JP4638555B1 - 核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定方法及び核酸又は免疫クロマトグラフィー測定用キット - Google Patents

Abstract

【課題】 核酸又は免疫クロマトグラフィー測定を行うにあたり、分析対象物以外の成分の非特異的反応による結合を低減し、且つ分析対象物の分散能を高め、クロマト担体上の展開性を良化するとともに、特異的反応を促進することで、低濃度の分析対象物を用いても正確且つ迅速な判断ができる試薬組成物の提供。
【解決手段】 重量平均分子量８０００以上の水溶性高分子化合物、２価又は３価の金属の塩、非イオン性界面活性剤、及び、水溶性非プロトン性有機化合物を含有する核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸又は免疫クロマトグラフィーに使用される試薬組成物、それを使用する核酸又は免疫クロマトグラフィー測定方法、及びそれを含む核酸又は免疫クロマトグラフィー測定用キットに関する。

従来、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定において感度を上げるためには、固相に塗布する抗体や核酸の量を増加させるか、標識物質に結合させる抗体や核酸の量を増加させることが常套手段であった。

しかし、抗体や核酸などの反応体を増加させると、非特異的な反応が生じやすくなり、また、少量であると十分な感度が得られないという問題点があった。

核酸又は免疫クロマトグラフィーにおいて、種々の目的で各種の試薬成分が使用されている。ポリアニオン等の水溶性高分子化合物、無機塩類、界面活性剤などの添加物を加えて、非特異的な反応を抑えたり、感度を向上させたりする試みが行われてきた（特許文献１〜１１）。
しかし、いずれの添加物の組み合わせも、未だ、非特異的な反応の抑制や感度、クロマト担体上の展開性の向上は十分には達成されていない。

特開２００１−２１５６０号公報 特開２００６−２１５０４４号公報 特開２００６−３１７２２６号公報 特開２００７−１２１２０４号公報 特開２００７−１２１２０５号公報 特開２００７−３２２３１０号公報 特開２００９−５２９４５号公報 特開２０１０−１４５０７号公報 特開２０１０−１９７９４号公報 特開２０１０−４４０９４号公報 特表２０１０−５００５５号パンフレット

本発明は、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定を行うにあたり、分析対象物以外の成分の非特異的反応による結合を低減し、且つ分析対象物の分散能を高めクロマト担体上の展開性を良化するとともに、特異的反応を促進することで、低濃度の分析対象物を用いても正確且つ迅速な判断ができるようにすることを課題とする。

本発明者は、上記の課題が、特定の添加剤の組合せを使用することにより解決されることを知見して本発明を達成した。

本発明は、重量平均分子量８０００以上の水溶性高分子化合物、２価又は３価の金属の塩、非イオン性界面活性剤、及び、水混和性非酸化性有機化合物を含有する核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物である。

本発明は、上記の核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物を用いて測定検体を展開する工程を含む、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定方法である。

本発明は、上記のクロマトグラフィー用試薬組成物を測定検体の展開液として含む、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定用キットである。

本発明によれば、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定を行うにあたり、分析対象物以外の成分の非特異的反応による結合を低減し、且つ分析対象物の分散能を高めるとともに、特異的反応を促進することで、低濃度の分析対象物を用いても正確且つ迅速な判断を行うことができる。

核酸クロマトグラフィー測定の概略工程図である。 核酸クロマトグラフィー測定用キットの概略図である。 核酸クロマトグラフィー測定の測定原理を示す概略図である。

本発明の核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物は、重量平均分子量８０００以上の水溶性高分子化合物、２価又は３価の金属の塩、非イオン性界面活性剤、及び、水溶性非プロトン性有機化合物を含有する。

（重量平均分子量８０００以上の水溶性高分子化合物）
重量平均分子量８０００以上の水溶性高分子化合物は、重量平均分子量が８０００以上であり、かつ、水溶性を有する化合物であれば特に限定されない。重量平均分子量は、１００００以上であるのが好ましい。前記水溶性高分子は重量平均分子量８０００以上であれば重量平均分子量既知の市販の化合物を用いることができる。合成したものを用いる場合は、高分子の分子量測定に汎用されるゲル浸透クロマトグラフィー（以下ＧＰＣ）により測定された重量平均分子量が８０００以上のものを使用する。重量平均分子量が８０００未満の場合、核酸のハイブリダイゼーションや抗原抗体反応に見られる分析対象物との特異的複合体を形成させる結合力が低下し、クロマトグラフィーによる検出感度が低下してしまう。より好ましくは重量平均分子量２万〜１００万の水溶性高分子が用いられる。重量平均分子量８０００以上の水溶性高分子化合物における「水溶性」とは、２０℃の水１Ｌに対して、化合物が１０ｇ以上、好ましくは５０ｇ以上溶解することをいう。

重量平均分子量８０００以上の水溶性高分子化合物は、たとえば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロック共重合体等のポリアルキレングリコール類；メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等のセルロース類；ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル等のビニル系高分子類；ポリメタクリルアミド、ポリアクリルアミド等のアミド系高分子類；及びポリアニオンからなる群から選択される１種以上である。

ポリアニオンとしては、多糖アニオン、ポリグルタミン酸やポリアスパラギン酸等の合成ペプチド系アニオン、合成核酸系ポリアニオンが挙げられ、多糖アニオンが好ましい。

多糖アニオンとしては、例えば、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びその塩からなる群から選択される１種以上が挙げられる。塩として、ナトリウム、カリウム、マグネシウム塩などがある。中でも、入手の容易性と経済性からデキストラン硫酸及びその塩がより好ましい。

重量平均分子量８０００以上の水溶性高分子化合物の量は、試薬組成物に対して、好ましくは０．１〜５重量％、より好ましくは０．５〜３重量％である。

分子量８０００以上の水溶性高分子化合物は、分析対象物との特異的複合体を形成させる結合力を高め、特異的反応を促進する。

（２価又は３価の金属の塩）
２価又は３価の金属は、２価又は３価の金属であれば特に限定されないが、例えば、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属（２価）、ホウ素、アルミニウム等のアルミニウム族金属（３価）が挙げられ、好ましくはマグネシウム、カルシウム又はアルミニウムであり、特に好ましくはマグネシウム又はカルシウムであり、最も好ましくはマグネシウムである。アルカリ金属（１価）を用いた場合、展開速度が低下し、かつ、非特異反応も増大してしまう。

２価又は３価の金属の塩のアニオンは、特に限定されないが、例えば、塩化物、臭化物等のハロゲン化物；硫酸塩；リン酸塩；炭酸塩；ホウ酸塩が挙げられる。好ましくは塩化物や臭化物等のハロゲン化物が用いられる。

２価又は３価の金属の塩は、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム等のマグネシウム塩；塩化カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩及び塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、炭酸アルミニウム等のアルミニウム塩からなる群から選択される１種以上であるのが好ましい。

２価又は３価の金属の塩の量は、試薬組成物に対して、好ましくは０．１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．５〜５０ｍＭ、さらに好ましくは１〜１０ｍＭである。
２価又は３価の金属の塩は、免疫複合体の非特異反応を起こさず毛細管現象の展開速度を高める。

（非イオン性界面活性剤）
非イオン性界面活性剤は、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミドが挙げられる。非イオン性界面活性剤のＨＬＢは、１０〜１８が好ましく、１３〜１８がより好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが好ましく、例えば、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンからなる群から選択される１種以上が特に好ましい。

非イオン性界面活性剤の量は、試薬組成物に対して、好ましくは０．１〜５重量％、より好ましくは０．５〜２．５重量％、さらに好ましくは０．５〜１重量％である。

（水溶性非プロトン性有機化合物）
水溶性非プロトン性有機化合物は、水溶性であり、プロトン性を有しない有機化合物であれば特に限定されない。「水溶性」とは、相分離することなく、水と任意の比率で混合されうる性質を意味し、好ましくは、２０℃の水１Ｌに対して、化合物が１０ｇ以上、好ましくは５０ｇ以上溶解する有機化合物である。「非プロトン性」とは、酸性水素を含まず、水素結合供与体として作用しない性質を意味する。

水溶性非プロトン性有機化合物としては、スルホキシド類、Ｎ，Ｎ’−ジアルキルアミド類、ケトン類、ニトリル類、環状エーテル類等が挙げられる。

スルホキシド類として、ジメチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、ブチルエチルスルホキシド等が挙げられる。

Ｎ，Ｎ’−ジアルキルアミド類として、ジメチルアセトアミド等のジアルキルアセトアミド、ジメチルホルムアミド等のジアルキルホルムアミド、Ｎ−メチル−ピロリドン、Ｎ−エチル−ピロリドン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル)-２-ピロリドン等のＮ−アルキルピロリドンなどが挙げられる。

ケトン類として、アセトン、アセチルアセトン、ジエチルケトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトン、イソブチルメチルケトン、γ −、ブチロラクトン、γ − バレロラクトン等が挙げられる。

ニトリル類として、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル等が挙げられる。

環状エーテル類として、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等が挙げられる。

水溶性非プロトン性有機化合物としては、スルホキシド類、Ｎ，Ｎ’−ジアルキルアミド類が好ましく、スルホキシド類が特に好ましい。

水溶性非プロトン性有機化合物の量は、試薬組成物に対して、好ましくは０．２〜５重量％、より好ましくは０．５〜３重量％である。

水溶性非プロトン性有機化合物は、毛細管現象による展開中に分析対象物以外のものが融着、凝集することによって起こる展開液の不均一性を改善し、非特異的反応を引き起こしにくくする。

本発明の試薬組成物は、通常、水を溶媒として含むものであり、上記の成分を水、例えば超純水に混和して得ることができる。

（核酸又は免疫クロマトグラフィー）
本発明の試薬組成物は、核酸又は免疫クロマトグラフィーに用いられるものである。
核酸クロマトグラフィーは、核酸のハイブリダイゼーションに基づくものである。

免疫クロマトグラフィーは、抗原抗体反応に基づくものであれば、特に限定されず、例えば、競合法、サンドイッチ法があり、その中でもサンドイッチ法が汎用されている。

核酸又は免疫クロマトグラフィーは、分析対象物である核酸や抗原等を標識するために、金、銀又は白金などの貴金属コロイド粒子、酸化鉄などの金属酸化物コロイド粒子、ラテックス粒子等を標識物質として使用することができ、金コロイド粒子を使用するのが好ましい。これらのコロイド状金属粒子の平均粒径は１〜５００ｎｍ、特に強い色調が得られる１０ｎｍ〜１５０ｎｍであることが好ましく、より好ましくは４０〜１００ｎｍの範囲内である。標識物質は分析対象物に結合能を有する蛋白質、特異的な結合能を有する相補的な核酸や抗体との複合体を形成し、分析対象物を標識するための標識試薬として使用され、クロマトグラフ媒体上で標識試薬を展開する際は分析対象物を含む試料と同時、あるいは、後に展開できる態様であれば良い。標識試薬はクロマトグラフ媒体の任意の部位に乾燥保持させて後、展開液や試料希釈液をその上流のサンプルパッド（試料添加部分）などに供給・滴下し展開させ、標識試薬保持部位から溶出させて展開させることができる。また、展開液や希釈液中に分散させて分散液とし、クロマトグラフ媒体上に展開させ使用することもできる。保存の観点から、標識試薬を予めクロマトグラフ媒体の任意の部位に乾燥保持させることが好ましい。

本発明の試薬組成物は、ブロッキング剤、例えばウシ血清アルブミン、牛乳由来たんぱく質、スキムミルク、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質の他、Blocking Peptide Fragment（TOYOBO）、変性魚ＤＮＡ、酵母由来ｔＲＮＡ、ＣＥ５１０（JSR Corporation）などの市販の親水性高分子ポリマー等のブロッキング剤を含むことが好ましい。ブロッキング剤を共存させることにより、感度を低下させることなくバックグランドを低下できるので、Ｓ／Ｎ比を改善できる。
本発明の試薬組成物は、本発明の効果を奏する限り、リン酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、炭酸塩、グリシンなどのアミノ酸、グッドバッファーなどの緩衝剤、核酸又は免疫クロマトグラフィー用の試薬組成物として慣用の成分を含むことができる。

本発明の試薬組成物は、核酸又は免疫クロマトグラフィーにおける展開液として使用できる。展開液としては、通常、溶媒として水を用い、これに重量平均分子量８０００以上の水溶性高分子化合物、２価又は３価の金属の塩、非イオン性界面活性剤、及び、水溶性非プロトン性有機化合物を加える。加える順序は特に特定されず、同時に加えても差支えない。展開液として用いる場合には、検出する分析対象物を含む試料と展開液を予め混合したものを、クロマトグラフ媒体、標識試薬保持部位、あるいは、サンプルパッド上に供給・滴下して展開させることもできるし、先に試料をサンプルパッド上に供給・滴下して後、展開液をサンプルパッド上に供給・滴下して展開させてもよい。試料希釈液として使用する場合には、試料を希釈した希釈液は、そのまま展開液としてクロマトグラフ媒体、標識試薬保持部位、あるいはサンプルパッド上に供給・滴下することにより使用できる。その他に、本発明の試薬組成物は、核酸又は免疫クロマトグラフィーにおいて、サンプルパッドや標識試薬の乾燥保持部位に予め保持させることもできる。希釈剤として使用された本発明の試薬組成物やサンプルパッドあるいは標識試薬の乾燥保持部位に保持された本発明の試薬組成物は、その後の工程で、展開液又はその一部として使用される。標識試薬の乾燥保持部位に保持させる場合、展開の際に多少の凝集が乗じることがあるため、展開液、希釈液又はそれらの一部、あるいはサンプルパッドに予め保持させる態様が好ましい。

本発明の分析対象物としては、それと特異的に結合する物質が存在するもしくは製造できるものであればよく、特に限定されない。「特異的に結合する」とは、生体分子が持つ親和力に基づいて結合することを意味する。このような親和力に基づく結合としては、抗原と抗体との結合が代表的なものであり、免疫測定法で広く利用されるが、このような結合のみならず、本発明では、糖とレクチンとの結合、ホルモンと受容体との結合、酵素と阻害剤との結合、核酸と相補的な核酸、核酸と核酸との結合能を有する蛋白質との結合なども利用できる。分析対象物が完全抗原といったそれ自体が抗原性を有するものであっても、もしくはハプテン（不完全抗原）といったそれ自体が抗原性を有しなくても化学的変成物とすることにより抗原性を持つに至るものであってもよい。これらの分析対象物と特異的に結合する検出物質が存在するもしくは製造できるものであればよく、検出物質としては分析対象物の核酸に相補的な核酸若しくは核酸結合蛋白質、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体等が挙げられる。本発明の分析対象物を例示すれば、培養細胞株、末梢血あるいは細菌、ウィルス等の微生物等に含まれる核酸（一本鎖核酸あるいは二本鎖核酸）若しくはその増幅物、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２タンパク、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ１９−９、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、免疫抑制酸性タンパク（ＩＰＡ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、便潜血、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＲＰ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、梅毒抗体、インフルエンザウイルス、クラミジア抗原、Ａ群β溶連菌抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗原、ロタウイルス、アデノウイルス、アルブミン、糖化アルブミン、及び、花粉、ダニ、室内塵、食品などのアレルゲン、アレルゲン特異的ＩｇＥ等が挙げられる。好ましくは、培養細胞株、末梢血あるいは細菌、ウィルス等の微生物等に含まれる核酸が用いられ、具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、それらの増幅物などが挙げられる。それらは、核酸そのものを分析対象物としても良いし、標識試薬との結合能を有する結合基や結合蛋白質で修飾された核酸であっても良い。
上記被検出物質を含む試料としては、例えば、生体試料、即ち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等の他、牛乳、卵、小麦、豆、牛肉、豚肉、鶏肉などやそれらを含む食品等の抽出液等が挙げられる。また、培養細胞株、末梢血あるいは細菌、ウィルス等の微生物等に含まれる核酸の抽出液、抽出された核酸の増幅物を含む液、あるいはそれら核酸と結合能を有する結合基や結合蛋白質で修飾された核酸を含む液が挙げられるがこれらに限定されない。

以下に、核酸クロマトグラフィーについて、検出方法、判定方法及び検出原理の例についてサンドイッチ法を用いて説明する。

（検出方法の例）
検出方法の例を図１に示す。（ｉ）分析試料（例えば、鼻水）を採取する。（ｉｉ）分析試料からウィルス等の遺伝子等を抽出する。（ｉｉｉ）必要に応じて、抽出した遺伝子等をＰＣＲ法等により遺伝子増幅装置を用いて増幅する。（ｉｖ）遺伝子等を免疫測定用キットに添加する。（ｖ）展開液を添加して遺伝子等を展開する。（ｖｉ）例えば１５分後に、陽性又は陰性を判定する。

（判定方法）
判定方法を図２に示す。陽性又は陰性の判定は、赤いラインの有無で決定する。Ｔｅｓｔライン（Ｔ位置）に赤いラインが現れれば、対象ウィルス等陽性（図２（ａ））、出現しなければ、対象ウィルス等陰性（図２（ｂ））となる。この時ｉｎｔｅｒｎａｌコントロールライン（Ｉ位置）は、患者の鼻等からウィルス等の検体を採取する際に一緒に含まれる患者自身の正常ヒト細胞を検出する。そのため検体採取の際の分析試料の採取が不適切な場合（例えば、鼻腔ぬぐいが不十分な場合）や、あるいは遺伝子等の増幅（ＰＣＲ）に不具合が生じた場合には、ｉｎｔｅｒｎａｌコントロールラインが出現せず、検査のやり直しとなる。またＦｌｏｗコントロールライン（Ｃ位置）が出現しない場合は、測定に不具合が生じたこととなり、再検査となる。

（検出原理）
図３に測定原理を示す。免疫測定用キットに添加された増幅遺伝子（例えばビオチン修飾され増幅された一本鎖ＤＮＡ）等は、標識物質（例えば、金コロイド）に、例えばビオチン−ストレプトアビジンを介して結合する。その後、展開液を添加すると、増幅遺伝子−金コロイド複合体は毛細管現象によりＴライン及びＩラインに固定されたＤＮＡ上を移動する。Ｔラインには対象ウィルス等由来のＤＮＡにのみ結合する相補ＤＮＡが、Ｉラインには正常ヒト細胞由来のＤＮＡにのみ結合する相補ＤＮＡがあらかじめ固定されているため、陽性の場合は金コロイドによる赤いラインを形成する。

Ｃラインには、標識物質（例えば、ストレプトアビジン結合金コロイド）と結合する例えばビオチン標識タンパク質が固定されており、展開が良好に行われた場合には、Ｃラインに金コロイドによる赤いラインが生じる。

本発明は、さらに、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定方法であり、この方法は、前記の試薬組成物を用いて測定検体を展開する工程を含む。この工程は、前記の試薬組成物を測定試料の希釈剤として用い、あるいは、サンプルパッドに予め保持させ、これをその後の展開に際して、展開液の少なくとも一部とする態様を包含する。
本発明は核酸又は免疫クロマトグラフィー測定キットであり、このキットは、前記の試薬組成物を測定検体の展開液として含む。このキットは、前記の試薬組成物を測定検体の希釈剤として含むか、あるいは、サンプルパッド等に予め保持し、希釈後に、これが展開液として使用される態様も含む。すなわち、展開液は、検出する分析対象物を含む試料と予め混合するために使用でき、この混合液をクロマトグラフ媒体、標識試薬保持部位、あるいは、サンプルパッド上に供給・滴下して展開させることもできる。また、先に試料をサンプルパッド上に供給・滴下して後、展開液をサンプルパッド上に供給・滴下して展開させてもよい。展開液を試料希釈液として使用する場合には、試料を希釈した希釈液は、そのまま展開液としてクロマトグラフ媒体、標識試薬保持部位、あるいはサンプルパッド上に供給・滴下することにより使用できる。その他に、展開液は、核酸又は免疫クロマトグラフィーにおいて、サンプルパッドや標識試薬の乾燥保持部位に予め保持させることもできる。希釈剤として使用された展開液やサンプルパッドあるいは標識試薬の乾燥保持部位に保持された展開液は、その後の展開工程における展開液の全部又はその一部として使用される。標識試薬の乾燥保持部位に保持させる場合、展開の際に多少の凝集が乗じることがあるため好ましくなく、前記の試薬組成物を展開液（希釈液としての使用を含む）又はその一部、あるいはサンプルパッドに予め保持させる態様が好ましい。

実施例及び比較例により本発明をより詳しく説明する。％は、重量基準である。

１．核酸クロマトグラフィー
〔１．捕獲プローブ用希釈液の作成〕
塩化ナトリウムを８７．７ｇ、及びクエン酸ナトリウム２水和物を４４．１ｇ秤量し、精製水８００ｍＬに溶解し、ｐＨ７．０に調整した。この溶液を１０００ｍＬにメスアップして、オートクレーブ滅菌を行って捕獲プローブ用希釈液を作成した。

〔２．クロマトグラフ媒体上への反応部位の作製〕
インフルエンザＡウィルス捕獲プローブをプローブ用希釈液で２．０μＭの濃度になるように希釈した。この液を、塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて、２５×２．５ｃｍのニトロセルロース膜(ミリポア社製)に塗布し、 ５０℃で５分間乾燥させた後、さらに８０℃で１時間乾燥させてクロマトグラフ媒体上の反応部位を作製した。

〔３．標識試薬溶液の作製〕
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：平均粒子径４０ｎｍ）２０ｍＬに４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍＬを加えて撹拌した。次に、リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）で０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈したストレプトアビジンを４ｍＬ加え、室温で１５分間静置した。次いで、ＣＥ５１０（ＪＳＲ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を１ｍＬ加え、室温で１５分間静置した。８０００×ｇで１５分間遠心分離を行った。遠心分離後、上清を除去し、１重量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む緩衝液（ｐＨ７．４）４ｍＬを加えて標識試薬溶液を作成した。

〔４．クロマトグラフ媒体の作製〕
上記３で作製した標識試薬溶液４００μＬをグラスファイバー製パッド（１６ｍｍ×１００ｍｍ）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識試薬保持部材とした。次いで、バッキングシートから成る基材に、上記調製したクロマトグラフ媒体、標識試薬保持部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）、及び展開した試料、余剰の標識試薬を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。最後に裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、クロマトグラフ媒体とした。

〔５．展開液の調製〕
（実施例１〜８及び比較例１〜４）
表１に記載の量で、超純水に、１０％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ硫酸マグネシウム、ジメチルスルホキシド、２０％デキストラン硫酸ナトリウム（重量平均分子量：５０万）、及び２％となるようにＣＥ５１０ (ＪＳＲ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加えて混和した。さらに防腐剤として１０％アジ化ナトリウムを０．０５％となるように加えて混和して試薬組成物を得た。

（実施例９〜１４及び比較例５〜９）
超純水に、表２に示すような種類で、重量平均分子量８０００以上の水溶性高分子を２％、２価又は３価の金属の塩を５ｍＭ、非イオン性界面活性剤を１％、水溶性非プロトン性有機化合物を０．９５％、及びＣＥ５１０ (ＪＳＲ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を２％となるように加えて混和した。さらに防腐剤として１０％アジ化ナトリウムを０．０５％となるように加え混和して実施例９〜１４の試薬組成物を得た。

超純水に、表２に示すような種類で、水溶性高分子を２％、金属塩を５ｍＭ、界面活性剤を１％、イソプロパノール０．９５％、ＣＥ５１０を２％及びアジ化ナトリウムを０．０５％となるように加え混和して比較例５〜９の試薬組成物を得た。

〔６．測定〕
上記作製したクロマトグラフ媒体を用いて、以下の方法で試料中のインフルエンザＡウィルスの存在の有無を測定した。すなわちインフルエンザウイルス感染患者の鼻水から抽出したインフルエンザＡウィルスの遺伝子を増幅する際にビオチンで修飾され一本鎖ＤＮＡとして増幅し、２．０×１０^６ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ（ｃｏｐｙ＝複製物１分子）の陽性検体を得た。この１５μＬを試料添加孔に添加した。その後、ただちに展開液１００μＬを試料添加孔に添加した。１５分後にラインの形成の有無を目視で確認した。尚、インフルエンザＡウィルスに感染していない正常人から採取した陰性検体も、鼻水から抽出し同様に作成及び測定した。

〔７．試験例１〕
分析対象物（ＤＮＡ量）とラインの色の濃さ（すなわち発色強度）との間に、ｙ＝βＭの関係が成り立つとして考えた（表４）。その理由は、金コロイドおよびニトロセルロース膜に固定された相補ＤＮＡは十分量用意されているため、添加したＤＮＡの量に応じてニトロセルロース膜のＴラインあるいはＩライン上に形成される複合体の量が増加し、強い発色強度が得られることになるからである。分析試料にＤＮＡが入っていない場合は金コロイドのみが展開液とともに展開されるが、この金コロイドは膜に固定されたＤＮＡと反応することはなく、Ｔラインが形成されることはない。

実施例１〜８及び比較例１〜４の試薬組成物を展開液として用いて、陽性検体（２．０×１０^６ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）の４倍希釈液、６倍希釈液及び８倍希釈液並びに陰性検体のそれぞれの発色及び展開ムラを試験した。

発色は、以下の基準で試料展開１０分後に目視で発色強度を評価した。
＋＋＋：非常に強く標識物質の赤色が確認されるもの。
＋＋ ：強く標識物質の赤色が確認されるもの。
＋ ：標識物質の赤色が確認されるもの。
± ：発色が弱く標識物質の赤色が確認し難いもの。
− ：標識物質の赤色が確認されないもの。
展開ムラは、展開中の赤色金コロイドの先端流形を目視する方法で評価した。

試験結果を表３に示す。

〔８．試験例２〕
実施例９〜１４及び比較例５〜９の試薬組成物を展開液として用いて、陽性検体の４倍希釈液、６倍希釈液及び８倍希釈液並びに陰性検体のそれぞれの発色及び展開ムラを試験した。その結果を表４に示す。

２．免疫クロマトグラフィー
〔１．捕獲抗体用希釈液の作成〕
イソプロピルアルコールを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で５％となるように混和希釈し捕獲抗体用希釈液を作成した。

〔２．クロマトグラフ媒体上への反応部位の作製〕
インフルエンザＡウィルス捕獲抗体（マウス由来抗インフルエンザＡモノクローナル抗体（第一抗体））を抗体用希釈液で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この液を、塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて、２５×２．５ｃｍのニトロセルロース膜(ミリポア社製)に塗布し、 ５０℃で５分間乾燥させた後、さらに室温で１時間乾燥させてクロマトグラフ媒体上の反応部位を作製した。

〔３．標識物質溶液の作製〕
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：平均粒子径４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈したマウス由来抗インフルエンザＡモノクローナル抗体（第二抗体）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。次いで、１重量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、０．５重量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を２ｍｌ加えた。以上の手順で標識試薬溶液を作製した。

〔４．クロマトグラフ媒体の作製〕
上記作製した標識試薬溶液を１５ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識試薬保持部材を作製した。次に、バッキングシートから成る基材に、上記作製したクロマトグラフィー媒体、標識試薬保持部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）、及び展開した試料、余剰の標識試薬を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。最後に裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、クロマトグラフ媒体とした。

〔５．展開液の調製〕
（実施例１５及び比較例１０〜１３）
表５に記載するように、超純水に、１０％Ｔｗｅｅｎ２０を１％、０．１Ｍ硫酸マグネシウムを５ｍＭ、ジメチルスルホキシドを０．９５％、２０％デキストラン硫酸ナトリウム（重量平均分子量：５０万）を２％、及びＣＥ５１０ (ＪＳＲ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を２％となるように加えて混和した。さらに、防腐剤として１０％アジ化ナトリウムを０．０５％となるように加えて混和して、実施例１５及び比較例１０〜１３の試薬組成物を得た。

〔６．測定〕
上記で作製したクロマトグラフ媒体を用いて、以下の方法で試料中のインフルエンザＡウィルスの存在の有無を測定した。吸引トラップの片方の管を吸引ポンプに、もう片方の管をインフルエンザＡに感染していない人の鼻腔の奥部まで挿入し、吸引ポンプを陰圧にして鼻汁を採取した。採取した鼻汁を上記作成した展開液で２０倍に希釈し、これを陰性検体試料とした。また、陰性検体試料に、蛋白濃度が２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬとなるように市販の不活化インフルエンザＡウィルスを加えたものを陽性検体試料とした。

〔７．試験例１〕
陰性検体試料、陽性検体試料とも１５０μＬをイムノクロマトグラフィー用試験片のサンプルパッド上に載せて展開させ、１５分後に目視判定をした。発色強度及び展開ムラの基準は核酸クロマトグラフィーと同様の基準とした。
試験結果を表６に示す。

本発明によれば、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定において、分析対象物以外の成分の非特異的反応による結合を低減し、且つ分析対象物の分散能を高めるとともに、特異的反応を促進することで、低濃度の分析対象物を用いても正確且つ迅速な判断を行うことができる。

１：クロマトグラフ媒体
２：増幅した遺伝子
３：展開液
４：陰性の発色ストリップ
５：陽性の発色ストリップ
６：増幅したＤＮＡ
７：展開液
８：金コロイド
９：膜固定プローブ
１０：ニトロセルロース膜

Claims (13)

1. 重量平均分子量８０００以上の水溶性高分子化合物、２価又は３価の金属の塩、非イオン性界面活性剤、及び、水溶性非プロトン性有機化合物を含有する核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物。
2. 重量平均分子量８０００以上の水溶性高分子化合物が、ポリアルキレングリコール類、セルロース類、ビニル系高分子類、アミド系高分子類及びポリアニオンからなる群から選択される１種以上である、請求項１に記載の試薬組成物。
3. ポリアニオンが多糖アニオンである、請求項２に記載の試薬組成物。
4. 多糖アニオンが、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びその塩からなる群から選択される１種以上である、請求項３に記載の試薬組成物。
5. 水溶性非プロトン性有機化合物が、スルホキシド類及びＮ，Ｎ’−ジアルキルアミド類からなる群から選択される１種以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試薬組成物。
6. ２価又は３価の金属の塩が、マグネシウム塩、カルシウム塩及びアルミニウム塩からなる群から選択される１種以上である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬組成物。
7. 非イオン性界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンからなる群から選択される１種以上である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の試薬組成物。
8. 核酸クロマトグラフィー用である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の試薬組成物。
9. 免疫クロマトグラフィー用である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の試薬組成物。
10. 核酸又は免疫クロマトグラフィーが金コロイド粒子を標識物質として使用する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の試薬組成物。
11. 核酸又は免疫クロマトグラフィーにおける展開液として使用する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の試薬組成物。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の試薬組成物を用いて測定検体を展開する工程を含む、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定方法。
13. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の試薬組成物を測定検体の展開液として含む、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定用キット。