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TWI897893B - 含有血清白蛋白與生長激素之融合蛋白質之水性醫藥組成物 - Google Patents

含有血清白蛋白與生長激素之融合蛋白質之水性醫藥組成物

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TWI897893B
TWI897893B TW109137787A TW109137787A TWI897893B TW I897893 B TWI897893 B TW I897893B TW 109137787 A TW109137787 A TW 109137787A TW 109137787 A TW109137787 A TW 109137787A TW I897893 B TWI897893 B TW I897893B
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hgh
amino acid
hsa
concentration
fusion protein
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TW109137787A
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TW202131944A (zh
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岡部真二
山口裕加
安川秀仁
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日商Ｊｃｒ製藥股份有限公司
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Abstract

本發明的課題係提供一種水性醫藥組成物，其含有：血清白蛋白與生長激素連結而成的蛋白質。 本發明的解決手段係一種水性醫藥組成物，其係含有人類血清白蛋白與人類生長激素之融合蛋白質作為有效成分而成之水性醫藥組成物，該蛋白質的濃度為10～100mg/mL，蔗糖的濃度為10～150mg/mL，非離子性界面活性劑的濃度為0.15～10mg/mL，防腐劑的濃度為0.5～12mg/mL，緩衝劑的濃度為1～30mM，pH為5.0～8.0。

Description

含有血清白蛋白與生長激素之融合蛋白質之水性醫藥組成物
本發明係關於例如含有血清白蛋白與生長激素之融合蛋白質作為有效成分的醫藥之在溶液狀態下儲存穩定的水性醫藥組成物，更詳細而言，係關於進一步含有蔗糖與非離子性界面活性劑作為穩定劑之水性醫藥組成物。
人類生長激素(hGH)係在視丘下部的控制下由腦下垂體前葉所分泌之蛋白質。hGH除了顯示軟骨形成促進、蛋白質同化促進等生長促進活性以外，亦顯示體組成及脂質代謝改善作用。於hGH的分泌少的兒童，生長激素缺乏性侏儒症會發病，其相較於正常健康兒童呈現低身高。
含有使用導入有hGH基因的大腸桿菌而作為重組蛋白質所製造之分子量約22KD的hGH作為有效成分之製劑(hGH製劑)，被廣泛地臨床應用作為以下疾病的治療劑：生長激素缺乏性侏儒症、透納氏症候群(Turner syndrome)中之侏儒症、SGA(胎兒小於妊娠年齡(Small-for-Gestational Age))性侏儒症、努南氏症候群(Noonan syndrome)中之侏儒症、由慢性腎衰竭所致之侏儒症、普威二氏症候群(Prader-Willi syndrome)中之侏儒症、軟骨發育不全症中之侏儒症。在此等疾病中不伴隨骨骺閉合之情形，hGH製劑特別會發揮效果。hGH製劑係被投予至皮下或肌肉內而在血中循環，藉由其生長促進活性而發揮促進患者生長的效果。又，hGH製劑亦被廣泛地臨床應用作為成人生長激素缺乏症的治療劑。在成人生長激素缺乏症的患者中，雖觀察到脂質代謝異常等各種異常，但藉由hGH製劑的投予，而患者的脂質代謝會正常化等，改善患者的QOL。作為對於生長激素缺乏性侏儒症、成人生長激素缺乏症等之hGH製劑，例如有GROWJECT(註冊商標)。
hGH在血漿中的半衰期被認為小於20分鐘，投予至患者的hGH係迅速地從血中消失。因此，為了使hGH的藥效在患者中實質地發揮，需要對患者以一週3次肌肉內或每日皮下來投予hGH。此種頻繁的投予係成為患者的負擔。因此，只要可使hGH在血漿中的穩定性增加而延長半衰期，藉此減少對患者投予hGH的次數，則可減輕患者的負擔而較佳。
人類血清白蛋白(HSA)，其成熟型為包含585個胺基酸之蛋白質。HSA係在血漿蛋白質之中量最多的成分，且在血漿中的半衰期長達14～20日。HSA有助於調節血漿的滲透壓，同時具有與血中的陽離子、脂肪酸、賀爾蒙類、膽紅素等內源性物質及藥劑等外源性物質結合並搬運該等的功能。一般而言，與HSA結合的物質係變得難以被臟器攝入，而變得可更長時間地在血中循環。
人類血清白蛋白(HSA)中，已知有複數種天然的變異體(variant)。人類血清白蛋白Redhill係其中之一(非專利文獻1、2)。相較於包含585個胺基酸之上述通常的人類血清白蛋白的胺基酸序列，人類血清白蛋白Redhill係在其從N端側起第320個胺基酸殘基不為丙胺酸而為蘇胺酸、且在其N端附加一個精胺酸殘基之點上不同，其包含586個胺基酸。藉由上述丙胺酸變化為蘇胺酸，而白蛋白Redhill在其胺基酸序列中產生以Asn-Tyr-Thr表示之序列，此序列中的Asn(天冬醯胺酸)殘基被N-鍵結型醣苷化。因此，觀察到相較於上述通常的人類血清白蛋白，白蛋白Redhill的分子量大2.5kDa左右。
已報導一種藉由使HSA與hGH結合而使hGH在血漿中的穩定性增加之方法(專利文獻1～8)。使HSA與hGH結合而成的蛋白質係藉由製作導入有表現載體的轉形細胞，且該表現載體已組入使編碼hGH的基因與編碼HSA的基因框內(in-frame)結合而成的DNA，並培養此細胞，而在培養基中或細胞內作為重組蛋白質被製作。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2017/154869 [專利文獻2]WO2017/159540 [專利文獻3]日本特表2003-530838號公報 [專利文獻4]日本特表2005-514060號公報 [專利文獻5]日本特表2000-502901號公報 [專利文獻6]日本特表2008-518615號公報 [專利文獻7]日本特表2013-501036號公報 [專利文獻8]日本特表2013-518038號公報
在上述背景下，本發明之一目的係提供一種水性醫藥組成物，其係含有人類白蛋白與人類生長激素之融合蛋白質作為有效成分之醫藥且其穩定到能在市場流通的程度。
本發明人等在追求上述目的之研究中反覆探討的結果，發現使包含下述胺基酸序列之變異體(人類血清白蛋白變異體)與人類生長激素(hGH)結合而得之化合物(人類血清白蛋白變異體-hGH融合蛋白質)，其在含有蔗糖與非離子性界面活性劑之水性醫藥組成物中為穩定，進而完成本發明：該胺基酸序列係相較於包含585個胺基酸之通常的人類血清白蛋白，其從N端起第320個胺基酸殘基之丙胺酸被蘇胺酸取代者。亦即，本發明係包含以下者。
1.一種水性醫藥組成物，其係含有人類血清白蛋白與人類生長激素之融合蛋白質作為有效成分而成之水性醫藥組成物，該融合蛋白質的濃度為10～100mg/mL，蔗糖的濃度為10～150mg/mL，非離子性界面活性劑的濃度為0.15～10mg/mL，防腐劑的濃度為0.5～12mg/mL，緩衝劑的濃度為1～30mM，pH為5.0～8.0。
2.如上述1所記載之水性醫藥組成物，其中該融合蛋白質的濃度為15～70mg/mL。
3.如上述1或2所記載之水性醫藥組成物，其中該蔗糖的濃度為50～100mg/mL。
4.如上述1至3中任一項所記載之水性醫藥組成物，其中該非離子性界面活性劑的濃度為1.5～4.5mg/mL。
5.如上述1至4中任一項所記載之水性醫藥組成物，其中該非離子性界面活性劑為聚山梨醇酯或泊洛沙姆(Poloxamer)。
6.如上述1至4中任一項所記載之水性醫藥組成物，其中該非離子性界面活性劑係選自包含聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80及聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇(Polyoxyethylene (160) polyoxypropylene (30) glycol)之群組者。
7.如上述1至6中任一項所記載之水性醫藥組成物，其中該防腐劑為酚。
8.如上述7所記載之水性醫藥組成物，其中該酚的濃度為3～9mg/mL。
9.如上述1至8中任一項所記載之水性醫藥組成物，其中該緩衝劑為磷酸緩衝劑。
10.如上述9所記載之水性醫藥組成物，其中該磷酸緩衝劑的濃度為2～20mM。
11.如上述1至10中任一項所記載之水性醫藥組成物，其中該pH為6.0～7.8。
12.如上述1至10中任一項所記載之水性醫藥組成物，其中該pH為6.5～7.6。
13.如上述1所記載之水性醫藥組成物，其中該融合蛋白質的濃度為10～100mg/mL，該蔗糖的濃度為75mg/mL，該非離子性界面活性劑為聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇，該聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的濃度為3mg/mL，該防腐劑為酚，該酚的濃度為6mg/mL，該緩衝劑為磷酸緩衝劑，該磷酸緩衝劑的濃度為10mM，該pH為7.0～7.4。
14.如上述1所記載之水性醫藥組成物，其中該融合蛋白質的濃度為15～70mg/mL，該蔗糖的濃度為75mg/mL，該非離子性界面活性劑為聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇，該聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的濃度為3mg/mL，該防腐劑為酚，該酚的濃度為6mg/mL，該緩衝劑為磷酸緩衝劑，該磷酸緩衝劑的濃度為10mM，該pH為7.0～7.4。
15.如上述1所記載之水性醫藥組成物，其中該融合蛋白質的濃度為50mg/mL，該蔗糖的濃度為75mg/mL，該非離子性界面活性劑為聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇，該聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的濃度為3mg/mL，該防腐劑為酚，該酚的濃度為6mg/mL，該緩衝劑為磷酸緩衝劑，該磷酸緩衝劑的濃度為10mM，該pH為7.0～7.4。
16.如上述1至15中任一項所記載之水性醫藥組成物，其中該融合蛋白質的胺基酸序列為與序列識別號11所示之胺基酸序列具有85%以上的一致性者。
17.如上述1至15中任一項所記載之水性醫藥組成物，其中該融合蛋白質的胺基酸序列為與序列識別號11所示之胺基酸序列具有90%以上的一致性者。
18.如上述1至15中任一項所記載之水性醫藥組成物，其中該融合蛋白質的胺基酸序列為與序列識別號11所示之胺基酸序列具有95%以上的一致性者。
19.如上述1至15中任一項所記載之水性醫藥組成物，其中該融合蛋白質的胺基酸序列為具有序列識別號11所示之胺基酸序列者。
若依據本發明，例如可將含有人類白蛋白與人類生長激素結合而成之蛋白質作為有效成分的醫藥作成能在市場流通的程度之穩定的水性醫藥組成物。
[用以實施發明的形態]
在本說明書中，僅稱為「人類血清白蛋白」或「HSA」時，除了包含序列識別號1所示之585個胺基酸殘基之通常的野生型人類血清白蛋白以外，只要係具有結合血中的內源性物質及藥劑等外源性物質而搬運的功能等之作為通常的野生型人類血清白蛋白的功能者，則亦無特別區別地包含HSA的變異體，該HSA的變異體係相當於對於序列識別號1所示之胺基酸序列有1個或複數個胺基酸殘基經取代、缺失及/或附加(在本說明書中，胺基酸殘基的「附加」，意指在序列的末端或內部追加殘基)者。以其他胺基酸殘基取代胺基酸殘基之情形，所取代的胺基酸殘基的個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，再更佳為1～3個。使胺基酸殘基缺失之情形，所缺失的胺基酸殘基的個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，再更佳為1～3個。例如，序列識別號1所示之胺基酸序列的N端或C端的胺基酸殘基缺失之包含584個胺基酸殘基的變異體亦包含在人類血清白蛋白中。又，亦可組合此等胺基酸殘基的取代與缺失。再者，亦可為在通常的野生型HSA或其變異體的胺基酸序列中或在該胺基酸序列的N端側或者C端側附加1個或複數個胺基酸殘基者。此時所附加之胺基酸殘基的個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，再更佳為1～3個。
作為組合此等胺基酸的取代、缺失及附加之3種類的變異之中至少二種類的變異而導入之HSA的變異體，較佳為具有下述胺基酸序列者：對於序列識別號1所示之胺基酸序列進行0～10個胺基酸殘基的缺失、0～10個胺基酸殘基取代成其他胺基酸殘基、以及0～10個胺基酸殘基的附加而成之胺基酸序列。更佳為，對於序列識別號1所示之胺基酸序列，該等所缺失、取代及/或附加之胺基酸殘基的個數較佳為分別5個以下，再更佳為3個以下。
在本發明中，「人類血清白蛋白Redhill」(HSA-Redhill)的用語，意指為人類血清白蛋白的變異體而包含序列識別號2所示之586個胺基酸殘基者。人類血清白蛋白Redhill相當於：對於包含序列識別號1所示之585個胺基酸之野生型人類血清白蛋白的胺基酸序列，從N端起第320個胺基酸殘基不為丙胺酸而為蘇胺酸，且在N端附加一個精胺酸殘基者。藉由此丙胺酸取代成蘇胺酸，而白蛋白Redhill在其胺基酸序列中產生以Asn-Tyr-Thr表示之序列部分，此序列部分中的Asn(天冬醯胺酸)殘基被N-鍵結型醣苷化。因此觀察到相較於通常的野生型白蛋白(序列識別號1)，白蛋白Redhill的分子量大2.5kDa左右。
在本發明中，「人類血清白蛋白變異體」(HSA變異體)的用語，係指相對於通常的野生型HSA(序列識別號1)之上述的變異體，但為序列識別號2所示之變異體(HSA-Redhill)以外者。本發明中較佳的HSA變異體，除了為野生型HSA的胺基酸序列的從N端起第320個丙胺酸取代成蘇胺酸者之序列識別號3所示者以外，只要為具有結合血中的內源性物質及藥劑等外源性物質而搬運的功能等之作為通常的野生型人類血清白蛋白的功能者，則亦包含具有下述胺基酸序列者：對於序列識別號3所示之胺基酸序列，有1個或複數個胺基酸殘基經取代成其他胺基酸殘基、缺失或附加的胺基酸序列，但該胺基酸序列係序列識別號3所示之胺基酸序列的從N端起第318個天冬醯胺酸殘基及第320個蘇胺酸殘基在此等2殘基之間經由脯胺酸以外的單一胺基酸殘基(X)而藉由肽鍵連結的狀態下被保存者。以其他胺基酸殘基取代該胺基酸序列中的胺基酸殘基之情形，所取代的胺基酸殘基的個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，再更佳為1～3個。使胺基酸殘基缺失之情形，所缺失的胺基酸殘基的個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，再更佳為1～3個。例如，可為序列識別號3所示之胺基酸序列的N端或C端的胺基酸殘基缺失之包含584個胺基酸殘基的變異體。又，可為組合此等胺基酸殘基的取代與缺失者。再者，亦可為在該等變異體的胺基酸序列中或在該胺基酸序列的N端側或者C端側附加1個或複數個胺基酸殘基者。亦即，可為對於序列識別號3所示之胺基酸序列，組合胺基酸的取代及缺失、及附加之3種類的變異之中至少二種類的變異而導入者，其進行0～10個胺基酸殘基的缺失、0～10個胺基酸殘基取代成其他胺基酸殘基、以及0～10個胺基酸殘基的附加。但是，序列識別號3所示之胺基酸序列的從N端起第318～320個胺基酸殘基必須為天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(「X」為脯胺酸以外的胺基酸殘基)，較佳為天冬醯胺酸-酪胺酸-蘇胺酸。此外，人類血清白蛋白變異體只要保持作為人類血清白蛋白的功能，則係包含在人類血清白蛋白中。於此，人類血清白蛋白變異體的胺基酸序列較佳為與序列識別號1所示之通常的野生型HSA的胺基酸序列具有85%以上的一致性，更佳為具有90%以上的一致性，再更佳為具有95%以上的一致性。
在本發明中，各種HSA變異體中之與通常的野生型HSA比較時的各變異的位置及其形式(缺失、取代、附加)，可藉由兩個HSA的胺基酸序列的比對而輕易地確認。此外，在本發明中，野生型HSA的胺基酸序列與加入變異的HSA的胺基酸序列之一致性，可使用周知的同源性計算演算法而輕易地算出。例如，作為該種演算法，有BLAST (Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990))、Pearson及Lipman的相似性檢索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988))、Smith及Waterman的局部同源性演算法(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等。
上述HSA的胺基酸序列中的胺基酸的利用其他胺基酸之取代，例如，係在胺基酸該等的側鏈及化學性質具相關性的胺基酸家族內所發生者。此種在胺基酸家族內的取代，可預測在HSA的功能上不會造成大的變化(亦即，為保留式胺基酸取代)。作為此種胺基酸家族，例如有以下者： (1)為酸性胺基酸之天冬胺酸與麩胺酸； (2)為鹼性胺基酸之組胺酸、離胺酸及精胺酸； (3)為芳香族胺基酸之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸； (4)為具有羥基的胺基酸(羥基胺基酸)之絲胺酸與蘇胺酸； (5)為疏水性胺基酸之甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸； (6)為中性的親水性胺基酸之半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸及麩醯胺酸； (7)為影響肽鏈的配向的胺基酸之甘胺酸與脯胺酸； (8)為醯胺型胺基酸(極性胺基酸)之天冬醯胺酸與麩醯胺酸； (9)為脂肪族胺基酸之丙胺酸、白胺酸、異白胺酸及纈胺酸； (10)為側鏈小的胺基酸之丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸及蘇胺酸； (11)為側鏈特別小的胺基酸之丙胺酸與甘胺酸。
在後述的實施例中，使人類生長激素與人類血清白蛋白變異體結合而成的蛋白質中之人類血清白蛋白變異體(HSA變異體的典型一例)，係相對於包含585個胺基酸之野生型人類血清白蛋白的胺基酸序列(序列識別號1)，僅在從N端起第320個胺基酸殘基不為丙胺酸而為蘇胺酸之點上不同(序列識別號3)。藉由此差異，而該HSA變異體(稱為「HSA(A320T)」)在其胺基酸序列中產生以Asn-Tyr-Thr表示之序列部分，在此序列部分中，Asn(天冬醯胺酸)殘基可被N-鍵結型醣苷化。
在本說明書中，「人類血清白蛋白與人類生長激素之融合蛋白質」或「人類血清白蛋白-hGH融合蛋白質(HSA-hGH融合蛋白質)」係指使HSA與生長激素結合而成的蛋白質。於此，所謂使此等蛋白質「結合」，例如，包含使此等藉由肽鍵而連結，但不限於此。又，所謂使此等蛋白質「結合」，不僅包含使一者的N端與另一者的C端之間直接以肽鍵連結，亦包含使兩蛋白質經由連接子(linker)而間接地結合。尤其，在人類血清白蛋白為人類血清白蛋白變異體時，係稱為「人類血清白蛋白變異體與人類生長激素之融合蛋白質」或「人類血清白蛋白變異體-hGH融合蛋白質(HSA變異體-hGH融合蛋白質)」。亦即，人類血清白蛋白變異體-hGH融合蛋白質係包含在人類血清白蛋白-hGH融合蛋白質中。「人類血清白蛋白與人類生長激素之融合蛋白質」亦可稱為HSA連結hGH。
此處「連接子」係在上述2個多肽之間以共價鍵將兩者結合的結構部分，且並非源自HSA(包含HSA變異體)與為其結合對象之生長激素的任一末端者。連接子可為與兩個多肽進行肽鍵結之單一胺基酸殘基或是包含2個以上的胺基酸殘基之肽鏈部分(肽連接子)，在本說明書中，將此等包含1個以上的胺基酸殘基之連接子統稱為「肽連接子」。又，在本說明書中，所謂HSA與生長激素「經由肽鍵」而結合時，包含兩者直接藉由肽鍵而結合之情形、及兩者藉由與肽連接子的結合而結合之情形。此外，在本說明書中，HSA與生長激素直接或經由肽連接子而結合之情形，為該化合物之「人類血清白蛋白-hGH融合蛋白質(HSA-hGH融合蛋白質)」亦可稱為「人類血清白蛋白融合hGH (HSA融合hGH)」。關於人類血清白蛋白變異體-hGH融合蛋白質(HSA變異體-hGH融合蛋白質)亦同樣。
在本發明中，HSA與生長激素經由肽連接子而結合時，該連接子係以較佳為1～50個、更佳為1～17個、再更佳為1～10個、又再更佳為1～6個胺基酸殘基所構成，例如係以2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個或25～29個胺基酸所構成者，再者，例如為僅1個胺基酸殘基所構成者、或由2個、3個、5個、6個或20個胺基酸殘基所構成者。只要以肽連接子結合之HSA部分係保持作為HSA的功能且生長激素的部分亦在生理的條件下可發揮生長激素的生理活性，則對於構成肽連接子的胺基酸殘基或胺基酸序列並無限定，但較佳為由甘胺酸與絲胺酸所構成者。作為肽連接子的較佳例，可列舉由一個甘胺酸、一個絲胺酸、Gly-Ser、Gly-Gly-Ser、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號4)、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號5)、及Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號6)所構成者、以及包含此等胺基酸序列而成者。具有此等胺基酸序列的任一種連續2～10次或2～5次而成之序列者，亦可較佳地使用作為肽連接子，又，具有使此等胺基酸序列的任二種以上組合而連續1～10次或2～5次而成之序列者，亦可較佳地使用作為肽連接子。作為使此等胺基酸序列的任二種以上組合而成的肽連接子之較佳者，可列舉在胺基酸序列Gly-Ser後接著連續3個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號5)而成之包含合計20個胺基酸序列者。
作為結合2個不同的多肽的方法，例如，一般為下述方法，且可在本發明中利用：製作組入DNA的表現載體，該DNA係在編碼其中一個多肽的基因的下游，使編碼另一個多肽的基因框內(in-frame)結合而成，並培養使用此表現載體所轉形的宿主細胞，藉此而作為重組融合蛋白質表現之方法。
藉由在轉形細胞中作為重組體表現而產生HSA-hGH融合蛋白質之情形，能獲得包含生長激素的胺基酸序列而成之多肽與包含HSA的胺基酸序列而成之多肽的N端或C端的任一者結合的形態的融合蛋白質。使用基因重組技術而製造之HSA-hGH融合蛋白質，特別稱為重組HSA-hGH融合蛋白質。
使包含生長激素的胺基酸序列而成之多肽與包含HSA的胺基酸序列而成之多肽的N端側結合之情形，能使用組入下述DNA的表現載體：在編碼包含生長激素的胺基酸序列而成之多肽的基因的下游，使編碼包含HSA的胺基酸序列而成之多肽的基因框內結合而成的DNA。經由肽連接子而間接地結合2個多肽之情形，在編碼2個多肽的基因之間，框內插入有編碼該連接子的DNA序列。
使包含生長激素的胺基酸序列之多肽與包含HSA的胺基酸序列之多肽的C端側結合之情形，能使用組入下述DNA的表現載體：在編碼包含生長激素的胺基酸序列之多肽的基因的上游，使編碼包含HSA的胺基酸序列之多肽的基因框內結合而成的DNA。經由肽連接子而間接地結合2個多肽之情形，在編碼2個多肽的基因之間，框內插入有編碼該連接子的DNA序列。
為了使宿主細胞產生HSA-hGH融合蛋白質，係在宿主細胞中導入已組入編碼該等之任一者的DNA之表現載體。可用於此的宿主細胞，只要為可藉由導入該種表現載體而使HSA-hGH融合蛋白質表現者，則無特別限制，可為哺乳動物細胞、酵母、植物細胞、昆蟲細胞等真核生物細胞、大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞之任一者，但特佳為哺乳動物細胞。但是，作為經糖鏈修飾的蛋白質而表現之情形的宿主細胞，係選自哺乳動物細胞、酵母、植物細胞、昆蟲細胞等真核生物細胞。藉由通常野生型HSA的第320個胺基酸殘基成為蘇胺酸所產生之以Asn-Tyr-Thr表示的序列部分的Asn殘基、或以Asn-X-Thr(「X」為脯胺酸以外的胺基酸殘基)表示的序列中的Asn殘基，係藉由使HSA-hGH融合蛋白質的表現在真核生物細胞中進行而被N-鍵結型醣苷化。
使用哺乳動物細胞作為宿主細胞之情形，關於該哺乳動物細胞的種類並無特別限定，但較佳為源自人類、小鼠、中國倉鼠之細胞，特佳為源自中國倉鼠卵巢細胞之CHO細胞、或源自小鼠骨髓瘤之NS/0細胞。又，此時用於組入編碼HSA-hGH融合蛋白質的DNA片段並使其表現之表現載體，只要為在導入哺乳動物細胞內時造成該基因的表現者，則可無特別限定地使用。組入表現載體的該基因，被配置在可在哺乳動物細胞內調節基因的轉錄頻率之DNA序列(基因表現控制部位)的下游。作為本發明中可使用的基因發現控制部位，可列舉例如：源自巨細胞病毒的啟動子、SV40早期啟動子、人類延長因子(elongation factor)-1α (EF-1α)啟動子、人類泛蛋白C啟動子。
導入有此種表現載體的哺乳動物細胞變得會表現組入表現載體的蛋白質，但其表現量係依據各個細胞而異，並非一樣。因此，為了效率佳地生產HSA-hGH融合蛋白質，變得需要從導入有表現載體的哺乳動物細胞選擇此等的表現程度高的細胞之步驟。為了進行此選擇步驟，而在表現載體中組入發揮作為選擇標記的作用的基因。
作為選擇標記，最一般者係分解嘌黴素、新黴素等藥劑的酵素(抗藥性標記)。哺乳動物細胞通常在一定濃度以上的此等藥劑的存在下會死亡。然而，導入有已組入抗藥性標記基因之表現載體的哺乳動物細胞，因可藉由所表現的抗藥性標記而將上述藥劑無毒化或弱毒化，變得即使在上述藥劑存在下亦能存活。將組入抗藥性標記作為選擇標記的表現載體導入哺乳動物細胞，並在含有對應於其抗藥性標記的藥劑之選擇培養基中，例如，若一邊使該藥劑的濃度緩緩上升一邊持續培養，則能獲得即使在更高濃度的藥劑存在下亦能增殖的細胞。在如此進行而選擇的細胞中，組入表現載體之編碼目標蛋白質的基因的表現量一般亦與抗藥性標記一起增加，就結果而言係選擇該蛋白質的表現程度高的細胞。
又，作為選擇標記，亦可使用麩醯胺酸合成酵素(GS)。麩醯胺酸合成酵素係由麩胺酸與氨合成麩醯胺酸的酵素。若將哺乳動物細胞在含有麩醯胺酸合成酵素的抑制劑、例如L-甲硫胺酸磺醯亞胺(L-methionine sulfoximine) (MSX)且不含有麩醯胺酸的選擇培養基中培養，則細胞通常會死亡。然而，若將已組入作為選擇標記的麩醯胺酸合成酵素之表現載體導入哺乳動物細胞，則變得在該細胞中麩醯胺酸合成酵素的表現程度會上升，因此變得即使在更高濃度的MSX存在下亦能增殖。此時，若一邊使MSX的濃度緩緩上升一邊持續培養，則能獲得即使在更高濃度的MSX存在下亦能增殖的細胞。在如此進行而選擇的細胞中，組入表現載體之編碼目標蛋白質的基因的表現量一般亦與麩醯胺酸合成酵素一起增加，就結果而言係選擇該蛋白質的表現程度高的細胞。
又，作為選擇標記，亦可使用二氫葉酸還原酶(DHFR)。使用DHFR作為選擇標記之情形，導入有表現載體的哺乳動物細胞係在含有胺甲喋呤、胺喋呤等DHFR抑制劑的選擇培養基中培養。若一邊使DHFR抑制劑的濃度緩緩上升一邊持續培養，則能獲得即使在更高濃度的DHFR抑制劑存在下亦能增殖的細胞。此時能使用的選擇培養基較佳為不含有次黃嘌呤及胸苷。在如此進行所選擇的細胞中，組入表現載體之編碼目標蛋白質的基因的表現量一般也與DHFR一起增加，就結果而言係選擇該蛋白質的表現程度高的細胞。
已知一種表現載體，其在編碼目標蛋白質的基因的下游側經由內部核糖體進入位(IRES：internal ribosome entry site)而配置作為選擇標記的麩醯胺酸合成酵素(GS)(國際專利公報WO2012/063799、WO2013/161958)。此等文獻所記載的表現載體可特佳地使用在製造HSA-hGH融合蛋白。
例如，下述表現載體可較佳地使用於製造HSA-hGH融合蛋白質：其係用於使目標蛋白質表現的表現載體，其係包含第一基因發現控制部位、以及在其下游之編碼該蛋白質的基因、在更下游之內部核糖體進入位、及在更下游之編碼麩醯胺酸合成酵素的基因，且在上述第一基因發現控制部位或與此不同的第二基因發現控制部位的下游進一步包含二氫葉酸還原酶基因或抗藥性基因而成。在此表現載體中，作為第一基因發現控制部位或第二基因發現控制部位，能較佳地使用源自巨細胞病毒的啟動子、SV40早期啟動子、人類延長因子-1α啟動子(hEF-1α啟動子)、人類泛蛋白C啟動子，但特佳為hEF-1α啟動子。
又，作為內部核糖體進入位，能較佳地使用源自選自包含小核糖核酸病毒科的病毒、口蹄疫病毒、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒、冠狀病毒、牛腸病毒、泰勒氏鼠腦脊髓炎病毒、柯薩奇B型病毒之群組的病毒的基因體、或選自包含人類免疫球蛋白重鏈結合蛋白質基因、果蠅觸角足基因(Drosophila Antennapedia gene)、果蠅超級雙胸基因(Drosophila Ultrabithorax gene)之群組的基因的5’非轉譯區域者，但特佳為源自小鼠腦心肌炎病毒基因體的5’非轉譯區域之內部核糖體進入位。使用源自小鼠腦心肌炎病毒基因體的5’非轉譯區域之內部核糖體進入位之情形，除了野生型者以外，亦可較佳地使用野生型內部核糖體進入位所含之複數的起始密碼子中之一部分被破壞者。又，能在此表現載體中較佳地使用的抗藥性基因，較佳為嘌黴素或新黴素抗性基因，更佳為嘌黴素抗性基因。
又，例如，下述表現載體可較佳地使用於製造HSA-hGH融合蛋白質：其係用於使目標蛋白質表現的表現載體，其係包含人類延長因子-1α啟動子、在其下游之編碼該蛋白質的基因、在更下游之源自小鼠腦心肌炎病毒基因體的5’非轉譯區域之內部核糖體進入位、及在更下游之編碼麩醯胺酸合成酵素的基因，且在其他基因發現控制部位及其下游進一步包含二氫葉酸還原酶基因的表現載體，其中該內部核糖體進入位係野生型內部核糖體進入位所含之複數的起始密碼子中之一部分被破壞者。作為此種表現載體，可列舉WO2013/161958所記載之表現載體。
又，例如，下述表現載體可較佳地使用於製造HSA-hGH融合蛋白質：其係用於使目標蛋白質表現的表現載體，其係包含人類延長因子-1α啟動子、在其下游之編碼該蛋白質的基因、在更下游之源自小鼠腦心肌炎病毒基因體的5’非轉譯區域之內部核糖體進入位、及在更下游之編碼麩醯胺酸合成酵素的基因，且在其他基因表現控制部位及其下游進一步包含抗藥性基因的表現載體，其中該內部核糖體進入位係野生型內部核糖體進入位所含之複數的起始密碼子中之一部分被破壞者。作為此種表現載體，可列舉WO2012/063799所記載之pE-mIRES-GS-puro及WO2013/161958所記載之pE-mIRES-GS-mNeo。
在源自野生型小鼠腦心肌炎病毒基因體的5’非轉譯區域之內部核糖體進入位的3’末端，存在3個起始密碼子(ATG)，包含該3個起始密碼子的序列部分係以序列識別號7 (5’-ATGataatATGgccacaaccATG-3’：將起始密碼子的ATG以大寫表示)表示。作為此序列部分中的起始密碼子之中的一部分被破壞者，例如有序列識別號8 (5’-atgataagcttgccacaaccatg-3’)所示者，上述的pE-mIRES-GS-puro及pE-mIRES-GS-mNeo係具有包含序列識別號8所示之序列的IRES的表現載體。
在本發明中，導入有已組入編碼HSA-hGH融合蛋白質的DNA片段之表現載體的哺乳動物細胞，係為了選擇此等的表現程度高的細胞，而在選擇培養基中進行選擇培養。
在選擇培養中，使用DHFR作為選擇標記之情形，使選擇培養基所含之DHFR抑制劑的濃度階段性地上升。在DHFR抑制劑為胺甲喋呤之情形，其最大濃度較佳為0.25～5 μM，更佳為0.5～1.5 μM，再更佳為約1.0 μM。
使用GS作為選擇標記之情形，使選擇培養基所含之GS抑制劑的濃度階段性地上升。在GS抑制劑為MSX之情形，其最大濃度較佳為10～1000 μM等，例如為20～500 μM、20～80 μM、20～30 μM。又，此時，一般而言能使用不含有麩醯胺酸的培養基作為選擇培養基。
使用分解嘌黴素的酵素作為選擇標記之情形，選擇培養基所含之嘌黴素的最大濃度較佳為3～30 μg/mL，更佳為5～20 μg/mL，再更佳為約10 μg/mL。
使用分解新黴素的酵素作為選擇標記之情形，選擇培養基所含之G418的最大濃度較佳為0.1～2 mg/mL，更佳為0.5～1.5 mg/mL，再更佳為約1 mg/mL。
又，作為用於培養哺乳動物細胞的培養基，選擇培養所使用的培養基、後述用於生產重組蛋白質的培養基(重組蛋白質生產用培養基)皆只要為可培養哺乳動物細胞並使其增殖者，則可無特別限定地使用，但較佳為使用無血清培養基。HSA因具有吸附血清中所含的成分的性質，而在使用含有血清的培養基來生產HSA之情形中，係獲得吸附有血清中的不純物之HSA，因此變得需要在之後的步驟去除此不純物。
在本發明中，HSA-hGH融合蛋白質特別係將表現此等的細胞在無血清培養基中進行培養而得者。藉由使用無血清培養基，可減少不純物對於HSA-hGH融合蛋白質的吸附量，因此可簡化之後的精製步驟。
藉由選擇培養所選擇之HSA-hGH融合蛋白質的表現程度高的細胞係使用於HSA-hGH融合蛋白質的生產(HSA-hGH融合蛋白質產生細胞)。HSA-hGH融合蛋白質的生產係藉由在HSA-hGH融合蛋白質生產用培養基中培養HSA-hGH融合蛋白質產生細胞而進行。將此培養稱為生產培養。
在本發明中，就能使用作為HSA-hGH融合蛋白質生產用培養基的無血清培養基而言，例如，能較佳地使用含有3～700 mg/L的胺基酸、0.001～50 mg/L的維生素類、0.3～10 g/L的單醣類、0.1～10000 mg/L的無機鹽、0.001～0.1 mg/L的微量元素、0.1～50 mg/L的核苷、0.001～10 mg/L的脂肪酸、0.01～1 mg/L的生物素、0.1～20 μg/L的氫化可體松(hydrocortisone)、0.1～20 mg/L的胰島素、0.1～10 mg/L的維生素B12、0.01～1 mg/L的腐胺、10～500 mg/L的丙酮酸鈉、及水溶性鐵化合物之培養基。依據期望，亦可在培養基中添加胸苷、次黃嘌呤、慣用的pH指示劑及抗生素等。
就能使用作為HSA-hGH融合蛋白質生產用培養基的無血清培養基而言，可將DMEM/F12培養基(DMEM與F12的混合培養基)使用作為基本培養基，此等各培養基對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言為周知。又再者，作為無血清培養基，亦可使用DMEM(HG)HAM改良型(R5)培養基，其係包含碳酸氫鈉、L-麩醯胺酸、D-葡萄糖、胰島素、亞硒酸鈉、二胺基丁烷、氫化可體松、硫酸鐵(II)、天冬醯胺酸、天冬胺酸、絲胺酸及聚乙烯醇者。再者，亦可將市售的無血清培養基，例如，CD OptiCHO TM培養基、CHO-S-SFM II培養基或CD CHO培養基(Thermo Fisher Scientific公司)、IS cho-V TM培養基(Irvine Scientific公司)、EX-CELL TM302培養基、EX-CELL TMAdvanced培養基或EX-CELL TM325-PF培養基(SAFC Biosciences公司)等使用作為基本培養基。
在HSA-hGH融合蛋白質生產用培養基中，亦可適當添加1～50 g/L(例如1～5 g/L)的源自大豆、小麥、稻等植物的水解物。最一般所使用者係源自大豆的蛋白質水解物。但是，HSA-hGH融合蛋白質可不在HSA-hGH融合蛋白質生產用培養基中添加源自稻等植物的水解物、例如源自大豆的蛋白質水解物而進行製造。
生產培養結束後的培養液被供至用於精製HSA-hGH融合蛋白質的層析法步驟。但是，被供至層析法步驟者係已從培養液去除細胞等之培養上清液。作為從培養液獲得培養上清液的方法，有利用膜過濾器的過濾、離心分離等。
在本發明中，用於精製HSA-hGH融合蛋白質的各層析法步驟，可因應需要，為了防止蛋白質的非特異性吸附而在非離子性界面活性劑的存在下進行。關於使用何種非離子性界面活性劑並無特別限定，但較佳使用聚山梨醇酯系界面活性劑，更佳為聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。此種非離子性界面活性劑的濃度較佳為0.005% (w/v)～0.1% (w/v)，更佳為0.005% (w/v)～0.05% (w/v)，例如為0.01% (w/v)、0.05% (w/v)等。
HSA-hGH融合蛋白質的精製步驟可在室溫或低溫進行，但較佳為在低溫，尤其可在1～10℃進行。
在本發明的一實施形態中，HSA-hGH融合蛋白質的精製步驟係包含：將結合有對HSA-hGH融合蛋白質具有親和性的抗體之材料用作固定相的管柱層析法步驟、將具有對於磷酸基的親和性之材料用作固定相的管柱層析法步驟、陽離子交換管柱層析法步驟及尺寸篩析管柱層析法(size-exclusion column chromatography)步驟。但是，亦可在此等層析法步驟中增加1或複數個層析法步驟。作為此種追加的層析法步驟，可列舉例如：將結合有對HSA-hGH融合蛋白質具有親和性的抗體之材料用作固定相的管柱層析法步驟、將具有對於磷酸基的親和性之材料用作固定相的管柱層析法步驟、陽離子交換管柱層析法步驟、陰離子交換管柱層析法步驟、疏水性管柱層析法步驟、色素親和性管柱層析法步驟及尺寸篩析管柱層析法步驟。
在本發明的一實施形態中，HSA-hGH融合蛋白質的精製步驟依序包含：將結合有對HSA-hGH融合蛋白質具有親和性的抗體之材料用作固定相的管柱層析法步驟、將具有對於磷酸基的親和性之材料用作固定相的管柱層析法步驟、陽離子交換管柱層析法步驟及尺寸篩析管柱層析法步驟。但是，在此等層析法步驟中亦可增加1或複數個層析法步驟。作為此種追加的層析法步驟，可列舉例如：將結合有對HSA-hGH融合蛋白質具有親和性的抗體之材料用作固定相的管柱層析法步驟、將具有對於磷酸基的親和性之材料用作固定相的管柱層析法步驟、陽離子交換管柱層析法步驟、陰離子交換管柱層析法步驟、疏水性管柱層析法步驟、色素配體管柱層析法步驟及尺寸篩析管柱層析法步驟。追加的層析法可增加在任何相鄰的步驟之間，或亦可增加作為最初的層析法步驟、最後的層析法步驟。
以下針對本發明的一實施形態中之精製步驟進行詳述，該精製步驟依序包含：將結合有對HSA-hGH融合蛋白質具有親和性的抗體之材料用作固定相的管柱層析法步驟、將具有對於磷酸基的親和性之材料用作固定相的管柱層析法步驟、陽離子交換管柱層析法步驟及尺寸篩析管柱層析法步驟。
第一管柱層析法步驟係使用將結合有對HSA-hGH融合蛋白質具有親和性的抗體之材料用作固定相的管柱層析法者。於此，抗體可為對HSA或hGH的任一者具有親和性者，但較佳為對hGH具有親和性者。例如，可較佳地使用Capture select Human Growth Hormone Affinity Matrix (Thermo Fisher Scientific公司)，其係包含結合有對於人類生長激素的抗體之擔體者。
使用將結合有對hGH具有親和性的抗體之材料用作固定相的管柱層析法管柱之情形，HSA-hGH融合蛋白質被施予至已預先以緩衝液平衡化的管柱。於此，對於緩衝液的種類並無特別限定，但較佳為Tris-HCl緩衝液，其濃度較佳為5～50 mM，更佳為10～30 mM。又，其pH較佳為被調整成6.7～7.3，更佳為6.9～7.1，再更佳為約7.0。HSA-hGH融合蛋白質之從管柱的沖提，較佳為使用甘胺酸-鹽酸而進行。甘胺酸-鹽酸的濃度較佳為20～100 mM，更佳為40～60 mM，再更佳為約50 mM。又，其pH較佳為被調整成2.0～4.0，更佳為2.8～3.2，再更佳為約3.0。沖提液的pH立刻被調整成中性附近，例如pH 6.4～7.0。
第二管柱層析法步驟係將具有對於磷酸基的親和性之材料用作固定相者。就作為將具有對於磷酸基的親和性之材料用作固定相的管柱層析法的較佳者而言，可列舉羥磷灰石管柱層析法與氟磷灰石管柱層析法，但特佳為羥磷灰石管柱層析法。此等係利用因由鈣離子所致之金屬親和性與由磷酸基所致之陽離子交換這兩者的相互作用，而用於去除夾雜物者。
以下針對使用羥磷灰石管柱層析法之情形詳述。關於使用於羥磷灰石層析法的擔體並無特別限定，可為陶瓷性，亦可為結晶性，但作為特佳的擔體之一，可列舉CHT Type II, 40μm (Bio-Rad Laboratories公司)。
第一管柱層析法步驟所得之沖提液係在被施予至羥磷灰石層析法管柱前調整pH與導電率。此時，pH較佳為被調整成6.5～7.5，更佳為6.8～7.2，再更佳為6.9～7.1。又，導電率較佳為被調整成0.4～0.8 S/m，更佳為0.5～0.7 S/m。
已調整pH與導電率的沖提液，被施予至已預先以緩衝液平衡化的羥磷灰石層析法管柱。於此，對於緩衝液的種類並無特別限定，但較佳為MES緩衝液，其濃度較佳為5～50 mM，更佳為10～30 mM，例如為20 mM。又，其pH較佳為被調整成6.7～7.3，更佳為6.9～7.1，再更佳為約7.0。又，緩衝液包含磷酸離子，其濃度較佳為0～3 mM，更佳為0～2 mM，例如為1 mM。
HSA-hGH融合蛋白質之從羥磷灰石層析法管柱的沖提，係使用提高磷酸離子的濃度的緩衝液而進行。此時的磷酸離子的濃度，較佳為20～50 mM，更佳為25～40 mM，再更佳為25～35 mM，例如為30 mM。
第三管柱層析法步驟係使用陽離子交換管柱層析法者，且係用於去除夾雜蛋白質者。關於在陽離子交換管柱層析法中使用何種陽離子交換樹脂並無特別限定，但較佳為弱陽離子交換樹脂，更佳為具有基於疏水性相互作用及氫鍵形成這兩者之選擇性的弱陽離子交換樹脂。例如，可較佳地使用如Capto MMC (GE Healthcare)等之具有苯基、醯胺鍵及羧基且具有基於疏水性相互作用及氫鍵形成之選擇性的弱陽離子交換樹脂。
第二管柱層析法步驟所得之沖提液係在被施予至陽離子交換管柱層析法前調整pH與導電率。此時，pH較佳為被調整成5.3～6.2，更佳為5.4～6.1，再更佳為5.6～5.8。又，導電率較佳為被調整成0.5～0.9 S/m，更佳為0.6～0.8 S/m。
已調整pH與導電率的沖提液，被施予至已預先以緩衝液平衡化的陽離子交換管柱層析法。於此，對於緩衝液的種類並無特別限定，但較佳為MES緩衝液，其濃度較佳為30～70 mM，更佳為40～60 mM，例如為50 mM。又，其pH較佳為被調整成5.4～6.0，更佳為5.6～5.8，例如為5.7。又，緩衝液包含鹽，在鹽為中性鹽時的緩衝液中的濃度，較佳為30～150 mM，更佳為50～120 mM，再更佳為80～120 mM，例如為100 mM。此時的中性鹽較佳為氯化鈉、氯化鉀，但特佳為氯化鈉。
HSA-hGH融合蛋白質之從陽離子交換管柱層析法的沖提，係使用提高中性鹽的濃度的緩衝液而進行。此時的中性鹽的濃度，較佳為400～600 mM，更佳為500～600 mM，再更佳為530～570 mM，例如為550 mM。
第四管柱層析法步驟係使用尺寸篩析層析法者。尺寸篩析層析法係基於分子尺寸而用於去除尤其是內毒素等低分子夾雜物、HSA-hGH融合蛋白質的多聚體或分解物者。
在尺寸篩析層析法步驟中，管柱被預先平衡化。於此，對於緩衝液的種類並無特別限定，但較佳為磷酸緩衝液，其濃度較佳為5～20 mM，更佳為8～12 mM，例如為10 mM。其pH較佳為被調整成6.6～7.4，更佳為7.0～7.4，例如為7.2。又，緩衝液亦可為含有能使用作為醫藥品添加物的雙醣者。此種雙醣較佳為蔗糖，其濃度較佳為60～90 mg/mL，更佳為70～80 mg/mL，例如為75 mg/mL。藉由此第一至第四管柱層析法步驟，能獲得實質上純粹的HSA-hGH融合蛋白質。
在HSA-hGH融合蛋白質的精製步驟中，亦可依據期望追加病毒去活化步驟。病毒去活化步驟可在任意的2個層析法步驟之間實施，又，亦可在最初的層析法步驟之前、或最後的層析法步驟之後實施。又，病毒去活化步驟可在HSA-hGH融合蛋白質的精製步驟中實施1次，亦可實施2次，或亦可實施3次以上。
層析法步驟係依序包含將結合有對HSA-hGH融合蛋白質具有親和性的抗體之材料用作固定相的管柱層析法步驟(第一管柱層析法步驟)、將具有對於磷酸基的親和性之材料用作固定相的管柱層析法步驟(第二管柱層析法步驟)、陽離子交換管柱層析法步驟(第三管柱層析法步驟)及尺寸篩析管柱層析法步驟(第四管柱層析法步驟)者之情形，病毒去活化步驟較佳為在第一管柱層析法步驟與第二管柱層析法步驟之間、或/及第四管柱層析法步驟之後實施。關於應用何種病毒去活化步驟並無特別限定，但可較佳地應用溶媒-界面活性劑法或過濾器過濾法。溶媒-界面活性劑法係藉由在應將病毒去活化的溶液中添加有機溶媒與界面活性劑而使病毒去活化的方法。應用溶媒-界面活性劑法之情形，係在含有HSA-hGH融合蛋白質的溶液中添加有機溶媒與非離子性界面活性劑進行混合，並將此混合液培養(incubation)例如超過3小時。溶媒-界面活性劑法所使用的溶液，只要為將HSA-hGH融合蛋白質至少穩定地保持2小時者則無特別限定，但可較佳地使用：在pH被調整成中性附近的甘胺酸緩衝液、磷酸緩衝液、MES緩衝液、Tris-HCl緩衝液或此等混合物中混合有有機溶媒與非離子性界面活性劑者。又，關於使用何種非離子性界面活性劑亦無特別限定，但例如可將聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80及triton X-100單獨或任意組合此等而使用。聚山梨醇酯80係特別適合的非離子性界面活性劑之一，可單獨或與其他非離子性界面活性劑組合使用。又，關於使用何種有機溶媒亦無特別限定，但例如可使用磷酸三(正丁酯)。在將聚山梨醇酯80與磷酸三(正丁酯)組合使用之情形，混合液中的聚山梨醇酯80的濃度為0.3～2%，例如為1%；磷酸三(正丁酯)的濃度為0.1～0.5%，例如為0.3%；混合液係培養2～5小時，例如3小時。
過濾器過濾法係將應去除病毒的溶液以具有去除病毒的性能之過濾膜(病毒去除膜)進行過濾而去除病毒的方法。過濾器過濾法所使用的過濾膜，較佳係平均孔徑為17～21 nm者，其材質例如為再生纖維素。應用過濾器過濾法之情形，係使含有HSA-hGH融合蛋白質的溶液通過病毒去除膜。例如，在第一管柱層析法步驟與第二管柱層析法步驟之間，藉由溶媒-界面活性劑法進行病毒去活化，在第四管柱層析法步驟之後，藉由過濾器過濾法進行病毒去活化，藉此可更確實地進行病毒去除。
此外，利用病毒去除膜之方法，亦可稱為病毒去除步驟，但在本發明中，亦可稱為病毒去活化步驟的一手法。
在本發明中，相較於未結合HSA的原本的生長激素，HSA-hGH融合蛋白質在血中的穩定性提高，半衰期變長。雖依據投予路徑及投予量而變動，但以皮下注射投予至食蟹獼猴時的血中半衰期(t 1/2β)若例如為5小時以上，則在血中變得非常穩定。例如，HSA變異體-人類生長激素融合蛋白質的血中半衰期(t 1/2β)在以0.5～10 mg/kg的用量單次皮下投予至雄性食蟹獼猴時，血中半衰期(t 1/2β)為5～40小時。
在本發明中，含有HSA變異體-生長激素融合蛋白質作為有效成分而成之醫藥，可作為注射劑而投予至靜脈內、肌肉內、腹腔內或皮下。
人類生長激素中，主要有分子量為22 kDa者(22kDa人類生長激素，本說明書中的22K人類生長激素)與為20 kDa者(20kDa人類生長激素，本說明書中的20K人類生長激素)之分子量不同的二種類。22K生長激素係具有序列識別號9所示之胺基酸序列之由191個胺基酸所構成的蛋白質。通常，稱為「人類生長激素(或hGH)」時，意指此22K生長激素，但在本說明書中，僅稱為「人類生長激素(或hGH)」時，包含22K人類生長激素與20K人類生長激素之兩者。
在本說明書中，僅稱為「22K人類生長激素(或22KhGH)」時，除了具有序列識別號9所示之胺基酸序列的野生型22KhGH以外，亦包含：為對於其有1個或複數個胺基酸經取代、缺失及/或附加者之22KhGH變異體，且具有生長促進活性者。可取代、缺失及/或附加的胺基酸的個數，每各變異類型，較佳為1～8個，更佳為1～4個，再更佳為1～2個。於此，22KhGH變異體的胺基酸序列較佳為與序列識別號9所示之野生型22KhGH的胺基酸序列具有85%以上的一致性者，更佳為具有90%以上的一致性，再更佳為具有95%以上的一致性。
野生型20K人類生長激素係具有成長促進活性的蛋白質，包含由176個胺基酸所構成之胺基酸序列(序列識別號10)，相當於在構成野生型22K生長激素(序列識別號9)之191個胺基酸之中從N端起算的第32個～第46個之15個胺基酸缺失者。但是，在本說明書中，在僅稱為「20K人類生長激素(或20KhGH)」時，除了序列識別號10所示之野生型20KhGH以外，亦包含：為相當於對於該序列有1個或複數個胺基酸經取代、缺失及/或附加者之20KhGH的變異體，且具有生長促進活性者。可取代、缺失及/或附加的胺基酸的個數，每各變異類型，較佳為1～8個，更佳為1～4個，再更佳為1～2個。於此，20KhGH變異體的胺基酸序列較佳為與序列識別號10所示之野生型20KhGH的胺基酸序列具有85%以上的一致性者，更佳為具有90%以上的一致性，再更佳為具有95%以上的一致性。
在本發明中，各種hGH變異體中之與通常的野生型hGH比較時的各變異的位置及其形式(缺失、取代、附加)，可藉由兩個hGH的胺基酸序列的比對，而輕易地確認。此外，在本發明中，野生型hGH的胺基酸序列與加入變異的hGH的胺基酸序列之一致性，可使用周知的同源性計算演算法而輕易地算出。例如，作為該種演算法，有BLAST (Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990))、Pearson及Lipman的相似性檢索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988))、Smith及Waterman的局部同源性演算法(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等。
上述hGH的胺基酸序列中的胺基酸的利用其他胺基酸之取代，例如，係在胺基酸該等的側鏈及化學性質具相關性的胺基酸家族內所發生者。此種在胺基酸家族內的取代，可預測在hGH的功能上不會造成大的變化(亦即，為保留式胺基酸取代)。作為此種胺基酸家族，例如有以下者： (1)為酸性胺基酸之天冬胺酸與麩胺酸； (2)為鹼性胺基酸之組胺酸、離胺酸及精胺酸； (3)為芳香族胺基酸之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸； (4)為具有羥基的胺基酸(羥基胺基酸)之絲胺酸與蘇胺酸； (5)為疏水性胺基酸之甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸； (6)為中性的親水性胺基酸之半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸及麩醯胺酸； (7)為影響肽鏈的配向的胺基酸之甘胺酸與脯胺酸； (8)為醯胺型胺基酸(極性胺基酸)之天冬醯胺酸與麩醯胺酸； (9)為脂肪族胺基酸之丙胺酸、白胺酸、異白胺酸及纈胺酸； (10)為側鏈小的胺基酸之丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸及蘇胺酸； (11)為側鏈特別小的胺基酸之丙胺酸與甘胺酸。
含有使用導入有hGH基因的大腸桿菌而作為重組蛋白質所製造之分子量約22KD的hGH作為有效成分之製劑(hGH製劑)，被廣泛地臨床使用作為以下疾病的治療劑：生長激素缺乏性侏儒症、透納氏症候群中之侏儒症、SGA性侏儒症、努南氏症候群中之侏儒症、由慢性腎衰竭所致之侏儒症、普威二氏症候群中之侏儒症及軟骨發育不全症中之侏儒症。在此等疾病中不伴隨骨骺閉合之情形，hGH製劑特別會發揮效果。hGH製劑係藉由被投予至皮下或肌肉內，而其成分的hGH在血中循環，藉由其生長促進活性而發揮促進患者生長的效果。又，hGH製劑亦被廣泛地臨床使用作為成人生長激素缺乏症的治療劑。在成人生長激素缺乏症的患者中，雖觀察到脂質代謝異常，但藉由投予hGH製劑，而患者的脂質代謝等會正常化，改善患者的QOL。生長激素亦被臨床應用作為由AIDS所致之消耗的治療劑。作為生長激素缺乏性侏儒症、成人生長激素缺乏症等的hGH製劑，例如有GROWJECT(註冊商標)。
在製作HSA變異體與hGH的融合蛋白質之情形，作為使包含HSA變異體的胺基酸序列之多肽與包含hGH的胺基酸序列之多肽結合的具體方法，例如，一般為下述方法，且可在本發明中利用：製作組入DNA片段的表現載體，該DNA片段係在編碼其中一者的多肽的基因的下游，使編碼另一者的多肽的基因框內(in-frame)結合而成，並培養使用此表現載體所轉形的宿主細胞，藉此而作為重組蛋白質表現之方法。
藉由在轉形細胞中作為重組蛋白質表現的方法而製作HSA變異體與hGH的融合蛋白質時，包含hGH的胺基酸序列之多肽係直接、或經由連接子而間接地結合在包含HSA變異體的胺基酸序列之多肽的N端側或C端側之任一側。
使包含hGH的胺基酸序列之多肽與包含HSA變異體的胺基酸序列之多肽的N端側結合之情形，能使用組入下述DNA片段的表現載體：在編碼包含hGH的胺基酸序列之多肽的基因的下游，使編碼包含HSA變異體的胺基酸序列之多肽的基因框內結合而成的DNA片段。經由肽連接子間接地結合2個多肽之情形，在編碼2個多肽的基因之間，框內配置有編碼該連接子的DNA序列。
使包含hGH的胺基酸序列之多肽與包含HSA變異體的胺基酸序列之多肽的C端側結合之情形，能使用組入下述DNA片段的表現載體：在編碼包含hGH的胺基酸序列之多肽的基因的上游，使編碼包含HSA變異體的胺基酸序列之多肽的基因框內結合而成的DNA片段。在經由肽連接子間接地結合2個多肽之情形，在編碼2個多肽的基因之間，框內配置有編碼該連接子的DNA序列。
在本發明中，作為HSA變異體與hGH的融合蛋白質(HSA-hGH融合蛋白質的一種)的較佳一例，可列舉具有序列識別號11所示之胺基酸序列的HSA-hGH融合蛋白質，其係在具有序列識別號3所示之胺基酸序列的HSA(A320T)的N端，不經由連接子，而使具有序列識別號9所示之胺基酸序列的22K人類生長激素的C端藉由肽鍵結合者。在本發明中，將依此順序使HSA(A320T)與22KhGH結合者稱為「22K人類生長激素-mHSA」或「22KhGH-mHSA」。同樣地，將在HSA(A320T)的C端，22K人類生長激素的N端不經由連接子而藉由肽鍵結合者稱為「mHSA-22K人類生長激素」或「mHSA-22KhGH」。
又，將具有序列識別號12所示之胺基酸序列的HSA-hGH融合蛋白質稱為「20K人類生長激素-mHSA」或「20KhGH-mHSA」，其係在具有序列識別號3所示之胺基酸序列的人類血清白蛋白(A320T)的N端，不經由連接子，而使具有序列識別號10所示之胺基酸序列的20K人類生長激素的C端藉由肽鍵結合者。同樣地，將在人類血清白蛋白(A320T)的C端，20K人類生長激素的N端不經由連接子而藉由肽鍵結合者稱為「mHSA-20K人類生長激素」或「mHSA-20KhGH」。
在本發明中，HSA-hGH融合蛋白質的特徵在於，以皮下注射投予至食蟹獼猴時的血中半衰期(t 1/2β)若為約5小時以上，則在血中變得非常穩定。雖依據投予量而變動，但例如在以4 mg/kg的用量單次皮下投予至雄性食蟹獼猴時之mHSA-22KhGH及22KhGH-mHSA的血中半衰期(t 1/2β)為20～35小時。
本發明中之HSA-hGH融合蛋白質可使用作為醫藥。HSA-hGH融合蛋白質可使人類生長激素與HSA的功能在活體內協同合作。
本發明中之HSA-hGH融合蛋白質在血中非常穩定。因此，若依據本發明，可使人類生長激素在血中穩定化，在長時間保持活性的狀態下滯留在血中。因此，該融合蛋白質在使用作為醫藥之情形，相較於人類生長激素，能減少投予頻率或/及投予量。例如，人類生長激素需要每日投予，但若為該融合蛋白質，則亦能將投予頻率設為例如每3～30日1次。又，亦能將治療期間中的醫藥的總投予量減少至例如以莫耳比計為1/3以下(例如1/3～1/10)。
本發明中之HSA-hGH融合蛋白質可使用作為以下述為對象疾病的醫藥：生長激素缺乏性侏儒症、透納氏症候群中之侏儒症、由慢性腎衰竭所致之侏儒症、普威二氏症候群中之侏儒症、軟骨發育不全症中之侏儒症、SGA性侏儒症或努南氏症候群中之侏儒症。在此等疾病中不伴隨骨骺閉合之情形，hGH製劑特別會發揮效果。另外，本發明中之HSA-hGH融合蛋白質可使用作為以下述為對象疾病的醫藥，但不限於此：成人生長激素缺乏症、由AIDS所致之消耗、及由厭食症所致之消耗；且可使用作為以下疾病的治療劑：藉由使生長激素所具有的軟骨形成促進、蛋白質同化促進等生長促進活性、身體組成及脂質代謝改善作用等生理活性長期作用而能改善症狀的疾病。
對於將22KhGH-mHSA以治療為目的而投予至人類時的用法用量，只要顯示hGH的藥效則並無特別限定。將22KhGH-mHSA的用法用量例示於以下，但用法用量不受限於此等。
將22KhGH-mHSA投予至不伴隨骨骺閉合的生長激素缺乏性侏儒症的患者之情形，每次的較佳投予量為0.01～0.7 mg/Kg體重。將22KhGH-mHSA投予至不伴隨骨骺閉合的透納氏症候群中之侏儒症的患者之情形，每次的較佳投予量為0.015～1.4 mg/Kg體重。將22KhGH-mHSA投予至不伴隨骨骺閉合的由慢性腎衰竭所致之侏儒症的患者之情形，每次的較佳投予量為0.01～1.4 mg/Kg體重。將22KhGH-mHSA投予至不伴隨骨骺閉合的普威二氏症候群中之侏儒症的患者之情形，每次的較佳投予量為0.012～0.98 mg/Kg體重。將22KhGH-mHSA投予至不伴隨骨骺閉合的軟骨發育不全症中之侏儒症的患者之情形，每次的較佳投予量為0.015～1.4 mg/Kg體重。將22KhGH-mHSA投予至不伴隨骨骺閉合的SGA性侏儒症的患者之情形，每次的較佳投予量為0.012～1.9 mg/Kg體重。將22KhGH-mHSA投予至成人生長激素缺乏症的患者之情形，每次的較佳投予量為0.001～0.34 mg/Kg體重。將22KhGH-mHSA投予至不伴隨骨骺閉合的努南氏症候群中之侏儒症的患者之情形，每次的較佳投予量為0.013～1.8 mg/Kg體重。將22KhGH-mHSA投予至因AIDS而消耗的患者之情形，每次的較佳投予量為0.005～0.4 mg/Kg體重。但是，投予量應依據患者的檢查所見等而適當變更。又，此等疾病中之較佳的22KhGH-mHSA的投予間隔係每7～30日1次，且應依據患者的檢查所見等而適當變更成每7～14日、每10～20日、或每14～21日1次。又，投予方法較佳為皮下注射、肌肉內注射或靜脈注射，更佳為皮下注射或肌肉內注射。
本發明中之水性醫藥組成物係含有作為有效成分之使血清白蛋白與生長激素結合而成的蛋白質、防腐劑、主要作為穩定劑之蔗糖與非離子性界面活性劑、及作為pH調整劑之緩衝劑而成者。
水性醫藥組成物所含之使血清白蛋白與生長激素結合而成的蛋白質(尤其是22KhGH-mHSA)的濃度，較佳為10～100 mg/mL，更佳為15～70 mg/mL，再更佳為30～65 mg/mL，又再更佳為40～60 mg/mL，例如為50 mg/mL。
作為水性醫藥組成物所含有之防腐劑，只要為藥劑學上能容許者則無特別限定，但較佳為酚。使用酚作為防腐劑之情形，水性醫藥組成物所含有之酚的濃度，較佳為0.5～12 mg/mL，更佳為3～9 mg/mL，再更佳為4～8 mg/mL，又再更佳為5～7 mg/mL，例如為6 mg/mL。
水性醫藥組成物所含有之蔗糖的濃度，較佳為10～150 mg/mL，更佳為50～100 mg/mL，再更佳為60～90 mg/mL，又再更佳為70～80 mg/mL，例如為75 mg/mL。
作為水性醫藥組成物所含有之非離子性界面活性劑，可將聚山梨醇酯及泊洛沙姆等單獨或組合此等而使用。作為聚山梨醇酯，特佳為聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80；作為泊洛沙姆，特佳為泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)。又，水性醫藥組成物所含有之非離子性界面活性劑的濃度，較佳為0.15～10 mg/mL，更佳為1.0～4.5 mg/mL，再更佳為1.5～4.5 mg/mL，又再更佳為2～4 mg/mL，又再更佳為2.5～3.5 mg/mL，例如為3 mg/mL。
水性醫藥組成物所含有之緩衝劑，只要為藥劑學上能容許者則無特別限定，但較佳為磷酸緩衝劑。使用磷酸緩衝劑作為緩衝劑之情形，水性醫藥組成物所含有之磷酸緩衝劑的濃度，較佳為1～30 mM，更佳為2～20 mM，再更佳為5～15 mM，例如為約10 mM。又，藉由緩衝劑所調整之水性醫藥組成物的pH，較佳為5.0～8.0，更佳為6.0～7.8，再更佳為6.5～7.6，又再更佳為7.0～7.4，例如為7.2。又，水性醫藥組成物之相對於生理食鹽水的滲透壓比，係調整成例如1.0～1.3。
作為本發明的水性醫藥組成物的較佳組成，可列舉使血清白蛋白與生長激素結合而成的蛋白質(尤其22KhGH-mHSA)的濃度為10～100 mg/mL、防腐劑的濃度為0.5～12 mg/mL、蔗糖的濃度為10～150 mg/mL、非離子性界面活性劑的濃度為0.15～10 mg/mL、防腐劑的濃度為0.5～12 mg/mL、緩衝劑的濃度為1～30 mM、pH為5.0～8.0者。
作為本發明的水性醫藥組成物的更佳組成，可列舉使血清白蛋白與生長激素結合而成的蛋白質(尤其22KhGH-mHSA)的濃度為10～100 mg/mL、蔗糖的濃度為75 mg/mL、聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的濃度為3 mg/mL、酚的濃度為6 mg/mL、磷酸緩衝劑的濃度為10 mM、pH為7.0～7.4者。各成分的濃度能分別變更成上述較佳濃度之任一者。
作為本發明的水性醫藥組成物的更佳組成，可列舉使血清白蛋白與生長激素結合而成的蛋白質(尤其22KhGH-mHSA)的濃度為15～70 mg/mL、蔗糖的濃度為75 mg/mL、聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的濃度為3 mg/mL、酚的濃度為6 mg/mL、磷酸緩衝劑的濃度為10 mM、pH為7.0～7.4者。各成分的濃度能分別變更成上述較佳濃度之任一者。
含有本發明的HSA-hGH融合蛋白質(尤其22KhGH-mHSA)作為有效成分而成之醫藥，可作為注射劑而投予至靜脈內、肌肉內、腹腔內、皮下或腦室內。該等注射劑可作為冷凍乾燥製劑或水性液劑(水性醫藥組成物)供給。作為水性液劑之情形，可作成填充至小瓶的形態，也可作為預先填充至注射器之載藥型的製劑供給。冷凍乾燥製劑之情形，在使用前溶解於水性介質而復原使用。 [實施例]
以下，參照實施例更詳細地說明本發明，但並未意圖將本發明限定於實施例。
[實施例1] 22KhGH-HSA表現用載體的構築 將為使22KhGH的C端與野生型HSA(序列識別號1)的N端結合者之具有序列識別號15所示之胺基酸序列的蛋白質作為22KhGH-HSA。序列識別號15所示之胺基酸序列中，第1～191個胺基酸殘基相當於22KhGH的胺基酸序列，第192～776個胺基酸殘基相當於HSA的胺基酸序列。化學合成具有序列識別號16所示之鹼基序列的DNA，該序列識別號16包含編碼22KhGH-HSA的基因(22KhGH-HSA基因)。在此序列中，鹼基11～88編碼hGH的前導肽，鹼基89～661編碼成熟型hGH，鹼基662～2416編碼成熟型HSA。以限制酵素(MluI及NotI)消化此DNA，藉由組入pE-mIRES-GS-puro的MluI部位與NotI部位之間，而構築為22KhGH-HSA表現用載體之pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)。此外，pE-mIRES-GS-puro的製作方法被記載於國際專利公報WO2012/063799等，係周知者。
[實施例2] 22KhGH-mHSA表現用載體的構築 將為使22KhGH(序列識別號9)的C端與HSA(A320T)(序列識別號3)的N端結合者之具有序列識別號11所示之胺基酸序列的蛋白質作為22KhGH-mHSA。將實施例1所製作之pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)作為模板，使用引子YA082(序列識別號13)及引子YA083(序列識別號14)，藉由PCR將包含編碼22KhGH-mHSA的基因的DNA片段進行擴增。使此DNA片段自黏合(self-annealing)，構築為22KhGH-mHSA表現用載體之pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)。
[實施例3] 22KhGH-mHSA表現細胞株的製作 如下述進行而製作用於使22KhGH-mHSA表現的細胞。對於為源自中國倉鼠卵巢的細胞之CHO-K1細胞，使用Gene Pulser Xcell電穿孔系統(Bio Rad公司)，導入實施例2所製作的為22KhGH-mHSA表現用載體之pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)。將導入有表現載體的細胞，使用包含16 μM 胸苷、100 μM 次黃嘌呤、10 mg/L 胰島素、L-甲硫胺酸磺醯亞胺(SIGMA公司)及嘌黴素(SIGMA公司)的CD OptiCHO TM培養基(Thermo Fisher Scientific公司)進行選擇培養。在選擇培養之際，使L-甲硫胺酸磺醯亞胺及嘌黴素的濃度階段性地上升，最終將L-甲硫胺酸磺醯亞胺的濃度設為300 μM、將嘌黴素的濃度設為10 μg/mL，選擇性地使顯示較高抗藥性的細胞增殖。接著，藉由限制稀釋法(limiting dilution method)，以每1孔接種1個以下的細胞之方式，將選擇培養所選擇的細胞接種在96孔盤上，培養約10日直到形成源自單一細胞的群落，將細胞殖株化。進一步培養殖株化的細胞而使其增殖後，使其懸浮於含有16 μM 胸苷、100 μM 次黃嘌呤、300 μM L-甲硫胺酸磺醯亞胺及10% (v/v) DMSO的CD OptiCHO TM培養基後，分注至冷凍小管(cryotube)，保存在液態氮中。將此細胞作為22KhGH-mHSA表現細胞株。
[實施例4] 22KhGH-mHSA表現細胞的前培養 以37℃水浴融解實施例3所製作之22KhGH-mHSA表現細胞株，使其懸浮於包含16 μM 胸苷、100 μM 次黃嘌呤及300 μM L-甲硫胺酸磺醯亞胺的無血清培養基之EX-CELL Advanced培養基(前培養用培養基，SIGMA公司)，並進行離心而使細胞沉澱，去除上清液。將沉澱的細胞以2×10 5個/mL以上的密度懸浮於前培養用培養基，在37℃、5% CO 2存在下培養2～4天。一邊使培養規模擴大直到細胞數至少增殖到1.0×10 11個，一邊重複此培養。
[實施例5] 22KhGH-mHSA表現細胞的生產培養 使前培養所增殖的細胞，以細胞濃度為4×10 5個/mL的密度，懸浮在200 L的容量之為包含16 μM的胸苷及100 μM的次黃嘌呤的無血清培養基之EX-CELL Advanced培養基(生產培養用培養基，SIGMA公司)。將此懸浮液在Xcellerex200L培養系統(XDR200)的一次性培養槽內，一邊藉由葉輪以100 rpm的速度進行攪拌，一邊維持37℃、溶氧量40%、pH6.9，培養10日。
[實施例6] 22KhGH-mHSA的精製 (精製步驟1：收取步驟/濃縮1步驟) 生產培養結束後，將培養液使用Millistak+(註冊商標)HC縱槽過濾器(pod filter)等級D0HC (1.1 m 2×2，Merck公司)進行過濾，接著使用Millistak+HC縱槽過濾器等級X0HC (1.1 m 2×1，Merck公司)進行過濾而去除細胞，進一步以Opticap SHC XL3(孔徑：0.5/0.2 μm，Merck公司)進行過濾而獲得培養上清液。使用預先以純水清洗後經PBS平衡化的截留分子量(molecular weight cut-off) 30 kDa的超過濾膜裝置(安裝有Ultracel PLCTK膜的Pellicon3匣，1.14 m 2，Merck公司)，將所得之培養上清液進行濃縮。從超過濾膜裝置回收濃縮後的溶液。再者，將裝置內通過PBS而進行清洗，將此清洗液與先前回收的濃縮後的溶液合併，將重量調整成約15 kg者作為濃縮培養液。接著，將濃縮培養液使用孔徑的最大部為0.5 μm且最小部為0.2 μm之親水性過濾器(Opticap SHC XL600，Merck公司)進行過濾。過濾後，確認濃縮培養液的pH及導電率分別為7.0±0.3、1.2±0.4 S/m。
(精製步驟2：第一層析法步驟(親和力管柱層析法步驟)) 將填充有Capture select Human Growth Hormone Affinity Matrix (Thermo Fisher Scientific公司)的QS管柱(管柱體積：4.2～5.2 L，床高：15.0±1.5 cm，Merck公司)，以管柱體積的1倍容量的50 mM甘胺酸鹽酸緩衝液(pH 3.0)、進一步以管柱體積的1倍容量的0.01 M氫氧化鈉水溶液進行清洗後，以管柱體積的4倍容量的20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)平衡化。接著，將精製步驟1所得之濃縮培養液的1/4量裝填至管柱，使22KhGH-mHSA吸附於管柱。接著，以管柱體積的5倍容量的含有200 mM精胺酸及0.05% (w/v)聚山梨醇酯80的20 mM Tris-HCl緩衝液(pH7.0)、進一步以管柱體積的5倍容量的20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)清洗管柱。接著，將管柱體積的5倍容量的50 mM甘胺酸鹽酸緩衝液(pH 3.0)供給至管柱，沖提22KhGH-mHSA。沖提液係回收至預先放入沖提液量的1/5容量的250 mM MES緩衝液(pH7.0)的容器中，以pH成為6.7±0.3之方式，立刻進行中和。精製步驟2係在4～8℃的冷溫度下實施，又，通過精製步驟2的整體而供給至管柱之溶液的線流速係設為200 cm/小時。又，裝填至每1 L的親和力管柱擔體之22KhGH-mHSA的上限係設為7 g。
(精製步驟3：病毒不活化步驟) 將精製步驟2所得之沖提液加溫至25℃，在此沖提液中添加該液量的1/19容量的含有20.0% (w/v)聚山梨醇酯80的6.0% (v/v)磷酸三(正丁酯)水溶液，在25℃攪拌3小時。
(精製步驟4：第二層析法步驟(羥磷灰石管柱層析法步驟)) 將已在精製步驟3進行病毒去活化處理的流份(fraction)冷卻至8℃，適量添加1 M Tris-HCl緩衝液(pH8.8)與含有4 M NaCl的20 mM MES緩衝液(pH7.0)，將pH及導電率分別調整成7.0±0.1及0.6±0.1 S/m，使用孔徑0.2 μm的親水性過濾器(Merck公司)進行過濾。接著，在冷藏(線流速：200 cm/小時)下實施以下的層析法。
將填充有為羥磷灰石擔體之CHT Type II, 40 μm (Bio-Rad Laboratories公司)的QS管柱(管柱體積：8.8～10.8 L，床高：20.0±2.0 cm，Merck公司)，以200 mM磷酸緩衝液(pH7.0)、接著以1 M NaOH水溶液、進一步以200 mM磷酸緩衝液(pH7.0)進行清洗後，以4倍容量的含有50 mM NaCl及1 mM磷酸二氫鈉的20 mM MES緩衝液(pH7.0)平衡化。接著，將上述濾液裝填至管柱，使22KhGH-mHSA吸附於管柱。接著，以3倍容量的含有50 mM NaCl及1 mM磷酸二氫鈉的20 mM MES緩衝液(pH7.0)清洗管柱。接著，將含有50 mM NaCl及30 mM磷酸二氫鈉的20 mM MES緩衝液(pH7.0)供給至管柱，沖提22KhGH-mHSA。精製步驟4係在4～8℃的冷溫度下實施，又，通過精製步驟4的整體而供給至管柱之溶液的線流速係設為200 cm/小時。又，裝填至每1 L的羥磷灰石擔體之22KhGH-mHSA的上限係設為13 g。
(精製步驟5：第三層析法步驟(多重(multimodal)弱陽離子交換管柱層析法步驟)) 在精製步驟4所得之沖提液中，添加與其同體積的含有50 mM NaCl的20mM MES緩衝液(pH5.7)後，添加稀鹽酸，將pH及導電率分別調整成5.7±0.1、0.7±0.1 S/m。之後，使用孔徑0.5/0.2 μm的親水性過濾器(Merck公司)進行過濾。
將預填充管柱RTP Capto MMC 10 L(管柱體積：8.8～10.8 L，床高：20.0±2.0 cm，Merck公司)，使用1 M NaOH水溶液並接著使用含有1M NaCl的50 mM磷酸緩衝液(pH7.0)進行清洗後，以4倍容量的含有100 mM NaCl的50 mM MES緩衝液(pH5.7)平衡化。接著，將上述濾液裝填至管柱，使22KhGH-mHSA吸附於管柱。接著，以5倍容量的含有100 mM NaCl的50 mM MES緩衝液(pH5.7)清洗管柱。接著，將含有550 mM NaCl的50 mM MES緩衝液(pH5.7)供給至管柱，沖提22KhGH-mHSA。精製步驟5係在4～8℃的冷溫度下實施，又，通過精製步驟5的整體而供給至管柱之溶液的線流速係設為200 cm/小時。又，裝填至每1 L的多重弱陽離子交換擔體之22KhGH-mHSA的上限係設為11.5 g。
(精製步驟6：濃縮2步驟) 對截留分子量30 kDa的超過濾膜(Pellicon3匣Ultracel PLCTK膜，1.14m 2，Merck公司)，使純水通過而充分地清洗後，以含有75 mg/mL蔗糖的10 mM磷酸緩衝液(pH 7.2)平衡化。將精製步驟5所得之沖提液，使用此超過濾膜進行濃縮。在濃縮後的溶液中添加含有75 mg/mL蔗糖的10 mM磷酸緩衝液(pH 7.2)，將吸光度(280 nm)調整成23±3。此濃縮步驟係在室溫下實施。
(精製步驟7：第四層析法步驟(尺寸篩析管柱層析法步驟)) 將精製步驟6所得之濃縮液使用孔徑0.5/0.2 μm的親水性過濾器(Merck公司)進行過濾。將填充有為尺寸篩析層析法用樹脂之Fractogel TMBioSEC樹脂(Merck公司)的QS管柱(管柱體積：25.4～31.1 L，床高：40.0±4.0 cm， Merck公司)以0.5M NaOH水溶液進行清洗後，以含有75 mg/mL蔗糖的10 mM磷酸緩衝液(pH 7.2)平衡化。接著，將上述濾液裝填至管柱，接下來供給含有75 mg/mL蔗糖的10 mM磷酸緩衝液(pH 7.2)。此時，在來自尺寸篩析管柱的沖提液的流路，配置用於連續地測定沖提液的吸光度之吸光光度計，監測280 nm的吸光度，將在280 nm顯示吸收峰的流份回收作為包含22KhGH-mHSA的流份，將此作為22KhGH-mHSA精製品。精製步驟7係在室溫下實施，又，通過精製步驟7的整體而供給至管柱的溶液的線流速係設為30 cm/小時以下。又，裝填至多重弱陽離子交換擔體之含有22KhGH-mHSA的濾液的液量係設為擔體的體積的8%以下。
(精製步驟8：濃縮3步驟) 將中空纖維膜(hollow fiber membrane) (ReadyToProcess Hollow Fiber Cartridge，截留分子量 30 kDa，GE Healthcare公司)以含有75 mg/mL蔗糖的10 mM磷酸緩衝液(pH7.2)平衡化。使用此中空纖維膜，將精製步驟7所得之22KhGH-mHSA精製品進行濃縮，將22KhGH-mHSA的濃度調整成85 mg/mL。在所得之濃縮液中，添加該液量的1/29的容量的含有90 mg/mL泊洛沙姆188與75 mg/mL蔗糖的10 mM磷酸緩衝液(pH7.2)並進行混合，使用孔徑0.5/0.2 μm的親水性過濾器(Merck公司)進行過濾。此濃縮步驟係在室溫下實施。
(精製步驟9：病毒去除步驟) 製作含有3 mg/mL泊洛沙姆188與75 mg/mL蔗糖的10 mM磷酸緩衝液(pH7.2)。使用此緩衝液，使病毒去除膜(Planova 20N，膜面積：0.12 m 2，材質：再生纖維素，Asahi Kasei Medical公司)平衡化。以壓力98 kPa以下，使精製步驟8所得之濾液通過此病毒去除膜而進行過濾。此病毒去除步驟係在室溫下實施。
(精製步驟10：原料藥化步驟) 在室溫下，將精製步驟9所得之濾液以孔徑0.2 μm的親水性過濾器(Merck公司)進行過濾，作為22KhGH-mHSA原料藥。
[實施例7]含有22KhGH-mHSA之水性醫藥組成物的穩定性的探討1 使用實施例6所得之22KhGH-mHSA原料藥，製備含有15 mg/mL 22KhGH-mHSA及20 mM磷酸緩衝劑且pH不同之具有表1所示的組成的6種類的水性醫藥組成物(配方1-1～1-6)。
[表1] 表1 水性醫藥組成物(配方1-1～1-6)的組成
成分 配方 1-1 配方 1-2 配方 1-3 配方 1-4 配方 1-5 配方 1-6
22KhGH-mHSA 15 mg/mL
磷酸緩衝劑 20 mM
鹽酸或氫氧化鈉 適量 適量 適量 適量 適量 適量
pH 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
將上述6種類的水性醫藥組成物各1.5 mL分別填充至玻璃製小瓶，在暗處以5℃靜置保存1週，或以40℃靜置保存1週。靜置後，藉由實施例13所示之SE-HPLC分析，測定各溶液中所含之22KhGH-mHSA的單體、其聚合物、及為其分解物之低分子體的比例。將其結果示於表2。於此，將在暗處以5℃靜置1週、及以40℃靜置1週後的溶液所含之聚合物及低分子體的比例皆為約2%以下一事，預先訂定為穩定的水性醫藥組成物的條件。表2的結果顯示，在此測定條件之下，為了獲得22KhGH-mHSA的穩定的水性醫藥組成物，較佳係將pH設為6.0以上，特佳係將pH設為6.5～7.5。
[表2] 表2 水性醫藥組成物(配方1-1～1-6)的SE-HPLC分析結果
受驗配方 測定點 含量(%)
單體 聚合物 低分子體
配方1-1 pH 5.0 剛製備後 97.19 2.80 0.01
5℃ 1W 97.77 2.21 0.02
40℃ 1W 91.93 6.92 1.16
配方1-2 pH 5.5 剛製備後 97.66 2.33 0.01
5℃ 1W 97.83 2.15 0.01
40℃ 1W 96.67 2.83 0.50
配方1-3 pH 6.0 剛製備後 98.15 1.84 0.01
5℃ 1W 98.10 1.89 0.01
40℃ 1W 97.48 2.01 0.51
配方1-4 pH 6.5 剛製備後 98.35 1.64 0.01
5℃ 1W 98.34 1.65 0.01
40℃ 1W 97.88 1.63 0.49
配方1-5 pH 7.0 剛製備後 98.32 1.67 0.01
5℃ 1W 98.33 1.66 0.01
40℃ 1W 98.09 1.48 0.44
配方1-6 pH 7.5 剛製備後 98.37 1.62 0.01
5℃ 1W 98.36 1.63 0.01
40℃ 1W 98.12 1.48 0.40
[實施例8]含有22KhGH-mHSA之水性醫藥組成物的穩定性的探討2 使用實施例6所得之22KhGH-mHSA原料藥，製備含有15 mg/mL 22KhGH-mHSA及20 mM磷酸緩衝劑且蔗糖及氯化鈉的濃度不同之具有表3所示的組成的3種類的水性醫藥組成物(配方2-1～2-3)。任一溶液的pH皆調整成7.0，滲透壓比皆調整成約1.0。使用蛋白質物性解析裝置(Optim1000，AVACTA公司)，在光析槽(UNi，UNCHAINED LABS公司)中裝入9 μL的測定試料，每次1℃地將光析槽從20.0℃加溫至96.0℃為止，對於各溫度測定在波長473 nm的靜態光散射強度。
[表3] 表3 水性醫藥組成物(配方2-1～2-3)的組成
成分 配方 2-1 配方 2-2 配方 2-3
22KhGH-mHSA 15 mg/mL
磷酸緩衝劑 20 mM
蔗糖 70 mg/mL 53 mg/mL 33 mg/mL
氯化鈉 0 mM 25 mM 55 mM
鹽酸或氫氧化鈉 適量 適量 適量
pH 7.0
將靜態光散射強度的測定結果的圖表示於圖1。在圖1中，縱軸表示靜態光散射強度，在此靜態光散射強度與溶液中所含之因蛋白質凝聚而產生的微粒的濃度之間，存在正相關關係。開始產生凝聚的溫度在配方2-1～2-3中幾乎相同，但藉由使溫度上升，而產生的微粒的量有氯化鈉的濃度愈高則愈多之傾向。因此，為了抑制溶液中所含之22KhGH-mHSA的凝聚，作為添加於水性醫藥組成物的賦形劑，可謂比起氯化鈉，更佳為蔗糖。
[實施例9]含有22KhGH-mHSA之水性醫藥組成物的穩定性的探討3 使用實施例6所得之22KhGH-mHSA原料藥，製備含有35 mg/mL 22KhGH-mHSA、20 mM磷酸緩衝劑及70 mg/mL蔗糖且非離子性界面活性劑(泊洛沙姆188)的濃度不同之具有表4所示的組成的6種類的水性醫藥組成物(配方3-1～3-6)。任一溶液的pH皆調整成7.2，滲透壓比皆調整成約1.0。
[表4] 表4 水性醫藥組成物(配方3-1～3-6)的組成
成分 配方 3-1 配方 3-2 配方 3-3 配方 3-4 配方 3-5 配方 3-6
22KhGH-mHSA 35 mg/mL
磷酸緩衝劑 20 mM
蔗糖 70 mg/mL
泊洛沙姆188 0 mg/mL 0.5 mg/mL 0.8 mg/mL 1.0 mg/mL 1.5 mg/mL 2.0 mg/mL
鹽酸或氫氧化鈉 適量 適量 適量 適量 適量 適量
pH 7.2
將上述6種類的水性醫藥組成物各1 mL分別填充至玻璃製小瓶，在室溫環境下以240往復/分鐘振盪24小時。藉由實施例13所示之SE-HPLC分析，測定振盪前及振盪後之各溶液中所含的22KhGH-mHSA整體中聚合物所佔的比例，求取從振盪後的聚合物含量(%)減去振盪前的聚合物含量(%)之值作為聚合物增加量(%)。將其結果示於表5。在此條件下，藉由使泊洛沙姆188的濃度成為1.0 mg/mL以上，可抑制聚合物的生成，藉由使其濃度成為1.5 mg/mL以上，可幾乎完全抑制聚合物的生成。此外，在不包含泊洛沙姆188的配方3-1中，因大量生成聚合物而無法獲得測定值。
[表5] 表5 水性醫藥組成物(配方3-1～3-6)中之界面活性劑的濃度與由振盪所致之影響的關係
成分 配方 3-1 配方 3-2 配方 3-3 配方 3-4 配方 3-5 配方 3-6
泊洛沙姆188 0 mg/mL 0.5 mg/mL 0.8 mg/mL 1.0 mg/mL 1.5 mg/mL 2.0 mg/mL
SE-HPLC 聚合物增加量(%) N.D. 13.87 4.46 0.54 0.06 0.00
接著，將22KhGH-mHSA的濃度設為130 mg/mL，製備含有20 mM磷酸緩衝劑及70 mg/mL蔗糖且非離子性界面活性劑(泊洛沙姆188)的濃度不同之具有表6所示的組成的5種類的水性醫藥組成物(配方4-1～4-5)。任一溶液的pH皆調整成7.2，滲透壓比皆調整成約1.0。
[表6] 表6 水性醫藥組成物(配方4-1～4-5)的組成
成分 配方 4-1 配方 4-2 配方 4-3 配方 4-4 配方 4-5
22KhGH-mHSA 130 mg/mL
磷酸緩衝劑 20 mM
蔗糖 70 mg/mL
泊洛沙姆188 2 mg/mL 4 mg/mL 6 mg/mL 8 mg/mL 10 mg/mL
鹽酸或氫氧化鈉 適量 適量 適量 適量 適量
pH 7.2
將上述6種類的水性醫藥組成物各0.8 mL分別填充至玻璃製小瓶，在室溫環境下以240 往復/分鐘振盪24小時。振盪後，藉由實施例13所示之SE-HPLC分析，測定各溶液中所含的22KhGH-mHSA整體中聚合物及低分子體所佔的比例。將其結果示於表7。在配方4-1～4-5之任一者中，聚合物含量(%)及低分子體含量(%)的值皆與振盪前的值幾乎無變化(未顯示振盪前的數據)，聚合物含量(%)及低分子體含量(%)的值在全部的配方中為同等。
[表7] 表7 水性醫藥組成物(配方4-1～4-5)中之界面活性劑的濃度與由振盪所致之影響的關係
成分 配方 4-1 配方 4-2 配方 4-3 配方 4-4 配方 4-5
泊洛沙姆188 2 mg/mL 4 mg/mL 6 mg/mL 8 mg/mL 10 mg/mL
聚合物含量(%) 2.18 2.12 2.09 2.11 2.13
低分子體含量(%) 0.38 0.42 0.39 0.42 0.40
[實施例10]含有22KhGH-mHSA之水性醫藥組成物的穩定性的探討4 使用實施例6所得之22KhGH-mHSA原料藥，製備含有35 mg/mL 22KhGH-mHSA、20 mM磷酸緩衝劑、70 mg/mL蔗糖、1.0 mg/mL非離子性界面活性劑(泊洛沙姆188)及作為防腐劑的3.3 mg/mL酚之具有表8所示的組成之pH不同的3種類的水性醫藥組成物(配方5-1～5-3)。
[表8] 表8 水性醫藥組成物(配方5-1～5-3)的組成
成分 配方 5-1 配方 5-2 配方 5-3
22KhGH-mHSA 35 mg/mL
磷酸緩衝劑 20 mM
蔗糖 70 mg/mL
泊洛沙姆188 1.0 mg/mL
酚 3.3 mg/mL
鹽酸或氫氧化鈉 適量 適量 適量
pH 6.2 6.7 7.2
將上述3種類的水性醫藥組成物各1 mL分別填充至玻璃製小瓶，在暗處以5℃或25℃靜置保存2個月。針對以5℃靜置者係在2週後、1個月後及2個月後，而針對以25℃靜置者係在1個月後及2個月後，進行實施例13所記載之SE-HPLC分析及實施例15所記載之微粒數分析。將其結果示於表9。
若針對依據SE-HPLC測定之聚合物含量來看，則調整成pH 7.2的配方5-3在以5℃靜置1個月之情形、以25℃靜置2個月之情形的任一者中皆幾乎無變化。另一方面，調整成pH 6.2的配方5-1在以5℃靜置1個月之情形、以25℃靜置2個月之情形的任一者中，皆觀察到聚合物的含量隨著時間增加。又，調整成pH 6.7的配方5-2在以5℃靜置1個月之情形中，聚合物的含量並無變化，但在以25℃靜置2個月之情形中則觀察到聚合物隨著時間增加。若針對依據SE-HPLC測定之低分子體含量來看，則在以5℃靜置1個月之情形中，配方5-1～5-3的任一者中皆幾乎無變化。另一方面，在以25℃靜置2個月之情形中，在任一配方中皆觀察到低分子體含量的增加，但其程度輕微。若針對微粒數分析來看，則在調整成pH 7.2的配方5-3中，相較於配方5-1及5-2，10 μm以上及25 μm以上的微粒數係大幅地減少。
[表9] 表9 水性醫藥組成物(配方5-1～5-3)的穩定性探討結果
評價項目 配方 剛製備後 5℃ 2W 5℃ 1M 5℃ 2M 25℃ 1M 25℃ 2M
SE-HPLC 分析 聚合物含量 (%) 5-1 1.69 1.80 1.85 1.99 2.12 2.25
5-2 1.68 1.79 1.83 1.85 1.87 1.92
5-3 1.72 1.81 1.83 1.83 1.77 1.80
低分子體含量 (%) 5-1 0.12 0.12 0.15 0.13 0.32 0.42
5-2 0.13 0.14 0.15 0.14 0.36 0.49
5-3 0.12 0.14 0.16 0.15 0.41 0.55
微粒數 分析 (個/mL) 10μm以上 5-1 34 51 820 957 222 684
25μm以上 17 17 68 34 0 51
10μm以上 5-2 34 17 1266 325 461 736
25μm以上 0 0 188 51 51 68
10μm以上 5-3 34 34 205 188 103 34
25μm以上 0 0 17 34 0 0
[實施例11]水性醫藥組成物的製劑設計 由上述實施例7～10所示的結果，作為含有22KhGH-mHSA之水性醫藥組成物的製劑配方的較佳一例，能設計含有50 mg/mL 22KhGH-mHSA、10 mM磷酸緩衝劑、75 mg/mL蔗糖、3 mg/mL泊洛沙姆188及6 mg/mL酚且將pH調整成7.2、將滲透壓比調整成約1.0之具有表10所示的組成者(配方6)。此水性醫藥組成物能以0.5～10 mL的液量填充・封入玻璃製或塑膠製的小瓶、安瓿或注射器。預先填充至注射器者亦能作為載藥型的製劑供給。保存溫度為2～10℃，例如較佳為4℃，假定保存在能記錄溫度的冰箱中。
[表10] 表10 水性醫藥組成物(配方6)的組成
成分 配方6
22KhGH-mHSA 50 mg/mL
磷酸緩衝劑 10 mM
蔗糖 75 mg/mL
泊洛沙姆188 3 mg/mL
酚 6 mg/mL
鹽酸或氫氧化鈉 適量
pH 7.2
[實施例12]含有22KhGH-mHSA之水性醫藥組成物的穩定性的探討5 製備具有表10所示的組成之配方6的水性醫藥組成物，填充1.7 mL至硼矽酸玻璃製注射管(cartridge)中，在暗處以5℃靜置保存12個月。在3個月後、6個月後及12個月後，進行實施例14所記載之性質試驗、實施例16所記載之不溶性異物檢查及pH測定、實施例13所記載之SE-HPLC分析、實施例15所記載之微粒數分析及實施例17所記載之22KhGH-mHSA定量。將其結果示於表11。在任一檢查值中皆無大的變化，可知配方6作為含有22KhGH-mHSA之水性醫藥組成物，至少12個月是穩定的。此外，表11中，定量法(相對理論值(%))表示將在製備配方6時的22KhGH-mHSA的量設為100%時之實際的定量值(%)。
[表11] 表11 水性醫藥組成物(配方6)的注射管製劑的穩定性試驗結果
評價項目 剛製備後 5℃ 3M 5℃ 6M 5℃ 12M
性質試驗 帶褐黃色的 澄清液體 帶褐黃色的 澄清液體 帶褐黃色的 澄清液體 帶褐黃色的 澄清液體
不溶性異物檢查 未觀察到 未觀察到 未觀察到 未觀察到
pH測定 7.21 7.17 7.20 7.18
SE-HPLC 單體含量(%) 98.4 98.2 98.4 97.6
聚合物含量(%) 1.31 1.47 1.49 1.89
低分子體含量(%) 0.33 0.31 0.07 0.50
微粒 測定 (個/mL) 10μm以上 179 11 184 40
25μm以上 100 0 6 6
定量值(相對理論值(%)) 102 102 100 102
[實施例13] SE-HPLC分析(使用SE-HPLC之22KhGH-mHSA的聚合物、單體及低分子體含量的測定) 將磷酸二氫鈉二水合物及氯化鈉溶解於水，製備含有0.1 M的磷酸、0.2 M的氯化鈉之磷酸鹽緩衝液。又，製備為試驗對象之與各水性醫藥組成物為相同組成且不包含22KhGH-mHSA及酚之溶液，將此作為試料稀釋液。
將為試驗對象之水性醫藥組成物，使用試料稀釋液，以蛋白質濃度成為2.0 mg/mL之方式進行調整，作為試料溶液。
使用HPLC裝置(LC-20A，島津製作所公司)及管柱(TSKgel G3000SW XL，Tosoh公司)，藉由下述的表12所示之條件進行測定。但是，針對流量，不一定限定成表12所示的條件，而以主峰的滯留時間成為12分鐘左右之方式進行適當調整。將代表性的層析圖示於圖2。在藉由試料溶液的測定所得之層析圖上，將在滯留時間12分鐘左右檢測到之主峰當作單體，將在主峰之前檢測到之峰當作聚合物，將在主峰之後檢測到之峰當作低分子體，由各峰的面積算出主峰含量(%)、聚合物含量(%)、低分子體含量(%)。此外，在23.5分鐘左右檢測到之峰係源自酚，故從解析排除。又，針對與在藉由試料稀釋液的測定而得之層析圖上所檢測到的峰相同的峰，亦從試料溶液的解析排除。
[表12] 表12 SE-HPLC測定條件
檢測器 紫外吸光光度計 (波長215 nm)
槽(cell)部溫調溫度 40℃
管柱溫度 25℃
自動取樣器溫度 4℃
流量 0.7 mL/min
在層析圖上進行峰面積的 計算之滯留時間的範圍 注入測定對象試料後30分鐘
[實施例14]性質試驗 作為顏色的比較液，使用下述。 (1) Color Reference Solutions B套組(褐色，Sigma-Aldrich公司) (2) Color Reference Solutions BY套組(帶褐黃色，Sigma-Aldrich公司) (3) Color Reference Solutions Y套組(黃色，Sigma-Aldrich公司)
將裝有為試驗對象之水性醫藥組成物的容器(小瓶等)，使用黑色及白色的背景，從容器側面進行觀察，確認色調及澄清性。在判斷色調時，也可使用顏色的比較液。
[實施例15]微粒數的測定 測定條件：使用流式細胞粒子影像解析裝置(FlowCam VS-1，FLUID IMAGING TECHNOLOGIES公司)，藉由下述的表13所示之條件進行測定。使用流量槽(FC80FV-5，FLUID IMAGING TECHNOLOGIES公司)，實施為試驗對象之水性醫藥組成物所含的微粒數(個/mL)。微粒數係分別測定具有10 μm以上及25 μm以上的直徑者的個數。
[表13] 表13 微粒數的測定條件
樣本體積 100 μL
離最近者的距離 0 μm
流速 0.05 mL/min
自動成像速率 每秒鐘22幀
[實施例16]不溶性異物檢查、pH的測定及滲透壓比測定的方法 針對不溶性異物檢查、pH的測定及滲透壓比測定，係藉由日本藥典所訂定的一般手法而實施。此外，不溶性異物檢查係藉由目視確認有無容易被檢測的不溶性異物之檢查法。
[實施例17] 22KhGH-mHSA的定量(Bradford法) 將已知濃度的22KhGH-mHSA溶液以水進行稀釋，製備分別含有1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL之22KhGH-mHSA的溶液，分別作為標準溶液1～5。將為試驗對象之水性醫藥組成物，以蛋白質濃度落入0.4～0.8 mg/mL的範圍之方式，以水進行稀釋，作為試料溶液。
利用考馬斯試劑(Coomassie Reagent)之反應：在15 mL離心管中各取5 mL的Pierce TMCoomassie (Bradford) Protein Assay Kit (ThermoFisher SCIENTIFIC公司)所含之Pierce Coomassie Assay Reagent，並取測定所需的管數份。接著，在取有Pierce Coomassie Assay Reagent的15 mL離心管中，各分別添加100 μL之水(空白組(blank)用)、標準溶液1～5及試料溶液，在翻轉混合後在室溫下靜置10分鐘使其反應。反應後迅速地使用分光光度計(UV-2600，島津製作所公司)，在測定用槽(光析槽，光徑長10 mm，光徑寬10 mm，Sarstedt公司)中裝入2 mL以上的測定試料，在波長595 nm進行吸光度測定。將標準溶液1～5的吸光度取作Y軸，將理論蛋白質濃度取作X軸，作成迴歸線(校正曲線)，由試料溶液的吸光度算出蛋白質濃度。 [產業上利用之可能性]
若依據本發明，可使含有血清白蛋白與生長激素連結而成的蛋白質作為有效成分之醫藥，以水性醫藥組成物的形態在市場上流通。 [序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1：野生型人類血清白蛋白的胺基酸序列 序列識別號2：人類血清白蛋白Redhill的胺基酸序列 序列識別號3：人類血清白蛋白變異體(A320T)的胺基酸序列 序列識別號4：連接子的胺基酸序列的例1 序列識別號5：連接子的胺基酸序列的例2 序列識別號6：連接子的胺基酸序列的例3 序列識別號7：源自野生型小鼠腦心肌炎病毒之內部核糖體進入位的部分鹼基序列 序列識別號8：源自變異型小鼠腦心肌炎病毒之內部核糖體進入位的部分鹼基序列 序列識別號9：22K人類生長激素的胺基酸序列 序列識別號10：20K人類生長激素的胺基酸序列 序列識別號11：22KhGH-mHSA的胺基酸序列 序列識別號12：20KhGH-mHSA的胺基酸序列 序列識別號13：引子YA082，合成序列 序列識別號14：引子YA083，合成序列 序列識別號15：22KhGH-HSA的胺基酸序列 序列識別號16：包含22KhGH-HSA基因的鹼基序列，合成序列
無。
圖1係顯示實施例的靜態光散射強度的測定結果之圖。縱軸表示在473nm之靜態光散射強度(任意單位)，橫軸表示溫度。圖中，(a)、(b)及(c)分別為配方2-3、2-2及2-1的測定結果。
圖2(a)顯示實施例10中之配方5-1在剛製備後的SE-HPLC圖表。縱軸表示在215nm之吸光度(任意單位)，橫軸表示滯留時間(分鐘)。圖2(b)係將圖2(a)在縱軸方向上擴大之圖。圖中，峰1對應於22KhGH-mHSA的單體，峰2對應於其聚合物，峰3對應於其低分子體，峰4對應於酚。
無。

Claims (1)

  1. 一種水性醫藥組成物，其係含有人類血清白蛋白與人類生長激素之融合蛋白質作為有效成分而成之水性醫藥組成物，該融合蛋白質的濃度為50mg/mL，蔗糖的濃度為75mg/mL，聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇(Polyoxyethylene(160)polyoxypropylene(30)glycol)的濃度為3mg/mL，酚的濃度為6mg/mL，磷酸緩衝劑的濃度為10mM，pH為7.0~7.4，該融合蛋白質的胺基酸序列為具有序列識別號11所示之胺基酸序列者。
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