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TWI876171B - 糞便檢體之檢查方法及其免疫層析試驗片 - Google Patents

糞便檢體之檢查方法及其免疫層析試驗片 Download PDF

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TWI876171B
TWI876171B TW111120812A TW111120812A TWI876171B TW I876171 B TWI876171 B TW I876171B TW 111120812 A TW111120812 A TW 111120812A TW 111120812 A TW111120812 A TW 111120812A TW I876171 B TWI876171 B TW I876171B
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齋藤祐司
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日商電化股份有限公司
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Abstract

本發明揭示一種糞便檢體之檢查方法及用於該方法之免疫層析試驗片，其可抑制因糞便檢體所含之對於免疫層析法的干擾物質所造成之影響，而正確、特異性地測定出受檢試料中之被檢測物質。糞便檢體之檢查方法包含於水溶性聚合物之存在下，藉由免疫層析法檢查糞便檢體。水溶性聚合物為例如包含聚氧伸乙基部分之化合物、或者聚丙烯酸或其鹽。糞便檢體之檢查用免疫層析試驗片係於檢體滴加部位包含水溶性聚合物。

Description

糞便檢體之檢查方法及其免疫層析試驗片
本發明係關於糞便檢體之檢查方法及用於該方法之免疫層析試驗片。
近年開發出在短時間之內，進行病毒或細菌等病原體感染之有無、懷孕之有無等各種檢查的簡易檢查試劑或套組。病原體構成成分、人類絨毛膜促性腺激素等為檢測或定量的對象。大部分簡易檢查試劑具有所謂無需特別的設備而操作亦簡單且便宜的特徵，例如，用於懷孕診斷之簡易檢查試劑在一般藥局均有販售。又，檢查病原體感染的簡易檢查試劑係與其他的檢查試劑不同，除了大醫院及醫療檢查中心之外，在一般的醫院或診所亦被廣泛使用。此等設施大多為患者最初就診的醫療機構，若當場判明從患者採集的檢體有無感染，則可在早期施行治療處置，因此，簡易檢查試劑在醫療上的重要性日益增高。
現在，就簡易檢查方法而言，一般已知利用抗原抗體反應的免疫測定法，尤其是免疫層析法。免疫層析法係藉由在膜上形成特異性地結合於被檢測物之捕捉體(捕捉物質)及特異性地結合於被檢測物之標識體的複合體，並將標識進行檢測/定量，而進行被檢測物的檢測(測定或定量)。免疫層析法，由於測定裝置簡單，且在成本之點上亦優良，而被廣泛用於各式各樣之被檢測物的檢測。
在免疫層析法之一形態中，對具備檢測部及標識體部的檢查裝置滴加包含被檢測物的檢體試料，一邊形成被檢測物-標識體的複合體，一邊展開，而在檢測部捕捉此複合體，藉此將標識進行檢測或定量，其中該檢測部係將會特異性地結合於被檢測物的抗體作為捕捉物質而固相化在硝基纖維素等之膜條(membrane strip)上；該標識體部包含會特異性地結合於被檢測物的標識體(例如專利文獻1及專利文獻2)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2008-268043號公報 [專利文獻2]日本特開2008-203135號公報
[發明欲解決之課題]
本發明之目的係提供糞便檢體之檢查方法及用於該方法之免疫層析試驗片，其可抑制因糞便檢體所含之對於免疫層析法的干擾物質所造成之影響，而正確、特異性地測定出受檢試料中之被檢測物質。 [用以解決課題之手段]
本案發明者深入研究之結果，發現藉由於水溶性聚合物之存在下進行免疫層析法，可抑制因干擾物質所造成之影響，且不論糞便檢體供於試驗的量，皆可正確、特異性地測定糞便檢體中的被檢測物質，而完成本發明。
亦即，本發明提供以下項目。 (1)一種糞便檢體之檢查方法，其包含在水溶性聚合物之存在下，藉由免疫層析法檢查糞便檢體。 (2)如(1)記載之方法，其中該水溶性聚合物係選自包含聚氧伸乙基(polyoxyethylene)部分的化合物以及聚丙烯酸及其鹽中之至少1種。 (3)如(2)記載之方法，其中該包含聚氧伸乙基部分的化合物係選自聚氧伸乙基二苯乙烯化苯醚、聚乙二醇、聚氧伸乙基月桂醚及辛基酚乙氧化物所構成之群組中之至少1種。 (4)如(1)至(3)中任一項記載之方法，其中該水溶性聚合物被包含於糞便檢體的懸浮液或萃取液中。 (5)如(1)記載之方法，其中在用於免疫層析法的免疫層析試驗片之檢體滴加部位包含該水溶性聚合物。 (6)如(1)至(5)中任一項記載之方法，其中用於免疫層析法的免疫層析試驗片具有抗諾羅病毒抗體，並檢測糞便檢體中的諾羅病毒。 (7)一種糞便檢體之檢查用免疫層析試驗片，其中於檢體滴加部位包含水溶性聚合物。 [發明之效果]
若藉由本發明之方法，可抑制因糞便檢體中的干擾物質所造成之影響，且不論糞便檢體供於試驗的量，皆可正確、特異性地測定糞便檢體中的被檢測物質。
[用以實施發明的形態]
本發明係關於可防止在糞便檢體所發生的偽陰性，而正確地測定被檢測物質的檢查方法及用於該方法的免疫層析試驗片。其中，所謂偽陰性係指即使檢體中包含被檢測物質，於檢定時亦未產生顯示陽性的訊號。例如，在免疫層析法(immunochromatography)中，於檢體中存在被檢測物質的情況，在固相支撐體上形成固定化物質-被檢測物質-標識試劑的複合體，產生從該複合體發出的標識試劑之訊號，但在偽陰性中，會因未形成上述複合體等理由而阻礙訊號的產生。
免疫層析試驗片具備：支撐體，其具有檢測區域，該檢測區域固定化有捕捉測定對象物(抗原等)的抗體(抗體1)；標識體區域，其具有可移動的標識抗體(抗體2)；進行滴加檢體的樣品墊片；吸收被展開之檢體液的吸收帶；用於將此等構件貼合在一起的底板(backing sheet)。
此外，檢測區域的數目及標識體區域所含之標識抗體的種類非限於1種，藉由使用複數種對應於測定對象物的抗體，可在同一個試驗片上測定2種以上的抗原。
圖1為顯示典型免疫層析試驗片之一較佳形態的圖。此外，免疫層析試驗片非限定於圖1所示者。圖1中，a係指支撐體，b係指標識體區域，c係指檢測區域，d係指樣品墊片，e係指吸收帶，f係指底板。
圖1之上為上視圖，下為切斷截面圖。在圖之例中，分別將形成有2個檢測區域之支撐體、吸收帶、標識體區域、樣品墊片等積層在底板上。而如圖所示，吸收帶之一端部與支撐體之一端部、支撐體之另一端部與標識體區域之一端部、標識體區域之另一端部與樣品墊片之一端部分別重疊，藉此形成連續的側流(lateral flow)之流路。
支撐體係具有將用於捕捉被檢物質(抗原)的抗體固定化之性能的材料，且具有不妨礙液體沿水平方向通行之性能。較佳而言，為具有毛細管作用之多孔性薄膜，為可將液體及分散於其中之成分藉由吸收而輸送的材料。成為支撐體之材質無特別限定，可列舉例如纖維素、硝基纖維素、乙酸纖維素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、玻璃纖維、尼龍、聚酮等。其中以使用硝基纖維素而作成薄膜者為更佳。
標識體區域係由包含標識抗體之多孔性基材構成，基材之材質可使用一般所能使用的玻璃纖維或不織布等。該基材為了含浸大量的標識抗體，以厚度約0.3mm～0.6mm的墊片狀為較佳。
檢測區域係指固定化有捕捉被檢物質(抗原)的抗體的支撐體之一部分區域。檢測區域設置至少一個固定化有用於捕捉抗原的抗體的區域。
樣品墊片係滴加檢體或使用檢體調製之試料的部位，為具有吸水性之多孔性材料。於該材料可使用一般所用的纖維素、玻璃纖維、不織布等。為了將大量的檢體使用於免疫測定，以厚度約0.3mm～1mm的墊片狀為較佳。此外，樣品墊片與前述之標識體區域僅為功能性的區別，未必需要個別的材料。亦即，設置作為樣品墊片的材料之一部分區域亦可具有標識體區域的功能。
吸收帶係用於吸收被供給至支撐體且在檢測區域不參與反應之成分的構件。於該材料可使用包含一般的天然高分子化合物、合成高分子化合物等的保水性高之濾紙、海棉等，但為了促進檢體之展開，以吸水性高者為較佳。
底板係用於將前述所有材料，亦即支撐體、樣品墊片、標識體區域、吸收帶等，保持部分重疊地貼附・固定之構件。只要此等材料等以最適間隔配置・固定，則未必需要底板，但從製造上或使用上之便利性來看，一般以使用為較佳。
在圖1所說明之形態的試驗片中，檢體通過藉由樣品墊片、標識體區域、支撐體、檢測區域、吸收帶等之一連串接續所形成的多孔性流路。因此，在本形態中，此等全部成為檢體移動區域。依據各構成材料之材質或形態，亦可有檢體不滲透材料內部而通行界面的形態，但在本說明書中所定義的檢體移動區域係不論材料之內部或界面，因此該形態之試驗片亦包含於本說明書之範圍。
本發明在檢體懸浮液或檢體萃取液、或者免疫層析試驗片上包含水溶性聚合物。其中，水溶性聚合物意指顯示親水性與親油性之平衡的HBL值為5～25、較佳為12.4～18.0之聚合物。
就水溶性聚合物之較佳例而言，可列舉聚乙二醇、包含聚氧伸乙基部分之非離子界面活性劑、聚丙烯酸及其鹽。就包含聚氧伸乙基部分之非離子界面活性劑的較佳例而言，可列舉聚氧伸乙基二苯乙烯化苯醚、聚氧伸乙基月桂醚及辛基酚乙氧化物(octylphenol ethoxylate)(別名：聚(氧伸乙基)辛基苯醚(poly(oxyethylene) octylphenyl ether))等。在包含聚氧伸乙基部分之化合物(聚乙二醇或包含聚氧伸乙基部分之非離子界面活性劑)的情況，聚氧伸乙基部分之聚合度，通常為約3～1000，較佳為約7～567。又，在聚丙烯酸或其鹽之情況，其質量平均分子量通常為約900～30,000，較佳為約2,100～15,000。此等水溶性聚合物可單獨使用，亦可將複數種組合而使用。
檢體懸浮用緩衝液或萃取用緩衝液中之水溶性聚合物的濃度，通常為0.005質量%～20質量%，較佳為0.05質量%～10質量%。
就在免疫層析試驗片上施加水溶性聚合物的方法而言，較佳為下述方法：將水溶性聚合物之溶液、較佳為以水或水系緩衝液作為溶劑之水溶液，藉由含浸或滴加等而添加的方法。又，在免疫層析試驗片上之水溶性聚合物的添加量，通常為約0.3mg～10mg，較佳為約0.3mg～5mg。
糞便檢體可使用以緩衝液稀釋者，或不稀釋而原樣使用。被檢測物亦無任何限定，可為所欲檢測的任何物質。就具體例而言，可列舉流感病毒、腺病毒、RS病毒、HAV、HBs、HIV、諾羅病毒等病毒抗原；MRSA、A群鏈球菌、B群鏈球菌、退伍軍人症桿菌屬細菌等細菌抗原；細菌等所產生之毒素；黴漿菌；砂眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)；人類絨毛膜促性腺激素等荷爾蒙；C反應蛋白、肌球蛋白(myoglobin)、心肌肌鈣蛋白(troponin)、各種腫瘤標記、農藥、環境荷爾蒙等抗原，進一步可列舉針對上述細菌、病毒等的抗體。
本發明亦提供如上述所形成的免疫層析試驗片。除了在檢體懸浮用/萃取用緩衝液中施加上述界面活性劑之點外，檢查裝置之構成本體可為周知者。將本發明之免疫層析試驗片之具體例的模式圖示於圖1，但本發明之試驗片不受其限定。
繼而，針對使用此免疫層析試驗片之免疫測定法的較佳例加以說明。首先，調製使糞便檢體懸浮或萃取於檢體懸浮用或萃取用緩衝液中的檢體試料。將前述檢體試料滴加在檢查裝置之試料添加部(d)中，其中該檢查裝置係在積層於塑膠板(f)上之硝基纖維素膜(a)之上，具備標識體部(b)且進一步具備檢測部(c)者；該標識體部(b)包含藉由上述方法所形成之安定化乾燥標識體墊片，其中將會與被檢測物進行抗原抗體反應之抗體以著色乳膠粒子標識；該檢測部(c)係將會與被檢測物進行抗原抗體反應之抗體作為捕捉物質而固相化為線狀。包含被檢測物之檢體試料係一邊在膜上沿水平方向移動，一邊將標識體展開，因此若存在被檢測物，則形成被檢測物-標識體的複合體，進一步到達檢測部(c)時，在該線上形成捕捉抗體-被檢測物-標識體的複合體，並藉由此複合體中之著色乳膠粒子檢測複合體之存在，藉此而判定檢體中之被檢測物的有無。此外，檢測部(c)係將抗體或其抗原結合性片段固相化為線狀的區域，該抗體可與被檢測物質進行抗原抗體反應，並且與著色乳膠粒子上之抗體或其抗原結合性片段同時結合於被檢測物。不參與反應之其他的成分等，則被吸收墊片部(e)吸收。此外，如圖1所示之例中，雖存在2個檢測部(c)，但其係用於分別捕捉例如A型流感病毒與B型流感病毒之2種被檢測物者。藉由設置複數個此種檢測部(c)，可將複數種被檢測物同時進行免疫測定。
藉由使用本發明之免疫層析試驗片，可迅速且簡便地測定被檢測物，本發明之免疫層析試驗片係將結合有會與被檢測物進行抗原抗體反應之抗體或其抗原結合性片段的乳膠粒子作為安定化乾燥標識體使用。 [實施例]
以下，基於實施例及比較例而更具體地說明本發明。但是，本發明不限定於下述實施例。在下述實施例及比較例中，%為質量基準。
實施例1 對於糞便檢體的含有水溶性聚合物之檢體懸浮液的檢討 1. 抗諾羅病毒抗體對硝基纖維素膜之固定化 準備抗諾羅病毒抗體以精製水稀釋成1.0mg/mL的液體及抗小鼠IgG抗體，分別在以PET薄膜襯底之硝基纖維素膜的樣品墊片側將抗諾羅病毒抗體塗布為線狀，在吸收體側將抗小鼠IgG抗體塗布為線狀。然後，使硝基纖維素膜於45℃乾燥30分鐘，得到抗諾羅病毒抗體固定化膜。在本實施例中將此膜稱為「抗體固定化膜」。
2. 抗諾羅病毒抗體對著色聚苯乙烯粒子之固定化 將抗諾羅病毒抗體以精製水稀釋成0.5mg/mL，在其中以成為0.1%的方式添加著色聚苯乙烯粒子，攪拌後，以成為1%之方式添加碳化二亞胺，進一步攪拌。藉由離心操作，除去上清液，並再懸浮於50mM Tris(pH9.0)、3.0%BSA中，得到結合有抗諾羅病毒抗體之著色聚苯乙烯粒子。於本實施例中，將此粒子稱為「抗體固定化粒子」。
3. 結合有抗諾羅病毒抗體之著色聚苯乙烯粒子的塗布・乾燥 將2所製作之抗體固定化粒子塗布設定量1.0μg於玻璃纖維不織布，於45℃乾燥30分鐘。在本實施例中，將所得到的不織布稱為「乾燥墊片」。
4. 諾羅病毒試驗片之製作 將1所製作之抗體固定化膜、3所製作之乾燥墊片與其他構件(樣品墊片、底板、吸收帶)貼合，裁切成5mm寬，作成諾羅病毒試驗片。此外，試驗片係沿著檢體之流動，從上游起具備樣品墊片、乾燥墊片(標識體區域)、抗體固定化膜(檢測區域)、吸收帶。
5. 檢體懸浮液 在檢體懸浮液(QuickNavi-檢體懸浮液；Denka Seiken公司製)中，以成為1%之方式添加聚氧伸乙基二苯乙烯化苯醚(商品名Emulgen A-500)(以下稱為Emulgen A-500)，調製改良檢體懸浮液。
6. 糞便檢體處理 以將棉棒之棉球輕輕覆蓋的程度採集諾羅病毒陽性之糞便檢體，將其懸浮於檢體懸浮液(QuickNavi-檢體懸浮液；Denka Seiken公司製)中(比較例1)。又，以將棉棒之棉球輕輕覆蓋的程度採集糞便檢體，將其懸浮於改良檢體懸浮液中(實施例1)。
7. 測定 將諾羅病毒陽性之糞便檢體處理檢體(比較例1)及改良糞便檢體處理檢體(實施例1)，分別以檢體懸浮液及改良檢體懸浮液稀釋，並將其中之50μL滴加於試驗片。15分鐘後，以目視判定固定化有抗諾羅病毒抗體之設定位置上有無著色聚苯乙烯粒子的堆積及其程度。將其線狀堆積程度強者當作+，將未見到堆積者當作-。將結果示於下述表1。
[表1]
例 判定結果 (陽性檢體稀釋倍率)
x4 x16 x64
(比較例1)糞便檢體處理檢體 + + -
(實施例1)改良糞便檢體處理檢體 (+1% Emulgen A-500) + + +
從表1來看，藉由將諾羅病毒陽性之糞便檢體稀釋成64倍，與固定化有抗諾羅病毒抗體的設定位置上變得看不到著色聚苯乙烯粒子之堆積的糞便檢體處理檢體相比，本發明之實施例1則可容易地確認到粒子的堆積。
實施例2～5 對於糞便檢體的含有水溶性聚合物之樣品墊片的檢討 1. 抗諾羅病毒抗體對硝基纖維素膜之固定化 準備抗諾羅病毒抗體以精製水稀釋成1.0mg/mL的液體及抗小鼠IgG抗體，分別在以PET薄膜襯底之硝基纖維素膜的樣品墊片側將抗諾羅病毒抗體塗布為線狀，在吸收體側將抗小鼠IgG抗體塗布為線狀。然後，使硝基纖維素膜於45℃乾燥30分鐘，得到抗諾羅病毒抗體固定化膜。在本實施例中將此膜稱為「抗體固定化膜」。
2. 抗諾羅病毒抗體對著色聚苯乙烯粒子之固定化 將抗諾羅病毒抗體以精製水稀釋成0.5mg/mL，在其中以成為0.1%的方式添加著色聚苯乙烯粒子，攪拌後，以成為1%之方式添加碳化二亞胺，進一步攪拌。藉由離心操作，除去上清液，並再懸浮於50mM Tris(pH9.0)、3.0%BSA中，得到結合有抗諾羅病毒抗體之著色聚苯乙烯粒子。於本實施例中，將此粒子稱為「抗體固定化粒子」。
3. 結合有抗諾羅病毒抗體之著色聚苯乙烯粒子的塗布・乾燥 將2所製作之抗體固定化粒子塗布設定量1.0μg於玻璃纖維不織布上，於45℃乾燥30分鐘。在本實施例中，將所得到的不織布稱為「乾燥墊片」。
4. 含浸不織布之製作 將Emulgen A-500以成為設定量之方式塗布於不織布，進行乾燥，得到含浸不織布(每一試驗片為0.1 mg～1.28 mg Emulgen A-500)。
5. 諾羅病毒試驗片之製作 將1所製作之抗體固定化膜、3所製作之乾燥墊片、4所製作之含浸不織布與其他構件(底板、吸收帶)貼合，裁切成5mm寬，作成諾羅病毒試驗片。在本實施例中，將使用含浸不織布作為樣品墊片的試驗片稱為「改良試驗片」。此外，試驗片係沿著檢體之流動，從上游起具備樣品墊片、乾燥墊片(標識體區域)、抗體固定化膜(檢測區域)、吸收帶。
6. 糞便檢體處理 以將棉棒之棉球輕輕覆蓋的程度採集諾羅病毒陽性之糞便檢體，將其懸浮於檢體懸浮液(QuickNavi-檢體懸浮液；Denka Seiken公司製)中(糞便檢體處理檢體)。
7. 測定 將諾羅病毒陽性之糞便檢體處理檢體以檢體懸浮液稀釋，將其中50μL滴加於試驗片上。15分鐘後，以目視判定固定化有抗諾羅病毒抗體之設定位置上有無著色聚苯乙烯粒子的堆積及其程度。將其線狀堆積程度強者當作+，將未見到堆積者當作-。將結果示於下述表2。
[表2]
例 Emulgen A-500(商品名) 含浸量 判定結果 (陽性檢體稀釋倍率)
x40 x80
比較例2 0 mg + -
實施例2 0.1 mg + +
從表2來看，藉由將諾羅病毒陽性之糞便檢體稀釋成80倍，與在固定化有抗諾羅病毒抗體的設定位置上變得看不到著色聚苯乙烯粒子的堆積的比較例2相比，本發明之實施例2則可容易地確認到粒子的堆積。
[表3]
例 Emulgen A-500(商品名) 含浸量 判定結果 (陽性檢體稀釋倍率)
x400 x1600 x6400
實施例3 0.32 mg + - -
實施例4 0.64 mg + + -
實施例5 1.28 mg + + +
從表3來看，藉由將諾羅病毒陽性之糞便檢體稀釋成1600倍，實施例3變得看不到著色聚苯乙烯粒子的堆積，但實施例4～5則可容易地確認到粒子之堆積。又，藉由將諾羅病毒陽性之糞便檢體稀釋成6400倍，實施例4變得看不到著色聚苯乙烯粒子的堆積，但實施例5則可容易地確認到粒子的堆積。
從以上之結果來看，藉由水溶性聚合物，可抑制因糞便檢體中之干擾物質所造成的影響，且不論糞便檢體供於試驗的量，皆可正確、特異性地測定糞便檢體中的被檢測物質。
a:支撐體 b:標識體區域 c:檢測區域 d:樣品墊片 e:吸收帶 f:底板
圖1係顯示典型的免疫層析試驗片之一較佳形態之圖。
a:支撐體
b:標識體區域
c:檢測區域
d:樣品墊片
e:吸收帶
f:底板

Claims (3)

  1. 一種糞便檢體之檢查方法，其包含在水溶性聚合物之存在下，藉由免疫層析法檢查糞便檢體，該水溶性聚合物係選自聚氧伸乙基二苯乙烯化苯醚、聚乙二醇、聚氧伸乙基月桂醚及辛基酚乙氧化物所構成之群組中之至少1種，並在用於免疫層析法的免疫層析試驗片之檢體滴加部位包含該水溶性聚合物。
  2. 如請求項1之方法，其中用於免疫層析法的免疫層析試驗片具有抗諾羅病毒抗體，並檢測糞便檢體中的諾羅病毒。
  3. 一種糞便檢體之檢查用免疫層析試驗片，其中於檢體滴加部位包含水溶性聚合物，該水溶性聚合物係選自聚氧伸乙基二苯乙烯化苯醚、聚乙二醇、聚氧伸乙基月桂醚及辛基酚乙氧化物所構成之群組中之至少1種。
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