TW202408566A - 一種治療神經損傷及其相關病症的方法 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種治療神經損傷及其相關病症的方法，包括給藥受試者治療有效量的纖維蛋白溶酶原激活途徑組分。本發明還涉及用於治療上述病症的包含纖維蛋白溶酶原激活途徑組分的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。

Description

一種治療神經損傷及其相關病症的方法

本發明涉及一種治療神經損傷及其相關病症，例如癱瘓的方法，包括給藥受試者有效量的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物，例如纖溶酶原，以修復損傷神經，改善臨床症狀和體徵。

神經系統包括中樞神經（大腦、脊髓）系統及外周神經系統（周圍神經組織）。神經系統損傷由多種因素引起：（1）物理損傷，直接造成損傷部位的神經組織損害，如外傷造成的腦神經組織損傷或脊髓損傷；（2）部分神經系統的臨時或永久性缺血或缺氧，如中風或腦栓塞造成腦神經組織損傷；（3）接觸神經毒素，如用於治療癌症的化學製劑等；（4）慢性代謝病，如糖尿病或腎功能障礙引起的外周神經損傷等。

脊髓神經損傷是外傷或疾病導致脊髓神經結構和功能破壞或受損的病理狀况的總稱。例如脊髓外傷、脊柱壓縮性骨折、橫斷性脊髓炎、脊髓腫瘤、椎骨結核和脊髓空洞症等可導致脊髓損傷，造成癱瘓。而脊髓頸膨大以上橫貫性病變引起的截癱爲高位截癱，第三胸椎以下的脊髓損傷所引起的截癱爲雙下肢截癱。脊髓損傷急性期，受傷平面以下雙側肢體感覺、運動、反射等消失，以及和膀胱、肛門括約肌功能喪失，導致脊髓休克。目前對包括脊髓損傷等的神經損傷尚無理想的治療方法。

本發明研究發現纖溶酶原可以明顯促進神經損傷的修復，促進損傷神經的髓鞘再生，改善相關症狀。

具體地，本發明涉及如下各項：

1. 一種治療神經損傷的方法，包括給藥受試者治療有效量的選自如下的一種或多種化合物：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

2. 如請求項1所述的方法，其中所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自纖維蛋白溶酶原、重組人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、微纖溶酶（micro-plasmin）、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶（delta-plasmin）、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。

3. 如請求項1的方法，所述纖溶抑制劑的拮抗劑爲PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抑制劑，例如抗體。

4. 如請求項1-3任一項的方法，其中所述神經損傷包括脊髓神經損傷，尤其是壓迫性脊髓神經損傷。

在一些實施方案中，所述神經損傷爲中樞神經損傷（例如脊髓神經損傷）或外周神經損傷。

5. 如請求項4的方法，所述脊髓神經損傷包括脊柱壓縮性骨折、橫斷性脊髓炎、脊髓腫瘤、椎骨結核或脊髓空洞症造成的脊髓神經損傷。

6. 如請求項1-5任一項的方法，包括通過治療神經損傷相關病症。

7. 如請求項6的方法，其中所述神經損傷相關病症包括癱瘓。

8. 如請求項7的方法，其中所述癱瘓爲高位截癱或雙下肢截癱。

9. 如請求項1-8任一項的方法，其中所述化合物促進損傷神經的修復。

10. 如請求項1-9任一項的方法，其中所述化合物促進神經髓鞘的再生。

11．如請求項1-10任一項的方法，其中所述化合物促進脊髓神經絲蛋白的表達。

12. 如請求項1-11任一項的方法，其中所述化合物促進感覺神經功能恢復。

13. 如請求項12的方法，其中所述化合物促進痛覺恢復。

14. 如請求項1-13任一項的方法，其中所述化合物爲纖溶酶原。

在一些實施方案中，本申請涉及纖溶酶原的選自如下一項或多項活性或功能：促進神經髓鞘的再生、促進脊髓神經絲蛋白的表達和神經纖維再生、促進感覺神經功能恢復或運動神經功能恢復、促進痛覺恢復、促進神經突觸素的表達、促進損傷的神經細胞尼氏體水平的恢復。

15. 在一些實施方案中，上述纖溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性（例如蛋白水解活性或賴氨酸結合活性）。

16. 在一些實施方案中，上述纖溶酶原爲包含纖溶酶原活性片段，並且仍然具有纖溶酶原活性（例如蛋白水解活性或賴氨酸結合活性）的蛋白質。在一些實施方案中，所述纖溶酶原活性片段與序列14所示的纖溶酶原活性片段具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，或與14所示的纖溶酶原活性片段具有100%的氨基酸序列同一性。

17. 如請求項1-14任一項的方法，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性（例如蛋白水解活性或賴氨酸結合活性）的變體。

18. 如請求項1-14任一項的方法，所述纖溶酶原爲天然或合成的人全長纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性（例如蛋白水解活性、或賴氨酸結合活性）的變體或片段。

在本發明的上述任一實施方案中，所述纖溶酶原可與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性（例如蛋白水解活性或賴氨酸結合活性）。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性（例如蛋白水解活性或賴氨酸結合活性）的蛋白質，例如蛋白水解活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原包含或具有序列2、6、8、10或12所示的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質，例如蛋白水解活性、或賴氨酸結合活性、或蛋白水解活性和賴氨酸結合活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性（例如蛋白水解活性或賴氨酸結合活性）的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性（例如蛋白水解活性或賴氨酸結合活性）的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。

在一些實施方案中，所述受試者是人。在一些實施方案中，所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。在一些實施方案中，所述缺乏或缺失是先天的、繼發的和/或局部的。

在一些實施方案中，所述藥物組合物包含藥學上可接受的載劑和用於前述方法的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述試劑盒可以是預防性或治療性試劑盒，其包含：(i)用於前述方法的纖溶酶原和(ii)用於遞送所述纖溶酶原至所述受試者的構件(means)。在一些實施方案中，所述構件爲注射器或小瓶。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示將所述纖溶酶原投予所述受試者以實施前述任一方法。

在一些實施方案中，所述製品包含：含有標籤的容器；和包含(i)用於前述方法的纖溶酶原或包含纖溶酶原的藥物組合物，其中所述標籤指示將所述纖溶酶原或組合物投予所述受試者以實施前述任一方法。

在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含另外的一個或多個構件或容器，該構件或容器中含有其他藥物。

在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原通過全身或局部給藥，較佳通過以下途徑施用：靜脈內、肌內、皮下或鞘內給予纖溶酶原來進行治療。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000 mg/kg、0.001-800 mg/kg、0.01-600 mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg（以每公斤體重計算）或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800 mg/cm2、0.01-600 mg/cm2、0.1-400 mg/cm2、1-200 mg/cm2、1-100 mg/cm2、 10-100 mg/cm2（以每平方公分體表面積計算）的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。

本發明明確涵蓋了屬於本發明實施方案之間的技術特徵的所有組合，並且這些組合後的技術方案在本申請中已經明確公開，就像上述技術方案  已經單獨且明確公開一樣。另外，本發明還明確涵蓋各個實施方案及其要素的之間的組合，該組合後的技術方案在本文中明確公開。

纖維蛋白溶解系統（Fibrinolytic system）亦稱纖溶系統，爲參與纖維蛋白溶解（纖溶）過程的一系列化學物質組成的系統，主要包括纖維蛋白溶解酶原（纖溶酶原）、纖溶酶、纖溶酶原激活物、纖溶抑制劑。纖溶酶原激活物包括組織型纖溶酶原激活物（t-PA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）。t-PA是一種絲氨酸蛋白酶，由血管內皮細胞合成。t-PA激活纖溶酶原，此過程主要在纖維蛋白上進行；尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）由腎小管上皮細胞和血管內皮細胞産生，可以直接激活纖溶酶原而不需要纖維蛋白作爲輔因子。纖溶酶原（PLG）由肝臟合成，當血液凝固時，PLG大量吸附在纖維蛋白網上，在t-PA或u-PA的作用下，被激活爲纖溶酶，促使纖維蛋白溶解。纖溶酶（PL）是一種絲氨酸蛋白酶，作用如下：降解纖維蛋白和纖維蛋白原；水解多種凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅶ、XI、Ⅱ等；使纖溶酶原轉變爲纖溶酶；水解補體等。纖溶抑制物：包括纖溶酶原激活物抑制劑（PAI）和α2抗纖溶酶（α2-AP）。PAI主要有PAI-1和PAI-2兩種形式，能特異性與t-PA以1：1比例結合，從而使其失活，同時激活PLG。α2-AP由肝臟合成，與PL以1：1比例結合形成複合物，抑制PL活性；FⅩⅢ使α2-AP以共價鍵與纖維蛋白結合，減弱了纖維蛋白對PL作用的敏感性。體內抑制纖溶系統活性的物質：PAI-1，補體C1抑制物；α2抗纖溶酶；α2巨球蛋白。

本發明的術語“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”涵蓋：

1. 纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、delta-纖溶酶原；它們的變體或類似物；

2. 纖維蛋白溶酶以及它們的變體或類似物；和

3. 纖維蛋白溶酶原激活劑，例如tPA和uPA以及包含一個或多個tPA或uPA的結構域(如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的tPA或uPA變體和類似物。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及通過添加、删除和/或取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸、仍然具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA活性的蛋白質。例如，纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括通過例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個保守性氨基酸取代獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的“纖溶酶原變體”涵蓋與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性（例如蛋白水解活性、或賴氨酸結合活性、或蛋白水解活性和賴氨酸結合活性）的蛋白質。例如本發明的“纖溶酶原變體”可以是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性（例如蛋白水解活性、或賴氨酸結合活性、或蛋白水解活性和賴氨酸結合活性）的蛋白質。具體地，本發明纖溶酶原變體包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及通過保守性氨基酸取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的纖溶酶原可以爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性（例如蛋白水解活性、或賴氨酸結合活性、或蛋白水解活性和賴氨酸結合活性）的變體，例如序列2、6、8、10或12所示的纖溶酶原，例如序列2所示的人天然纖溶酶原。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“類似物”包括分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用的化合物。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”。例如，纖維蛋白溶酶原的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖溶酶原結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶原變體和類似物，例如小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)。纖維蛋白溶酶的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖維蛋白溶酶結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶 “變體”和“類似物”，例如小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)和δ-纖維蛋白溶酶(delta-plasmin)。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的“變體”或“類似物”是否分別具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的活性，或者是否分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用可以通過本領域已知方法進行檢測，例如，通過基於酶譜法(enzymography)、ELISA(酶聯免疫吸附測定)和FACS(螢光激活細胞分選方法)通過激活的纖維蛋白溶酶活性水平來衡量，例如可以參照選自如下文獻中記載的方法測量：Ny，A.，Leonardsson，G.，Hagglund，A.C，Hagglof，P.，Ploplis，V.A.，Carmeliet，P. and Ny，T. (1999). Ovulation inplasminogen-deficient mice. Endocrinology 140，5030-5035；Silverstein RL, Leung LL, Harpel PC, Nachman RL (November 1984). "Complex formation of platelet thrombospondin with plasminogen. Modulation of activation by tissue activator". J. Clin. Invest. 74 (5): 1625–33；Gravanis I, Tsirka SE (February 2008). "Tissue-type plasminogen activator as a therapeutic target in stroke". Expert Opinion on Therapeutic Targets. 12 (2): 159–70；Geiger M, Huber K, Wojta J, Stingl L, Espana F, Griffin JH, Binder BR (Aug 1989). "Complex formation between urokinase and plasma protein C inhibitor in vitro and in vivo". Blood. 74 (2): 722–8.

在本發明的一些實施方案中，本發明的“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”爲纖溶酶原，選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性（例如蛋白水解活性、或賴氨酸結合活性、或蛋白水解活性和賴氨酸結合活性）的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的保守突變變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的保守突變變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是如序列2所示的人天然纖溶酶原。

“能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物”指能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的任何化合物，例如tPA、uPA、鏈激酶、沙蘆普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉諾替普酶、帕米普酶、葡激酶。

本發明“纖溶抑制劑的拮抗劑”爲拮抗、減弱、封閉、阻止纖溶抑制劑作用的化合物。所述纖溶抑制劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶和α2巨球蛋白。所述拮抗劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體，或阻斷或下調例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白表達的反義RNA或小RNA，或占據PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合位點但無PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白功能的化合物”，或 封閉PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合結構域和/或活性結構域的化合物。

纖溶酶是纖溶酶原激活系統（PA系統）的關鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶，能夠水解細胞外基質（ECM）的幾個組分，包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖。此外，纖溶酶能將一些金屬蛋白酶前體(pro-MMPs)激活形成具有活性的金屬蛋白酶（MMPs）。因此纖溶酶被認爲是胞外蛋白水解作用的一個重要的上游調節物。纖溶酶是由纖溶酶原通過兩種生理性的PAs：組織型纖溶酶原激活劑（tPA ）或尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）蛋白水解形成的。由於纖溶酶原在血漿和其他體液中相對水平較高，傳統上認爲PA系統的調節主要通過PAs的合成和活性水平實現。PA系統組分的合成受不同因素嚴格調節，如激素、生長因子和細胞因子。此外，還存在纖溶酶和PAs的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α2-抗纖溶酶（α2-antiplasmin）。PAs的活性同時被uPA 和tPA 的纖溶酶原激活劑抑制劑-1（PAI-1）抑制以及主要抑制uPA的溶酶原激活劑抑制劑-2（PAI-2）調節。某些細胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細胞表面受體(uPAR)。

纖溶酶原是一個單鏈糖蛋白，由791個氨基酸組成，分子量約爲92 kDa。纖溶酶原主要在肝臟合成，大量存在於胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約爲2 μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的一個巨大的潜在來源。纖溶酶原存在兩種分子形式：谷氨酸-纖溶酶原（Glu-plasminogen）和賴氨酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個氨基末端（N-末端）谷氨酸，因此被稱爲谷氨酸-纖溶酶原。然而，在纖溶酶存在時，谷氨酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成爲賴氨酸-纖溶酶原。與谷氨酸-纖溶酶原相比，賴氨酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力，並可以更高的速率被PAs激活。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割，導致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成。纖溶酶原的氨基末端部分包含五個同源三環，即所謂的kringles，羧基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringles含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α2-AP特異性相互作用的賴氨酸結合位點。最新發現一個纖溶酶原爲38 kDa的片段，其中包括kringles1-4，是血管生成的有效抑制劑。這個片段被命名爲血管抑素，可通過幾個蛋白酶水解纖溶酶原産生。

纖溶酶的主要底物是纖維蛋白，纖維蛋白的溶解是預防病理性血栓形成的關鍵。纖溶酶還具有對ECM幾個組分的底物特異性，包括層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠，表明纖溶酶在ECM重建中亦起著重要作用。間接地，纖溶酶還可以通過轉化某些蛋白酶前體爲活性蛋白酶來降解ECM的其他組分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纖溶酶可能是細胞外蛋白水解的一個重要的上游調節器。此外，纖溶酶具有激活某些潜在形式的生長因子的能力。在體外，纖溶酶還能水解補體系統的組分並釋放趨化補體片段。

“纖溶酶”是存在於血液中的一種非常重要的酶，能將纖維蛋白凝塊水解爲纖維蛋白降解産物和D-二聚體。

“纖溶酶原”是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源纖溶酶原氨基酸序列（序列4）計算由810個氨基酸組成，分子量約爲90kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中循環的糖蛋白，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域：位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI數據，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。

Glu-纖溶酶原是人天然全長的纖溶酶原，由791個氨基酸組成（不含有19個氨基酸的信號肽），編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。 在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纖溶酶原 (δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶結構域（亦稱蛋白酶結構域（protease domain，PD）），有文獻報導了delta-纖溶酶原的氨基酸序列（序列8），編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7所示。小纖溶酶原（Mini-plasminogen）由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），其氨基酸序列如序列10所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原（Micro-plasminogen）僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報導其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），亦有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），在本專利申請中微纖溶酶原序列參考專利文獻CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

全長纖溶酶原的結構亦描述在Aisina等(Aisina R B , Mukhametova L I . Structure and function of plasminogen/plasmin system[J]. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2014, 40(6):590-605)的文章中。在該文章中，Aisina等描述纖溶酶原包括Kringle1、2、3、4、5結構域和絲氨酸蛋白酶結構域（亦稱蛋白酶結構域（protease domain，PD）），其中，Kringles負責纖溶酶原與低分子量和高分子量的配體結合，導致纖溶酶原轉變成一個更加開放的構型，從而更容易被活化，蛋白酶結構域（PD）爲殘基Val562-Asn791，tPA和UPA特異性切割纖溶酶原的Arg561-Val562位活化鍵，從而使纖溶酶原形成纖溶酶。

本發明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用，含義相同；“纖溶酶原”與“纖溶酶原”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用，含義相同。

在本申請中，所述纖溶酶原“缺乏”的含義或活性爲受試者體內纖溶酶原的含量比正常人低，低至足以影響所述受試者的正常生理功能；所述纖溶酶原“缺失”的含義或活性爲受試者體內纖溶酶原的含量顯著低於正常人，甚至活性或表達極微，只有通過外源提供才能維持正常生理功能。

所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶，因此，本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。在循環過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在纖溶酶原激活劑(plasminogen activator，PA)的介導下，其轉變爲呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解爲纖維蛋白降解産物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要決定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。已知多種能夠作爲纖溶酶原激活劑的酶，包括：組織纖溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纖溶酶原活性片段” 是指具有與底物靶序列中賴氨酸結合的活性（賴氨酸結合活性）、或發揮蛋白水解功能的活性（蛋白水解活性）、或蛋白水解活性和賴氨酸結合活性的片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶結構域或由纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶結構域組成，較佳，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、或與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列或由序列14、或與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列組成。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4、Kringle 5中一個或多個的區域，或由選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4、Kringle 5中一個或多個的區域組成。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原包括含有上述纖溶酶原活性片段的蛋白質。

目前，對於血液中纖溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖溶酶原激活劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖溶酶原激活劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg) 、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法爲發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖溶酶原活性成正比。此外亦可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖溶酶原活性進行測定。

“直系同源物或直系同系物（ortholog）”指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物亦包括DNA同源物，亦稱爲直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代變體”是指其中一個給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性（如酸性，鹼性，疏水性，等）的氨基酸取代親本蛋白質中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質的氨基酸是衆所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性氨基酸並可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水氨基酸，則可被亮氨酸，蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或氨基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN算法的70%至99%的相似度（同一性）。“保守取代變體”還包括通過BLAST或FASTA算法確定具有60%以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能達 75%以上更好，最好能達85%以上，甚至達90%以上爲最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。

“分離的”纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如通過Lowry法所確定的，例如超過99% (按重量計)，(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原亦包括通過生物工程技術從重組細胞製備，並通過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。

術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物；等等。

關於參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分數（%）”定義爲在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視爲序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。爲測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公衆可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）軟件。所屬技術領域中具有通常知識者能決定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何算法。然而，爲了本發明的目的，氨基酸序列同一性百分數值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2産生的。

在採用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情况中，給定氨基酸序列A相對於給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（或者可表述爲具有或包含相對於、與、或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A）如下計算：

分數X/Y 乘 100

其中X是由序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分爲相同匹配的氨基酸殘基的數目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數。應當領會，在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情况下，A相對於B的%氨基酸序列同一性會不等於B相對於A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2計算機程序獲得的。

如本文中使用的，術語“治療”和“處理”指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀，和/或部分或完全治愈疾病和/或其症狀，並且包括：(a)預防疾病在受試者體內發生，所述受試者可以具有疾病的素因，但是尚未診斷爲具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滯其形成；和(c)減輕疾病和/或其症狀，即引起疾病和/或其症狀消退。

術語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠、小鼠)、非人靈長類、人、犬、猫、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、猪、山羊)等。

“治療有效量”或“有效量”指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖溶酶原的量。“治療有效量”會根據所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。

本發明纖溶酶原的製備

纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，亦可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS) (其中將序列的C末端氨基酸附接於不溶性支持物，接著序貫添加序列中剩餘的氨基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis; 第3-284頁於The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield,等 J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewart等, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984);和Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10和Camarero JA等 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複循環後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的氨基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。

可以使用標準重組方法來生産本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啓動子(例如天然關聯的或異源的啓動子)、信號序列、增强子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啓動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水平表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。

合適的表達載體通常在宿主生物體中作爲附加體或作爲宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。

大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於複製主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，亦可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公知的啓動子，諸如乳糖啓動子系統，色氨酸(trp)啓動子系統，beta-內醯胺酶啓動子系統，或來自噬菌體λ的啓動子系統。啓動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情况中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啓動並完成轉錄和翻譯。

其他微生物，諸如酵母亦可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S. cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啓動子)、複製起點、終止序列等。典型的啓動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啓動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啓動子。

在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)亦可以用於表達並生成本發明的抗-Tau抗體(例如編碼主題抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啓動子和增强子(Queen等, Immunol. Rev. 89:49 (1986))，以及必需的加工信息位點，諸如核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啓動子。參見Co等, J. Immunol. 148:1149 (1992)。

一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱，親和柱，柱層析，高效液相層析(HPLC)，凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除主題抗體以外的大分子，等等。

藥物配製劑

可以通過將具有所需純度的纖溶酶原與可選的藥用載體，賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版，Osol, A. ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如 TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。較佳凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作爲參考。

本發明的配製劑亦可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，較佳活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如，抗高血壓的藥物，抗心律失常的藥物，治療糖尿病的藥物等。

本發明的纖溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或界面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)。

用於體內給藥的本發明的纖溶酶原必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。

本發明的纖溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277(1981)；Langer, Chem. Tech., 12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919, EP 58,481)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯－乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間却較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。

給藥和劑量

可以通過不同方式，例如通過靜脈內，腹膜內，皮下，顱內，鞘內，動脈內(例如經由頸動脈)，肌內來實現本發明藥物組合物的施用。

用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。亦可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。

醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取决於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以例如爲例如每天約0.0001至2000 mg/kg，或約0.001至500 mg/kg (例如0.02 mg/kg，0.25 mg/kg，0.5 mg/kg，0.75 mg/kg，10 mg/kg，50 mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1 mg/kg體重或50 mg/kg體重或在1-50 mg/kg的範圍，或至少1 mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量亦涵蓋在內，特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量亦包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每周或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天1-10 mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要實時評估治療效果和安全性。

製品或藥盒

本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含可用於治療由糖尿病引起的心血管病及其相關病症的本發明纖溶酶原或纖溶酶。所述製品較佳包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可爲靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑爲纖溶酶原/纖溶酶。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述由糖尿病引起的心血管病及其相關病症。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將纖溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。

實施例

以下實施例中使用的人纖溶酶原來自人捐贈者血漿，基於如下文獻描述的方法：KennethC Robbins,Louis Summaria,David Elwyn et al.Further Studies on the Purification and Characterization of Human Plasminogen and Plasmin. Journal of Biological Chemistry , 1965 , 240 (1) :541-550；Summaria L, Spitz F, Arzadon L et al. Isolation and characterization of the affinity chromatography forms of human Glu- and Lys-plasminogens and plasmins. J Biol Chem. 1976 Jun 25;251(12):3693-9；HAGAN JJ, ABLONDI FB, DE RENZO EC. Purification and biochemical properties of human plasminogen. J Biol Chem. 1960 Apr;235:1005-10，並進行製程優化，從人捐贈者血漿純化所得，其中人纖維蛋白溶酶原單體＞98%。

實施例 1 纖溶酶原促進脊髓壓迫損傷模型小鼠神經損傷的修復

取8周齡C57雌性小鼠15隻稱重後隨機分三組，分別爲假手術組、給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(50mg/kg)麻醉，切開背部正中線皮膚，分離背部T7-T9肌肉並移除T7-T9椎板。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組將顯微血管夾（3.5×1.0mm，瑞沃德）夾於T8脊髓處1分鐘；假手術組只移除椎板，避免造成硬脊膜損傷。所有小鼠手術處理後立即縫合，肌肉注射Tolfedine(0.1mg/kg)及青黴素鉀（4萬單位/kg）後置於加熱墊上直至其蘇醒。手術過程中預防感染，術後手動協助小鼠排尿直至自主排尿 ^[1]。手術後30分鐘開始給藥，給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS，假手術組小鼠不做給藥處理。開始給藥第1天，給藥周期爲7天。給藥第8天，解剖小鼠取脊髓T7-T9段於4%多聚甲醛固定。固定後的組織樣本經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。脊髓組織橫切切片厚度爲4μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化後氨水返藍併酒精梯度脫水封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，假手術組(圖1A)神經元及神經纖維均呈正常形態，胞漿紅染；給溶媒PBS對照組(圖1B)及給纖溶酶原組採集正常神經及損傷神經交界的部位給溶媒PBS對照組在交界區可見較大部位的損傷空洞（三角形標識），而給纖溶酶原組(圖1C)損傷部位的神經修復程度明顯較之於給溶媒PBS對照組好，未見明顯的空洞。說明纖溶酶原能夠明顯促進脊髓壓迫損傷模型小鼠脊髓損傷神經的修復。

實施例 2 纖溶酶原促進神經髓鞘的再生

取8周齡C57雌性小鼠15隻稱重後隨機分三組，分別爲假手術組、給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(50mg/kg)麻醉，切開背部正中線皮膚，分離背部T7-T9肌肉並移除T7-T9椎板。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組將顯微血管夾（3.5×1.0mm，瑞沃德）夾於T8脊髓處1分鐘；假手術組只移除椎板，避免造成硬脊膜損傷。所有小鼠手術處理後立即縫合，肌肉注射Tolfedine(0.1mg/kg)及青黴素鉀（4萬單位/kg）後置於加熱墊上直至其蘇醒。手術過程中預防感染，術後手動協助小鼠排尿直至自主排尿 ^[1]。手術後30分鐘開始給藥，給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS，假手術組小鼠不做給藥處理。開始給藥第1天，給藥周期爲7天。給藥第8天，解剖小鼠取脊髓T7-T9段於4%多聚甲醛固定。固定後的組織樣本經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。脊髓組織橫切切片厚度爲4μm，脫蠟至水後，用髓鞘染色液進行LFB染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下，觀察拍照。

LFB（luxol fast blue）染色運用固藍染色法染髓鞘，藍色程度代表髓鞘量越多。LFB染色是研究皮質脊髓束定位、髓鞘病變、損傷和再生修復形態學觀察的有效方法 ^[2,3]。

結果顯示，假手術組(圖2A)神經髓鞘結構完整，連續；給溶媒PBS對照組(圖2B)神經髓鞘呈現明顯的較大面積的崩解(箭頭標識)，藍色較淺，髓鞘斷裂；與溶媒PBS對照組相比，給纖溶酶原組(圖2C)髓鞘結構明顯較完整，藍色加深。說明纖溶酶原能夠促進脊髓壓迫模型小鼠髓鞘的再生。

實施例 3 纖溶酶原促進脊髓神經絲蛋白的表達

取8周齡C57雌性小鼠15隻稱重後隨機分三組，分別爲假手術組、給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(50mg/kg)麻醉，切開背部正中線皮膚，分離背部T7-T9肌肉並移除T7-T9椎板。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組將顯微血管夾（3.5×1.0mm，瑞沃德）夾於T8脊髓處1分鐘；假手術組只移除椎板，避免造成硬脊膜損傷。所有小鼠手術處理後立即縫合，肌肉注射Tolfedine(0.1mg/kg)及青黴素鉀（4萬單位/kg）後置於加熱墊上直至其蘇醒。手術過程中預防感染，術後手動協助小鼠排尿直至自主排尿。手術後30分鐘開始給藥，給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS，假手術組小鼠不做給藥處理。開始給藥第1天，給藥周期爲7天。給藥第8天，解剖小鼠取脊髓T7-T9於4%多聚甲醛固定。固定後的組織樣本經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。檸檬酸修復30分鐘，室溫冷却10分鐘後水輕柔沖洗。以3%雙氧水培育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10%的羊血清（Vector laboratories，Inc., USA）封閉1小時；時間到後，棄除羊血清液。兔源抗神經絲蛋白（NFP）抗體（Abcam，ab207176）4℃培育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體（Abcam）二抗室溫培育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒（Vector laboratories， Inc.,USA）顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水返藍5分鐘，然後PBS洗1次。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

神經絲蛋白（Neurofilament protein,NFP）是構成神經細胞軸突中間絲的蛋白質。其功能是提供彈性使神經纖維易於伸展和防止斷裂，在維持細胞骨架、穩定細胞形態和軸突轉運方面均有十分重要意義 ^[4]。

結果顯示，給纖溶酶原組（圖3C）NFP的表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組(圖3B)， NFP表達更加接近假手術組小鼠(圖3A)。說明纖溶酶原能夠促進NFP的表達，促進脊髓壓迫損傷模型小鼠脊髓神經纖維的再生。

實施例 4 纖溶酶原促進神經損傷的修復

取8周齡Plg-/-雌性小鼠10隻稱重後隨機分爲兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(50mg/kg)麻醉，切開背部正中線皮膚，分離背部T7-T9肌肉並移除T7-T9椎板。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組將顯微血管夾（3.5×1.0mm，瑞沃德）夾於T8脊髓處1分鐘。所有小鼠手術處理後立即縫合，肌肉注射Tolfedine(0.1mg/kg)及青黴素鉀（4萬單位/kg）後置於加熱墊上直至其蘇醒。手術過程中預防感染，術後手動協助小鼠排尿直至自主排尿 ^[1]。手術後30分鐘開始給藥，給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS。開始給藥第1天，連續給藥7天。給藥第8天，解剖小鼠取脊髓T7-T9段於4%多聚甲醛固定。固定後的組織樣本經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。脊髓組織橫切切片厚度爲4μm，切片脫蠟複水併用蘇木素和伊紅染色(H&E染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，併酒精梯度脫水封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，假手術組（圖4A）神經元及神經纖維均呈正常形態，胞漿紅染；給溶媒PBS對照組（圖4B）及給纖溶酶原組(圖4C)採集正常神經及損傷神經交界的部位，可見二者在損傷部位正常的神經元及神經纖維結構均消失，代之以修復的纖維，胞漿淡染，炎細胞浸潤，但溶媒PBS對照組在交界區可見較大部位的損傷空洞(三角形標識)，而給纖溶酶原組損傷部位的修復程度明顯較之於溶媒PBS對照組好，未見明顯的空洞，炎細胞浸潤亦明顯減輕。說明纖溶酶原能夠明顯促進脊髓壓迫神經損傷模型Plg-/-小鼠脊髓損傷的修復。

實施例 5 纖溶酶原促進 Plg-/- 小鼠脊髓壓迫損傷模型小鼠神經髓鞘的再生

取8周齡Plg-/-雌性小鼠10隻稱重後隨機分爲兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(50mg/kg)麻醉，切開背部正中線皮膚，分離背部T7-T9肌肉並移除T7-T9椎板。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組將顯微血管夾（3.5×1.0mm，瑞沃德）夾於T8脊髓處1分鐘。所有小鼠手術處理後立即縫合，肌肉注射Tolfedine(0.1mg/kg)及青黴素鉀（4萬單位/kg）後置於加熱墊上直至其蘇醒。手術過程中預防感染，術後手動協助小鼠排尿直至自主排尿 ^[1]。手術後30分鐘開始給藥，給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS。開始給藥第1天，連續給藥7天。給藥第8天，解剖小鼠取脊髓T7-T9段於4%多聚甲醛固定。固定後的組織樣本經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。脊髓組織橫切切片厚度爲4μm，脫蠟至水後，用髓鞘染色液進行LFB染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下，觀察拍照。

結果顯示，給溶媒PBS對照組（圖5A）神經髓鞘呈現明顯的較大面積的崩解(三角形標識)，藍色較淺，髓鞘斷裂（箭頭標識），與之相比，給纖溶酶原組（圖5B）髓鞘結構明顯較完整，連續，藍色較深。說明纖溶酶原能夠明顯促進脊髓壓迫神經損傷模型Plg-/-小鼠髓鞘的再生。

實施例 6 纖溶酶原促進脊髓壓迫損傷模型小鼠痛覺恢復

取7周齡C57BL/6J雌性小鼠38隻，造模前一天稱量體重，根據體重結果隨機分爲2組，假手術組7隻，模型組31隻。所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(50mg/kg)麻醉，切開背部正中線皮膚，分離背部T5-T8肌肉並移除T6-T7椎板。模型組將顯微血管夾（30g，Kent Scientific Corporation）夾於T6-T7脊髓處1分鐘，鑷子應插入椎骨通道，尖端位於椎板的頂部，形成90°角 ^[5]；假手術組只移除椎板，避免造成硬脊膜損傷。所有小鼠手術處理後立即縫合，肌肉注射Tolfedine(0.1mg/kg)及青黴素鉀（4萬單位/kg）後置於加熱墊上直至其蘇醒。手術過程中預防感染，術後手動協助小鼠排尿直至自主排尿，持續觀察7天。手術後7天後所有小鼠進行體重及BMS評分（兩個人分別進行盲法評分） ^[5]，根據體重和BMS評分模型組小鼠隨機分爲三組，給藥A組、給藥B組、溶媒對照組並開始給藥，定爲給藥第1天，給藥A組小鼠按照1mg/100μl /隻尾靜脈注射纖溶酶原溶液，給藥B組小鼠按照0.5mg/100μl/隻尾靜脈注射纖溶酶原溶液，溶媒對照組小鼠按照100μl/隻尾靜脈注射溶媒溶液，持續給藥6天。第7天，對小鼠的左腿進行Von-Frey機械觸痛檢測。

結果顯示，與假手術組小鼠相比溶媒組小鼠機械閾值明顯升高，說明建立脊髓壓迫損傷模型後，小鼠疼痛感覺丟失；給藥A組（1mg）和給藥B組（0.5mg）小鼠痛覺閾值明顯低於溶媒組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05,**表示P＜0.01）（圖6）。該結果表明纖溶酶原能夠促進脊髓壓迫損傷模型小鼠痛覺恢復。

實施例 7 纖溶酶原促進截癱模型小鼠脊髓神經絲蛋白表達

8-10周齡的C57雌性小鼠32隻，造模前進行稱重，根據體重所有小鼠隨機分爲2組，假手術組8隻小鼠，模型組24隻小鼠。模型組小鼠術前在舒泰50淺麻下將小鼠背部的被毛去除，之後使用呼吸麻醉術將小鼠完全麻醉，俯臥位放置於開啓2.5%異氟烷的呼吸麻醉機上。手術打開皮膚和肌肉，暴露T9和T10段，行椎板摘除術，暴露脊髓後，將T9與 T10之間脊髓沿冠狀面橫切右半邊造成半橫斷損傷，完成後縫合傷口。假手術組小鼠相同方式麻醉後，進行椎板摘除術，之後直接縫合。所有術後小鼠置加熱墊上至小鼠清醒。術後護理，包括每天注射止痛藥Tolfedine及青黴素鉀（4萬單位/kg），共4天；保證小鼠獲取食物和飲水，幫助小鼠排出尿液至恢復膀胱自主排尿功能 ^[6]。手術造模完成一周後，對手術後小鼠進行曠場行爲學檢測，並進行評分，根據檢測結果將模型組小鼠隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組各12隻小鼠；假手術組小鼠不作分組處理。分組完成後，溶媒組及假手術組小鼠按照0.1ml/隻/天尾靜脈注射溶媒，給藥組小鼠按照1mg/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，記爲給藥第1天，持續給藥28天。第29天犧牲小鼠，取材造模處脊髓於4%多聚甲醛固定。固定後的組織樣本經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。檸檬酸修復30分鐘，室溫冷却10分鐘後水輕柔沖洗。以3%雙氧水培育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10%的羊血清（Vector laboratories，Inc.,USA）封閉1小時；時間到後，棄除羊血清液。兔源抗神經絲蛋白（NFP）抗體（Abcam，ab207176）4℃培育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體（Abcam）二抗室溫培育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒（Vector laboratories， Inc.,USA）顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水返藍5分鐘，然後PBS洗1次。梯度脫水透明並封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，假手術組小鼠（圖7A）脊髓表達一定水平的NFP（箭頭標識），溶媒組小鼠（圖7B）造模處脊髓NFP的表達明顯少於假手術組小鼠，給藥組小鼠（圖7C）造模處脊髓NFP的表達明顯高於溶媒組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）（圖7D）。提示纖溶酶原能夠促進脊髓橫斷模型小鼠脊髓NFP的表達。

實施例 8 纖溶酶原改善截癱模型小鼠後肢運動功能

8-10周齡的C57雌性小鼠42隻，造模前進行稱重，根據體重所有小鼠隨機分爲2組，假手術組14隻小鼠，模型組28隻小鼠。取實驗小鼠，預麻後將小鼠背部的被毛去除，之後使用呼吸麻醉術將小鼠完全麻醉，俯臥位放置於開啓2.5%異氟烷的呼吸麻醉機上。手術打開皮膚和肌肉，暴露T9和T10段，行椎板摘除術，暴露脊髓後，將T9與 T10之間脊髓沿冠狀面橫切右半邊造成半橫斷損傷，完成後縫合傷口。假手術組小鼠以相同方式麻醉後，手術打開皮膚和肌肉，暴露T9和T10段，之後直接縫合。在術前、術後24、72小時給與止痛劑Tolfedine及青黴素鉀（20萬單位/kg，8萬單位/ml）。所有術後小鼠置加熱墊上，需維持頸部水平，勿使頸部彎曲直至小鼠清醒。術後護理：正常動物每日約需40-80ml/kg液體，麻醉蘇醒後，若發現小鼠無法進食或喝水，必須腹腔注射給予生理鹽水補充體液。幫助小鼠排出尿液至恢復膀胱自主排尿功能 ^[6]。爲防止動物術後當日傷口受糞、尿、墊料污染，需於PC盒內墊料上放置一張乾淨拭紙。手術造模完成三天後，對手術後小鼠進行曠場行爲學檢測，並進行評分，根據檢測結果將模型組28隻小鼠隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組各14隻小鼠；假手術組小鼠不作分組處理。分組完成後，溶媒組及假手術組小鼠按照0.1ml/隻/天尾靜脈注射溶媒，給藥組小鼠按照1mg/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，記爲給藥第1天，持續給藥7天。第8天進行按表1進行Basso Mouse Scale（BMS）檢測。

BMS 評分專用於評價脊髓損傷小鼠後肢功能的變化， 包括主、副評分系統 ：主評分是觀察小鼠的後肢踝關節活動度、 協調性、 脚爪姿態 、 軀幹穩定性和尾巴姿態後計分， 副評分是根據協調性、穩定性等對主評分補充修正 ^[7]。

BMS(Basso Mouse Scale)評分
0分	無關節活動
1分	輕微關節活動
2分	大幅度關節活動
3分	爪子脚底著地或者沒有重量支持，或者偶而，頻繁，或者一直依靠背部移動，但沒有走步
4分	偶而脚底行走
5分	頻繁或者一直脚底行走，協調性差；頻繁或者一直脚底行走，有一些協調，脚底初次接觸時爪子能旋轉
6分	頻繁或者一直脚底行走，有一定的協調性，在初次接觸時，脚掌平行；一直脚底行走，協調性好，脚底初次接觸時爪子能旋轉
7分	頻繁或者一直脚底行走，協調性較好，脚掌平行；頻繁或者一直脚底行走，協調性較好，脚掌平行，嚴重的肢體平衡性
8分	頻繁或者一直脚底行走，協調性較好，脚掌平行，具有輕微的肢體平衡性；頻繁或者一直脚底行走，協調性較好，脚掌平行，具有輕微的肢體平衡性，正常的肢體平衡性和尾巴向下或都上或下
9分	頻繁或者一直脚底行走，協調性較好，脚掌平行，具有輕微的肢體平衡性，尾巴總是向上

結果顯示，假手組小鼠BMS評分均爲9分，溶媒組小鼠BMS評分爲6.75±1.92分，明顯低於假手術組小鼠，給藥組小鼠BMS評分爲8.29±0.39分，明顯高於溶媒組小鼠，且統計差異顯著（*表示P＜0.05，***表示P＜0.001）（圖8）。提示纖溶酶原能夠促進截癱模型小鼠後肢運動功能恢復。

實施例9 纖溶酶原促進截癱模型小鼠脊髓纖溶酶原基因轉錄

8周齡的雌性C57小鼠15隻，造模前進行稱重，根據體重所有小鼠隨機分爲2組，空白對照組5隻小鼠，模型組10隻小鼠。取實驗小鼠，預麻後將小鼠背部的被毛去除，之後使用呼吸麻醉術將小鼠完全麻醉，俯臥位放置於開啓2.5%異氟烷的呼吸麻醉機上。手術打開皮膚和肌肉，暴露T9和T10段，行椎板摘除術，暴露脊髓後，將T9與 T10之間脊髓沿冠狀面橫切右半邊造成半橫斷損傷，完成後縫合傷口。空白對照組小鼠相同方式麻醉後，手術打開皮膚和肌肉，暴露T9和T10段，之後直接縫合 ^[6]在術前、術後24、72小時給與止痛劑Tolfedine及青黴素鉀（20萬單位/kg，8萬單位/ml）。所有術後小鼠置加熱墊上，需維持頸部水平，勿使頸部彎曲直至小鼠清醒。術後護理：正常動物每日約需40-80ml/kg液體，麻醉蘇醒後，若發現小鼠無法進食或喝水，必須腹腔注射給予生理鹽水補充體液。幫助小鼠排出尿液至恢復膀胱自主排尿功能。爲防止動物術後當日傷口受糞、尿、墊料污染，需於PC盒內墊料上放置一張乾淨拭紙。手術造模完成三天後，對手術後小鼠進行曠場行爲學檢測，並進行評分，根據檢測結果將模型組10隻小鼠隨機分爲兩組，溶媒組5隻小鼠，給藥組5隻小鼠；空白對照組不作分組處理。分組完成後，所有實驗小鼠按照50mg/kg /天的注射劑量尾靜脈注射，給藥組注射纖溶酶原溶液（10mg/ml），空白對照組及溶媒組注射溶媒。給藥6小時後犧牲小鼠，取材造模處脊髓勻漿後行Plg基因轉錄mRNA的RT-PCR檢測，記錄CT值，引物信息見下表1。計算200ng總RNA中Plg基因轉錄mRNA的CT值。

靶標	引物名稱	引物	長度
Plg	Plg-F（序列15）	GACCAGTCAGATTCCTCAGTTC	117
Plg-R（序列16）	CTTCTTCCCTGTGATGGTAGTG

CT 值：表示每個 PCR 反應管內螢光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，各模板的 CT 值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關係，起始拷貝數越多，CT 值越小。反之亦然。

結果顯示，空白對照組小鼠脊髓具有一定水平的Plg mRNA，給藥組小鼠脊髓Plg mRNA水平明顯多於溶媒組，且統計差異接近顯著(P=0.051)（圖9）。提示纖溶酶原能夠促進截癱模型小鼠脊髓纖溶酶原基因轉錄。

實施例 10 纖溶酶原促進截癱模型小鼠損傷脊髓突觸素的表達

8-10周齡的C57雌性小鼠42隻，造模前進行稱重，根據體重所有小鼠隨機分爲2組，假手術組14隻小鼠，模型組28隻小鼠。取實驗小鼠，預麻後將小鼠背部的被毛去除，之後使用呼吸麻醉術將小鼠完全麻醉，俯臥位放置於開啓2.5%異氟烷的呼吸麻醉機上。手術打開皮膚和肌肉，暴露T9和T10段，行椎板摘除術，暴露脊髓後，將T9與 T10之間脊髓沿冠狀面橫切右半邊造成半橫斷損傷，完成後縫合傷口。假手術組小鼠以相同方式麻醉後，手術打開皮膚和肌肉，暴露T9和T10段，之後直接縫合。在術前、術後24、72小時給與止痛劑Tolfedine及青黴素鉀（20萬單位/kg，8萬單位/ml）。所有術後小鼠置加熱墊上，需維持頸部水平，勿使頸部彎曲直至小鼠清醒。術後護理：正常動物每日約需40-80ml/kg液體，麻醉蘇醒後，若發現小鼠無法進食或喝水，必須腹腔注射給予生理鹽水補充體液。幫助小鼠排出尿液至恢復膀胱自主排尿功能[6]。爲防止動物術後當日傷口受糞、尿、墊料污染，需於PC盒內墊料上放置一張乾淨拭紙。手術造模完成三天後，對手術後小鼠進行曠場行爲學檢測，並進行評分，根據檢測結果將模型組28隻小鼠隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組各14隻小鼠；假手術組小鼠不作分組處理。分組完成後，溶媒組及假手術組小鼠按照0.1ml/隻/天尾靜脈注射溶媒，給藥組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，記爲給藥第1天，持續給藥28天。第30天犧牲小鼠取材損傷部位脊髓於10%甲醛溶液固定。固定後的組織樣本經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。檸檬酸修復30分鐘，室溫冷却10分鐘後水輕柔沖洗。以3%雙氧水培育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10%的羊血清（Vector laboratories，Inc.,USA）封閉1小時；時間到後，棄除羊血清液。兔源抗突觸素蛋白抗體（武漢三鷹，10842-1-AP）4℃培育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體（Abcam）二抗室溫培育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒（Vector laboratories， Inc.,USA）顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水返藍5分鐘，然後PBS洗1次。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

突觸素亦稱突觸囊泡蛋白、突觸生長素、突觸體素等。是一種位於突觸囊泡膜上，分子量爲38KDa的鈣結合蛋白，與突觸結構和功能密切相關的膜蛋白。它廣泛存在於機體所有神經終末，特異性地分布於突觸前囊泡膜上，參與鈣離子依賴的神經遞質釋放和突觸囊泡的循環，被認爲是突觸發生和突觸重塑的重要標誌[8]。

結果顯示，假手術組小鼠（圖10A）脊髓表達一定水平的突觸素（箭頭標識），溶媒組小鼠（圖10B）造模處脊髓突觸素水平明顯低於假手術組小鼠，兩組比較統計差異極爲顯著（***表示P＜0.001）。給藥組（圖10C）小鼠造模處脊髓突觸素水平明顯高於溶媒組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）（圖10D）。說明纖溶酶原能夠促進截癱模型小鼠損傷脊髓突觸素表達，促進脊髓損傷修復。

實施例11纖溶酶原促進截癱模型小鼠損傷脊髓神經元功能狀態恢復

8-10周齡的C57雌性小鼠42隻，造模前進行稱重，根據體重所有小鼠隨機分爲2組，假手術組14隻小鼠，模型組28隻小鼠。取實驗小鼠，預麻後將小鼠背部的被毛去除，之後使用呼吸麻醉術將小鼠完全麻醉，俯臥位放置於開啓2.5%異氟烷的呼吸麻醉機上。手術打開皮膚和肌肉，暴露T9和T10段，行椎板摘除術，暴露脊髓後，將T9與 T10之間脊髓沿冠狀面橫切右半邊造成半橫斷損傷，完成後縫合傷口。假手術組小鼠以相同方式麻醉後，手術打開皮膚和肌肉，暴露T9和T10段，之後直接縫合。在術前、術後24、72小時給與止痛劑Tolfedine及青黴素鉀（20萬單位/kg，8萬單位/ml）。所有術後小鼠置加熱墊上，需維持頸部水平，勿使頸部彎曲直至小鼠清醒。術後護理：正常動物每日約需40-80ml/kg液體，麻醉蘇醒後，若發現小鼠無法進食或喝水，必須腹腔注射給予生理鹽水補充體液。幫助小鼠排出尿液至恢復膀胱自主排尿功能[6]。爲防止動物術後當日傷口受糞、尿、墊料污染，需於PC盒內墊料上放置一張乾淨拭紙。手術造模完成三天後，對手術後小鼠進行曠場行爲學檢測，並進行評分，根據檢測結果將模型組28隻小鼠隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組各14隻小鼠；假手術組小鼠不作分組處理。分組完成後，溶媒組及假手術組小鼠按照0.1ml/隻/天尾靜脈注射溶媒，給藥組小鼠按照1mg/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，記爲給藥第1天，持續給藥28天。固定後的紋狀體組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，脫蠟至水後，用0.4%焦油紫染液（pH=3）進行染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片在400倍光學顯微鏡下觀察拍照。

尼氏體又稱嗜染質，是神經細胞所特有的結構，由許多平行排列的粗面內質網和分布期間的游離核糖體組成，具有合成蛋白的功能，其數量和分布與神經元的功能狀態密切相關，被視爲神經細胞活性的標誌 ^[9]。

結果顯示，假手術組小鼠（圖11A）脊髓具有一定水平尼氏體（箭頭標識），溶媒組小鼠（圖11B）造模處脊髓尼氏體水平明顯高於假手術組小鼠，兩組比較統計差異極爲顯著（***表示P＜0.001）。給藥組（圖11C）小鼠造模處脊髓尼氏體水平明顯低於溶媒組，且統計差異顯著（**表示P＜0.01）（圖11D）。說明纖溶酶原能夠促進截癱模型小鼠損傷脊髓尼氏體水平恢復，促進脊髓損傷修復。

序列表：

序列1：

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無

圖1A-C脊髓壓迫損傷模型小鼠給予纖溶酶原7天後脊髓H&E染色代表性圖片。A爲假手術組，B爲給溶媒PBS對照組，C爲給纖溶酶原組。結果顯示，假手術組神經元及神經纖維均呈正常形態，胞漿紅染；給溶媒PBS對照組及給纖溶酶原組採集正常神經及損傷神經交界的部位，給溶媒PBS對照組在交界區可見較大部位的損傷空洞（三角形標識），而給纖溶酶原組損傷部位的神經修復程度明顯較之於給溶媒PBS對照組好，未見明顯的空洞。說明纖溶酶原能夠明顯促進脊髓壓迫損傷模型小鼠脊髓損傷神經的修復。

圖2A-C 脊髓壓迫損傷模型小鼠給予纖溶酶原7天脊髓LFB染色代表性圖片。A爲假手術組，B爲給溶媒PBS對照組，C爲給纖溶酶原組。結果顯示，假手術組(圖2A)神經髓鞘結構完整，連續；給溶媒PBS對照組(圖2B)神經髓鞘呈現明顯的較大面積的崩解(箭頭標識)，藍色較淺，髓鞘斷裂；與溶媒PBS對照組相比，給纖溶酶原組(圖2C)髓鞘結構明顯較完整，藍色加深。說明纖溶酶原能夠促進脊髓壓迫模型小鼠髓鞘的再生。

圖3A-C 脊髓壓迫損傷模型小鼠給予纖溶酶原7天脊髓神經絲蛋白（NFP）染色代表性圖片。A爲假手術組，B爲給溶媒PBS對照組，C爲給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組NFP的表達（箭頭標識）明顯多於給溶媒PBS對照組， NFP表達更加接近假手術組小鼠。說明纖溶酶原能夠促進NFP表達，促進脊髓壓迫損傷模型小鼠脊髓神經纖維再生。

圖4 A-B脊髓壓迫損傷模型Plg-/-小鼠給予纖溶酶原7天脊髓H&E染色代表性圖片。A爲給溶媒PBS對照組，B爲給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組及給纖溶酶原組採集正常神經及損傷神經交界的部位，可見二者在損傷部位正常的神經元及神經纖維結構均消失，代之以修復的纖維，胞漿淡染，炎細胞浸潤，但給溶媒PBS對照組在交界區可見較大部位的損傷空洞(三角形標識)，而給纖溶酶原組損傷部位的修復程度明顯較之於給溶媒PBS對照組好，未見明顯的空洞，炎細胞浸潤亦明顯減輕。說明纖溶酶原能夠明顯促進脊髓壓迫神經損傷模型Plg-/-小鼠脊髓損傷的修復。

圖5A-B 脊髓壓迫損傷模型Plg-/-小鼠給予纖溶酶原7天脊髓LFB染色代表性圖片。A爲給溶媒PBS對照組，B爲給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組神經髓鞘呈現明顯的較大面積的崩解(三角形標識)，藍色較淺，髓鞘斷裂（箭頭標識），與之相比，給纖溶酶原組髓鞘結構明顯較完整，連續，藍色較深。說明纖溶酶原能夠明顯促進脊髓壓迫神經損傷模型Plg-/-小鼠髓鞘損傷修復。

圖6脊髓壓迫損傷模型C57小鼠給予纖溶酶原6天Von-frey 機械疼痛閾值檢測結果。結果顯示，與假手術組小鼠相比溶媒組小鼠機械閾值明顯升高，說明建立脊髓壓迫模型後，小鼠疼痛感覺丟失；給藥A組（1mg）和給藥B組（0.5mg）小鼠痛覺閾值明顯低於溶媒組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05,**表示P＜0.01）。該結果表明纖溶酶原能夠促進脊髓壓迫模型小鼠痛覺恢復。

圖7A-D給予纖溶酶原28天，脊髓橫斷模型小鼠脊髓NFP免疫組化染色結果。A爲假手術組，B爲給溶媒PBS對照組（亦稱溶媒組，以下相同），C爲給纖溶酶原組（亦稱給藥組，以下相同），D爲平均光密度定量分析結果。結果顯示，假手術組小鼠脊髓表達一定水平的NFP（箭頭標識），溶媒組小鼠）造模處脊髓NFP的表達明顯少於假手術組小鼠，給藥組小鼠造模處脊髓NFP的表達明顯高於溶媒組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）。提示纖溶酶原能夠促進脊髓橫斷模型小鼠脊髓NFP的表達。

圖8 脊髓橫斷模型小鼠BMS評分結果。結果顯示，假手組小鼠BMS評分均爲9分，溶媒組小鼠BMS評分爲6.75±1.92分，明顯低於假手術組小鼠，給藥組小鼠BMS評分爲8.29±0.39分，明顯高於溶媒組小鼠，且統計差異顯著（*表示P＜0.05，***表示P＜0.001）。提示纖溶酶原能夠促進截癱模型小鼠後肢運動功能恢復。

圖9 給藥纖溶酶原6小時後脊髓橫斷模型小鼠損傷脊髓纖溶酶原mRNA RT-PCR檢測結果。結果顯示，空白對照組小鼠脊髓具有一定水平的纖溶酶原 mRNA，給藥組小鼠脊髓纖溶酶原 mRNA水平明顯多於溶媒組，且統計差異接近顯著(P=0.051）。提示纖溶酶原能夠促進截癱模型小鼠脊髓纖溶酶原基因轉錄。

圖10A-D 給予纖溶酶原28天，脊髓橫斷模型小鼠脊髓突觸素免疫組化染色結果。A爲假手術組，B爲溶媒組，C爲給藥組，D爲平均光密度定量分析結果。結果顯示，假手術組小鼠脊髓表達一定水平的突觸素（箭頭標識），溶媒組小鼠造模處脊髓突觸素水平明顯低於假手術組小鼠，兩組比較統計差異極爲顯著（***表示P＜0.001）。給藥組小鼠造模處脊髓突觸素水平明顯高於溶媒組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）。說明纖溶酶原能夠促進截癱模型小鼠損傷脊髓突觸素表達，促進脊髓損傷修復。

圖11A-D給予纖溶酶原28天，脊髓橫斷模型小鼠脊髓尼氏染色結果。結果顯示，假手術組小鼠脊髓具有一定水平尼氏體（箭頭標識），溶媒組小鼠造模處脊髓尼氏體水平明顯高於假手術組小鼠，兩組比較統計差異極爲顯著（***表示P＜0.001）。給藥組小鼠造模處脊髓尼氏體水平明顯低於溶媒組，且統計差異極爲顯著（**表示P＜0.01）。說明纖溶酶原能夠促進截癱模型小鼠損傷脊髓尼氏體水平恢復，促進脊髓損傷修復。

無

Claims (15)

1. 一種治療神經損傷的方法，包括給藥受試者治療有效量的選自如下的一種或多種化合物：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。
2. 如請求項1所述的方法，其中所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自纖維蛋白溶酶原、重組人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、微纖溶酶（micro-plasmin）、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶（delta-plasmin）、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。
3. 如請求項1所述的方法，所述神經損傷爲中樞神經損傷或外周神經損傷。
4. 如請求項1-3任一項所述的方法，其中所述化合物促進損傷神經的修復。
5. 如請求項1-4任一項所述的方法，其中所述化合物促進神經髓鞘的再生。
6. 如請求項1-5任一項所述的方法，其中所述化合物促進脊髓神經絲蛋白的表達和神經纖維再生。
7. 如請求項1-6任一項所述的方法，其中所述化合物促進感覺神經功能恢復或運動神經功能恢復。
8. 如請求項7所述的方法，其中所述化合物促進痛覺恢復。
9. 如請求項1-8任一項所述的方法，其中所述化合物促進神經突觸素的表達。
10. 如請求項1-9任一項所述的方法，其中所述化合物促進損傷的神經細胞尼氏體水平的恢復。
11. 如請求項1-10任一項所述的方法，其中所述化合物爲纖溶酶原。
12. 如請求項1-11任一項所述的方法，其中所述纖溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且具有纖溶酶原的蛋白水解活性。
13. 如請求項12所述的方法，其中所述纖溶酶原爲序列2所述纖溶酶原的保守取代變體。
14. 如請求項1-13任一項所述的方法，所述纖溶酶原包含與序列14所示的纖溶酶原活性片段具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的氨基酸序列、並且具有纖溶酶原的蛋白水解活性。
15. 如請求項1-14任一項所述的方法，所述纖溶酶原爲天然或合成的人全長纖溶酶原。