼠肌肉NF-κB蛋白水平增加。

圖11 給予纖溶酶原後SMNΔ7 SMA小鼠代表性腦SMN蛋白Western blot 檢測結果和光密度（OD）值定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠腦表達一定量的SMN蛋白，溶媒組小鼠SMN蛋白表達水平低於空白對照組小鼠，給藥組小鼠SMN蛋白表達水平明顯高於溶媒組小鼠。該結果提示纖溶酶原能夠促進SMNΔ7 SMA小鼠腦SMN蛋白表達。

圖12給予纖溶酶原後SMNΔ7 SMA小鼠代表性後肢肌肉SMN蛋白Western blot 檢測結果和光密度（OD）值定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠肌肉表達一定量的SMN蛋白，溶媒組小鼠肌肉SMN蛋白表達水平低於空白對照組小鼠，給藥組小鼠肌肉SMN蛋白表達水平明顯高於溶媒組小鼠。該結果提示纖溶酶原能夠促進SMNΔ7 SMA小鼠肌肉SMN蛋白表達。

圖13A-B給予纖溶酶原後SMA小鼠後腦組織Western blot 檢測結果和NGF/Pro-NGF光密度（OD）比值定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠腦組織具有一定NGF/ProNGF比值，給藥組小鼠腦組織NGF/ProNGF比值明顯高於溶媒組小鼠，且統計差異極爲顯著（***表示P＜0.001）。提示纖溶酶原能夠促進SMA模型小鼠腦組織中ProNGF轉化形成NGF，促進成熟NGF的形成。

圖14給予纖溶酶原後SMA小鼠代表性後肺組織H&E染色圖片結果顯示，空白對照組小鼠肺組織終末細支氣管上皮細胞排列整齊，清晰可辨；肺泡腔大小均勻，肺泡間隔未見增厚，血管周圍未見炎細胞浸潤；溶媒組小鼠肺組織呼吸性細支氣管上皮脫落，肺泡管、肺泡囊擴大，肺泡隔增寬，肺泡塌陷至結構紊亂，肺血管周圍伴嗜酸性粒細胞、泡沫細胞、淋巴細胞；給藥組小鼠肺組織呼吸性細支氣管上皮排列有序，肺泡管、肺泡囊擴大，肺泡腔均勻擴大，但可見由單層肺泡上皮組成的肺泡壁。提示纖溶酶原能夠改善SMA模型小鼠肺組織損傷。

圖15A-D SMA小鼠給藥9天肺組織F4/80免疫組織化學染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒組，C爲給藥組，D爲單位面積F4/80陽性細胞統計結果。結果顯示，空白對照組肺組織具有一定水平的F4/80陽性細胞，溶媒組小鼠肺組織F4/80陽性細胞水平明顯增加，給藥組小鼠F4/80陽性細胞水平明顯低於溶媒組小鼠，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）。說明纖溶酶原能夠顯著促進SMA小鼠損傷肺組織炎症修復。

圖16給藥纖溶酶原 9天SMNΔ7 SMA小鼠脊髓SMNΔ7 mRNA檢測結果。結果顯示，給藥後小鼠脊髓中SMNΔ7的轉錄水平顯著高於溶媒組，P值爲0.002。說明纖溶酶原可促進SMA小鼠脊髓中SMNΔ7的轉錄，促進功能性SMN蛋白的增加。

圖17A-C 給藥纖溶酶原 9天SMNΔ7 SMA小鼠肌肉組織H&E染色代表性圖片。A爲空白對照組，B爲溶媒組，C爲給藥組。結果顯示，空白對照組小鼠肌肉組織肌纖維胞體多呈圓形，大小均勻且平行排列，細胞核位於肌膜內側；相較於溶媒組，給藥組肌纖維細胞間質較爲緊密。提示纖溶酶原能夠減輕SMA小鼠肌肉組織損傷。

圖18A-C 給藥纖溶酶原 9天SMNΔ7 SMA小鼠腦組織H&E染色代表性圖片。A爲空白對照組，B爲溶媒組，C爲給藥組。結果顯示，空白對照組小鼠大腦皮層各層神經元結構清晰；內錐體細胞層的錐體細胞胞質豐富，頂端可見一條較粗的主樹突，核仁清晰；溶媒組小鼠大腦皮層各層神經元數目減少，結構不大清晰，錐體細胞難辨認，腦組織疏鬆；給藥組與溶媒組相比，各層神經元數目增多，內錐體細胞層可見錐體細胞，多形細胞層亦可見小型錐體細胞，腦組織相對緊密。提示纖溶酶原能夠減輕SMA小鼠腦組織損傷。

圖19連續給藥纖溶酶原後，ELISA 法檢測SMNΔ7 SMA小鼠肺組織中纖溶酶原含量結果。結果顯示，空白對照組小鼠肺組織纖溶酶原水平爲1.22±1.12ng/mg；溶媒組小鼠肺組織纖溶酶原水平爲2.36±0.87ng/mg，約爲空白對照組的1.9倍；給藥組小鼠肺組織纖溶酶原水平爲96.94±20.49ng/mg，約爲溶媒組的41倍。提示SMA條件下，纖溶酶原會向肺組織聚集，且肺組織纖溶酶原是不足的，補充纖溶酶原能夠進一步的促進纖溶酶原向肺組織聚集。

圖20連續給藥纖溶酶原後，ELISA 法檢測SMNΔ7 SMA肌肉組織中纖溶酶原含量結果。結果顯示，空白對照組小鼠肌肉組織纖溶酶原水平爲5.95±3.84ng/mg；溶媒組小鼠肌肉組織纖溶酶原水平爲15.11±10.38ng/mg，約爲空白對照組的2.5倍；給藥組小鼠肌肉組織纖溶酶原水平爲901.30±398.51ng/mg，約爲溶媒組的60倍。提示SMA條件下，纖溶酶原會向肌肉組織聚集，且肌肉組織纖溶酶原是不足的，補充纖溶酶原能夠進一步的促進纖溶酶原向肌肉組織聚集。

圖21連續給藥纖溶酶原後，ELISA 法檢測SMNΔ7 SMA小鼠腦組織中纖溶酶原含量結果。結果顯示，空白對照組野生型小鼠腦組織纖溶酶原水平爲1.18±1.54ng/mg；溶媒組小鼠腦組織纖溶酶原水平爲1.49±1.59ng/mg，與空白對照組相比，溶媒組小鼠腦組織纖溶酶原水平未見明顯變化；給藥組SMA轉基因小鼠纖溶酶原水平爲12.09±5.32ng/mg，約爲溶媒組的8倍。提示補充纖溶酶原可以促進SMA疾病條件下血-腦屏障對纖酶原通透性增加，纖溶酶原可通過血-腦屏障，達到腦部。

圖22連續給藥纖溶酶原後，ELISA 法檢測SMNΔ7 SMA脊髓組織中纖溶酶原含量結果。結果顯示，空白對照組野生型小鼠脊髓纖溶酶原水平爲8.51±9.51ng/mg。溶媒組SMA轉基因小鼠脊髓纖溶酶原水平爲19.95±4.06ng/mg，相比於空白對照組稍有增加。正常給藥對照組纖溶酶原水平爲13.03±7.51ng/mg。給藥組SMA轉基因小鼠脊髓纖溶酶原水平爲62.33±17.37ng/mg，約爲溶媒組小鼠的3倍，且給藥組和溶媒組兩組比較統計分析P值爲0.029；約爲正常給藥對照組的4.8倍，且給藥組和正常給藥對照組比較統計分析P值爲0.026。說明給藥纖溶酶原可促進SMA條件下血-脊髓屏障對纖溶酶原通透性增加，纖溶酶原可通過血-脊髓屏障，達到脊髓部位。

圖23單次尾靜脈注射給予纖溶酶原於LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠2小時後，脊髓勻漿纖溶酶原水平ELISA檢測結果。結果顯示，空白對照組小鼠脊髓組織勻漿纖溶酶原水平爲2.70±0.74ng/mg；氣管滴注LPS後，溶媒組小鼠脊髓組織勻漿纖溶酶原水平爲3.17±1.51ng/mg，與空白對照組相比未見明顯變化；給藥組小鼠補充2.5倍生理劑量水平的纖溶酶原後，纖溶酶原水平爲121.16±44.68ng/mg，約爲溶媒組小鼠的38.2倍。提示補充纖溶酶原能夠促進LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠血-脊髓屏障對纖溶酶原的通透性增加，該條件下纖溶酶原可通過血-脊髓屏障，進入中樞神經系統。

圖24單次尾靜脈注射給予纖溶酶原於LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠2小時後，脊髓勻漿纖溶酶原水平酶底物動力學法檢測結果。結果顯示，空白對照組小鼠脊髓組織纖溶酶原水平爲0.00011±4.51x10^-5 U/mg；氣管滴注LPS後，溶媒組小鼠脊髓纖溶酶原水平爲0.00010±9.72 x10^-6 U/mg，與空白對照組相比，未見明顯變化；給藥組小鼠補充2.5倍生理劑量水平的纖溶酶原後，纖溶酶原水平增加至0.00034±1.04 x10^-4 U/mg，與溶媒相比，統計分析P值爲0.058。提示補充纖溶酶原能夠促進LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠血-脊髓屏障對纖溶酶原的通透性增加，纖溶酶原可通過血-脊髓屏障，在脊髓處聚集。

圖25單次尾靜脈注射給予纖溶酶原於LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠2小時後，肺組織勻漿纖溶酶原水平ELISA檢測結果。結果顯示，空白對照組小鼠肺組織纖溶酶原水平爲1.49±0.47ng/mg；氣管滴注LPS後，溶媒組小鼠肺組織纖溶酶原水平爲3.67±1.01ng/mg ，約爲空白對照組的2.5倍；給藥組小鼠補充2.5倍生理劑量水平的纖溶酶原後，肺組織纖溶酶原水平爲562.68±102.85ng/mg，約爲溶媒組小鼠的153倍。提示補充纖溶酶原能夠特異聚集損傷部位，修復損傷。

圖26單次尾靜脈注射給予纖溶酶原於LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠2小時後，肺勻漿纖溶酶原水平酶底物動力學法檢測結果。結果顯示，空白對照組小鼠肺組織纖溶酶原水平爲0.00022±1.31x10^-5 U/mg；用LPS誘導SMA雜合小鼠發生急性肺炎後，溶媒組小鼠肺組織纖溶酶原水平增加至0.00033±3.70x10^-5 U/mg；給藥組小鼠施予2.5倍生理劑量的纖溶酶原2小時後，纖溶酶原水平增加至0.0023±1.78x10^-4 U/mg，約爲溶媒組的7倍。說明LPS誘導肺組織損傷後，纖溶酶原向損傷部位聚集，且補充纖溶酶原可顯著促進損傷部位纖溶酶原水平增加。

圖27A-D SMA小鼠給藥9天脊髓組織NGF免疫組織化學染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒組，C爲給藥組，D爲平均光密度定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠脊髓表達一定水平的NGF，溶媒組小鼠脊髓NGF表達水平明顯降低，給藥組小鼠脊髓NGF表達水平明顯高於溶媒組小鼠，且兩組比較統計差異顯著（*表示P＜0.05）。說明纖溶酶原能夠促進SMA小鼠脊髓的NGF表達。

圖28 SMA小鼠給藥9天脊髓組織全長SMN基因PCR檢測結果。結果顯示，給藥組脊髓組織中全長SMN mRNA水平明顯高於溶媒組，且統計差異顯著（**表示P＜0.01）。纖溶酶原能夠促進SMA模型小鼠脊髓全長SMN基因轉錄。

圖29 給藥纖溶酶原後SMA小鼠翻正實驗測試結果。結果顯示，溶媒組小鼠相比空白對照組小鼠翻正時間顯著延長，說明其運動能力明顯下降，但給藥纖溶酶原後相比溶媒組小鼠可提高運動能力，減少 SMA小鼠翻正時間。儘管P值接近0.05但由於個數問題尚未達到統計差異顯著。該結果表明纖溶酶原能夠改善SMA小鼠運動能力，延緩病程惡化。

圖30 給藥纖溶酶原後SMA小鼠管測試評分結果。結果顯示，溶媒組小鼠相比空白對照組野生型小鼠TTS評分顯著降低，給藥組給藥纖溶酶原後可以提高SMA小鼠的評分，改善小鼠運動功能退化這一趨勢。該結果表明纖溶酶原能夠改善SMA小鼠神經肌肉功能的退化，延緩病程惡化。

無

Claims

一種纖溶酶原或纖維蛋白溶酶製備治療患脊髓性肌萎縮症(SMA)的受試者的脊髓性肌萎縮症(SMA)的藥物的用途。
如請求項1所述的用途，其中所述纖溶酶原或纖維蛋白溶酶促進SMN基因的轉錄和/或表達。
如請求項1所述的用途，其中所述纖溶酶原或纖維蛋白溶酶改善受試者選自下組的一項或多項：肌力、肌張力、運動功能、呼吸功能和肌肉萎縮。
如請求項1-3任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原或纖維蛋白溶酶延長受試者生存期。
如請求項1-3任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原或纖維蛋白溶酶促進受試者NF-κB蛋白的表達。
如請求項1-3任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原或纖維蛋白溶酶具有選自下組的一項或多項作用：1)促進纖溶酶原透過血-腦屏障和血-脊髓屏障，2)促進纖溶酶原向SMA受試者大腦和脊髓組織聚集，3)促進纖溶酶原向SMA受試者損傷組織聚集，4)提高SMA受試者大腦和脊髓中纖溶酶原水平，5)提高SMA受試者損傷組織局部纖溶酶原水平，6)減輕SMA受試者損傷組織損傷，7)促進SMA受試者損傷組織炎症修復，8)促進SMA受試者大腦和脊髓中SMN△7的轉錄，9)提高SMA受試者大腦和脊髓中SMN蛋白的水平，10)促進SMA受試者大腦和脊髓中NGF的表達，和 11)促進SMA受試者生長發育。
如請求項1-3任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原或纖維蛋白溶酶與一種或多種其它藥物或治療方法聯合施用。
如請求項1-3任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原或纖維蛋白溶酶通過鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液、滴眼液、滴耳液、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內或肌肉內給藥。
如請求項1所述的用途，其中所述纖溶酶原為人全長纖溶酶原或其保守取代變體。
如請求項1所述的用途，其中所述纖溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原的賴氨酸結合活性或蛋白水解活性。
如請求項1所述的用途，其中所述纖溶酶原包含與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%胺基酸序列同一性的胺基酸序列、並且仍然具有纖溶酶原的蛋白水解活性的蛋白質。
如請求項1所述的用途，其中所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原的蛋白水解活性的變體。
如請求項1所述的用途，其中所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10、12所示的胺基酸序列或包含序列2、6、8、10、12所示胺基酸序列的保守取代變體。