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TWI869353B - 包含外源性活化圈之梭狀芽孢桿菌神經毒素、其製造方法、及其相關應用 - Google Patents

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TWI869353B
TWI869353B TW108135053A TW108135053A TWI869353B TW I869353 B TWI869353 B TW I869353B TW 108135053 A TW108135053 A TW 108135053A TW 108135053 A TW108135053 A TW 108135053A TW I869353 B TWI869353 B TW I869353B
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亞當 庫賓斯基
蘿拉 樂芙拉克
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英商艾普森生物製藥有限公司
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Abstract

本發明係關於一種將單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素進行蛋白水解加工成對應的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素的方法，該方法包含：提供一單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素；及使該單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與腸激酶或Xa因子接觸；其中該單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素具有含多肽序列Cys-(Xaa)a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b-Cys(SEQ ID NO：1)之活化圈，其中a=1-10且b=4-15；且其中腸激酶或Xa因子將活化圈之肽鍵水解，從而產生一雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。本發明亦關於工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素及製造其之方法，以及相關的醫藥組成物、核苷酸序列及治療用途。

Description

包含外源性活化圈之梭狀芽孢桿菌神經毒素、其製造方法、及其相關應用
本發明係關於一種梭狀芽孢桿菌神經毒素以及其活化及使用方法。
梭狀芽孢桿菌屬(genus Clostridia)中的細菌產生強效且特異性的蛋白質毒素，其可毒害彼等被遞送至之神經元及其他細胞。此種梭狀芽孢桿菌神經毒素之例包括破傷風桿菌(C.tetani)(TeNT)及肉毒桿菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G及X(詳見WO 2018/009903 A2)所產生的神經毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)及酪酸梭菌(C.butyricum)所產生者。
於梭狀芽孢桿菌神經毒素中有一些為已知最強效的毒素。舉例而言，肉毒桿菌神經毒素視其血清型而定，對於小鼠具有範圍從0.5至5ng/kg之半數致死劑量(LD50)值。破傷風及肉毒桿菌毒素兩者係藉由抑制受影響之神經元的功能而作用，特別是神經傳導物的釋放。而肉毒桿菌毒素作用於神經肌肉會合處並在周圍神經系統中抑制膽鹼性傳導(cholinergic transmission)，破傷風毒素則作用於中樞神經系統。
於梭狀芽孢桿菌中梭狀芽孢桿菌神經毒素被表現為單鏈多肽。各梭狀芽孢桿菌神經毒素具有一個催化輕鏈，其藉由一個被稱為活化圈(activation loop)的暴露區域而與重鏈(包含N端易位域和C端受體結合域)隔開。在蛋白質成熟過程中，活化圈的蛋白水解切割將梭狀芽孢桿菌神經毒素的輕鏈和重鏈分開，並藉由雙硫鍵將其固定在一起，從而產生完全活性的雙鏈毒素。此過程必須在重組毒素生產過程中再現。
外源性蛋白酶(例如胰蛋白酶或Lys-C)係用於將單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素進行蛋白水解性活化。然而，對於一些梭狀芽孢桿菌神經毒素，以Lys-C或胰蛋白酶培養會導致單鏈多肽的部分或不適當的切割，從而導致污染的單鏈及/或不活化型之切割/降解產物的產生(例如，於BoNT/E的情況)，被迫進行全長雙鏈多肽的純化。因此，目前尚無用於活化梭狀芽孢桿菌神經毒素的通用外源性蛋白酶。此在鑑定新的梭狀芽孢桿菌神經毒素或生產經修飾的(例如嵌合的或雜合的)神經毒素時特別成為問題，其需要篩選多種蛋白酶以確定正確的活化。
最近鑑定出肉毒桿菌神經毒素血清型X(BoNT/X)(WO 2018/009903 A2)。已發現BoNT/X對於活化特別成為問題，且以胰蛋白酶或Lys-C切割會完全降解該多肽。
本發明克服了上述一或多個問題。
相較於習知所使用之胰蛋白酶及Lys-C，蛋白酶腸激酶呈現出更高的受質特異性。此蛋白酶辨識並立即切割DDDDK肽序列(SEQ ID NO：72)的C端。值得注意的是，所有的梭狀芽孢桿菌神經毒素活化圈皆不存在此序列(參見圖1)，因此先前已排除腸激酶作為用於活化梭狀芽孢桿菌神經毒素的蛋白酶。
本案發明人等驚訝地發現，腸激酶辨識並立即切割存在於BoNT/C1活化圈之IDGR序列的C端(參見圖1)。有利地，此序列亦可被Xa因子辨識並切割，該Xa因子為另一種呈現高受質特異性(例如，與胰蛋白酶及Lys-C相比)的蛋白酶。再者，BoNT/C1活化圈亦具有離胺酸和精胺酸殘基，允許被離胺酸或胰蛋白酶切割。因此，本發明人驚訝地發現，BoNT/C1圈構成梭狀芽孢桿菌神經毒素的通用活化圈，從而提供使用四種不同蛋白酶的靈活性。
在本發明之一態樣中提供一種用於將單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如本文所述之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素)進行蛋白水解加工成對應的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素的方法，該方法包含： a.提供單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素；及 b.使單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與腸激酶接觸； 其中該單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素具有包含多肽序列Cys-(Xaa)a -Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b -Cys (SEQ ID NO：1)之活化圈；且 其中腸激酶將活化圈之肽鍵水解，從而產生雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如本文所述的工程化雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素)。
在一相關態樣中，本發明提供一種用於將單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如本文所述之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素)進行蛋白水解加工成對應的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素的方法，該方法包含： a.提供單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素；及 b.使單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素與Xa因子接觸； 其中該單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素具有包含多肽序列Cys-(Xaa)a -Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b -Cys (SEQ ID NO：1)之活化圈；且 其中Xa因子將活化圈之肽鍵水解，從而產生雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如本文所述的工程化雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素)。
單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素較佳為本發明之工程化單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該活化圈為外源性活化圈。有利的是，本案發明人等發現，以SEQ ID NO：1所示之外源性活化圈(其於其天然內容物中含有蛋白酶切割位)置換內源性梭狀芽孢桿菌神經毒素活化圈，克服了與修飾內源性活化圈以插入蛋白酶切割位(例如，如Ile-Asp-Gly-Arg [SEQ ID NO：18]或Ile-Glu-Gly-Arg [SEQ ID NO：19]之Xa因子切割位)有關的問題。特別是，修飾內源性活化圈以插入蛋白酶切割位可導致構形變化，其進而可對切割效率產生負面影響(參見本文實施例7)。
在一特佳之實施方式中，本發明之方法包含使用腸激酶。
在一態樣中，本發明針對腸激酶的用途，其係用於水解包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19(較佳為SEQ ID NO：18)所示之序列的多肽(例如梭狀芽孢桿菌神經毒素)之肽鍵。較佳地，腸激酶立即水解多肽序列中所包含的SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19 (更佳為SEQ ID NO：18)的C端的肽鍵。在一實施方式中，多肽包含SEQ ID NO：1所示之多肽序列，或包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少70%序列一致性之多肽序列。
本發明亦提供一種用於製造工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法，該方法包含： a.鑑定梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素之特徵為梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈外的肽鍵係藉由胰蛋白酶或Lys-C而水解；且 b.以外源性活化圈置換內源性活化圈，從而提供一種工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該外源性活化圈包含多肽序列Cys-(Xaa)a -Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b -Cys (SEQ ID NO：1)。
本發明亦提供一種用於製造工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法，該方法包含： a.鑑定梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素之特徵為該內源性活化圈無法有效地藉由胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解加工；及 b.以外源性活化圈置換內源性活化圈，從而提供工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該外源性活化圈包含多肽序列Cys-(Xaa)a -Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b -Cys (SEQ ID NO：1)。
在一實施方式中，該梭狀芽孢桿菌神經毒素之特徵在於梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈外的肽鍵係藉由胰蛋白酶或Lys-C而水解，且該內源性活化圈無法有效地藉由胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解加工。
在該內源性活化圈無法有效地藉由胰蛋白酶進行蛋白水解加工(且較佳地該梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈外的肽鍵不能被胰蛋白酶水解)的實施方式中，該方法可進一步包含使工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素接觸胰蛋白酶，其能夠水解該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素之外源性活化圈中的肽鍵。同樣地，在該內源性活化圈無法有效地藉由Lys-C進行蛋白水解加工(且較佳地該梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈外的肽鍵不能被Lys-C水解)的實施方式中，該方法可進一步包含使工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素接觸Lys-C，其能夠水解該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素之外源性活化圈中的肽鍵。
在一實施方式中，方法包含篩選梭狀芽孢桿菌神經毒素其用於本發明方法的適合性之步驟。該篩選步驟可包含確定該梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈外的肽鍵是否被胰蛋白酶或Lys-C水解。或者或另外，該篩選步驟可包含確定該梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈是否無法有效地藉由胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解加工。
在一實施方式中，相對於梭狀芽孢桿菌神經毒素(工程化前)，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素並非無法有效地藉由腸激酶或Xa因子進行蛋白水解加工，及/或該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素之外源性活化圈外的肽鍵不能被腸激酶或Xa因子水解。因此，該梭狀芽孢桿菌神經毒素(工程化前)較佳為對藉由腸激酶及/或Xa因子的蛋白水解加工具有抗性。
梭狀芽孢桿菌神經毒素可藉由分析而鑑定為適合在本發明方法中用於工程化，該分析包含在50 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM NaCl反應緩衝液中，於至少4℃下，使1 mg梭狀芽孢桿菌神經毒素與至少0.25 µg之胰蛋白酶(≥3350個單位/mg)或Lys-C(≥200個單位/mg)接觸至少5小時。
在一實施方式中，該分析包含在50 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM NaCl反應緩衝液中，於4℃下，使1 mg之梭狀芽孢桿菌神經毒素與0.25 µg之胰蛋白酶(≥3350個單位/mg) (~1:611莫耳比例之梭狀芽孢桿菌神經毒素對胰蛋白酶)或Lys-C(≥200個單位/mg) (~1:734莫耳比例之梭狀芽孢桿菌神經毒素對Lys-C)接觸18小時。
在另一實施方式中，該分析包含在50 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM NaCl反應緩衝液中，於20℃下，使1 mg之梭狀芽孢桿菌神經毒素與0.40 µg之胰蛋白酶(≥3350個單位/mg) (~1:978莫耳比例之梭狀芽孢桿菌神經毒素對胰蛋白酶)或Lys-C(≥200個單位/mg) (~1:1174莫耳比例之梭狀芽孢桿菌神經毒素對Lys-C)接觸5小時。
所使用之胰蛋白酶較佳為市售TrypZean (Sigma# T3568)。胰蛋白酶可具有與SEQ ID NO：47具至少70%序列一致性之多肽序列。在一實施方式中，胰蛋白酶可具有與SEQ ID NO：47具至少80%或90%序列一致性之多肽序列。較佳地，胰蛋白酶可具有如SEQ ID NO：47所示之多肽序列。一個單位的該胰蛋白酶(Trypzean)係定義為使用3.2 mL的反應體積之0.23 mM Na-苄基-L-精胺酸乙酯溶液(BAEE)作為受質，在25℃、pH 7.6下，會產生每分鐘0.003的在253 nm的吸光度變化之酶的量。
所使用之Lys-C較佳為市售Lys-C (Sigma# 000000011047825001)。Lys-C可具有與SEQ ID NO：48具至少70%序列一致性之多肽序列。在一實施方式中，Lys-C可具有與SEQ ID NO：48具至少80%或90%序列一致性之多肽序列。較佳地，Lys-C可具有如SEQ ID NO：48所示之多肽序列。一個單位的該Lys-C係定義為在25℃、pH 7下，每分鐘會水解1.0 µmol Tos-Gly-Pro-Lys-pNA之酶的量。
若藉由SDS-PAGE(較佳為以考馬斯(Coomassie)或同等靈敏度的染料染色時)觀察到梭狀芽孢桿菌神經毒素的H鏈及L鏈以外的一或多個切割產物，則可確定梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈外的肽鍵已被胰蛋白酶或Lys-C水解。較佳地，在進行上述分析後，若藉由SDS-PAGE觀察到梭狀芽孢桿菌神經毒素的鏈及L鏈以外的至少3、4、5、6、7、8、9或10個切割產物，則可確定梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈外的肽鍵已被胰蛋白酶或Lys-C水解。
另外或或者，若少於70%的內源性活化圈被胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解加工而產生雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素(在進行上述分析後，較佳為在以考馬斯或同等靈敏度的染料染色時，藉由SDS-PAGE的方式評估)，則可確定內源性活化圈無法有效地藉由胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解切割。較佳地，若少於60%、50%、40%、30%、10%或5%的內源性活化圈被胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解加工(在進行上述分析後藉由SDS-PAGE的方式評估)，則梭狀芽孢桿菌神經毒素之特徵可定為內源性活化圈無法有效地藉由胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解切割。更佳地，若少於30%內源性活化圈被胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解加工(在進行上述分析後，藉由SDS-PAGE的方式評估)，則梭狀芽孢桿菌神經毒素之特徵可定為內源性活化圈無法有效地藉由胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解切割。
梭狀芽孢桿菌神經毒素(工程化前)較佳為其之肽鍵(在活化圈之內或之外)不被或實質上不被腸激酶或Xa因子水解。術語「實質上不水解」意指存在於反應中之梭狀芽孢桿菌神經毒素的少於10%、5%、4%、3%、2%或1%含有已被本發明方法中的腸激酶或Xa因子水解的肽鍵。
在一實施方式中，本發明方法進一步包含使工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素與腸激酶或Xa因子(更佳為腸激酶)接觸，從而產生對應的雙鏈工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素。
在一態樣中，本發明提供一種工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如可藉由本發明方法獲得)，其中梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈已被外源性活化圈置換，從而提供一種工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素， 其中該外源性活化圈包含多肽序列Cys-(Xaa)a -Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b -Cys (SEQ ID NO：1)。
在一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素(工程化前)之特徵為：梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈外的肽鍵被胰蛋白酶或Lys-C水解。在一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素(工程化前)之特徵為：內源性活化圈無法有效地藉由胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解加工。在另一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素(工程化前)之特徵為：梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈外的肽鍵被胰蛋白酶或Lys-C水解；且內源性活化圈無法有效地藉由胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解加工。確認梭狀芽孢桿菌神經毒素(工程化前)的這些特徵較佳係藉由上述分析的方式。
本發明可包含以本文所述之外源性活化圈置換任何梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素不為BoNT/C1。梭狀芽孢桿菌神經毒素可為肉毒桿菌神經毒素或破傷風神經毒素。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素為肉毒桿菌神經毒素(BoNT)，例如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或BoNT/X。
在一實施方式中，用於本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素為BoNT/X、BoNT/E或BoNT/A1C1雜合體。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素為BoNT/X或BoNT/E，其二者皆具有下述特徵：胰蛋白酶及/或Lys-C水解其內源性活化圈外的肽鍵，及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素二者含有無法有效地藉由胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解加工的內源性活化圈。最佳地，用於本發明梭狀芽孢桿菌神經毒素為BoNT/X。
本文所使用的術語「內源性活化圈」意指對象梭狀芽孢桿菌神經毒素中存在的活化圈，例如指示之血清型的對象梭狀芽孢桿菌神經毒素。例如，BoNT/A1包括BoNT/A1重鏈及輕鏈，因此BoNT/A1之內源性活化圈為A1活化圈。關於梭狀芽孢桿菌神經毒素嵌合體或雜合體，所屬技術領域中具有通常知識者可例如藉由自所衍生的L鏈及HN 域確定血清型來鑑定「內源性活化圈」。在一些實施方式中，嵌合體或雜合體梭狀芽孢桿菌神經毒素可具有內源性活化圈，其係來由兩種不同血清型的活化圈的融合。舉例而言，嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素，例如BoNT/A1C1，具有BoNT/A1輕鏈及易位域，因此內源性BoNT/A1C1活化圈為A1活化圈。活化圈之例係提供於圖1。
較佳地，「內源性活化圈」為非SEQ ID NO：1的任何活化圈。在一實施方式中，「內源性活化圈」為非SEQ ID NO：2及/或SEQ ID NO：3的任何活化圈。
相較之下，本文所使用的「外源性活化圈」意指不同於對象梭狀芽孢桿菌神經毒素中存在之內源性活化圈的活化圈，例如指示血清型的對象梭狀芽孢桿菌神經毒素。例如，BoNT/C1活化圈具有不同於野生型-BoNT/A1活化圈的多肽序列，因此對於BoNT/A1，BoNT/C1活化圈是外源性的。關於梭狀芽孢桿菌神經毒素嵌合體或雜合體，所屬技術領域中具有通常知識者可例如藉由自所衍生的L鏈及HN 域確定血清型來確定活化圈是否為「外源性活化圈」。當L鏈為BoNT/B L鏈且HN 域來自BoNT/D，則該內源性活化圈可具有部分的BoNT/B序列及部分的BoNT/D序列，且若活化圈(例如C1活化圈)與此不同，則被認為是「外源性活化圈」。
可藉由比對對象梭狀芽孢桿菌神經毒素與活化圈之序列，並查看活化圈是否存在於對象梭狀芽孢桿菌神經毒素序列，來確定活化圈是否為「外源性活化圈」。若不存在，則可將活化圈鑑定為外源性活化圈。
較佳地，整個內源性活化圈被本文所述之外源性活化圈所置換。然而，在一些實施方式中，部分的內源性活化圈被置換，例如內源性活化圈的至少5、10、15、20、25、30、35或40個胺基酸殘基被置換。
內源性活化圈的置換可藉由所屬技術領域中已知的任何方法達成。例如，置換可藉由胺基酸修飾的方式達成。在一實施方式中，內源性活化圈可藉由刪除內源性活化圈之一或多個胺基酸殘基來置換。內源性活化圈可藉由以外源性活化圈之胺基酸殘基取代內源性活化圈之一或多個胺基酸殘基來置換。在一些實施方式中，可去除內源性活化圈(或其之部分)，並插入外源性活化圈，較佳為插入內源性活化圈形式上所佔有之位置。或者，內源性活化圈可保留於本發明工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素中，且較佳為不活化型(例如藉由突變之方式)。較佳為內源性活化圈(或其部分，更佳為整個內源性活化圈)不存在於本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素中。較佳為外源性活化圈佔據梭狀芽孢桿菌神經毒素中內源性活化圈形式上所佔有之位置。
藉由胺基酸殘基的取代、插入或刪除而修飾蛋白質的方法為所屬技術領域中已知的，並可用於本發明的實施。舉例而言，可藉由修飾編碼梭狀芽孢桿菌神經毒素的DNA序列來導入胺基酸修飾。此可使用標準的分子選殖技術達成，例如藉由定點誘變，其中使用聚合酶酵素並使用編碼所欲胺基酸的DNA短股(寡核苷酸)以置換原始編碼序列，或藉由以各種酶(例如連接酶和限制性核酸內切酶)插入/刪除部分基因。或者，可化學合成經修飾的基因序列。
在一實施方式中，內源性活化圈包含與SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：71具有至少70% (例如至少80%或90%)序列一致性之多肽序列。在一實施方式中，內源性活化圈包含與SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：71具有至少95%序列一致性之多肽序列。較佳地，內源性活化圈包含如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：71所示之多肽序列。
在一實施方式中，內源性活化圈包含與SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69具有至少70% (例如至少80%或90%)序列一致性之多肽序列。在一實施方式中，內源性活化圈包含與SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69具有至少95%序列一致性之多肽序列。較佳地，內源性活化圈包含如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69所示之多肽序列。
在一實施方式中，內源性活化圈包含與SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：24具有至少70% (例如至少80%或90%)序列一致性之多肽序列。在一實施方式中，內源性活化圈包含與SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：24具有至少95%序列一致性之多肽序列。較佳地，內源性活化圈包含如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：24所示之多肽序列。
較佳地，內源性活化圈包含與SEQ ID NO：20具有至少70% (例如至少80%或90%)序列一致性之多肽序列。在一實施方式中，內源性活化圈包含與SEQ ID NO：20具有至少95%序列一致性之多肽序列。更佳地，內源性活化圈包含如SEQ ID NO：20所示之多肽序列。
較佳地，內源性活化圈包含與SEQ ID NO：21具有至少70%(例如至少80%或90%)序列一致性之多肽序列。在一實施方式中，內源性活化圈包含與SEQ ID NO：21具有至少95%序列一致性之多肽序列。更佳地，內源性活化圈包含如SEQ ID NO：21所示之多肽序列。
較佳地，內源性活化圈包含與SEQ ID NO：24具有至少70%(例如至少80%或90%)序列一致性之多肽序列。在一實施方式中，內源性活化圈包含與SEQ ID NO：24具有至少95%序列一致性之多肽序列。更佳地，內源性活化圈包含如SEQ ID NO：24所示之多肽序列。
本發明包含方法及梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中內源性活化圈已被外源性活化圈置換，例如包含如Cys-(Xaa)a -Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b -Cys (SEQ ID NO：1)所示之多肽的外源性活化圈。Xaa或Yaa可為任何胺基酸。在Xaa及Yaa位置的胺基酸數量分別以字母「a」及「b」表示。在一實施方式中，「a」及「b」可為允許活化圈之蛋白水解切割並產生活性雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素的任何整數。在一實施方式中，「a」為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一實施方式中，「b」為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一實施方式中，「a」為≤12、≤11、≤10、≤9、≤8、≤7、≤6、≤5或≤4。在一實施方式中，「b」為≤20、≤19、≤18、≤17、≤16、≤15、≤14、≤13、≤12、≤11、≤10或≤9。
在一實施方式中，「a」為1-12，例如1-10。較佳地，「a」為1-7，例如2-4。更佳地，「a」為3。在一實施方式中，「b」為1-20，例如4-15。較佳地，「b」為6-10。更佳地，「b」為8。
無意使Xaa或Yaa僅限定於一種類型的胺基酸。因此，在Xaa位置上存在的一或多個殘基可獨立地選自標準胺基酸：天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、離胺酸、組胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、半胱胺酸、丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸及苯丙胺酸。在Yaa位置上存在的一或多個殘基可獨立地選自標準胺基酸：天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、離胺酸、組胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、半胱胺酸、丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸及苯丙胺酸。較佳地，在Yaa位置上(更佳為緊鄰在SEQ ID NO：1的Arg殘基的C端)的胺基酸不為脯胺酸。
或者/另外，在Xaa或Yaa位置上的一或多個殘基可獨立地選自非標準胺基酸(不屬於上述標準組中20個的胺基酸)。舉例而言，非標準胺基酸可包括4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸、α-甲基絲胺酸、反-3-甲基脯胺酸、2,4-甲橋-脯胺酸、順-4-羥基脯胺酸、反-4-羥基-脯胺酸、N-甲基甘胺酸、別(allo)-蘇胺酸、甲基-蘇胺酸、羥基-乙基半胱胺酸、羥基乙基升(homo)-半胱胺酸、硝基-麩醯胺酸、升麩醯胺酸、六氫菸鹼酸(pipecolic acid)、三級白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯基-丙胺酸、4-氮雜苯基-丙胺酸、L-鳥胺酸、L-2-胺基-3-胍基丙酸、或離胺酸、精胺酸及/或鳥胺酸之D-異構物、及4-氟苯丙胺酸。用於將非標準胺基酸導入蛋白質的方法為所屬技術領域中已知的，且包括使用大腸桿菌(E. coli )營養缺陷型表現宿主的重組蛋白質合成。
下表列出標準胺基酸的性質：
胺基酸     側鏈
天冬胺酸 Asp D 帶電荷 (酸性)
麩胺酸 Glu E 帶電荷 (酸性)
精胺酸 Arg R 帶電荷 (鹼性)
離胺酸 Lys K 帶電荷 (鹼性)
組胺酸 His H 不帶電荷 (極性)
天冬醯胺酸 Asn N 不帶電荷 (極性)
麩醯胺酸 Gln Q 不帶電荷 (極性)
絲胺酸 Ser S 不帶電荷 (極性)
蘇胺酸 Thr T 不帶電荷 (極性)
酪胺酸 Tyr Y 不帶電荷 (極性)
甲硫胺酸 Met M 不帶電荷 (極性)
色胺酸 Trp W 不帶電荷 (極性)
半胱胺酸 Cys C 不帶電荷 (極性)
丙胺酸 Ala A 不帶電荷 (疏水性)
甘胺酸 Gly G 不帶電荷 (疏水性)
纈胺酸 Val V 不帶電荷 (疏水性)
白胺酸 Leu L 不帶電荷 (疏水性)
異白胺酸 Ile I 不帶電荷 (疏水性)
脯胺酸 Pro P 不帶電荷 (疏水性)
苯丙胺酸 Phe F 不帶電荷 (疏水性)
以下胺基酸被認為是帶電荷之胺基酸：天冬胺酸(負)、麩胺酸(負)、精胺酸(正)及離胺酸(正)。
SEQ ID NO：1所包含之序列Ile-Asp/Glu-Gly-Arg係指被本發明人驚訝地發現之被腸激酶(以及Xa因子)辨識的位置。較佳地，該序列為Ile-Asp-Gly-Arg，例如Cys-(Xaa)a -Ile-Asp-Gly-Arg-(Yaa)b -Cys。據信，腸激酶及Xa因子水解緊鄰於SEQ ID NO：1之Arg的C端的肽鍵(即，Arg與Yaa之間的肽鍵)。
在一實施方式中，在緊鄰於SEQ ID NO：1之Ile的N端的Xaa上的胺基酸殘基為不帶電荷之疏水性胺基酸，較佳為丙胺酸。在一些實施方式中，「a」為至少2，且Xaa包含至少C端不帶電荷之極性胺基酸及緊鄰於其N端的帶電荷之鹼性胺基酸。該帶電荷之鹼性胺基酸較佳為離胺酸。因此，在「a」為至少2之實施方式中，Xaa可包含至少Lys-Ala，其中Ala係緊鄰於SEQ ID NO：1之Ile的N端。
在一實施方式中，Xaa包含序列HKA或由序列HKA組成。
在一實施方式中，在緊鄰於SEQ ID NO：1之Arg的C端的Yaa上的胺基酸殘基為不帶電荷之極性胺基酸，較佳為絲胺酸。在一些實施方式中，「b」為至少2，且Yaa包含至少N端不帶電荷之極性胺基酸及緊鄰於其C端的不帶電荷之疏水性胺基酸。該不帶電荷之疏水性胺基酸較佳為白胺酸。因此，在「b」為至少2之實施方式中，Yaa可包含至少Ser-Leu，其中Ser係緊鄰於SEQ ID NO：1之Arg的C端。
在一實施方式中，Yaa包含序列SLYNKTLDC或由序列SLYNKTLDC組成。
在一些實施方式中，外源性活化圈與SEQ ID NO：2具有至少70%序列一致性。在一實施方式中，外源性活化圈與SEQ ID NO：2具有至少80%, 85%或90%序列一致性。較佳地，外源性活化圈與SEQ ID NO：2具有至少95%序列一致性。更佳地，外源性活化圈與SEQ ID NO：2具有至少99%序列一致性。
在特佳之實施方式中，外源性圈包含SEQ ID NO：2。更佳地，外源性圈由SEQ ID NO：2組成。
外源性圈亦可為SEQ ID NO：2之變異體，例如SEQ ID NO:3或與其具有至少70%序列一致性之序列。SEQ ID NO：3為SEQ ID NO：2之變異體，其中腸激酶辨識位IDGR已突變為IEGR。在一實施方式中，外源性活化圈與SEQ ID NO：3具有至少80%、85%或90%序列一致性。較佳的，外源性活化圈與SEQ ID NO：3具有至少95%序列一致性。更佳地，外源性活化圈與SEQ ID NO：3具有至少99%序列一致性。
在特佳之實施方式中，外源性圈包含SEQ ID NO：3。更佳地，外源性圈由SEQ ID NO：3組成。
本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素)可藉由與SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12具有至少70%序列一致性之核苷酸序列所編碼。在一實施方式中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素可藉由與SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12具有至少80%或90%序列一致性之核苷酸序列所編碼。較佳地，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素可藉由包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12 (更佳為由此等序列組成)之核苷酸序列所編碼。
本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素)可包含與SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13具有至少70%序列一致性之多肽序列。在一實施方式中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含與SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13具有至少80%或90%序列一致性之多肽序列。較佳地，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13所示之多肽序列(更佳為由此等序列組成)。
本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素)較佳為BoNT/X，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由與SEQ ID NO：4具有至少70%序列一致性之核苷酸序列所編碼。在一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由與SEQ ID NO：4具有至少80%或90%序列一致性之核苷酸序列所編碼。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由包含SEQ ID NO：4 (或由其組成)之核苷酸序列所編碼。本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素較佳為BoNT/X，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素包含與SEQ ID NO：5具有至少70%序列一致性之多肽序列。在一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素包含與SEQ ID NO：5具有至少80%或90%序列一致性之多肽序列。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素包含如SEQ ID NO：5所示之多肽序列(或由其組成)。
本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素)較佳為BoNT/E，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由與SEQ ID NO：10具有至少70%序列一致性之核苷酸序列所編碼。在一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由與SEQ ID NO：10具有至少80%或90%序列一致性之核苷酸序列所編碼。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由包含SEQ ID NO：10 (或由其組成)之核苷酸序列所編碼。本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素較佳為BoNT/E，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素包含與SEQ ID NO：11具有至少70%序列一致性之多肽序列。在一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素包含與SEQ ID NO：11具有至少80%或90%序列一致性之多肽序列。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素包含如SEQ ID NO：11所示之多肽序列(或由其組成)。
在一些實施方式中，本發明之多肽序列(或編碼其之核苷酸序列)可包括純化標籤(purification tag)，例如His-tag。本發明意圖亦包括去除純化標籤的多肽序列(及編碼其之核苷酸序列)。
本發明包含使單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素)與能夠水解單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素活化圈中之肽鍵的蛋白酶接觸，從而產生雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。該蛋白酶可為內肽酶。蛋白酶可為腸激酶、Xa因子、Lys-C或胰蛋白酶。較佳地，蛋白酶為腸激酶或Xa因子，更佳為腸激酶。
術語「腸激酶」或「EK」包含本文所述之腸激酶，以及具有結構及/或功能相似性(較佳為結構及功能相似性)而能水解SEQ ID NO：1之肽鍵的任何蛋白酶。適當的腸激酶為腸激酶輕鏈，其可自NEB (#P8070)商業上購得。一個單位可定義為在25 µl (20 mM Tris-HCl、50 mM NaCl、2 mM CaCl2 (pH 8.0 @ 25℃))之總反應體積中，於25℃下在16小時內將25 µg MBP-EK-副肌凝蛋白(paramyosin)-ΔSal受質切割至完成95%所需之酶的量。
在一實施方式中，腸激酶包含與SEQ ID NO：49具有至少70%序列一致性之多肽序列。在一些實施方式中，腸激酶包含與SEQ ID NO：49具有至少80%或90%序列一致性之多肽序列。較佳地，腸激酶包含SEQ ID NO：49 (更佳為由其組成)。
在一些實施方式中，腸激酶可進一步包含重鏈，其中重鏈與輕鏈藉由雙硫鍵連結。此類腸激酶可商業上購得(例如購自R&D Systems)。
術語「Xa因子」包含本文所述之Xa因子，以及具有結構及/或功能相似性(較佳為結構及功能相似性)而能水解SEQ ID NO：1之肽鍵的任何蛋白酶。適當的Xa因子可自NEB (#P8010)商業上購得。一個單位可定義為在50 µl (20 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、2 mM CaCl2 (pH 8.0))之反應體積中，於23℃下在6小時以內將50 µg MBP融合蛋白測試受質MBP-ΔSal (受質MBP-ΔSal為一種與截短型副肌凝蛋白融合的麥芽糖結合蛋白，在融合接點具有胺基酸Ile-Glu-Gly-Arg)切割至完成95%所需之Xa因子的量。
在一實施方式中，Xa因子包含具有重鏈及輕鏈的多肽序列，該重鏈與SEQ ID NO：50具有至少70%序列一致性，該輕鏈與SEQ ID NO：51具有至少70%序列一致性，其中該重鏈及輕鏈藉由雙硫鍵連結。在一些實施方式中，Xa因子包含具有重鏈及輕鏈的多肽序列，該重鏈與SEQ ID NO：50具有至少80%或90%序列一致性，該輕鏈與SEQ ID NO：51具有至少80%或90%序列一致性，其中該重鏈及輕鏈藉由雙硫鍵連結。較佳地，Xa因子包含SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51 (更佳為由彼等組成)，其中該重鏈及輕鏈藉由雙硫鍵連結。
接觸可在任何適當條件下發生，該條件可造成產生大於30%、40%、50%或60%(較佳為大於70%)的單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素被蛋白水解加工成對應的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素，且在該梭狀芽孢桿菌神經毒素之活化圈外的肽鍵並無或實質上無水解。「實質上無水解」可意指所接觸的梭狀芽孢桿菌神經毒素的少於5%、4%、3%、2%或1%含有已被本發明方法的蛋白酶水解之活化圈外的肽鍵。
具有技術通常知識者可選擇適當的反應時間、溫度、緩衝液、及蛋白酶對單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素的莫耳比例來達成以上所述。可使用常規技術憑經驗地確定此類條件的最佳化，例如使用在該接觸後之反應產物的SDS-PAGE (例如以考馬斯或類似靈敏度的染料染色)視覺分析、或光譜技術(例如質譜)。
當藉由SDS-PAGE(例如以考馬斯或類似靈敏度的染料染色)評估時，本發明的方法較佳為結果僅產生梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈及H鏈。
在一實施方式中，本發明方法中藉由蛋白酶之蛋白水解加工結果產生少於5種梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈或H鏈的降解產物，更佳為少於4、3、2或1種降解產物。較佳地，藉由本發明方法所生產的L鏈及H鏈為全長的L鏈及H鏈。
因此，在特佳之實施方式中，用於本發明方法的蛋白酶(例如腸激酶或Xa因子)僅水解SEQ ID NO：1之肽鍵，更佳為僅水解SEQ ID NO：1之Arg與Yaa之間的肽鍵。
在一實施方式中，接觸發生至少1小時，例如至少2、4、6、8、10、12、14、16、18或20小時。
在一實施方式中，接觸發生在至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40℃的溫度下。
在一實施方式中，接觸發生在1至10℃(較佳為約4℃)的溫度下。較佳地，接觸發生在1至10℃(更佳為約4℃)的溫度下10-25小時(較佳為15-20小時)。
在一實施方式中，接觸發生在15-25℃(較佳為約20℃)的溫度下。較佳地，接觸發生在15-25℃(更佳為約20℃)的溫度下10-25小時(較佳為15-20小時)。
在一實施方式中，接觸發生在20-30℃(較佳為約25℃)的溫度下。較佳地，接觸發生在20-30℃(更佳為約25℃)的溫度下10-25小時(較佳為15-20小時)。
本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用至少1 µg蛋白酶。在一實施方式中，本發明方法的接觸步驟包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用至少0.1、0.2、0.4、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20 µg蛋白酶。較佳地，本發明方法的接觸步驟包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用至少2 µg(更佳為至少4 µg)蛋白酶。
在一實施方式中，本發明方法的接觸步驟包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用≤20 µg蛋白酶。在一實施方式中，本發明方法的接觸步驟包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用≤15 µg蛋白酶。較佳地，本發明方法的接觸步驟包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用≤10 µg蛋白酶。更佳地，本發明方法的接觸步驟包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用≤7 µg蛋白酶。
本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用0.1-20 µg蛋白酶。在一實施方式中，本發明方法可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用1-10 µg蛋白酶，較佳為每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用4-7 µg蛋白酶。
本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用至少10、20、30、40、50、60或70個單位之腸激酶。較佳地，本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用至少60個單位之腸激酶(更佳為至少70個單位)。在一些實施方式中，本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用≤150、≤140、≤130、≤120、≤110、≤100、≤90個單位之腸激酶。較佳地，本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用≤100個單位之腸激酶(更佳為≤90個單位)。本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用50-110個單位之腸激酶。在一實施方式中，本發明方法可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用70-90個單位之腸激酶，例如每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用約80個單位之腸激酶。
本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用至少0.5、1、2、3、4或5個單位的Xa因子。較佳地，本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用至少3個單位的Xa因子(更佳為至少4個單位)。在一些實施方式中，本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用≤15、≤14、≤13、≤12、≤11、≤10、≤9、≤8或≤7個單位的Xa因子。較佳地，本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用≤8個單位的Xa因子(更佳為≤7個單位)。本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用0.5-15個單位的Xa因子。在一實施方式中，本發明方法可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用1-10個單位(較佳為4-7個單位)的Xa因子，例如每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用約5或6個單位的Xa因子。
本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用至少0.02、0.04、0.06或0.08個單位的Lys-C。較佳地，本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用至少0.04個單位的Lys-C。在一些實施方式中，本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用≤0.5、≤0.4或≤0.2個單位的Lys-C。較佳地，本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用≤0.2個單位的Lys-C。本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用0.02-0.5個單位的Lys-C。較佳地，本發明方法可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用0.04-0.2個單位的Lys-C。
本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用至少0.1、0.2、0.3或0.4個單位的胰蛋白酶。較佳地，本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用至少0.4個單位的胰蛋白酶。在一些實施方式中，本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用≤2.5、≤2.3、≤2.1、≤1.9個單位的胰蛋白酶。較佳地，本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用≤1.8個單位的胰蛋白酶。本發明方法的接觸步驟可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用0.1-2.5個單位的胰蛋白酶。較佳地，本發明方法可包含每mg梭狀芽孢桿菌神經毒素使用0.3-2個單位(更佳為0.4-1.8個單位)的胰蛋白酶。
在一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化前)可為BoNT/X。參考的BoNT/X序列如SEQ ID NO：33所示。帶有組胺酸標籤型BoNT/X係表示為SEQ ID NO：34。編碼BoNT/X之參考的核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示。
在一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化前)可為BoNT/A。參考的BoNT/A序列如SEQ ID NO：35所示。
在另一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化前)可為BoNT/B。參考的BoNT/B序列如SEQ ID NO：36所示。
在另一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化前)可為BoNT/C。參考的BoNT/C1 序列如SEQ ID NO：37所示。
在另一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化前)可為BoNT/D。參考的BoNT/D序列如SEQ ID NO：38所示。
在另一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化前)可為BoNT/E。參考的BoNT/E序列如SEQ ID NO：39所示。
在另一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化前)可為BoNT/F。參考的BoNT/F序列如SEQ ID NO：40所示。
在另一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化前)可為BoNT/G。參考的BoNT/G序列如SEQ ID NO：41所示。
在另一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化前)可為TeNT。參考的TeNT序列如SEQ ID NO：42所示。
如上所討論，梭狀芽孢桿菌神經毒素係由兩條多肽鏈形成，重鏈(H鏈)(其具有約100 kDa之分子量)及輕鏈(L鏈)(其具有約50 kDa之分子量)。H鏈包含C端靶向成分(受體結合域或HC 域)及N端易位成分(HN 域)。
輕鏈參考序列之例包括： 肉毒桿菌A型神經毒素：胺基酸殘基1-448 肉毒桿菌B型神經毒素：胺基酸殘基1-440 肉毒桿菌C1型神經毒素：胺基酸殘基1-441 肉毒桿菌D型神經毒素：胺基酸殘基1-445 肉毒桿菌E型神經毒素：胺基酸殘基1-422 肉毒桿菌F型神經毒素：胺基酸殘基1-439 肉毒桿菌G型神經毒素：胺基酸殘基1-441 破傷風神經毒素：胺基酸殘基1-457
關於最近鑑定出的BoNT/X，據報導，L鏈對應於其胺基酸1-439，且L鏈的邊界可能相差約25個胺基酸(例如1-414或1-464)。
以上經鑑定的參考序列應被視為指引，因為根據亞血清型可能會發生細微變異。舉例而言，US 2007/0166332 (其全文藉由引用併入本文)引用略為不同的梭狀芽孢桿菌序列： 肉毒桿菌A型神經毒素：胺基酸殘基M1-K448 肉毒桿菌B型神經毒素：胺基酸殘基M1-K441 肉毒桿菌C1型神經毒素：胺基酸殘基M1-K449 肉毒桿菌D型神經毒素：胺基酸殘基M1-R445 肉毒桿菌E型神經毒素：胺基酸殘基M1-R422 肉毒桿菌F型神經毒素：胺基酸殘基M1-K439 肉毒桿菌G型神經毒素：胺基酸殘基M1-K446 破傷風神經毒素：胺基酸殘基M1-A457
易位域係使蛋白酶能易位進入目標細胞，從而在目標細胞的細胞質液內發生蛋白酶活性的功能表現之分子。任何分子(例如蛋白質或肽)是否具有本發明必要的易位功能可藉由許多習知分析中的任一種加以確認。
例如，Shone C. (1987)敘述一種使用微脂體的活體外分析，將該微脂體以測試分子攻擊。必要易位功能的存在係藉由自微脂體中釋放的K+ 及/或經標幟的NAD而確認，此等釋放可容易地進行監測[參見Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp. 175-180]。
Blaustein R. (1987)提供另外的實例，其敘述一種使用平面磷脂雙層膜的簡易活體外分析。將該膜以測試分子攻擊，而必要的易位功能係藉由跨膜之電導度的增加而確認[參見Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp. 115-120]。
能夠評估膜融合從而鑑定適用於本發明的易位域之另外的方法論係提供於Methods in Enzymology Vol 220 and 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993。
本發明亦包含變異型易位域，只要該變異型域仍顯示必要的易位活性。舉例而言，變異型與參考易位域可具有至少70%、較佳為至少80%、更佳為至少90%、且最佳為至少95%或至少98%胺基酸序列同源性。當使用於與易位域相關時，術語「片段」意指具有參考易位域之至少20、較佳為至少40、更佳為至少80、且最佳為至少100個胺基酸殘基的肽。在梭狀芽孢桿菌易位域的情況下，片段較佳具有參考易位域(例如HN 域)之至少100、較佳為至少150、更佳為至少200、且最佳為至少250個胺基酸殘基。本發明之易位「片段」包含基於參考序列的變異型易位域片段。
易位域較佳為在低pH條件下能夠在脂質膜中形成離子通透孔。較佳地，已發現僅使用能在胞內體膜內形成孔的蛋白質分子的那些部分。
易位域可由微生物蛋白來源獲得，特別是從細菌或病毒蛋白來源。因此，在一實施方式中，易位域為酶(例如細菌毒素或病毒蛋白)的易位域。
已充分證實細菌毒素分子的某些域能夠形成此類的孔。亦已知病毒表現膜融合蛋白的某些易位域能夠形成此類的孔。此類的域可在本發明中使用。
易位域可為梭狀芽孢桿菌來源的，例如HN 域(或其功能成分)。HN 意指梭狀芽孢桿菌神經毒素的H鏈的一部分或片段，大約等於H鏈之胺基末端的一半，或在完整H鏈中與該片段相對應的域。在一實施方式中，H鏈的HC 功能可藉由刪除HC 胺基酸序列(在DNA合成階段或在合成後階段藉由核酸酶或蛋白酶處理)而移除。或者，HC 功能可藉由化學或生物處理而不活化。因此，在一些實施方式中，H鏈可能不能夠結合至與天然梭狀芽孢桿菌神經毒素(即全毒素(holotoxin))結合的目標細胞上的結合位。
適當的(參考)易位域之例包括： 肉毒桿菌A型神經毒素  -胺基酸殘基(449-871) 肉毒桿菌B型神經毒素   -胺基酸殘基(441-858) 肉毒桿菌C型神經毒素   -胺基酸殘基(442-866) 肉毒桿菌D型神經毒素  -胺基酸殘基(446-862) 肉毒桿菌E型神經毒素   -胺基酸殘基(423-845) 肉毒桿菌F型神經毒素   -胺基酸殘基(440-864) 肉毒桿菌G型神經毒素  -胺基酸殘基(442-863) 破傷風神經毒素           -胺基酸殘基(458-879)
上述經鑑定之參考序列應被視為一種指引，因為根據亞血清型可能會發生細微變異。舉例而言，US 2007/0166332 (其藉由引用併入本文)引用略為不同的梭狀芽孢桿菌序列： 肉毒桿菌A型神經毒素  -胺基酸殘基(A449-K871) 肉毒桿菌B型神經毒素   -胺基酸殘基(A442-S858) 肉毒桿菌C型神經毒素   -胺基酸殘基(T450-N866) 肉毒桿菌D型神經毒素  -胺基酸殘基(D446-N862) 肉毒桿菌E型神經毒素   -胺基酸殘基(K423-K845) 肉毒桿菌F型神經毒素   -胺基酸殘基(A440-K864) 肉毒桿菌G型神經毒素  -胺基酸殘基(S447-S863) 破傷風神經毒素           -胺基酸殘基(S458-V879)
在本發明上下文中，各種包含易位域的梭狀芽孢桿菌神經毒素HN 區域在本發明的態樣中是有幫助的，前提是這些活性片段可促進非細胞毒性蛋白酶(例如梭狀芽孢桿菌L鏈)從細胞內囊泡釋放到目標細胞的細胞質中，因而參與執行整個細胞機制，從而使梭狀芽孢桿菌神經毒素將受質進行蛋白水解切割。來自梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈的HN 區域，長度約為410-430個胺基酸，且包含易位域。研究顯示，來自梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈的HN 區域的完整長度對於易位域的易位活性並非必需。因此，此實施方式的態樣可包括梭狀芽孢桿菌神經毒素HN 區域，其包含具有例如至少350個胺基酸、至少375個胺基酸、至少400個胺基酸及至少425個胺基酸之長度的易位域。此實施方式的其他態樣可包括梭狀芽孢桿菌神經毒素HN 區域，其包含具有例如最多350個胺基酸、最多375個胺基酸、最多400個胺基酸及最多425個胺基酸之長度的易位域。
有關在肉毒桿菌(Clostridium botulinum )和破傷風桿菌(C. tetani )中毒素生產的遺傳基礎上的更詳細說明，請參考Hendersonet al (1997) inThe Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press 。
術語HN 包括天然存在的神經毒素HN 部分，且包括具有在自然界不存在的胺基酸序列及/或具有合成的胺基酸殘基的經修飾HN 部分，只要經修飾HN 部分仍顯示上述易位功能。
或者，該易位域可能為非梭狀芽孢桿菌來源的。非梭狀芽孢桿菌(參考)易位域來源的實例包括但不限於白喉毒素的易位域[O’Keefeet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206；Silvermanet al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532；及London, E. (1992)Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51 ]、假單胞菌(Pseudomonas )外毒素A型的易位域[Prioret al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559]、炭疽毒素的易位域[Blankeet al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442]、各種易位功能的基因融合(fusogenic)或疏水性肽[Planket al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924；及Wagneret al (1992)PNAS, 89, pp.7934-7938 ]及兩親肽(amphiphilic peptide)[Murataet al (1992)Biochem., 31, pp.1986-1992 ]。易位域可反映天然存在的蛋白質中所存在的易位域，或者可包括胺基酸變異，只要該變異不破壞易位域的易位能力。
適用於本發明的病毒(參考)易位域的特定例包括病毒表現之膜融合蛋白的某些易位域。例如，Wagneret al. (1992)及Murataet al . (1992)述及從流感病毒血球凝集素N端區域衍生的數種基因融合和兩親肽的易位(即膜融合和囊泡形成)功能。已知具有所欲之易位活性的其他病毒表現的膜融合蛋白為塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus；SFV)之基因融合肽的易位域、水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的易位域、SER病毒F蛋白的易位域及泡沫病毒(Foamy virus)套膜糖蛋白的易位域。病毒編碼的棘蛋白(Aspike protein)在本發明上下文中具有特殊的應用，例如，SFV的E1蛋白及VSV的G蛋白的G蛋白。
表(如下)所列之(參考)易位域的用途包括其序列變異體的用途。變異體可包含一或多個保留式核酸取代及/或核酸刪除或插入，前提是變異體具有必要的易位功能。變異體亦可包含一或多個胺基酸取代及/或胺基酸刪除或插入，只要該變異體具有必需的易位功能。
易位域來源 胺基酸殘基 參考
白喉毒素 194-380 Silvermanet al . , 1994, J. Biol. Chem. 269, 22524-22532London E ., 1992, Biochem. Biophys. Acta., 1113, 25-51
假單胞菌外毒素之域II 405-613 Prioret al . , 1992, Biochemistry 31, 3555-3559Kihara & Pastan , 1994, Bioconj Chem. 5, 532-538
流感病毒血球凝集素 GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG (SEQ ID NO：73)及其變異體 Planket al . , 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924Wagneret al . , 1992, PNAS, 89, 7934-7938Murataet al . , 1992, Biochemistry 31, 1986-1992
塞姆利基森林病毒 基因融合蛋白 易位域 Kielianet al ., 1996, J Cell Biol. 134(4), 863-872
水皰性口炎病毒糖蛋白G 118-139 Yaoet al ., 2003, Virology 310(2), 319-332
SER病毒F蛋白 易位域 Sethet al ., 2003, J Virol 77(11) 6520-6527
泡沫病毒套膜糖蛋白 易位域 Picard-Maureauet al ., 2003, J Virol. 77(8), 4722-4730
梭狀芽孢桿菌神經毒素 HC 域參考序列之例包括： BoNT/A-N872-L1296 BoNT/B-E859-E1291 BoNT/C1-N867-E1291 BoNT/D-S863-E1276 BoNT/E-R846-K1252 BoNT/F-K865-E1274 BoNT/G-N864-E1297 TeNT-I880-D1315
關於最近鑑定出的BoNT/X，據報導，HC 域對應於其胺基酸893-1306，且該域的邊界可能相差約25個胺基酸(例如868-1306或918-1306)。
本文所述之梭狀芽孢桿菌神經毒素可進一步包含易位輔助域(translocation facilitating domain)。該域輔助遞送非細胞毒性蛋白酶進入目標細胞之細胞質液中，且敘述於例如WO 08/008803及WO 08/008805中，其各藉由引用併入本文。
舉例而言，適當的易位輔助域包括有套膜病毒(enveloped virus)基因融合肽域，例如，適當的基因融合肽域包括流感病毒基因融合肽域(例如，23個胺基酸的A型流感病毒基因融合肽域)、α病毒基因融合肽域(例如26個胺基酸的塞姆利基森林病毒基因融合肽域)、水皰病毒(vesiculovirus)基因融合肽域(例如，21個胺基酸的水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)基因融合肽域)、呼吸道病毒(respirovirus)基因融合肽域(例如，25個胺基酸的仙台病毒(Sendai virus)基因融合肽域)、麻疹病毒(morbillivirus)基因融合肽域(例如，25個胺基酸的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus)基因融合肽域)、禽副黏液病毒(avulavirus)基因融合肽域(例如，25個胺基酸的新城病病毒(Newcastle disease virus)基因融合肽域)、亨尼巴病毒(henipavirus)基因融合肽域(例如，25個胺基酸的亨德拉病毒(Hendra virus)基因融合肽域)、間質肺炎病毒(metapneumovirus)基因融合肽域(例如，25個胺基酸的人類間質肺炎病毒(Human metapneumovirus)基因融合肽域)或泡沫病毒(spumavirus)基因融合肽域，例如猿猴泡沫病毒(simian foamy virus)基因融合肽域；或彼等之片段或變異體。
進一步舉例而言，易位輔助域可包含梭狀芽孢桿菌神經毒素HCN 域或其片段或變異體。更詳細而言，梭狀芽孢桿菌神經毒素HCN 易位輔助域可具有至少200個胺基酸、至少225個胺基酸、至少250個胺基酸、至少275個胺基酸之長度。在這方面，梭狀芽孢桿菌神經毒素HCN 易位輔助域較佳具有最多200個胺基酸、最多225個胺基酸、最多250個胺基酸或最多275個胺基酸之長度。特定的(參考)實例包括： 肉毒桿菌A型神經毒素  -胺基酸殘基(872-1110) 肉毒桿菌B型神經毒素   -胺基酸殘基(859-1097) 肉毒桿菌C型神經毒素   -胺基酸殘基(867-1111) 肉毒桿菌D型神經毒素  -胺基酸殘基(863-1098) 肉毒桿菌E型神經毒素   -胺基酸殘基(846-1085) 肉毒桿菌F型神經毒素   -胺基酸殘基(865-1105) 肉毒桿菌G型神經毒素  -胺基酸殘基(864-1105) 破傷風神經毒素           -胺基酸殘基(880-1127)
上述序列的位置可能根據血清型/亞型而有一些不同，適當的(參考)梭狀芽孢桿菌神經毒素HCN 域的其他實例包括： 肉毒桿菌A型神經毒素  -胺基酸殘基(874-1110) 肉毒桿菌B型神經毒素   -胺基酸殘基(861-1097) 肉毒桿菌C型神經毒素   -胺基酸殘基(869-1111) 肉毒桿菌D型神經毒素  -胺基酸殘基(865-1098) 肉毒桿菌E型神經毒素   -胺基酸殘基(848-1085) 肉毒桿菌F型神經毒素   -胺基酸殘基(867-1105) 肉毒桿菌G型神經毒素  -胺基酸殘基(866-1105) 破傷風神經毒素           -胺基酸殘基(882-1127)
任何上述的輔助域可與適於本發明使用的任何前述易位域肽組合。因此，舉例而言，非梭狀芽孢桿菌輔助域可與非梭狀芽孢桿菌易位域肽或與梭狀芽孢桿菌易位域肽結合。或者，梭狀芽孢桿菌神經毒素HCN 易位輔助域可與非梭狀芽孢桿菌易位域肽結合。或者，梭狀芽孢桿菌神經毒素HCN 輔助域可與梭狀芽孢桿菌易位域肽結合，其之例包括： 肉毒桿菌A型神經毒素  -胺基酸殘基(449-1110) 肉毒桿菌B型神經毒素   -胺基酸殘基(442-1097) 肉毒桿菌C型神經毒素   -胺基酸殘基(450-1111) 肉毒桿菌D型神經毒素  -胺基酸殘基(446-1098) 肉毒桿菌E型神經毒素   -胺基酸殘基(423-1085) 肉毒桿菌F型神經毒素   -胺基酸殘基(440-1105) 肉毒桿菌G型神經毒素  -胺基酸殘基(447-1105) 破傷風神經毒素           -胺基酸殘基(458-1127)
在一些實施方式中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素可缺乏梭狀芽孢桿菌神經毒素之功能性HC 域。因此，該梭狀芽孢桿菌神經毒素在結合分析中並不能結合大鼠突觸體膜(synaptosomal membrane)(藉由梭狀芽孢桿菌HC 成分)，如Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82中所述。在一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素較佳缺乏梭狀芽孢桿菌神經毒素全毒素的最後50個C端胺基酸。在另一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素較佳缺乏梭狀芽孢桿菌神經毒素全毒素的最後100個、較佳為最後150個、更佳為最後200個、特佳為最後250個、及最佳為最後300個C端胺基酸殘基。或者，HC 結合活性可藉由突變誘發而消除/減少-舉例而言，方便起見請參考BoNT/A，在神經節苷脂結合袋(ganglioside binding pocket)中一或二個胺基酸殘基突變(對於L為W1266及對於F為Y1267)的修飾會引起HC 區域失去其之受體結合功能。可對非血清型A梭狀芽孢桿菌肽成分進行類似突變，例如基於具有突變(對於L為W1262及對於F為Y1263)之肉毒桿菌B或肉毒桿菌E (對於L為W1224及對於F為Y1225)的構建體。對於活性位的其他突變可達成HC 受體結合活性的相同消除，例如肉毒桿菌A型毒素中的Y1267S及在其他梭狀芽孢桿菌神經毒素中對應的高度保留的殘基。此突變及其他突變的詳情敘述於Rummel et al (2004) (Molecular Microbiol. 51:631-634)，其藉由引用併入本文。
天然梭狀芽孢桿菌神經毒素的HC 肽包含約400-440個胺基酸殘基，且由兩個功能不同的域組成，每個域約25kDa，即N端區域(通常稱為HCN 肽或域)及C端區域(通常稱為HCC 肽或域)。以下出版物已證實此一事實，其各藉由引用將其全文併入本文中：Umland TC (1997) Nat. Struct. Biol. 4: 788-792；Herreros J (2000) Biochem. J. 347: 199-204；Halpern J (1993) J. Biol. Chem. 268: 15, pp. 11188-11192；Rummel A (2007) PNAS 104: 359-364；Lacey DB (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 898-902；Knapp (1998) Am. Cryst. Assoc. Abstract Papers 25: 90；Swaminathan and Eswaramoorthy (2000) Nat. Struct. Biol. 7: 1751-1759；及Rummel A (2004) Mol. Microbiol. 51(3), 631-643。此外，已有充分的文獻證明，構成C端160-200個胺基酸殘基的C端區域(HCC )負責將梭狀芽孢桿菌神經毒素與其天然細胞受體結合，即結合至神經肌肉會合處的神經末梢-此一事實亦被上述出版物證實。因此，在整個說明書中，參考缺乏功能性重鏈HC 肽(或域)的梭狀芽孢桿菌重鏈，致使該重鏈不能結合至天然梭狀芽孢桿菌神經毒素所結合的細胞表面受體，這意指梭狀芽孢桿菌重鏈僅缺乏功能性HCC 肽。換言之，HCC 肽區域可被部分或全部刪除、或另外修飾(例如通過習知化學或蛋白水解處理)，以使其對神經肌肉會合處的神經末梢的天然結合能力不活化。
因此，在一實施方式中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素HN 肽缺乏梭狀芽孢桿菌神經毒素的部分C端肽部分(HCC )，因此缺乏天然梭狀芽孢桿菌神經毒素之HC 結合功能。舉例而言，在一實施方式中，C端延伸的梭狀芽孢桿菌HN 肽缺乏梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈的C端40個胺基酸殘基、或C端60個胺基酸殘基、或C端80個胺基酸殘基、或C端100個胺基酸殘基、或C端120個胺基酸殘基、或C端140個胺基酸殘基、或C端150個胺基酸殘基或C端160個胺基酸殘基。在另一實施方式中，本發明之梭狀芽孢桿菌HN 肽缺乏梭狀芽孢桿菌神經毒素的整個C端肽部分(HCC )，因此缺乏天然梭狀芽孢桿菌神經毒素之HC 結合功能。舉例而言，在一實施方式中，梭狀芽孢桿菌HN 肽缺乏梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈的C端165個胺基酸殘基、或C端170個胺基酸殘基、或C端175個胺基酸殘基、或C端180個胺基酸殘基、或C端185個胺基酸殘基、或C端190個胺基酸殘基、或C端195個胺基酸殘基。進一步舉例而言，本發明的梭狀芽孢桿菌HN 肽缺乏選自以下所組成群組之梭狀芽孢桿菌HCC 參考序列： 肉毒桿菌A型神經毒素-胺基酸殘基(Y1111-L1296) 肉毒桿菌B型神經毒素-胺基酸殘基(Y1098-E1291) 肉毒桿菌C型神經毒素-胺基酸殘基(Y1112-E1291) 肉毒桿菌D型神經毒素-胺基酸殘基(Y1099-E1276) 肉毒桿菌E型神經毒素-胺基酸殘基(Y1086-K1252) 肉毒桿菌F型神經毒素-胺基酸殘基(Y1106-E1274) 肉毒桿菌G型神經毒素-胺基酸殘基(Y1106-E1297) 破傷風神經毒素-胺基酸殘基(Y1128-D1315)。
上述經鑑定的參考序列應被視為指引，因為根據亞血清型可能會發生一些細微變化。
本發明適用於許多不同種類的梭狀芽孢桿菌神經毒素。因此，在本發明上下文中，術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」包括肉毒桿菌所產生的毒素(肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G、H及X)、破傷風桿菌所產生的毒素(破傷風神經毒素)、酪酸梭菌所產生的毒素(肉毒桿菌神經毒素血清型E)及巴氏梭菌所產生的毒素(肉毒桿菌神經毒素血清型F)，以及經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素或衍生自前述任一者的衍生物。術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」亦包含肉毒桿菌神經毒素血清型H。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素不為BoNT/C1。
肉毒桿菌神經毒素(BoNT)由肉毒桿菌產生，其形式為大型蛋白複合物，由BoNT本身與許多輔助蛋白複合而組成。目前有九種不同類別的肉毒桿菌神經毒素，亦即：肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G、H及X，其全部都具有相似的結構和作用模式。可基於藉由特定中和抗血清的不活化來區分不同的BoNT血清型，而藉由血清型的這種分類與胺基酸層級上的序列一致性百分比相關。根據胺基酸序列一致性百分比，給定的血清型的BoNT蛋白進一步分為不同亞型。
BoNT在胃腸道中被吸收，且進入全身性循環後，結合至膽鹼能神經末梢(cholinergic nerve terminal)的突觸前膜上，並阻止其神經傳導物乙醯膽鹼的釋放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F及BoNT/G切割突觸小泡蛋白(synaptobrevin)/囊泡相關膜蛋白(vesicle-associated membrane protein；VAMP)；BoNT/C1、BoNT/A及BoNT/E切割25 kDa的突觸體相關蛋白(SNAP-25)；而BoNT/C1切割突觸融合蛋白(syntaxin)。BoNT/X已被發現切割SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5、Ykt6及突觸融合蛋白1。
破傷風毒素係由破傷風桿菌產生的單一血清型。酪酸梭菌產生BoNT/E，而巴氏梭菌產生BoNT/F。
術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」亦意圖包括經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素及其衍生物，包括但不限於以下所述者。經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素或衍生物，相較於天然(未經修飾)形式的梭狀芽孢桿菌神經毒素可含有一或多個已被修飾的胺基酸，或可含有一或多個在天然(未經修飾)形式的梭狀芽孢桿菌神經毒素中不存在的被插入的胺基酸。舉例而言，經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素可在相對於天然(未經修飾)梭狀芽孢桿菌神經毒素序列的一或多個域中具有經修飾的胺基酸序列。此類修飾可修飾毒素的功能態樣，例如生物學活性或持久性。因此，在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素為一種工程化經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素，或為一種工程化經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素衍生物，或為一種工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素衍生物。
經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素在重鏈胺基酸序列中可具有一或多個修飾(例如經修飾HC 域)，其中該經修飾的重鏈以高於或低於天然(未經修飾)梭狀芽孢桿菌神經毒素的親和性結合至目標神經細胞。在HC 域的此類修飾可包括在HC 域的神經節苷脂結合位或蛋白質(SV2或突觸結合蛋白(synaptotagmin))結合位中的修飾殘基，其改變與目標神經細胞的神經節苷脂受體及/或蛋白質受體的結合。此類經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素的實例敘述於WO 2006/027207及WO 2006/114308，其二者藉由引用其全文而併入本文中。
經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素在輕鏈胺基酸序列中可具有一或多個修飾，例如受質結合或催化域中的修飾，其可改變或修飾經修飾的L鏈的SNARE蛋白特異性。此類經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素的實例敘述於WO 2010/120766及US 2011/0318385，其二者藉由引用其全文而併入本文中。
經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含一或多個修飾，其增加或降低經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素的生物活性及/或生物持久性。例如，經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含白胺酸系或酪胺酸系模體(motif)，其中該模體增加或減少經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素的生物活性及/或生物持久性。適當的白胺酸系模體包括xDxxxLL (SEQ ID NO：74)、xExxxLL (SEQ ID NO：75)、xExxxIL (SEQ ID NO：76)及xExxxLM (SEQ ID NO：77) (其中x為任何胺基酸)。適當的酪胺酸系模體包括Y-x-x-Hy (SEQ ID NO：78)(其中Hy為疏水性胺基酸)。包含白胺酸系及酪胺酸系模體的經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素的實例敘述於WO 2002/08268，其藉由引用其全文而併入本文中。
術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」意圖包含雜合及嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素。雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素包含來自一種梭狀芽孢桿菌神經毒素或其亞型之輕鏈的至少一部分，及來自另一種梭狀芽孢桿菌神經毒素或梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之重鏈的至少一部分。在一實施方式中，雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素可含有來自一種梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之整個輕鏈及來自另一種梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之整個重鏈。在另一實施方式中，嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素可含有一種梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之重鏈的一部分(例如結合域)及來自另一種梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之重鏈的另一部分。相似地或或者，治療性元件可包含來自不同梭狀芽孢桿菌神經毒素的輕鏈部分。此類雜合體或嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素係有用的，例如作為遞送此類梭狀芽孢桿菌神經毒素治療益處的一種手段，其遞送至對於給定的梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型具有免疫抗性的病患、遞送至對於給定梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈結合域可能具有低於受體平均濃度的病患、或遞送至可能具有膜或囊泡毒素受質(例如SNAP-25、VAMP及突觸融合蛋白)的蛋白酶抗性變異體的病患。雜合及嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素敘述於US 8,071,110，其之公開藉由引用其全文而併入本文中。因此，在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素為一種工程化雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素或一種工程化嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素。
在特佳之實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素為包含來自非BoNT/X梭狀芽孢桿菌神經毒素之至少一個域的BoNT/X(例如BoNT/X雜合體或嵌合體)。
例如，在一實施方式中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素(包含外源性活化圈)可包含： i.     BoNT/X L鏈及非BoNT/X HN 及HC 域； ii.    BoNT/X HN 域及非BoNT/X L鏈及HC 域； iii.   BoNT/X HC 域及非BoNT/X L鏈及HN 域； iv.   BoNT/X L鏈及HN 域及非BoNT/X HC 域； v.    BoNT/X L鏈及HC 域及非BoNT/X HN 域；或 vi.   BoNT/X HN 域及HC 域及非BoNT/X L鏈。
在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/A HC 域。在一實施方式中，含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/A HC 域的本發明工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由包含與SEQ ID NO：6至少70%序列一致性的核苷酸序列所編碼。在一實施方式中，含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/A HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由包含與SEQ ID NO：6至少80%或90%序列一致性的核苷酸序列所編碼。較佳地，含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/A HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由包含SEQ ID NO：6 (更佳為由其所組成)的核苷酸序列所編碼。在一實施方式中，含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/A HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含與SEQ ID NO：7具有至少70%序列一致性的多肽序列。在一實施方式中，含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/A HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含與SEQ ID NO：7具有至少80%或90%序列一致性的多肽序列。較佳地，含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/A HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含如SEQ ID NO：7所示的多肽序列(更佳為由其所組成)。
在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/B HC 域。在一實施方式中，含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/A HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由包含與SEQ ID NO：8至少70%序列一致性的核苷酸序列所編碼。在一實施方式中，含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/A HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由包含與SEQ ID NO：8至少80%或90%序列一致性的核苷酸序列所編碼。較佳地，含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/A HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由包含SEQ ID NO：8 (更佳為由其所組成)的核苷酸序列所編碼。在一實施方式中，含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/A HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含與SEQ ID NO：9具有至少70%序列一致性的多肽序列。在一實施方式中，含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/A HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含與SEQ ID NO：9具有至少80%或90%序列一致性的多肽序列。較佳地，含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/A HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含如SEQ ID NO：9所示的多肽序列(更佳為由其所組成)。
在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/C HC 域。在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/D HC 域。在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/E HC 域。在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/F HC 域。在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/X L鏈及HN 域及BoNT/G HC 域。在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/X L鏈及HN 域及TeNT HC 域。
在一實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素為包含來自非BoNT/A梭狀芽孢桿菌神經毒素的至少一個域的BoNT/A。
例如，在一實施方式中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素(包含外源性活化圈)可包含： i.     BoNT/A L鏈及非BoNT/A HN 及HC 域； ii.    BoNT/A HN 域及非BoNT/A L鏈及HC 域 iii.   BoNT/A HC 域及非BoNT/A L鏈及HN 域； iv.   BoNT/A L鏈及HN 域及非BoNT/A HC 域 v.    BoNT/A L鏈及HC 域及非BoNT/A HN 域；或 vi.   BoNT/A HN 域及HC 域及非BoNT/A L鏈。
在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/A L鏈及HN 域及BoNT/C1 HC 域。在一實施方式中，含BoNT/A L鏈及HN 域及BoNT/C1 HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由包含與SEQ ID NO：12至少70%序列一致性的核苷酸序列所編碼。一實施方式中，含BoNT/A L鏈及HN 域及BoNT/C1 HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由包含與SEQ ID NO：12至少80%或90%序列一致性的核苷酸序列所編碼。較佳地，含BoNT/A L鏈及HN 域及BoNT/C1 HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素係藉由包含SEQ ID NO：12 (更佳為由其所組成)的核苷酸序列所編碼。在一實施方式中，含BoNT/A L鏈及HN 域及BoNT/C1 HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含與SEQ ID NO：13具有至少70%序列一致性的多肽序列。在一實施方式中，含BoNT/A L鏈及HN 域及BoNT/C1 HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含與SEQ ID NO：13具有至少80%或90%序列一致性的多肽序列。較佳地，含BoNT/A L鏈及HN 域及BoNT/C1 HC 域的本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含如SEQ ID NO：13所示的多肽序列(更佳為由其所組成)。
在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/A L鏈及HN 域及BoNT/B HC 域。在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/A L鏈及HN 域及BoNT/D HC 域。在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/A L鏈及HN 域及BoNT/E HC 域。在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/A L鏈及HN 域及BoNT/F HC 域。在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/A L鏈及HN 域及BoNT/G HC 域。在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/A L鏈及HN 域及BoNT/X HC 域。在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/A L鏈及HN 域及TeNT HC 域。
例如，在一實施方式中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素(包含外源性活化圈)可包含： i.     BoNT/B L鏈及非BoNT/B HN 及HC 域； ii.    BoNT/B HN 域及非BoNT/B L鏈及HC 域； iii.   BoNT/B HC 域及非BoNT/B L鏈及HN 域； iv.   BoNT/B L鏈及HN 域及非BoNT/B HC 域； v.    BoNT/B L鏈及HC 域及非BoNT/B HN 域；或 vi.   BoNT/B HN 域及HC 域及非BoNT/B L鏈。
例如，在一實施方式中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素(包含外源性活化圈)可包含： i.     BoNT/D L鏈及非BoNT/XD HN 及HC 域； ii.    BoNT/D HN 域及非BoNT/D L鏈及HC 域； iii.   BoNT/D HC 域及非BoNT/D L鏈及HN 域； iv.   BoNT/D L鏈及HN 域及非BoNT/D HC 域； v.    BoNT/D L鏈及HC 域及非BoNT/D HN 域；或 vi.   BoNT/D HN 域及HC 域及非BoNT/D L鏈。
例如，在一實施方式中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素(包含外源性活化圈)可包含： i.     BoNT/E L鏈及非BoNT/E HN 及HC 域； ii.    BoNT/E HN 域及非BoNT/E L鏈及HC 域； iii.   BoNT/E HC 域及非BoNT/E L鏈及HN 域； iv.   BoNT/E L鏈及HN 域及非BoNT/E HC 域； v.    BoNT/E L鏈及HC 域及非BoNT/E HN 域；或 vi.   BoNT/E HN 域及HC 域及非BoNT/E L鏈。
例如，在一實施方式中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素(包含外源性活化圈)可包含： i.     BoNT/F L鏈及非BoNT/F HN 及HC 域； ii.    BoNT/F HN 域及非BoNT/F L鏈及HC 域； iii.   BoNT/F HC 域及非BoNT/F L鏈及HN 域； iv.   BoNT/F L鏈及HN 域及非BoNT/F HC 域； v.    BoNT/F L鏈及HC 域及非BoNT/F HN 域；或 vi.   BoNT/F HN 域及HC 域及非BoNT/F L鏈。
例如，在一實施方式中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素(包含外源性活化圈)可包含： i.     BoNT/G L鏈及非BoNT/G HN 及HC 域； ii.    BoNT/G HN 域及非BoNT/G L鏈及HC 域； iii.   BoNT/G HC 域及非BoNT/G L鏈及HN 域； iv.   BoNT/G L鏈及HN 域及非BoNT/G HC 域； v.    BoNT/G L鏈及HC 域及非BoNT/G HN 域；或 vi.   BoNT/G HN 域及HC 域及非BoNT/G L鏈。
例如，在一實施方式中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素(包含外源性活化圈)可包含： i.     TeNT L鏈及非TeNT HN 及HC 域； ii.    TeNT HN 域及非TeNT L鏈及HC 域 iii.   TeNT HC 域及非TeNT L鏈及HN 域； iv.   TeNT L鏈及HN 域及非TeNT HC 域 v.    TeNT L鏈及HC 域及非TeNT HN 域；或 vi.   TeNT HN 域及HC 域及非TeNT L鏈。
術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」亦可包含藉由非梭狀芽孢桿菌微生物表現之新發現的肉毒桿菌神經毒素蛋白家族成員，例如腸球菌編碼的毒素，其對於BoNT/X具有最接近的序列一致性；米氏魏氏菌(Weissella oryzae )編碼毒素，稱為BoNT/Wo (NCBI Ref Seq：WP_027699549.1)，其切割VAMP2(在W89-W90)；糞腸球菌(Enterococcus faecium )編碼毒素(GenBank：OTO22244.1)，其切割VAMP2及SNAP25；及皮氏金黃桿菌(Chryseobacterium pipero )編碼毒素(NCBI Ref.Seq：WP_034687872.1)。
術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」意圖包含重靶向的(re-targeted)梭狀芽孢桿菌神經毒素。在重靶向梭狀芽孢桿菌神經毒素中，該梭狀芽孢桿菌神經毒素被修飾成包括被稱為靶向部分(TM)的外源性配體。TM係經選擇以提供對所欲目標細胞的結合特異性，且作為重靶向過程的一部分，可去除梭狀芽孢桿菌神經毒素的天然結合部分(例如HC 域或HCC 域)。重靶向技術被敘述於例如：EP-B-0689459；WO 1994/021300；EP-B-0939818；US 6,461,617；US 7,192,596；WO 1998/007864；EP-B-0826051；US 5,989,545；US 6,395,513；US 6,962,703；WO 1996/033273；EP-B-0996468；US 7,052,702；WO 1999/017806；EP-B-1107794；US 6,632,440；WO 2000/010598；WO 2001/21213；WO 2006/059093；WO 2000/62814；WO 2000/04926；WO 1993/15766；WO 2000/61192；及WO 1999/58571；其全部藉由引用其全文而併入本文中。因此，在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素為一種工程化重靶向梭狀芽孢桿菌神經毒素。本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素可缺乏梭狀芽孢桿菌神經毒素的功能HC 域，且亦缺乏任何功能等效的TM。因此，該多肽缺乏梭狀芽孢桿菌神經毒素的天然結合功能，且在結合分析中無法結合大鼠突觸體膜(藉由梭狀芽孢桿菌HC 成分，或藉由任何功能等效的TM)，如Shoneet al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82中所述。在一實施方式中，TM較佳不為小麥胚芽凝集素(Wheat Germ Agglutinin；WGA)肽。
在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含本文所述之工程化LHN 多肽。
在一實施方式中，工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含本文所述之工程化LHN 多肽及靶向部分(TM)。
參考的工程化LHN 多肽序列在本文中表示為SEQ ID NO：53-60，然而工程化LHN 多肽序列可與SEQ ID NO：53-60之任一者具有至少70%序列一致性。在一實施方式中，工程化LHN 多肽序列可與SEQ ID NO：53-60之任一者具有至少80%或90%序列一致性。較佳地，工程化LHN 多肽序列包含SEQ ID NOs：53-60之任一者(更佳為由其所組成)。
在一實施方式中，TM可包含炭疽毒素保護性抗原(PA)或其片段。PA的參考序列如SEQ ID NO：52所示。在一些實施方式中，PA包含與SEQ ID NO：52具有至少70%序列一致性的多肽序列或其片段。在一些實施方式中，PA包含與SEQ ID NO：52具有至少80%或90%序列一致性的多肽序列或其片段。在另外的實施方式中，PA包含如SEQ ID NO：52所示之多肽序列或其片段(或由其所組成)。
因此，在一實施方式中，本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含：梭狀芽孢桿菌神經毒素非細胞毒性蛋白酶域、梭狀芽孢桿菌神經毒素易位域(例如梭狀芽孢桿菌神經毒素之LHN )及包含PA或其片段之TM。該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含含多肽序列Cys-(Xaa)a -Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b -Cys (SEQ ID NO：1)的外源性活化圈。
因此，在一實施方式中，工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含PA或其片段及LHN /A、LHN /B、LHN /D、LHN /E、LHN /F、LHN /G、LHN /X或LHN /TeNT，其中內源性梭狀芽孢桿菌神經毒素活化圈已被包含多肽序列Cys-(Xaa)a -Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b -Cys (SEQ ID NO：1)的外源性活化圈所置換。
Lys-C並不適合與包含LHN 和PA TM的習知梭狀芽孢桿菌神經毒素一起使用，因為Lys-C水解在該梭狀芽孢桿菌神經毒素的內源性活化圈外的一或多個肽鍵，例如，已發現Lys-C水解在PA TM中的一或多個肽鍵。
因此，在一些實施方式中，工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含PA(或其片段)及： i.     SEQ ID NO：35之胺基酸殘基1-871 ii.    SEQ ID NO：36之胺基酸殘基1-858 iii.   SEQ ID NO：38之胺基酸殘基1-862 iv.   SEQ ID NO：39之胺基酸殘基1-845 v.    SEQ ID NO：40之胺基酸殘基1-864 vi.   SEQ ID NO：41之胺基酸殘基1-863 vii.  SEQ ID NO：42之胺基酸殘基1-879或 viii. SEQ ID NO：33之胺基酸殘基1-924； 其中該內源性梭狀芽孢桿菌神經毒素活化圈已被含多肽序列 Cys-(Xaa)a -Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b -Cys (SEQ ID NO：1)之外源性活化圈所置換。
在一實施方式中，工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素具有一多肽序列，該多肽序列與包含下列之多肽具有至少70%序列一致性： a.SEQ ID NO：52；及 b.SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60。
在一實施方式中，工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素具有一多肽序列，該多肽序列與包含下列之多肽具有至少80%或90%序列一致性： a.SEQ ID NO：52；及 b.SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60。
較佳地，工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素具有包含下列之多肽序列： a.SEQ ID NO：52；及 b.SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60。
在一實施方式中，工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素具有一多肽序列，該多肽序列與包含下列之多肽具有至少70%序列一致性： a.SEQ ID NO：52之片段；及 b.SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60。
在一實施方式中，工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素具有一多肽序列，該多肽序列與包含下列之多肽具有至少80%或90%序列一致性： a.SEQ ID NO：52之片段；及 b.SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60。
較佳地，工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素具有包含下列之多肽序列： a.SEQ ID NO：52之片段；及 b.SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60。
在一實施方式中，PA片段可為PAd1，其位於SEQ ID NO：52之殘基1-258。在一實施方式中，PA片段可為PAd2，其位於SEQ ID NO：52之殘基259-487。在一實施方式中，PA片段可為PAd3，其位於SEQ ID NO：52之殘基488-594。在一實施方式中，PA片段可為PAd4，其位於SEQ ID NO：52之殘基595-735。在其他實施方式中，PA片段可含有PAd1、PAd2、PAd3或PAd4的任何組合。
全長83 kDa PA (PA83)可藉由弗林(furin)或其他類弗林(furin-like)蛋白酶進行蛋白水解加工，因而移除N端片段(PA20)。該63 kDa經加工形式稱為PA63，係PA的可寡聚物形式(oligomerisable form)。
在一實施方式中，PA片段可包含PA63、PAd3-d4、PAd2-d4及PAd4中一或多個(或由其所組成)。
在一實施方式中，PA片段可為PA的C端受體結合域，或其保留與ANTXR2或痛覺受器神經元結合蛋白之結合活性的PA片段(或變異體)。
本發明亦包含具有非天然蛋白酶切割位的梭狀芽孢桿菌神經毒素。在此類梭狀芽孢桿菌神經毒素中，將天然蛋白酶切割位(亦稱為活化位，如上所述)修飾或以對於該梭狀芽孢桿菌神經毒素為非天然的蛋白酶切割位(即，外源性切割位)置換。這樣的位置將會需要外源性蛋白酶進行切割，從而可改良對於切割事件的時間和位置的控制。可使用於梭狀芽孢桿菌神經毒素的非天然蛋白酶切割位包括：
TEV (菸草蝕刻病毒(Tobacco Etch virus)) (ENLYFQ↓G) (SEQ ID NO：79)
凝血酶 (LVPR↓GS) (SEQ ID NO：80)
PreScission (LEVLFQ↓GP) (SEQ ID NO：81)。
額外的蛋白酶切割位包括被非細胞毒性蛋白酶切割的識別序列，例如被梭狀芽孢桿菌神經毒素的輕鏈切割。此等包括被例如梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈的非細胞毒性蛋白酶切割的SNARE(例如SNAP-25、突觸融合蛋白、VAMP)蛋白識別序列。包含非天然蛋白酶切割位的梭狀芽孢桿菌神經毒素敘述於US 7,132,259、EP 1206554-B2及US 2007/0166332，其全部藉由引用其全文而併入本文中。術語蛋白酶切割位亦包括內含肽(intein)，其為一種自切割序列。自剪接反應係可控制的，例如，藉由改變存在的還原劑的濃度。
本發明亦包含含「破壞性切割位(destructive cleavage site)」的梭狀芽孢桿菌神經毒素。在該梭狀芽孢桿菌神經毒素中，非天然蛋白酶切割位被併入梭狀芽孢桿菌神經毒素的所選擇的位置中，如此在該位置的切割將會降低梭狀芽孢桿菌神經毒素的活性或使梭狀芽孢桿菌神經毒素的活性不活化。如果梭狀芽孢桿菌神經毒素在投予後遷移至非目標位置，則破壞性蛋白酶切割位可易於被局部蛋白酶切割。適當的非天然蛋白酶切割位包括上述那些。含破壞性切割位的梭狀芽孢桿菌神經毒素敘述於WO 2010/094905及WO 2002/044199，其二者藉由引用其全文而併入本文中。
本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，特別是其輕鏈成分，可被PEG化-這可能有助於增加穩定性，例如輕鏈成分的作用期間。當輕鏈包含BoNT/A、B或C1蛋白酶時，PEG化係特佳的。PEG化較佳包括添加PEG至輕鏈成分的N端。舉例而言，輕鏈N端可以一或多個相同或不同的胺基酸(例如半胱胺酸)殘基延伸。一或多個該胺基酸殘基可具有連接(例如共價連接)於其自身的PEG分子。此技術的實例敘述於WO2007/104567，藉由引用其全文而併入本文中。
本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素可不包含天然存在的梭狀芽孢桿菌神經毒素複合物中所存在的複合蛋白。
可使用重組核酸技術製造本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素。因此，在一實施方式中，工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素(如上所述)為一種重組工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素。
在另一態樣中，本發明提供一種包含編碼上述工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素的核酸序列的核酸(例如，DNA)。在一實施方式中，該核酸序列被製備成含啟動子及終止子之DNA載體的一部分。
在一較佳實施方式中，該載體具有選自下列之啟動子：
啟動子 誘導劑 典型誘導條件
Tac (雜合體) IPTG 0.2 mM (0.05-2.0mM)
AraBAD L-阿拉伯糖 0.2% (0.002-0.4%)
T7-lac 操作子 IPTG 0.2 mM (0.05-2.0mM)
在另一較佳實施方式中，該載體具有選自下列之啟動子：
啟動子 誘導劑 典型誘導條件
Tac(雜合體) IPTG 0.2 mM (0.05-2.0mM)
AraBAD L-阿拉伯糖 0.2% (0.002-0.4%)
T7-lac 操作子 IPTG 0.2 mM (0.05-2.0mM)
T5-lac 操作子 IPTG 0.2 mM (0.05-2.0mM)
可使用所屬技術領域中已知的任何合適方法製備本發明之核酸分子。因此，該核酸分子可使用化學合成技術製造。或者，本發明的核酸分子可使用分子生物學技術製造。
本發明的DNA構築體較佳以電腦模擬(in silico )設計，然後藉由習知DNA合成技術合成。
根據所使用的最終宿主細胞(例如大腸桿菌)表現系統，為了密碼子偏倚(codon-biasing)，可選擇性地修飾上述核酸序列訊息。
在一態樣中，本發明提供一種編碼本發明之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素的核苷酸序列。該核苷酸序列包含與SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12具有至少70%序列一致性的序列。在一實施方式中，該核苷酸序列包含與SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12具有至少80%或90%序列一致性的序列。較佳地，該核苷酸序列包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12(更佳為由其所組成)。
本發明之核苷酸序列編碼含SEQ ID NO：1之多肽。
在本文中以相同涵意使用術語「核苷酸序列」及「核酸」。較佳地，核苷酸序列為DNA序列。
本發明提供一種製造具有輕鏈及重鏈的單鏈(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素蛋白的方法，該方法包含在適當的宿主細胞中表現本文所述之核酸，溶解宿主細胞以提供含單鏈(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素蛋白的宿主細胞均質物，及分離單鏈(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素蛋白。在一態樣中，本發明提供一種將本發明之(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素進行蛋白水解加工成對應的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素的方法，該方法包含使(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素接觸蛋白酶(較佳為內肽酶，例如腸激酶或Xa因子)，從而製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如其中輕鏈與重鏈藉由雙硫鍵連接在一起)。
因此，本發明提供一種可由本發明之方法獲得的雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素。
本文所使用的術語「可獲得的」亦包含術語「所獲得的」。在一實施方式中，術語「可獲得的」意指所獲得的。
本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素適合在醫藥或化妝品上發現用途。在用途中，梭狀芽孢桿菌神經毒素較佳為雙鏈形式。
本發明之(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素可用於預防或治療某些醫學或美容的疾病和症狀。因此，在另外的態樣中，本發明提供一種如上所述之(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素，用於醫藥。
在一相關態樣中，本發明提供一種如上所述之(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素，用於預防或治療選自下列之疾病或症狀：與非所欲之免疫分泌有關之症狀、斜視、瞼痙攣(blepharospasm)、斜眼、肌張力不全(dystonia)(例如痙攣性肌張力不全、口下頷肌張力不全、局部肌張力不全、遲發性肌張力不全(tardive dystonia)、喉肌張力不全、四肢肌張力不全、頸部肌張力不全)、斜頸(例如痙攣性斜頸)、受益於細胞/肌肉失能的美容療法(美容)應用(藉由SNARE調降(down-regulation)或不活化)、眼球運動(ocular motility)之神經肌肉障礙或症狀(例如共同性斜視(concomitant strabismus)、垂直向斜視(vertical strabismus)、外直肌麻痺、眼球震顫、甲狀腺發育不良性肌病(dysthyroid myopathy))、書寫痙攣(writer's cramp)、瞼痙攣、磨牙、威爾森氏症(Wilson's disease)、震顫、抽搐、節段性肌陣攣(segmental myoclonus)、痙攣、慢性多發性硬化症引起之痙攣狀態、痙攣狀態導致膀胱控制異常、敵意(animus)、背部痙攣、抽筋(charley horse)、緊張性頭痛、提肌骨盆症候群(levator pelvic syndrome)、脊柱裂(spina bifida)、遲發性運動障礙、帕金森氏症(Parkinson's disease)、口吃、半面痙攣、眼瞼障礙、腦性麻痺、局部痙攣狀態、痙攣性結腸炎、神經性膀胱障礙、肛門痙攣(anismus)、四肢痙攣狀態(limb spasticity)、抽搐、震顫、磨牙、肛裂、弛緩不能(achalasia)、吞嚥困難、流淚(lacrimation)、多汗症(hyperhidrosis)、過度流涎、胃腸道分泌過多、肌肉疼痛(例如來自肌肉痙攣的疼痛)、頭痛(例如緊張性頭痛)、抬頭紋(brow furrows)、皮膚皺紋、癌症、子宮病症、泌尿生殖器病症、泌尿生殖器神經障礙、慢性神經性炎症及平滑肌障礙。
當本發明之(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素包含BoNT/X序列(或其之部分)，該梭狀芽孢桿菌神經毒素由於其切割VAMP4、VAMP5及/或Ykt6的能力，而能夠靶向神經元以外之其他類型的分泌細胞。在一些實施方式中，所靶向之分泌細胞為分泌性免疫細胞。本文所使用之「分泌性免疫細胞」係指分泌細胞介素(cytokine)、趨化介素(chemokine)或抗體的免疫細胞。此類分泌性免疫細胞可為先天免疫細胞，該先天免疫細胞包括但不限於天然殺手細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、巨噬細胞、嗜中性球及樹突狀細胞(dendritic cell)。分泌抗體的分泌性免疫細胞(例如白血球)亦可被本揭示的梭狀芽孢桿菌神經毒素所靶向。抗體分泌細胞的非限制性例包括但不限於血漿B細胞、漿細胞、形質細胞及效應B細胞(effector B cell)。在一些實施方式中，梭狀芽孢桿菌神經毒素可調控免疫反應。因此，本文進一步考慮的是本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素的治療用途，用於治療與非所欲之分泌有關的症狀，較佳為非所欲之免疫分泌。與非所欲之分泌有關的症狀包括但不限於：炎症、牛皮癬、過敏、吞噬血色素性淋巴組織細胞增生症(haemophagocytic lymphohistiocytosis)及酒精性胰臟病。
在一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含本發明之(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素或雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素及醫藥可接受的載劑、賦形劑、佐劑、推進劑(propellant)及/或鹽。
本發明之(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素可被調配用於口服、非腸胃道(parenteral)、連續輸注、吸入或局部施用。適於注射的組成物的形式可為溶液、懸浮液或乳液之形式，或可為使用前溶解或懸浮於適當的媒劑(vehicle)中的乾粉之形式。
在被局部遞送的(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素的情況中，(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素可調配成霜劑(例如用於局部施用)或用於皮下注射。
局部的遞送手段可包括氣霧劑(aerosol)或其它噴霧(例如噴霧器(nebuliser))。於此方面，(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素的氣霧劑調配物能夠遞送至肺及/或其他鼻及/或支氣管或氣道通道。
本發明之(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素可藉由鞘內腔注射或硬膜外注射(epidural injection)而投予至病患涉及受影響的器官的神經支配的脊髓節段部位(level of the spinal segment)的脊柱中。
較佳的投予途徑為經由腹腔鏡注射及/或局部注射，特別是肌內注射。
用於投予本發明之(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素的劑量範圍係產生所欲治療效果的劑量範圍。應當理解，所需的劑量範圍取決於(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素或組成物的精確性質、投予途徑、調配物的性質、病患年齡、病患症狀的性質、範圍或嚴重程度、禁忌(若有的話)以及主治醫師的判斷。為了最佳化，可使用標準經驗慣例來調整此等劑量水準的變動。
適當的每日劑量(病患的每公斤體重)之範圍在0.0001-1 ng/kg，較佳為0.0001-0.5 ng/kg，更佳為0.002-0.5 ng/kg，且特佳為0.004-0.5 ng/kg。單位劑量可在低於1皮克(picogram)至30 ng間變化，但通常將會在每劑量0.01至1 ng的範圍內，其可每日投予，或較佳為較低的頻率，例如每週或六個月。
特佳的給藥方案係基於0.05 ng(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素而作為1X (1倍)劑量。在這方面，較佳的劑量範圍為1X–100X (即0.05-5 ng)。
液體劑型通常使用(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素和無熱原的無菌媒劑而製備。依據所用的媒劑和濃度，(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素可溶解或懸浮於媒劑中。在製備溶液時，可將(工程化)梭狀芽孢桿菌神經毒素溶解在媒劑中，如果需要，可藉由添加氯化鈉將溶液作成等張的，且在將溶液灌入適當的無菌小瓶或安瓿中並密封之前，藉由通過使用無菌技術的無菌過濾器之過濾進行滅菌。或者，如果溶液的穩定性足夠，則可藉由高壓滅菌將其密封容器中的溶液進行滅菌。有利地，例如緩衝劑、增溶劑、穩定劑、防腐劑或殺菌劑、懸浮劑或乳化劑及/或局部麻醉劑之添加劑可溶解於媒劑中。
在使用前溶解或懸浮在適當媒劑中的乾粉可藉由使用無菌技術在無菌區域內將預先滅菌的成分填充至無菌容器中來製備。或者，可使用無菌技術在無菌區域內將成分溶解並置入適當的容器中。然後將產品冷凍乾燥，並將容器無菌密封。
適用於肌肉內、皮下或皮內注射的腸胃道外懸浮液，除了無菌成分係以懸浮於無菌媒劑中來代替溶解於無菌媒劑中，且不能藉由過濾完成滅菌之外，以實質上相同的方式製備。成分可在無菌狀態下分離，或者其可在分離後例如藉由γ射線滅菌。
有利的是，在組成物中包括例如聚乙烯吡咯烷酮之懸浮劑以利於成分的均勻分佈。
根據本發明的投予可利用多種遞送技術，包括微粒包封(microparticle encapsulation)、病毒遞送系統或高壓氣霧劑衝擊(high-pressure aerosol impingement)。
與本發明的各種方法有關的實施方式意圖同樣地應用於其他方法、梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素)(無論為單鏈還是雙鏈形式)、用途或醫藥組成物，反之亦然。序列同源性
可使用多種序列比對方法中的任一種來確定一致性百分比，包括但不限於整體法(global method)、局部法和雜合體法，舉例而言，例如區段逼近法(segment approach method)。確定一致性百分比的實驗規程為本領域所屬技術領域中具有通常知識者範疇內的常規程序。整體法從分子的起始到末端比對序列，並藉由累加各個殘基對的分數並藉由施加間隙罰分(gap penalties)來確定最佳比對。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，詳見例如Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)；及疊代細化(iterative refinement)，詳見例如Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996)。局部法藉由鑑定所有輸入序列所共有的一或多個保留式模體來比對序列。非限定之方法包括例如Match-box，詳見例如Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)；吉布斯抽樣(Gibbs sampling)，詳見例如C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131 ) Science 208-214 (1993)；Align-M，詳見例如Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)。
因此，藉由習知方法確定序列一致性百分比。詳見例如Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 and Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992。簡而言之，將兩個胺基酸序列進行比對，以優化比對得分，其使用間隙開放罰分10、間隙延伸罰分1以及Henikoff及Henikoff (ibid.)的「blosum 62」評分矩陣，如下所示(胺基酸藉由標準的單一字母代碼表示)。
兩個以上核酸或胺基酸序列間的「序列一致性百分比」係在序列所共有的相同位置之數目的函數。因此，一致性%可以下述方式計算：相同核苷酸/胺基酸的數目除以核苷酸/胺基酸總數乘以100。序列一致性%的計算亦可考慮到為了最佳化兩個以上序列的比對所需要導入之間隙(gap)的數量、以及各間隙的長度。兩個以上序列之間的序列比較及一致性百分比的確定可使用例如BLAST的特定數學演算法進行，其為具有技術通常知識者所熟悉的。
用於確定序列一致性的比對分數 然後，一致性百分比計算為：
實質上同源的多肽特徵在於具有一或多個胺基酸取代、刪除或添加。這些改變較佳為較小性質，即保留式的胺基酸取代(詳見下文)及不會顯著影響多肽的折疊或活性的其他取代；小刪除，通常刪除1至約30個胺基酸；及小的胺基或羧基末端延伸，例如胺基末端的甲硫胺酸殘基、最多達約20-25個殘基的小型連接肽或親和性標籤。
保留式的胺基酸替代
鹼性： 精胺酸
  離胺酸
  組胺酸
酸性： 麩胺酸
  天冬胺酸
極性： 麩醯胺酸
  天冬醯胺酸
疏水性： 白胺酸
  異白胺酸
  纈胺酸
芳族： 苯丙胺酸
  色胺酸
  酪胺酸
小型： 甘胺酸
  丙胺酸
  絲胺酸
  蘇胺酸
  甲硫胺酸
除了20個標準胺基酸之外，非標準胺基酸(例如4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸及α-甲基絲胺酸)亦可取代本發明的多肽的胺基酸殘基。有限數量的非保留式胺基酸、非由遺傳密碼編碼的胺基酸及非天然胺基酸可取代多肽胺基酸殘基。本發明之多肽亦可包含非天然存在的胺基酸殘基。
非天然存在的胺基酸包括但不限於反-3-甲基脯胺酸、2,4-甲橋-脯胺酸、順-4-羥基脯胺酸、反-4-羥基-脯胺酸、N-甲基甘胺酸、別-蘇胺酸、甲基-蘇胺酸、羥基-乙基半胱胺酸、羥基乙基升-半胱胺酸、硝基-麩醯胺酸、升麩醯胺酸、六氫菸鹼酸、三級白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯基-丙胺酸、4-氮雜苯基-丙胺酸及4-氟苯丙胺酸。在所屬技術領域中已知數種將非天然存在的胺基酸殘基併入蛋白質中的方法。例如，可使用活體外系統，其中使用經化學胺基醯化的壓制型tRNA(suppressor tRNA)而抑制無意義突變(nonsense mutation)。用於合成胺基酸和胺基醯化tRNA的方法為所屬技術領域中所已知的。包含無意義突變的細胞質體的轉錄和轉譯係於無細胞系統中進行，該無細胞系統包含大腸桿菌S30萃取物及可商業上購得的酶和其他試劑。蛋白質可藉由層析純化。詳見例如，Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991；Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991；Chung et al., Science 259:806-9, 1993；及Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993)。在第二種方法中，藉由顯微注射突變的mRNA和經化學胺基醯化的壓制型tRNA，而在爪蟾卵母細胞(Xenopus oocyte)中進行轉譯(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996)。在第三種方法中，在欲替換的天然胺基酸(例如苯丙胺酸)不存在且所欲的非天然存在的胺基酸(例如2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸或4-氟苯丙胺酸)存在下培養大腸桿菌細胞。非天然存在的胺基酸被併入多肽中代替其天然的對應物。詳見Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994。天然存在的胺基酸殘基可藉由活體外化學修飾而轉化為非天然存在的種類。化學修飾可與定點誘變結合以進一步擴大取代範圍(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993)。
有限數量的非保留式的胺基酸、非由遺傳密碼編碼的胺基酸、非天然存在的胺基酸及非天然的胺基酸可取代本發明之多肽的胺基酸殘基。
在本發明多肽中的必須胺基酸可根據所屬技術領域中已知的程序鑑定，例如定點誘變或丙胺酸掃描誘變(alanine-scanning mutagenesis)(Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989)。生物相互作用的位置亦可藉由結合推定的接觸位胺基酸的突變之結構物理分析來確定，例如藉由如核磁共振、結晶學、電子繞射或光親和性標幟(photoaffinity labeling)之技術來確定。詳見例如，de Vos et al., Science 255:306-12, 1992；Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992；Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992。必須胺基酸的一致性亦可從與本發明之多肽的相關成分(例如易位或蛋白酶成分)的同源性分析來推斷。
可使用已知的誘變和篩選方法而進行和測試多個胺基酸取代，例如Reidhaar-Olson與Sauer (Science 241:53-7, 1988)或Bowie與Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)所揭示者。簡而言之，這些作者揭示用於在多肽中同時隨機化二或多個位置，選擇功能性多肽，然後定序誘變的多肽以確定每個位置允許取代的幅度之方法。可使用的其他方法包括噬菌體展示(phage display) (例如Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991；Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409；Huse, WIPO Publication WO 92/06204)及區域定向誘變(region-directed mutagenesis) (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986；Ner et al., DNA 7:127, 1988)。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有如被本揭示所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解的相同含義。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)及Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)提供具有技術通常知識者本揭示所使用的許多術語的通用詞典。
本揭示並不受限於本文所揭示的例示方法及材料，且與本文描述的那些方法或材料相似或等同的任何方法和材料皆可用於本揭示之實施方式的實施或測試中。數字範圍包括定義範圍的數字。除非另有說明，否則任何核酸序列均以5'至3'方向從左至右書寫；胺基酸序列以胺基至羧基的方向從左至右書寫。
本文所提供的標題並非本揭示之各種態樣或實施方式的限制。
胺基酸在本文中使用胺基酸的名稱、三字母縮寫或單字母縮寫來指稱。本文所使用之術語「蛋白」包括蛋白、多肽及肽。本文所使用之術語「胺基酸序列」與術語「多肽」及/或術語「蛋白質」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」與術語「肽」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」與術語「酶」同義。術語「蛋白」和「多肽」在本文可互換使用。在本揭示及申請專利範圍中，可使用用於胺基酸殘基的習知一字母及三字母代碼。胺基酸的三字母代碼，係與IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)一致地定義。亦應理解的是，由於遺傳密碼的簡併性，一種多肽可藉由一種以上的核苷酸序列所編碼。
術語的其他定義可能在整個說明書中出現。在更詳細地描述例示性實施方式之前，應理解本揭示不限於所描述的特定實施方式，並且因此可加以變化。亦應理解，本文中所使用的術語僅出於描述特定實施方式的目的，而並未意圖限制，因為本揭示的範疇僅由後附的申請專利範圍定義。
在提供一數值範圍時，應當理解，除非上下文另有明確指明，否則在該範圍的上限及下限之間的每個居中值(intervening value)至下限單位的十分之一亦被具體揭示。在本揭示中包含「在所述範圍內的任何所述值或居中值」與「所述範圍內的任何其他所述或居中值」之間的每個較小範圍。此等較小範圍的上限及下限可獨立地在該範圍內被包括或排除，且於較小範圍內包含此限值中的任一個、兩個皆不包含或兩個皆包含之每個範圍亦被包括於本揭示內容中，受到於所述範圍內任何明確排除的限制。當於所述範圍包括此限值的一或兩個時，排除彼等所包含的限值之一或兩個的範圍亦包括於本揭示內容。
必須注意於本文及所附申請專利範圍中使用時，單數形式「一」、「一種」、及「該」包括複數的指涉對象，除非上下文另有明確規定。因此，例如，提及「一種梭狀芽孢桿菌神經毒素」包括多種的此種候選藥劑，而提及「該梭狀芽孢桿菌神經毒素」包括提及所屬技術領域中具有通常知識者已知的一或多種梭狀芽孢桿菌神經毒素及其等效物等。
本文中討論的出版物僅提供用於彼等在本申請案之申請日之前的揭示。本文中的任何內容均不應解釋為承認此類出版物構成所附之申請專利範圍的先前技術。
現僅藉由例示的方式，參考下列圖式及實施例來描述本發明之實施方式。
 序列表
在任何以下SEQ ID NO中指示初始Met胺基酸殘基或對應的初始密碼子時，該殘基/密碼子是任選的。
SEQ ID NO：1(C1活化圈共通序列)Cys-(Xaa)a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b-Cys
SEQ ID NO：2(C1活化圈)CHKAIDGRSLYNKTLDC
SEQ ID NO：3(C1活化圈變異體)CHKAIEGRSLYNKTLDC
SEQ ID NO：4(具有C1活化圈之BoNT/X的核苷酸序列)
Figure 108135053-A0305-12-0076-3
SEQ ID NO：5 (具有C1活化圈之BoNT/X的多肽序列) SEQ ID NO：6 (具有C1活化圈之BoNT/XA [LHN X-HC A]的核苷酸序列) SEQ ID NO：7 (具有C1活化圈之BoNT/XA [LHN X-HC A]的多肽序列) SEQ ID NO：8 (具有C1活化圈之BoNT/XB [LHN X-HC B]的核苷酸序列) SEQ ID NO：9 (具有C1活化圈之BoNT/XB [LHN X-HC B]的多肽序列) SEQ ID NO：10 (具有C1活化圈之BoNT/E的核苷酸序列) SEQ ID NO：11(具有C1活化圈之BoNT/E的多肽序列) SEQ ID NO：12(具有C1活化圈之BoNT/A1C1的核苷酸序列) SEQ ID NO：13(具有C1活化圈之BoNT/A1C1的多肽序列) SEQ ID NO：14(BoNT/C1(0)(惰性的(Endonegative))之核苷酸序列) SEQ ID NO：15 (BoNT/C1(0) (惰性的)之多肽序列) SEQ ID NO：16 (BoNT/C1之核苷酸序列) SEQ ID NO：17 (BoNT/C1之多肽序列) SEQ ID NO：18 (腸激酶及Xa因子切割位) SEQ ID NO：19 (腸激酶及Xa因子切割位變異體) SEQ ID NO：20 (BoNT/X活化圈) SEQ ID NO：21 (BoNT/A1 & A6活化圈) SEQ ID NO：22 (BoNT/B2、B3及B6活化圈) SEQ ID NO：23 (BoNT/D活化圈) SEQ ID NO：24 (BoNT/E1至E5、E9及E12活化圈) SEQ ID NO：25 (BoNT/F1及F6活化圈) SEQ ID NO：26 (BoNT/F2及F3活化圈) SEQ ID NO：27 (BoNT/F4活化圈) SEQ ID NO：28 (BoNT/F5活化圈) SEQ ID NO：29 (BoNT/F7活化圈) SEQ ID NO：30 (TeNT活化圈) SEQ ID NO：31 (BoNT/G活化圈) SEQ ID NO：32 (野生型BoNT/X-10HT之核苷酸序列) SEQ ID NO：33 (BoNT/X之多肽序列) SEQ ID NO：34 (野生型BoNT/X-10HT之多肽序列) SEQ ID NO：35 (BoNT/A - UniProt P10845) SEQ ID NO：36 (BoNT/B - UniProt P10844) SEQ ID NO：37 (BoNT/C - UniProt P18640) SEQ ID NO：38 (BoNT/D - UniProt P19321) SEQ ID NO：39 (BoNT/E - UniProt Q00496) SEQ ID NO：40 (BoNT/F - UniProt A7GBG3) SEQ ID NO：41 (BoNT/G - UniProt Q60393) SEQ ID NO：42 (TeNT-UniProt P04958) SEQ ID NO：43(具有EK切割位之LHN /A1的核苷酸序列) SEQ ID NO：44 (具有EK切割位之LHN /A1的多肽序列) SEQ ID NO：45 (具有天然A1圈之BoNT的核苷酸序列) SEQ ID NO：46(具有天然A1圈之BoNT的多肽序列) SEQ ID NO：47(胰蛋白酶之多肽序列) SEQ ID NO：48(Lys-C之多肽序列) SEQ ID NO：49(腸激酶輕鏈之多肽序列) SEQ ID NO：50(Xa因子重鏈之多肽序列) SEQ ID NO：51(Xa因子輕鏈之多肽序列) SEQ ID NO：52(炭疽毒素保護性抗原之多肽序列 - NCBI Ref Seq：NP_ 052806) SEQ ID NO：53 (具有C1活化圈之LHN /A) SEQ ID NO：54(具有C1活化圈之LHN /B) SEQ ID NO：55(具有C1活化圈之LHN /D) SEQ ID NO：56(具有C1活化圈之LHN /E) SEQ ID NO：57(具有C1活化圈之LHN /F) SEQ ID NO：58(具有C1活化圈之LHN /G) SEQ ID NO：59(具有C1活化圈之LHN /TeNT) SEQ ID NO：60 (具有C1活化圈之LHN /X) 實施例 材料及方法 材料
●    5 ml HiTrap 丁基HP (GE#：28411005) ●    5 ml HiTrap Q HP (GE#：17-1154-01) ●    5 ml HiTrap 苯基HP管柱 (GE# 17-5195-01) ●    CHT Type II 管柱 (Biorad# 7324756) ●    TrypZean (Sigma# T3568) ●    Lys-C (Sigma# 000000011047825001) ●    腸激酶，輕鏈 (NEB#P8070) ●    Xa因子(NEB#P8010) ●    ACQUITY UPLC蛋白BEH C4管柱(Waters# 186004495)蛋白質純化
大腸桿菌BL21 (DE3)或NiCo (DE3) (NEB)係用於蛋白質表現。一般而言，將細菌培養於37℃直至誘導，溫度降至16℃，並以1 mM IPTG誘導蛋白質表現隔夜。具有 C1 圈之 BoNT/AC (SEQ ID NO ： 13)
藉由超音波處理，將細菌團塊在胞溶緩衝液(lysis buffer)(50 mM Tris-HCl pH=8)中裂解，並藉由離心澄清。將硫酸銨濃度調整為1.3M，並使用丁基HP樹脂(GE)捕捉目標蛋白。將含有目標蛋白的流份(fraction)脫鹽，並充填至Q HP樹脂(GE)上。將純化的蛋白質在4℃下以6μg/1mg的BoNT Xa因子(NEB)活化隔夜，然後使用苯基HP樹脂(GE)精製。具有 C1 圈之 BoNT/E (SEQ ID NO ： 11)
藉由超音波處理，將細菌團塊在胞溶緩衝液(100mM 磷酸鈉 pH=7.8；100mM NaCl) 中裂解，並藉由離心澄清。將硫酸銨濃度調整為1.25 M，並使用丁基HP樹脂(GE)捕捉目標蛋白。將含有目標蛋白的流份脫鹽，並充填至Q HP樹脂(GE)上。將純化的蛋白質在4℃下以5 μg/1mg的BoNT Xa因子(NEB)或80 U/ml的腸激酶(NEB)活化隔夜，然後使用CHT Type II樹脂(Biorad)精製。BoNT/X (SEQ ID NO ： 5)
藉由超音波處理，將細菌團塊在胞溶緩衝液(50 mM Tris-HCl pH=8, 500mM NaCl)中裂解，並藉由離心澄清。使用HisTrap HP管柱(GE)捕捉目標蛋白。將含有目標蛋白的流份脫鹽，並充填至Q HP樹脂(GE)上。將純化的蛋白質在4℃下以5 μg/1mg的BoNT Xa因子(NEB)或80 U/ml的腸激酶之BoNT (NEB)活化隔夜，然後使用1ml HisTrap管柱(GE)精製。LC/MS
在分析之前，將樣品進行緩衝液交換成50 mM碳酸氫銨。樣品為完整蛋白，或是藉由在37℃與10 mM DTT培養30分鐘而還原者。使用Waters Acquity H-Class UPLC系統結合Waters Xevo G2-XS QToF質譜儀來測試樣品。 ●    移動相A 含0.1%甲酸之水 ●    移動相B 含0.1%甲酸之乙腈 ●    管柱：ACQUITY UPLC蛋白 BEH C4 (Waters)實施例 1 BoNT/C1 活化圈可被多個蛋白酶切割
將不活化型BoNT/C1(0)(SEQ ID NO：15)與一組蛋白酶：胰蛋白酶、Lys-C、腸激酶及Xa因子培養。所有蛋白酶均在活化圈內顯示切割。BoNT/C1 (0) (SEQ ID NO：15)以腸激酶(EK)或Xa因子(FXa)在4℃及25℃消化隔夜。此外，BoNT/C1 (0)以胰蛋白酶在20℃歷經16小時時程消化(圖2A、B)。當與蛋白酶未處理之對照比較時，所有三種蛋白酶可切割BoNT/C1活化圈並產生雙鏈分子。然而，胰蛋白酶和Lys-C消化後可見到額外的切割產物。實施例 2 BoNT/X 蛋白水解活化的特徵和改良
將部分純化的野生型BoNT/X-10HT (SEQ ID NO：34)與增量的胰蛋白酶(TrypZean)及Lys-C以及Xa因子(FXa)及腸激酶(EK)於4℃培養隔夜。
圖3顯示野生型BoNT/X完全被Lys-C(圖3A)和胰蛋白酶(圖3B，泳道12-13及15-17)二者降解。值得注意的是，FXa和EK無法將蛋白質切割成雙鏈形式(圖3B，分別為泳道18及19)。
為了改良BoNT/X的活化，BoNT/X活化圈被產生工程化BoNT蛋白SEQ ID NO：5的BoNT/C1活化圈(SEQ ID NO：2)置換。使用數個層析步驟純化工程化BoNT，並以腸激酶(EK)或Xa因子(FXa)處理，以驗證BoNT/C圈的存在得以產生雙鏈分子。令人驚訝的是，圖4顯示EK和FXa特異地將工程化BoNT/X切割成雙鏈形式。實施例 3 BoNT/E 蛋白水解活化的特徵和改良
以Lys-C及胰蛋白酶(TryZean)切割野生型BoNT/E。圖5A顯示Lys-C不精確地切割/降解BoNT/E。以胰蛋白酶處理導致BoNT/E截短，這意味需要額外的純化步驟以將全長蛋白從截短產物中分離(圖5B)。
為了改良BoNT/E的活化，BoNT/E活化圈被產生工程化BoNT蛋白SEQ ID NO：11的BoNT/C1活化圈(SEQ ID NO：2)置換。使用數個層析步驟純化工程化BoNT，並以腸激酶(EK)或Xa因子(FXa)處理，以驗證BoNT/C圈的存在得以產生雙鏈分子。令人驚訝的是，圖6顯示EK和FXa特異地將工程化BoNT/E切割成雙鏈形式。實施例 4 BoNT/A1C1 嵌合體之蛋白水解活化
將BoNT/C圈導入BoNT/A1C1嵌合體(具有C1 HC 域之LHN /A1)以促進蛋白水解的蛋白活化。將BoNT/A1C1之BoNT/A1活化圈以產生工程化BoNT蛋白SEQ ID NO：13的BoNT/C1圈置換。使用數個層析步驟純化工程化BoNT，並以Xa因子(FXa)處理，以驗證BoNT/C圈的存在得以產生雙鏈分子。圖7A顯示FXa特異性地將工程化BoNT/A1C1切割成雙鏈形式。為了比較，將含A1活化圈的野生型Met BoNT/A1(自MetabiologicsA1080116商業上購得)與FXa及EK培養。圖7B顯示FXa並不能切割A1活化圈，同時EK僅以最小的活性切割，而FXa與EK二者導致形成額外不適當的切割產物(降解產物)。實施例 5 含有 C1 圈的 BoNT 保留 SNARE 切割活性
以含BoNT/C1活化圈之實施例4的BoNT/A1C1(SEQ ID NO：13)及純化的重組BoNT/C1(SEQ ID NO：17)處理大鼠初代皮質神經元24小時。培養後，量測藉由氯化鉀刺激之來自細胞中的SNARE依賴性麩胺酸鹽的釋放(圖8)。這些數據證實被修飾以包括BoNT/C1活化圈的梭狀芽孢桿菌神經毒素的活性。實施例 6 Xa 因子和腸激酶在相同位置 IDGR↓SL 上切割 BoNT/C 活化圈
含有BoNT/C1圈的純化的BoNT/E(SEQ ID NO：11)以腸激酶或Xa因子蛋白酶活化，並與10 mM DTT培養以減少雙硫鍵並分離輕鏈和重鏈。對還原和非還原的工程化BoNT/E(SEQ ID NO：11)樣品進行完整蛋白質質量的液相層析-質譜分析，以繪製兩種蛋白酶的切割位圖譜。兩種蛋白酶均切割BoNT/E以產生相同大小的輕鏈和重鏈，其表示腸激酶和Xa因子均在相同位置切割(表1)。
表 1. 在C圈內IDGR↓SL位置切割後，工程化BoNT/E(SEQ ID NO：11)的預測質量和量測質量的比較。重鏈質量表示腸激酶和Xa因子均在預測位置切割。
預測理論質量 [Da] EK 切割後實測質量 [Da] FXa 切割後實測質量 [Da]
完整的分子 143952 143853 (圖9) 143850 (圖11)
輕鏈 47633 47518 (圖10) 47518 (圖12)
重鏈 96337 96338 (圖10) 96335 (圖 12)
比較實施例 7 將蛋白酶辨識位插入內源性圈
BoNT/C1活化圈係唯一含有針對特定蛋白酶FXa(及令人驚訝的EK)的天然存在的切割位之BoNT活化圈(詳見圖1)。所有其他的圈皆被例如胰蛋白酶或Lys-C的非特異性蛋白酶切割。藉由Lys-C和胰蛋白酶的切割通常導致非所欲之蛋白質截短，因為切割位係由蛋白酶可及性(accessibility)決定而非由特定的識別序列。
來自不同血清型的天然活化圈演變為允許蛋白酶可及性，並藉由梭狀芽胞桿菌將毒素加工成雙鏈形式。不希望受到理論的束縛，據信將這些圈突變以產生蛋白酶辨識位可導致構形變化，其可對切割效率產生負面影響。
為了檢驗該假設，將具有BoNT/A1輕鏈和易位域(LHN /A1)的多肽修飾以包括EK蛋白酶識別序列DDDDK(SEQ ID NO：44)。評估以EK將經修飾的LHN /A1進行蛋白水解切割的效率，並與以Lys-C切割野生型A1活化圈比較(注意，由於野生型圈中並不存在EK辨識位，因此無法直接使用EK進行比較)。圖13顯示經修飾之圈的切割效率遠低於野生型圈。實施例 8 BoNT/XA 嵌合體的蛋白水解活化
製造含BoNT/X的輕鏈和易位域、BoNT/A1的結合域及BoNT/C1活化圈的BoNT/XA嵌合體(SEQ ID NO：7)。圖14顯示以FXa活化後產生工程化BoNT/XA嵌合體的雙鏈形式。 實施例 9 BoNT/XB 嵌合體的蛋白水解活化
製造含BoNT/X之輕鏈和易位域、BoNT/B 結合域及BoNT/C1活化圈的BoNT/XB嵌合體(SEQ ID NO：9)。圖15顯示以FXa活化後產生工程化BoNT/XB嵌合體的雙鏈形式。
以上說明書中提及的所有出版物均藉由引用併入本文。在不脫離本發明的範疇和精神之下，本發明的所描述的方法和系統的各種修飾和變化對所屬技術領域中具有通常知識者而言將為顯而易見的。儘管已結合特定較佳實施方式對本發明進行描述，但應當理解，所請發明不應過度限於此類具體實施方式。實際上，對於生物化學和生物技術或相關技術領域中具有通常知識者而言顯而易見的是，所述用於實施本發明之模式的各種修飾都在以下申請專利範圍的範疇內。
無。
圖 1 顯示所有BoNT血清型和破傷風毒素的活化圈的蛋白質序列之比較，彼等具有形成連接毒素分子之輕鏈及重鏈的雙硫鍵的兩個側翼的半胱胺酸。BoNT/C1及BoNT/CD中的Xa因子切割位(IDGR)以底線標示。圖 2 顯示相較於C-蛋白酶未處理對照，具有切割BoNT/C1活化圈且產生雙鏈分子的能力的所有四種測試蛋白酶：胰蛋白酶(TrypZean)、Lys-C、Xa因子(FXa)及腸激酶(EK)。(A,B ) BoNT/C1(0) (SEQ ID NO：15)以Xa因子(FXa)、腸激酶(EK)及胰蛋白酶處理(1-16小時時程)，如藉由SDS-PAGE在非還原性條件(A )和還原性條件(B )下之測試所示。同樣地，藉由Lys-C的蛋白水解消化產生BoNT/C1的雙鏈分子(C )。胰蛋白酶及Lys-C二者顯示BoNT/C1之重鏈內的脫靶切割(off-target cleavage)。1-基準(BenchMark)(5ul)；2-對照樣本(-LysC)-DTT；3-對照樣本(-LysC) +DTT；4-經活化-DTT；5-經活化 +DTT。圖 3 (A )顯示藉由Lys-C切割BoNT/X。在非還原和還原(+ DTT)條件下測試樣品。1-基準(5ul)；2-無蛋白酶對照；3-LysC 0.125 µg/ml；4-LysC 0.25 µg/ml；5-LysC 0.5 µg/ml；6-LysC 1 µg/ml；7-LysC 2 µg/ml；8-LysC 4 µg/ml；9-無蛋白酶對照 +DTT；10-LysC 0.125 µg/ml +DTT；11-LysC 0.25 µg/ml +DTT；12-LysC 0.5 µg/ml +DTT；13-LysC 1 µg/ml +DTT；14-LysC 2 µg/ml +DTT；15-LysC 4 µg/ml +DTT；及16-基準(5ul)。(B )顯示藉由胰蛋白酶(TrypZean)、Xa因子及腸激酶切割BoNT/X。在非還原和還原(+ DTT)條件下測試樣品。1-基準(5ul)；2-無蛋白酶對照；3-TrypZean 0.125 µg/ml；4-TrypZean 0.25 µg/ml；5-無蛋白酶對照；6-TrypZean 1 µg/ml；7-TrypZean 2 µg/ml；8-TrypZean 4 µg/ml；9-Xa因子 5 µg/ml；10-腸激酶 0.01 µg/ml；11-無蛋白酶對照 +DTT；12-TrypZean 0.125 µg/ml +DTT；13-TrypZean 0.25 µg/ml +DTT；14-無蛋白酶對照 +DTT；15-TrypZean 1 µg/ml +DTT；16-TrypZean 2 µg/ml +DTT；17-TrypZean 4 µg/ml +DTT；18-Xa因子 5 µg/ml；19-腸激酶 0.01 µg/ml；及20-基準(5ul)。圖 4 顯示以指示之蛋白酶處理工程化BoNT/X(SEQ ID NO：5)並成功形成BoNT雙鏈，其藉由非還原(-DTT)和還原(+DTT)條件之間的比較顯而易見。泳道4-7顯示進行中的樣品。泳道8-11顯示最後精製步驟後的最終樣品。1-捕捉HisHP充填；2-對照-DTT-蛋白酶；3-對照+DTT-蛋白酶；4-經活化-DTT+EK；5-經活化+DTT+EK；6-經活化-DTT+FXa；7-經活化+DTT+FXa；8-最終-DTT EK活化；9-最終+DTT EK活化；10-最終-DTT FXa活化；11-最終+DTT FXa活化。圖 5 (A )顯示BoNT/E在37℃以10 µg/ml的來自產酶溶桿菌(Lysobacter enzymogenes )(「Lys-C」)及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )(「rLys-C」)之內蛋白酶Lys-C處理2小時。樣品以非還原和還原(+TCEP)條件進行測試。(B )顯示BoNT/E在-20℃以指示量的胰蛋白酶處理7小時。(C)-樣品儲存於20℃。(T)-於20℃之無蛋白酶對照。樣品於還原(+DTT)條件下測試。圖 6 顯示工程化BoNT/E(SEQ ID NO：11)以指示之蛋白酶處理，並成功形成BoNT雙鏈，其藉由非還原(-DTT)和還原(+DTT)條件之間的比較顯而易見。1-基準(5ul)；2-對照樣品(-EK) -DTT；3-對照樣品 (-EK)+DTT；4-經活化 (+EK) -DTT；5-經活化(+ EK)+DTT；6-基準(5ul)；7-對照樣品 (-FXa)-DTT；8-對照樣品(-FXa)+DTT；9-經活化(+FXa) -DTT；10-經活化(+FXa)+DTT。圖 7 (A )顯示工程化BoNT/A1C1 (SEQ ID NO：13)以Xa因子蛋白酶處理，並成功形成BoNT雙鏈，其藉由非還原(-DTT)和還原(+DTT)條件之間的比較顯而易見。1-基準梯帶；2-對照(-FXa -DTT)；3-對照(-FXa +DTT)；4-經活化(+FXa -DTT)；5-經活化(+FXa +DTT)。(B )顯示以FXa或EK切割2小時後之BoNT/A1與陽性對照(雙鏈BoNT/A1)之比較。圖 8 顯示來自初代大鼠神經元之麩胺酸鹽釋放的BoNT/A1C1及BoNT/C1劑量依賴性抑制。圖 9 顯示藉由具有143853 Da指示質量之腸激酶活化的非還原工程化BoNT/E(SEQ ID NO：11)的完整質量分析。圖 10 顯示藉由具有47518Da及96338Da指示質量之腸激酶活化的還原工程化BoNT/E(SEQ ID NO：11)的完整質量分析。圖 11 顯示藉由具有143850 Da指示質量之Xa因子活化的非還原工程化BoNT/E(SEQ ID NO：11)的完整質量分析。圖 12 顯示藉由具有47518Da及96335Da指示質量之Xa因子活化的還原工程化BoNT/E(SEQ ID NO：11)的完整質量分析。圖 13 顯示含EK切割位之LHN /A1插入活化圈(SEQ ID NO：44)並以EK處理，其係與經Lys-C處理之天然A1圈(SEQ ID NO：46)比較。1-基準(5ul)；2-空的；3-SEQ ID NO：44 +EK –DTT；4-SEQ ID NO：44 +EK +DTT；5-SEQ ID NO：44-EK-DTT；6-SEQ ID NO：44-EK+DTT；7-基準；8-SEQ ID NO：46-LysC-DTT；9-SEQ ID NO：46-LysC-DTT；10-SEQ ID NO：46+LysC-DTT；11-SEQ ID NO：46-LysC+DTT；12-SEQ ID NO：46+LysC+DTT；及13-SEQ ID NO：46-LysC+DTT。
圖14顯示藉由Fxa之工程化BoNT/XA(SEQ ID NO：7)的活化。
圖15顯示藉由Fxa之工程化BoNT/XB(SEQ ID NO：9)的活化。
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無。

Claims (65)

  1. 一種將單鏈工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素進行蛋白水解加工成對應的雙鏈工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法，該方法包含：a.提供該單鏈工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中內源性活化圈已被外源性活化圈置換；及b.使該單鏈工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素與腸激酶或Xa因子接觸；其中該單鏈工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素具有包含多肽序列Cys-(Xaa)a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b-Cys(SEQ ID NO：1)的活化圈，其中a=1-10且b=4-20；其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素不為肉毒桿菌神經毒素C1(BoNT/C1)；且其中腸激酶或Xa因子將該活化圈之肽鍵水解，從而產生該雙鏈工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素。
  2. 如請求項1之方法，其中a=2-4。
  3. 如請求項2之方法，其中a=3。
  4. 如請求項1之方法，其中b=6-10。
  5. 如請求項4之方法，其中b=8。
  6. 如請求項1之方法，其中該活化圈包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少70%序列一致性之多肽序列。
  7. 如請求項6之方法，其中該活化圈包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80%或90%序列一致性之多肽序列。
  8. 如請求項1之方法，其中該活化圈包含具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之多肽序列。
  9. 如請求項1之方法，其中該活化圈包含SEQ ID NO：2。
  10. 如請求項1之方法，其中該活化圈由SEQ ID NO：2組成。
  11. 如請求項1之方法，其中該單鏈工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素係與腸激酶接觸。
  12. 如請求項1之方法，其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素缺乏梭狀芽孢桿菌神經毒素之功能性HC域。
  13. 如請求項1之方法，其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素為含非梭狀芽孢桿菌靶向部分(TM)之重靶向(re-targeted)梭狀芽孢桿菌神經毒素。
  14. 如請求項1之方法，其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素為含TM之重靶向梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該TM包含炭疽毒素保護性抗原(PA)或其片段。
  15. 如請求項14之方法，其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素具有與包含下述的多肽具至少70%序列一致性之多肽序列：a.SEQ ID NO：52或其片段；及b.SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素係選自：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X及TeNT。
  17. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素為BoNT/X、BoNT/E、嵌合BoNT或雜合BoNT。
  18. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該單鏈工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素：a.藉由與SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12具有至少70%序列一致性之核苷酸序列所編碼；或b.包含與SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13具有至少70%序列一致性之多肽序列。
  19. 一種製造工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法，該方法包含：a.鑑定梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素之特徵在於：i.該梭狀芽孢桿菌神經毒素之該內源性活化圈外的肽鍵可藉由胰蛋白酶或Lys-C而水解；及/或ii.該內源性活化圈無法有效地藉由胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解加工；及b.以外源性活化圈置換該內源性活化圈，從而提供該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該外源性活化圈 包含多肽序列Cys-(Xaa)a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b-Cys(SEQ ID NO：1)，其中a=1-10且b=4-20；其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素不為BoNT/C1。
  20. 如請求項19之方法，其中該內源性活化圈為選自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：71之一或多者。
  21. 如請求項19之方法，其中藉由使該梭狀芽孢桿菌神經毒素與胰蛋白酶或Lys-C接觸，並確認該梭狀芽孢桿菌神經毒素之該內源性活化圈外的肽鍵的水解，而鑑定該梭狀芽孢桿菌神經毒素適合使用於該方法。
  22. 如請求項19之方法，其進一步包含使該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素與腸激酶或Xa因子接觸，從而產生對應的雙鏈工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素。
  23. 如請求項19之方法，其中a=2-4。
  24. 如請求項23之方法，其中a=3。
  25. 如請求項19之方法，其中b=6-10。
  26. 如請求項25之方法，其中b=8。
  27. 如請求項19之方法，其中該外源性活化圈包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少70%序列一致性之多肽序列。
  28. 如請求項27之方法，其中該外源性活化圈包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80%或90%序列一致性之多肽序列。
  29. 如請求項19之方法，其中該外源性活化圈包含具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之多肽序列。
  30. 如請求項19之方法，其中該外源性活化圈包含SEQ ID NO：2。
  31. 如請求項19之方法，其中該外源性活化圈由SEQ ID NO：2組成。
  32. 如請求項22之方法，其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素係與腸激酶接觸。
  33. 如請求項19之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素缺乏梭狀芽孢桿菌神經毒素之功能性HC域。
  34. 如請求項19之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素為含非梭狀芽孢桿菌靶向部分(TM)之重靶向梭狀芽孢桿菌神經毒素。
  35. 如請求項19之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素為含TM之重靶向梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該TM包含炭疽毒素保護性抗原(PA)或其片段。
  36. 如請求項35之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素具有與包含下述的多肽具至少70%序列一致性之多肽序列：a.SEQ ID NO：52或其片段；及b.SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60。
  37. 如請求項19至36中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係選自：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X及TeNT。
  38. 如請求項19至36中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素為BoNT/X、BoNT/E、嵌合BoNT或雜合BoNT。
  39. 如請求項19至36中任一項之方法，其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素：a.藉由與SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12具有至少70%序列一致性之核苷酸序列所編碼；或b.包含與SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13具有至少70%序列一致性之多肽序列。
  40. 一種工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中梭狀芽孢桿菌神經毒素之內源性活化圈已被外源性活化圈置換，從而提供該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素， 其中該外源性活化圈包含多肽序列Cys-(Xaa)a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b-Cys(SEQ ID NO：1)，其中a=1-10且b=4-20，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素之特徵在於：該梭狀芽孢桿菌神經毒素之該內源性活化圈外的肽鍵可藉由胰蛋白酶或Lys-C而水解；及/或該內源性活化圈無法有效地藉由胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解加工；且其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素不為BoNT/C1。
  41. 如請求項40之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該內源性活化圈為選自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：71之一或多者。
  42. 如請求項40之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中a=2-4。
  43. 如請求項42之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中a=3。
  44. 如請求項40之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中b=6-10。
  45. 如請求項44之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中b=8。
  46. 如請求項40之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該外源性活化圈包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少70%序列一致性之多肽序列。
  47. 如請求項40之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該外源性活化圈包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80%或90%序列一致性之多肽序列。
  48. 如請求項40之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該外源性活化圈包含具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之多肽序列。
  49. 如請求項40之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該外源性活化圈包含SEQ ID NO：2。
  50. 如請求項40之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該外源性活化圈由SEQ ID NO：2組成。
  51. 如請求項40之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素缺乏梭狀芽孢桿菌神經毒素之功能性HC域。
  52. 如請求項40之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素為含非梭狀芽孢桿菌靶向部分(TM)之重靶向梭狀芽孢桿菌神經毒素。
  53. 如請求項40至52中任一項之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係選自：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X及TeNT。
  54. 如請求項40至52中任一項之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素為BoNT/X、BoNT/E、嵌合BoNT或雜合BoNT。
  55. 如請求項40至52中任一項之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該單鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素：a.藉由與SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12具有至少70%序列一致性之核苷酸序列所編碼；或b.包含與SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13具有至少70%序列一致性之多肽序列。
  56. 如請求項40至52中任一項之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素為含靶向部分(TM)之重靶向梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該TM包含炭疽毒素保護性抗原(PA)或其片段。
  57. 如請求項56之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素具有與包含下述的多肽具至少70%序列一致性之多肽序列：a.SEQ ID NO：52或其片段；及b.SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60。
  58. 一種工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其包含與SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、 SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13具有至少90%序列一致性的多肽序列。
  59. 如請求項58之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13。
  60. 如請求項58之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素為雙鏈工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素。
  61. 一種將如請求項40至59中任一項之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素進行蛋白水解加工成對應的雙鏈工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法，該方法包含使該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素與腸激酶或Xa因子接觸，從而產生雙鏈工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素。
  62. 一種醫藥組成物，其包含如請求項40至60中任一項之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素、以及醫藥可接受的載劑、賦形劑、佐劑、推進劑及/或鹽。
  63. 一種如請求項40至60中任一項之工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項62之醫藥組成物之用途，其用於製造治療下列之一或多者之醫藥：與非所欲之免疫分泌有關之症狀、斜視、瞼痙攣(blepharospasm)、斜眼、肌張力不全(dystonia)、斜頸、受益於細胞/肌肉失能的美容療法(美容)應用(藉由SNARE調降(down-regulation)或不活化)、眼球運動(ocular motility)之神經肌肉障礙或症狀)、書寫痙攣 (writer's cramp)、磨牙、威爾森氏症(Wilson's disease)、震顫、抽搐、節段性肌陣攣(segmental myoclonus)、慢性多發性硬化症引起之痙攣狀態、痙攣狀態導致膀胱控制異常、背部痙攣、抽筋(charley horse)、緊張性頭痛、提肌骨盆症候群(levator pelvic syndrome)、脊柱裂(spina bifida)、遲發性運動障礙、帕金森氏症(Parkinson's disease)、口吃、半面痙攣、眼瞼障礙、腦性麻痺、局部痙攣狀態、痙攣性結腸炎、神經性膀胱障礙、肛門痙攣(anismus)、四肢痙攣狀態(limb spasticity)、肛裂、弛緩不能(achalasia)、吞嚥困難、流淚(lacrimation)、多汗症(hyperhidrosis)、過度流涎、胃腸道分泌過多、肌肉疼痛、頭痛、抬頭紋(brow furrows)、皮膚皺紋、癌症、子宮病症、泌尿生殖器病症、泌尿生殖器神經障礙、慢性神經性炎症及平滑肌障礙。
  64. 如請求項63之用途，其中：a.該肌張力不全為痙攣性肌張力不全、口下頷肌張力不全、局部肌張力不全、遲發性肌張力不全(tardive dystonia)、喉肌張力不全、四肢肌張力不全、頸部肌張力不全；b.該斜頸為痙攣性斜頸；c.該眼球運動之神經肌肉障礙或症狀為共同性斜視(concomitant strabismus)、垂直向斜視(vertical strabismus)、外直肌麻痺、眼球震顫、甲狀腺發育不良性肌病(dysthyroid myopathy)； d.該肌肉疼痛為來自肌肉痙攣的疼痛；或e.該頭痛為緊張性頭痛。
  65. 一種核苷酸序列，其編碼一工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素，該工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素包含與SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12具有至少70%序列一致性之序列。
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