TWI885613B - 細胞培養容器、細胞培養裝置及細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

提供一種能夠將在1個的細胞培養容器處所培養了的複數枚之細胞片容易地作卸下之細胞培養容器。該細胞培養容器，其特徵為，係具備有：框體，係將培養容器作區隔；和基材，係在藉由前述框體而被作了區隔的複數之區劃處，於前述各區劃之每一者處而被配置在前述培養容器之底面處，前述基材，係能夠於前述各區劃之每一者處而作卸下。

Description

細胞培養容器、細胞培養裝置及細胞培養方法

本發明，係有關於細胞培養容器之構造、和使用有此之細胞培養裝置，以及細胞培養方法。

使用再生了的組織或者是細胞來使發生有功能不全或損傷之組織恢復的再生醫療，係作為針對於先前技術中並不存在有治療方法的疾病之根治治療法而備受期待。作為再生醫療之代表性的移植形態之其中一者，係可列舉出使細胞與細胞或者是使細胞與細胞外基質(Extracellular matrix)作了結合的細胞片。基於今後所能夠預見的細胞片之需求，為了工業性地供給具有一定之品質的細胞片，係對於大量地培養、製造出複數之細胞片的技術之開發有所需求。

作為本技術領域之背景技術，例如，係存在有像是專利文獻1一般之技術。在專利文獻1中，係揭示有反覆進行「在被組入至了於表面上被覆有溫度回應性聚合物的培養皿中之小容器內培養細胞而得到細胞片，並藉由具備有細胞附著部之培養細胞移動治具來將細胞片作回收」之工程的方法。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特開2015-192640號公報

[發明所欲解決之問題]

但是，在將複數人之量的細胞片以培養裝置來進行自動培養的情況時，若是使用封閉系培養容器來以1個病患之量的單位來進行培養，則培養裝置之流路係變得複雜。故而，係有必要以大面積之培養容器來進行複數病患之量的製造。

在一次製造出複數病患之量之細胞片的情況時，係有必要將大面積之細胞片從培養容器之底面而剝離。

又，係有必要將該大面積之細胞片分別切斷為1個1個的病患之量。

然而，在專利文獻1中，係並未針對「將在培養時為接著於培養容器之底面處的細胞片並不從培養容器之底面剝離地而作取出」一事作任何之記載。故而，可以推測到，為了將複數枚之細胞片從培養容器而剝離，係會耗費時間。

因此，本發明之目的，係在於提供一種能夠將在1個的細胞培養容器處所培養了的複數枚之細胞片容易地作卸下之細胞培養容器、和使用有此之細胞培養裝置以及細胞培養方法。 [用以解決課題之手段]

為了解決上述課題，本發明，其特徵為，係具備有：框體，係將培養容器作區隔；和基材，係在藉由前述框體而被作了區隔的複數之區劃處，於前述各區劃之每一者處而被配置在前述培養容器之底面處，前述基材，係能夠於前述各區劃之每一者處而作卸下。

又，本發明，其特徵為，係具備有：細胞培養容器，係具備有將培養容器作區隔之框體、和在藉由前述框體而被作了區隔的複數之區劃處於前述各區劃之每一者處而被配置在前述培養容器之底面處之基材，前述基材係能夠於前述各區劃之每一者處而作卸下，前述框體之高度係較前述培養容器之側壁之高度而更低；和蓋，係覆蓋前述培養容器之開口部；和液體保持部，係收容培養液；和送液管，係貫通前述蓋，並從前述液體保持部而對於前述培養容器供給前述培養液；和排出管，係貫通前述蓋，並從前述培養容器而將前述培養液排出。

又，本發明，其特徵為，係具備有：對於培養容器而供給包含有細胞之培養液，並在被配置於藉由框體而被作了區隔的複數之區劃處並且能夠於前述各區劃之每一者處而作卸下之基材上，培養細胞片之步驟；和將前述框體卸下之步驟；和取得乘載有所培養了的前述細胞片之前述基材之步驟。 [發明之效果]

若依據本發明，則係可實現一種能夠將在1個的細胞培養容器處所培養了的複數枚之細胞片容易地作卸下之細胞培養容器、和使用有此之細胞培養裝置以及細胞培養方法。

藉由此，將細胞片從培養容器而取出之工程係變得更為簡便，而能夠將所製造出的細胞片有效率地搬運至移植現場處。

上述記載以外的課題、構成以及效果，係基於以下之實施形態的說明而成為更加明瞭。

以下，針對本發明之實施例，使用圖面而作說明。另外，在各圖面中，針對相同之構成，係附加相同的元件符號，關於重複之部分，係省略其之詳細說明。 實施例1

參照圖1A～圖8，針對本發明之實施例1之細胞培養容器和使用有此之細胞培養裝置以及細胞培養方法進行說明。

首先，基於圖1A～圖1D，針對本實施例之細胞培養容器101之其中一個構成作說明。圖1A，係為從上方來對於細胞培養容器作了觀察之平面圖。圖1B，係為圖1A之A-A'剖面圖。圖1C，係為在圖1B中的細胞培養容器之分解圖。圖1D，係為對於正在使用細胞培養容器101而培養細胞片的模樣作展示之圖。

在圖1A～圖1C中，係對於細胞培養容器101和位於其之內部的可卸下培養構件之構成作展示。可卸下培養構件，係由框體102與基材103所成。基材103，係能夠進行細胞之接著和增殖。框體102，係相對於基材103之周緣而於垂直方向上相接。

藉由此構成，基材103之周緣，由於係被放置在框體102之下，因此，在培養中，培養基係存在於基材103中，但是，係能夠避免基材103之位置發生變化或者是浮起的情形。又，在位置於框體102之下部處的基材103之周緣處，由於細胞係並不會生育，因此，在培養細胞並將框體102作了卸下之後，藉由把持細胞並未生育之基材103之周緣，係能夠並不對於所培養了的細胞造成損傷地而將基材103取出。基材103，係於被框體102所包圍之各區劃之每一者處而分別被獨立配置，而並非為會跨越至相鄰接之區劃處地而被作配置者。框體102，係包含有細胞為非接著性之材質。具體而言，框體102，係為矽膠等之素材，例如係藉由注模而被製作。框體102，係藉由矽膠等之素材本身所具有之性質、或者是藉由在製作後進行電漿處理等之表面處理，來將框體102之表面設為細胞非接著性。藉由此，來避免在培養中而細胞接著於框體102上的情形。又，就算是當細胞接著於框體102之外部104處的情況時，亦由於框體102係為細胞非接著性，因此，係不會有細胞一直移動至其他之區劃處的情形。

框體102之剖面形狀，例如係設為如同在圖1B中所示一般之梯形。係亦可如同在實施例2(圖9A～圖9E)處而於後再述一般地來設為其他之形狀。框體102之高度，例如係設為1mm程度，而設為細胞直徑之約1000倍之高度。藉由在框體102處設置有高度，就算是細胞接著於框體102上並於其之上移動，也成為能夠對於其之在框體102所形成的區劃間之移動造成阻礙。

又，框體102之高度，係設為在後述之細胞播種時之搖動或培養基交換時不會對於培養基之移動造成妨礙的程度之高度。具體而言，框體102之高度，係只要設為較細胞培養容器101之側壁而更低即可，框體102之高度只要有細胞培養容器101之側壁之二分之一程度之高度即可。又，培養基量雖係依存於細胞種類而有所相異，但是，具體而言，培養基之高度，係設為數mm～數cm，若是存在有將框體102作覆蓋之程度的培養基量則為理想。

框體102，係如同在圖1A中所示一般，於細胞培養容器101內形成1以上之區劃。各區劃之大小，係與在移植時所使用的細胞片之大小相同。在位置於框體102之內側處的各區劃之中，係被設置有基材103，並在基材103上培養細胞。

細胞培養容器101，係亦可藉由前述之方法而設為細胞非接著性。藉由此，框體之外部104之細胞培養容器101之底面係成為細胞非接著性，而防止細胞接著於框體之外部104處的情形。

基材103，係只要設置較位置於框體102之內部的各區劃之面積而更大的基材即可，在藉由框體102而將基材103作了按壓時，若是所露出的基材103之面積係與在移植時所使用的細胞片之大小相同，則為理想。

基材103，係以身為具備有多孔質之薄膜為理想。又，基材103之素材，係只要為塑膠即可，具體性而言，係可列舉出聚氨酯丙烯酸酯、聚酯丙烯酸酯、環氧丙烯酸酯、聚(甲基)丙烯酸甲酯、乙氧基化雙酚A丙烯酸酯、脂肪族聚氨酯丙烯酸酯、聚酯丙烯酸酯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、丙烯酸改質脂環式環氧化物、雙官能醇醚型環氧化合物、丙烯酸矽酮、丙烯酸二甲基矽氧烷等。又，係亦可為身為組織接著劑之纖維蛋白糊或貝靈(Periblast)。

如同在圖1C中所示一般，於細胞培養容器101上放置基材103，並放置框體102。係亦可對於框體102而將基材103藉由熱溶著等之手段來預先作安裝。於此情況，較理想，係以在培養後能夠將基材103藉由以鑷子等來作把持等之方法而簡單地卸下之程度的強度來作安裝。係亦可牢固地作安裝，並藉由手術刀等來作切斷。

在將框體102與基材103設置於細胞培養容器101之中的狀態下，為了避免在培養中而細菌等從細胞培養容器101之外部而進入並產生生物學性之污染，係在細胞培養容器101之上方處，設置將細胞培養容器101之開口部全體作覆蓋的蓋105。蓋105，例如係亦可設為與細胞培養容器101相同之素材，並藉由熱溶著等之方法來作設置。或者是，係亦可藉由螺絲鎖合等來設置蓋105。

細胞培養容器101，係亦可配合於細胞培養裝置之形態，而具備有培養基供給管、排出管、送氣管等，只要因應於培養基交換方法、氣體交換方法來設置各管即可。此些之管，係貫通蓋105地而作設置。細胞培養容器101，係並不需要為了成為能夠對於1個的細胞培養容器101而製造複數枚之細胞片而在細胞培養裝置內具備有複數之供給管和排出管、送氣管。

在圖2A以及圖2B中，對於變形例作展示。圖2A，係為對於圖1D之變形例作展示之圖，圖2B，係為在圖2A中的細胞培養容器之分解圖。

如同在圖2A以及圖2B中所示一般，係亦可替代蓋105，而具備有容易進行開閉之蓋201。蓋201，係使縱剖面具備有凹形狀，並以在將蓋201被覆於細胞培養容器101處時會使蓋201之內側之側面與細胞培養容器101之外側之側面相嵌合的方式而被成形。藉由把持蓋201之外側之側面，係能夠容易地進行蓋201之開閉。藉由設為此種形狀，在實施細胞播種、培養基交換等之操作時，係能夠在安全腔等之中來無菌性地將蓋201作開閉並實施必要之作業。

如同在圖10中所示一般，於培養時，若是將細胞與培養基106一同作播種，則到達了位置於框體102之內側處之各區劃內之基材103上的細胞，係接著、伸展並增殖，在培養後，係持續增殖直到成為片狀為止，而形成細胞片107。由於框體102係為細胞非接著性，因此，於此之上係並不存在有細胞。

到達了框體之外部104處之細胞，當將框體之外部104設為細胞非接著性的情況時，於培養基交換時係被去除。當將框體102之外部104設為細胞接著性的情況時，細胞雖會接著、伸展、增殖，但是，由於框體102係身為細胞非接著性，因此，係不會有一直移動至位置在框體102之內側處之各區劃處的情形。

於培養後，將蓋105無菌性地卸下，並將框體102同樣地無菌性地取出。之後，將基材103取出。基材103，由於係僅為被設置在細胞培養容器101之上，因此，係能夠藉由以鑷子來作把持等之方法，來簡單地從細胞培養容器101取出。亦即是，係能夠將所培養了的細胞片107從細胞培養容器101來一枚一枚地簡便地取出。

又，基材103，由於係藉由框體102而被區隔為與在移植中所使用之細胞片之大小相同的大小，因此，在培養後係並不需要將細胞片作切斷。另外，係能夠將1枚的基材設為1個病患之量，亦可將複數枚之基材設為1個病患之量。

圖3A～圖3D，係均為圖1A之變形例，並為在圖1A～圖1D中所作了說明的細胞培養容器101之框體102中而對於位置在框體102之內部的各區劃之形狀之例作了展示之圖。圖3A，係為藉由框體302來將在圖1A中之各區劃之面積作了縮小者。圖3B，係為藉由框體302來在1個的細胞培養容器301中具備有複數種類之大小之區劃者。在圖3B中，係展示有大、中、小之3種類的大小之區劃。圖3C以及圖3D，係為將藉由框體302所規定的區劃之形狀設為圓形者。圖3C，係為具備有框體之外部304之例，圖3D，係為將框體302之面積設定為廣而並不設置框體之外部304之例。

區劃之大小或形狀，係亦可配合於所移植之移植部位的大小或形狀來適宜對於組合作選擇。區劃之形狀，係亦可設為圓形以外之形狀。係能夠製作出所期望之大小、形狀之細胞片，而能夠將需要熟練的作業之細胞片之切斷工程作省略。

圖4A～圖4H，係為對於在細胞培養容器處的細胞片之從培養起直到回收、包裝為止之工程作展示之圖。

圖4A，係對於緊接於培養後的狀態作展示。在細胞培養容器401之內部，係被設置有框體402和基材403，在基材403之上係被接著有細胞片404。在細胞培養容器401內，係被裝入有培養基405。在培養後，係將培養基405排出，並藉由生理食鹽水、磷酸緩衝液(PBS：phosp hate-buffered saline)等來進行適當之次數之洗淨。洗淨作業，係可使用封閉系細胞培養裝置來自動性地實施，亦可從封閉系細胞培養裝置而將細胞培養容器401卸下並在安全腔內而以手動作業來實施。

接著，如同在圖4B中所示一般，將蓋406卸下。當將前述之洗淨在安全腔內而以手動作業來實施的情況時，係亦可先將蓋406去除之後再進行洗淨。

接著，如同在圖4C中所示一般，將框體402藉由鑷子等來作把持並無菌性地卸下。由於框體402係為細胞非接著性，因此，係並不會有將基材403上的細胞作拉扯的情況，而能夠僅將框體402卸下。當框體402係為細胞接著性的情況時，基材403上之細胞片404與框體402係會經由細胞而相互連接，在將框體402上舉時，細胞片404也會移動。為了避免此，框體402係有必要為細胞非接著性。

接著，如同在圖4D中所示一般，將細胞片404所接著之基材403，藉由鑷子等來作把持並無菌性地從細胞培養容器401而卸下。

接著，如同在圖4E中所示一般，在預先所準備了的支持體407之上，放置基材403與細胞片404。此時，係以會使細胞片404與支持體407相接的方式來作放置。支持體407，除了可為藉由身為組織接著劑之纖維蛋白糊或貝靈(Periblast)所製作出的支持體以外，亦可為親水性PVDF膜、硝酸纖維素膜等。

之後，如同在圖4F中所示一般，放置在包裝材408之上，並進而將其他之包裝材408以覆蓋基材403和細胞片404以及支持體407的方式而作被覆。

接著，如同在圖4G中所示一般，將上下之包裝材408作熱熔著，而將基材403和細胞片404以及支持體407藉由包裝材408來作密封。在此狀態下，於適當地將溫度、壓力、清淨性作了維持的狀態下，來一直輸送至手術室處。於輸送時，為了保持細胞之品質狀態，係亦可使用安裝在包裝材408處之輸送用溶液注入口(未圖示)與輸送用溶液排出口(未圖示)，來以在包裝材408內裝入有輸送用溶液的狀態下而進行輸送。

於進行輸送之前，由於係並不進行將細胞片404從基材403而剝離之工程，因此，係能夠削減在細胞片404之處理中所耗費之時間，而能夠將大氣之對於細胞片404之影響抑制在最小限度。

於輸送後，將細胞片404和基材403以及支持體407無菌性地從包裝材408而取出，並如同在圖4H中所示一般地，將基材403從細胞片404而剝離。例如，係將基材403藉由鑷子等來作把持並從細胞片404而剝離。

係亦可先對於基材403以及細胞片404而例如進行中性蛋白酶(dispase)等之酵素處理而僅進行細胞片404之基底層之分解，之後，如同圖4H一般地而將基材403藉由鑷子等來作把持並作卸下。又，係亦可將基材403設為溫度回應性培養表面，而在培養時設為疏水性並以細胞接著性的狀態來處理，並且於輸送後使溫度降低而設為親水性並以細胞非接著性的狀態來處理，而如同圖4H一般地來將基材403藉由鑷子等來作把持並作卸下。

又，係亦可將固化前之狀態的組織接著劑作為支持體407而乘載於細胞片404處，並藉由使組織接著劑固化來使細胞片404與組織接著劑牢固地一體化，之後，藉由將身為組織接著材之支持體407以鑷子來上舉，而將細胞片404從基材403作剝離。由於係使細胞片404與組織接著材牢固地一體化，因此，係成為容易將細胞片404從基材403而剝離。當支持體407係為組織接著劑的情況時，係可亦包含有支持體407地來進行移植。

當支持體407係為親水性PVDF膜、硝酸纖維素膜等的情況時，係先進行移植，之後將親水性PVDF膜、硝酸纖維素膜等卸下。

另外，如同在圖4F以及圖4G中所示一般，雖係在並不將基材403卸下的狀態下而進行包裝，之後再輸送至手術室處，但是，係亦可在將基材403作了卸下的狀態下而進行包裝，之後再輸送至手術室處。於此情況，在將細胞片404作包裝之前，係將基材403卸下，並成為在使基材403被剝離了的狀態下而進行輸送，而能夠減少在手術室處之作業。

若依據如同上述一般所構成之細胞培養容器，則係能夠將所培養了的細胞片一枚一枚地並不從基材剝離地而從細胞培養容器取出，而能夠將細胞片之取出簡便化。又，在將細胞片從細胞培養容器而取出時，係並不需要準備追加之裝置等，便能夠將細胞片取出。圖5，係為對於本實施例的細胞培養裝置之概略構成作展示之圖。本實施例之細胞培養容器，係不論是封閉系細胞培養裝置或者是框體型細胞培養裝置均可作使用，但是，在本實施例中，係作為其中一例，而對於使用了封閉系細胞培養裝置之例作展示。

如同在圖5中所示一般，包含有封閉系之細胞培養容器501的封閉系細胞培養裝置，係使藉由控制裝置502而被作控制之各構成要素被與被配置在培養箱503之內部的細胞培養容器501作連接。在控制裝置502處，係被連接有用以對於培養箱503之溫度作控制之溫度調節部504、和用以對於培養箱503內之氣體濃度作控制之氣體濃度調節部506、和被設置在用以自動性地對於細胞培養容器501內之培養基進行送液的封閉系流路迴路中處之幫浦507、和CO2、O2感測器508、和培養基、培養上清液包511、以及溫度感測器550。在氣體濃度調節部506處，係被連接有氣體供給部505，並從氣體供給部505而對於氣體濃度調節部506供給有CO2、O2、N2等之氣體。

控制裝置502，係對應於在「具備有由CPU (Central Processing Unit，中央處理部)所成之處理部、記憶部、由顯示器裝置以及鍵盤所成之輸入輸出部等的通常之電腦」中之處理部以及記憶部，顯示畫面509係對應於顯示器裝置之顯示部。

控制裝置502，係在作為處理部之CPU上而使在記憶部中所被記憶的各種程式動作。藉由此，來藉由溫度調節部504、氣體供給部505、幫浦507、CO2、O2感測器508、氣體濃度調節部506、溫度感測器550、培養基、培養上清液包511，而對於培養箱503中之培養環境作控制，並成為能夠實施在細胞培養容器501內之特定之培養工程。

細胞培養容器501內之氣體交換，係藉由被設置在細胞培養容器501處之氣體透過膜，來在培養箱503與細胞培養容器501之間而被進行。另外，氣體濃度調節部506，係亦可被與細胞培養容器501直接作連接。溫度調節部504、氣體濃度調節部506、CO2、O2感測器508，係亦可為被與細胞培養容器501直接作連接之構成。於此構成的情況時，對於細胞培養容器501，係成為對於容器內而直接供給氣體。

圖6，係為對於本實施例的細胞培養裝置之流路之構成作展示之圖。在圖6中，係對於包含有卸下培養構件之封閉系流路的封閉系細胞培養裝置之例作展示。

在圖6中所示之封閉系細胞培養裝置601，係具備有用以保存第1液體之第1容器602、和用以裝入第1液體之第2容器603。第1容器602，係為將身為第1液體之細胞培養用之培養基預先作保存之容器。第2容器603，係為培養細胞之容器，而為細胞培養容器。

第1容器602、第2容器603，係可考慮到其之目的而藉由該業者之技術常識而容易地製作。第1容器602，係具備有經由濾網604而被開放於外部大氣中之氣壓調節管605，並於容器內之氣相處而具有末端。第2容器603，係具備有經由濾網606而被開放於外部大氣中之氣壓調節管607，並於容器內之氣相內而具有其之末端。

封閉系細胞培養裝置601，係具備有用以將第1容器602中之第1液體作送液之第1送液管608、和用以將第1送液管608中之第1液體送液至第2容器603處之第2送液管609。第2送液管609，係具備有第1送液幫浦610，並對於第2送液管609內之送液量作調節。各個的送液管608、609，係可藉由該業者之技術常識而容易地製作。第1送液管608，係具備有第1閥611，並能夠藉由與經由濾網612而供給包含有5%濃度之CO2之空氣的第2閥613交互地做開閉，來對於送液與送氣作切換。

又，封閉系細胞培養裝置601，係具備有用以將第2容器(細胞培養容器)603中之第1液體排出之第3容器614。第3容器614，係可考慮到其之目的而藉由該業者之技術常識而容易地製作。第3容器614，係具備有經由濾網615而被開放於外部大氣中之氣壓調節管616，並於容器內之氣相部分而具有末端。

封閉系細胞培養裝置601，係進而具備有用以將第2容器(細胞培養容器)603內之第1液體排出之第1排出管617、和被與第1排出管617作連接並將第2容器(細胞培養容器)603中之第1液體通過第1排出管617來排出至第3容器614處之第2排出管618。第2送液幫浦619，係對於第1排出管617內之送液量作控制。各個的送液管608、609、排出管617、618，係可藉由該業者之技術常識而容易地製作。第2排出管618，係具備有第3閥620。係能夠藉由第3閥620之開閉，來對於送液之有無作切換。

身為細胞培養容器之第2容器603，係亦可將複數之容器並聯地作連接。在將複數之細胞培養容器作連接的情況時，係只要在第2送液管609處設置分歧，並進行第5閥621之設置，並且設置與所期望之第4容器622之數量相同數量的第6閥623即可。又，第1液體之排出，係只要在第1排出管617處設置分歧，並進行第7閥626之設置，並且設置與所期望之第4容器622之數量相同數量的第8閥624即可。為了進行第4容器622之容器內壓之調整，係只要設置用以與濾網606作連接之分歧、和與第4容器622之數量相同數量之氣壓調節管625即可。

圖7A～圖7F，係為對於本實施例的封閉系細胞培養裝置之系統之畫面例作展示者。此些係為圖5之顯示畫面509之顯示例。

圖7A，係展示有關於培養方法之選擇畫面(1)。封閉系細胞培養裝置之系統，係如同在圖7A中所示一般，作為輸入，而受理細胞種類、培養容器之種類、培養容器之個數、封閉系細胞培養裝置之使用流路等的資訊。系統，係因應於先選擇了的項目之內容，而於之後在進行選擇之項目中僅顯示能夠選擇者。藉由此，係能夠避免在所培養之細胞種類以及與細胞種類相對應之培養容器等之中的選擇之錯誤。另外，在圖7B以後的畫面中，係亦同樣的具備有此功能。

圖7B以及圖7C，係對於被顯示有將各細胞片作移植的病患之一覽之畫面例作展示。在圖7B中，係展示有預定移植之病患清單。具體而言，係顯示病患No、病患ID、對於各病患所移植的細胞片之大小、成為輸送目標之移植醫療機關等。在圖7C中，係展示有各病患之個別的細胞片尺寸。

圖7D，係展示有關於培養方法之選擇畫面(2)。封閉系細胞培養裝置之系統，係基於在圖7C中所被提示的於移植中所需要之細胞片之大小，來如同在圖7D中所示一般地而提示所使用的培養容器之種類。又，係提示被與各區劃之細胞片相互附加有關連性之病患之No.。

圖7E，係展示有關於培養方法之選擇畫面(3)。封閉系細胞培養裝置之系統，在顯示圖7D之後，係如同在圖7E中所示一般地，作為輸入，而受理所使用的培養容器之個數。

圖7F，係展示有關於培養方法之選擇畫面(4)。封閉系細胞培養裝置之系統，係基於所被輸入了的培養容器之個數，而如同在圖7F中所示一般地，將在自動培養中所使用的封閉系流路之資訊作輸出。

如同前述一般，在培養後，係依循於在圖7中所示之病患資訊，而決定所輸送的醫療機關，但是，在各細胞培養容器、框體、框體之區劃內之基材、包裝、輸送容器處，係被賦予有辨識符號。辨識符號，係為文字資訊、一維條碼、二維條碼、QR碼、RFID標籤等，而選擇1個或者是複數並作賦予。例如，在賦予了文字資訊與RFID標籤的情況時，作為作業者，人類係能夠根據文字資訊來認識到內容，電子讀取機等係能夠認識到RFID標籤，藉由此，係成為能夠以2個的方法來對於內容作確認。

辨識符號所表現之資訊，係為進行移植之病患之資訊、細胞片之資訊、所輸送之醫療機關等之資訊、被與該些之資訊相互附加有關連性之ID等。為了防止在培養後之細胞片之剝離、包裝、對於輸送容器之捆包、輸送等時之錯拿等，係藉由辨識符號來進行管理。又，在培養後，係會有以將基材403作了卸下的狀態而進行輸送的情況和並不卸下地而進行輸送的情況，但是，封閉系細胞培養裝置之系統，係設為對於此狀態有所反映者，又，在作業者於作業時所參照之標準程序書中係亦有所反映。支持體407之種類，係存在有組織接著劑、親水性PVDF膜、硝酸纖維素膜等，但是，此些亦係在系統、標準程序書中有所反映。

在圖8中，對於使用具有以上之功能的封閉系細胞培養裝置來製造細胞片的一連串之處理程序作展示。

＜步驟S0：細胞培養容器之事先準備＞ 首先，作為事先準備，而製作細胞培養容器。具體而言，係如同在圖1C中所示一般，準備細胞培養容器101、基材103、框體102、蓋105。在細胞培養容器101之底部處，配置1個或複數之基材103，並進而在基材103之周緣處配置框體102。此時，較理想，係以藉由框體102來從上方而按壓基材103之周緣的方式來作配置。如同前述一般，此係為了避免基材103之位置發生變化或者是浮起的情形。之後，在細胞培養容器101之上方處，配置將細胞培養容器101之開口部全體作覆蓋之蓋105。

另外，在本步驟中，係亦可在細胞培養容器101之底部處僅配置框體102，並在此之後的步驟、例如於在步驟S2處而設置了流路之後，在藉由框體102而被作了區隔的各區劃處，配置基材103。於此情況，蓋105，係在將基材103配置於細胞培養容器101內之後，再被作設置。

之後，所製作出的細胞培養容器，係被進行滅菌處理。滅菌處理方法，係設為γ線滅菌、EOG滅菌等，而根據所使用之細胞培養容器之素材、表面來適當作選擇。當在細胞培養容器處被連接有封閉系流路的情況時，係亦針對封閉系流路而進行滅菌處理。

＜步驟S1：系統開始＞ 啟動封閉系細胞培養裝置之系統。作為所使用的封閉系細胞培養裝置之資訊，在作業程序書中係記載有裝置編號等。在封閉系細胞培養裝置處，係預先被設置有電子標籤或2維條碼，藉由以條碼讀取機等來對於電子標籤或2維條碼進行讀取，來事先確認其係與在作業程序書中所記載之裝置編號等之資訊相互一致。

作業者，係按下位置在控制裝置處之操作部的開始鍵而進行啟動。接著，係在控制部之顯示器(顯示畫面509)之操作畫面處，確認封閉系細胞培養裝置之內部環境是否為適當。例如，係確認培養箱之溫度係為37℃。此些之數值，係並非為限定性者，例如，溫度係可在0℃～45℃之範圍中作選擇。又，自動培養時程，係事先藉由培養軟體來決定，該資訊係對於封閉系細胞培養裝置而有所反映。在自動培養時程中，係亦包含有細胞播種、培養基交換、培養上清液回收、檢查用組織回收、移植用組織回收等所被進行之日期時間、液量等之條件。

＜步驟S2：流路設置＞ 在封閉系細胞培養裝置處，設置包含有細胞培養容器之封閉系流路。事先，依循於在圖7A～圖7F中所說明了的流程，來決定細胞種類、包含有具有特定之區劃數量的框體之細胞培養容器之種類、細胞培養容器之個數、所使用之封閉系流路。另外，當在步驟S0中而在細胞培養容器101之底部處僅配置了框體102的情況時，係在藉由框體102而被作了區隔的各區劃處，配置基材103。

另外，封閉系流路，係於從倉庫而被作了搬出的階段處，藉由以條碼讀取機等來對於預先被設置在封閉系流路處之電子標籤或2維條碼進行讀取，來事先確認了其係與在作業程序書中所記載之裝置編號等之資訊相互一致。封閉系流路，係由細胞培養容器、裝入有培養基之培養基包、將培養上清液作回收之培養上清液包等、以及將該些作連接之流路管，而被構成。構成，係成為與所選擇了的封閉系流路之種類相對應者。辨識符號，係亦具備有細胞培養容器、框體、基材。

＜步驟S3：細胞播種＞ 事先在安全腔內而對於細胞瓶裝入調製為特定濃度之細胞懸浮液，並將其設置在封閉系細胞培養裝置中。封閉系細胞培養裝置，係從細胞瓶而對於各細胞培養容器送液細胞懸浮液，並進行細胞播種。細胞懸浮液，係只要送液會使框體被作覆蓋之程度的液量即可。

另外，細胞播種，係亦可在步驟S2處以手動作業來實施。於此情況，係在安全腔內，將細胞懸浮液以手動作業來裝入至封閉系流路之細胞培養容器內。

又，如同在圖1B中所作了說明一般，由於框體之高度係為充分低，因此，框體之高度係並不會對於細胞撥種時之搖動而造成影響。在藉由搖動來使細胞均勻地分散於細胞培養容器內之培養基中之後，細胞係依循於重力而沉降，並成為接著於框體之區劃內之基材所形成的培養表面上。

＜步驟S4：培養＞ 在將細胞培養容器作了靜置的狀態下，細胞係在所作了接著的基材處而進行特定時間之培養。在培養中，係藉由培養箱而維持於37℃。封閉系細胞培養裝置內之空氣，係藉由風扇而恆常被作攪拌，並設為使溫度分布會恆常成為均一。另外，係在封閉系細胞培養裝置處，安裝粒子計數器與生菌數計測裝置，而藉由清淨度之監測來成為能夠提升製造安全性。

氣體交換，當使用具備有氣體透過膜、濾網等之細胞培養容器的情況時，培養箱內之氣相與細胞培養容器內之氣相，係經由氣體透過膜、濾網等而被進行氣體交換。當使用具備有送氣用流路之細胞培養容器的情況時，藉由對於細胞培養容器內直接送氣特定之氣體，氣體交換係被進行。氣體交換，在培養期間中，係以1天數次之程度的頻率來實施。

所供給之氣體，例如係使用包含有CO2濃度5%之空氣。氣體，係從氣體鋼瓶來對於各細胞培養容器，而以藉由氣體流計來對於流量作控制並且通過加濕瓶來使水分子成為了飽和的狀態而作供給。對於細胞培養容器而送氣後之不必要的氣體，係經由濾網而被排出至流路外。濾網，係因應於需要而對於流路內之壓力作調整。濾網，例如係使用不會使0.62μm以上之粒子通過的品質之濾網。

＜步驟S5：監測＞ 對於培養中之細胞片，而使用觀察機構來取得有關於細胞狀態之資訊。觀察機構，係根據所取得的細胞畫像和培養上清液，來對於細胞之增殖率、佔有率、細胞狀態等進行解析。係能夠對於複數枚之細胞片，而從1個的培養容器來取得有關於細胞狀態之資訊，而能夠有效率地培養細胞片。

＜步驟S6、S7：培養基交換＞ 當成為進行培養基交換之日的情況時，係實施培養基交換。係亦可為僅追加培養基之培養基追加。將在電冰箱內以4℃而被作保管的培養基，一直送液至預熱瓶處，而進行預熱。係亦能夠一面以低送液速度來進行送液，一面使其升溫。在培養基交換中，首先，係從細胞培養容器而將舊的培養基排出。培養基，係只要一直排出至框體之高度處即可。

在排出後，迅速地將新的培養基對於細胞培養容器內作供給。舊的培養基，最終係被排出至培養上清液包處。因應於必要，而將培養上清液內之培養上清液回收，並藉由葡萄糖、乳酸、pH等之培養基成分分析，來對於細胞之生育狀態進行評價。

培養基交換，係亦可藉由在裝入有舊的培養基的狀態下而將新的培養基推出的方式而實施，亦可僅為將新的培養基對於細胞培養容器內作供給之培養基追加。又，封閉系細胞培養裝置，係亦可根據細胞培養之進行狀態，而判定是否要開始進行培養基之交換(步驟S6)。在並不需要進行培養基之交換的情況時(步驟S6，NO)，封閉系細胞培養裝置係回到步驟S4之處理處。在需要進行培養基之交換的情況時(步驟S6，YES)，係前進至步驟S7處，並實施培養基交換。

＜步驟S8：細胞培養結束＞ 封閉系細胞培養裝置，係根據細胞培養之進行狀態，而進行是否要將細胞培養結束之判定。在將細胞培養結束的情況時(步驟S8，YES)，係前進至步驟S9處，並將細胞培養容器從封閉系細胞培養裝置而回收，並且進行細胞片之回收。在並不結束細胞培養的情況時(步驟S8，NO)，封閉系細胞培養裝置係回到步驟S4之處理處。

＜步驟S9：細胞片之回收＞ 依循於在圖4A～圖4D中所說明了的流程，來將細胞片回收。細胞片之回收，係在無菌環境下而實施。所謂無菌環境，例如係為安全腔內、隔離器內或者是潔淨工作台內。將蓋卸下，並將框體藉由鑷子等來作把持而無菌性地卸下。之後，將具有細胞片之基材之周緣，藉由鑷子等來作把持而無菌性地取出。

＜步驟S10：細胞片之包裝＞ 依循於在圖4E～圖4G中所說明了的流程，來將所取出的基材與細胞片，放置在預先所準備了的支持體之上，並在包裝材之上放置基材和細胞片以及支持體，並且將其他之包裝材以覆蓋基材和細胞片以及支持體的方式而作被覆，並藉由將上下之包裝材作熱熔著，來進行包裝。係亦可在將基材作了卸下的狀態下而進行包裝。因應於必要，而使用安裝在包裝材處之輸送用溶液注入口與輸送用溶液排出口來將輸送用溶液作注液。另外，包裝係具備有辨識符號。

＜步驟S11：輸送＞ 在包裝後，依循於辨識符號所具有之資訊，而輸送至移植所被進行的醫療機關處。個體包裝容器，係以能夠在輸送中而維持品質的方式，來因應於輸送手段，而使用能夠維持溫度、壓力、清淨性之適當的輸送容器來進行輸送。

＜步驟S12：移植＞ 在到達手術室處後，將細胞片從輸送容器取出，並從包裝之中而無菌性地取出。在開封時，由於在個體包裝容器之外側處係會有覆著有細菌等之生物或粒子的可能性，因此，係以維持清淨性的方式來無菌性地開封。在開封後，依循於在圖4H中所說明了的方法，來將基材從細胞片而卸下。當支持體係為組織接著劑的情況時，係可亦包含有支持體地來將細胞片作移植。當支持體係為親水性PVDF膜、硝酸纖維素膜等的情況時，係先進行移植，之後將親水性PVDF膜、硝酸纖維素膜等卸下。

＜步驟S13：結束＞ 在封閉系細胞培養裝置中，將在培養中所使用了的封閉系流路卸下，並使封閉系細胞培養裝置之各種軟體結束，而使封閉系細胞培養裝置之動作結束。

若依據如同上述一般所構成之封閉系細胞培養裝置以及在其之中所使用之細胞培養容器，則藉由將框體設為較細胞培養容器之側壁之高度而更低，在封閉系細胞培養裝置處，係能夠並不被框體所影響地而將複數枚之細胞片同時地自動作培養。又，在培養後，係能夠將細胞片並不從細胞培養容器剝離地而取出。又，若依據本實施例，則係成為不需要進行將細胞片切斷為在移植中所使用之大小的工程，其結果，製造效率係提升，而成為能夠達成製造成本之降低。

另外，框體和基材，係亦可藉由進行滅菌處理而作反覆使用。 實施例2

參照圖9A～圖10E，針對本發明之實施例2之細胞培養容器以及細胞培養方法進行說明。在本實施例中，係針對與實施例1之細胞培養容器相異的框體以及基材之實施形態作說明。以下，係以與實施例1之間之差異作為中心來進行說明。

框體901之剖面形狀，係如同在圖9A～圖9E中所示一般，除了梯形以外，亦可為三角形、T字形、四角形、倒梯形，亦可為將此些之圖形作了複數組合之形狀。基於框體901之剖面形狀，由於框體901之外周亦會改變，因此，當選擇了外周為長之框體的情況時，係能夠防止與框體作了接著之細胞移動至其他之區劃處的情形。進而，在像是圖9B之T字形或者是圖9C之倒梯形一般的框體901之剖面形狀之上邊為較下邊而更長的情況時，係能夠防止細胞跨越框體的情形。

另外，係亦可如同圖9D以及圖9E一般地，而在框體901之中央處設置凹部。藉由在框體901之中央處具備有凹部，係會成為當接著於框體901之上的細胞移動至其他之區劃處時的阻礙。

框體1002，係亦可如同在圖10A以及圖10B中所示一般，構成為能夠在各區劃處而個別分離。1枚的基材1003，係藉由1個的框體1002而被作包圍，並在區劃內而進行細胞之培養。圖10A，係對於培養時之狀態作展示，圖10B，係對於在培養後而將1個的框體1002作了卸下的狀態作展示。

圖10C、圖10D，係分別對於從橫方向來對於圖10A、圖10B作了觀察的狀態作展示。係亦可如同圖10D一般地而將1個的框體1002卸下，並如同在圖10E中所示一般地，包含框體1002與基材1003、細胞片1004、支持體1005地而包裝在包裝材1006內。

在圖10E中，由於所培養了的細胞片1004係被框體1002所包圍，因此，係能夠亦包含框體地而將細胞片作包裝、輸送，就算是在輸送中細胞片受到有機械性之壓力或衝擊，也能夠藉由框體1002來作保護。

基材1003之素材，係與實施例1相同的，只要為塑膠即可，此些係亦可為平板狀。又，平板狀之基材1003，係事先藉由表面處理等而設為具備有細胞接著性者。在平板狀之基材1003的情況時，係能夠防止基材之捲起以及基材在培養基中而浮游的情形。在將細胞片1004作剝離時，係將平板狀之基材1003和細胞片1004藉由鑷子等來作把持並作卸下。

又，係亦能夠以藉由將組織接著劑被覆在區劃內一事所得到的片狀之基材1003，來培養細胞片1004，當基材1003係身為組織接著劑的情況時，在將組織接著劑與細胞片從細胞培養容器而取出之後，係能夠並不將細胞片1004從基材1003剝離地來直接對於病患作移植。 實施例3

參照圖11A～圖11D，針對本發明之實施例3之細胞培養容器以及細胞培養方法進行說明。在本實施例中，係針對與實施例1之細胞培養容器之底面相異的框體以及基材之實施形態作說明。以下，係以與實施例1之間之差異作為中心來進行說明。

如同在圖11A以及圖11B中所示一般，本實施例之細胞培養容器，相對於實施例1，係在基材1103與細胞培養容器1101之間存在有架高材1104，在此點上，係為相異。架高材1104，例如係為海藻酸、膠原蛋白凝膠、層連結蛋白、組織接著劑等。

在培養時，培養基係浸潤於架高材1104中。故而，基材1103上之細胞，係成為亦從下方而被供給有培養基。此構成，係成為能夠對於細胞之生育賦予良好的影響。又，基材1103，係亦可為具有多數之身為微細之孔的孔膜(pore membrane)之膜。

圖11C以及圖11D，係為在細胞培養容器1101之底面與基材1103之間具有成為腳部之框體1108之構成。如同在圖11C中所示一般，基材1103，係從上下而被框體1108所包夾，上下之框體1108，係藉由具備有從細胞培養容器1101之底面起而存在於鉛直方向上方處之構成，而成為能夠在基材1103與細胞培養容器1101之間具有培養基1106。藉由此構成，基材1103上之細胞，係成為亦從下方而被供給有培養基，而對於細胞之育成賦予良好之影響。

如同上述一般，若依據上述之實施例1～實施例3之細胞培養容器，則係能夠將所培養了的細胞片並不從基材剝離地而取出。又，就算是身為封閉系細胞培養裝置，也成為能夠進行在具有區劃的細胞培養容器中之細胞片之培養，細胞片之製造效率係提升。

另外，本發明係並不被限定於前述之實施例，而亦包含有在所添附的申請專利範圍之趣旨內的各種之變形例及其同等之構成。例如，前述之各實施例，係為為了對於本發明作易於理解之說明而作了詳細的說明者，本發明係並不被限定於包含有所說明了的全部之構成者。又，係亦可將某一實施例之構成的一部分置換為其他之實施例的構成。又，係亦可對於某一實施例之構成而追加其他之實施例的構成。又，係亦可針對各實施例之構成的一部分，而進行其他之構成的追加、削除或置換。

101:細胞培養容器 102:框體 103:基材 104:框體之外部 105:蓋 106:培養基 107:細胞片 201:蓋 301:細胞培養容器 302:框體 303:基材 304:框體之外部 401:細胞培養容器 402:框體 403:基材 404:細胞片 405:培養基 406:蓋 407:支持體 408:包裝材 501:細胞培養容器 502:控制裝置 503:培養箱 504:溫度調節部 505:氣體供給部 506:氣體濃度調節部 507:幫浦 508:CO2、O2感測器 509:顯示畫面 511:培養基包、培養上清液包 550:溫度感測器 601:封閉系細胞培養裝置 602:第1容器 603:第2容器(細胞培養容器) 604:濾網 605:氣壓調節管 606:濾網 607:氣壓調節管 608:第1送液管 609:第2送液管 610:第1送液幫浦 611:第1閥 612:濾網 613:第2閥 614:第3容器 615:濾網 616:氣壓調節管 617:第1排出管 618:第2排出管 619:第2送液幫浦 620:第3閥 621:第5閥 622:第4容器 623:第6閥 624:第8閥 625:氣壓調節管 626:第7閥 901:框體 902:基材 1001:細胞培養容器 1002:框體 1003:基材 1004:細胞片 1005:支持體 1006:包裝材 1101:細胞培養容器 1102:框體 1103:基材 1104:架高材 1105:細胞片 1106:培養基 1107:蓋 1108:框體

[圖1A]係為本發明之實施例1的細胞培養容器之平面圖。 [圖1B]係為圖1A之A-A’剖面圖。 [圖1C]係為圖1B中的細胞培養容器之分解圖。 [圖1D]係為對於正在培養細胞片的模樣作展示之圖。 [圖2A]係為對於圖1D之變形例作展示之圖。 [圖2B]係為在圖2A中的細胞培養容器之分解圖。 [圖3A]係為對於圖1A之變形例作展示之圖。 [圖3B]係為對於圖1A之變形例作展示之圖。 [圖3C]係為對於圖1A之變形例作展示之圖。 [圖3D]係為對於圖1A之變形例作展示之圖。 [圖4A]係為對於本發明之實施例1的細胞培養方法之其中一個工程作展示之圖。 [圖4B]係為對於接續於圖4A之後的工程作展示之圖。 [圖4C]係為對於接續於圖4B之後的工程作展示之圖。 [圖4D]係為對於接續於圖4C之後的工程作展示之圖。 [圖4E]係為對於接續於圖4D之後的工程作展示之圖。 [圖4F]係為對於接續於圖4E之後的工程作展示之圖。 [圖4G]係為對於接續於圖4F之後的工程作展示之圖。 [圖4H]係為對於接續於圖4G之後的工程作展示之圖。 [圖5]係為對於本發明之實施例1的細胞培養裝置之概略構成作展示之圖。 [圖6]係為對於本發明之實施例1的細胞培養裝置之流路之構成作展示之圖。 [圖7A]係為對於圖5之顯示畫面509之顯示例作展示之圖。 [圖7B]係為對於圖5之顯示畫面509之顯示例作展示之圖。 [圖7C]係為對於圖5之顯示畫面509之顯示例作展示之圖。 [圖7D]係為對於圖5之顯示畫面509之顯示例作展示之圖。 [圖7E]係為對於圖5之顯示畫面509之顯示例作展示之圖。 [圖7F]係為對於圖5之顯示畫面509之顯示例作展示之圖。 [圖8]係為本發明之實施例1的細胞培養方法之流程圖。 [圖9A]係為對於本發明之實施例2的框體901之剖面形狀作展示之圖。 [圖9B]係為對於圖9A之變形例作展示之圖。 [圖9C]係為對於圖9A之變形例作展示之圖。 [圖9D]係為對於圖9A之變形例作展示之圖。 [圖9E]係為對於圖9A之變形例作展示之圖。 [圖10A]係為對於本發明之實施例2的細胞培養容器之培養時之狀態作展示之平面圖。 [圖10B]係為對於從圖10A而將1個的框體1002作了卸下的狀態作展示之圖。 [圖10C]係為對於從橫方向來對於圖10A作了觀察的狀態作展示之圖。 [圖10D]係為對於從橫方向來對於圖10B作了觀察的狀態作展示之圖。 [圖10E]係為對於將框體和基材和細胞片以及支持體作了包裝的狀態作展示之圖。 [圖11A]係為對於本發明之實施例3的細胞培養容器作展示之圖。 [圖11B]係為圖11A的細胞培養容器之分解圖。 [圖11C]係為對於圖11A之變形例作展示之圖。 [圖11D]係為圖11C的細胞培養容器之分解圖。

101:細胞培養容器

102:框體

103:基材

104:框體之外部

105:蓋

106:培養基

107:細胞片

Claims (15)

1. 一種細胞培養容器，係具備有： 框體，係將培養容器作區隔；和 基材，係在藉由前述框體而被作了區隔的複數之區劃處，於前述各區劃之每一者處而被配置在前述培養容器之底面處， 前述基材，係能夠於前述各區劃之每一者處而作卸下， 前述框體，係從上方而按壓前述基材之周緣。
2. 如請求項1所記載之細胞培養容器，其中， 前述框體，係相對於前述基材之周緣而於垂直方向上相接。
3. 如請求項1所記載之細胞培養容器，其中， 前述框體，係具備有細胞非接著性。
4. 如請求項1所記載之細胞培養容器，其中， 前述培養容器，係具備有細胞非接著性。
5. 如請求項1所記載之細胞培養容器，其中， 前述基材，係為具備有多孔質之薄膜。
6. 如請求項1所記載之細胞培養容器，其中， 前述框體之高度，係較前述培養容器之側壁之高度而更低。
7. 如請求項1所記載之細胞培養容器，其中， 係具備有覆蓋前述培養容器之開口部之蓋。
8. 如請求項1所記載之細胞培養容器，其中， 前述框體，係具備有複數之前述區劃。
9. 如請求項1所記載之細胞培養容器，其中， 前述框體之剖面，係為上邊為較下邊而更長之形狀、或者是於前述框體之上部處而具有凹部之形狀。
10. 如請求項1所記載之細胞培養容器，其中， 前述基材，係為平板狀之塑膠。
11. 如請求項5所記載之細胞培養容器，其中， 在前述培養容器之底面與前述薄膜之間，係具備有架高材。
12. 如請求項10所記載之細胞培養容器，其中， 在前述培養容器之底面與前述基材之間，係具備有腳部。
13. 如請求項1所記載之細胞培養容器，其中， 前述基材，係為片狀之組織接著劑。
14. 一種細胞培養裝置，係具備有： 細胞培養容器，係具備有將培養容器作區隔之框體、和在藉由前述框體而被作了區隔的複數之區劃處於前述各區劃之每一者處而被配置在前述培養容器之底面處之基材，前述基材係能夠於前述各區劃之每一者處而作卸下，前述框體之高度係較前述培養容器之側壁之高度而更低；和 蓋，係覆蓋前述培養容器之開口部；和 液體保持部，係收容培養液；和 送液管，係貫通前述蓋，並從前述液體保持部而對於前述培養容器供給前述培養液；和 排出管，係貫通前述蓋，並從前述培養容器而將前述培養液排出。
15. 一種細胞培養方法，係具備有： 對於培養容器而供給包含有細胞之培養液，並在被配置於藉由框體而被作了區隔的複數之區劃處並且能夠於前述各區劃之每一者處而作卸下之基材上，培養細胞片之步驟；和 將前述框體卸下之步驟；和 取得乘載有所培養了的前述細胞片之前述基材之步驟。

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