TWI869073B - 非神經元性ＳＮＡＲＥ裂解的肉毒桿菌神經毒素、裂解ｈＳＮＡＰ-２３之活體外方法、及經修飾ＢｏＮＴ／Ａ Ｌ鏈蛋白酶之用途 - Google Patents
非神經元性ＳＮＡＲＥ裂解的肉毒桿菌神經毒素、裂解ｈＳＮＡＰ-２３之活體外方法、及經修飾ＢｏＮＴ／Ａ Ｌ鏈蛋白酶之用途 Download PDFInfo
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Abstract
本發明提供一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A (BoNT/A) L鏈蛋白酶，相對於未經修飾的(野生型) BoNT/A L鏈蛋白酶，其顯示增強的裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)，以及其用於裂解hSNAP-23之用途。
Description
本發明係關於一種具有裂解非神經元性SNARE蛋白能力的經修飾的肉毒桿菌神經毒素蛋白酶，及關於其用於藉由切割哺乳動物細胞中之該非神經元性SNARE蛋白以抑制該哺乳動物細胞非所欲之分泌的用途。
毒素通常屬於兩類中的一類，亦即殺死其天然靶細胞的細胞毒性毒素(例如植物毒素，例如蓖麻毒素)，及並不殺死其天然靶細胞的非細胞毒性毒素(例如肉毒桿菌神經毒素)。非細胞毒性毒素藉由抑制蛋白合成以外的細胞方法對靶細胞發揮其作用。
肉毒桿菌神經毒素蛋白酶藉由被稱為SNARE蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白(Syntaxin))之蛋白水解-裂解的細胞內轉運蛋白作用，字首縮寫SNARE來自術語可溶性NSF附著蛋白受體(
Soluble
NSF
Attachment protein
Receptor)，其中NSF表示N-乙基馬來醯亞胺敏感因子(
N-ethylmaleimide-
Sensitive
Factor)。SNARE蛋白為一種蛋白質之大型超家族。SNARE蛋白的一個重要功能是介導神經傳導物質分子向突觸後連接處的胞泌作用。因此，SNARE蛋白對於經由來自細胞的囊泡轉運的分子分泌是不可或缺的。
肉毒芽胞梭菌(
Clostridium botulinum)製造七種(A至G)不同的神經毒素(BoNT)，其藉由缺乏抗血清交叉血清型中和反應而在血清學上區分。BoNT藉由靶向神經元和裂解的神經元特異性SNARE蛋白引發神經元特異性弛緩性麻痺。
BoNT具有一150 kDa之多肽鏈，其包含藉由二硫鍵連接之100 kDa重鏈和50 kDa輕鏈。BoNT分為三個功能域：N端蛋白水解輕鏈(L鏈)；及C端重鏈(H-鏈)，後者由轉位域(translocation domain)(H
N)和C端神經元結合域(H
C)所組成。BoNT的毒性作用(神經中毒)遵循3步驟作用機制。首先，H
C部分與膽鹼性神經細胞結合並經由受體介導之內胞飲作用而內化。其次，H
N部分使L鏈轉位跨越胞內體膜並進入神經細胞的細胞液(cytosol)中。第三，L鏈結合並裂解細胞液內的神經元SNARE蛋白，從而抑制神經傳導物質從神經細胞中釋放而導致神經細胞中毒。
七種BoNT血清型裂解在三種SNARE蛋白中之一種上的特定殘基：
血清型B、D、F及G裂解VAMP-2；
血清型A及E裂解SNAP-25；及
血清型C裂解SNAP-25及突觸融合蛋白la。
雖然天然BoNT能夠靶向和切割神經元SNARE同功型，例如VAMP-2、SNAP-25和突觸融合蛋白1a，該蛋白酶對大多數非神經元性SNARE蛋白具有很少或不具有裂解作用。這種神經元SNARE基質特異性與經BoNT證明的天然神經元細胞結合特異性一致而且被理解為是反應性的。例如，BoNT/A裂解人類SNAP-25，但不是人類非神經元性同功型。
早在1989年，BoNT/A就被FDA批准用於治療斜視、眼瞼痙攣和半邊顏面痙攣症，然後用於頸部肌張力障礙、化妝品用途、眉間顏面皺紋和腋窩多汗症。BoNT/A在肌張力障礙和其他與不隨意骨骼肌活動相關的疾病中有效，加上令人滿意的安全性，促使經驗/藥品仿單標示外使用(off-label use)於各種分泌作用和疼痛和美容障礙。
BoNT的臨床應用集中於靶向與神經肌肉活動相關的病症。最近，Syntaxin Ltd領導的開創性研究已經允許設計重新靶向的BoNT，其結合至獨特的神經元子集(例如痛覺傳入-參見WO96/33273，其全部內容併入本文)及/或結合至非神經元性細胞(例如氣管上皮細胞–參見WO00/10598，其全部內容併入本文)。此技術稱為靶向分泌抑製劑(TSI)技術，涉及藉由不同靶向部分(例如生長因子或其他信號分子)取代天然BoNT結合域，並且為新的以BoNT為基礎之治療學和療法打開了大門。
然而，BoNT對神經元特異性SNARE蛋白的選擇性切割限制了這些非神經元系統中新療法的發展。神經元和非神經元性SNARE蛋白被認為與細胞內囊泡融合的方法同等重要，因此被認為是經由來自細胞的囊泡轉運來分泌分子。因此，使用習知以BoNT為基礎之治療劑來去活化神經元SNARE蛋白驅動分泌將不會解決任何對應的非神經元SNARE驅動細胞分泌。
因此，需要一種有效裂解非神經元性SNARE蛋白的工程化BoNT L鏈蛋白酶。
本發明藉由提供一種工程化BoNT/A L鏈蛋白酶解決了上述一或多個問題，該蛋白酶裂解主要在非神經元性細胞(即人類SNAP-23(hSNAP-23))中表現的SNARE蛋白同功型。因此，本發明提供一種新種類的非細胞毒性治療劑。
除本文另有定義，與本發明有關的科學和技術術語應具有本領域具有通常技術之人所一般理解的含義。此外，除上下文另有要求，本文使用的命名法和細胞及組織培養技術是本領域熟知且通常使用者。
然而，關於在本說明書全文中使用之不同術語，以下定義更具體地適用。
除上下文另有指示，單數術語「一」、「一種」或「該」包含複數含義，例如「一或多種」或「至少一種」。
術語「蛋白酶」在本文中意指能夠水解裂解蛋白及/或肽之酶。在本發明上下文中，該蛋白酶更具體地為肉毒桿菌神經毒素(BoNT)輕鏈(L鏈)蛋白酶，即衍生自肉毒桿菌神經毒素的蛋白酶(亦稱為蛋白水解域)，特別是衍生自肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)。如熟悉技術者所熟知，肉毒桿菌神經毒素的輕鏈提供蛋白酶功能(亦稱為非細胞毒性蛋白酶功能)，且通常具有約50 kDa的分子量。此類非細胞毒性蛋白酶通常藉由稱為SNARE蛋白的蛋白水解裂解的細胞內轉運蛋白作用(例如SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白)–參見Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology” (4th edition) John Wiley & Sons, Inc。天然存在的(即野生型)BoNT/A L鏈更特別能夠有效地裂解SNAP-25，但僅能微量裂解hSNAP-23，如下面進一步說明。相反地，如下文更詳細的描述，本發明之BoNT/A L鏈蛋白酶與天然存在的BoNT/A L鏈的不同之處在於其具有改善的裂解hSNAP-23的能力，且在本文中被稱為「裂解hSNAP-23之經修飾的BoNT/A L鏈」。
裂解hSNAP23的能力可經由習知分析確認，例如下文實施例2中所述的分析。「hSNAP-23的裂解」更具體地意指本發明之經修飾BoNT/A L鏈相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)顯示改善的hSNAP-23裂解。可以使用任何簡單的比較分析，例如實施例2所說明之hSNAP-23分析。野生型BoNT/A L鏈僅能進行微量的(即背景值)hSNAP-23裂解。
因此，本發明之經修飾BoNT/A L鏈顯示下列一或多者(較佳為兩者)：
a) 在無細胞分析中(1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37℃溫育約1小時)，hSNAP-23裂解大於0.2%(例如大於0.5%，較佳大於1%，更佳大於5%)-參見實施例2，圖1；及/或
b) 在無細胞分析中(1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37℃溫育約1小時)，小於225 (例如小於200，較佳小於150)微莫耳之Km – 參見實施例2，圖1；及/或
c) 在無細胞分析中(1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37℃溫育約1小時)，小於0.2之Kcat (1/min) (例如，小於0.18，較佳小於0.1) – 參見實施例2，圖1。
本發明之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶可選擇地不僅裂解hSNAP-23而且也裂解SNAP-25。SNAP-25的裂解可經由習知分析確認，例如下文實施例3中所述之分析。根據此可選擇的具體實施例，「SNAP-25的裂解」本文中意指相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO: 1)，本發明之經修飾BoNT/A L鏈較佳顯示至少0.5%、至少1%、至少2%，較佳至少3%，亦較佳至少10%之SNAP-25裂解。可以採用任何簡單的比較分析，例如實施例3所說明之SNAP-25分析。
在一較佳具體實施例中，本發明之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶裂解hSNAP-23但不裂解SNAP-25，例如hSNAP-25。
術語「SNAP-23」(synaptosomal-associated protein 23；突觸體相關蛋白23)在本文中指SNARE蛋白，其能夠結合各種其他SNARE蛋白並與細胞中(較佳在非神經元性細胞中)這些蛋白形成高親和力複合體，從而調節該細胞中的細胞內細胞膜融合。「hSNAP-23」更具體而言係指人類SNAP-23，且較佳為序列EQ ID NO：2的蛋白。
術語「SNAP-25」(突觸體相關蛋白25)在本文中指SNARE蛋白，其能夠結合各種其他SNARE蛋白並在細胞中(較佳在神經元性細胞中)形成高親和力複合體，從而調節該細胞中的細胞內細胞膜融合。「hSNAP-25」更具體而言係指人類SNAP-25，且較佳為序列SEQ ID NO：3的蛋白。
術語「修飾」、「變更」或「突變」在本文中可互換使用，且係指胺基酸序列與參考蛋白相較下之變更，即本文相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的變更。本文中作為SEQ ID NO：1說明的胺基酸序列長度為438個胺基殘基，並以K438結束。應理解的是，K438是活化圈(activation loop)的第一個離胺酸胺基殘基，且最可能代表活化圈蛋白水解裂解後L鏈的C末端。因此，SEQ ID NO：1代表來自野生型BoNT/A L鏈的(天然)活化形式。在這方面，於蛋白水解活化之前，野生型BoNT/A L鏈的長度通常為~448個胺基殘基，其包括一活化環胺基酸殘基的短C末端延伸。
如下文進一步解釋，本發明揭示野生型BoNT/A L鏈中關鍵胺基酸位置的鑑定，其需要合理變更不同的胺基酸殘基以使得BoNT/A L鏈能夠裂解hSNAP-23。在這方面，胺基酸變化(即突變)的導入可藉由胺基酸插入、缺失或取代之方式來實現，且較佳以胺基酸取代之方式。允許導入此類突變的方法為本領域熟悉技術者所已知的。例如，可藉由使用退化之引子的PCR進行隨機或定向突變誘發來引入突變，例如在編碼參考蛋白質的核苷酸序列中。該技術特別被描述於Sambrook et al. in “Molecular Cloning: A laboratory Manual”, 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012年，且2014年更新)，及描述於Ausubel et al. in “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons (2012)。
相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)，胺基酸變化發生在一或多個L鏈「結合囊袋(binding pocket)」內。藉由「結合囊袋」，其在本文中意指一BoNT/A L鏈的區域，其包含用於結合至hSNAP-23對應結合位之接觸點(例如經由氫鍵、鹽橋及/或疏水接觸)的一或多個胺基酸，及/或其提供容納能結合hSNAP-23之其他基質胺基酸殘基(例如藉由修飾，例如藉由取代)的空間。本文所用的術語「結合至」意指「適於結合至」且形成申請人之本發明基本原理的一部分-該基本原理並不構成本發明的實質技術特徵。例如，由SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基E148、T307、A308及Y312所定義之該BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋係指包含胺基酸E148、T307、A308及/或Y312、及/或其於本文中所述之突變型之BoNT/A L鏈蛋白酶的區域，申請人認為配合結合hSNAP-23上的預測結合位(例如結合至hSNAP-23之P182/D178結合位)。
術語「結合位」在本文中係指hSNAP-23的區域，其包含一或多個可被對應的BoNT/A L鏈結合囊袋所結合的胺基酸。例如，該hSNAP-23之「P182/D178」結合位包含hSNAP-23之胺基酸P182及/或D178。術語「結合位」如在本文中使用簡單意指「預測結合位」(經申請人預測)且形成申請人之本發明基本原理的一部分-該基本原理並不構成本發明的實質技術特徵。
胺基酸或核酸序列之間的「序列同一性」可藉由比較各序列中的位置來確定，該序列可為比較之目的而對齊比對。當比較的序列中的位置被相同的核苷酸或胺基酸佔據時，則該序列在該位置是相同的。胺基酸序列之間的同一性程度是這些序列之間共有的相同胺基酸序列的數量函數。核酸之間的序列同一性程度是這些序列共有的位置處相同核苷酸數量的函數。
為了確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之間的「序列同一性百分比」，對齊序列以進行理想的比較。例如，可以在第一個胺基酸序列或第一個核酸序列的序列中導入缺口(gap)，用於與第二胺基酸序列或第二核酸序列最佳的比對，然後比較在對應的胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置被相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據作為第二序列中的對應位置時，該分子在該位置是相同的。
兩個序列之間的同一性百分比(%)是序列共有的相同位置的數量函數。因此，可藉由將相同位置的數量乘以100並除以對齊區域的長度(重疊位置)，包括間隙(僅內部間隙，而不是序列末端處的間隙)，來計算同一性百分比。
在此比較中，序列可有相同的長度，或可具有不同的長度。同一性評分僅計算完美匹配，且並不考量胺基酸彼此的相似程度。
本文中可較佳地進行序列的最佳比對，可藉由整體同源性比對演算法應該使用相同或相似長度的序列進行比對，例如藉由Needleman and Wunsch (Journal of Molecular Biology；1970, 48 (3): 443–53)中所述之演算法，藉由此演算法的電腦化執行(例如使用DNASTAR® Lasergene軟體)，或藉由目視檢測。或者，如果使用不同長度的序列進行比對(例如，根據本發明的輕鏈胺基酸序列與天然存在之肉毒桿菌神經毒素的整個胺基酸序列)，序列的最佳比對於此可較佳地藉由局部同源性比對演算法進行，例如藉由Smith and Waterson (Journal of Molecular Biology；1981, 147: 195-197)中所述之演算法，藉由此演算法的電腦化執行(例如使用DNASTAR® Lasergene軟體)，或藉由目視檢測。選擇由各種方法產生的最佳比對(即，產生比較序列之間的最高同一性百分比)。整體和局部同源性比對演算法之實例為本領域熟悉技術者所熟知的，且包括但不限於ClustalV(整體比對)，ClustalW(局部比對)和BLAST(局部比對)。
本領域熟悉技術者將更容易理解本發明包含實質上同源之經修飾BoNT/A L鏈，其保留裂解hSNAP-23的能力，即功能性變體或同源物。這些功能性變體或同源物特徵在於具有一或多個胺基酸突變(例如，胺基酸缺失、增加及/或取代)，而不是下文所揭示之與hSNAP-23裂解相關者，且其並不顯著影響折疊或蛋白酶活性，特別是hSNAP-23裂解。例如，此類突變包括但不限於，保守取代、少部分缺失(通常為1至約30個胺基酸)、少部分胺基-或羧基-末端延伸(例如胺基-末端甲硫胺酸殘基)，增加最多至約20-25個殘基之少部分連結子胜肽或親和性標籤(tag)。
根據本發明的功能變體或同源物較佳包含微小性質的突變，例如保守胺基酸取代。保守胺基酸取代為本領域熟悉技術者所熟知的，包括但不限於：
鹼性：精胺酸、離胺酸、組胺酸
酸性：麩胺酸、天冬胺酸
極性：麩醯胺酸、天冬醯胺
疏水性:白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸
芳族：苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸
小型：甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸
除了20個標準胺基酸外，例如4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸和α-甲基絲胺酸之非標準胺基酸可取代本發明之多肽的胺基酸殘基。有限數量的非保守的胺基酸、非由遺傳密碼編碼之胺基酸及非天然的胺基酸可以替代梭菌多肽胺基酸殘基。本發明的多肽亦可包含非天然存在的胺基酸殘基。
非天然存在的胺基酸包括但不限於反-3-甲基脯胺酸、2,4-橋亞甲基-脯胺酸、順-4-羥基脯胺酸、反-4-羥基-脯胺酸、N-甲基甘胺酸、別-蘇胺酸、甲基-蘇胺酸、羥基-乙基半胱胺酸、羥基乙基高-半胱胺酸、硝基-麩醯胺酸、高麩醯胺酸、哌啶酸、第三-白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯基-丙胺酸、4-氮雜苯基-丙胺酸及4-氟苯丙胺酸。數種方法為本領域已知用於將非天然存在的胺基酸殘基併入蛋白質。
胺基酸取代可包含將含特定生理化學性質(例如疏水性)的胺基酸以具有相似或替代性質的胺基酸取代。此類替代之實例如下所列：
酸性胺基酸取代中性、極性胺基酸；
極性胺基酸取代非極性胺基酸；
非極性胺基酸取代非極性胺基酸；
非極性胺基酸取代極性胺基酸；
極性胺基酸取代鹼性胺基酸；
非極性胺基酸取代酸性胺基酸；
非極性胺基酸取代極性胺基酸。
因此，本發明包括所有BoNT/A亞型的L鏈，例如BoNT/A1至BoNT/A8 L鏈中的任一個，其包含一或多個如本文所述的用於裂解hSNAP-23之突變。該BoNT/A L鏈可另外包含其他突變以提供非天然活化切割位，例如腸激酶(SEQ ID NO：10)之切割位、PreScission、因子Xa、凝血酶、TEV蛋白酶等。
在整個說明書中提供另外的定義。
本發明可如下敘述。
於第一態樣中，本發明提供一種裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之經修飾的肉毒桿菌神經毒素A (BoNT/A) L鏈蛋白酶，其相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO: 1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；
b) 其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148、T307、A308及Y312定義；
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包括：
i. 選自天冬醯胺及酪胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148之位置；及/或
ii. 選自苯丙胺酸、異白胺酸及白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基T307之位置；及/或
iii. 選自脯胺酸、天冬醯胺、蘇胺酸及異白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基A308之位置；及/或
iv. 選自離胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸及白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y312之位置。
不希望受任何理論束縛，申請人認為上述定義的BoNT/A L鏈結合囊袋與hSNAP-23上的識別序列產生重要的酶-基質組合。
因此，本發明基於令人驚訝的發現(例如不可預期之技術效果)，所請求之經靶向胺基取代允許產生增加hSNAP-23裂解的BoNT/A L鏈(相對於野生型BoNT/A L鏈)。本發明人不僅已成功地鑑定出BoNT/A L鏈可被變更(例如被取代)以增加hSNAP-23裂解的適當胺基位置，而且亦已鑑定出，提供此效果的精確胺基酸取代。
於第一態樣中，本發明提供一種裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之經修飾的肉毒桿菌神經毒素A (BoNT/A) L鏈蛋白酶，其相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；
b) 其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148定義；
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包括：
i. 選自天冬醯胺及酪胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148之位置。
於一態樣中，本發明提供一種裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之經修飾的肉毒桿菌神經毒素A (BoNT/A) L鏈蛋白酶，其相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；
b) 其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148、T307、A308及Y312定義；
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包括：
i. 選自苯丙胺酸、異白胺酸及白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基T307之位置；及/或
ii. 選自脯胺酸、天冬醯胺、蘇胺酸及異白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基A308之位置；及/或
iii. 選自離胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸及白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y312之位置。
經修飾BoNT/A L鏈可包含一個胺基酸取代(相對於野生型SEQ ID NO：1)。經修飾BoNT/A L鏈可包含二個胺基酸取代(相對的野生型WT SEQ ID NO：1)。經修飾BoNT/A L鏈可包含三個胺基酸取代(相對於野生型SEQ ID NO：1)。經修飾BoNT/A L鏈可包含四個胺基酸取代(相對於野生型SEQ ID NO：1)。
包含用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈通常顯示hSNAP-23裂解增加1.15倍(相對於野生型BoNT/A L鏈) –參見圖1A中之第1資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈之實例(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)包括：
包含取代E148Y或E148N之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代T307I、A308P及Y312V之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代T307F、A308N及Y312L之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148N、T307I及A308P、Y312V之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307F、A308N及Y312L之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307I、A308P及Y312V之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307L、A308T及Y312M之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307L、A308I及Y312M之經修飾BoNT/A L鏈。
在一具體實施例中，包含用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈顯示hSNAP-23裂解增加1.35倍(相對於野生型BoNT/A L鏈) - 參見圖1A中之第1資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈之實例(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)包括：
包含取代E148Y或E148N之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代T307I、A308P及Y312V之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代T307F、A308N及Y312L之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148N、T307I、A308P及Y312V之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307F、A308N及Y312L之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307I、A308P及Y312V之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307L、A308T及Y312M之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307L、A308I及Y312M之經修飾BoNT/A L鏈。
在另一具體實施例中，包含用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈顯示hSNAP-23裂解增加1.7倍(相對於野生型BoNT/A L鏈) - 參見圖1A中之第1資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈之實例(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)包括：
包含取代E148Y之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代T307F之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代T307I之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代Y312K之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代Y312K、E148Y之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代T307I、A308P及Y312V之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148N、T307I、A308P及Y312V之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307F、A308N及Y312L之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307L、A308T及Y312M之經修飾BoNT/A L鏈。
在另一具體實施例中，包含用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈顯示hSNAP-23裂解增加2.0倍(相對於野生型BoNT/A L鏈) - 參見圖1A中之第1資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈之實例(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)包括：
包含取代E148Y之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148N、T307I、A308P及Y312V之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307F、A308N及Y312L之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307L、A308T及Y312M之經修飾BoNT/A L鏈。
在另一具體實施例中，包含用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈顯示hSNAP-23裂解增加4.0倍(相對於野生型BoNT/A L鏈) - 參見圖1A中之第1資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈之實例(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)包括：
包含取代E148Y之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148N、T307I、A308P及Y312V之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307F、A308N及Y312L之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、T307L、A308T及Y312M之經修飾BoNT/A L鏈。
在另一具體實施例中，包含用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈顯示hSNAP-23裂解增加至少6.0倍，較佳為至少7.0倍，更佳為至少8.0倍(相對於野生型BoNT/A L鏈) - 參見圖1A中之第1資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈之實例(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)包括：
包含取代E148Y之經修飾BoNT/A L鏈。
包含用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈通常顯示大於1.5%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1A中之第2資料欄。供參考，野生型BoNT/A L鏈(例如SEQ ID NO：1)顯示小於0.5%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時)。此類經修飾L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代T307F之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代T307I之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代Y312K之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代Y312K及E148Y之經修飾BoNT/A L鏈。
在一具體實施例中，包含用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈通常顯示大於2%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1A中之第2資料欄。此類經修飾L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代T307I之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代Y312K之經修飾BoNT/A L鏈。
在其他具體實施例中，包含用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈通常顯示大於9%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1A中之第2資料欄。此類經修飾L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y之經修飾BoNT/A L鏈。
具有用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋突變的經修飾BoNT/A L鏈突變體(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)的額外實例包括：
包含取代A308L之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代A308V之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代A308I之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代A308P之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代A308N之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代A308T之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代Y312V之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代Y312M之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代Y312L之經修飾BoNT/A L鏈。
具有用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可包含相對於野生型BoNT/A L鏈之一或多個胺基酸殘基變更，如本文上述所定義。作為說明，本發明經修飾BoNT/A L鏈可具有單一胺基酸殘基突變(在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內，如上述定義)，例如對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基E148的突變。同樣地，本發明經修飾BoNT/A L鏈可包含大於一個胺基酸殘基突變(在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內，如上述定義)，例如對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基T307、A308及Y312的突變。
在一較佳具體實施例中，具有用於hSNAP-23上P182/D178結合位之一或多個結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈在用於hSNAP-23之一或多個不同BoNT/A L鏈結合囊袋內進一步包含一或多個突變，進一步如下所述。
該用於hSNAP-23之一或多個不同BoNT/A L鏈結合囊袋包括用於結合至hSNAP-23之D189/D192結合位的第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋；用於結合至hSNAP-23之I198結合位的第三BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋；用於結合至hSNAP-23之K185結合位的第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋；用於結合至hSNAP-23之R186結合位的第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋；用於結合至hSNAP-23之K206結合位的第六BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋；用於結合至hSNAP-23之D210結合位的第七BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋；用於結合至hSNAP-23之D168結合位的第八BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋。
或者，根據本發明的不同技術特徵，經修飾BoNT/A L鏈可包含非在用於如上定義之hSNAP23上P182/D178結合位的結合囊袋內的一或多個突變。
該用於hSNAP-23之BoNT/A L鏈結合囊袋及所關注的對應突變於下文進一步詳細說明。
因此，作為額外之技術特徵，或作為替代之技術特徵，本發明包括在本文定義之BoNT/A L鏈的囊袋內包含一或多個突變的BoNT/A L鏈突變體。舉例而言，裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之本發明經修飾BoNT/A L鏈相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，其包含：
a) 位於用於結合hSNAP-23之R186結合位的第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更；
b) 其中該第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基S143定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. 選自麩醯胺酸、麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S143之位置。
不希望受任何理論所束縛，申請人認為上述定義的BoNT/A L鏈結合囊袋在hSNAP-23上的R186與BoNT/A上的S143之間提供穩定的鹽橋。
包含用於hSNAP-23上R186結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈對於hSNAP-23通常顯示小於100微莫耳之K
M，例如小於95微莫耳 - 參見圖1A中之第3資料欄。供參考，野生型BoNT/A L鏈(例如SEQ ID NO：1)對於hSNAP-23顯示大於150微莫耳之K
M，例如大於200微莫耳。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代V304D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代V304E之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代G305D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代G305E之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代S143D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代S143E之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代S143Q之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代K166F之經修飾BoNT/A L鏈。
在一較佳具體實施例中，具有用於hSNAP-23上R186結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可進一步包含在如本文所述之一或多種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如，在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內，如上述定義)。此類突變體通常顯示hSNAP-23裂解減少至少0.5倍(相對於E148Y經修飾BoNT/A L鏈)或，換句話說，hSNAP-23裂解增加至少4.0倍(相對於野生型BoNT/A L鏈) - 參見圖1B中多囊袋突變體之第1資料欄；或至少5% hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1B中之第2資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y及S143E之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y及S143D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y及S143Q之經修飾BoNT/A L鏈。
因此，在本文一具體實施例中，提供一種裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，且其相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148定義；及
b) 位於第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的R186結合位；其中該第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S143定義；及
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包括：
i. 選自酪胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148之位置；及
ii. 選自麩胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S143之位置。
在另一具體實施例中，提供一種裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，且其相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148定義；及
b) 位於第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的R186結合位；其中該第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S143定義；
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包括：
i. 選自酪胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148之位置；及
ii. 選自天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S143之位置。
在另一具體實施例中，具有用於hSNAP-23上R186結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT L鏈進一步包含在如本文所述之一或多種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內，如上述定義)。此類突變體通常顯示hSNAP-23裂解增加至少2.0倍(相對於E148Y經修飾BoNT/A L鏈) - 參見圖1B中多囊袋突變體之第1資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)包括：
具有取代E148Y及S143E之經修飾BoNT/A L鏈；
具有取代E148Y及S143D之經修飾BoNT/A L鏈。
在另一具體實施例中，具有用於hSNAP-23上R186結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT L鏈進一步包含在如本文所述之一或多種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內，如上述定義)。此類突變體通常顯示hSNAP-23裂解增加至少3.0倍(作為相對於E148Y經修飾BoNT/A L鏈之百分比) - 參見圖1B中多囊袋突變體之第1資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y、S143D之經修飾BoNT/A L鏈。
作為額外技術特徵，或作為替代技術特徵，本發明包括BoNT/A L鏈突變體，其在如本文所定義BoNT/A L鏈之囊袋內包含一或多個突變。舉例而言，裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)的本發明經修飾BoNT/A L鏈相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，其包含：
a) 位於用於結合hSNAP-23之K185結合位的第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更；
b) 其中該第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈 (SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基V304及G305定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. 選自麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基V304之位置；及/或
ii. 選自麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基G305之位置。
不希望受任何理論所束縛，申請人認為上述定義的BoNT/A L鏈結合囊袋在hSNAP-23上的K185與BoNT/A之間提供穩定的鹽橋。
包含用於hSNAP-23上K185結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈對於hSNAP-23通常顯示小於100微莫耳之K
M- 參見圖1A中之第3資料欄。供參考，野生型BoNT/A L鏈(例如SEQ ID NO：1)對於hSNAP-23顯示大於150微莫耳之K
M，例如大於200微莫耳。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代V304D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代V304E之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代G305D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代G305E之經修飾BoNT/A L鏈。
具有用於hSNAP-23上K185結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈相對於野生型BoNT/A L鏈包含一或多個胺基酸殘基變更，如本文上述定義。舉例而言，本發明經修飾BoNT/A L鏈可具有單一胺基酸殘基突變(在用於hSNAP-23上K185結合位之結合囊袋內，如上述定義)，例如對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基G305的突變體。同樣地，本發明經修飾BoNT/A L鏈可包含一或多個突變(在用於hSNAP-23上K185結合位之結合囊袋內，如上述定義)，例如對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基V304及G305。
在一較佳具體實施例中，具有用於hSNAP-23上K185結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可進一步包含在如本文所述之一或多種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內，如上述定義)。此類突變體通常顯示hSNAP-23裂解增加至少2.0倍，較佳為至少2.5倍(相對於E148Y經修飾BoNT/A L鏈) - 參見圖1B中多囊袋突變體之第1資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
具有取代E148Y及G305D之經修飾BoNT/A L鏈。
因此，在另一具體實施例中，提供一種裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，且其相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148定義；及
b) 位於第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的K185結合位；其中該第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基G305定義；
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包括：
i. 選自酪胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148之位置；及
ii. 選自天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基G305之位置。
再者，作為額外技術特徵，或作為替代技術特徵，本發明包括BoNT/A L鏈突變體，其在如本文所定義BoNT/A L鏈之囊袋內包含一或多個突變。舉例而言，裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)的本發明經修飾BoNT/A L鏈相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，其包含：
a) 位於用於結合hSNAP-23之D189/D192結合位的第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更；
b) 其中該第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈 (SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基Q29定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. 胺基酸殘基丙胺酸，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29之位置。
不希望受任何理論所束縛，申請人認為上述定義的BoNT/A L鏈結合囊袋在hSNAP-23上的D189/D192與BoNT/A的胺基酸29或附近的胺基酸之間提供穩定的鹽橋。
此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
具有取代Q29A之經修飾BoNT/A L鏈。
在一較佳具體實施例中，具有用於hSNAP-23上D189/D192結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈進一步包含在如本文所述之一或多種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內，如上述定義)。此類突變體通常顯示hSNAP-23裂解增加至少1.50倍%(相對於E148Y經修飾BoNT/A L鏈) - 參見圖1B中多囊袋突變體之第1資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
具有取代E148Y、Q29A之經修飾BoNT/A L鏈。
因此，在另一具體實施例中，提供一種裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，且其相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148定義；及
b) 位於第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的D189/D192結合位；其中該第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29定義；
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包括：
i. 選自酪胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148之位置；及
ii. 選自丙胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29之位置。
在另一具體實施例中，具有用於hSNAP-23上D189/D192結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT L鏈進一步包含在如本文所述之至少兩種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變((例如在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內，且在用於hSNAP-23上R186結合位之結合囊袋內，二者如上述定義)。此類突變體通常顯示hSNAP-23裂解增加至少2.5倍(相對於E148Y經修飾BoNT/A L鏈) - 參見圖1B中第1資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y、Q29A及S143D之經修飾BoNT/A L鏈。
因此，在另一具體實施例中，提供一種裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，且其相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148定義；及
b) 位於第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的D189/D192結合位；其中該第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29定義；
c) 位於第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的R186結合位；其中該第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S143定義；
d) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包括：
i. 選自酪胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148之位置；及
ii. 選自丙胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29之位置；及
iii. 選自天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S143之位置。
在另一具體實施例中，具有用於hSNAP-23上D189/D192結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT L鏈進一步包含在如本文所述之至少二種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如在用於hSNAP-23上P182 /D178結合位的結合囊袋內，及在用於hSNAP-23上K185 結合位的結合囊袋內，如上述定義)。此類突變體通常顯示hSNAP-23裂解增加至少3.0倍，較佳為至少3.4倍(相對於E148Y經修飾BoNT/A L鏈)-參見圖1B中多囊袋突變體之第1資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y、Q29A及G305D之經修飾BoNT/A L鏈。
因此，在另一具體實施例中，提供一種裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，且其相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148定義；及
b) 位於第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的D189/D192結合位；其中該第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29定義；及
c) 位於第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的K185結合位；其中該第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基G305定義；
d) 且其中該胺基酸殘基變更包括：
i. 選自酪胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148之位置；及
ii. 選自丙胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29之位置；及
iii. 選自天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基G305之位置。
作為額外技術特徵，或作為替代技術特徵，本發明包括BoNT/A L鏈突變體，其在如本文所定義BoNT/A L鏈之囊袋內包含一或多個突變。舉例而言，裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)的本發明經修飾BoNT/A L鏈相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，其包含：
a) 位於用於結合hSNAP-23之K206結合位的第六BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更；
b) 其中該第六BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基Y251、L256、V258、L367及F369定義；
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包含：
i. 選自麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y251之位置；及/或
ii. 選自麩胺酸、天門冬胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸及精胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基L256之位置；及/或
iii. 選自絲胺酸、丙胺酸、脯胺酸、白胺酸及麩胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基V258之位置；及/或
iv. 選自丙胺酸及甘胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基L367之位置；及/或
v. 選自甘胺酸、絲胺酸及白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基F369之位置。
作為額外技術特徵，或作為替代技術特徵，本發明包括BoNT/A L鏈突變體，其在如本文所定義BoNT/A L鏈之囊袋內包含一或多個突變。舉例而言，裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)的本發明經修飾BoNT/A L鏈相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，其包含：
a) 位於用於結合hSNAP-23之K206結合位的第六BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更；
b) 其中該第六BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基Y251、L256、V258、L367及F369定義；
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包含：
i. 選自麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y251之位置；及/或
ii. 選自麩醯胺酸及精胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基L256之位置；及/或
iii. 選自絲胺酸、白胺酸及麩胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基V258之位置；及/或
iv. 選自丙胺酸及甘胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基L367之位置；及/或
v. 選自甘胺酸、絲胺酸及白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基F369之位置。
不希望受任何理論所束縛，申請人認為上述定義的BoNT/A L鏈結合囊袋與用於hSNAP-23的識別序列的(S3')位置產生重要的酶-基質組合。
作為額外技術特徵，或作為替代技術特徵，本發明包括BoNT/A L鏈突變體，其在如本文所定義BoNT/A L鏈之囊袋內包含一或多個突變。舉例而言，裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)的本發明經修飾BoNT/A L鏈相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，其包含：
a) 位於用於結合hSNAP-23之K206結合位的第六BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更；
b) 其中該第六BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基Y251、L256、V258、L367及F369定義；
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包含：
i. 選自麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y251之位置；及/或
ii. 選自麩醯胺酸及精胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基L256之位置；及/或
iii. 選自絲胺酸、白胺酸及麩胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基V258之位置；及/或
iv. 選自丙胺酸及甘胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基L367之位置；及/或
v. 選自甘胺酸、絲胺酸及白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基F369之位置。
具有用於hSNAP-23上K206結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可包含在相對於野生型BoNT/A L鏈的一或多個胺基酸殘基變更，如本文上述定義。舉例而言，本發明經修飾BoNT/A L鏈可具有單一胺基酸殘基突變(在用於hSNAP-23上K206結合位之結合囊袋內)，例如對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基Y251的突變體。同樣地，本發明經修飾BoNT/A L鏈可包含一或多個突變(在用於hSNAP-23上K206結合位之結合囊袋內)，例如對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基Y251及L256。
包含用於hSNAP-23上K206結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈通常顯示大於1.5%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1A中之第2資料欄。供參考，野生型BoNT/A L鏈(例如SEQ ID NO：1)顯示小於0.5%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1A中之第2資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代Y251D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代Y251E之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代L256D之經修飾BoNT/A L鏈。
在一具體實施例中，本發明經修飾BoNT/A L鏈顯示至少3%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37℃溫育約1小時) - 參見圖1A中之第2資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代Y251E之經修飾BoNT/A L鏈。
具有用於hSNAP-23上K206結合位之結合囊袋突變的經修飾BoNT/A L鏈突變體(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之額外實例包括：
包含取代V245D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代L256E之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代L256G之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代L256Q之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代L256A之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代V258A之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代V258P之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代V258L之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代L256E及V258P之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代L256Q及V258P之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代L256A及V258L之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代L256G及V258L之經修飾BoNT/A L鏈。
在一較佳具體實施例中，具有用於hSNAP-23上K206結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可進一步包含在如本文所述之一或多種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內，如上述定義)。此類突變體通常顯示hSNAP-23裂解減少至少0.5倍(相對於E148Y經修飾BoNT/A L鏈)或，換句話說，hSNAP-23裂解增加至少4.0倍(相對於野生型BoNT/A L鏈) - 參見圖1B中多囊袋突變體之第1資料欄；或至少5% hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1B中之第2資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之較佳實例包括：
包含取代E148Y及Y251D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y及L256D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y及Y251E之經修飾BoNT/A L鏈。
因此，在另一具體實施例中，提供一種裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，且其相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148定義；及
b) 位於第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的K206結合位；其中該第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y251定義；及
c) 且其中該胺基酸殘基變更包括：
i. 選自酪胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148之位置；及
ii. 選自天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y251之位置。
在另一具體實施例中，具有用於hSNAP-23上K206結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT L鏈進一步包含在如本文所述之至少三種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內、在用於hSNAP-23上R186結合位之結合囊袋內，及在用於hSNAP-23上D189/D192結合位之結合囊袋內，如上述定義)。此類突變體通常顯示hSNAP-23裂解增加至少1.3倍(相對於E148Y經修飾BoNT/A L鏈) - 參見圖1B中多囊袋突變體之第1資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y、S143D、Q29A及Y251E之經修飾BoNT/A L鏈。
因此，在另一具體實施例中，提供一種裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，且其相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148定義；及
b) 位於第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的R186結合位；其中該第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S143定義；及
c) 位於第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的D189/D192結合位；其中該第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29A定義；及
d) 位於第六BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的K206結合位；其中該第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y251定義；
e) 且其中該胺基酸殘基變更包括：
i. 選自酪胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148之位置；及
ii. 選自天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S143之位置；及
iii. 選自丙胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29之位置；及
iv. 選自麩胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y251之位置。
作為額外技術特徵，或作為替代技術特徵，本發明包括BoNT/A L鏈突變體，其在如本文所定義BoNT/A L鏈之囊袋內包含一或多個突變。舉例而言，裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)的本發明經修飾BoNT/A L鏈相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，其包含：
a) 位於用於結合hSNAP-23之I198結合位的第三BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更；
b) 其中該第三BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈 (SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基K166定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. 選自纈胺酸、苯丙胺酸、白胺酸及異白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K166之位置。
不希望受任何理論所束縛，申請人認為上述定義的BoNT/A L鏈結合囊袋在hSNAP-23上的I198與BoNT/A的胺基酸166之間提供穩定的疏水性交互作用。
包含用於hSNAP-23上I198結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈通常顯示大於9%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1A中之第2資料欄。供參考，野生型BoNT/A L鏈(例如SEQ ID NO：1)顯示小於0.5%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1A中之第2資料欄。此類經修飾L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代K166V之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代K166F之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代K166L之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代K166I之經修飾BoNT/A L鏈。
在一具體實施例中，包含用於hSNAP-23上I198結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈通常顯示大於40%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1A中之第2資料欄。此類經修飾L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代K166F之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代K166L之經修飾BoNT/A L鏈。
在其他具體實施例中，包含用於hSNAP-23上I198結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈通常顯示大於60%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1A中之第2資料欄。此類經修飾L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代K166F之經修飾BoNT/A L鏈。
在一較佳具體實施例中，具有用於hSNAP-23上I198結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可進一步包含在如本文所述之一或多種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如，在至少二種不同BoNT/A L鏈結合囊袋，例如用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內，及用於hSNAP-23上K185或R186 結合位之結合囊袋內)。此類突變體通常顯示至少40%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1B中第2資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y、K166F及G305D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、K166V及G305D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、S143D及K166F之經修飾BoNT/A L鏈。
因此，在另一具體實施例中，提供一種裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，且其相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148定義；及
b) 位於第三BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的I198結合位；其中該第三BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K166定義；及
c) 位於第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的K185結合位；其中該第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基G305定義；
d) 且其中該胺基酸殘基變更包括：
i. 選自酪胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148之位置；及
ii. 選自纈胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K166之位置；及
iii. 選自天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基G305之位置。
在另一具體實施例中，具有用於hSNAP-23上I198結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可進一步包含在至少二種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如，用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內，及用於hSNAP-23上K185或R186 結合位之結合囊袋內)。此類突變體通常顯示至少15%之hSNAP-23裂解(在10奈莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1B中第2資料欄**。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y、K166F及G305D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、S143D及K166F之經修飾BoNT/A L鏈。
在一具體實施例中，具有用於hSNAP-23上I198結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可進一步包含在至少三種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內、在用於hSNAP-23上D189/D192結合位之結合囊袋內、及在用於hSNAP-23上K185結合位之結合囊袋內，如上述定義)。此類突變體通常顯示至少60%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1B中第2資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代 E148Y、Q29A、K166V及G305D之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代 E148Y、Q29A、K166F及G305D之經修飾BoNT/A L鏈。
因此，在另一具體實施例中，提供一種裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，且其相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148定義；及
b) 位於第三BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的I198結合位；其中該第三BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K166定義；及
c) 位於第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的D189/D192結合位；其中該第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29A定義；及
d) 位於第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的K185結合位；其中該第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基G305定義；及
e) 且其中該胺基酸殘基變更包括：
i. 選自酪胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148之位置；及
ii. 選自纈胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K166之位置；及
iii. 選自丙胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29之位置；及
iv. 選自天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基G305之位置。
在另一具體實施例中，具有用於hSNAP-23上I198結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可進一步包含在至少三種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內、在用於hSNAP-23上D189/D192結合位之結合囊袋內、及在用於hSNAP-23上K185結合位之結合囊袋內)。此類突變體通常顯示至少10%之hSNAP-23裂解(在10奈莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1B中第2資料欄**。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y、Q29A、K166F及G305D之經修飾BoNT/A L鏈。
具有用於hSNAP-23上I198結合位之結合囊袋突變的經修飾BoNT/A L鏈突變體(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之額外實例包括：
包含取代E148Y、Q29A、K166F、Y251E及G305D之經修飾BoNT/A L鏈。
在一具體實施例中，具有用於hSNAP-23上I198結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可進一步包含在一或多種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內、或在用於hSNAP-23上K185結合位之結合囊袋內)。此類突變體通常顯示至少3%之hSNAP-23裂解(在10奈莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1B中第2資料欄**。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y及K166F之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代G305D及K166F之經修飾BoNT/A L鏈。
在另一具體實施例中，具有用於hSNAP-23上I198結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可進一步包含在一或多種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如在用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋內、或在用於hSNAP-23上K185結合位之結合囊袋內)。此類突變體通常顯示至少5%之hSNAP-23裂解(在10奈莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1B中第2資料欄**。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y及K166F之經修飾BoNT/A L鏈。
作為額外技術特徵，或作為替代技術特徵，本發明包括BoNT/A L鏈突變體，其在如本文所定義BoNT/A L鏈之囊袋內包含一或多個突變。舉例而言，裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)的本發明經修飾BoNT/A L鏈相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，其包含：
a) 位於第七BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23之D210結合位；
b) 其中該第七BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈 (SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基S254定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. (例如)胺基酸殘基丙胺酸，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S254之位置。
不希望受任何理論所束縛，申請人認為上述定義的BoNT/A L鏈結合囊袋可以與hSNAP-23之D210結合位呈現出氫鍵。然而，申請人認為該結合囊袋的修飾(如本文所定義)排除了建議在hSNAP-23上的D210與BoNT/A的胺基254之間形成的氫鍵。反之，此被認為是以更佳的「離去基」的形式產生C端hSNAP-23裂解產物，從而增強hSNAP-23的裂解速率。
此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代S254A之經修飾BoNT/A L鏈。
在一具體實施例中，具有用於hSNAP-23上D210結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可進一步包含在如本文所述之一或多種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如，在至少二種或三種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內，例如用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋，及用於hSNAP-23上I198 結合位之結合囊袋，及可選擇地用於hSNAP-23上K185結合位之結合囊袋)。此類突變體通常顯示至少10%之hSNAP-23裂解(在10奈莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1B中第2資料欄**。此類經修飾BoNT/A L鏈之實例包括：
包含取代E148Y、K166F及S254A之經修飾BoNT/A L鏈；
包含取代E148Y、K166F、S254A及G305D之經修飾BoNT/A L鏈。
在一較佳具體實施例中，具有用於hSNAP-23上D210結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可進一步包含在如本文所述之一或多種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變(例如，在至少三種不同BoNT/A L鏈結合囊袋內，例如用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋、用於hSNAP-23上I198 結合位之結合囊袋、及可選擇地用於hSNAP-23上K185結合位之結合囊袋)。此類突變體通常顯示至少25%之hSNAP-23裂解(在10奈莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1B中第2資料欄**。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y、K166F、S254A及G305D之經修飾BoNT/A L鏈。
作為額外技術特徵，或作為替代技術特徵，本發明包括BoNT/A L鏈突變體，其在如本文所定義BoNT/A L鏈之囊袋內包含一或多個突變。舉例而言，裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)的本發明經修飾BoNT/A L鏈相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，其包含：
a) 位於第八BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23之D168結合位；
b) 其中該第八BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈 (SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基K340定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. (例如)胺基酸殘基組胺酸，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K340之位置。
不希望受任何理論所束縛，申請人認為上述定義的BoNT/A L鏈結合囊袋在hSNAP-23上的D168與BoNT/A的胺基酸340之間提供鹽橋。
此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代K340H之經修飾BoNT/A L鏈。
在一具體實施例中，具有用於hSNAP-23上P182/D178結合位之結合囊袋突變的本發明經修飾BoNT/A L鏈可進一步包含在用於hSNAP-23上D168結合位之BoNT/A L鏈結合囊袋內的一或多個突變。此類突變體通常顯示至少3%之hSNAP-23裂解(在1微莫耳經修飾BoNT/A L鏈之%；20微莫耳hSNAP-23；較佳在約37
oC溫育約1小時) - 參見圖1B中第2資料欄。此類經修飾BoNT/A L鏈(藉由相對於對應野生型BoNT/A L鏈SEQ ID NO：1之胺基酸取代指出)之實例包括：
包含取代E148Y及K340H之經修飾BoNT/A L鏈。
如上述之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶可包含與野生型BoNT/A L鏈 (SEQ ID NO：1)相較具有至少70%之胺基酸序列序列同一性，例如至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少98%、或至少99%。該經修飾BoNT/A L鏈胺基酸序列與野生型BoNT/A L鏈 (例如SEQ ID NO：1)相較具有少於100%序列同一性。如前所述，通過參考本說明書，經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶包括其功能片段，即該裂解hSNAP-23的蛋白酶片段。例如，本發明的經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶包含至少300個(例如，至少350個、或至少400個或至少410個)胺基酸。舉例而言，肉毒桿菌神經毒素L鏈蛋白酶的N端八個胺基酸及/或羧基末端(例如，最後32個胺基酸)並不是蛋白水解活性所必需的。
本發明的經修飾BoNT/A L鏈可被聚乙二醇化(PEGylated)以增加穩定性，例如蛋白酶成分的作用持續，聚乙二醇化較佳包括添加PEG至L鏈的N端。舉例而言，L鏈的N端可以一或多個胺基酸(例如半胱胺酸)殘基延伸，該一或多個胺基酸殘基可具有連接其自身的PEG分子(例如以共價連接)。在WO2007/104567中描述此技術的實例，該專利的全部內容藉由引用併於本文。
本發明經修飾BoNT/A L鏈可包括增加(或移除)「第二修飾位」–參見WO2002/040506、US7223577及WO2005/068494，各該全部內容藉由引用併於本文。此類位置的額外存在或缺失(對於野生型BoNT L鏈)改變本發明經修飾的L鏈的生物持久性(例如生物半生期)。
本發明第二態樣係提供一種核酸構築體，其包含或由編碼如本文所述之經修飾BoNT/A L鏈的核酸序列所組成。該核酸序列可較佳編碼TSI遞送載體，如下文所進一步描述。本發明的核酸構築體可包括習知調節元件，例如起動子及/或終止子。
在一具體實施例中，核酸構築體以細菌質體或病毒載體的形式提供，該核酸構築體可選擇地為密碼子偏置的(codon-biased)，用以優化所需宿主細胞(例如大腸桿菌)中的表現(例如重組表現)。
在一具體實施例中，編碼如本文所述之經修飾BoNT/A L鏈的核酸構築體可用於對關注的靶細胞進行給藥，例如用於治療或美容目的。為此，該核酸構築體通常可藉由習知方法學進行優化，以便遞送至靶細胞中(然後在其中表現)，較佳為人類細胞，靶細胞較佳為非神經元性細胞。
本發明第三態樣係提供一種用於經修飾BoNT/A L鏈之遞送載體，從而促進經修飾BoNT/A L鏈進入關注的靶細胞中。根據此態樣，本發明更具體地關於一種遞送載體，包括：
a) 依據本發明之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，或包含或由編碼依據本發明之經修飾BoNT/A L鏈之核酸序列所組成的核酸構築體；及
b) 將該經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶或該核酸構築體遞送至靶細胞的手段。
用於此類遞送的較佳手段包括本領域已知的任何習知遞送載體技術，例如脂質體、基因槍微粒(biolistic particle)、細胞穿透胜肽、基因轉移載體等。
一種特佳高度適用於本發明的遞送技術是申請人的專有的靶向分泌抑製劑(Targeted Secretion Inhibitor，TSI)技術。用於生成TSI的基礎方法已有詳細記載，現已被認為是習知技術(參見例如，WO98/07864、WO2006/059113、WO2009/150469、WO2010/020811、WO2009/150470、WO2010/094905、WO2012/156743，各該全部內容藉由引用併於本文)。TSI技術仰賴一種遞送機制，其模仿梭菌神經毒素在使宿主細胞中毒時採用的相同基礎步驟 (即結合靶細胞，胞內體形成，L鏈易位至細胞液中，藉由L鏈蛋白水解切割SNARE蛋白)。TSI遞送載體係基於一個簡單的梭菌神經毒素骨架，其具有三個主要組成部分：
1) 梭菌神經毒素L鏈；
2) 靶向部分(TM)，引導遞送載體至選擇的靶細胞。通常，天然梭菌神經毒素結合結構域(H
CC)可用配體代替，以提供遞送載體選擇性結合至該H
CC的天然靶細胞以外的所需靶細胞。在一較佳具體實施例中，可以使用多於一個TM(可選擇地包括梭菌神經毒素結合域)；
3) 易位肽(translocation peptide) (例如梭菌神經毒素H
N易位域)以確保將梭菌神經毒素L鏈遞送至靶細胞中，然後可發揮其蛋白水解作用(即SNARE蛋白裂解)。
因此，在一較佳具體實施例中，本發明之遞送載體的裝置b)可包括：
- i)靶向部分(TM)，其結合遞送載體至靶細胞。該靶向部分可為天然的梭菌神經毒素結合域(H
CC)，或更佳為，提供結合至該H
CC的天然靶細胞以外的靶細胞之配體；及
- ii)易位肽，其將本發明之經修飾BoNT/A L鏈蛋白易位至靶細胞中，較佳為進入該細胞之細胞液中。
本發明之遞送載體通常包括一或多個靶向部分(TM)。參照TM所包含與位點(Site)(例如受體或接受體)功能性相互作用的任何結構(通常為肽)，以引起本發明經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶與哺乳動物靶細胞表面(例如人類細胞)之間的物理結合。該位點較佳為能夠內化者(例如，形成胞內體)-亦稱為受體介導的內胞飲作用。TM可具有胞內體膜轉運功能，在此情況下，不需要使用分離的TM和易位結構域成分。
本發明之TM結合(例如特異性結合)至所選擇之靶細胞。術語「特異性結合」較佳意指所給定的TM以10
6M
-1或以上之結合親和力(Ka)結合至靶細胞，例如10
7M
-1或以上、10
8M
-1或以上或10
9M
-1或以上。
通常會確認TM與選擇的靶細胞結合，例如，可以採用簡單的放射性置換實驗，其中代表關注的靶細胞之組織或細胞在過量未標示的TM存在下暴露至標示的(例如氚化)TM，在這樣的實驗中，可評估非特異性和特異性結合的相對比例，從而可證實TM結合至靶細胞。可選擇地，該分析可包括一或多種結合拮抗劑，且該分析還可包括觀察TM結合的喪失。可以在Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp. 303-311、In Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Press中找到此類實驗的例示。
本發明之TM較佳結合至非神經元性靶細胞(例如肥大細胞和/或上皮細胞–參見，例如WO00/10598及WO01/21213，各該全部內容藉由引用併於本文)。如此進行時，該TM能夠將遞送載體引導至所選擇的非神經元性靶細胞，其表現非所欲的hSNAP-23表型(且可選擇地為非所欲的SNAP-25表型)。同時，本發明之TM可分別地結合(例如藉由相同的TM或藉由第二TM)至所選擇的第二靶細胞，例如結合至第二非神經元性靶細胞或結合至表現非所欲的hSNAP-23及/或SNAP-25表型之神經元靶細胞。
適當的TM包括：對於哺乳動物細胞結合位受體之配體，例如細胞介素、生長因子、神經肽、凝集素和抗體–該術語包括單株抗體、單鏈抗體和抗體片段，例如Fab、F(ab)'
2、Fv、ScFv等。
作為進一步的例子，TM包括瘦素(leptin)肽、腦腸肽(ghrelin)受體、體抑素肽、胰島素生長因子肽、ErbB肽(例如EGF)、VIP-昇糖素-GRF-胰泌素肽(例如PACAP肽)、介白素肽(例如Il-1、IL-2、IL-6或IL-10肽)、NGF肽、VEGF肽、鈴蟾素(bombesin)肽、尾體素(urotensin)肽、黑色素集中激素肽、泌乳素釋放激素肽、KiSS-1肽、CRF肽、GHRH肽、物質P肽、β-2腎上腺受體肽、胃泌素釋放肽、抑鈣素基因相關肽、血小板衍生生長因子肽、角質細胞生長因子肽、肝細胞生長因子肽、TGF-α肽、TGF-β肽、心房利鈉肽及整聯蛋白肽。
本發明之遞遞載體通常缺乏(功能)梭菌神經毒素結合域(作為TM)。
或者，本發明之遞送載體可包括(功能性)梭菌神經毒素結合域(作為TM)。參照梭菌神經毒素結合域包括梭菌神經毒素的H
C(更明確而言，H
CC)部分，以及保留H
C結構域之結合能力的突變體(例如在習知結合分析中結合大鼠突觸體膜，例如敘述於Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82)。
天然梭菌神經毒素的H
C結合域/肽包含約400-440個胺基殘基，且由兩個功能不同各為約25kDa的域所組成，即N端區域(通常稱為H
CN肽或域)及C端區域(通常稱為H
CC肽或域)。C端區域(H
CC)，其構成C端160-200個胺基酸殘基，負責結合梭菌神經毒素(至神經肌肉交接處的神經末梢)。H
CC肽之實例包括：
肉毒桿菌A型神經毒素-胺基酸殘基(Y1111-L1296)
肉毒桿菌B型神經毒素-胺基酸殘基(Y1098-E1291)
肉毒桿菌C型神經毒素-胺基酸殘基(Y1112-E1291)
肉毒桿菌D型神經毒素-胺基酸殘基(Y1099-E1276)
肉毒桿菌E型神經毒素-胺基酸殘基(Y1086-K1252)
肉毒桿菌F型神經毒素-胺基酸殘基(Y1106-E1274)
肉毒桿菌G型神經毒素-胺基酸殘基(Y1106-E1297)
破傷風神經毒素-胺基酸殘基(Y1128-D1315)。
上述參考序列應被視為指南，因為根據次血清型可能發些微變化。
本發明之遞送載體通常包括易位肽，其能夠使經修飾的L鏈易位至目標的細胞液中，肽是否具有本發明所必需的易位功能可藉由許多習知分析中的任何一種來確認。例如，Shone C. (1987)敘述一種使用微脂體的活體外分析，該微脂體受到測試分子的攻擊。藉由從K
+及/或經標示NAD的微脂體釋放來確認必要之易位功能的存在，其可容易地監測[參見Shone C. (1987) Eur. J. Biochem；vol. 167(1)：pp. 175-180]。Blaustein R. (1987)提供進一步實例，其敘述一種使用平面磷脂雙層膜之簡單活體外分析，用測試分子攻擊該膜，並藉由穿過所述膜的電導增加來證實所需的易位功能[參見Blaustein (1987) FEBS Letts；vol. 226, no. 1：pp. 115-120]。能夠評估膜融合並因此鑑定適用於本發明的易位域的其他方法被提供於Methods in Enzymology Vol. 220及221, Membrane Fusion Techniques, Parts A及B, Academic Press 1993。
易位域可為梭菌來源，例如神經毒素的H
N域/部分。參考「H
N域」意指大約相當於H鏈的胺基端一半的梭菌神經毒素的H鏈片段。梭菌神經毒素的H
N域缺乏H鏈之H
C成分的天然結合功能，因此，H
N域不能與在靶細胞上與天然梭菌神經毒素(即全毒素)結合的結合位結合。
適當的(參考)易位域之實例包括：
肉毒桿菌A型神經毒素-胺基酸殘基(449-871)
肉毒桿菌B型神經毒素-胺基酸殘基(441-858)
肉毒桿菌C型神經毒素-胺基酸殘基(442-866)
肉毒桿菌D型神經毒素-胺基酸殘基(446-862)
肉毒桿菌E型神經毒素-胺基酸殘基(423-845)
肉毒桿菌F型神經毒素-胺基酸殘基(440-864)
肉毒桿菌G型神經毒素-胺基酸殘基(442-863)
破傷風神經毒素-胺基酸殘基(458-879)。
研究顯示，來自梭菌神經毒素重鏈的H
N部分的全長對於易位活性並不是必需的。因此，此具體實施例的態樣可包括梭菌毒素H
N區域，其包含具有例如至少350個胺基酸、至少375個胺基酸、至少400個胺基酸及至少425個胺基酸長度的易位域。關於肉毒芽胞梭菌(
Clostridium botulinum)及破傷風桿菌(
C. tetani)中毒素生產的遺傳基礎之進一步細節，我們參考Henderson
et al(1997) in
The Clostridia ： Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press。
術語H
N包括天然存在的神經毒素H
N部分，以及具有在自然界中不存在之胺基酸序列的變體H
N部分，但只要該變體H
N部分仍然證明上述易位功能即可。例如，梭菌神經毒素H
N部分包含變體胺基酸序列，其與野生型梭菌神經毒素H
N部分相比具有至少70%(例如，至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少98%、或至少99%)之序列同一性之，然而附帶條件是保留易位功能。
或者，該易位肽可能屬於非梭菌來源，例如，白喉毒素的易位域[O. Keefe
et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206；Silverman
et al.,J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532；及London, E. (1992)
Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51]、假單胞菌(
Pseudomonas)外毒素A型的易位域[Prior
et al.Biochemistry (1992) 31, 3555-3559]、炭疽毒素的易位域[Blanke
et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442]、易位功能的多種基因融合或疏水性肽[Plank
et al.J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924；及Wagner
et al(1992)
PNAS, 89, pp.7934-7938]及兩親性肽[Murata
et al(1992)
Biochem., 31, pp.1986-1992]。
參考的非梭菌神經毒素易位肽包括片段和變體胺基酸序列，其相較於對應非梭菌野生型易位肽序列具有至少70% (例如，至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少98%或至少99%)之序列同一性，然而條件是該變體具有必要條件。
| 易位域來源 | 胺基酸殘基 | 參考 |
| 白喉毒素 | 194-380 | Silverman et al ., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22524-22532 London E., 1992, Biochem. Biophys. Acta., 1113, 25-51 |
| 假單胞菌外毒素之域II | 405-613 | Prior et al ., 1992, Biochemistry 31, 3555-3559 Kihara & Pastan, 1994, Bioconj Chem. 5, 532-538 |
| 流感病毒血球凝集素 | GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG, 及其變體 | Plank et al ., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924 Wagner et al ., 1992, PNAS, 89, 7934-7938 Murata et al ., 1992, Biochemistry 31, 1986-1992 |
| 塞姆利基森林病毒 (Semliki Forest virus)基因融合蛋白 | 易位域 | Kielian et al ., 1996, J Cell Biol. 134(4), 863-872 |
| 水泡性口炎病毒糖蛋白G | 118-139 | Yao et al ., 2003, Virology 310(2), 319-332 |
| SER病毒F蛋白 | 易位域 | Seth et al ., 2003, J Virol 77(11) 6520-6527 |
| 泡沫病毒(foamy virus)封套糖蛋白 | 易位域 | Picard-Maureau et al ., 2003, J Virol. 77(8), 4722-4730 |
本發明的多肽可進一步包含易位促進域(translocation facilitating domain)。該域有助於將非細胞毒性蛋白酶遞送到靶細胞之細胞液中，且其描述於例如WO 08/008803及WO 08/008805，各該全部內容藉由引用併於本文。
舉例而言，適當的易位促進域包括有封套的病毒基因融合肽域(enveloped virus fusogenic peptide domain)，例如，適當的基因融合肽域包括流感病毒基因融合肽域(例如，23個胺基酸之A型流感病毒基因融合肽域)、α病毒基因融合肽域(例如26個胺基酸之塞姆利基森林病毒基因融合肽域)、水泡病毒基因融合肽域(例如21個胺基酸之水泡性口炎病毒基因融合肽域)、呼吸道病毒基因融合肽域(例如25個胺基酸之仙台病毒(Sendai virus)基因融合肽域)、麻疹病毒基因融合肽域(例如25個胺基酸之犬瘟熱病毒基因融合肽域)、禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)基因融合肽域(例如25個胺基酸之新城病病毒(Newcastle disease virus)基因融合肽域)、亨尼巴病毒(henipavirus)基因融合肽域(例如25個胺基酸之亨德拉病毒(Hendra virus)基因融合肽域)、間質肺炎病毒(metapneumovirus)基因融合肽域(例如25個胺基酸之人類間質肺炎病毒融合肽域)或泡沫反轉錄病毒(spumavirus)基因融合肽域，例如猴泡沫病毒(simian foamy virus)基因融合肽域；或其片段或變異體。
作為進一步的實例，易位促進域可包含梭菌神經毒素H
CN域或片段或變異體(與對應之野生型序列具有至少70%序列同一性)，然而附帶條件是保留增強的易位功能。更詳細地，梭菌毒素H
CN易位促進域可具有至少200個胺基酸、至少225個胺基酸、至少250個胺基酸、至少275個胺基酸之長度。在這方面，梭菌毒素H
CN易位促進域較佳具有最多200個胺基酸、最多225個胺基酸、最多250個胺基酸或最多275個胺基酸之長度。特定(參考)實例包括：
肉毒桿菌A型神經毒素-胺基酸殘基(872-1110)
肉毒桿菌B型神經毒素-胺基酸殘基(859-1097)
肉毒桿菌C型神經毒素-胺基酸殘基(867-1111)
肉毒桿菌D型神經毒素-胺基酸殘基(863-1098)
肉毒桿菌E型神經毒素-胺基酸殘基(846-1085)
肉毒桿菌F型神經毒素-胺基酸殘基(865-1105)
肉毒桿菌G型神經毒素-胺基酸殘基(864-1105)
破傷風神經毒素-胺基酸殘基(880-1127)。
本發明之第四態樣係提供一種裂解hSNAP-23的方法，該方法包含以如本文所述之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶、或以核酸構築體、或以遞送載體接觸hSNAP-23，從而允許經修飾BoNT/A L鏈結合該hSNAP-23，然後藉由經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶對hSNAP-23進行蛋白水解裂解。在一具體實施例中，該方法於活體外進行。
在一具體實施例中，該裂解hSNAP-23之方法包括預備步驟：
1) 遞送載體經由其靶向部分(TM)與靶細胞結合；及
2) 經修飾BoNT/A L鏈經由遞送載體的易位肽轉移到靶細胞內，較佳進入該靶細胞的細胞液中。
較佳地，TM結合至靶細胞上的位點(例如，結合至蛋白、糖及/或脂質分子)，該位點能夠為受體介導的內胞飲作用，且該遞送載體隨後藉由形成胞內體被內化於靶細胞內。此後，遞送載體之易位肽可以使經修飾BoNT/A L鏈跨越胞內膜而易位至靶細胞的細胞液中。
在另一態樣，本發明係關於一種用於如上述裂解hSNAP23之方法的經修飾的(BoNT/A) L鏈蛋白酶，或關於一種核酸構築體，或關於一種遞送載體，如本文所述。
在另一態樣，本發明包括一種用於治療方法的本文所述之經修飾的(BoNT/A)L鏈蛋白酶，較佳為治療分泌性病症之方法。
因此，一態樣為提供使用作為醫藥品的本文所述之BoNT/A L鏈蛋白酶，或本文所述之核酸構築體，或本文所述之遞送載體。
在此類態樣中，該經修飾的(BoNT/A) L鏈蛋白酶較佳包含於BoNT中，該BoNT另包含重鏈，即一全長之BoNT。此全長之BoNT通常具有包含100 kDa之重鏈及藉由雙硫鍵連接之50 kDa的輕鏈150 kDa的多肽鏈，並被組織成三個功能域：N端蛋白水解輕鏈(L鏈)；及C端重鏈(H鏈)，後者由易位域(H
N)和C端神經元結合域(H
C)組成。
較佳的分泌病症包括肌肉痙攣/過度活躍的肌肉運動(包括中風後後痙攣、脊髓損傷後痙攣、頭頸部、眼瞼、陰道、四肢、下頜和聲帶痙攣)、斜視、多汗症和嚴重的原發性腋窩多汗症。
依據以下詳細實施例將更好理解本發明。然而，本領域技術人員將理解，此詳細描述並非是限制性的，且在不脫離本發明的範圍的情況下可以進行各種修改、替換、省略和改變。
胺基酸序列SEQ ID NO：1 - 野生型BoNT/A輕鏈(Uniprot A5HZZ9之胺基酸殘基1-438)
SEQ ID NO：2 - 人類SNAP23
SEQ ID NO：3 - 人類及囓齒類SNAP25
SEQ ID NO：4 – IgA-蛋白酶位點His6Tag (人工)
SEQ ID NO：5 - Twin Strep Tag (人工)
SEQ ID NO：6 - His6 Tag (人工)
SEQ ID NO：7 – V-IgA-蛋白酶位點His6Tag (人工)
SEQ ID NO：8 - 野生型BoNT/A1
SEQ ID NO：9 - LH
N連接子(人工)
SEQ ID NO：10 - 腸激酶活化位點
SEQ ID NO：11 - BoNT/A1活化圈
實施例 實施例 1- 根據本發明之經修飾 BoNT/A L 鏈 (BoNT/A LC) 的製造
使用62A菌株之細菌DNA作為模板，以PCR及適當寡核苷酸引子，產生編碼質體之野生型BoNT/A L鏈(胺基酸1-448，SEQ ID NO：1) (pBN3)，將編碼胺基酸序列PPTPGHHHHHH (SEQ ID NO：4)之DNA插入在胺基酸Ala-449密碼子之後。將大腸桿菌(
E. coli)菌株M15pREP4 (Qiagen，Hilden，Germany)以含
wtBoNT/A LC之pBN3或其突變體轉染，即以本案所述之SEQ ID NO：1蛋白酶突變體轉染。對於各轉染之大腸桿菌菌株，將在5 ml 2YT培養基中隔夜生長的單一細菌菌落用於接種500 ml 2YT培養基。
在培養達OD600為0.7後，在21℃下使用0.2 mM IPTG誘導15小時期間產生BoNT/A L鏈，藉由離心收集細菌並在-20℃下冷凍隔夜。將細菌重新懸浮於補充有苯甲脒、pepstatin A (胃蛋白酶抑製劑)和PMSF的裂解緩衝液(300 mM NaCl，50mM磷酸鹽，pH 8.0)中，最終濃度分別為5 mM、1 μg/ ml和0.5 mM，以超聲波裂解，裂解物經29.000 g離心30分鐘而澄清，並將BoNT/A L鏈結合至Ni2+-硝基三乙酸-瓊脂糖珠。用20填充床體積(Bed Volume)的含10 mM咪唑之裂解緩衝液洗滌珠子，並以含100 mM咪唑之裂解緩衝液洗提BoNT/A L鏈，將含有所需蛋白的濾分用毒素分析緩衝液(150 mM麩胺酸鉀、10 mM Hepes-KOH，pH7.2)透析，並將純化的L鏈最終在液態氮中冷凍，並保持在-70℃。
實施例 2-hSNAP-23 無細胞裂解分析
產生用於大腸桿菌表現及活體外轉錄/轉譯之hSNAP-23 (SEQ ID NO：2)質體，pS3-hSNAP-23His6。
其編碼N端的稠合twin strep-tag (MASWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEKGAGS，SEQ ID NO：5)及羧基-末端絲胺酸-211密碼子的下游C端稠合His6-tag (GHHHHHH, SEQ ID NO：6)。
對於蛋白質的生產和純化，將pS3-hSNAP-23His6轉染至大腸桿菌菌株BL21-DE3 (Stratagene Europe，Ebsdorfergrund，Germany)中，並如實施例1中對BoNT/A L鏈蛋白酶所詳述施用相同的規程。然而，藉由以20填充床體積之0.1 M Tris pH 8.0洗滌並以含10 mM去硫生物素之0.1 M Tris pH 8.0洗提，將來自Ni2+-硝基三乙酸-瓊脂糖珠之經洗提的蛋白進一步於Strep-Tactin 瓊脂糖珠(IBA Lifesciences，Göttingen，Germany)上純化。此外，用於hSNAP-23純化的所有緩衝液均補充10 mM β-巰基乙醇。
根據製造商之說明，藉由使用pS3-hSNAP-23His6、T7偶合TNT網織紅細胞裂解物系統(T7 coupled TNT reticulocyte lysate system (Promega))及[35S]甲硫胺酸(370 KBq/μl，＞37 TBq/mmol；Hartmann Analytic，Braunschweig，Germany)，經活體外轉錄/轉譯，隨後產生放射性標示的hSNAP-23。
hSNAP-23無細胞裂解分析包含20微莫耳最終濃度之重組hSNAP-23加上1 μl [35S]甲硫胺酸-標示hSNAP-23之轉錄/轉譯混合物，且各經修飾的或野生型BoNT/A L鏈於最終濃度為1微莫耳或10奈莫耳，將其在37℃下於總體積為10 μl之毒素分析緩衝液中培養60分鐘。藉由添加等體積的雙倍濃縮樣品緩衝液[120 mM Tris–HCl (pH 6.75)、10% (v/v) β-巰基乙醇、4% (w/v) SDS、20% (w/v)甘油及0.014% (w/v)溴酚藍]來終止反應。在37℃溫育30分鐘後，藉由使用15%Tris-甘胺酸凝膠(丙烯醯胺/雙丙烯醯胺比例：73.5:1)之SDS-PAGE分析每個樣品。
將凝膠乾燥並使用FLA-9000磷光影像掃描分析儀(phosphorimager) (Fuji Photo Film, Co., Ltd., Tokyo, Japan)顯色放射性標示蛋白，以Multigauge 3.2軟體(Fuji Photo Film)進行放射性標示蛋白及其裂解產物的定量。為了測定野生型BoNT/A L鏈及其突變體的酶動力學參數，使用大腸桿菌中產生的hSNAP-23，將基質濃度在5和100 μM之間變化。藉由添加經活體外轉錄/翻譯所產生之1 μl放射性標示hSNAP-23賦予各種不同基質濃度，在最終體積為25μl的毒素分析緩衝液中進行培養。在37℃培養2和4分鐘後，取10 μl的等分樣品，並藉由與10 μl預冷的雙倍濃度SDS-PAGE樣品緩衝液混合來終止酶反應。如上所述，從放射性標示基質的轉換確定之裂解百分比，並用於計算基質水解的初始速度，使用GraphPad Prism 4.03程式(GraphPad Software Inc.，San Diego，USA)藉由非線性回歸計算Km、Kcat和Vmax值。
所產生之數據顯示於圖1。
實施例 3-hSNAP-25 無細胞裂解分析
用於大腸桿菌表現之hSNAP-25 (SEQ ID NO：3)質體(pBN10)已敘述於Binz et al.(J Biol Chem., 1994；269：1617-20)。羧基端甘胺酸-206的密碼子之後是編碼胺基酸序列VPPTPGHHHHHH(SEQ ID NO：7)的DNA。隨後藉由次選殖pBN10的EcoRI-SalI片段在pSP73(Promega，Mannheim，Germany)中相應切割，產生活體外轉錄/轉譯之質體pSNAP-25His6。
對於蛋白質生產和SNAP-25的純化，將pBN10轉染至大腸桿菌菌株M15pREP4 (Qiagen，Hilden，Germany)中，並依據實施例1對於BoNT/A L鏈蛋白酶的詳細描述施用相同規程(protocol)。
根據製造商之說明，藉由使用pSNAP-25His6、SP6偶合TNT網織紅細胞裂解物系統(Promega)及[35S]甲硫胺酸(370 KBq/μl，＞37 TBq/mmol；Hartmann Analytic，Braunschweig，Germany)之活體外轉錄/轉譯，產生放射性標示SNAP-25。
完全如實施例2中對hSNAP-23的描述進行hSNAP25裂解分析。
所產生之數據顯示於圖1。
實施例 4- 根據本發明之含經修飾輕鏈 A (BoNT/A LC) 之 LH
N 域的製造
此實施例敘述構築顯示含本發明hSNAP23裂解活性之經修飾的輕鏈A (BoNT/A LC)的易位LH
N域。此類LH
N域可用於創建TSI遞送載體家族，其藉由添加適當的靶向部分。
簡而言之，對於根據本發明BoNT/A LC的各突變體，藉由化學合成DNA(GeneArt, ThermoFisher)，首先構建BoNT/A LC選殖載體，其編碼該突變體BoNT/A LC且對於大腸桿菌中之表現加以優化，次選殖至pCR4載體中。同時，藉由化學合成密碼子優化DNA編碼H
N/A域(對應於SEQ ID NO：8之胺基酸殘基449至872，UniprotKB登錄號A5HZZ9)，同樣地構築選殖載體之BoNT/A H
N域，次選殖至標準載體中，例如pCR 4載體(Invitrogen)。藉由化學合成密碼子優化DNA編碼該倍次選殖至標準載體(pCR 4載體(Invitrogen))內的連結子，進一步構築LH
N連結子選殖載體。特別是，該LH
N連結子vrgiitsktksldkgynkalndl (SEQ ID NO：9)，其適於BoNT/A血清型(其為間-域多肽區域，存在於LC與BoNT A之H
N域間的二硫橋之半胱胺酸之間)，用於構築LH
N連結子載體。可產生替代的LH
N連結子構築體：實際上，如本領域熟悉技術者所熟知，為了產生特定的蛋白酶切割位點，可使用LysC蛋白酶對蛋白水解的天然感受性，或可將腸激酶活化位點(例如DDDDK，SEQ ID NO：10)插入活化圈，以產生例如VDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQ (SEQ ID NO：11)之序列，或可將用於本領域熟知的任何其他蛋白酶之蛋白酶(例如PreScision、因子Xa (Factor Xa)、凝血酶、TEV蛋白酶等)位點插入活化圈中。
隨後在兩個主要步驟中，藉由選殖編碼LH
N連結子之DNA上游的編碼各本發明經修飾BoNT/A LC的DNA進入經修飾的pET表現載體(Novagen)中來組裝LH
N域，該連結子位於編碼H
N/A域的DNA之更上游。
實施例 5- 結合本發明之非神經元性細胞的 TSI 遞送載體的製造
此實施例敘述藉由添加適當靶向部分(本文中，人類GHRP)至含本發明經修飾的輕鏈A(如上述實施例2)之LH
N域的各C端末端以構築TSI遞送載體。為此，在靶向部分和LH
N域之間導引撓性連結子。
簡而言之，藉由化學合成密碼子優化的DNA構建連結子-hGHRP選殖載體，該密碼子優化的DNA編碼在骨架內稠合至hGHRP靶向部分的撓性連結子，次選殖至pCR4載體(Invitrogen)中。
隨後藉由選殖編碼連結子-hGHRP的DNA進入各含實施例2所述LH
N域的pET表現載體中來組裝TSI構築體，以此種方式，連結子-hGHRP被稠合於各LH
N域的C端末端的骨架內。
對於各TSI載體的蛋白質表現，將含0.2%葡萄糖胺和30 μg/ml卡那黴素(kanamycin)之100 ml經修飾Terrific Broth (TB)培養基於250 ml燒瓶中與以TSI轉染之單一細菌菌落(大腸桿菌BL21 (DE3)培養，各培養物在37℃、225 rpm下生長16小時；然後將含有0.2%葡萄糖胺和30 μg/ml卡那黴素的1 L經修飾TB於2L燒瓶中與10 ml隔夜培養物培養。然後將所產生之培養物在37℃下生長直至達到OD600nm約為0.5，此時溫度降至16℃。1小時後，以1 mM IPTG誘導各培養物，並在16℃下進一步生長另16小時，藉由離心收集細菌並在-20℃下冷凍隔夜。
各種表現的TSI的後續純化如下進行。
將細菌解凍並對細胞沉澱物進行超音波處理以裂解細胞。離心後，將上清液裝填至充填0.1 M NiSO4的螯合管柱上，該管柱以50 mM HEPES pH 7.2 200 mM NaCl平衡。用含40至100 mM咪唑(步驟梯度)之緩衝液進行洗滌管柱以洗提未結合的蛋白質，並以含200 mM咪唑之緩衝液洗滌以洗提TSI蛋白。隨後將含所欲蛋白(TSI)的濾分對含有50 mM HEPES pH 7.2 200 mM NaCl的緩衝液進行透析，然後將蛋白酶以適當量添加(此處為LysC)至1 mg純化的TSI中使其活化(亦即，使TSI形成二鏈，能夠結合GHRP，將輕鏈易位到細胞質中，並催化裂解hSNAP23)。然後藉由將所產生之混合物裝填至充填0.1 M NiSO4的螯合管柱上進一步純化，該管柱以50 mM HEPES pH 7.2 200 mM NaCl平衡。該管柱以50 mM HEPES pH 7.2 200 mM NaCl洗滌第一次，然後以含40至100 mM咪唑之緩衝液洗滌以洗提未特異性結合的蛋白質，及以含200 mM咪唑之緩衝液洗滌以洗提活化的TSI。隨後將含有欲活化的蛋白(TSI)的濾分對含有50 mM HEPES pH 7.2 150 mM NaCl的緩衝液進行透析，然後將經透析之蛋白濃縮至約2 mg/ml，等分樣品並最終在-80℃冷凍。
條款
1.一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A (BoNT/A) L鏈蛋白酶，其裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)，且相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的P182/D178結合位；
b) 其中該第一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148、T307、A308及Y312定義；
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包含：
i. 選自天冬醯胺及酪胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基E148之位置；及/或
ii. 選自苯丙胺酸、異白胺酸及白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基T307之位置；及/或
iii. 選自脯胺酸、天冬醯胺、蘇胺酸及異白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基A308之位置；及/或
iv. 選自離胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸及白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y312之位置。
2.如條款1之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，其進一步包含：
a) 位於第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的R186結合位；
b) 其中該第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S143定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. 選自麩醯胺酸、麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S143之位置。
3.如條款1或2之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，其進一步包含：
a) 位於第三BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的K185結合位；
b) 其中該第三BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基V304及G305定義；
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包含：
i. 選自麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基V304之位置；及/或
ii. 選自麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基G305之位置。
4.如前述任一項條款之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，其進一步包含：
a) 位於第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的D189/D192結合位；
b) 其中該第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. 選自丙胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29之位置。
5.如前述任一項條款之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，其進一步包含：
a) 位於第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的K206結合位；
b) 其中該第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y251、L256、V258、L367及F369定義；
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包含：
i. 選自麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y251之位置；及/或
ii. 選自麩胺酸、天門冬胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸及精胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基L256之位置；及/或
iii. 選自絲胺酸、丙胺酸、脯胺酸、白胺酸及麩胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基V258之位置；及/或
iv. 選自丙胺酸及甘胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基L367之位置；及/或
v. 選自甘胺酸、絲胺酸及白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基F369之位置。
6.如前述任一項條款之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，其進一步包含：
a) 位於第六BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的I198結合位；
b) 其中該第六BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K166定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. 選自纈胺酸、苯丙胺酸、白胺酸及異白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K166之位置。
7.如前述任一項條款之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，其進一步包含：
a) 位於第七BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的D210結合位；
b) 其中該第七BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S254定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. 選自丙胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S254之位置。
8.如前述任一項條款之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，其進一步包含：
a) 位於第八BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的D168結合位；
b) 其中該第八BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K340定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. 選自組胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K340之位置。
9.一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A (BoNT/A) L鏈蛋白酶，其裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)，且相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的D189/D192結合位；
b) 其中該第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. 選自丙胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29之位置。
10.一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A (BoNT/A) L鏈蛋白酶，其裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)，且相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第九BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的I198結合位；
b) 其中該第九BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K166定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. 選自纈胺酸、苯丙胺酸、白胺酸及異白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K166之位置。
11.一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A (BoNT/A) L鏈蛋白酶，其裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)，且相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的K206結合位；
b) 其中該第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y251、L256、V258、L367及F369定義；
c) 且其中該至少一個胺基酸殘基變更包含：
i. 選自麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y251之位置；及/或
ii. 選自天門冬胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸及精胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基L256之位置；及/或
iii. 選自絲胺酸、丙胺酸、脯胺酸、白胺酸及麩胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基V258之位置；及/或
iv. 選自丙胺酸及甘胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基L367之位置；及/或
v. 選自甘胺酸、絲胺酸及白胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基F369之位置。
12.一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A (BoNT/A) L鏈蛋白酶，其裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)，且相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第七BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的D210結合位；
b) 其中該第七BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S254定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. 選自丙胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S254之位置。
13.一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A (BoNT/A) L鏈蛋白酶，其裂解人類SNAP-23 (hSNAP-23)，且相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：
a) 位於第八BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的D168結合位；
b) 其中該第八BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K340定義；
c) 且其中該胺基酸殘基變更包含：
i. 選自組胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K340之位置。
14.如條款9至13中任一項之經修飾的肉毒桿菌神經毒素A (BoNT/A) L鏈蛋白酶，其進一步包含至少一個位於不同BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，其中該胺基酸殘基變更及該另一BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋係由條款1至13中任一項所述之技術特徵定義。
15.一種核酸構築體，其包含或由編碼如前述任一項條款中所定義之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶的核酸序列所組成。
16.一種遞送載體，其包含：
a) 如條款1至14中任一項所定義之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，或條款15之核酸構築體；及
b) 用於遞送該經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶、或該核酸構築體至靶細胞的手段，較佳為遞送至非神經元性靶細胞內。
17.如條款16之遞送載體，其中該用於遞送該經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶至靶細胞之手段b)包含：
i) 靶向部分，其將遞送載體結合至靶細胞；及
ii) 易位肽，其將該經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶或核酸構築體易位至靶細胞中，較佳至非神經元性靶細胞中。
18.一種裂解hSNAP-23之方法，其包含將hSNAP-23與如條款1至14中任一項之(BoNT/A) L鏈蛋白酶接觸，或與如條款15之核酸構築體接觸，或與如條款16或17之遞送載體接觸。
19.一種用於條款18之方法的條款1至14中任一項之(BoNT/A) L鏈蛋白酶、或條款15之核酸構築體或條款16或17之遞送載體。
無
圖 1-對於本發明經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶之hSNAP-23及hSNAP25裂解數據。(
A) 在單一結合囊袋中具有突變之BoNT/A L鏈蛋白酶的數據，(
B) 在多重結合囊袋中具有突變之BoNT/A L鏈蛋白酶的數據，(C)具有描述於其中之突變之BoNT/AL鏈蛋白酶的數據。
圖 2-BoNT/A L鏈蛋白酶(輪廓線)與SNAP-25/23之結合囊袋的相互作用之3D描繪圖像(描繪線)。
無。
Claims (9)
- 一種經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)L鏈蛋白酶，其顯示相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)增加人類SNAP-23(hSNAP-23)裂解(cleavage)，且相對於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)具有經修飾的胺基酸序列，包含：a)位於第九BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的I198結合位；b)其中該第九BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K166定義；且c)其中該至少一個胺基酸殘基變更包含：胺基酸殘基苯丙胺酸，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基K166之位置。
- 如請求項1之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，其進一步包含：a)位於第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的D189/D192結合位；b)其中該第二BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29定義；且 c)其中該胺基酸殘基變更包含：胺基酸殘基丙胺酸，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Q29之位置。
- 如請求項1或2之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，其進一步包含：a)位於第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的K185結合位；b)其中該第四BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基G305定義；且c)其中該至少一個胺基酸殘基變更包含：選自由麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基G305之位置。
- 如請求項1或2之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，其進一步包含：a)位於第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的R186結合位；b)其中該第五BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S143定義；且 c)其中該胺基酸殘基變更包含：選自由麩醯胺酸、麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基S143之位置。
- 如請求項1或2之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶，其進一步包含：a)位於第六BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋內的至少一個胺基酸殘基變更，該囊袋用於結合hSNAP-23的K206結合位；b)其中該第六BoNT/A L鏈蛋白酶結合囊袋由野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y251定義；且c)其中該至少一個胺基酸殘基變更包含：選自由麩胺酸及天門冬胺酸所組成群組之胺基酸殘基，其位於經修飾的L鏈蛋白酶胺基酸序列上對應於野生型BoNT/A L鏈(SEQ ID NO：1)的胺基酸殘基Y251之位置。
- 一種載體，其包含核酸構築體，該核酸構築體包含編碼如請求項1至5中任一項之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶的核酸序列。
- 一種遞送載體，其包含：如請求項6之載體。
- 一種裂解hSNAP-23之活體外方法，其包含將hSNAP-23與如請求項1至5中任一項之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶接觸，或與如請求項7之遞送載體接觸。
- 一種如請求項1至5中任一項之經修飾BoNT/A L鏈蛋白酶或如請求項7之遞送載體用於製備用以治療分泌性病症之醫藥品之用途。
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