TWI882505B

TWI882505B - 製造嘌呤核苷酸的微生物及使用該微生物製造嘌呤核苷酸的方法

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Publication number: TWI882505B
Application number: TW112142060A
Authority: TW
Inventors: 權嬉修; 奉賢珠; 裵賢貞; 李沚泫; 李智惠
Original assignee: 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2022-11-01
Filing date: 2023-11-01
Publication date: 2025-05-01
Also published as: KR102837216B1; WO2024096545A1; EP4610359A1; TW202426628A; AR130925A1; WO2024096545A9; KR20240066507A; CN120677243A; JP2025537690A

Abstract

本揭露係關於一種製造嘌呤核苷酸的微生物和使用該微生物製造嘌呤核苷酸的方法。

Description

製造嘌呤核苷酸的微生物及使用該微生物製造嘌呤核苷酸的方法

本揭露係關於製造嘌呤核苷酸的微生物和使用該微生物製造嘌呤核苷酸的方法。

嘌呤核苷酸係核酸生物合成代謝系統中的中間體，在身體中具有重要生理角色，且廣泛地用於食品和醫藥等。該嘌呤核苷酸係包含5'-肌苷單磷酸(5’-inosine monophosphate)(IMP)、5'-黃苷單磷酸(5’-xanthosine monophosphate)(XMP)和5'-鳥苷單磷酸(5’-guanosine monophosphate)(GMP)等。

對於如IMP、XMP和GMP等嘌呤核苷酸的製造，已經進行了各種研究以開發具有高效生產的微生物和發酵製程技術。例如，主要使用標靶物質特異性方案，如增加編碼參與IMP、XMP和GMP等的生物合成之酵素的基因表現，或去除生物合成中不必要的基因(EP 3722430 A1和US 2020-0347346 A1)。

然而，當透過有氧發酵自生產該嘌呤核苷酸的微生物製造該嘌呤核苷酸時，當長時間連續培養時，在發酵後期有生產率因為氧化壓力降低的問題。

本揭露發明人發現，相較於未經修飾的現有微生物，將具增強活性的錳運輸蛋白導入微生物時，該微生物製造嘌呤核苷酸的能力增加，從而完成了本發明。

本揭露的目的係提供製造嘌呤核苷酸之其中錳運輸蛋白活性經增強的棒狀桿菌(Corynebacterium)屬微生物。

本揭露的另一個目的係提供製造嘌呤核苷酸的方法，該方法包含在培養基培養製造嘌呤核苷酸之其中錳運輸蛋白活性經增強的棒狀桿菌屬微生物的步驟。

本揭露的又一個目的係提供用於製造嘌呤核苷酸的組成物，該組成物包含其中錳運輸蛋白活性經增強的棒狀桿菌屬微生物；培養過該微生物的培養基；或其組合。

相較於未經修飾的現有微生物，本揭露的微生物藉由增強錳運輸蛋白活性可具有增加的製造嘌呤核苷酸能力。

本揭露將描述細節如下。同時，本揭露中所揭露的各個描述和實施態樣亦可應用於其他描述和實施態樣。換言之，本揭露中所揭露的各種要素的所有組合皆落入本揭露的範圍內。再者，本揭露的範疇不受以下所述的具體描述限制。再者，在整個說明書中，參考了許多文獻和專利文件，並提供了它們的引用。引用的文獻和專利文件的揭露內容，以其整體藉由引用併入本說明書中，且本揭露內容所屬之主題的等級和範疇得到進一步釐清。

本揭露的一態樣提供製造嘌呤核苷酸之其中錳運輸蛋白活性經增強的棒狀桿菌屬微生物。

如本文中所用，術語「錳運輸蛋白」指運輸錳(Mn)的蛋白質，且屬於鐵/錳/鋅ABC(類TroA ATP結合匣(TroA-like ATP-binding cassette))運輸蛋白。

該錳運輸蛋白的胺基酸序列可從NCBI GenBank等獲得，NCBI GenBank是習知的數據庫。

例如，本揭露的錳運輸蛋白可衍生自微生物。該微生物可具體地衍生自棒狀桿菌屬的微生物，且更具體地，衍生自停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)、J010B-136棒狀桿菌(Corynebacterium sp.J010B-136)、乾酪棒狀桿菌(Corynebacterium casei)或產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)等，但不限於此。

又例如，本揭露的錳運輸蛋白的胺基酸序列可為衍生自停滯棒狀桿菌ATCC6872的WP_066796334.1，但明顯地，也包含衍生自各種來源之具有錳運輸蛋白活性的蛋白質。

在本揭露中，該錳運輸蛋白可具有、包含或由SEQ ID NO：1的胺基酸序列所組成，或可實質上由該胺基酸序列所組成。

在本揭露中，該SEQ ID NO：1的胺基酸序列可包含具有至少70%或更多、75%或更多、76%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多、99.5%或更多、99.7%或更多或99.9%或更多的與該SEQ ID NO：1的胺基酸序列同源性或一致性的胺基酸序列。再者，顯而易見地，在胺基酸序列的一部分序列為具有缺失(deletion)、修飾、取代、保留取代(conservative substitution)或加成(addition)的任意蛋白質，只要其係具有與包含該SEQ ID NO：1的胺基酸序列之蛋白質相應的同源性或一致性並表現出相應的功效，則可包含在本揭露的範疇內。

例如，在胺基酸序列的N-末端、C-末端和/或內部，可存在不改變本揭露蛋白質的功能之序列加成或缺失、自然發生的突變、沉默突變或保留取代。

「保留取代(conservative substitution)」指一個胺基酸被另一個具有與其相似的結構和/或化學性質的胺基酸取代。此胺基酸取代通常可基於殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性(amphipathic)特性的相似性而發生。通常，保留取代可對蛋白質或多肽的活性影響很小或沒有影響。

如本文中所用，術語「同源性(homology)」或「一致性(identity)」指兩個給定胺基酸序列或核苷酸序列之間的相似程度，且可表示為百分比。術語「同源性和一致性」通常可交替使用。

保留性(conserved)多核苷酸或多肽的序列同源性或一致性可由標準排比演算法(standard alignment algorithm)決定，且藉由使用程式所建立的預設空位罰分(default gap penalties)亦可一同使用。實質上，同源或一致的序列通常可在中度或高度嚴格(stringent)條件下以整體或部分彼此雜合。顯然，雜合還包含與含有正常密碼子之多核苷酸的雜合或含有考慮到該多核苷酸的密碼子簡併性(degeneracy)的密碼子之多核苷酸的雜合。

任何兩個多核苷酸或多肽序列之間是否具有同源性、相似性或一致性可使用諸如「FASTA」程式之習知電腦演算法，運用由Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444所用的預設參數而決定。或者，可使用EMBOSS套裝軟體(EMBOSS：歐洲分子生物學開放軟體套件(European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000,Trends Genet.16：276-277)(5.0.0或更新之版本)(包含GCG程式組合(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research 12：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等人，J MOLEC BIOL 215：403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994和CARILLO等人(1988)SIAM J Applied Math 48：1073))之Needleman程式中執行的Needleman-Wunsch演算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)而決定。例如，可使用國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)的BLAST或ClustalW來決定同源性、相似性或一致性。

多核苷酸或多肽之間的同源性、相似性或一致性可藉由使用例如揭露於Smith和Waterman Adv.Appl.Math(1981)2：482的由Needleman等人(1970),J Mol Biol.48：443所介紹之GAP電腦程式比對序列訊息來決定。簡言之，該GAP程式將同源性、相似性或一致性界定為藉由將相似的經排比的符號(即，核苷酸或胺基酸)的數量除以兩個序列中較短者的符號總數而獲得的值。該GAP 程式的預設參數可包含：(1)二進位比較矩陣(含有表示一致性的數值1和表示非一致性的數值0)以及如揭露於Schwartz和Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)中的Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14：6745之加權比較矩陣(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣)；(2)對各空位(gap)之3.0的罰分(penalty)以及各空位中的每個符號額外0.10的罰分(或是空位打開10罰分，且空位延伸0.5罰分)；以及(3)對終端空位不罰分。

本揭露的錳運輸蛋白可為znuA1基因所編碼者。

例如，znuA1基因可為編碼衍生自停滯棒狀桿菌ATCC6872的WP_066796334.1之多核苷酸，但不限於此。又例如，znuA1基因可為衍生自停滯棒狀桿菌ATCC6872的Ncam2275或CP016326.1的一部分，但不限於此，且明顯地，也包含編碼衍生自各種來源之具有錳運輸蛋白活性的蛋白質的znuA1基因。

如本文中所用，術語「多核苷酸(polynucleotide)」指作為核苷酸聚合物的具有超過一定長度的DNA或RNA股，其是藉由共價鍵連接核苷酸單體的長鏈，且更具體地，是指編碼蛋白質的多核苷酸片段。

編碼本揭露的錳運輸蛋白的多核苷酸可包含編碼SEQ ID NO：1的胺基酸序列的核苷酸序列。如本揭露的實例，本揭露的多核苷酸可具有或可包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列。再者，本揭露的多核苷酸可由或可實質上由SEQ ID NO：2的核苷酸序列所組成。具體地，該znuA1基因可藉由SEQ ID NO：2的核苷酸序列所代表的多核苷酸編碼。

考慮到密碼子簡併性或表現本揭露的錳運輸蛋白之生物體中較佳的密碼子，本揭露的多核苷酸可在其編碼區中，在該錳運輸蛋白的胺基酸序列不改變的範圍內，進行各種修飾。具體地，本揭露的多核苷酸可具有或可包含具有70%或更多、75%或更多、76%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多或99%或更多與SEQ ID NO：2的序列同源性或一致性的核苷酸序列，或者可由或可實質上由具有70%或更多、75%或更多、76%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多或99%或更多與SEQ ID NO：2的序列同源性或一致性的核苷酸序列所組成，但不限於此。

此外，本揭露的多核苷酸可包含但不限於，在嚴格條件下，與能夠從已知基因序列製備的探針雜合的序列，例如，與本揭露的多核苷酸序列的部分或全部互補的序列。術語「嚴格條件(stringent condition)」指能使多核苷酸之間進行特異性雜合的條件。這些條件在文獻中有詳細描述(參見J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989和F.M.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York,9.50-9.51,11.7-11.8)。例如，該條件可包含多核苷酸具有高同源性或一致性，如其之間具有70%或更多、75%或更多、76%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多或99%或更多同源性或一致性的多核苷酸彼此雜合，但具有較低同源性或一致性的多核苷酸彼此不雜合的條件；或用於典型南方雜合法(Southern hybridization)的洗滌條件，其洗滌在相應於60℃、1×SSC和 0.1% SDS，具體地60℃、0.1×SSC和0.1% SDS，更具體地68℃、0.1×SSC和0.1% SDS的鹽濃度和溫度下進行一次，或具體地兩次或三次。

雜合需要兩個核酸具有互補序列，然而取決於雜合嚴格性(stringency)，鹼基之間的錯配是可能的。術語「互補(complementary)」用於描述可以彼此相互雜合的核苷酸鹼基之間的關係。例如，對於DNA，腺嘌呤與胸腺嘧啶互補且胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此，本揭露的多核苷酸還可包含與整個序列以及與整個序列實質上相似的核酸序列互補的經單離的核酸片段。

具體地，使用包含在Tm為55℃之雜合步驟和使用上述條件的雜合條件可檢測與本揭露的多核苷酸具有同源性或一致性的多核苷酸。此外，Tm值可為60℃、63℃或65℃，但不限於此，且所屬技術領域中具有通常知識者可根據目的適當控制。

用於雜合多核苷酸的適當嚴格性取決於多核苷酸的長度和互補程度，且其變量係所屬技術領域中所習知者(例如，同上之Sambrook等人)。

如本文中所用，術語「微生物(microorganism)(或菌株(strain))」涵蓋所有野生型微生物或天然或人工基因修飾的微生物，指因為外源基因的插入或內源基因活性的增強或減弱而使其中特定機制的增強或減弱的微生物，且可為包含用於製造目標多肽、蛋白質或產物之基因修飾的微生物。

因此，本揭露的微生物可例示為具有增強該錳運輸蛋白活性之基因修飾的重組微生物。

相較於內在活性，本揭露的微生物可具有增強的錳運輸蛋白活性。

例如，相較於棒狀桿菌屬的野生型微生物，本揭露的微生物可具有藉由增加錳運輸蛋白表現而增強的錳運輸蛋白活性，但不限於此。

如本文中所用，術語多肽(實例包含由各酵素的名稱所指定的蛋白質)的「增強(enhancement)」指與多肽的內在活性相比，該多肽的活性增加。增強可以與活化(activation)、向上調節(up-regulation)、過度表現(overexpression)、增加(increase)等交替使用。本文中，活化、增強、向上調節、過度表現和增加可包含與內在活性或修飾前的活性相比，所有的原始不擁有的活性表現或所有的增強的活性表現。「內在活性(intrinsic activity)」指當藉由自然或人為因素引起的基因突變而轉形時，其轉形前親代菌株或未經修飾微生物原始擁有的特定多肽的活性。該術語可以與「修飾前的活性(activity before modification)」交替使用。與其內在活性相比，多肽的活性的「增強」、「向上調節」、「過度表現」或「增加」指提高轉形前親代菌株或未經修飾微生物原始擁有之特定多肽的活性和/或濃度(表現量)。

可經由外源多肽的引入或內源多肽的活性增強和/或濃度(表現量)來實現增強。多肽活性的增強可藉由相應多肽的活性程度或表現量的增加或從相應多肽所製造之產物量的增加來鑑定。

相應於本揭露的目的，本揭露的微生物可為藉由增強錳運輸蛋白活性而具有增強製造嘌呤核苷酸能力之微生物。作為比較製造嘌呤核苷酸能力或錳運輸蛋白是否增加的目標菌株，未增強錳運輸蛋白的未經修飾的微生物可為製造5'-肌苷單磷酸(IMP)之停滯棒狀桿菌KCCM12151P(CJI0323，韓國專利號10-1904675)以及製造5'-黃苷單磷酸(XMP)之停滯棒狀桿菌KCCM12285P(CJX1664，韓國專利號10-1950141)和停滯棒狀桿菌KCCM12313P(CJX1682，韓國專利號10-2006977)，但不限於此。

多肽活性的增強可藉由應用所屬技術領域習知的各種方法來實現，且不限定，只要與修飾前的微生物相比該方法能夠增強目標多肽的活性即可。具體地，可使用所屬技術領域中具有通常知識者習知的基因工程和/或蛋白質工程，其係分子生物學的常規方法(如，Sitnicka等人，Functional Analysis of Genes.Advances in Cell Biology.2010,Vol.2.1-16和Sambrook等人，Molecular Cloning 2012等)，但不限於此。

具體地，本揭露之多肽的增強可藉由以下方式實現：

1)增加編碼該多肽的多核苷酸的細胞內複本數；

2)替換染色體上編碼該多肽的基因表現控制區為具有強活性的序列；

3)修飾編碼該多肽的基因轉錄物的編碼其起始密碼子或5’-UTR區的核苷酸序列；

4)修飾該多肽的胺基酸序列以增強該多肽的活性；

5)修飾編碼該多肽的多核苷酸序列以增強該多肽的活性(如，修飾該多肽基因的多核苷酸序列以編碼經修飾以增強該多肽活性的多肽)；

6)引入展現該多肽活性的外源多肽或編碼該多肽的外源多核苷酸；

7)編碼該多肽的多核苷酸的密碼子優化；

8)修飾或化學修飾藉由分析該多肽的三級結構所選擇的暴露位點；或

9)選自1)至8)項中的兩種或多種的組合，但不特別限於此。

更具體地，第1)項中編碼該多肽的多核苷酸的細胞內複本數的增加，可藉由將為可操作地連接且可獨立於宿主進行複製和發揮作用之編碼相應多肽的多核苷酸的載體引入宿主細胞來實現。或者，第1)項的該增加可藉由將編碼相應多肽的多核苷酸的一個或兩個或多個複本引入宿主細胞的染色體來實現。該染色體的引入可藉由將可使多核苷酸插入宿主細胞染色體的載體引入至宿主細胞來進行，但不限於此。該載體如上所述。

第2)項中將染色體上編碼該多肽的的基因表現控制區(表現控制序列)以具有強活性的序列替換可為，例如，經由缺失、插入、非保留或保留取代或其組合的序列突變，或以具有較強活性的序列替換，以進一步增強表現控制區的活性。表現控制區可包含但不特別限於，啟動子、操縱子序列、編碼核醣體結合位點的序列、控制轉錄和轉譯終止的序列等。例如，可以用較強的啟動子替換原始的啟動子，但不限於此。

習知較強的啟動子的實例可包含CJ1至CJ7啟動子(韓國專利號10-0620092；US 7662943 B2)、lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、λ噬菌體PR啟動子、PL啟動子、tet啟動子、gapA啟動子、SPL7啟動子、SPL13(sm3)啟動子(US 10584338 B2)、O2啟動子(US 10273491 B2)、tkt啟動子、yccA啟動子等，但不限於此。

第3)項中編碼該多肽的基因轉錄物的編碼其起始密碼子或5’-UTR區的核苷酸序列的修飾可為，例如，用編碼具有較高多肽表現率的另一個起始密碼子(而不是內源起始密碼子)的核苷酸序列作取代，但不限於此。

第4)和5)項中的胺基酸序列或多核苷酸序列的修飾可為在該多肽的胺基酸序列或編碼該多肽的多核苷酸序列中，經由缺失、插入、非保守或保守取代或其組合對序列的突變，或用經修飾為具有較強活性的胺基酸序列或多核苷酸序列或用經修飾為具有增加的活性的胺基酸序列或多核苷酸序列替換，以增強該多肽的活性，但不限於此。具體地，可以藉由同源重組將多核苷酸插入至染色體進行替換，但不限於此。本文中使用的載體可進一步包含用於檢查染色體插入的篩選標記(selection maker)。

第6)項中展現該多肽的活性的外源多肽的引入可為將編碼展現與該多肽相同/相似活性的多肽的外源多核苷酸引入至宿主細胞。該外源多核苷酸不受其來源或序列所限，只要該外源多核苷酸展現與該多肽相同/相似的活性即可。用於引入的方法可藉由所屬技術領域中具有通常知識者適當選擇的任何習知轉形方法來進行，且可經由在宿主細胞中表現引入的多核苷酸製造該多肽並增強其活性。

第7)項中編碼該多肽的多核苷酸的密碼子優化，可為內源多核苷酸的密碼子優化以增加其在宿主細胞的轉錄或轉譯，或外源多核苷酸的密碼子優化以允許優化其在宿主細胞的轉錄或轉譯。

第8)項中藉由分析該多肽的三級結構選擇的暴露位點的修飾或化學修飾可為，例如，藉由將待分析多肽的序列訊息與儲存現有蛋白質序列訊息的資料庫進行比較，根據序列的相似性決定模板蛋白質候選物，以及鑑定基於此的結構之待修飾或待化學修飾之暴露位點的修飾或化學修飾。

這些多肽活性的增強可意味著相對於野生型或修飾前微生物菌株中表現的多肽的活性或濃度，相應多肽的活性、濃度或表現量為增加的，或從相應多肽製造的產物量為增加的，但不限於此。

例如，本揭露錳運輸蛋白的活性增強可為因編碼該錳運輸蛋白的多核苷酸在細胞內複本數增加而增強。又例如，本揭露錳運輸蛋白的活性增強可為因替換編碼該錳運輸蛋白基因的啟動子或因修飾該啟動子而增強。再例如，本揭露錳運輸蛋白的活性增強可為因引入展現錳運輸蛋白活性的多核苷酸而增強，但不限於此。

本揭露的微生物中的部分或全部多核苷酸的修飾可以藉由以下方式誘導：(a)利用在微生物進行染色體插入的載體來同源重組，或利用工程化核酸酶(如，CRISPRCas9)來基因體編輯(genome editing)；和/或(b)用如紫外線和輻射的光和/或化學品處理，但不限於此。修飾部分或全部基因的方法可包含藉由DNA重組技術的方法。例如，可將含有與目標基因同源的核苷酸序列的核苷酸序列或載體引入至微生物以引起同源重組，致使基因的部分或全部缺失。待引入的核苷酸序列或載體可包含顯性篩選標記，但不限於此。

本揭露的載體可包含DNA建構體(construct)，該DNA建構體含有編碼目標多肽之多核苷酸之核苷酸序列，其可操作地連接到合適的表現控制區(或表現控制序列)，據此在合適的宿主中表現該目標多肽。該表現控制區可以包含能夠啟動轉錄的啟動子、用於控制該轉錄的任何操縱子序列、編碼合適的mRNA核醣體結合位點的序列、以及控制轉錄和轉譯終止的序列。在轉形到合適的宿主細胞後，該載體可獨立於宿主的基因體進行複製或發揮作用，或可整合到基因體本身中。

本揭露中使用的載體沒有被特別限制，且可使用所屬技術領域習知的任何載體。常用的載體的實例可包含天然或重組質體、黏質體(cosmid)、病毒和噬菌體。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A可用作噬菌體載體或黏質體載體，以及基於pDZ、基於pBR、基於pUC、基於pBluescriptII、基於pGEM、基於pTZ、基於pCL和基於pET的載體可用作質體載體。具體而言，可使用pDZ、pDC、pDCM2、 pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC載體。

例如，可經由用於在細胞中作染色體插入的載體，把編碼目標多肽的多核苷酸插入染色體。可使用所屬技術領域習知的任何方法進行該多核苷酸對染色體的插入，例如同源重組，但不限於此。該載體還可包含用於探究染色體插入的篩選標記。該篩選標記係用於選擇經該載體轉形的細胞，即，識別目標核酸分子的插入，且可使用賦予可選擇性表現型的標記，如耐藥性、營養缺陷型、細胞毒性藥物抗性或表面多肽的表現。在以選擇劑處理的情況下，只有表現篩選標記的細胞可存活或表現其他表現型性狀，從而可選擇經轉形的細胞。

如本文中所用，術語「轉形(transformation)」係指將含有編碼目標多肽的多核苷酸的載體引入宿主細胞或微生物中，以允許由多核苷酸編碼的多肽在宿主細胞中表現。轉形的多核苷酸可包含任何多肽，只要其可在宿主細胞中表現即可，不管其係插入並位於該宿主細胞的染色體內或位於該染色體之外。此外，多核苷酸的實例包含編碼目標多肽的DNA和/或RNA。該多核苷酸可以以任何形式引入，只要該多核苷酸可引入宿主細胞中並表現即可。例如，該多核苷酸可以以含有自我表現所需之所有因子的基因建構體的表現匣(expression cassette)的形式引入。該表現匣通常可包含可操作地連接至該多核苷酸的啟動子、轉錄終止訊號、核醣體結合位點和轉譯末端訊號。該表現匣可為能夠自我複製的表現載體。此外，該多核苷酸可以其原始形式引入宿主細胞中，並可操作地連接宿主細胞中表現所需的序列，但不限於此。

再者，如上所述，術語「可操作地連接(operatively linked)」指用於啟動和介導編碼本揭露目標多肽之多核苷酸轉錄的啟動子序列與該多核苷酸序列之間的功能性連接。

在本揭露的另一實例中，本揭露的微生物可為具有製造嘌呤核苷酸能力的微生物。

本揭露的微生物可為具有增強的製造嘌呤核苷酸能力的微生物。

如本文中所用，術語「嘌呤核苷酸(purine nucleotide)」指含有基於嘌呤結構的核苷酸。該嘌呤核苷酸可為XMP、IMP、GMP或AMP，特別係IMP、XMP或GMP，但不限於此。

本揭露的「肌苷5’-單磷酸酯(inosine 5'-monophosphate)或5’-肌苷酸(5'-inosinic acid)(IMP)」和「鳥苷-5’-單磷酸酯(guanosine-5'-monophosphate)或5’-鳥苷酸(5'-guanylic acid)(GMP)」係核酸生物合成代謝系統的中間產物，在體內具有重要的生理角色且廣泛地用於食品和藥品等。具體而言，已知IMP本身賦予牛肉之風味，且已知衍生自XMP的GMP賦予蘑菇之風味。眾所周知，這兩種材料都增強麩胺酸單鈉鹽(MSG)的風味，且因此作為一種增強風味的核酸系調味料而備受關注。

在一實施態樣中，GMP可藉由從XMP轉化而製造，但不限於此。例如，藉由將增加製造的XMP轉化為GMP，可增加GMP的製造量，且因此GMP也包含在本揭露的範疇內。

本發明的「XMP」也稱為黃苷5’-單磷酸酯(xanthosine-5'-monophosphate)或5’-黃苷酸，且可經由IMP脫氫酶的作用由IMP形成，或者經由GMP合成酶的作用轉化為GMP。

本揭露的微生物可為其中錳運輸蛋白活性經增強的微生物。具體地，本揭露的微生物可為其中錳運輸蛋白或編碼其之znuA1基因經增強的微生物；或經基因修飾以增強錳運輸蛋白或編碼其之znuA1基因的微生物(如，重組微生物)。

本揭露的微生物可為自然具有製造嘌呤核苷酸能力的微生物，或藉由在沒有製造嘌呤核苷酸能力的親代菌株中增強錳運輸蛋白或編碼其之多核苷酸來增加或賦予製造嘌呤核苷酸能力的微生物，但不限於此。

相應於本揭露的目的，本揭露的重組微生物可為相較於自然野生型微生物或藉由包含錳運輸蛋白或編碼其之多核苷酸製造嘌呤核苷酸的微生物，藉由在該自然野生型微生物中增強錳運輸蛋白或編碼其之多核苷酸或在該藉由包含錳運輸蛋白或編碼其之多核苷酸製造嘌呤核苷酸的微生物中增強錳運輸蛋白或編碼其之多核苷酸而具有增加的製造嘌呤核苷酸能力之微生物，但不限於此。例如，如上所述，該自然野生型微生物或該藉由包含錳運輸蛋白或編碼其之多核苷酸製造嘌呤核苷酸的微生物可為比較該製造嘌呤核苷酸能力或該錳運輸蛋白是否增加的目標菌株，但不限於此。

例如，相較於修飾前的親代菌株或未經修飾的微生物，該具有增加的製造能力的重組菌株可具有約1%或更多的增加的製造嘌呤核苷酸能力，具體地，約2%或更多、約5%或更多、約5.4%或更多、約5.7%或更多、約6%或更多、約6.7%或更多、約7%或更多、約8%或更多、約9%或更多、約10%或更多、約11%或更多、約11.5%或更多、約12%或更多、約12.9%或更多、約13%或更多、約14%或更多、約14.4%或更多、約15%或更多、約16%或更多、約17%或更多、約18%或更多、約19%或更多、或約20%或更多的增加的製造嘌呤核苷酸能力(上限不具體限定，但可為，例如，約200%或更低、約150%或更低、約100%或更低、約50%或更低、約40%或更低、約30%或更低、約20%或更低、或約15%或更低的增加的製造嘌呤核苷酸能力)，但增加量不限於此，只要與修飾前的親代菌株或未經修飾的微生物的製造能力相比，製造能力具有+值之增加量即可。在另一實例中，相較於修飾前的親代菌株或未經修飾的微生物，具有增加的製造能力的微生物可具有約1.01倍或更多、約1.02倍或更多、約1.05倍或更多、約1.054倍或更多、約1.057倍或更多、約1.06倍或更多、約1.067倍或更多、約1.07倍或更多、約1.08倍或更多、約1.09倍或更多、約1.10倍或更多、約1.11倍或更多、約1.115倍或更多、約1.12倍或更多、約1.129倍或更多、約1.13倍或更多、約1.14倍或更多、約1.144倍或更多、約1.15倍或更多、約1.16倍或更多、約1.17倍或更多、約1.18倍或更多、約1.19倍或更多、或約1.20倍或更多(上限不具體限定，但可為，例如，約10倍或更低、約5倍或更低、約3倍或更低、約2倍或更低)的增加的製造嘌呤核苷酸能力，但不限於此。

該製造能力可藉由測量藉由培養基培養所獲得的目標產物的生產量來評估。該評估可藉由利用所屬技術領域習知的適合方法測量目標產物的生產量來進行。例如，可使用高效液相層析法(HPLC)、氣相層析法(GC)、氣相層析-質譜法(GC/MS)、液相層析-質譜法(LC/MS)、凝膠滲透層析法(GPC)、或其組合，且該目標產物的生產量可利用所屬技術領域習知的適合方法測量。

如本文中所用，術語「未經修飾的微生物(unmodified microorganism)」可指野生型菌株或原樣的天然菌株，或在由於天然或人工因子所引起基因突變的轉形前的菌株，不排除包含可能在微生物中自然發生的突變的菌株。例如，未經修飾微生物可以指未增強本文中的該錳運輸蛋白或編碼其之多核苷酸的菌株或在其增強之前的菌株。「未經修飾的微生物(unmodified microorganism)」可以與「修飾前的菌株(strain before modification)」、「修飾前的微生物(microorganism before modification)」、「未變異的菌株(unvaried strain)」、「未經修飾的菌株(unmodified strain)」、「未經變異的微生物(unvaried microorganism)」或「參考微生物(reference microorganism)」交替使用。

在本揭露中，該嘌呤核苷酸可為選自由IMP、XMP和GMP所組成群組的一種或多種。其描述如上所述。

在本揭露的又一實例中，本揭露的微生物可為停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、生乳棒狀桿菌(Corynebacterium crudilactis)、沙漠棒狀桿菌(Corynebacterium deserti)、高效棒狀桿菌(Corynebacterium efficiens)、癒傷組織棒狀桿菌(Corynebacterium callunae)、奇異棒狀桿菌(Corynebacterium singular)、耐鹽棒狀桿菌(Corynebacterium halotolerans)、紋狀棒狀桿菌(Corynebacterium striatum)、產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、污染棒狀桿菌(Corynebacterium pollutisoli)、模擬棒狀桿菌(Corynebacterium imitans)、龜鱉目棒狀桿菌(Corynebacterium testudinoris)或微黃棒狀桿菌(Corynebacterium flavescens)，具體地，為停滯棒狀桿菌，但不限於此。

在本揭露的又一實例中，本揭露的重組微生物可為藉由額外增強一些參與嘌呤核苷酸生物合成途徑的蛋白質活性，或藉由額外減弱一些參與嘌呤核苷酸降解途徑的蛋白質活性，來增強製造嘌呤核苷酸能力的的微生物。

如本文中所用，術語多肽活性的「減弱(diminishment)」具有涵蓋與內在活性相比所有活性降低或活性缺乏的概念。該減弱可以與不活化、不足、向下調節、減少、降低、衰減等交替使用。

該減弱還可以包含由於編碼該多肽的多核苷酸的突變等，與原始微生物所擁有的該多肽的活性相比，該多肽本身的活性降低或消失的情況；由於抑制編碼該多肽的多核苷酸的基因表現或抑制轉譯成多肽，與天然菌株相比細胞中整體多肽的活性和/或濃度(表現量)為較低的情況；不進行多核苷酸表現的情況；和/或儘管表現多核苷酸，但該多肽沒有活性的情況。「內在活性(intrinsic activity)」指當藉由自然或人為因素引起的基因突變而轉形時，該修飾前親代菌株或野生型或未經修飾微生物原始所擁有的特定多肽的活性。該術語可以與「修飾前的活性(activity before modification)」交替使用。與其內在活性相比之多肽的活性的「減弱、不活化(inactivation)、不足(deficiency)、減少(decrease)、向下調節(down-regulation)、降低(reduction)或衰減(attenuation)」指該多肽的活性與轉形前親代菌株或未經修飾微生物原始所擁有的特定多肽的活性相比為較低者。

多肽活性的減弱可藉由所屬技術領域習知的任何方法進行，但不限於此，且可藉由應用所屬技術領域習知的各種方法來實現(如，Nakashima N等人，Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing.Int J Mol Sci.2014；15(2)：2773-2793和Sambrook等人，Molecular Cloning 2012，等)。

具體地，本揭露之多肽活性的減弱可以藉由以下方式實現：

1)編碼該多肽的基因的部分或全部的缺失；

2)修飾表現控制區(或表現控制序列)以降低編碼該多肽的基因表現；

3)修飾構成該多肽的胺基酸序列以消除或減弱該多肽的活性(如，該胺基酸序列中一個或多個胺基酸的缺失/取代/加成)；

4)修飾編碼該多肽的基因序列以消除或減弱該多肽的活性(如，該多肽基因的核苷酸序列中的一個或多個核苷酸的缺失/取代/加成，以編碼經修飾以消除或減弱多肽活性的該多肽)；

5)修飾編碼該多肽的基因轉錄物的編碼其起始密碼子、夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列或5’-UTR區的核苷酸序列；

6)引入與編碼該多肽的基因轉錄物互補結合的反義寡核苷酸(如，反義RNA)；

7)在編碼該多肽的基因的夏因-達爾加諾序列的上游加成與該夏因-達爾加諾序列互補的序列，以形成使核醣體不可能附著的二級結構；

8)在編碼該多肽的基因序列的開放閱讀框(open reading frame，ORF)的3’端加成待逆轉錄的啟動子(逆轉錄工程(reverse transcription engineering)，RTE)；或

9)自1)至8)項中選擇兩種或多種的組合，但不特別限於此。

例如，

第1)項中編碼該多肽之基因的部分或全部的缺失可為染色體中編碼內源性目標蛋白質之多核苷酸的全部消除、用具有部分核苷酸缺失的多核苷酸替換、或用標記基因替換。

第2)項中的表現控制區(或表現控制序列)的修飾可為經由缺失、插入、非保留或保留取代或其組合在表現控制區(或表現控制序列)的突變，或替換為活性更減弱的序列。表現控制區包括啟動子、操縱子序列、編碼核醣體結合位點的序列、和控制轉錄和轉譯終止的序列，但不限於此。

第3)和4)項中的胺基酸序列或多核苷酸序列的修飾可為在該多肽的胺基酸序列或編碼該多肽的多核苷酸序列中，經由缺失、插入、非保留或保留取代或其組合對序列的突變、或用經修飾為活性更減弱的胺基酸序列或多核苷酸序列或用經改良為不具活性的胺基酸序列或多核苷酸序列替換，因而減弱該多肽的活性，但不限於此。例如，可藉由將突變引入多核苷酸序列，以形成終止密碼子來抑制或衰減基因表現，但不限於此。

第5)項中編碼該多肽的基因轉錄物的編碼其起始密碼子或5’-UTR區之核苷酸序列的修飾可為，例如，用編碼具有較低多肽表現率的另一個起始密碼子(而不是內源起始密碼子)的核苷酸序列作取代，但不限於此。

第6)項中與編碼該多肽的基因轉錄物互補結合的反義寡核苷酸(如，反義RNA)的引入可以參考，例如，文獻(Weintraub,H.等人，Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis,Reviews-Trends in Genetics,Vol.1(1)1986)。

第7)項中在編碼該多肽的基因的夏因-達爾加諾序列的上游加成與該夏因-達爾加諾序列互補的序列，因而形成使核醣體不可能附著的二級結構，可能使mRNA不可能轉譯或降低其速率。

第8)項中的編碼該多肽的基因序列的開放閱讀框(ORF)的3’末端的待逆轉錄的啟動子的加成(逆轉錄工程，RTE)，可能產生與編碼該多肽的基因轉錄物互補的反義核苷酸以減弱該多肽的活性。

本揭露的又一方面提供一種製造嘌呤核苷酸的方法，該方法包含在培養基培養製造嘌呤核苷酸之其中錳運輸蛋白活性經增強的棒狀桿菌屬微生物的步驟。

本揭露的嘌呤核苷酸製造方法可包含在培養基培養其中錳運輸蛋白或編碼其之znuA1基因經增強的微生物，或經基因修飾以增強錳運輸蛋白或編碼其之znuA1基因的微生物的步驟。該微生物如上所述。

如本文中所用，術語「培養(culture)」指在適當調整的環境條件中生長本揭露的微生物。本揭露的培養程序可根據本領域習知的適當培養基或培養條件進行。所屬技術領域中具有通常知識者可以根據所選擇的微生物而輕易地調整培養方法。具體地，培養可為分批式、連續式和/或分批進料式，但不限於此。

如本文中所用，「培養基(medium)」指含有作為主要成分的培養本揭露微生物所需的營養物質的混合物，其中培養基供應包含生存和生長所必需的水、生長因子等營養物質。具體地，對於用於培養本揭露的微生物的培養基和其他培養條件，可使用任何用於微生物通常培養的培養基而沒有特別限制。然而，本揭露的微生物可在有氧條件下在含有適當碳源、氮源、磷源、無機化合物、胺基酸和/或維生素的常規培養基培養，同時控制其溫度及pH等。

具體地，可在文獻中(“Manual of Methods for General Bacteriology”by the American Society for Bacteriology(Washington D.C.,USA,1981))找到用於棒狀桿菌屬微生物的培養基。

在本揭露中，碳源可包含碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖(saccharose)、乳糖、果糖、蔗糖(sucrose)、麥芽糖等；糖醇，如甘露醇、山梨糖醇等；有機酸，如丙酮酸、乳酸、檸檬酸等；和胺基酸，如麩胺酸、甲硫胺酸、離胺酸等。此外，可使用天然有機營養源，如澱粉水解物、糖蜜、赤糖糊(blackstrap)糖蜜、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浸漬液(corn steep liquor)，且特別地，可使用碳水化合物，如葡萄糖和無菌經預處理糖蜜(即，轉化為還原糖類的糖蜜)，且可使用適量的各種其他碳源而沒有限制。這些碳源可單獨使用或以其兩種或更多種組合使用，但不限於此。

對於氮源，可使用無機氮源，如氨、硫酸銨、氯化銨、乙酸銨、磷酸銨、碳酸銨、硝酸銨等；胺基酸，如麩胺酸、甲硫胺酸、麩醯胺酸等；和有機氮源，如蛋白腖、NZ-胺、肉萃取物、酵母萃取物、麥芽萃取物、玉米浸漬液、酪蛋白水解物、魚類或其分解產物、脫脂豆餅或其降解產物等。這些氮源可單獨使用或以其兩種或更多種組合使用，但不限於此。

磷酸鹽源可包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和與其相應的含鈉鹽。對於無機化合物，可使用氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳和碳酸鈣等，且此外，可包含胺基酸類、維生素類和/或合適的前驅物。這些組成成分或前驅物可以分批或連續方式添加到培養基。然而，本揭露不限於此。

在本揭露的微生物的培養期間，培養基的pH可藉由向培養基以適當方式添加化合物(如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸)予以調節。此外，可添加消泡劑(如脂肪酸聚二醇酯(fatty acid polyglycol ester))以壓制培養期間泡沫的形成。此外，可向培養基注入氧氣或含氧氣體以維持培養基的有氧(aerobic)狀態；或可不注入氣體，或可注入氮氣、氫氣或二氧化碳氣體，以維持培養基的無氧(anaerobic)或非有氧(non-aerobic)狀態，但不限於此。

在本揭露的培養中，該培養溫度可保持在20℃至45℃，具體為25℃至40℃，且可進行約10小時至160小時的培養，但不限於此。

藉由本揭露的培養所製造的嘌呤核苷酸可為釋放到培養基，或者可保留在細胞中。

該嘌呤核苷酸可為選自由IMP、XMP和GMP所組成群組的一種或多種。

本揭露的嘌呤核苷酸製造方法可復包含製備本揭露的微生物的步驟、製備培養微生物的培養基的步驟或這些步驟的組合(不分先後，以任意順序)，例如，在培養步驟之前或之後。

本揭露的嘌呤核苷酸製造方法可復包含從由培養所得的培養基(經進行培養的培養基)或經培養的微生物回收嘌呤核苷酸的步驟。在培養步驟之後可復包含該回收步驟。

回收可為根據用於本揭露的微生物的培養方法(例如，分批、連續或進料分批型培養)，使用所屬技術領域習知的適當方法收集所需的嘌呤核苷酸。例如，可使用離心、過濾、用結晶蛋白質沉澱劑處理(鹽析)、萃取、超音波破碎、超過濾(ultrafiltration)、透析、如分子篩層析法(凝膠過濾)、吸附層析法、離子交換層析法和親和層析法的各種類型的層析法、HPLC，以及這些方法的組合，且可藉由使用所屬技術領域習知的適當方法，從培養基或微生物中回收所需的嘌呤核苷酸。

此外，本揭露的嘌呤核苷酸製造方法可復包含純化步驟。可藉由使用所屬技術領域習知的適當方法進行純化。在一個示例性實施態樣中，當本揭露的嘌呤核苷酸製造方法包括回收步驟和純化步驟兩者時，該回收步驟和該純化步驟可以不分先後順序連續或不連續進行，或者可以同時進行或整合為一步驟進行，但不限於此。

在本揭露的方法中，該錳運輸蛋白、該多核苷酸、該載體、該微生物等如其他態樣中所述。

本揭露的又一態樣係提供一種用於製造嘌呤核苷酸的組成物，該組成物包含其中錳運輸蛋白活性經增強的棒狀桿菌屬微生物；培養過該微生物的培養基；或其組合。

本揭露的組成物可復含有通常用於製造嘌呤核苷酸的組成物的任何合適的賦形劑，且該賦形劑的實例可包含防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑、等滲劑等，但不限於此。

在本揭露的又一態樣提供製備製造嘌呤核苷酸的棒狀桿菌屬微生物的方法，該方法包含增強錳運輸蛋白活性的步驟。

該製備方法可包含修飾微生物使具有相較於內在活性增強的錳運輸蛋白活性的步驟。

本揭露的又一態樣提供其中錳運輸蛋白活性經增強的棒狀桿菌屬微生物用於製造嘌呤核苷酸的用途。

該錳運輸蛋白、該增強和該棒狀桿菌屬微生物等如其他態樣中所述。

[本發明的實施模式]

後文將藉由示例性實施態樣的形式對本揭露進行更詳細的描述。然而，以下示例性實施態樣僅係用於闡明本揭露的較佳的實施態樣，因此並非意欲限制本揭露的範疇。同時，本說明書中未描述的技術事項可為本揭露技術領域或相似技術領域的通常知識者充分理解且輕易施行。

實施例1：載體的製備

實施例1-1：用於增加znuA1基因複本數的載體的製備

製備用於增加編碼錳運輸蛋白(鐵/錳/鋅ABC(類TroA ATP結合匣)運輸蛋白)(WP_066796334.1，SEQ ID NO：1)的znuA1(Ncam2275)基因(CP016326.1，SEQ ID NO：2)複本數的載體。

詳言之，利用Intron’s G-spin Total DNA萃取小套組(產品編號17045)依據其程序單離野生型停滯棒狀桿菌ATCC6872菌株的染色體基因，並作為分別利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引子對、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引子對、以及SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引子對進行PCR的模板使用。PCR條件包含94℃變性5分鐘；20個94℃變性30秒、55℃退火30秒和72℃聚合1分鐘的循環；然後72℃聚合7分鐘。結果分別取得Pn/Ncam2275-A(1050bp)、Pn/Ncam2275-B(1648bp)和Pn/Ncam2275-C(1048bp)的基因片段。

利用從而取得的該3種基因片段作為模板在相同條件下進行二次PCR，以取得3.6k bp的基因片段。取得的基因片段以Xbal限制酶(New England Biolabs,Beverly,MA)消化，並利用T4連接酶(New England Biolabs,Beverly,MA)選殖入經同樣Xbal限制酶消化的線性pDCM2載體(韓國專利號10-2020-0136813)。製備的載體命名為pDCM2-Pn/Ncam2275。

實施例1-1使用的引子序列如下表1。

[表1]

實施例1-2：用於增加znuA1基因複本數並取代啟動子的載體的製備

製備用於增加znuA1基因複本數並用於以pCJ7啟動子(韓國專利號10-0620092)取代自然啟動子的載體。

詳言之，利用野生型停滯棒狀桿菌ATCC6872菌株的染色體基因作為模板以及分別以SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的引子對、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的引子對、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的引子對、以及SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的引子對進行PCR。PCR條件包含94℃變性5分鐘；20個94℃變性30秒、55℃退火30秒和72℃聚合1分鐘的循環；然後72℃聚合7分鐘。結果分別取得Pcj7/Ncam2275-A(1050bp)、Pcj7/Ncam2275-B(318bp)、Pcj7/Ncam2275-C(1079bp)和Pcj7/Ncam2275-D(1048bp)的基因片段。

利用從而取得的該4種基因片段作為模板在相同條件下進行二次PCR，以取得3.5k bp的基因片段。取得的基因片段以Xbal限制酶消化，並利用 T4連接酶選殖入經同樣Xbal限制酶消化的線性pDCM2載體。製備的載體命名為pDCM2-Pcj7/Ncam2275。

實施例1-2使用的引子序列如下表2。

[表2]

實施例1-3：用於引入錳運輸蛋白的載體的製備

製備用於引入錳運輸蛋白的載體。

詳言之，利用野生型停滯棒狀桿菌ATCC6872菌株的染色體基因作為模板以及分別以SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的引子對、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的引子對、以及SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的引子對進行PCR。PCR條件包含94℃變性5分鐘；20個94℃變性30秒、55℃退火30秒和72℃聚合1分鐘的循環；然後72℃聚合7分鐘。

取得的基因片段利用In-Fusion® HD轉殖套組(Clontech)融合選殖(fusion-cloned)入經Xbal限制酶消化的線性pDCM2載體。製備的載體命名為pDCM2-delNCam2155-NCam2275。

實施例1-3使用的引子序列如下表3。

[表3]

實施例2：製造嘌呤核苷酸的菌株的製備

實施例2-1：具有增加的znuA1基因複本數的菌株的製備

為製備製造嘌呤核苷酸的菌株，將實施例1-1中製備的pDCM2-Pn/Ncam2275載體藉由電穿孔(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545)轉形到製造5'-肌苷單磷酸(IMP)之停滯棒狀桿菌KCCM12151P(CJI0323，韓國專利號10-1904675)中，然後使具有載體插入至染色體的菌株在含有25mg/L康絲菌素的篩選培養基上進行初級篩選。接著，經由利用染色體上現有基因和經由載體插入的基因之間的同源性的二次交叉互換(secondary cross-over)作用取得染色體上內源znuA1基因複本數增加至2複本的菌株。該菌株利用SEQ ID NO：23和 SEQ ID NO：24的引子對進行PCR，且最終經由基因定序分析篩選。從而取得的znuA1基因複本數增加至2複本的菌株命名為KCCM12151P_Pn/Ncam2275。

實施例2-2：具有增加的znuA1基因複本數和啟動子取代的菌株的製備

為製備增強znuA1基因的製造嘌呤核苷酸的菌株，相較於實施例2-1的菌株，將實施例1-2中製備的pDCM2-Pcj7/Ncam2275載體藉由電穿孔轉形到製造IMP之停滯棒狀桿菌KCCM12151P中，然後使具有載體插入至染色體的菌株在含有25mg/L康絲菌素的篩選培養基上進行初級篩選。接著，經由利用染色體上現有基因和經由載體插入的基因之間的同源性的二次交叉互換作用取得染色體上內源znuA1基因複本數增加至2複本且啟動子由pCJ7啟動子取代的菌株。該菌株利用SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的引子對進行PCR，且最終經由基因定序分析篩選。從而取得的znuA1基因複本數增加至2複本且啟動子由pCJ7啟動子取代的菌株命名為KCCM12151P_Pcj7/Ncam2275。

實施例2-1和2-2使用的引子序列如下表4。

[表4]

實施例2-3：引入錳運輸蛋白的菌株的製備

為製備製造嘌呤核苷酸的菌株，將實施例1-3中製備的pDCM2-delNCam2155-NCam2275載體藉由電穿孔分別轉形到製造5'-黃苷單磷酸(XMP)之停滯棒狀桿菌KCCM12285P(CJX1664，韓國專利號10-1950141)和停滯棒狀桿菌KCCM12313P(CJX1682，韓國專利號10-2006977)中，且具有載體插入至染色體的各菌株在含有25mg/L康絲菌素的篩選培養基上進行初級篩選。接著，經由利用染色體上現有基因和經由載體插入的基因之間的同源性的二次交叉互換作用取得染色體上引入錳運輸蛋白的菌株。該菌株利用SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：22的引子對進行PCR，且最終經由基因定序分析篩選。從而取得的引入錳運輸蛋白的菌株分別命名為CJX2591(CJX1664_delNCam2155-NCam2275)和CJX2592(CJX1682_delNCam2155-NCam2275)。

實施例3：菌株IMP製造能力的評估

為測量實施例2-1中製備的KCCM12151P_Pn/Ncam2275菌株、實施例2-2中製備的KCCM12151P_Pcj7/Ncam2275菌株和對照組停滯棒狀桿菌KCCM12151P菌株的IMP製造能力，進行燒瓶發酵效價測試(fermentation titer test)。

將各菌株接種在含有2.5mL的下述種子培養基的14mL管中，並在30℃以170rpm振盪培養24小時。在含有24mL的下述發酵培養基(24mL主培養基+另外的5mL無菌培養基)的250mL角擋燒瓶(corner-baffle flask)中，接種2mL種子培養物(seed culture)，並在30℃以170rpm振盪培養75小時。在培養完成後，利用HPLC測量IMP濃度。

種子培養基和發酵培養基的組成如下。

<IMP種子培養基>

1%葡萄糖、1%蛋白腖、1%肉萃取物、1%酵母萃取物、0.25%氯化鈉、100mg/L腺嘌呤、100mg/L鳥嘌呤且pH為7.2。

<IMP燒瓶發酵培養基(主培養基)>

0.1%麩胺酸鈉、1%氯化銨、1.2%硫酸鎂、0.01%氯化鈣、20mg/L硫酸鐵、20mg/L硫酸錳、20mg/L硫酸鋅、5mg/L硫酸銅、23mg/L L-半胱胺酸、24mg/L β-丙胺酸、8mg/L菸鹼酸、45μg/L生物素、5mg/L鹽酸噻胺(thiamine hydrochloride)、30mg/L腺嘌呤、1.9%磷酸(85%)、4.2%葡萄糖和2.4%果糖。

<另外的IMP燒瓶無菌培養基)>

23.3g/L磷酸(85%)、16.25g/L氨(28%)和25.5g/L氫氧化鉀。

以上試驗重複3次，分析結果的平均值示於下表5。

[表5]

如表5所示，分別確認相較於對照組菌株，增強znuA1基因的KCCM12151P_Pn/Ncam2275菌株和KCCM12151P_Pcj7/Ncam2275菌株，有與znuA1基因增強程度成比例的降低12%和24%的殘留糖量，從而展現提高的糖消耗率；以及有增加5.7%和11.5%的IMP生產量。

分別命名該KCCM12151P_Pn/Ncam2275菌株和該KCCM12151P_Pcj7/Ncam2275菌株為CJI-3141和CJI-3142，於2022年9月8日寄存在布達佩斯條約下的寄存機構韓國微生物保存中心(Korea Microorganism Conservation Center)，寄存號分別為KCCM13234P和KCCM13235P。

實施例4：菌株XMP製造能力的評估

為測量實施例2-3中製備的CJX2591(C.JX1664_delNCam2155-NCam2275)菌株和CJX2592(CJX1682_delNCam2155-NCam2275)菌株以及對照組停滯棒狀桿菌KCCM12285P(CJX1664)和停滯棒狀桿菌KCCM12313P(CJX1682)菌株的XMP製造能力，進行燒瓶發酵效價測試。

將各菌株接種在含有2mL的下述種子培養基之直徑18mm的試管中，並在30℃以170rpm振盪培養24小時。在含有32mL的下述發酵培養基(24mL主培養基+另外的8mL無菌培養基)的250mL角擋燒瓶中，接種0.7mL種子培養物，並在30℃以170rpm振盪培養75小時。在培養完成後，利用HPLC測量XMP濃度。

種子培養基和發酵培養基的組成如下。

<XMP種子培養基>

1%葡萄糖、1%蛋白腖、1%肉萃取物、1%酵母萃取物、0.25%氯化鈉、100mg/L腺嘌呤、100mg/L鳥嘌呤且pH為7.5。

<XMP燒瓶發酵培養基(主培養基)>

40g/L葡萄糖、10g/L硫酸鎂、100mg/L氯化鈣、20mg/L硫酸鐵、10mg/L硫酸錳、10mg/L硫酸鋅、0.8mg/L硫酸銅、20mg/L組胺酸、15mg/L胱胺酸、15mg/L β-丙胺酸、100μg/L生物素、5mg/L硫胺素、50mg/L腺嘌呤、25mg/L鳥嘌呤、15mg/L菸鹼酸且pH為7.0。

<另外的XMP燒瓶無菌培養基)>

18g/L磷酸二氫鉀、42g/L磷酸氫二鉀、7g/L尿素和5g/L硫酸銨。

以上試驗重複3次，分析結果的平均值示於下表6。

[表6]

如表6所示，分別確認相較於對照組CJX1664和CJX1682菌株，CJX2591菌株和CJX2592菌株增加12.9%和5.4%的XMP製造能力。

實施例5：菌株GMP製造能力的評估

為測量實施例2-3中製備的CJX2591(CJX1664_delNCam2155-NCam2275)菌株和CJX2592(CJX1682_delNCam2155-NCam2275)菌株以及對照組停滯棒狀桿菌KCCM12285P(CJX1664)和停滯棒狀桿菌KCCM12313P(CJX1682)菌株的5'-鳥苷單磷酸(GMP)製造能力，以與實施例4相同的方式進行燒瓶發酵效價測試。在培養完成後，利用HPLC測量XMP濃度。

為將所製造的XMP轉化為GMP，添加以下轉化反應添加劑和大腸桿菌XMP胺基酶(aminoase)到燒瓶發酵液中，在40℃，進行2.5小時的轉化反應(韓國專利號10-1210704)。反應完成後，表示相對於XMP消耗量的GMP製造量之轉化率示於下表7。

[表7]

如表7所示，分別確認相較於對照組CJX1664和CJX1682菌株，CJX2591菌株和CJX2592菌株增加有14.4%和6.7%的XMP製造能力；且相較於對照組CJX1664和CJX1682菌株，CJX2591菌株和CJX2592菌株的GMP轉化率增加。

該CJX2591和CJX2592菌株於2022年9月8日寄存在布達佩斯條約下的寄存機構韓國微生物保存中心，寄存號分別為KCCM13236P和KCCM13237P。

基於以上所述，本揭露所屬技術領域中具有通常知識者將能夠理解，在不悖離其技術精神或基本特徵的情況下，本揭露可以其他特定形式實施。在這方面，應當理解以上實施態樣在各個方面都不是限制性的，而是闡示性的。本揭露的範疇係以所附申請專利範圍而非其前面的描述所定義。因此，本申請專利範圍意欲涵蓋任何落於該申請專利範圍的邊界或與該邊界均等範圍內的修改和修飾。

【生物材料寄存】

KR南韓韓國微生物保存中心 2022/09/08 KCCM13234P

KR南韓韓國微生物保存中心 2022/09/08 KCCM13235P

KR南韓韓國微生物保存中心 2022/09/08 KCCM13236P

KR南韓韓國微生物保存中心 2022/09/08 KCCM13237P

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Claims

一種製造嘌呤核苷酸的棒狀桿菌(Corynebacterium)屬微生物，其中，錳運輸蛋白活性係經增強者，其中，該錳運輸蛋白具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO：1有70%或更多同源性的胺基酸序列。
如請求項1所述之微生物，其中，該嘌呤核苷酸係選自由IMP、XMP和GMP所組成群組的任一種或多種。
如請求項1所述之微生物，其中，該錳運輸蛋白具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO：1有90%或更多同源性的胺基酸序列。
如請求項1所述之微生物，其中，該棒狀桿菌屬微生物與野生型棒狀桿菌屬微生物相比，具有藉由增加該錳運輸蛋白表現而增強的該錳運輸蛋白活性。
如請求項1所述之微生物，其中，該棒狀桿菌屬微生物係停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)。
一種製造嘌呤核苷酸的方法，該方法包括在培養基中培養製造嘌呤核苷酸的棒狀桿菌屬微生物的步驟，其中，該微生物之錳運輸蛋白活性係經增強者，其中，該錳運輸蛋白具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO：1有70%或更多同源性的胺基酸序列。
如請求項6所述之方法，其中，該嘌呤核苷酸係選自由IMP、XMP和GMP所組成群組的任一種或多種。
一種用於製造嘌呤核苷酸的組成物，該組成物包括棒狀桿菌屬微生物，其中，該微生物之錳運輸蛋白活性係經增強者，其中，該錳運輸蛋白具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO：1有70%或更多同源性的胺基酸序列；或培養過該微生物的培養基；或其組合。