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TWI868189B - 與ｇｐｒｃ５ｄ結合之抗體 - Google Patents

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TWI868189B
TWI868189B TW109125498A TW109125498A TWI868189B TW I868189 B TWI868189 B TW I868189B TW 109125498 A TW109125498 A TW 109125498A TW 109125498 A TW109125498 A TW 109125498A TW I868189 B TWI868189 B TW I868189B
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Abstract

本發明通常涉及與 GPRC5D 結合之抗體，其包括例如用於活化 T 細胞之雙特異性抗原結合分子。此外，本發明涉及編碼此等抗體之多核苷酸，以及包含此等多核苷酸之載體和宿主細胞。本發明進一步涉及用於生產該等抗體之方法，以及涉及將其用於治療疾病之方法。

Description

與　GPRC5D　結合之抗體
本明通常涉及與 GPRC5D 結合之抗體，其包括例如用於活化 T 細胞之雙特異性抗原結合分子。此外，本發明涉及編碼此等抗體之多核苷酸，以及包含此等多核苷酸之載體和宿主細胞。本發明進一步涉及用於生產該等抗體之方法，以及涉及將其用於治療疾病之方法。
多發性骨髓瘤 (MM) 是最常見的血液學惡性腫瘤之一，在歐盟和美國每年有約 75,000 名新患者，其醫療需求仍未得到滿足。多發性骨髓瘤的特徵在於終末分化的漿細胞分泌非功能性單株免疫球蛋白。短期內，諸如來那度胺 (lenalidomide)、泊馬度胺 (pomalidomide) 等免疫調節藥物，以及諸如卡非佐米 (carfilzomib) 或硼替佐米 (bortezomib) 等蛋白酶體抑制劑可能仍是多發性骨髓瘤第一線治療的基幹 (Moreau, P. 及 S.V.Rajkumar, multiple myeloma-translation of trial results into reality.Lancet, 2016.388(10040): p. 111-3)。然而，這些藥物並不能特異性地靶定病變的腫瘤細胞，例如病變的漿細胞 (PC)。已經朝著選擇性地消耗多發性骨髓瘤的漿細胞的方向努力。缺乏特異性標記漿細胞的表面蛋白，阻礙了多發性骨髓瘤的抗體或細胞療法的開發。到目前為止，僅極少數成功的生物製劑案例，其包括達雷木單抗 (daratumumab) (抗 CD38) 和 埃洛妥珠單抗 (elotuzumab) (抗 CD319)，但需要注意的是，這二種分子並非僅由漿細胞表現。因此，利用 RNA 定序從多發性骨髓瘤的漿細胞中發現了新的標的，諸如 G 蛋白偶聯受體 C 類 5 組成員 D (GPRC5D)，其在多發性骨髓瘤的漿細胞相對於健康供體形成的漿細胞中表現不同。業經報導，GPRC5D 與多發性骨髓瘤患者的預後和腫瘤負荷有關 (Atamaniuk, J. 等人，Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma.Eur J Clin Invest, 2012.42(9): p. 953-60；及Cohen, Y. 等人，GPRC5D is a promising marker for monitoring the tumour load and to target multiple myeloma cells.Hematology, 2013.18(6): p. 348-51)。
GPRC5D 是一種孤兒受體，沒有已知的配體，一般而言，在男性中、特別是在癌症中的生物學特性未知。GPRC5D 編碼基因圖譜定位在在染色體 12p13.3 上，其含有 3 個外顯子，橫跨約 9.6 kb (Brauner-Osborne, H. 等人，Cloning and characterization of a human orphan family C G-protein coupled receptor GPRC5D.Biochim Biophys Acta, 2001.1518(3): p. 237-48)。大的第一外顯子編碼七個跨膜域 (seven-transmembrane domain)。業經顯示，GPRC5D 參與動物毛囊中角蛋白的形成 (Gao, Y. 等人，Comparative Transcriptome Analysis of Fetal Skin Reveals Key Genes Related to Hair Follicle Morphogenesis in Cashmere Goats.PLoS One, 2016.11(3): p. e0151118；及 Inoue, S., T. Nambu 及 T. Shimomura, The RAIG family member, GPRC5D, is associated with hard-keratinized structures.J Invest Dermatol, 2004.122(3): p. 565-73)。
WO 2018/017786 A2 揭示 GPRC5D 特異性抗體或抗原結合片段。
鑑於所有的標準照護治療都無法治愈多發性骨髓瘤患者，顯然需要開發有效且特異性的新穎療法。其中一種方法包括結合 GPRC5D 之抗體、特別是結合在標靶細胞上的 GPRC5D 和活化 T 細胞抗原 (諸如 T 細胞上的 CD3) 之雙特異性抗體。當此抗體與其兩者標的同時結合時，將形成 T 細胞突觸，導致 (細胞毒性) T 細胞的活化和隨後標靶細胞的溶裂。
本發明提供新型抗體，其包括特異性結合人 GPRC5D 之雙特異性抗體。特別是，根據本發明的靶向 GPRC5D 之 T 細胞雙特異性抗體具有治療多發性骨髓瘤的效力。
本案發明人開發了結合新型 GPRC5D 抗體的與 GPRC5D 和活化 T 細胞抗原結合之雙特異性抗原結合分子。
本發明之第一方面提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含： a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分 (first antigen binding moiety)，其中，該第一抗原為 GPRC5D，且該第一抗原結合部分包含 (i) 重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 84 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；(ii) 重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 85 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；(iii) 重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；(iv) 重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 96 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；或 (v) 重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 92 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；以及b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，該第二抗原為 CD3，且該第二抗原結合部分包含 (i) 重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 29 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 30 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 31 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 32 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 33 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 34 之 LCDR 3；(i) 重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；或 (ii) 重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 106 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 107 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 108 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 109 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 110 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 111 之 LCDR 3。
在另一實施例中，(i) 該第一抗原結合部分之該 VH 包含與 SEQ ID NO: 13 之序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，並且該第一抗原結合部分之該 VL 包含與 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；或 (ii) 該第一抗原結合部分之該 VH 包含與 SEQ ID NO: 15 之序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，並且該第一抗原結合部分之該 VL 包含與 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；或 (iii) 該第一抗原結合部分之該 VH 包含與 SEQ ID NO: 48 之序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，並且該第一抗原結合部分之該 VL 包含與 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；或 (iv) 其中，該第一抗原結合部分之該 VH 包含與 SEQ ID NO: 49 之序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，且其中，該第一抗原結合部分之該 VL 包含與 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；或 (v) 該第一抗原結合部分之該 VH 包含與 SEQ ID NO: 57 之序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，並且該第一抗原結合部分之該 VL 包含與 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；或 (vi) 該第一抗原結合部分之該 VH 包含與 SEQ ID NO: 58 之序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，且其中，該第一抗原結合部分之該 VL 包含與 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。在另一實施例中，該第二抗原結合部分之該 VH 包含胺基酸序列 (i) 該胺基酸序列與 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同，並且該第二抗原結合部分之該 VL 包含的胺基酸序列與 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；(ii) 該胺基酸序列與 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同，並且該第二抗原結合部分之該 VL 包含的胺基酸序列與 SEQ ID NO: 105 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；或 (iii) 該胺基酸序列與 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同，並且該第二抗原結合部分之該 VL 包含的胺基酸序列與 SEQ ID NO: 113 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同。
在一實施例中，該第一抗原結合部分和/或該第二抗原結合部分為 Fab 分子。這代表該第一抗原結合部分可為 Fab 分子，抑或是該第二抗原結合部分可為 Fab 分子，或者，該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分可為 Fab 分子。在另一實施例中，該第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，該 Fab 輕鏈和該 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1、特別是該變異域 VL 和 VH 為彼此取代。在另一實施例中，該第一抗原結合部分為 Fab 分子，其中，在恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，並且在恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。在另一實施例中，該第一抗原結合部分和該第二抗原結合部分為彼此融合，可選地，為經由胜肽連接子彼此融合。在另一實施例中，該第一抗原結合部分和該第二抗原結合部分各自為 Fab 分子，且其中，(i) 該第二抗原結合部分在該 Fab 重鏈的 C 端與該第一抗原結合部分的該 Fab 重鏈的 N 端融合，或 (ii) 該第一抗原結合部分在該 Fab 重鏈的 C 端與該第二抗原結合部分的該 Fab 重鏈的 N 端融合。在另一實施例中，該雙特異性抗原結合分子復包含第三抗原結合部分。在另一實施例中，該第三抗原結合部分與該第一抗原結合部分相同。在另一實施例中，該雙特異性抗原結合分子復包含由第一次單元和第二次單元所構成之 Fc 域。在另一實施例中，該第一抗原結合部分、該第二抗原結合部分和 (如果存在的) 第三抗原結合部分各自為 Fab 分子；且其中，(i) 該第二抗原結合部分在該 Fab 重鏈的 C 端與該第一抗原結合部分的該 Fab 重鏈的 N 端融合，且該第一抗原結合部分在該 Fab 重鏈的 C 端與該 Fc 域的該第一次單元的 N 端融合，抑或是 (ii) 該第一抗原結合部分在該 Fab 重鏈的 C 端與該第二抗原結合部分的該 Fab 重鏈的 N 端融合，且該第二抗原結合部分在該 Fab 重鏈的 C 端與該 Fc 域的該第一次單元的 N 端融合；且其中，該第三抗原結合部分 (如存在) 在該 Fab 重鏈的 C 端與該 Fc 域的該第二次單元的 N 端融合。在另一實施例中，該 Fc 域為 IgG Fc 域。在另一實施例中，該 Fc 域為 IgG1 Fc 域。在又另一實施例中，該 Fc 域為人 Fc 域。在另一實施例中，該 Fc域的該第一次單元的該 CH3 域中的胺基酸殘基被具有較大側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在該第一次單元的該 CH3 域內產生突起，該突起為可定位在該第二次單元的 CH3 域內的空腔中，並且該 Fc 域的該第二次單元的該 CH3 域中的胺基酸殘基被具有較小側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在該第二次單元的該 CH3 域內產生空腔，該第一次單元的該 CH3 域內的該突起為可定位在該空腔內。在另一實施例中，該 Fc 域包含降低與 Fc 受體的結合和/或效應功能 (effector function) 的一或多個胺基酸取代。
本發明之另一方面提供一種或多種經單離之多核苷酸，其編碼如本文所述之雙特異性抗原結合分子。本發明之又一方面提供一種或多種載體，特別是表現載體，其包含如本文所述之多核苷酸。本發明之另一方面提供一種宿主細胞，其包含如本文所述之多核苷酸或載體。
本發明之另一方面提供一種用於生產與 GPRC5D 結合之雙特異性抗原結合分子之方法，其包含下列步驟：a) 在適合表現該雙特異性抗原結合分子之條件下培養如本文所述之宿主細胞，b) 可選地，回收該雙特異性抗原結合分子。
本發明之另一方面提供一種與 GPRC5D 結合之雙特異性抗原結合分子，其藉由如申請專利範圍第 21 項所述之方法來生產。
本發明之另一方面提供一種醫藥組成物，其包含如本文所述之雙特異性抗原結合分子以及醫藥上可接受之載劑。
本發明之另一方面提供如本文所述之雙特異性抗原結合分子或如本文所述之醫藥組成物，其係用作為藥物。
本發明之另一方面提供如本文所述之雙特異性抗原結合分子或如本文所述之醫藥組成物，其係用於治療疾病。
本發明之另一方面提供如本文所述之雙特異性抗原結合分子或醫藥組成物，其中，該疾病為癌症或自體免疫疾病。
如本發明之另一方面提供如本文所述之雙特異性抗原結合分子或如本文所述之醫藥組成物，其中，該疾病為多發性骨髓瘤。
本發明之又一方面提供一種如本文所述之雙特異性抗原結合分子之用途，其係用於製造治療疾病之藥物。
本發明之另一方面涉及一種治療個體疾病、特別是癌症、更特別是多發性骨髓瘤之方法，其包含將治療有效量之組成物以醫藥上可接受之形式投予該個體，該組成物包含如本文所述之雙特異性抗原結合分子。可替代地，該疾病為自體免疫疾病，諸如全身性紅斑性狼瘡和/或類風濕性關節炎。在任何上述實施例中，該個體較佳的為哺乳動物，特別為人。
定義
定義除非在下文中另外定義，否則本文所用的術語為本技術領域中的一般使用。
如本文中所使用的術語「抗原結合分子」，在其最寬廣意義上係指特異性結合抗原決定位之分子。抗原結合分子之實例為免疫球蛋白及其衍生物 (例如片段)。
術語「雙特異性」意指抗原結合分子能夠特異性結合至少二個不同的抗原決定位。通常，雙特異性抗原結合分子包含二個抗原結合位點，各該抗原結合位點對不同抗原決定位具有特異性。在某些實施例中，該雙特異性抗原結合分子能夠同時結合二個抗原決定位，特別是在二種不同細胞上表現之二個抗原決定位。
如本文中所使用的術語「價數 (valent)」，表示抗原結合分子中存在指定數量之抗原結合位點。因此，術語「單價結合抗原 (monovalent binding to an antigen)」表示抗原結合分子中存在對抗原具有特異性之一個 (且不超過一個) 抗原結合位點。
如本文中所使用的術語「抗原結合部分 (antigen binding moiety)」，係指特異性結合抗原決定位之多肽分子。在一個實施例中，抗原結合部分能夠將其所附著的實體 (例如第二抗原結合部分) 導引至標靶位點，例如導引至載有抗原決定位的特定類型之腫瘤細胞。在另一個實施例中，抗原結合部分能夠藉由其標靶抗原 (例如 T 細胞受體複合體抗原) 活化傳訊。抗原結合部分包括如本文進一步定義的抗體及其片段。特定抗原結合部分包括抗體之抗原結合域，其包含抗體重鏈變異區及抗體輕鏈變異區。在某些實施例中，抗原結合部分可包括如本文進一步定義及本技術中已知之抗體恆定區。可用之重鏈恆定區包括五種同型 (isotype) 中之任一者：α、δ、ε、γ、或 μ。可用之輕鏈恆定區包括二種同型中之任一者：κ 及 λ。
如本文中所使用的術語「抗原決定位 (antigenic determinant)」與「抗原」及「抗原決定基 (epitope)」同義，且係指抗原結合部分結合的多肽大分子上的形成抗原結合部分-抗原複合體之位點 (例如，胺基酸之連續延伸或由非連續胺基酸之不同區域構成的構象構型)。例如，可用之抗原決定位可存在於腫瘤細胞之表面上、受病毒感染之細胞之表面上、其他患病細胞之表面上、免疫細胞的表面上，不存在於血清中，且/或存在於細胞外基質 (ECM) 中。本文稱為抗原的蛋白質 (例如GPRC5D、CD3) 可為源自任何脊椎動物 (包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如人)、非人的靈長類動物 (例如食蟹獼猴) 及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)) 之蛋白質之任何天然形式，除非另有說明。在特定實施例中，該抗原為人蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋「全長」、未處理之蛋白質及由在細胞中處理所產生之任何蛋白質形式。該術語亦涵蓋天然生成之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。適用作抗原之例示性人蛋白質為 CD3，特定言之 CD3 之 ε 次單元 (參見 UniProt 編號 P07766 (第 185 版)、NCBI RefSeq 編號 NP_000724.1，就人序列而言，SEQ ID NO: 40；或 UniProt 編號 Q95LI5 (第69版)、NCBI GenBank 編號 BAB71849.1，就食蟹獼猴序列而言，SEQ ID NO: 41) 或 GPRC5D (參見 UniProt 編號 Q9NZD1 (第 115 版)；NCBI RefSeq 編號 NP_061124.1，就人序列而言，SEQ ID NO: 45)。在某些實施例中，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子結合來自不同物種之 CD3 或 GPRC5D 抗原中保守的 CD3 或 GPRC5D 之表位。在特定實施例中，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子結合人 GPRC5D。
「特異性結合」意指結合對抗原具有選擇性且可區分出非所欲或非特定之相互作用。抗原結合部分結合特異性抗原決定基之能力可藉由酶聯免疫吸附檢定 (ELISA) 或熟習此項技術者熟悉的其他技術，例如表面電漿子共振 (SPR) 技術 (例如於BIAcore儀器上分析) (Liljeblad 等人，Glyco J 17，323-329 (2000)) 及傳統的結合檢定 (Heeley，Endocr Res 28，217-229 (2002)) 來測定。在一個實施例中，抗原結合部分結合不相關的蛋白質之程度小於抗原結合部分結合抗原的約 10%，例如藉由 SPR 測定。在某些實施例中，結合抗原之抗原結合部分或包含該抗原結合部分之抗原結合分子具有≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM 或 ≤ 0.001 nM (例如 10-8 M 或更小，例如 10-8 M 至 10-13 M，例如，10-9 M 至 10-13 M) 之解離常數 (KD )。
「親和力」係指分子 (例如受體) 之單個結合站點與其結合搭配物 (例如配位體) 之間的非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」，係指反映結合對成員 (例如，抗原結合部分及抗原或受體及其配位體) 之間 1:1 相互作用之內在結合親和力。分子 X 對其搭配物 Y 之親和力通常可以解離常數 (KD )表示，其係解離速率常數與結合速率常數 (分別為 koff 及 kon ) 之比。因此，等效親和力可包括不同速率常數，只要速率常數比保持相同即可。可藉由此項技術中已知的既定方法測定親和力，包括彼等本文所述之方法。用於測定親和力之特定方法為表面電漿子共振 (SPR)。
「減少結合」，例如減少結合 Fc 受體，係指 (例如) 藉由 SPR 測得各自相互作用之親和力降低。為清楚起見，該術語亦包括將親和力降低至零 (或低於分析方法的檢測限度)，即相互作用完全廢除。相反，「增加結合」係指各自相互作用之結合親和力增加。
如本文中所使用的「活化 T 細胞抗原 (activating T cell antigen)」，係指在 T 淋巴細胞 (特定言之細胞毒性 T 淋巴細胞) 之表面上表現之抗原決定位，其能夠在與抗原結合分子相互作用時誘導 T 細胞活化。具體言之，抗原結合分子與活化 T 細胞抗原之相互作用可藉由觸發 T 細胞受體複合體之傳訊級聯來誘導 T 細胞活化。在一特定實施例中，該活化 T 細胞抗原為 CD3，特定言之 CD3 之 ε 次單元 (參見 UniProt 編號 P07766 (第 144 版)，NCBI RefSeq 編號 NP_000724.1，就人序列而言，SEQ ID NO: 40；或 UniProt 編號 Q95LI5 (第 49 版)，NCBI GenBank 編號 BAB71849.1，就食蟹獼猴序列而言，SEQ ID NO: 41)。
如本文中所使用的「T 細胞活化」，係指 T 淋巴細胞 (特定言之細胞毒性 T 淋巴細胞) 之一或多種細胞反應，選自：增殖、分化、細胞因子分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標記之表現。測定 T 細胞活化之適宜分析係本技術中已知的並在本文中描述。
如本文中所使用的「標靶細胞抗原 (target cell antigen)」，係指存在於標靶細胞 (例如腫瘤中的細胞，諸如癌細胞或腫瘤基質之細胞) 之表面上之抗原決定位。在一特定實施例中，該標靶細胞抗原為 GPRC5D，特定言之根據 SEQ ID NO: 45 之人 GPRC5D。
如本文中所使用的關於 Fab 分子等的術語「第一」、「第二」或「第三」，係用於方便區分每一類型之部分何時存在多於一個。除非明確說明，否則使用此等術語並非旨在賦予雙特異性抗原結合分子特定之順序或方向。
「融合」意指組分 (例如 Fab 分子及 Fc 域次單元) 經肽鍵直接或經由一或多個肽連接子連接。
「Fab 分子」係指由重鏈 (「Fab 重鏈」)之 VH 及 CH1 域及免疫球蛋白之輕鏈 (「Fab 輕鏈」)之 VL 及 CL 域組成之蛋白質。
「交換型 (crossover)」Fab 分子 (亦稱為「Crossfab」)意指 Fab 分子，其中，Fab 重鏈及輕鏈之變異域或恆定域被交換 (即彼此替換)，即，交換型 Fab 分子包含由輕鏈變異域 VL 及重鏈恆定域 1 CH1 組成之胜肽鏈 (VL-CH1，在 N 端至 C 端方向中)、及由重鏈變異域 VH 及輕鏈恆定域 CL 組成之胜肽鏈 (VH-CL，在 N 端至 C 端方向中)。為清楚起見，在 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之變異域被交換之交換型 Fab 分子中，包含重鏈恆定域 1 CH1 之肽鏈在本文中稱為 (交換型) Fab 分子之「重鏈」。相反地，在 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之恆定域被交換之交換型 Fab 分子中，包含重鏈變異域 VH 之肽鏈在本文中稱為 (交換型) Fab 分子之「重鏈」。
與此相反，「習知」 Fab 分子意指其自然形式 (即包含由重鏈變異域及恆定域組成之重鏈 (VH-CH1，在 N 端至 C 端方向中) 及由輕鏈變異域及恆定域組成之輕鏈 (VL-CL，在 N 端至 C 端方向中))之 Fab 分子。
術語「免疫球蛋白分子 (immunoglobulin molecule)」係指具有天然生成之抗體之結構之蛋白質。例如，IgG 類的免疫球蛋白為約 150,000 道耳頓、由二條輕鏈及二條重鏈經二硫鍵鍵合所構成之異四聚體糖蛋白。從 N 端至 C 端，每條重鏈具有變異域 (VH)，亦稱為重鏈變異域或重鏈變異區，接著係三個恆定域 (CH1、CH2 及 CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，從 N 端至 C 端，每條輕鏈具有變異域 (VL)，亦稱為輕鏈變異域或輕鏈變異區，接著為輕鏈恆定 (CL) 域，亦稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白之重鏈可被歸類為五種類型中的一種，稱為 α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG) 或μ (IgM)，其中一些可進一步分為亞型，例如γ1 (IgG1 )、γ2 (IgG2 )、γ3 (IgG3 )、γ4 (IgG4 )、α1 (IgA1 ) 及 α2 (IgA2 )。基於其恆定域之胺基酸序列，免疫球蛋白之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。免疫球蛋白基本上由經由免疫球蛋白鉸鏈區連接的二個 Fab 分子及一個 Fc 域組成。
本文中的術語「抗體」為在最寬廣意義上使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 (例如雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等展示出所需抗原結合活性即可。
如本文中所使用的術語「單株抗體 (monoclonal antibody)」，係指獲自實質上同源抗體群體之抗體，即群體中包含的個別抗體係相同的且/或結合相同抗原決定基，但不包括 (例如) 含有天然生成之突變或產生於單株抗體製劑生產過程中的可能的變異體抗體，此等變異體通常係以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定基) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，意欲根據本發明使用的單株抗體可藉由多種技術來製造，包括但不限於融合瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體展示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
「經單離之 (isolated)」抗體係與其自然環境之組分分離之分離的抗體，即不在其天然環境中之分離的抗體。不需要特定純化水平。例如，可自其天然或自然環境中移除經單離之抗體。出於本發明之目的，在宿主細胞中表現的重組產生之抗體被視作經單離的，視為係已藉由任何適宜技術分離、分級或部分或實質上純化之天然或重組抗體。因此，本發明之抗體及雙特異性抗原結合分子為經單離的。在一些實施例中，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，藉由 (例如) 電泳 (例如 SDS-PAGE、等電聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 方法測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如 Flatman 等人，J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構之抗體。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括 (但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F (ab')2 、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子 (例如scFv) 及單域抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見 Hudson 等人，Nat Med 9，129-134 (2003)。關於 scFv 片段的綜述，參見例如 Plückthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York，第 269 頁至第 315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894 號及第 5,587,458 號。關於包含補救受體結合抗原決定基殘基且具有增加的體內半衰期之 Fab 及 F(ab')2 片段的論述，參見美國第 5,869,046 號專利。雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點 (其可係二價或雙特異性的) 之抗體片段。參見例如 EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson 等人，Nat Med 9，129-134 (2003)；及 Hollinger 等人，Proc Natl Acad Sci USA 90，6444-6448 (1993)。Hudson 等人，Nat Med 9，129-134 (2003) 中亦描述三功能抗體及四功能抗體。單域抗體為包含抗體之重鏈變異域之全部或部分或抗體之輕鏈變異域之全部或部分之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人單域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham, MA；參見例如美國第 6,248,516 B1 號專利)。抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如大腸桿菌或噬菌體) 之產生。
術語「抗原結合域 (antigen binding domain)」係指抗體之部分，其包含特異性結合抗原之部分或全部且與其互補之區域。抗原結合域可由例如一個或多個抗體變異域 (亦稱為抗體變異區) 提供。特言之，抗原結合域包含抗體輕鏈變異域 (VL) 及抗體重鏈變異域 (VH)。
術語「變異區 (variable region)」或「變異域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之變異域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性框架區 (FR) 及三個高度變異區 (HVR)。參見例如 Kindt 等人，Kuby Immunology，第 6 版，W.H. Freeman and Co.，第 91 頁 (2007)。單個 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。如在本文中結合變異區序列所使用的「Kabat 編號」，係指 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda, MD (1991) 描述的編號系統。
如本文中所使用的重鏈及輕鏈之所有恆定區及域之胺基酸位置，係根據描述於 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991) 的 Kabat 編號系統 (在本文中稱為「根據 Kabat 編號」或「Kabat 編號」) 編號。具體言之，Kabat 編號系統 (參見 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991) 的第 647-660 頁) 係用於卡帕及蘭姆達同型之輕鏈恆定域 CL 及 Kabat 及 EU 索引編號系統 (參見第 661-723 頁) 係用於重鏈恆定域 (CH1、鉸鏈、CH2 及 CH3)，在此情況中，其於本文中藉由參考「根據 Kabat EU 索引編號」進一步闡明。
如本文中所使用的術語「高度變異區 (hypervariable region)」或「HVR」，係指抗體變異域之每個區，其在序列中係高度變異的 (「互補決定區」或「CDR」；重鏈變異區/域之 CDR 縮寫為例如 HCDR1、HCDR2 及 HCDR3；輕鏈變異區/域之 CDR 縮寫為例如 LCDR1、LCDR2 及 LCDR3) 且/或形成結構上限定之環 (「高度變異環」) 且/或含有抗原接觸殘基 (「抗原接觸」)。一般而言，抗體包含六個 HVR；三個在 VH 中 (H1、H2、H3)，及三個在 VL 中 (L1、L2、L3)。在本文中，例示性 HVR 包括： (a)              高度變異環存在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、及 96-101 (H3) 處 (Chothia 及 Lesk，J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)； (b)             CDR 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、及 95-102 (H3)處 (Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda, MD (1991))； (c)              抗原接觸存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、及 93-101 (H3) 處 (MacCallum 等人 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及 (d)             (a)、(b) 及/或 (c) 之組合，包括 HVR 胺基酸殘基 46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、及 94-102 (H3)。
除非另有說明，否則變異域中之 HVR 殘基及其他殘基 (例如 FR 殘基) 在本文中係根據 Kabat 等人 (同前述) 編號。
「框架 (framework)」或「FR」係指除高度變異區 (hypervariable region) (HVR) 殘基之外的變異域殘基。變異域之 FR 通常由四個 FR 域組成：FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，HVR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
「人源化 (humanized)」抗體係指包含來自非人 HVR 之胺基酸殘基及來自人 FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 變異域，其中所有或實質上所有 HVR (例如 CDR) 對應於非人抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人抗體之其等。此等變異域在本文中稱為「人源化變異區 (humanized variable region)」。人源化抗體可選地可包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人源化抗體中的一些 FR 殘基經來自非人抗體 (例如衍生 HVR 殘基之抗體) 之對應殘基取代，以例如恢復或改善抗體特異性或親和力。抗體 (例如非人抗體) 之「人源化形式 (humanized form)」係指已經歷人源化之抗體。本發明所涵蓋的「人源化抗體 (humanized antibody)」之其他形式為其中恆定區已自原始抗體之形式另外修飾或改變者，以產生根據本發明之性質、尤其關於 C1q 結合及/或 Fc 受體 (FcR) 結合之性質。
「人抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。在某些實施例中，人抗體係衍生自非人轉殖基因哺乳動物，例如小鼠、大鼠、或兔。在某些實施例中，人抗體係衍生自融合瘤細胞株。從人抗體庫分離的抗體或抗體片段在本文中亦被視作人抗體或人抗體片段。
抗體或免疫球蛋白之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG、及 IgM，且彼等中的幾種可進一步分為次類 (同型 (isotype))，例如 IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 、及 IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。
本文中的術語「Fc 域」或「Fc 區域」，用於定義包含至少一部分恆定區的免疫球蛋白重鏈的 C 端區域。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異 Fc 區域。儘管 IgG 重鏈之 Fc 區域之邊界可能略有變化，但通常將人 IgG 重鏈之 Fc 區域定義爲從 Cys226 或 Pro230 延伸至該重鏈之羧基端。但是，由宿主細胞產生的抗體可能經歷重鏈 C 端的一種或多種、特別是一種或兩種胺基酸之翻譯後切割。因此，由宿主細胞透過表現編碼全長重鏈的特定核酸分子而產生的抗體可包括全長重鏈，或者可包括全長重鏈的切割變體 (在本文中也稱為「切割變體重鏈」)。重鏈的最後兩個 C 端胺基酸為甘胺酸 (G446) 及離胺酸 (K447，根據 Kabat EU 索引編號)。因此，可以存在或可以不存在 Fc 區域之 C 端離胺酸 (Lys447) 或 C 端甘胺酸 (Gly446) 及離胺酸 (K447)。除非另有說明，否則包括 Fc 域 (或本文定義的 Fc 域的次單元) 之重鏈之胺基酸序列在本文中表示不含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽。在本發明之一個實施例中，根據本發明所述之抗體或雙特異性抗原結合分子中所含之重鏈 (包含本文所指定之 Fc 域之次單元) 包含額外之 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 及 K447，根據 Kabat EU 索引編號)。在本發明之一個實施例中，根據本發明所述之抗體或雙特異性抗原結合分子中所含之重鏈 (包含本文所指定之 Fc 域之次單元) 包含額外之 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 Kabat EU 索引編號)。本發明之組成物，如本文所述之醫藥組成物，包含本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子群。抗體或雙特異性抗原結合分子群可包含具有全長重鏈之分子及具有切割變體重鏈之分子。抗體或雙特異性抗原結合分子群可由具有全長重鏈之分子及具有切割變體重鏈之分子之混合物組成，其中，抗體或雙特異性抗原結合分子之至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80% 或至少 90% 具有切割變體重鏈。在本發明之一個實施例中，包含本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子群之組成物包含抗體或雙特異性抗原結合分子，該抗體或雙特異性抗原結合分子包含重鏈，該重鏈具有本文指定之 Fc 域之次單元及額外之 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 及 K447，根據 Kabat EU 索引編號)。在本發明之一個實施例中，包含本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子群之組成物包含抗體或雙特異性抗原結合分子，該抗體或雙特異性抗原結合分子包含重鏈，該重鏈具有本文指定之 Fc 域之次單元及額外之 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 Kabat EU 索引編號)。在本發明之一個實施例中，此等組成物包含抗體或雙特異性抗原結合分子群，該抗體或雙特異性抗原結合分子群由以下分子組成：包含以下重鏈之分子，該重鏈包含本文所指定之 Fc 域之次單元；包含以下重鏈之分子，該重鏈包含本文所指定之 Fc 域之次單元及額外的 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 Kabat EU 索引編號)；以及包含以下重鏈之分子，該重鏈包含本文所指定之 Fc 域之次單元及額外之 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 和 K447，根據 Kabat EU 索引編號)。除非本文另有說明，否則 Fc 區域或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (也稱為 EU 指數) 進行，如 Kabat 等人所述 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) (另見上文)。如本文中所使用的 Fc 域之「次單元」，係指形成二聚體 Fc 域之兩個多肽之一，即包含能夠穩定自締合之免疫球蛋白重鏈之 C 端恆定區之多肽。例如，IgG Fc 域之次單元包含 IgG CH2 及 IgG CH3 恆定域。
「促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元之締合之修飾」係對胜肽主鏈的操作或對 Fc 域次單元之翻譯後修飾，其減少或阻止包含 Fc 域次單元之多肽與相同多肽之締合形成同型二聚體。本文所用之促進締合之修飾，特別包括對期望締合之兩個 Fc 域次單元 (即 Fc 域之第一次單元及第二次單元) 中的每一個所進行之單獨修飾，其中，該修飾彼此互補，以便促進兩個 Fc 域次單元之締合。例如，促進締合之修飾可改變一個或兩個 Fc 域次單元之結構或電荷，以分別使其在空間或靜電上有利。因此，(雜)二聚化發生在包含第一 Fc 域次單元之多肽與包含第二 Fc 域次單元之多肽之間，其就進一步融合到每個次單元 (例如，抗原結合部分) 的組分而言可能有所不同。在一些實施例中，促進締合之修飾包括 Fc 域中之胺基酸突變，特別是胺基酸取代。在一個特定實施例中，促進締合之修飾包括 Fc 域之兩個次單元的每一個中之單獨的胺基酸突變，特別是胺基酸取代。
術語「效應功能」，係指歸因於抗體的 Fc 區域的那些生物活性，其隨抗體同種型而變化。抗體效應功能的實例包括：C1q 結合及補體依賴性細胞毒性 (CDC)、Fc 受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP)、細胞因子分泌、抗原呈遞細胞攝取之免疫複合物介導抗原、細胞表面受體 (例如，B 細胞受體) 降調及 B 細胞活化。
如本文中所使用的術語「工程改造 (engineer、engineered、engineering)」，被認為包括對胜肽主鏈的任何操作或天然存在的或重組的多肽或其片段的轉譯後修飾。工程改造包括修改胺基酸序列、醣化模式、或單個胺基酸的側鏈基團，以及這些方法的組合。
如本文所用的術語「胺基酸突變」，意指涵蓋胺基酸取代、缺失、插入和修飾。可實施取代、缺失、插入和修飾之任意組合以得到最終構建體，前提條件為最終構建體具有所需之特徵，例如，與 Fc 受體之結合減少或與另一種肽之締合增加。胺基酸序列缺失和插入包括胺基酸之胺基和/或羧基末端之缺失和插入。特定之胺基酸突變為胺基酸取代。為改變例如 Fc 區域之結合特徵，特別優選非保守胺基酸取代，即將一種胺基酸取代爲具有不同結構和/或化學性質之另一種胺基酸。胺基酸取代包括用二十種標準胺基酸之非天然存在之胺基酸或天然存在之胺基酸衍生物 (例如，4-羥基脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥基離胺酸) 取代。可使用本領域中熟知的遺傳或化學方法產生胺基酸突變。遺傳方法可包括定點誘變、PCR、基因合成等。預期透過遺傳工程以外之方法諸如化學修飾改變胺基酸之側鏈基團的方法也可能有用。本文可使用各種名稱指示同一胺基酸突變。例如，Fc 域位置 329 處之脯胺酸取代為甘胺酸，可表示為 329G、G329、G329 、P329G 或 Pro329Gly。
相對於參比多肽序列所述之「百分比 (%) 胺基酸殘基同一性」，是指候選序列中胺基酸殘基與參比多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸百分比序列同一性之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公開可用的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign (DNASTAR) 軟件或 FASTA 程式封裝實現。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何算法。但是，出於本文之目的，使用 FASTA 封裝 36.3.8c 版或更高版本的 ggsearch 程式及 BLOSUM50 比較矩陣來生成 % 胺基酸序列同一性值。FASTA 程式封裝由以下作者開發：W. R. Pearson 及 D. J. Lipman (1988) (“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448)；W. R. Pearson (1996) (“Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227-258)；及 Pearson 等人(1997) (Genomics 46:24-36)，並可從以下網址公開存取：http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml。可替代地，可使用透過 http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi 存取的公用伺服器，使用 ggsearch (global protein:protein) 程式和預設選項 (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2) 比較序列，以確保執行全局而不是局部比對。胺基酸同一性百分比提供於輸出比對標題中。
術語「多核苷酸」，係指經單離之核酸分子或構建體，例如信使 RNA (mRNA)、病毒來源的 RNA 或質體 DNA (pDNA)。多核苷酸可包含習知的磷酸二酯鍵或非習知的鍵 (例如酰胺鍵，諸如肽核酸 (PNA) 中所見)。術語「核酸分子」，係指任何存在於多核苷酸中之一個或多個核酸片段，例如 DNA 或 RNA 片段。
「經單離之」核酸分子或多核苷酸，係指已從其天然環境中分離出之核酸分子 (DNA 或 RNA)。例如，就本發明而言，編碼載體中所含之多肽的重組多核苷酸被視爲是經單離。經單離之多核苷酸之更多實例包括在異源性宿主細胞中保持之重組多核苷酸或溶液中經純化之 (部分或基本上) 多核苷酸。經單離之多核苷酸包括通常包含多核苷酸分子之細胞中所含之多核苷酸分子，但是多核苷酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。經單離之 RNA 分子包括本發明之體內或體外 RNA 轉錄物，以及正鏈和負鏈形式及雙鏈形式。根據本發明之經單離之多核苷酸或核酸進一步包括合成產生之此等分子。此外，多核苷酸或核酸可以為或可以包括調控元件，諸如啟動子、核醣體結合位點或轉錄終止子。
「經單離之多核苷酸 (或核酸) 編碼 [例如本發明之抗體或雙抗體抗原結合分子]」係指編碼抗體重鏈和輕鏈 (或其片段) 之一種或多種多核苷酸分子，包括在單個載體或單獨抗體中之此等多核苷酸分子，並且此等核酸分子存在於宿主細胞中的一個或多個位置。
術語「表達盒」係指重組或合成產生之多核苷酸，其具有一系列允許特定核酸在標靶細胞中轉錄之特定核酸元件。重組表達盒可被引入質體、染色體、粒線體 DNA、色素體 DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表達盒部分除其他序列外還包括待轉錄之核酸序列和啟動子。在某些實施例中，表達盒包含多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段。
術語「載體」或「表現載體」係指用於在細胞中引入並指導與其可操縱地連接的特定基因之表現的 DNA 分子。該術語包括作為自我複制核酸結構之載體以及摻入已引入該宿主細胞的基因組中的載體。本發明之表現載體包含表達盒。表現載體轉錄大量穩定的 mRNA。一旦表現載體進入細胞內部，由基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質即透過細胞轉錄和/或翻譯機制而產生。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表達盒，該表達盒包含多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼本發明的抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」和「宿主細胞培養物」可互換使用，係指已向其中引入外源性核酸的細胞，包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉化細胞中篩選或選擇的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的突變子代細胞。宿主細胞為可用於產生本發明的抗體或雙特異性抗原結合分子的任何類型的細胞系統。宿主細胞包括培養的細胞，例如培養的哺乳動物細胞，諸如 HEK 細胞、CHO 細胞、BHK 細胞、NS0 細胞、SP2/0 細胞、YO 骨髓瘤細胞、P3X63 小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6 細胞或雜交瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和植物細胞等，還包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物或動物組織內的細胞。
「活化 Fc 受體」為在抗體之 Fc 域參與之後引起刺激受體攜帶細胞執行效應功能的信號轉導事件的 Fc 受體。人活化 Fc 受體包括 FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32) 和 FcαRI (CD89)。
抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC) 為一種免疫機制，其導致免疫效應細胞裂解抗體包被的標靶細胞。標靶細胞為抗體或其衍生物包含 Fc 區域的細胞，其通常透過作爲 N 端的蛋白質部分與 Fc 區域結合。如本文中所使用的術語「減少 ADCC」，係指透過上文定義的 ADCC 機制在給定時間內以標靶細胞周圍之培養基中給定濃度的抗體在給定時間內裂解的標靶細胞數量的減少，和/或透過 ADCC 機制在給定時間內實現給定數量的標靶細胞之裂解所需的標靶細胞周圍之培養基中抗體濃度的增加。ADCC 的減少相對於使用相同標準生產、純化、配製和儲存方法 (本技術領域具有通常知識者已知的方法) 由相同類型的宿主細胞所生產的相同抗體 (但尚未工程化) 所介導的 ADCC。例如，由 Fc 域中包含減少 ADCC 的胺基酸取代的抗體所介導的 ADCC 的減少為相對於在 Fc 域中不含此胺基酸取代的相同抗體所介導的 ADCC。用於測量 ADCC 的合適的測定法為本技術領域中熟知的 (參見例如 PCT 公開號 WO 2006/082515 或 PCT 公開號 WO 2012/130831)。
藥劑之「有效量」係指在其所投予的細胞或組織中引起生理變化所需的量。
藥劑例如醫藥組成物的「治療有效量」係指在所需之給藥劑量和時間段內有效實現所需的治療或預防效果的量。治療有效量的藥劑例如消除、減少、延遲、最小化或防止疾病的不利影響。
「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。特別地，個體或受試者為人類。
術語「醫藥組成物」係指以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且不含對組成物將投予之受試者具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥組成物中除對受試者無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩沖劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文中所使用的「治療」(及其語法變體，諸如「治療過程」或「治療中」)，係指試圖改變受治療個體之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。
術語「藥品說明書」用於指涉通常包含在治療性產品的商業包裝中的說明，該說明包含有關使用此等治療性產品的適應症、用法、劑量、給藥途徑、聯合治療、禁忌症和/或警告等資訊。
實施例實施方式
本發明提供了與 GPRC5D、特別是人 GPRC5D 結合之抗體和雙特異性抗原結合分子。此外，該分子具有用於治療應用的其他有利特性，例如關於有效性和/或安全性以及可生產性。
GPRC5D 抗體
本發明的第一方面提供與 GPRC5D 結合之抗體，該抗體包含：(i) 重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 84 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；(ii) 重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 85 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；(iii) 重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；(iv) 重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 96 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；或 (v) 重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 92 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3。
在一些實施例中，抗體為人源化抗體。在一個實施例中，VH 為人源化 VH 和/或 VL 為人源化 VL。在一個實施例中，該抗體包含如上述任一實施例所述的 CDR，並且進一步包含人受體框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一個特定實施例中，(i) VH 包含與 SEQ ID NO: 13 之序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，且 VL 包含與 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；或 (ii) VH 包含與 SEQ ID NO: 15 之序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，且 VL 包含與 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；或 (iii) VH 包含與 SEQ ID NO: 48 之序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，且 VL 包含與 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；或 (iv) VH 包含與 SEQ ID NO: 49 之序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，且 VL 包含與 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；或 (v) VH 包含與 SEQ ID NO: 57 之序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，且 VL 包含與 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；或 (vi) VH 包含與 SEQ ID NO: 58 之序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，且 VL 包含與 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。
在一個特定實施例中，抗體包含：(i) VH，其與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；及 VL，其與 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；或 (ii) VH，其與 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；及 VL，其與 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；或 (iii) VH，其與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；及 VL，其與 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；或 (iv) VH，其與 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；及 VL，其與 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；或 (v) VH，其與 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；及 VL，其與 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；或 (vi) VH，其與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；及 VL，其與 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同。
在另一個實施例中，抗體為 IgG，特別為 IgG1 抗體。在一個實施例中，抗體為全長抗體。在另一個實施例中，抗體為選自 Fv 分子、scFv 分子、Fab 分子和 F(ab')2 分子之抗體片段。在一個實施例中，抗體為多特異性抗體。
在某些實施例中，具有至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 或 VL 序列包含相對於參比序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗體保留與 GPRC5D 結合之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO: 13 中共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入和缺失，和/或 SEQ ID NO: 14 中共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入和缺失，和/或 SEQ ID NO: 15 中共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入和缺失，和/或 SEQ ID NO: 16 中共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入和缺失，和/或 SEQ ID NO: 48 中共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入和缺失，和/或 SEQ ID NO: 53 中共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入和缺失，和/或 SEQ ID NO: 49 中共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入和缺失，和/或 SEQ ID NO: 52 中共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入和缺失，和/或 SEQ ID NO: 57 中共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入和缺失，和/或 SEQ ID NO: 64 中共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入和缺失，和/或 SEQ ID NO: 58 中共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入和缺失，和/或 SEQ ID NO: 63 中共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入和缺失。
在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在 HVR 以外的區域 (即，在 FR 中)。可選地，抗體包含 SEQ ID NO: 13 中之 VH 序列和/或 SEQ ID NO: 14 中之 VL 序列，其包括該序列之翻譯後修飾。可選地，抗體包含 SEQ ID NO: 15 中之 VH 序列和/或 SEQ ID NO: 16 中之 VL 序列，其包括該序列之翻譯後修飾。可選地，抗體包含 SEQ ID NO: 448 中之 VH 序列和/或 SEQ ID NO: 53 中之 VL 序列，其包括該序列之翻譯後修飾。可選地，抗體包含 SEQ ID NO: 49 中之 VH 序列和/或 SEQ ID NO: 52 中之 VL 序列，其包括該序列之翻譯後修飾。可選地，抗體包含 SEQ ID NO: 57 中之 VH 序列和/或 SEQ ID NO: 64 中之 VL 序列，其包括該序列之翻譯後修飾。可選地，抗體包含 SEQ ID NO: 58 中之 VH 序列和/或 SEQ ID NO: 63 中之 VL 序列，其包括該序列之翻譯後修飾。
在一個實施例中，抗體包含：VH，該 VH 包含選自 SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 15 的胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗體包含選自 SEQ ID No: 13 和 SEQ ID No: 12 之 VH 序列以及 SEQ ID No: 16 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，抗體包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，抗體包含 SEQ ID No: 13 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 14 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，抗體包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，抗體包含 SEQ ID No: 15 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 16 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，抗體包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，抗體包含 SEQ ID No: 48 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 53 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，抗體包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，抗體包含 SEQ ID No: 49 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 52 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，抗體包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，抗體包含 SEQ ID No: 57 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 64 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，抗體包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，抗體包含 SEQ ID No: 58 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 63 之 VL 序列。
在一個實施例中，抗體包含人恆定區。在一個實施例中，抗體為包含人恆定區的免疫球蛋白分子，特別為包含人 CH1、CH2、CH3 和/或 CL 域的 IgG 類免疫球蛋白分子。人恆定域的示例性序列在 SEQ ID NO 37 和 38 (分別為人 κ 和 λ CL 域) 以及 SEQ ID NO: 39 (人 IgG1 重鏈恆定域 CH1-CH2-CH3) 中給出。在一些實施例中，抗體包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含與 SEQ ID NO: 37 或 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列、特別是 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含與 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。特別地，如本文所述，重鏈恆定區可在 Fc 域中包含胺基酸突變。
在一個實施例中，抗體為單克隆抗體。
在一個實施例中，抗體為 IgG，特別為 IgG1 抗體。在一個實施例中，抗體為全長抗體。
在一個實施例中，抗體包含 Fc 域，特別是 IgG Fc 域，更特別地是 IgG1 Fc 域。在一個實施例中，Fc 域為人 Fc 域。抗體之 Fc 域可單獨或組合地結合本文中相對於本發明之雙特異性抗原結合分子的 Fc 域所述之任何特徵。
在另一個實施例中，抗體為選自 Fv 分子、scFv 分子、Fab 分子和 F(ab')2 分子、特別是 Fab 分子之抗體片段。在另一個實施例中，抗體片段為雙鏈抗體、三鏈抗體或四鏈抗體。
在另一方面，如以下部分所述，根據以上任一實施例所述之抗體可單獨或組合地結合任何特徵。
糖基化變體
在某些實施例中，改變本文提供的抗體以增加或減少抗體發生糖基化之程度。抗體中添加或缺失糖基化位點可透過改變胺基酸序列以使得產生或去除一個或多個糖基化位點而方便地實現。
當抗體包含 Fc 區域時，可改變與其相連的寡糖。哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含支化的雙天線型寡糖，其通常透過 N 鍵連接至 Fc 區域 CH2 域之 Asn297。參見例如 Wright 等人 TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺 (GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及在雙天線型寡糖結構之「莖」中連接至 GlcNAc 的岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明之抗體中的寡糖進行修飾，以產生具有某些改善之特性的抗體變體。
在一個實施例中，提供了具有非岩藻糖基化寡糖的抗體變體，即缺少 (直接或間接地) 連接至 Fc 區域的岩藻糖的寡糖結構。此等非岩藻糖基化寡糖 (也稱為「去岩藻糖基化」寡糖) 特別在雙天線型寡糖結構的莖中缺少與第一 GlcNAc 連接之岩藻糖殘基的 N-連接寡糖。在一個實施例中，提供了與天然或親本抗體相比在 Fc 區域中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗體變體。例如，非岩藻糖基化寡糖的比例可以為至少約 20%、至少約 40%、至少約 60%、至少約 80% 或甚至約 100% (即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖之百分比是缺少岩藻糖殘基之寡糖相對於連接至 Asn 297 (例如復合物、雜合和高甘露糖結構) 的所有寡糖的總和之 (平均) 量，該百分比透過 MALDI-TOF 質譜法測得，例如 WO 2006/082515 中所述。Asn 297 係指位於 Fc 區域位置 297 附近之天冬酰胺殘基 (Fc 區域殘基的 EU 編號)；但是，Asn297 也可以位於位置 297 上游或下游大約 ±3 個胺基酸處，即由於抗體之微小序列變化而介於位置 294 和 300 之間。此等在 Fc 區域中具有增加的比例的非岩藻糖基化寡糖的抗體可具有改善的 FcγRIIIa 受體結合和/或改善的效應功能，特別是改善的 ADCC 功能。參見例如 US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能夠產生具有減少的岩藻糖基化抗體之細胞系的實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之 Lec13 CHO 細胞 (Ripka 等人， Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；及 WO 2004/056312，尤其是在實例 11 中)；和敲除細胞系，諸如敲除 α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因 FUT8 的 CHO 細胞 (參見例如 Yamane-Ohnuki 等人 Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004)；Kanda, Y. 等人, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及 Wo2003/085107)；或 GDP-岩藻糖合成或轉運蛋白活性降低或消失的細胞 (參見例如 US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一個實施例中，抗體變體被提供有二等分之寡糖，例如，其中連接至抗體之 Fc 區域的雙天線型寡糖被 GlcNAc 平分。此等抗體變體可具有如上文所述之減少的岩藻糖基化和/或改善的 ADCC 功能。此等抗體變體之實例描述於例如：Umana 等人，Nat Biotechnol 17，176-180 (1999)；Ferrara 等人，Biotechn Bioeng 93，851-861 (2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878。
還提供了在寡糖上具有至少一個連接至 Fc 區域之半乳糖殘基的抗體變體。此等抗體變體可具有改善的 CDC 功能。此等抗體變體描述於例如 WO 1997/30087、WO 1998/58964 及 WO 1999/22764 中。
胱胺酸工程化抗體變體
在某些實施例中，可能希望創建胱胺酸工程化抗體，例如「thioMAb」，其中抗體之一個或多個殘基被胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，取代殘基出現在抗體之可進入的位點。透過用胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分 (例如藥物部分或連接子-藥物部分) 綴合，以形成免疫複合體，如本文進一步所述。胱胺酸工程化抗體可按照例如美國專利號 7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130 或 WO2016040856 所屬的方法產生。
抗體衍生物
在某些實施例中，可進一步修飾本文所提供之抗體，以使其包含本技術領域中已知且容易獲得的附加的非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或無規共聚物) 以及右旋糖酐或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，並且可以為支鏈聚合物或非支鏈聚合物。連接至抗體的聚合物之數量可以變化，並且如果連接的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量和/或類型可基於以下考慮因素來確定，這些考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療中等。
在另一個實施例中，提供了可透過暴露於輻射而選擇性加熱之抗體和非蛋白質部分的複合體。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳納米管 (Kam 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。輻射可具有任何波長，並且包括但不限於不損害普通細胞但是將非蛋白質部分加熱至接近抗體-非蛋白質部分的細胞被殺死之溫度的波長。
免疫複合體
本發明還提供了包含如本文所述之抗 GPRC5D 抗體的免疫複合體，其綴合 (化學鍵合) 至一種或多種治療劑，例如細胞毒性劑、化學治療劑、藥物、生長抑製劑、毒素 (例如來源於細菌、真菌、植物或動物之蛋白毒素、酶活性毒素或其片段) 或放射性同位素。
在一個實施例中，免疫複合體為抗體-藥物複合體 (ADC)，其中抗體與上述一種或多種治療劑綴合。通常使用連接子將抗體連接至一種或多種治療劑。ADC 技術概述 (包括治療劑、藥物和連接子之實例) 載於 Pharmacol Review 68:3-19 (2016) 中。
在另一個實施例中，免疫複合體包括綴合至酶活性毒素或其片段的本文所述之抗體，該酶活性毒素或其片段包括但不限於白喉 A 鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素 A 鏈 (來源於銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白 A 鏈、相思子毒素 A 鏈、莫迪素 A 鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陸蛋白 (PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜抑制因子、薑黃素、巴豆毒素、肥皂草抑製劑、白樹毒素、米托菌素、局限曲菌素、酚黴素、伊諾黴素和單端孢黴烯族毒素。
在另一個實施例中，免疫複合體包含綴合至放射性原子以形成放射性複合體的本文所述之抗體。在另一個實施例中，多種放射性同位素可用於產生放射性複合體。實例包括 At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212、P32 、Pb212 和 Lu 的放射性同位素。當放射性複合體用於檢測時，它可能包含用於閃爍顯像研究之放射性原子，例如 tc99m 或 I123，或用於核磁共振 (NMR) 成像 (也稱為磁共振成像，mri) 之自旋標記物，例如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體和細胞毒性劑之複合體可使用多種雙功能蛋白偶聯劑進行製備，該雙功能蛋白偶聯劑例如 N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯 (SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯 (SMCC)、亞胺基硫烷 (IT)、亞胺基酸酯的雙功能衍生物 (例如己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯 (例如雙琥珀酰亞胺辛二酸)、醛 (例如戊二醛)、雙疊氮化合物 (例如雙(對疊氮基苯甲酰基)己二胺)、雙重氮衍生物 (例如雙-(對重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二異氰酸酯 (例如甲苯 2,6-二異氰酸酯) 和雙活性氟化合物 (例如 1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按照 Vitetta 等人 (Science 238:1098 (1987)) 所述的方法進行製備。用於將放射性核苷酸綴合至抗體的一種示例性螯合劑為碳-14 標記的 1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)。參見 WO94/11026。連接子可以為促進細胞中細胞毒性藥物釋放的「可切割連接子」。例如，可使用酸不穩定之連接子、對肽酶敏感之連接子、光不穩定之連接基、二甲基連接子或含二硫鍵之連接子 (Chari 等人，Cancer Res. 52:127-131 (1992)；美國第 5,208,020 號專利)。
本文之免疫複合體或 ADC 明確考慮但不限於此等用交聯劑製得之複合體，該交聯劑包括但不限於可商購獲得 (例如從 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL., U.S.A) 商購獲得) 之 BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC 和磺基-SMPB 以及 SVSB (琥珀酰亞胺基-(4-乙烯碸)苯甲酸酯)。
多特異性抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點 (即不同抗原上之不同抗原決定基或同一抗原上之不同抗原決定基) 具有結合特異性的單克隆抗體。在某些實施例中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。在某些實施例中，結合特異性之一為對 GPRC5D 的結合特異性，而其他 (兩種或更多種) 特異性則為針對任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至 GPRC5D 的兩個 (或更多個) 不同抗原決定基。多特異性 (例如，雙特異性) 抗體也可用於將細胞毒性劑或細胞定位於表現 GPRC5D 之細胞。多特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。
用於製備多特異性抗體之技術包括但不限於重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對 (參見 Milstein 和 Cuello，Nature 305: 537 (1983)) 和「杵臼」(knob-in-hole) 工程 (參見例如美國專利號 5,731,168，及 Atwell 等人 J. Mol. Biol. 270:26 (1997))。多特異性抗體也可透過以下方法進行製備：用於製備抗體 Fc-異二聚體分子的工程靜電轉向效應 (參見例如 WO 2009/089004)；交聯兩個或更多個抗體或片段 (參見例如美國專利號 4,676,980；及 Brennan 等人，Science，229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體 (參見例如，Kostelny 等人，J. Immunol.，148(5):1547-1553 (1992)；及 WO 2011/034605)；使用常用輕鏈技術規避輕鏈錯配問題 (參見例如 WO 98/50431)；使用「雙抗體」技術製備雙特異性抗體片段 (參見例如，Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90:6444-6448 (1993))；以及使用單鏈 Fv (sFv) 二聚體 (參見例如 Gruber 等人，J. Immunol.，152:5368 (1994))；以及按照例如 Tutt 等人 J. Immunol. 147: 60 (1991) 所述之方法製備三特異性抗體。
本文還包括具有三個或更多個抗原結合位點之工程化抗體，包括例如「章魚抗體」(Octopus antibodies) 或 DVD-Ig (參見例如 WO 2001/77342 及 WO 2008/024715)。具有三個或更多個抗原結合位點之多特異性抗體的其他實例可參見 WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792 及 WO 2013/026831 中。雙特異性抗體或其抗原結合片段還包括「雙重作用 FAb」或「DAF」，其包含與 GPRC5D 以及另一種不同抗原或 GPRC5D 的兩個不同抗原決定基結合之抗原結合位點 (參見例如 US 2008/0069820 及 WO 2015/095539)。
多特異性抗體也可提供為不對稱形式，其包含在一個或多個具有相同抗原特異性之結合臂中交叉的域，即透過交換 VH/VL 域 (參見例如 WO 2009/080252 及 WO 2015/150447)、CH1/CL 域 (參見例如 WO 2009/080253) 或完整的 Fab 臂 (參見例如 WO 2009/080251、WO 2016/016299，另見 Schaefer 等人，PNAS，108 (2011) 1187-1191，及 Klein 等人，MAbs 8 (2016) 1010-20) 實現。還可透過將帶電荷或不帶電荷之胺基酸突變引入域界面引導正確 Fab 配對，從而設計不對稱之 Fab 臂。參見例如 WO 2016/172485。
用於多特異性抗體之各種其他分子形式為本技術領域中已知的並且包括在本文中 (參見例如 Spiess 等人，Mol Immunol 67 (2015) 95-106)。
還包括於本文中的特定類型之多特異性抗體為雙特異性抗體，該雙特異性抗體被設計為同時結合至標靶細胞 (例如腫瘤細胞) 上之表面抗原以及 T 細胞受體 (TCR) 之活化不變組分 (例如CD3) 複合物，用於重定向 T 細胞以殺死標靶細胞。因此，在某些實施例中，本文中提供之抗體為多特異性抗體，特別為雙特異性抗體，其中，結合特異性之一針對 GPRC5D，且另一種結合特異性則針對 CD3。
可用於此目的之雙特異性抗體形式包括但不限於所謂「BiTE」(bispecific T cell engager) 分子，其中，兩個 scFv 分子透過柔性連接子融合 (參見例如 WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261 及 WO2008/119567；Nagorsen 和 Bäuerle，Exp Cell Res 317，1255-1260 (2011))；雙抗體 (Holliger 等人，Prot Eng 9，299-305 (1996)) 及其衍生物，諸如串聯雙抗體 (“TandAb”；Kipriyanov 等人，J Mol Biol 293，41-56 (1999))；「DART」(雙親和性重定位) 分子，其基於雙抗體形式，但具有 C 端二硫鍵以供進一步穩定 (Johnson 等人，J Mol Biol 399，436-449 (2010))，以及所謂 triomab，它們為完整的小鼠/大鼠 IgG 雜合分子 (參見 Seimetz 等人的綜述：Cancer Treat Rev 36，458-467 (2010))。本文所包括之特定 T 細胞雙特異性抗體形式描述於：WO 2013/026833；WO2013/026839；WO 2016/020309；及 Bacac 等人 Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498。
與 GPRC5D 和第二抗原結合之雙特異性抗原結合分子
本發明還提供了一種雙特異性抗原結合分子，即包含至少兩個能夠與兩種不同抗原決定位 (第一抗原和第二抗原) 特異性結合之抗原結合部分的抗原結合分子。
根據本發明之特定實施例，包含在雙特異性抗原結合分子中之抗原結合部分為 Fab 分子 (即，由重鏈和輕鏈組成之抗原結合域，其中每一個均包含變異域和恆定域)。在一個實施例中，第一抗原結合部分和/或第二抗原結合部分為 Fab 分子。在一個實施例中，所述 Fab 分子為人 Fab 分子。在一個特定實施例中，所述 Fab 分子為人源化分子。在另一個實施例中，所述 Fab 分子包含人重鏈及輕鏈恆定域。
較佳地，抗原結合部分中之至少一個為交叉 Fab 分子。此等修飾減少了來自不同 Fab 分子之重鏈及輕鏈的錯配，從而提高重組生產本發明之雙特異性抗原結合分子的產率和純度。在用於本發明之雙特異性抗原結合分子的特定交叉 Fab 分子中，交換了 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈 (分別為 VL 和 VH) 的變異域。但是，即使采用此域交換，由於錯配之重鏈和輕鏈之間的所謂 Bence Jones 型相互作用，雙特異性抗原結合分子的製備也可能包含某些副產物 (參見 Schaefer 等人，PNAS，108 (2011) 11187-11191)。為進一步減少來自不同 Fab 分子之重鏈和輕鏈的錯配，從而提高所需之雙特異性抗原結合分子的純度和產率，可在與第一抗原 (GPRC5D) 結合之 Fab 分子或與第二抗原 (例如活化 T 細胞抗原注入 CD3) 結合之 Fab 分子的 CH1 和 CL 域中特定之胺基酸位置引入帶相反電荷的胺基酸，如本文中進一步所述。可在雙特異性抗原結合分子中包含的習知 Fab 分子 (例如圖 1 A-C、G-J 所示) 或在 VH/VL 交叉 Fab 分子中包含的習知 Fab 分子 (例如圖 1 D-F、K-N 所示) 中 (但不是兩者兼有) 進行電荷修飾。在特定實施例中，在雙特異性抗原結合分子中包含的習知 Fab 分子中進行電荷修飾 (在特定實施例中，其與第一抗原即 GPRC5D 結合)。
在根據本發明的一個特定實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時與第一抗原 (即GPRC5D) 和第二抗原 (例如活化 T 細胞抗原，特別是 CD3) 結合。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠透過同時結合 GPRC5D 及活化 T 細胞抗原以使 T 細胞與標靶細胞交聯。在更具體的實施例中，此等同時結合導致標靶細胞、特別是表現 GPRC5D 之腫瘤細胞裂解。在一個實施例中，此等同時結合導致 T 細胞活化。在其他實施例中，此等同時結合導致 T 淋巴細胞、特別是細胞毒性 T 淋巴細胞之細胞回應，該細胞回應選自：增殖、分化、細胞因子分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標記物之表現。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子與活化 T 細胞抗原、特別是 CD3 結合，而非同時與 GPRC5D 結合，並不導致 T 細胞活化。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠將 T 細胞之細胞毒活性重定向至標靶細胞。在一個特定實施例中，所述重定向不依賴於標靶細胞之 MHC 介導的肽抗原呈遞和/或 T 細胞之特異性。
特別地，根據本發明之任何實施例的 T 細胞為細胞毒性 T 細胞。在一些實施例中，T 細胞為 CD4+ 或 CD8+ 細胞，特別為 CD8+ T 細胞。
第一抗原結合部分
本發明之雙特異性抗原結合分子包含至少一個與 GPRC5D (第一抗原) 結合之抗原結合部分 (特別是 Fab 分子)。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合部分，其特別是與 GPRC5D 結合的Fab 分子。在一個特定的此等實施例中，這些抗原結合部分中之每一個與相同之抗原決定位結合。在更具體的實施例中，所有這些抗原結合部分均相同，即它們包含相同之胺基酸序列，該胺基酸序列包括如本文所述之 CH1 和 CL 域中之相同的胺基酸取代 (如果有的話)。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子包含不超過兩個抗原結合部分，其特別是與 GPRC5D 結合的Fab 分子。
在特定實施例中，與 GPRC5D 結合之抗原結合部分為習知 Fab 分子。在此等實施例中，與第二抗原結合之抗原結合部分為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之變異域 VH 及 VL 或恆定域 CH1 及 CL 彼此交換/替換的 Fab 分子。
在替代實施例中，與 GPRC5D 結合之抗原結合部分為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之變異域 VH 及 VL 或恆定域 CH1 及 CL 彼此交換/替換的 Fab 分子。在此等實施例中，與第二抗原結合之抗原結合部分為習知 Fab 分子。
GPRC5D 結合部分能夠將雙特異性抗原結合分子導向標靶位點，例如導向表現 GPRC5D 的特定類型之腫瘤細胞。
除非在科學上明顯不合理或不可能，否則雙特異性抗原結合分子之第一抗原結合部分可單獨或組合結合本文相對於與 GPRC5D 結合之抗體所述的任何特徵。
因此，本發明之一個方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，該雙特異性抗原結合分子包含：(a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，該第一抗原為 GPRC5D，並且該第一抗原結合部分包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 84 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；以及 (b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分。本發明之另一方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，該雙特異性抗原結合分子包含：(a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，該第一抗原為 GPRC5D，並且該第一抗原結合部分包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 85 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；以及 (b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分。本發明之另一方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，該雙特異性抗原結合分子包含：(a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，該第一抗原為 GPRC5D，並且該第一抗原結合部分包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；以及 (b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分。本發明之另一方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，該雙特異性抗原結合分子包含：(a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，該第一抗原為 GPRC5D，並且該第一抗原結合部分包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 96 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；以及 (b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分。本發明之另一方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，該雙特異性抗原結合分子包含：(a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，該第一抗原為 GPRC5D，並且該第一抗原結合部分包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 92 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；以及 (b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分。本發明之另一方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，該雙特異性抗原結合分子包含：(a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，該第一抗原為 GPRC5D，並且該第一抗原結合部分包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 1 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 2 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 3 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 4 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 5 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 6 之 LCDR 3；以及 (b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分。本發明之另一方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，該雙特異性抗原結合分子包含：(a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，該第一抗原為 GPRC5D，並且該第一抗原結合部分包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 7 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 8 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 9 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；以及 (b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分。
在一些實施例中，第一抗原結合部分為 (來源於) 人源化抗體。在一個實施例中，VH 為人源化 VH 和/或 VL 為人源化 VL。在一個實施例中，第一抗原結合部分包含如上述任一實施例所述的 CDR，並且進一步包含人受體框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一個實施例中，第一抗原結合部分之 VH 包含與選自 SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57 和 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列，並且第一抗原結合部分之 VL 包含與選自 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63 和 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。
在一個實施例中，第一抗原結合部分包含與選自 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57 和 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VH 序列，以及與選自 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63 和 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VL 序列。
在一個實施例中，第一抗原結合部分包含：VH，其包含選自 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57 和 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL，其包含選自 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63 和 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。
在一個實施例中，第一抗原結合部分包含選自 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57 和 SEQ ID NO: 58 之 VH 序列以及選自 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63 和 SEQ ID NO: 64 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含 SEQ ID No: 13 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 14 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含 SEQ ID No: 15 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 16 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含 SEQ ID No: 48 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 53 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含 SEQ ID No: 49 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 52 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含 SEQ ID No: 57 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 64 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含 SEQ ID No: 58 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 63 之 VL 序列。在一個實施例中，第一抗原結合部分包含人恆定區。在一個實施例中，第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含人恆定區，特別是人 CH1 和/或 CL 域。人恆定域的示例性序列在 SEQ ID NO 37 和 38 (分別為人 κ 和 λ CL 域) 以及 SEQ ID NO: 39 (人 IgG1 重鏈恆定域 CH1-CH2-CH3) 中給出。在一些實施例中，第一抗原結合部分包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含與 SEQ ID NO: 37 或 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列、特別是 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。特別地，輕鏈恆定區可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變，和/或可在交叉 Fab 分子中包含一個或多個 (特別是兩個) N 端胺基酸之缺失或取代。在一些實施例中，第一抗原結合部分包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含與包含在 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列中的 CH1 域序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。特別地，重鏈恆定區 (特別是 CH1 域) 可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變。
第二抗原結合部分
本發明之雙特異性抗原結合分子包含至少一個抗原結合部分，特別是與第二抗原 (不同於 GPRC5D) 結合之 Fab 分子。
在特定實施例中，與第二抗原結合之抗原結合部分為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之變異域 VH 及 VL 或恆定域 CH1 及 CL 彼此交換/替換的 Fab 分子。在此類實施例中，與第一抗原 (即 GPRC5D) 結合之抗原結合部分優選為常規 Fab 分子。在其中存在一個以上與雙特異性抗原結合分子中包含之 GPRC5D 結合的抗原結合部分特別是 Fab 分子之實施例中，與第二抗原結合之抗原結合部分較佳的為交叉 Fab 分子，並且與 GPRC5D 結合之抗原結合部分為習知 Fab 分子。
在替代實施例中，與第二抗原結合之抗原結合部分為習知 Fab 分子。在此等實施例中，與第一抗原 (即 GPRC5D) 結合之抗原結合部分為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之變異域 VH 及 VL 或恆定域 CH1 及 CL 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其中存在一個以上與雙特異性抗原結合分子中包含之第二抗原結合的抗原結合部分特別是 Fab 分子之實施例中，與 GPRC5D 結合之抗原結合部分較佳的為交叉 Fab 分子，並且與第二抗原結合之抗原結合部分為習知 Fab 分子。
在一些實施例中，第二抗原為活化 T 細胞抗原 (在本文中也稱為「活化 T 細胞抗原結合部分或活化 T 細胞抗原結合 Fab 分子」)。在一個特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含能夠特異性結合至活化 T 細胞抗原之不超過一個抗原結合部分。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子提供與活化 T 細胞抗原之單價結合。
在特定實施例中，第二抗原為 CD3，特別為人 CD3 (SEQ ID NO: 40) 或食蟹猴 CD3 (SEQ ID NO: 41)，且最特別為 CD3。在一個實施例中，第二抗原結合部分與人及食蟹猴 CD3 交叉反應 (即與之特異性結合)。在一些實施例中，第二抗原為 CD3 的 ε 次單元 (CD3 ε)。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含 SEQ ID NO: 29 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 30 之 HCDR 2、SEQ ID NO: 31 之 HCDR 3、SEQ ID NO: 32 之 LCDR 1、SEQ ID NO: 33 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 34 之 LCDR 3。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 29 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 30 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 31 之 HCDR 3；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 32 之 LCDR 1、SEQ ID NO: 33 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 34 之 LCDR 3。在一些實施例中，第二抗原結合部分為 (來源於) 人源化抗體。在一個實施例中，VH 為人源化 VH 和/或 VL 為人源化 VL。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含如上述任一實施例所述的 CDR，並且進一步包含人受體框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VH 序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VL 序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VH 序列以及與 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VL 序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分之 VH 包含與 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，且其中，第二抗原結合部分之 VL 包含與 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含 SEQ ID No: 35 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 36 之 VL 序列。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含 SEQ ID NO: 98 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2、SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3、SEQ ID NO: 101 之 LCDR 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 98 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 101 之 LCDR 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3。在一些實施例中，第二抗原結合部分為 (來源於) 人源化抗體。在一個實施例中，VH 為人源化 VH 和/或 VL 為人源化 VL。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含如上述任一實施例所述的 CDR，並且進一步包含人受體框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VH 序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與 SEQ ID NO: 105 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VL 序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VH 序列以及與 SEQ ID NO: 105 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VL 序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分之 VH 包含與 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，且其中，第二抗原結合部分之 VL 包含與 SEQ ID NO: 105 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 105 之胺基酸序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含 SEQ ID No: 104 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 105 之 VL 序列。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含 SEQ ID NO: 106 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 107 之 HCDR 2、SEQ ID NO: 108 之 HCDR 3、SEQ ID NO: 109 之 LCDR 1、SEQ ID NO: 110 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 111 之 LCDR 3。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 106 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 107 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 108 之 HCDR 3；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 109 之 LCDR 1、SEQ ID NO: 110 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 111 之 LCDR 3。
在一些實施例中，第二抗原結合部分為 (來源於) 人源化抗體。在一個實施例中，VH 為人源化 VH 和/或 VL 為人源化 VL。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含如上述任一實施例所述的 CDR，並且進一步包含人受體框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VH 序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與 SEQ ID NO: 113 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VL 序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VH 序列以及與 SEQ ID NO: 113 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的 VL 序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分之 VH 包含與 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，且其中，第二抗原結合部分之 VL 包含與 SEQ ID NO: 113 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 113 之胺基酸序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含 SEQ ID No: 112 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 113 之 VL 序列。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含人恆定區。在一個實施例中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含人恆定區，特別是人 CH1 和/或 CL 域。人恆定域的示例性序列在 SEQ ID NO 37 和 38 (分別為人 κ 和 λ CL 域) 以及 SEQ ID NO: 39 (人 IgG1 重鏈恆定域 CH1-CH2-CH3) 中給出。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含輕鏈恒定區，該輕鏈恆定區包含與 SEQ ID NO: 37 或 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列、特別是 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。特別地，輕鏈恆定區可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變，和/或可在交叉 Fab 分子中包含一個或多個 (特別是兩個) N 端胺基酸之缺失或取代。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含與包含在 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列中的 CH1 域序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。特別地，重鏈恆定區 (特別是 CH1 域) 可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變。
在一些實施例中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之變異域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1、特別是變異域 VL 及 VH 彼此取代 (即根據此等實施例，第二抗原結合部分為交叉 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之變異域或恆定域發生交換)。在一個此等實施例中，第一 (及第三，如果有的話) 抗原結合部分為習知 Fab 分子。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子中存在不多於一個與第二抗原 (例如活化 T 細胞抗原，例如 CD3) 結合之抗原結合部分 (即雙特異性抗原結合分子提供與第二抗原之單價結合)。
電荷修飾
本發明之雙特異性抗原結合分子可在其中所包含之 Fab 分子中包含胺基酸取代，其特別有效地減少輕鏈與不匹配重鏈之錯配 (Bence-Jones 型副產物)，該錯配可能發生在基於 Fab 之雙/多特異性抗原結合分子的製備中，其中在其結合臂之一個 (或多個，如果分子包含兩個以上之抗原結合 Fab 分子) 中發生 VH/VL 交換 (另見 PCT 公開號 WO 2015/150447，特別是其中的實施例，其全部內容以引用方式併入本文)。所需的雙特異性抗原結合分子與不希望的副產物、特別是在其結合臂之一中具有 VH/VL 域交換之雙特異性抗原結合分子中發生的 Bence Jones 型副產物之比率可透過在 CH1 和 CL 域之特定胺基酸位置引入帶有相反電荷之胺基酸來改善 (有時在本文中稱為「電荷修飾」)。
因此，在一些實施例中，其中，雙特異性抗原結合分子之第一抗原結合部分及第二抗原結合部分均為 Fab 分子，並且在抗原結合部分之一 (特別是第二抗原結合部分)中，Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代， i) 在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被帶正電荷之胺基酸 (根據 Kabat 編號) 取代，且其中，在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸或位置 213 的胺基酸被帶負電荷之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；或 ii) 在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被帶正電荷之胺基酸 (根據 Kabat 編號) 取代，且其中，在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸或位置 213 的胺基酸被帶負電荷之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
雙特異性抗原結合分子不包含 i) 及 ii) 下所述的修飾。具有 VH/VL 交換之抗原結合部分之恆定域 CL 和 CH1 未彼此取代 (即保留未交換狀態)。
在一個更具體之實施例中， i) 在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或 組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸或位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代；或 i) 在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或 組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，並且在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸或位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在一個此等實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或 組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸或位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在另一個實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或 組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在一個特定實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在一個更特定之實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在一個甚至更特定的實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在特定實施例中，如果根據上述實施例之胺基酸取代發生在第一抗原結合部分之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中，則第一抗原結合部分之恆定域 CL 為 κ 同種型。
可替代地，根據上述實施例之胺基酸取代可發生在第二抗原結合部分之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中，而不是第一抗原結合部分之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中。在特定的此等實施例中，第二抗原結合部分之恆定域 CL 為 κ 同種型。
因此，在一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或 組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，並且在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸或位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在另一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或 組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，並且在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在另一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，並且在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在另一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含 (a)              與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D，並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 84 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；以及 (b)    與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈和 Fab 重鏈之變異域 VL 及 VH 彼此取代； 其中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 被獨立取代)，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或 天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含 (a)              與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D，並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 85 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；以及 (b)             與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈和 Fab 重鏈之變異域 VL 及 VH 彼此取代； 其中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 被獨立取代)，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或 天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含 (a)              與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D，並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 85 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；以及 (b)             與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈和 Fab 重鏈之變異域 VL 及 VH 彼此取代； 其中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 被獨立取代)，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或 天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含 (a)              與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D，並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；以及 (b)             與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈和 Fab 重鏈之變異域 VL 及 VH 彼此取代； 其中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 被獨立取代)，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或 天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含 (a)              與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D，並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 96 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；以及 (b)             與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈和 Fab 重鏈之變異域 VL 及 VH 彼此取代； 其中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 被獨立取代)，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或 天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含 (a)              與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D，並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 92 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；以及 (b)             與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈和 Fab 重鏈之變異域 VL 及 VH 彼此取代； 其中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 被獨立取代)，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或 天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含 (a)              與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D，並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 1 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 2 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 3 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 4 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 5 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 6 之 LCDR 3；以及 (b)             與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈和 Fab 重鏈之變異域 VL 及 VH 彼此取代； 其中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 被獨立取代)，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或 天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含 (a)              與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D，並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含重鏈變異區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 7 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 8 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 9 之 HCDR 3，及輕鏈變異區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；以及 (b)             與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈和 Fab 重鏈之變異域 VL 及 VH 彼此取代； 其中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 被獨立取代)，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代 (在一個特定實施例中，被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或 天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
雙特異性抗原結合分子形式
根據本發明之雙特異性抗原結合分子的組分可在各種構型中彼此融合。示例性構型如圖 1A-Z 所示。
在特定實施例中，雙特異性抗原結合分子中所包含之抗原結合部分為 Fab 分子。在此等實施例中，第一抗原結合部分、第二抗原結合部分、第三抗原結合部分等在本文中可分別稱為地第一 Fab 分子、第二 Fab 分子、第三 Fab 分子等。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子之第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合，可選地，可透過胜肽連接子彼此融合。在特定實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 Fab 分子。在一個此等實施例中，第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合。在另一個此等實施例中，第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合。另外，在其中，(i) 第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合或 (ii) 第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合的實施例中，第一抗原結合部分的 Fab 輕鏈可與第二抗原結合部分的 Fab 輕鏈彼此融合，可選地，可透過胜肽連接子融合。
可使用能夠與標靶細胞抗原 (諸如 GPRC5D) 特異性結合之具有單個抗原結合部分 (諸如 Fab 分子) 的雙特異性抗原結合分子 (例如，如圖 1A、1D、1G、1H、1K、1L 所示)，特別是在預期高親和性抗原結合部分結合後標靶細胞抗原發生內在化的情況下。在此等情況下，針對特定標靶細胞抗原的一種以上之抗原結合部分的存在可增強標靶細胞抗原的內在化，從而降低其可用性。
但是，在其他情況下，具有包含兩個或更多個針對特定標靶細胞抗原的抗原結合部分 (諸如 Fab 分子) 之雙特異性抗原結合分子 (例如，如圖 1B、1C、1E、1F、1I、1J、1M 或 1N 所示) 將為有利的，例如有利於優化對靶點的靶向或使標靶細胞抗原交聯。
因此，在特定實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子復包含第三抗原結合部分。
在一個實施例中，第三抗原結合部分與第一抗原即 GPRC5D 結合。在一個實施例中，第三抗原結合部分為 Fab 分子。
在一個實施例中，第三抗原結合部分與第一抗原結合部分相同。
除非在科學上明顯不合理或不可能，否則雙特異性抗原結合分子之第三抗原結合部分可單獨或組合結合本文相對於與 GPRC5D 結合之第一抗原結合部分和/或抗體所述的任何特徵。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 84 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 85 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 96 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 92 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 1 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 2 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 4 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 5 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 6 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 7 之 LCDR 3。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 7 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 8 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 9 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3。
在一些實施例中，第三抗原結合部分為 (來源於) 人源化抗體。在一個實施例中，VH 為人源化 VH 和/或 VL 為人源化 VL。在一個實施例中，第三抗原結合部分包含如上述任一實施例所述的 CDR，並且進一步包含人受體框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一個實施例中，第三抗原結合部分之 VH 包含與選自 SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57 和 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列，並且第三抗原結合部分之 VL 包含與選自 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63 和 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含：VH 序列，其與選自 SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57 和 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同；及 VL 序列，其與選自 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63 和 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含：VH，其包含選自 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57 和 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL，其包含選自 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63 和 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含選自 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57 和 SEQ ID NO: 58 之 VH 序列以及選自 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63 和 SEQ ID NO: 64 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含 SEQ ID No: 13 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 14 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含 SEQ ID No: 15 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 16 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含 SEQ ID No: 48 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 53 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含 SEQ ID No: 49 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 52 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含 SEQ ID No: 57 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 64 之 VL 序列。
在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列。在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含 SEQ ID No: 58 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 63 之 VL 序列。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含人恆定區。在一個實施例中，第三抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含人恆定區，特別是人 CH1 和/或 CL 域。人恆定域的示例性序列在 SEQ ID NO 37 和 38 (分別為人 κ 和 λ CL 域) 以及 SEQ ID NO: 39 (人 IgG1 重鏈恆定域 CH1-CH2-CH3) 中給出。在一些實施例中，第三抗原結合部分包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含與 SEQ ID NO: 37 或 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列、特別是 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。特別地，輕鏈恆定區可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變，和/或可在交叉 Fab 分子中包含一個或多個 (特別是兩個) N 端胺基酸之缺失或取代。在一些實施例中，第三抗原結合部分包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含與包含在 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列中的 CH1 域序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。特別地，重鏈恆定區 (特別是 CH1 域) 可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變。
在特定實施例中，第三及第一抗原結合部分各自為 Fab 分子，並且第三抗原結合部分與第一抗原結合部分相同。因此，在這些實施例中，第一抗原結合部分及第三抗原結合部分包含相同的重鏈和輕鏈胺基酸序列，並且具有相同排列的域 (即習知或交叉)。此外，在這些實施例中，第三抗原結合部分包含與第一抗原結合部分相同的胺基酸取代 (如果有的話)。例如，本文所述之“電荷修飾”胺基酸取代將在第一抗原結合部分和第三抗原結合部分中的每個的恆定域 CL 和恆定域 CH1 中進行。可替代地，所述胺基酸取代可在第二抗原結合部分 (其在特定實施例中亦為 Fab 分子) 之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中進行，但是不在第一抗原結合部分和第三抗原結合部分之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中進行。
與第一抗原結合部分類似，第三抗原結合部分特別是習知 Fab 分子。但是，也可以設想其中，第一抗原結合部分及第三抗原結合部分為交叉 Fab 分子 (且第二抗原結合部分為習知 Fab 分子) 的實施例。因此，在特定實施例中，第一抗原結合部分及第三抗原結合部分各自為習知 Fab 分子，並且第二抗原結合部分為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之變異域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他實施例中，第一抗原結合部分及第三抗原結合部分各自為交叉 Fab 分子，並且第二抗原結合部分為習知 Fab 分子。
如果存在第三抗原結合部分，在一個特定實施例中，第一抗原結合部分及第三抗原結合部分與 GPRC5D 結合，並且第二抗原結合部分與第二抗原、特別是活化 T 細胞抗原、更特別是 CD3、最特別是 CD3 ε 結合。
在特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含 Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成。Fc 域之第一次單元及第二次單元能夠穩定締合。
根據本發明之雙特異性抗原結合分子可具有不同的構型，即第一抗原結合部分、第二抗原結合部分 (及可選地第三抗原結合部分) 可彼此融合並以不同方式與 Fc 域融合。這些成分可直接彼此融合或優選地通過一個或多個合適的胜肽連接子融合。在 Fab 分子與 Fc 域的次單元之 N 端融合的情況下，其通常透過免疫球蛋白鉸鏈區融合。
在一些實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 Fab 分子，並且第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合。在此等實施例中，第一抗原結合部分可在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端或 Fc 域的次單元中另一個之 N 端融合。在特定的此等實施例中，所述第一抗原結合部分為習知 Fab 分子，並且第二抗原結合部分為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之變異域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他此等實施例中，所述第一 Fab 分子為交叉 Fab 分子，並且第二 Fab 分子為習知 Fab 分子。
在一個實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 Fab 分子，第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合，並且第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由第一 Fab 分子及第二 Fab 分子組成，Fc 域由第一次單元及第二次單元以及可選的一個或多個胜肽連接子構成，其中，第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一或第二次單元之 N 端融合。圖 1G 及圖 1K 中示意性地描述了這種構型 (在這些實例中，第二抗原結合域為 VH/VL 交叉 Fab 分子)。另外，可選地，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈和第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可彼此融合。
在另一個實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 Fab 分子，並且第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由第一 Fab 分子及第二 Fab 分子組成，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元以及可選的一個或多個胜肽連接子構成，其中，第一 Fab 分子及第二 Fab 分子各自在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。圖 1A 及圖 1D 中示意性地描繪了這種構型 (在這些實例中，第二抗原結合域為 VH/VL 交叉 Fab 分子並且第一抗原結合部分為習知 Fab 分子)。第一 Fab 分子及第二 Fab 分子可直接或透過胜肽連接子與 Fc 域融合。在一個特定實施例中，第一 Fab 分子及第二 Fab 分子各自透過免疫球蛋白鉸鏈區與 Fc 域融合。在一個具體實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人 IgG1 鉸鏈區，特別地，其中 Fc 域為 IgG1 Fc 域。
在一些實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 Fab 分子，並且第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合。在此等實施例中，第二抗原結合部分可在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端或 (如上文所述) Fc 域的次單元中另一個之 N 端融合。在特定的此等實施例中，所述第一抗原結合部分為習知 Fab 分子，並且第二抗原結合部分為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之變異域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他此等實施例中，所述第一 Fab 分子為交叉 Fab 分子，並且第二 Fab 分子為習知 Fab 分子。
在一個實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 Fab 分子，第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合，並且第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由第一 Fab 分子及第二 Fab 分子組成，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元以及可選的一個或多個胜肽連接子構成，其中，第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第一 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一或第二次單元之 N 端融合。圖 1H 及圖 1L 中示意性描繪了這種構型 (在這些實例中，第二抗原結合域為 VH/VL 交叉 Fab 分子並且第一抗原結合部分為習知 Fab 分子)。另外，可選地，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈和第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可彼此融合。
在一些實施例中，第三抗原結合部分特別是第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合。在特定的此等實施例中，所述第一 Fab 分子及第三 Fab 分子各自為習知 Fab 分子，並且第二 Fab 分子為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之變異域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他此等實施例中，所述第一 Fab 分子及第三 Fab 分子各自為交叉 Fab 分子，並且第二 Fab 分子是習知 Fab 分子。
在一個特定的此等實施例中，第二抗原結合部分及第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，並且第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由第一 Fab 分子、第二 Fab 分子及第三 Fab 分子組成，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元以及可選的一個或多個胜肽連接子構成，其中，第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元之 N 端融合，且其中，第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第二次單元之 N 端融合。圖 1B 和圖 1E (在這些實例中，第二抗原結合部分為 VH/VL 交叉 Fab 分子，並且第一抗原結合部分及第三抗原結合部分為習知 Fab 分子) 以及圖 1J 和 1N (在這些實例中，第二抗原結合部分為習知 Fab 分子，並且第一抗原結合部分及第三抗原結合部分為 VH/VL 交叉 Fab 分子) 中示意性描繪了這種構型。第二 Fab 分子及第三 Fab 分子可直接或透過胜肽連接子與 Fc 域融合。在一個特定實施例中，第二 Fab 分子及第三 Fab 分子各自透過免疫球蛋白鉸鏈區與 Fc 域融合。在一個具體實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人 IgG1 鉸鏈區，特別地，其中 Fc 域為 IgG1 Fc 域。另外，可選地，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈和第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可彼此融合。
在另一個此等實施例中，第一抗原結合部分及第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，並且第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由第一 Fab 分子、第二 Fab 分子及第三 Fab 分子組成，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元以及可選的一個或多個胜肽連接子構成，其中，第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第一 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元之 N 端融合，且其中，第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第二次單元之 N 端融合。圖 1C 和圖 1F (在這些實例中，第二抗原結合部分為 VH/VL 交叉 Fab 分子，並且第一及第三抗原結合部分為習知 Fab 分子) 以及圖 1I 和 1M (在這些實例中，第二抗原結合部分為習知 Fab 分子，並且第一抗原結合部分及第三抗原結合部分為 VH/VL 交叉 Fab 分子) 中示意性描繪了這種構型。第一 Fab 分子及第三 Fab 分子可直接或透過胜肽連接子與 Fc 域融合。在一個特定實施例中，第一 Fab 分子及第三 Fab 分子各自透過免疫球蛋白鉸鏈區與 Fc 域融合。在一個具體實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人 IgG1 鉸鏈區，特別地，其中 Fc 域為 IgG1 Fc 域。另外，可選地，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈和第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可彼此融合。
在其中，Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端透過免疫球蛋白鉸鏈區與 Fc 域的次單元之 N 端融合的雙特異性抗原結合分子之構型中，鉸鏈區和 Fc 域基本上形成免疫球蛋白分子。在一個特別實施例中，免疫球蛋白分子為 IgG 類免疫球蛋白。在更具體的實施例中，免疫球蛋白為 IgG1 亞類免疫球蛋白。在另一個實施例中，免疫球蛋白為 IgG4 亞類免疫球蛋白。在另一個特定實施例中，免疫球蛋白為人免疫球蛋白。在其他實施例中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一個實施例中，免疫球蛋白包含人恆定區，特別是人 Fc 區域。
在本發明之一些雙特異性抗原結合分子中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈彼此融合，可選地，可透過胜肽連接子融合。根據第一 Fab 分子及第二 Fab 分子的構型不同，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可在其 C 端與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈融合，或第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可在其 C 端與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈融合。第一 Fab 分子及第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈的融合進一步減少了 Fab 重鏈與輕鏈之錯配，並且還減少了表現本發明的某些雙特異性抗原結合分子所需的質體數量。
抗原結合部分可與 Fc 域直接融合或彼此融合，或者透過胜肽連接子與 Fc 融合或彼此融合，該胜肽連接子包含一個或多個胺基酸，通常約 2-20 個胺基酸。胜肽連接子為本領域中所公知的並且如本文所述。合適的非免疫原性胜肽連接子包括例如 (G4 S)n 、(SG4 )n 、(G4 S)n 或 G4 (SG4 )n 胜肽連接子。「N」通常為 1 至 10 的整數，特別為 2 至 4。在一個實施例中，所述胜肽連接子的長度為至少 5 個胺基酸；在一個實施例中，長度為 5 至 100 個胺基酸；在另一個實施例中，長度為 10 至 50 個胺基酸。在一個實施例中，所屬胜肽連接子為 (GxS)n 或 (GxS)n Gm 其中 G=甘胺酸，S=絲胺酸，並且 (x=3，n=3、4、5 或 6，且 m=0、1、2 或 3) 或 (x=4，n=2、3、4 或 5，且 m=0、1、2 或 3)，在另一個實施例中，x=4 且 n=2。在一個實施例中，所述胜肽連接子為 (G4 S)2 。一種用於使第一 Fab 分子及第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈彼此融合的特別合適的胜肽連接子為 (G4S)2。一種適用於連接第一 Fab 片段及第二 Fab 片段之 Fab 重鏈的示例性胜肽連接子包含序列 (D)-(G4 S)2 (SEQ ID NO 43 及 44)。另一個合適的此等連接子包含序列 (G4 S)4 。另外，連接子可包含免疫球蛋白鉸鏈區 (的一部分)。特別地，在其中 Fab 分子與 Fc 域次單元之 N 端融合的情況下，可透過包含附加的胜肽連接子或不含附加的胜肽連接子的免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分融合。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含：多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈變異區被輕鏈變異區替換)，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))；及多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈與 Fc 域次單元共享羧基末端肽鍵 (VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子 (VH(2) -CL(2) ) 之 Fab 重鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵；以及第一 Fab 分子 (VL(1) -CL(1) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在某些實施例中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含：多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH(2) -CL(2) -CH2-CH3(-CH4))；及多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈與 Fc 域次單元共享羧基末端肽鍵 (VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子 (VL(2) -CH1(2) ) 之 Fab 輕鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵；以及第一 Fab 分子 (VL(1) -CL(1) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在某些實施例中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈變異區被輕鏈變異區替換)，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VL(2) -CH1(2) -VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈變異區被輕鏈變異區替換)，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH(1) -CH1(1) -VL(2) -CH1(2) -CH2-CH3(-CH4))。
在這些實施例的一些中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：第二 Fab 分子 (VH(2) -CL(2) ) 之交叉 Fab 輕鏈多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵；及第一 Fab 分子 (VL(1) -CL(1) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在這些實施例的另一些中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VH(2) -CL(2) -VL(1) -CL(1) )；或多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL(1) -CL(1) -VH(2) -CL(2) ) (在適當情況下)。
根據這些實施例之雙特異性抗原結合分子可進一步包含 (i) Fc 域次單元多肽 (CH2-CH3(-CH4))，或 (ii) 多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH(3) -CH1(3) -CH2-CH3(-CH4))，及第三 Fab 分子 (VL(3) -CL(3) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在某些實施例中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH(2) -CL(2) -VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH(1) -CH1(1) -VH(2) -CL(2) -CH2-CH3(-CH4))。
I在這些實施例的一些中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：第二 Fab 分子 (VL(2) -CH1(2) ) 之交叉 Fab 輕鏈多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵；及第一 Fab 分子 (VL(1) -CL(1) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在這些實施例的另一些中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL(2) -CH1(2) -VL(1) -CL(1) )；或多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL(1) -CL(1) -VL(2) -CH1(2) ) (在適當情況下)。
根據這些實施例之雙特異性抗原結合分子可進一步包含 (i) Fc 域次單元多肽 (CH2-CH3(-CH4))，或 (ii) 多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH(3) -CH1(3) -CH2-CH3(-CH4))，及第三 Fab 分子 (VL(3) -CL(3) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在某些實施例中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子不包含 Fc 域。在特定的此等實施例中，所述第一 Fab 分子及 (如果存在) 第三 Fab 分子各自為習知 Fab 分子，並且第二 Fab 分子為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之變異域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他此等實施例中，所述第一 Fab 分子及 (如果存在) 第三 Fab 分子各自為交叉 Fab 分子，並且第二 Fab 分子為習知 Fab 分子。
在一個此等實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由第一抗原結合部分及第二抗原結合部分組成，並且可選地包含一個或多個胜肽連接子，其中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分均為 Fab 分子，並且第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合。圖 1O 及圖 1S 中示意性描繪了這種構型 (在這些實例中，第二抗原結合域為 VH/VL 交叉 Fab 分子並且第一抗原結合部分為習知 Fab 分子)。
在另一個此等實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由第一抗原結合部分及第二抗原結合部分組成，並且可選地包含一個或多個胜肽連接子，其中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分均為 Fab 分子，並且第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合。圖 1P 及圖 1T 中示意性描繪了這種構型 (在這些實例中，第二抗原結合域為 VH/VL 交叉 Fab 分子並且第一抗原結合部分為習知 Fab 分子)。
在一些實施例中，第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且雙特異性抗原結合分子進一步包含第三抗原結合部分、特別是第三 Fab 分子，其中，所述第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第一 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合。在某些此等實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由第一 Fab 分子、第二 Fab 分子及第三 Fab 分子組成，並且可選地包含一個或多個胜肽連接子，其中，第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第一 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合。圖 1Q 和 1U (在這些實例中，第二抗原結合域為 VH/VL 交叉 Fab 分子，並且第一抗原結合部分及第三抗原結合部分為習知 Fab 分子) 以及圖 1X 和 1Z (在這些實例中，第二抗原結合域為習知 Fab 分子，並且第一抗原結合部分及第三抗原結合部分各自為 VH/VL 交叉 Fab 分子) 中示意性描繪了這種構型。
在一些實施例中，第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第一 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且雙特異性抗原結合分子進一步包含第三抗原結合部分、特別是第三 Fab 分子，其中，所述第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 N 端與第一 Fab 分子的 Fab 重鏈之 C 端融合。在某些此等實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由第一 Fab 分子、第二 Fab 分子及第三 Fab 分子組成，並且可選地包含一個或多個胜肽連接子，其中，第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 N 端與第一 Fab 分子的 Fab 重鏈之 C 端融合。圖 1R 和 1V (在這些實例中，第二抗原結合域為 VH/VL 交叉 Fab 分子，並且第一抗原結合部分及第三抗原結合部分為習知 Fab 分子) 以及圖 1W 和 1Y (在這些實例中，第二抗原結合域為習知 Fab 分子，並且第一抗原結合部分及第三抗原結合部分各自為 VH/VL 交叉 Fab 分子) 中示意性描繪了這種構型。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈變異區被輕鏈變異區替換) (VH(1) -CH1(1) -VL(2) -CH1(2) )。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子 (VH(2) -CL(2) ) 之 Fab 重鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵；以及第一 Fab 分子 (VL(1) -CL(1) ) 之 Fab 輕鏈多肽。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈變異區被輕鏈變異區替換)，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵 (VL(2) -CH1(2) -VH(1) -CH1(1) )。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子 (VH(2) -CL(2) ) 之 Fab 重鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵；以及第一 Fab 分子 (VL(1) -CL(1) ) 之 Fab 輕鏈多肽。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵 (VH(2) -CL(2) -VH(1) -CH1(1) )。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子 (VL(2) -CH1(2) ) 之 Fab 輕鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵；以及第一 Fab 分子 (VL(1) -CL(1) ) 之 Fab 輕鏈多肽。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈變異區被輕鏈變異區替換)，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵 (VL(2) -CH1(2) -VH(1) -CH1(1) )。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子 (VH(2) -CL(2) ) 之 Fab 重鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵；以及第一 Fab 分子 (VL(1) -CL(1) ) 之 Fab 輕鏈多肽。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈變異區被輕鏈變異區替換) (VH(3)-CH1(3) -VH(1) -CH1(1) -VL(2) -CH1(2) )。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子 (VH(2) -CL(2) ) 之 Fab 重鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵；以及第一 Fab 分子 (VL(1) -CL(1) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含第三 Fab 分子 (VL(3) -CL(3) ) 之 Fab 輕鏈多肽。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換) (VH(3) -CH1(3) -VH(1) -CH1(1) -VH(2) -CL(2) )。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子 (VL(2) -CH1(2) ) 之 Fab 輕鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵；以及第一 Fab 分子 (VL(1) -CL(1) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含第三 Fab 分子 (VL(3) -CL(3) ) 之 Fab 輕鏈多肽。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈變異區被輕鏈變異區替換)，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵 (VL(2) -CH1(2) -VH(1) -CH1(1) -VH(3) -CH1(3) )。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子 (VH(2) -CL(2) ) 之 Fab 重鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵；以及第一 Fab 分子 (VL(1) -CL(1) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含第三 Fab 分子 (VL(3) -CL(3) ) 之 Fab 輕鏈多肽。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵 (VH(2) -CL(2) -VH(1) -CH1(1) -VH(3) -CH1(3) )。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子 (VL(2) -CH1(2) ) 之 Fab 輕鏈變異區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵；以及第一 Fab 分子 (VL(1) -CL(1) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含第三 Fab 分子 (VL(3) -CL(3) ) 之 Fab 輕鏈多肽。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈變異區被輕鏈變異區替換)，其繼而與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區共享羧基端肽鍵，其繼而與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第三 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈變異區被輕鏈變異區替換) (VH(2) -CH1(2) -VL(1) -CH1(1) -VL(3) -CH1(3) )。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子 (VH(1) -CL(1) ) 之 Fab 重鏈變異區與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵；及第二 Fab 分子 (VL(2) -CL(2) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含多肽，其中，第三 Fab 分子 (VH(3) -CL(3) ) 之 Fab 重鏈變異區與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區共享羧基端肽鍵，其繼而與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第三 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換) (VH(2) -CH1(2) -VH(1) -CL(1) -VH(3) -CL(3) )。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子 (VL(1) -CH1(1) ) 之 Fab 輕鏈變異區與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵；及第二 Fab 分子 (VL(2) -CL(2) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含多肽，其中，第三 Fab 分子 (VL(3) -CH1(3) ) 之 Fab 輕鏈變異區與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第三 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈變異區被輕鏈變異區替換)，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈變異區共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈變異區被輕鏈變異區替換)，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵 (VL(3) -CH1(3) -VL(1) -CH1(1) -VH(2) -CH1(2) )。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子 (VH(1) -CL(1) ) 之 Fab 重鏈變異區與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵；及第二 Fab 分子 (VL(2) -CL(2) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含多肽，其中，第三 Fab 分子 (VH(3) -CL(3) ) 之 Fab 重鏈變異區與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第三 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈變異區共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵 (VH(3) -CL(3) -VH(1) -CL(1) -VH(2) -CH1(2) )。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子 (VL(1) -CH1(1) ) 之 Fab 輕鏈變異區與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵；及第二 Fab 分子 (VL(2) -CL(2) ) 之 Fab 輕鏈多肽。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含多肽，其中，第三 Fab 分子 (VL(3) -CH1(3) ) 之 Fab 輕鏈變異區與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 84 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分與第一抗原結合部分相同；以及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 85 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分與第一抗原結合部分相同；以及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分與第一抗原結合部分相同；以及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 96 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分與第一抗原結合部分相同；以及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 92 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分與第一抗原結合部分相同；以及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 1 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 2 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 3 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 4 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 5 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 6 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分與第一抗原結合部分相同；以及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 7 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 8 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 9 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分與第一抗原結合部分相同；以及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 84 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 85 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 96 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 92 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a)與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 1 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 2 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 3 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 4 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 5 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 6 之 LCDR 3；與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i)在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 7 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 8 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 9 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分與在 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在根據本發明之雙特異性抗原結合分子的所有不同構型中，本文所述之胺基酸取代 (如果存在) 可在第一抗原結合部分及 (如果存在) 第三抗原結合部分/Fab 分子的 CH1 和 CL 域中或第二抗原結合部分/Fab 分子的 CH1 和 CL 域中。較佳地，它們在第一抗原結合部分及 (如果存在) 第三抗原結合部分/Fab 分子的 CH1 和 CL 域中。根據本發明之概念，如果本文所述之胺基酸取代在第一抗原結合部分 (及 (如果存在) 第三) 抗原結合部分/Fab 分子中進行，則第二抗原結合部分/Fab 分子中不存在此類胺基酸取代。相反，如果本文所述之胺基酸取代在第二抗原結合部分/Fab 分子中進行，則第一 (及 (如果存在) 第三) 抗原結合部分/Fab 分子中不存在此類胺基酸取代。胺基酸取代特別是在包含以下 Fab 分子的雙特異性抗原結合分子中進行，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH1 彼此取代。
在根據本發明之雙特異性抗原結合分子的特定實施例中，特別是其中，如本文所述之胺基酸取代在第一 (及 (如果存在) 第三) 抗原結合部分/Fab 分子中進行的情況下，第一 Fab 分子 (及 (如果存在) 第三) Fab 分子之恆定域 CL 為 κ 同種型。在根據本發明之雙特異性抗原結合分子的其他實施例中，特別是其中，如本文所述之胺基酸取代在第二抗原結合部分/Fab 分子中進行的情況下，第二抗原結合部分/Fab 分子之恆定域 CL 為 κ 同種型。在一些實施例中，第一 (及 (如果存在) 第三) 抗原結合部分/Fab 分子之恆定域 CL 及第二抗原結合部分/Fab 分子之恆定域 CL 為 κ 同種型。
在一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 84 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 85 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 96 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 92 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 1 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 2 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 3 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 4 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 5 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 6 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 7 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 8 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 9 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合；或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 84 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分与第一抗原結合部分相同；及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d)下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 85 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分与第一抗原結合部分相同；及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d)下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分与第一抗原結合部分相同；及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d)下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 96 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分与第一抗原結合部分相同；及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d)下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 92 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分与第一抗原結合部分相同；及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d)下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 1 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 2 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 3 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 4 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 5 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 6 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分与第一抗原結合部分相同；及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d)下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 7 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 8 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 9 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 與第一抗原結合之第三抗原結合部分，並且該第三抗原結合部分与第一抗原結合部分相同；及 d) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，(i) 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，或者 (ii) 在 b) 下所述之第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 a) 下所述之第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 c) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 d)下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 84 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端与 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 83 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 85 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 86 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 87 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 88 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 89 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端与 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端与 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 91 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 96 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端与 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 90 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 92 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 93 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 94 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 95 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 97 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端与 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 1 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 2 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 3 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 4 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 5 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 6 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端与 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一個實施例中，本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，第一抗原為 GPRC5D 並且第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 7 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 8 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 9 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，第二抗原為 CD3 並且第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH 彼此取代，且其中，Fab 分子包含：重鏈變異區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 98 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 99 之 HCDR 2 和 SEQ ID NO: 100 之 HCDR 3；及輕鏈變異區 (Vl)，其包含 SEQ ID NO: 101 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 102 之 LCDR 2 和 SEQ ID NO: 103 之 LCDR 3；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分和 b) 下所述之第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端与 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
根據上述任一實施例所述，雙特異性抗原結合分子的成分 (例如 Fab 分子，Fc 域) 可直接融合或透過各種連接子融合，特別是透過本文所述或本領域中所公知的包含一個或多個胺基酸 (通常約 2-20 個胺基酸) 的胜肽連接子進行融合。合適的非免疫原性胜肽連接子包括例如 (G4 S)n 、(SG4 )n 、(G4 S)n 或 G4 (SG4 )n 胜肽連接子，其中，n 通常為 1 至 10 的整數，特別為 2 至 4。
本發明的一个特定方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 第一抗原結合部分及與第一抗原結合之第三抗原結合部分；其中，第一抗原為 GPRC5D 且其中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 (習知) Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分；其中，第二抗原為 CD3 且其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈与 Fab 重鏈的變異域 VL 和 VH 彼此取代，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分進一步在 Fab 重鏈之 C 端与 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且与 b) 下所述之第二抗原結合部分及 a) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
本發明的一个特定方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 第一抗原結合部分及與第一抗原結合之第三抗原結合部分；其中，第一抗原為 GPRC5D 且其中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 (習知) Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分；其中，第二抗原為 CD3 且其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈与 Fab 重鏈的變異域 VL 和 VH 彼此取代，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分進一步在 Fab 重鏈之 C 端与 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且与 b) 下所述之第二抗原結合部分及 a) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
本發明的一个特定方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 第一抗原結合部分及與第一抗原結合之第三抗原結合部分；其中，第一抗原為 GPRC5D 且其中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 (習知) Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分；其中，第二抗原為 CD3 且其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈与 Fab 重鏈的變異域 VL 和 VH 彼此取代，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 105 之胺基酸序列；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分進一步在 Fab 重鏈之 C 端与 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且与 b) 下所述之第二抗原結合部分及 a) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
本發明的一个特定方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 第一抗原結合部分及與第一抗原結合之第三抗原結合部分；其中，第一抗原為 GPRC5D 且其中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 (習知) Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分；其中，第二抗原為 CD3 且其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈与 Fab 重鏈的變異域 VL 和 VH 彼此取代，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 105 之胺基酸序列；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分進一步在 Fab 重鏈之 C 端与 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且与 b) 下所述之第二抗原結合部分及 a) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
本發明的一个特定方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 第一抗原結合部分及與第一抗原結合之第三抗原結合部分；其中，第一抗原為 GPRC5D 且其中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 (習知) Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分；其中，第二抗原為 CD3 且其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈与 Fab 重鏈的變異域 VL 和 VH 彼此取代，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 105 之胺基酸序列；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分進一步在 Fab 重鏈之 C 端与 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且与 b) 下所述之第二抗原結合部分及 a) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
本發明的一个特定方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 第一抗原結合部分及與第一抗原結合之第三抗原結合部分；其中，第一抗原為 GPRC5D 且其中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 (習知) Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分；其中，第二抗原為 CD3 且其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈与 Fab 重鏈的變異域 VL 和 VH 彼此取代，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 105 之胺基酸序列；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分進一步在 Fab 重鏈之 C 端与 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且与 b) 下所述之第二抗原結合部分及 a) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
本發明的一个特定方面提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含：a) 第一抗原結合部分及與第一抗原結合之第三抗原結合部分；其中，第一抗原為 GPRC5D 且其中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 (習知) Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；b) 與第二抗原結合之第二抗原結合部分；其中，第二抗原為 CD3 且其中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈与 Fab 重鏈的變異域 VL 和 VH 彼此取代，該 Fab 分子包含：重鏈變異區，該重鏈變異區包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；及輕鏈變異區，該輕鏈 變異區包含 SEQ ID NO: 105 之胺基酸序列；c) 由第一次單元及第二次單元構成的 Fc 域；其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代 (最特別是被精胺酸 (R) 取代)，且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分的恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，並且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且其中，在 a) 下所述之第一抗原結合部分進一步在 Fab 重鏈之 C 端与 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且与 b) 下所述之第二抗原結合部分及 a) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在根據本發明這一方面的一實施例中，在 Fc 域之第一次單元中，位置 366 的穌胺酸殘基被色胺酸殘基取代 (T366W)，並且在 Fc 域之第二次單元中，位置 407 的酪胺酸殘基被纈胺酸殘基取代 (Y407V)，並且可選地，位置 366 的穌胺酸殘基被絲胺酸殘基取代 (T366S)，並且位置 368 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L368A) (根據 Kabat EU 索引編號)。
在根據本發明這一方面的另一個實施例中，在 Fc 域之第一次單元中，位置 354 的絲胺酸殘基又被胱胺酸殘基取代 (S354C) 或位置 356 的麩胺酸殘基被胱胺酸殘基取代 (E356C) (特別是位置 354 的絲胺酸殘基被胱胺酸殘基取代)，並且在 Fc 域之第二次單元中，位置 349 的酪胺酸殘基又被胱胺酸殘基取代 (Y349C) (根據 Kabat EU 索引編號)。
在根據本發明這一方面的又一個實施例中，在 Fc 域之第一次單元及第二次單元中的每個中，位置 234 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L234A)，位置 235 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L235A)，並且位置 329 的脯胺酸殘基被甘胺酸殘基取代 (P329G) (根據 Kabat EU 索引編號)。
在根據本發明這一方面的另一個實施例中，Fc 域為人 IgG1 Fc 域。
在特定的具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 19 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；及多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列。在另一個特定的具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 19 之胺基酸序列；及多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。
在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；及多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列。在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列；及多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列。
在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 114 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 115 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 116 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；及多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 117 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列。在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 114 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 115 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 116 之胺基酸序列；及多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 117 之胺基酸序列。
在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 119 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；及多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 121 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列。在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 119 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列；及多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 121 之胺基酸序列。
在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 123 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；及多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 125 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列。在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 123 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；及多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 125 之胺基酸序列。
在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 127 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；及多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 129 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列。在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 127 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列；及多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 129 之胺基酸序列。
在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 130 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 131 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 132 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列；及多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 133 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列。在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 130 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 131 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 132 之胺基酸序列；及多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 133 之胺基酸序列。
Fc 域
在特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含 Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成。應當理解，本文相對於雙特異性抗原結合分子所述之 Fc 域的特徵可等同應用於本發明之抗體中包含的 Fc 域。
雙特異性抗原結合分子之 Fc 域由包含免疫球蛋白分子之重鏈域的一對多肽鏈組成。例如，免疫球蛋白 G (IgG) 分子之 Fc 域為二聚體，其每個次單元包含 CH2 及 CH3 IgG 重鏈恆定域。Fc 域之兩個次單元能夠彼此穩定締合。在一個實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含不超過一個 Fc 域。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子之 Fc 域為 IgG Fc 域。在一個特定實施例中，Fc 域為 IgG1 Fc 域。在另一個實施例中，Fc 域為 IgG4 Fc 域。在一個更具體之實施例中，Fc 域為 IgG4 Fc 域，其包含在位置 S228 (根據 Kabat EU 索引編號) 的胺基酸取代，特別是胺基酸取代 S228P。該胺基酸取代減少體內 IgG4 抗體之 Fab 臂交換 (參見 Stubenrauch 等人，Drug Metabolism and Disposition 38，84-91 (2010))。在另一個特定實施例中，Fc 域為人 Fc 域。在一個甚至更特定的實施例中，Fc 域為人 IgG1 Fc 域。人 IgG1 Fc 區域的一個示例性序列在 SEQ ID No: 42 中給出。
促進異源二聚化的 Fc 域修飾
根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含不同的抗原結合部分，其可與 Fc 域之兩個次要單元中的一個或另一個融合，因此 Fc 域之兩個次要單元通常包含在兩個不同的多肽鏈中。這些多肽的重組共表達及隨後的二聚化導致兩種多肽具有若干可能的組合。為改善重組生產中雙特異性抗原結合分子之產率和純度，在雙特異性抗原結合分子之 Fc 域中引入促進所需之多肽締合的修飾將為有利的。
因此，在特定實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子的 Fc 域包含促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元的締合的修飾。人 IgG Fc 域之兩個次單元之間最廣泛的蛋白質-蛋白質相互作用位點在 Fc 域之 CH3 域中。因此，在一個實施例中，所述修飾在 Fc 域之 CH3 域中。
存在多種對 Fc 域之 CH3 域進行修飾以便增強異源二聚化之方法，這些方法很好地描述於例如 WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291 中。通常，在所有此等方法中，Fc 域之第一個單元的 CH3 域及 Fc 域之第二次單元的 CH3 域均以互補的方式進行工程化，以使每個 CH3 域 (或包含 CH3 域的重鏈) 不再能夠與自身發生同源二聚化，而是被迫與互補工程化之其他 CH3 域進行異源二聚化 (使得第一 CH3 域及第二 CH3 域異源二聚化，並且在兩個第一 CH3 域或兩個第二 CH3 域之間不形成同源二聚體)。這些用於改善重鏈異源二聚化之不同方法被視為與雙特異性抗原結合分子中重鏈-輕鏈修飾結合的不同選擇 (例如，一個結合臂中之 VH 和 VL 交換/置換，以及在 CH1/CL 界面中引入帶有相反電荷的胺基酸的取代基)，其減少了重鏈/輕鏈錯配及 Bence Jones 型副產物。
在一個具體實施例中，所述促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元的締合的修飾為所謂的「杵臼」修飾，其包括在 Fc 域之兩個次單元中的一個的「杵」修飾及 Fc 域之兩個次單元中的另一個的「臼」修飾。
「杵臼」技術描述於例如：US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway 等人，Prot Eng 9，617-621 (1996)；及 Carter，J Immunol Meth 248，7-15 (2001)。通常，該方法包括在第一多肽之界面處引入一個突起 (「杵」)，並且在第二多肽之界面中引入一個對應的空腔 (「臼」)，以使該突起可定位於空腔中，從而促進異源二聚體形成並阻礙同源二聚體形成。透過用較大側鏈 (例如酪胺酸或色胺酸) 替換第一多肽界面上之較小的胺基酸側鏈來構建突起。透過將較大胺基酸側鏈替換為較小的胺基酸側鏈 (例如丙胺酸或穌胺酸)，在第二多肽之界面中形成與突起具有相同或相近大小的互補空腔。
因此，在一個特定實施例中，在雙特異性抗原結合分子之 Fc 域的第一次單元的 CH3 域中，胺基酸殘基被具有較大側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在第一次單元之 CH3 域內產生突起，該突起可定位在第二次單元之 CH3 域内的空腔中，並且在 Fc 域的第二次單元的 CH3 域中，胺基酸殘基被具有較小側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在第二次單元之 CH3 域內產生空腔，第二次單元之 CH3 域内的突起為可定位在該空腔內。
較佳地，所述具有較大側鏈體積的胺基酸殘基選自精胺酸 (R)、苯丙胺酸 (F)、酪胺酸 (Y) 和色胺酸 (W)。
較佳地，所述具有較小側鏈體積的胺基酸殘基選自丙胺酸 (A)、絲胺酸 (S)、穌胺酸 (T) 和纈胺酸 (V)。
可透過改變編碼多肽的核酸 (例如透過針對特定位點之誘變或透過肽合成) 來製備突起和空腔。
在一個具體實施例中，在 Fc 域之第一次單元 (「杵」次單元) (的 CH3 域) 中，位置 366 的穌胺酸殘基被色胺酸殘基取代 (T366W)，並且在 Fc 域之第二次單元 (「臼」次單元) (的 CH3 域) 中，位置 407 的酪胺酸殘基被纈胺酸殘基取代 (Y407V)。在一個實施例中，在 Fc 域之第二次單元中，位置 366 的穌胺酸殘基又被絲胺酸殘基取代 (T366S)，並且位置 368 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L368A) (根據 Kabat EU 索引編號)。
在又一個實施例中，在 Fc 域之第一次單元中，位置 354 的絲胺酸殘基又被胱胺酸殘基取代 (S354C) 或位置 356 的麩胺酸殘基被胱胺酸殘基取代 (E356C) (特別是位置 354 的絲胺酸殘基被胱胺酸殘基取代)，並且在 Fc 域之第二次單元中，位置 349 的酪胺酸殘基又被胱胺酸殘基取代 (Y349C) (根據 Kabat EU 索引編號)。引入這兩個胱胺酸殘基導致在 Fc 域之兩個次單元之間形成二硫鍵，從而進一步穩定二聚體 (Carter，J Immunol Methods 248，7-15 (2001))。
在一個特定實施例中，Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 S354C 和 T366W，並且 Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S、L368A 和 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個特定實施例中，與第二抗原 (例如活化 T 細胞抗原) 結合之抗原結合部分與 Fc 域之第一次單元 (包含「杵」修飾) 融合 (可選地，透過與 GPRC5D 結合之第一抗原結合部分融合，和/或透過胜肽連接子融合)。不希望被理論束縛，與第二抗原 (諸如活化 T 細胞抗原) 結合之抗原結合部分與 Fc 域之含「杵」次單元的融合將 (進一步) 最大限度減少包含兩個與活化 T 細胞抗原結合之抗原結合部分的產生 (兩個含「杵」多肽之空間碰撞)。
可以設想將用於強制異源二聚化的 CH3 修飾的其他技術作為本發明之替代方案，並且這些技術描述於例如 WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291 中。
在一個實施例中，可替換使用 EP 1870459 中所述之異源二聚化方法。該方法基於在 Fc 域之兩個次單元之間的 CH3/CH3 域界面的特定胺基酸位置引入帶有相反電荷的胺基酸。本發明之雙特異性抗原結合分子的一個優選實施例為 (Fc 域的) 兩個 CH3 域之一中的胺基酸突變 R409D 和 K370E；及 Fc 域的兩個 CH3 域之另一個中的胺基酸突變 D399K 和 E357K (根據 Kabat EU 索引編號)。
在另一個實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 T366W 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 T366S、L368A、Y407V，以及 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 R409D、K370E 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 D399K、E357K (根據 Kabat EU 索引編號)。
在另一個實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 S354C、T366W 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者所述雙特異性抗原結合分子包含 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 Y349C、T366W 和Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 S354C、T366S、L368A、Y407V，以及 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 R409D、K370E 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 D399K、E357K (全部根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個實施例中，可替換使用 WO 2013/157953 中所述之異源二聚化方法。在一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 T366K，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 L351D (根據 Kabat EU 索引編號)。在另一個實施例中，第一 CH3 域進一步包含胺基酸突變 L351K。在另一個實施例中，第二 CH3 域進一步包含選自 Y349E、Y349D 和 L368E (較佳的是 L368E) (根據 Kabat EU 索引編號) 的胺基酸突變。
在一個實施例中，可替換使用 WO 2012/058768 中所述之異源二聚化方法。在一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 L351Y、Y407A，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 T366A、K409F。在另一個實施例中，第二 CH3 域進一步包含位置 T411、D399、S400、F405、N390 或 K392 的胺基酸突變，所述位置選自例如：a) T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E 或 T411W；b) D399R、D399W、D399Y 或 D399K；c) S400E、S400D、S400R 或 S400K；d) F405I、F405M、F405T、F405S、F405V 或 F405W；e) N390R、N390K 或 N390D；f) K392V、K392M、K392R、K392L、K392F 或 K392E (根據 Kabat EU 索引編號)。在另一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 L351Y、Y407A，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 T366V、K409F。在另一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 Y407A，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 T366A、K409F。在另一個實施例中，第二 CH3 域進一步包含胺基酸突變 K392E、T411E、D399R 和 S400R (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個實施例中，可替換使用 WO 2011/143545 中所述之異源二聚化方法，例如，在選自 368 和 409 (根據 Kabat EU 索引編號) 的位置處進行胺基酸修飾。
在一個實施例中，可替換使用 WO 2011/090762 中所述之異源二聚化方法，該方法同樣使用上述之「杵臼」技術。在一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 T366W，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 Y407A。在一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 T366Y，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 Y407T (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子或其 Fc 域屬於 IgG2 亞類，並且另選地使用 WO 2010/129304 中所述之異源二聚化方法。
在一個替代實施例中，促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元的締合的修飾包括介導靜電轉向作用的修飾，例如 PCT 公開 WO 2009/089004 中所述。通常，此方法涉及用帶電荷的胺基酸殘基取代兩個 Fc 域次單元界面上的一個或多個胺基酸殘基，從而使同源二聚體形成在靜電上不利，但異源二聚化在靜電上有利。在一個此等實施例中，第一 CH3 域包含帶負電荷之胺基酸 (例如麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D)，較佳的是 K392D 或 N392D) 對 K392 和 N392 之胺基酸取代，並且第二 CH3 域包含帶正電荷之胺基酸 (例如離胺酸 (K) 或精胺酸 (R)，較佳的是 D399K、E356K、D356K 或 E357K 且更佳的是 D399K 和 E356K) 對 D399、E356、D356 或 E357 之胺基酸取代。在另一個實施例中，第一 CH3 域進一步包含帶負電荷之胺基酸 (例如麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D)，更佳的是 K409D 或 R409D) 對 K409 或 R409 之胺基酸取代。在另一個實施例中，第一 CH3 域進一步或可替代地包含帶負電荷之胺基酸 (例如麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D)) 對 K439 和/或 K370 之胺基酸取代 (全部根據 Kabat EU 索引編號)。
在又一個實施例中，可替代地使用 WO 2007/147901 中所述之異源二聚化方法。在一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 K253E、D282K 和 K322D，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 D239K、E240K 和 K292D (根據 Kabat EU 索引編號)。
在另一個實施例中，可替代地使用 WO 2007/110205 中所述之異源二聚化方法。
在一個實施例中，Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 K392D 和 K409D，並且Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 D356K 和 D399K (根據 Kabat EU 索引編號)。
減少 Fc 受體結合和 / 或效應功能之 Fc 域修飾
Fc 域賦予雙特異性抗原結合分子 (或抗體) 有利的藥代動力學特性，包括較長之血清半衰期，其有助於在靶組織中獲得良好的蓄積和有利的組織-血液分配比。但是，與此同時，它可能導致不希望地將雙特異性抗原結合分子 (或抗體) 導向表現 Fc 受體的細胞，而不是優選的攜帶抗原的細胞。此外，Fc 受體信號傳導途徑之共活化可能導致細胞因子釋放，其與 T 細胞活化特性 (例如在雙特異性抗原結合分子的實施例中，其中，第二抗原結合部分與活化 T 細胞抗原結合) 及雙特異性抗原結合分子的長半衰期相結合，導致細胞因子受體的過度活化並在全身給藥時產生嚴重副作用。活化 T 細胞以外的 (攜帶 Fc 受體) 的免疫細胞甚至可能降低雙特異性抗原結合分子 (特別是其中，第二抗原結合部分與活化 T 細胞抗原結合至雙特異性抗原結合分子) 的效力，因為 NK 細胞可能破坏 T 細胞。
因此，在特定實施例中，與天然 IgG1 Fc 域相比，根據本發明的雙特異性抗原結合分子之 Fc 域表現出降低的與 Fc 受體的親和性和/或效應功能。在一個此等實施例中，Fc 域 (或包含所述 Fc 域的雙特異性抗原結合分子) 相比於天然 IgG1 Fc 域 (或包含 IgG1 Fc 域的雙特異性抗原結合分子) 表現出小於 50%、較佳的是小於 20%、更佳的是小於 10% 且最佳的是小於 5% 的對 Fc 受體的結合親和性，和/或相比於天然 IgG1 Fc 域 (或包含 IgG1 Fc 域的雙特異性抗原結合分子) 表現出小於 50%、優選小於 20%、更優選小於 10% 且最優選小於 5% 的效應功能。在一個實施例中，Fc 域 (或包含所述 Fc 域的雙特異性抗原結合分子) 基本上不與 Fc 受體結合和/或誘導效應功能。在一個特定實施例中，Fc 受體為 Fcγ 受體。在一個實施例中，Fc 受體為人 Fc 受體。在一個實施例中，Fc 受體為活化 Fc 受體。在一個具體實施例中，Fc 受體為活化人 Fcγ 受體，更具體地為人 FcγRIIIa、FcγRI 或 FcγRIIa，最具體地為 FcγRIIIa。在一個實施例中，效應功能為選自 CDC、ADCC、ADCP 和細胞因子分泌中的一種或多種。在一個特定實施例中，效應功能為 ADCC。在一個實施例中，與天然 IgG1 Fc 域相比，Fc 域對新生 Fc 受體 (FcRn) 表現出基本類似的結合親和性。當 Fc 域 (或包含所述 Fc 域的雙特異性抗原結合分子) 表現出天然 IgG1 Fc 域 (或包含 IgG1 Fc 域的雙特異性抗原結合分子) 對 FcRn 的結合親和性的大於約 70%、特別是大於約 80%、更特別是大於約 90% 時，將獲得與 FcRn 的基本上類似的結合。
在某些實施例中，與非工程化 Fc 域相比，工程化的 Fc 域對 Fc 受體具有降低的結合親和性和/或降低的效應功能。在特定實施例中，雙特異性抗原結合分子之 Fc 域包含一種或多種胺基酸突變，其降低 Fc 域對 Fc 受體的結合親和性和/或效應功能。通常，在 Fc 域之兩個次單元中的每個中都存在相同的一個或多個胺基酸突變。在一個實施例中，胺基酸突變降低了 Fc 域與 Fc 受體的結合親和性。在一個實施例中，胺基酸突變將 Fc 域與 Fc 受體的結合親和性降低至少 2 倍、至少 5 倍或至少 10 倍。在存在多於一種降低胺基酸對 Fc 受體的結合親和性的胺基酸突變的實施例中，這些胺基酸突變的組合可使 Fc 域對 Fc 受體的結合親和性降低至少 10 倍、至少 20 倍或甚至至少 50 倍。在一個實施例中，與包含非工程化 Fc 域之雙特異性抗原結合分子相比，包含工程化 Fc 域之雙特異性抗原結合分子與 Fc 受體的結合親和性降低至 20% 以下、特別是 10% 以下、更特別是 5% 以下。在一個特定實施例中，Fc 受體為 Fcγ 受體。在一些實施例中，Fc 受體為人 Fc 受體。在一些實施例中，Fc 受體為活化 Fc 受體。在一個具體實施例中，Fc 受體為活化人 Fcγ 受體，更具體地為人 FcγRIIIa、FcγRI 或 FcγRIIa，最具體地為 FcγRIIIa。較佳地，減少與這些受體中的每個之結合。在一些實施例中，也降低了與互補成分的結合親和性，即與 C1q 的特異性結合親和性。在一個實施例中，不降低與新生 Fc 受體 (FcRn) 之結合親和性。當 Fc 域 (或包含所述 Fc 域的雙特異性抗原結合分子) 表現出非工程化形式的 Fc 域 (或包含所述非工程形式的 Fc 域的雙特異性抗原結合分子) 對 FcRn 的結合親和性的大於約 70% 時，實現了與 FcRn 的基本上類似的結合，即 Fc 域對所述受體的結合親和性得以保持。Fc 域或包含所述 Fc 域的本發明之雙特異性抗原結合分子可表現出此等親和性的大於約 80% 且甚至大於約 90%。在某些實施例中，與未經工程化 Fc 域相比，對雙特異性抗原結合分子之 Fc 域進行工程化以獲得降低的效應功能。降低的效應功能可包括但不限於以下一種或多種：降低補體依賴性細胞毒性 (CDC)、降低抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)、降低抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP)、減少細胞因子分泌、減少抗原呈遞細胞的免疫複合體介導的抗原攝取、減少與 NK 細胞的結合、減少與巨噬細胞的結合、減少與單核細胞的結合、減少與多形核細胞的結合、減少直接信號傳導誘導的細胞凋亡、減少靶標結合抗體的交聯、降低樹突狀細胞成熟度或減少 T 細胞引發。在一個實施例中，降低的效應功能選自降低的 CDC、降低的 ADCC、降低的 ADCP 和減少的細胞因子分泌中的一種或多種。在一個特定實施例中，降低的效應功能為降低的 ADCC。在一個實施例中，降低的 ADCC 小於非工程化 Fc 域 (或包含非工程化 Fc 域的雙特異性抗原結合分子) 誘導的 ADCC 的 20%。
在一個實施例中，降低 Fc 域與 Fc 受體的結合親和性和/或效應功能的胺基酸突變為胺基酸取代。在一個實施例中，Fc 域包含在選自 E233、L234、L235、N297、P331 和 P329 (根據 Kabat EU 索引編號) 的位置的胺基酸取代。在一個更具體之實施例中，Fc 域包含在選自 L234、L235 和 P329 (根據 Kabat EU 索引編號) 的位置的胺基酸取代。在一些實施例中，Fc 域包含 L234A 和 L235A (根據 Kabat EU 索引編號) 的胺基酸取代。在一個此等實施例中，Fc 域為 IgG1 Fc 域，特別為人 IgG1 Fc 域。在一個實施例中，Fc 域包含在位置 P329 的胺基酸取代。在一個更具體之實施例中，胺基酸取代為 P329A 或 P329G，特別為 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。在一個實施例中，Fc 域包含在位置 P329 的胺基酸取代，以及在選自 E233、L234、L235、N297 和 P331 (根據 Kabat EU 索引編號) 的位置的另一個胺基酸取代。在一個更具體之實施例中，該另一個胺基酸取代為 E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D 或 P331S。在特定實施例中，Fc 域包含在位置 P329、L234 和 L235 (根據 Kabat EU 索引編號) 的胺基酸取代。在更特定的實施例中，Fc 域包含胺基酸突變 L234A、L235A 和 P329G (「P329G LALA」、「PGLALA」 或 「LALAPG」)。具體地，在特定實施例中，Fc 域之每個次單元包含胺基酸取代 L234A、L235A 和 P329G (根據Kabat Eu索引編號)，即在 Fc 域之第一次單元及第二次單元中的每個中，位置 234 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L234A)，位置 235 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L235A)，並且位置 329 的脯胺酸殘基被甘胺酸殘基取代 (P329G) (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個此等實施例中，Fc 域為 IgG1 Fc 域，特別為人 IgG1 Fc 域。胺基酸取代的「P329G LALA」組合幾乎完全消除了人 IgG1 Fc 域的 Fcγ 受體 (以及補體) 結合，如 PCT 公開號 WO 2012/130831 所述，其全文以引用方式併入本文。WO 2012/130831 還描述了用於製備此等突變 Fc 域的方法及確定其性質 (例如 Fc 受體結合或效應功能) 的方法。
IgG4 抗體與 IgG1 抗體相比，表現出與 Fc 受體的降低的結合親和性和降低的效應功能。因此，在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子的 Fc 域為 IgG4 Fc 域，特別為人 IgG4 Fc 域。在一個實施例中，IgG4 Fc 域包含在位置 S228 的胺基酸取代，具體地包含胺基酸取代 S228P (根據 Kabat EU 索引編號)。為進一步降低其與 Fc 受體的結合親和性和/或其效應功能，在一個實施例中，IgG4 Fc 域包含位置 L235 的胺基酸取代，特別是胺基酸取代 L235E (根據 Kabat EU 索引編號)。在另一個實施例中，IgG4 Fc 域包含在位置 P329 的胺基酸取代，具體地包含胺基酸取代 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。在一個特定實施例中，IgG4 Fc 域包含位置 S228、L235 和 P329 的胺基酸取代，具體地包含胺基酸取代 S228P、L235E 和 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。此等 IgG4 Fc 域變異體及其 Fcγ 受體結合性質描述於 PCT 公開號 WO 2012/130831中，其全文以引用方式併入本文。
在一個特定實施例中，與天然 IgG1 Fc 域相比，表現出降低的對 Fc 受體的結合親和性和/或降低的效應功能的 Fc 域為包含胺基酸取代 L234A、L235A 及可選的 P329G 的人 IgG1 Fc 域或包含胺基酸取代 S228P、L235E 及可選的 P329G (根據 Kabat EU 索引編號) 的人 IgG4 Fc 域。
在某些實施例中，已消除 Fc 域的 N-糖基化。在一個此等實施例中，Fc 域包含位置 N297 的胺基酸突變，特別是天冬醯胺酸被丙胺酸取代 (N297A) 或天冬胺酸取代 (N297D) 之胺基酸取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
除上文及 PCT 公開號 WO 2012/130831 中所述的 Fc 域以外，具有降低的 Fc 受體結合和/或效應功能的 Fc 域也包括被 Fc 域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 中的一個或多個取代的那些 (美國專利號 6,737,056) (根據 Kabat EU 索引編號)。此等 Fc 變異體包括在胺基酸位置 265、269、270、297 和 327 中的兩個或更多個取代的 Fc 變異體，包括所謂的「DANA」 Fc 變異體，其中殘基 265 和 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。
可使用此領域中所公知遺傳或化學方法，透過胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備變異體 Fc 域。遺傳方法可包括編碼 DNA 序列的位點特異性誘變、PCR、基因合成等。可透過例如測序來驗證核苷酸變化是否正確。
與 Fc 受體之結合可易於透過 ELISA 確定，或透過表面等離振子共振 (SPR) 使用標準儀器例如 BIAcore 儀器 (GE Healthcare) 進行確定，並且 Fc 受體可透過例如重組表現來獲得。可替代地，Fc 域或包含 Fc 域的雙特異性抗原結合分子對 Fc 受體的結合親和性可使用已知表現特定 Fc 受體的細胞系 (例如表現 FcγIIIa 受體的人 NK 細胞) 進行評估。
Fc 域或包含 Fc 域的雙特異性抗原結合分子的效應功能可透過此領域中所公知的方法進行測量。用於評估目標分子之 ADCC 活性的體外分析方法的實例描述於例如：美國專利號 5,500,362；Hellstrom 等人，Proc Natl Acad Sci USA 83，7059-7063 (1986)；及 Hellstrom 等人，Proc Natl Acad Sci USA 82，1499-1502 (1985)；美國專利號 5,821,337；Bruggemann 等人，J Exp Med 166，1351-1361 (1987)。可替代地，可采用非放射性分析方法 (參見例如：用於流式細胞術的 ACTI™ 非放射性細胞毒性測定 (CellTechnology，Inc. Mountain View，CA)；及 CytoTox 96® 非放射性細胞毒性測定 (Promega，Madison，WI))。用於此等分析的有用的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地，可在例如 Clynes 等人在 Proc Natl Acad Sci USA 95，652-656 (1998) 中公開的動物模型中在體內評估目標分子之 ADCC 活性。
在一些實施例中，減少 Fc 域與補體成分之結合，具體地減少與 C1q 之結合。因此，在一些實施例中，其中，Fc 域被工程化為具有降低的效應功能，所述降低的效應功能包括降低的 CDC。可實施 C1q 結合分析以確定 Fc 域或包含 Fc 域的雙特異性抗原結合分子能否結合 C1q 並因此具有 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 結合 ELISA。為評估補體活化，可實施 CDC 測定 (參見例如：Gazzano-Santoro 等人，J Immunol Methods 202，163 (1996)；Cragg 等人，Blood 101，1045-1052 (2003)；及 Cragg 和 Glennie，Blood 103，2738-2743 (2004))。
FcRn 結合和體內清除率/半衰期測定也可使用此領域中所公知的方法進行 (參見例如 Petkova, S.B. 等人，Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929)。
多核苷酸
本發明進一步提供了編碼本文所述的抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段的經單離之多核苷酸。在一些實施例中，所述片段為抗原結合片段。
編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的多核苷酸可表現為編碼整個抗體或雙特異性抗原結合分子的單個多核苷酸或為共表現的多個 (例如兩個或多個) 多核苷酸。共表現的由多核苷酸編碼的多肽可透過例如二硫鍵或其他方式締合以形成功能性抗體或雙特異性抗原結合分子。例如，抗體或雙特異性抗原結合分子之輕鏈部分可由與包含抗體或雙特異性抗原結合分子的重鏈的抗體或雙特異性抗原結合分子部分不同的多核苷酸進行編碼。當共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽締合以形成抗體或雙特異性抗原結合分子。在另一個實例中，包含兩個 Fc 域次單元之一和可選的一個或多個 Fab 分子 (的一部分) 的抗體或雙特異性抗原結合分子的部分可由與包含兩個 Fc 域次單元之另一個和可選的 Fab 分子 (的一部分) 的抗體或雙特異性抗原結合分子的部分不同的多核苷酸進行編碼。當共表現時，Fc 域次單元將締合以形成 Fc 域。
在一些實施例中，經單離之多核苷酸編碼根據本文所述之本發明的整個抗體或雙特異性抗原結合分子。在其他實施例中，經單離之多核苷酸編碼根據本文所述之本發明的抗體或雙特異性抗原結合分子中包含的多肽。
在某些實施例中，多核苷酸或核酸為 DNA。在其他實施例中，本發明之多核苷酸為 RNA，例如，呈信使 RNA (mRNA) 的形式。本發明之 RNA 可以為單鏈或雙鏈 RNA。
重組方法
可透過固態肽合成 (例如 Merrifield 固相合成) 或重組生產獲得本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子。在重組生產時，將例如上文所述之編碼抗體或雙特異性抗原結合分子 (片段) 的一種或多種多核苷酸分離並插入一種或多種載體中，以在宿主細胞中進一步克隆和/或表現。此等多核苷酸可易於使用習知方法進行分離和測序。在一個實施例中，提供了包含本發明之多核苷酸中的一種或多種的載體，較佳的是包含表現載體。可使用本領域的技術人員所公知的方法來構建包含抗體或雙特異性抗原結合分子 (片段) 的編碼序列以及適當的轉錄/翻譯控制信號的表現載體。這些方法包括體外重組 DNA 技術、合成技術及體內重組/基因重組。參見例如以下文獻中所述之技術：Maniatis 等人，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)；及 Ausubel 等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y (1989)。表現載體可以為質體、病毒的一部分，也可以為核酸片段。表現載體包括表達盒，其中將編碼抗體或雙特異性抗原結合分子 (片段) (即編碼區) 的多核苷酸與啟動子和/或其他轉錄或翻譯控制元件可操縱地締合以進行克隆。如本文所用的「編碼區」，為由翻譯成胺基酸的密碼子組成的核酸的一部分。儘管 「終止密碼子」 (TAG、TGA 或 TAA) 不翻譯成胺基酸，但可以將其視為編碼區的一部分 (如果存在)，但是任何側翼序列 (例如啟動子、核醣體結合位點、轉錄終止子、內含子、5’ 和 3’ 非翻譯區等) 不屬於編碼區的一部分。兩個或更多個編碼區可存在於單個多核苷酸構建體中，例如存在於單個載體上，或存在於單獨的多核苷酸構建體中，例如存在於單獨的 (不同的) 載體上。此外，任何載體可包含單個編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如，本發明之載體可編碼一種或多種多肽，該多肽經由蛋白水解後翻譯或共翻譯分離成最終蛋白。另外，本發明之載體、多核苷酸或核酸可編碼異源編碼區，其與編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子 (片段) 的多核苷酸或其變體或衍生物融合或不融合。異源編碼區包括但不限於專門的元件或基序 (諸如分泌信號肽) 或異源功能域。可操作的締合係指基因產物的編碼區 (例如多肽) 與一個或多個調控序列締合，從而使基因產物的表現處於調控序列的影響或控制之下。如果啟動子功能的誘導導致編碼所需基因產物的 mRNA 轉錄，並且兩個 DNA 片段之間的連接子性質不干擾表現調控序列指導基因產物表現的能力，也不干擾 DNA 模板被轉錄的能力，則兩個 DNA 片段 (例如多肽編碼區以及與之相締合的啟動子) 「可操縱地締合」。因此，如果啟動子能夠影響核酸的轉錄，則該啟動子區將與編碼多肽的核酸可操縱地締合。啟動子可以為細胞特異性啟動子，其僅指導預定細胞中 DNA 的大量轉錄。除啟動子外，其他轉錄控制元件，例如增強子、操縱子、阻遏子和轉錄終止信號，可與多核苷酸可操縱地締合以指導細胞特異性轉錄。本文公開了合適的啟動子及其他轉錄控制區。各種轉錄控制區為本領域的技術人員所公知的。其中包括但不限於在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如但不限於鉅細胞病毒 (例如直接早期啟動子，與內含子 A 結合)、猿猴病毒 40 (例如早期啟動子) 和逆轉錄病毒 (例如盧氏肉瘤病毒)。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因的那些，例如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素和兔 β-珠蛋白以及能夠控制真核細胞中基因表達的其他序列。其他合適的轉錄控制區包括組織特異性啟動子和增強子以及誘導型啟動子 (例如啟動子誘導的四環素)。類似地，各種翻譯控制元件為本領域的普通技術人員所公知的。其中包括但不限於核醣體結合位點、翻譯起始和終止密碼子以及來源於病毒體系的元件 (特別是內部核醣體進入位點或 IRES，也稱為 CITE 序列)。表達盒還可包含其他特徵，例如復制起點和/或染色體整合元件，例如逆轉錄病毒長末端重複序列 (LTR) 或腺相關病毒 (AAV) 反向末端重複序列 (ITR)。
本發明之多核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌或信號肽的其他編碼區締合，該分泌或信號肽指導由本發明之多核苷酸編碼的多肽的分泌。例如，如果需要分泌抗體或雙特異性抗原結合分子，可將編碼信號序列的 DNA 置於編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段的核酸的上游。根據信號假說，哺乳動物細胞所分泌之蛋白質具有信號肽或分泌前導序列，其在增長的蛋白質鏈透過粗內質網輸出時從成熟蛋白質上裂解下來。本領域的普通技術人員將認識到，脊椎動物細胞所分泌之多肽通常具有與多肽之 N 端融合的信號肽，其從翻譯後的多肽上裂解下來以產生分泌或「成熟」形式的多肽。在某些實施例中，使用天然信號肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽或該序列的功能性衍生物，該功能性衍生物保留指導與之可操縱地締合的分泌的能力。可替代地，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能性衍生物。例如，野生型前導序列可被人組織胞漿素原活化物 (TPA) 或小鼠 β-葡萄醣醛酸苷酶的前導序列取代。
編碼可用於促進以後的純化 (例如組胺酸標籤) 或輔助標記抗體或雙特異性抗原結合分子的短蛋白質序列的 DNA 可包括在編碼多核苷酸的抗體或雙特異性抗原結合分子 (片段) 的內部或末端。
在另一個實施例中，提供了包含本發明之一種或多種多核苷酸的宿主細胞。在某些實施例中，提供了包含本發明之一種或多種載體的宿主細胞。多核苷酸和載體可分別單獨或組合結合本文中相對於多核苷酸和載體所述的任何特徵。在一個此等實施例中，宿主細胞包含 (例如已被轉化或轉染) 一種或多種載體，該載體包含一種或多種編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子 (的一部分) 的多核苷酸。如本文所用的術語「宿主細胞」，係指可被工程化以產生本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段的任何類型的細胞體系。適於復制並支持抗體或雙特異性抗原結合分子的表現的宿主細胞為此技術領域中所公知。可在適當情況下用特定的表現載體轉染或轉導此等細胞，並且可生長大量包含載體的細胞以接種大規模發酵罐，獲得足夠量的抗體或雙特異性抗原結合分子以用於臨床應用。合適的宿主細胞包括原核微生物 (例如大腸桿菌) 或各種真核細胞 (例如中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)、昆蟲細胞等)。例如，多肽可能在細菌中產生，特別是在無需糖基化的情況下。在表現後，多肽可與細菌細胞糊中的可溶性部分分離，並可經過進一步純化。除原核生物以外，真核微生物 (如絲狀真菌或酵母菌) 也為合適的多肽編碼載體的克隆或表現宿主，包括其糖基化途徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而導致具有部分或完全人糖基化模式的多肽的產生。參見：Gerngross，Nat Biotech 22，1409-1414 (2004)；及 Li 等人，Nat Biotech 24，210-215 (2006)。用於表現 (糖基化) 多肽的合適的宿主細胞也來源於多細胞生物 (無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物和昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株，它們可以與昆蟲細胞結合使用，特別是用於轉染草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 細胞。植物細胞培養物也可以用作宿主。參見例如美國專利號 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978 及 6,417,429 (描述了在轉基因植物中生產抗體的 PLANTIBODIESTM 技術)。脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞係。可用的哺乳動物宿主細胞系的其他實例包括：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人胚胎腎系 (如 Graham 等人，J Gen Virol 36，59 (1977) 中所述之 293 或 293T 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather，Biol Reprod 23，243-251 (1980) 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather 等人，Annals N.Y.Acad Sci 383，44-68 (1982) 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 dhfr- CHO 細胞 (Urlaub 等人，Proc Natl Acad Sci USA 77，4216 (1980))；及骨髓瘤細胞系，例如 YO、NS0、P3X63 和 Sp2/0。有關某些適用於蛋白質生產的哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見例如：Yazaki 和 Wu，Methods in Molecular Biology，Vol. 248 (B.K.C. Lo 主編，Humana Press，Totowa, NJ)，pp. 255-268 (2003)。宿主細胞包括培養的細胞，例如哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞和植物細胞等，還包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物或動物組織內的細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，較佳的是哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞、人胚腎 (HEK) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。
標準技術為此領域中所公知，可在這些系統中表現外源基因。可對表現包含抗原結合域 (例如抗體) 的重鏈或輕鏈的多肽的細胞進行工程改造，使其也表現其他抗體鏈，從而使表現的產物為兼有重鏈和輕鏈的抗體。
在一個實施例中，提供了一種生產根據本發明所述之抗體或雙特異性抗原結合分子的方法，其中，該方法包括在適合於表現抗體或雙特異性抗原結合分子的條件下，培養包含編碼如本文所提供之抗體或雙特異性抗原結合分子的多核苷酸的宿主細胞，以及可選地從宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 中回收抗體或雙特異性抗原結合分子。
本發明之雙特異性抗原結合分子 (或抗體) 的成分可彼此基因融合。雙特異性抗原結合分子可設計為使其成分直接彼此融合或透過連接子序列間接融合。可根據此領域中所公知的方法確定連接子的組成和長度，並可以對其效力進行測試。本文提供了介於雙特異性抗原結合分子的不同成分之間的連接子序列的實例。如果需要，還可以包括附加的序列以摻入切割位點，以分離融合體的各種組分，例如內肽酶識別序列。
本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子通常包含至少一個能夠結合抗原決定位的抗體變異區。變異區可形成並來源於天然或非天然存在的抗體及其片段的一部分。用於生產多克隆抗體和單克隆抗體的方法為此技術領域中所公知 (參見例如 Harlow 和 Lane，"Antibodies, a laboratory manual"，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。非天然存在的抗體可使用固相肽合成來構建，可重組產生 (例如，如美國專利號 4,186,567 中所述)，或者可例如透過篩選包含變異重鏈和變異輕鏈的組合文庫來獲得 (參見例如授予 McCafferty 的美國專利號 5,969,108)。
在本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子中，可使用任何動物種類的抗體、抗體片段、抗原結合域或變異區。可用於本發明之非限制性抗體、抗體片段、抗原結合域或變異區可來源於鼠、靈長類或人。如果抗體或雙特異性抗原結合分子旨在供人使用，則可以使用抗體的嵌合形式，其中，抗體的恆定區來源於人。抗體的人源化或完全人源化形式也可以根據本領域中熟知的方法進行製備 (參見例如授予 Winter 的美國專利號 5,565,332)。人源化可以透過多種方法實現，這些方法包括但不限於：(a) 將非人類 (例如供體抗體) CDR 移植到人 (例如受體抗體) 框架和恆定區上，其中保留或不保留關鍵框架殘基 (例如，對於保持良好的抗原結合親和性或抗體功能很重要的那些)，(b) 僅將非人類特異性決定區域 (SDR 或 a-CDR；對抗體-抗原相互作用至關重要的殘基) 移植到人框架和恆定區，或 (c) 移植整個非人類變異域，但透過替換錶面殘基將其「隱藏」 (cloaking) 在仿人區段中。人源化抗體及其製備方法綜述於例如 Almagro 和 Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 中，並且進一步描述於例如：Riechmann 等人，Nature 332:323-329 (1988)；Queen 等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；US 專利號 5,821,337、7,527,791、6,982,321 和 7,087,409；Kashmiri 等人，Methods 36:25-34 (2005) (具體描述了決定區 (SDR) 接枝)；Padlan，Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (描述了「表面重塑」)；Dall’Acqua 等人，Methods 36:43-60 (2005) (描述了「FR 改組」)；Osbourn 等人，Methods 36:61-68 (2005)；及 Klimka 等人，Br. J. Cancer，83:252-260 (2000) (描述了 FR 改組的「導向選擇」法)。可以用於人源化的人框架區域包括但不限於：使用「最佳匹配」方法選擇的框架區域 (參見例如 Sims 等人  J. Immunol. 151:2296 (1993))；來源於輕鏈或重鏈變異區的特定亞組的人抗體的共有序列的框架區域 (參見例如：Carter 等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89:4285 (1992)；及 Presta 等人 J. Immunol.，151:2623 (1993))；人成熟的 (體細胞突變) 框架區域或人種系框架區域 (參見例如 Almagro 和 Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))；以及來源於篩選 FR 文庫的框架區域 (參見例如：Baca 等人，J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)；及 Rosok 等人，J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))。
可使用此領域中所公知的各種技術生產人抗體。人抗體一般性描述於：van Dijk 和 van de Winkel，Curr Opin Pharmacol 5，368-74 (2001)；及 Lonberg，Curr Opin Immunol 20，450-459 (2008)。可透過對轉基因動物給予免疫原來製備人抗體，該轉基因動物已被修飾以響應於抗原攻擊而產生完整的人抗體或具有人變異區的完整抗體。此等動物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合到動物的染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已被滅活。有關從轉基因動物中獲得人抗體的方法的綜述，參見 Lonberg，Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。另見例如：美國專利號 6,075,181 和 6,150,584 (描述了 XENOMOUSETM 技術)；美國專利號 5,770,429 (描述了 HUMAB® 技術)；美國專利號 7,041,870 (描述了 K-M MOUSE® 技術)；及美國專利申請公開號 US 2007/0061900 (描述了 VELOCIMOUSE® 技術)。由此等動物產生的來源於完整抗體的人變異區可被進一步修飾，例如透過與不同的人恆定區結合來修飾。
人抗體也可透過基於雜交瘤的方法進行製備。用於生產人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤細胞系已有描述。(參見例如：Kozbor J. Immunol.，133: 3001 (1984)；Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp. 51-63 (Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；及 Boerner 等人，J. Immunol.，147: 86 (1991)。) 透過人 B 細胞雜交瘤技術產生的人抗體也描述於 Li 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，103:3557-3562 (2006)。其他方法包括描述於例如以下文獻中的那些：美國專利號 7,189,826 (描述了由雜交瘤細胞系生產單克隆人 IgM 抗體)，及 Ni，Xiandai Mianyixue，26(4):265-268 (2006) (描述了人-人雜交瘤)。人雜交瘤技術 (Trioma 技術) 也描述於以下文獻中：Vollmers 和 Brandlein，Histology and Histopathology，20(3):927-937 (2005)；及 Vollmers 和 Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3):185-91 (2005)。
如本文所述的人抗體也可透過從人抗體文庫分離而產生。
用於本發明之抗體可透過篩選組合文庫中具有所需之一種或多種活性的抗體來分離。例如，用於篩選組合文庫的方法綜述於例如 Lerner 等人的 Nature Reviews 16:498-508 (2016)。例如，此領域中所公知的多種方法用於產生噬菌體展示文庫並篩選此等文庫中具有所需之結合特性的抗體。此等方法綜述於以下文獻中：Frenzel 等人的 mAbs 8:1177-1194 (2016)；Bazan 等人的 Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012)；及 Zhao 等人的 Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016)；以及 Hoogenboom 等人的 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien 等人主編，Human Press，Totowa，NJ，2001)；及 Marks 和 Bradbury 的 Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo 主編，Human Press，Totowa，NJ，2003)。
在某些噬菌體展示方法中，透過聚合酶鏈反應 (PCR) 分別克隆 VH 和 VL 基因庫，並在噬菌體文庫中隨機重組，然後可按照以下文獻所述之方法篩選抗原結合噬菌體：Winter 等人，Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994)。噬菌體通常以單鏈 Fv (scFv) 片段或 Fab 片段展示抗體片段。來自免疫源的文庫無需構建雜交瘤即可向免疫原提供高親和性抗體。可替代地，可以在不進行任何免疫的情況下克隆天然譜系 (例如，來自人) 以向各種非自身以及自身抗原提供抗體的單一來源，如 Griffiths 等人在 EMBO Journal 12: 725-734 (1993) 中所述。最後，還可以透過克隆幹細胞中未重排的 V 基因片段，並使用包含隨機序列的 PCR 引物來編碼高變異性 CDR3 區域並在體外完成重排，由此合成天然文庫，如 Hoogenboom 和 Winter 在 Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992) 中所述。描述人抗體噬菌體文庫的專利公開包括例如：美國專利號 5,750,373、7,985,840、7,785,903 及 8,679,490；以及美國專利公開號 2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764 及 2007/0292936。用於篩選組合文庫中具有所需活性之抗體的此領域中所公知方法的其他實例包括核醣體和 mRNA 展示以及用於細菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞上的抗體展示和選擇的方法。酵母表面展示方法綜述於例如 Scholler 等人的 Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012)、及 Cherf 等人的 Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015) 以及 Zhao 等人的 Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012) 中。於核醣體展示方法描述於例如 He 等人的 Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997) 及 Hanes 等人的 PNAS 94:4937-4942 (1997) 中。
按照本文所述之方法製備的抗體或雙特異性抗原結合分子可透過本領域中已知的技術進行純化，例如高效能液相層析法、離子交換層析法、凝膠電泳、親和力層析法、粒徑篩析層析法等。用於純化特定蛋白質之實際條件將部分取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且對本領域的技術人員而言為顯而易見的。對於親和力層析純化，可使用抗體、配體、受體或抗原以結合抗體或雙特異性抗原結合分子。例如，對於本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的親和力層析純化，可使用具有蛋白質 A 或蛋白質 G 的基體。可使用順序 Protein A 或 G 親和力層析法和粒徑篩析層析法分離基本上如實例中所述之抗體或雙特異性抗原結合分子。抗體或雙特異性抗原結合分子的純度可透過多種熟知的分析方法 (包括凝膠電泳法、高壓液相層析法等) 中的任一種進行測定。
分析
可采用此領域中所公知的各種分析法對本文所提供之抗體或雙特異性抗原結合分子的物理/化學性質和/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。
親和性分析
抗體或雙特異性抗原結合分子對 Fc 受體或靶抗原的親和性可通過表面等離振子共振 (SPR) 進行測定，其中使用標準儀器諸如 BIAcore 儀器 (GE Healthcare) 和受體或靶蛋白 (例如可通過重組表達獲得的那些)。另選地，可使用表現特定受體或靶抗原的細胞株 (例如通過流式細胞術 (FACS)) 評估抗體或雙特異性抗原結合分子對不同受體或靶抗原的結合。下面描述了用於測量結合親和性的具體的說明性和示例性實施例。
根據一個實施例，在 25℃ 下使用 BIACORE® T100 儀器 (GE Healthcare) 透過表面等離振子共振法測量 KD 。
為分析 Fc部分與 Fc 受體之間的相互作用，利用固定在 CM5 芯片上的抗 Penta His 抗體 (Qiagen) 捕獲 His 標記的重組 Fc 受體，並使用雙特異性構建體作為分析物。簡言之，根據供應商的說明，用 N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC) 和 N-羥基丁二酰亞胺 (NHS) 激活羧甲基化葡聚醣生物傳感器芯片 (CM5, GE Healthcare)。用 10 mM 乙酸鈉 (pH 5.0) 將抗 Penta-His 抗體稀釋至 40 μg/ml，然後以 5 μl/min 的流速注入，以獲得大約 6500 響應單位 (RU) 的偶聯蛋白。注入配體後，注入 1 M 乙醇胺以封閉未反應的基團。隨後，捕獲 Fc 受體 60 s，使其濃度達到 4 nM 或 10 nM。為實施動力學測量，在 25℃ 下，將抗體或雙特異性抗原結合分子之四倍系列稀釋液 (濃度範圍介於 500 nM 和 4000 nM 之間) 以 30 μl/min 的流速在 120 s 內注入 HBS-EP (GE Healthcare，10 mM HEPES，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.05% 表面活性劑 P20，pH 7.4) 中。
為確定對標靶抗原的親和性，抗體或雙特異性抗原結合分子由抗人 Fab 特異性抗體 (GE Healthcare) 捕獲，該抗體固定在活化 CM5 感測器晶片表面上，如針對抗 Penta-His 抗體所述。偶聯蛋白的最終量大約為 12000 RU。捕獲抗體或雙特異性抗原結合分子 90 s，使其濃度達到 300 nM。在 180 s 內，標靶抗原以 250 nM 至 1000 nM 的濃度範圍通過流通池，其流速為 30 μL/min。監測解離 180 s。
扣除參比流通池取得的回應，以校正本體折射率差。穩態回應用於透過 Langmuir 結合等溫線的非線性曲線擬合得出解離常數 KD。透過同時擬合結合和解離感測圖，使用簡單的一對一 Langmuir 結合模型 (BIACORE®T100 評估軟體版本 1.1.1) 計算結合速率 (kon) 和解離速率 (koff)。平衡解離常數 (KD) 透過 koff/kon 比率計算得出。參見例如：Chen 等人，J Mol Biol 293，865-881 (1999)。
活性分析
本發明之雙特異性抗原結合分子 (或抗體) 的生物活性可藉由如實例中所述的各種分析法來測量。生物活性可例如包括誘導 T 細胞的增殖、誘導 T 細胞中的信號傳導、誘導 T 細胞中活化標志物的表現、誘導 T 細胞分泌細胞因子、誘導靶細胞 (如腫瘤細胞) 裂解以及誘導腫瘤消退和/或改善生存率。
組成物、配方和給藥途徑
本發明之另一方面提供了包含本文所提供之任何抗體或雙特異性抗原結合分子的醫藥組成物，例如用於以下任何治療方法。在一個實施例中，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗體或雙特異性抗原結合分子和醫藥上可接受之載劑。在另一個實施例中，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗體或雙特異性抗原結合分子及至少一種附加治療劑 (如下文所述)。
還提供了一種以適合於體內給藥的形式產生本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的方法，該方法包括 (a) 獲得根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子，及 (b) 與至少一種醫藥上可接受之載劑一起配製抗體或雙特異性抗原結合分子，從而配製用於體內給藥之抗體或雙特異性抗原結合分子的製劑。
本發明之醫藥組成物包含治療有效量的溶於或分散於醫藥上可接受之載劑中的抗體或雙特異性抗原結合分子。短語「醫藥上或藥理學上可接受」係指在採用的劑量和濃度下通常對受體無毒的分子實體和組成物，即給予動物 (例如人) 時不產生不利的、過敏或其他不良反應 (在適當情況下)。根據本揭露，本技術領域具有通常知識者將認識到包含抗體或雙特異性抗原結合分子及可選的附加活性成分的醫藥組合物的製備方法，例如 Remington's Pharmaceutical Sciences 第 18 版 (Mack Printing Company，1990) 所述，該文獻以引用方式併入本文。此外，對於動物 (例如，人) 給藥，應當理解，製劑應符合 FDA 生物製品標準辦公室或其他國家/地區的有關部門所要求的無菌性、熱原性、一般安全性和純度標準。優選的組成物為凍乾製劑或水溶液。如本文所使用的「醫藥上可接受之載劑」，包括任何及所有溶劑、緩沖液、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑 (例如抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、抗氧化劑、蛋白質、藥物、藥物穩定劑、聚合物、凝膠、粘結劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料，諸如本技術領域具有通常知識者已知的材料及其組合 (參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第 18 版，Mack Printing Company，1990，pp. 1289-1329，該文獻以引用方式併入本文)。除非任何常規載劑與活性成分不相容，否則考慮其在治療或醫藥組合物中的用途。
本發明之免疫複合體 (及任何其他治療劑) 可透過任何合適的方式給藥，包括腸胃外、肺內和鼻內給藥，並且如果需要局部治療，則可以採用病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下給藥。給藥可透過任何合適的途徑進行，例如透過注射，例如靜脈內或皮下注射，部分取決於短暫給藥還是長期給藥。
腸胃外組成物包括設計用於透過注射給藥的那些，例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內肌內、鞘內或腹膜內註射。對於注射，可在水溶液中 (較佳地在生理相容性緩衝劑，如 Hanks 溶液、Ringer 溶液或生理鹽水緩衝劑) 中配製本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子。該溶液可包含配製劑，例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。可替代地，抗體或雙特異性抗原結合分子可以呈粉末形式，以便在使用前與合適的載劑例如無菌、無熱原水一起配製。藉由將所需量的本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子與適當的溶劑以及所需的以下枚舉之多種其他成分混合，製備無菌注射液。無菌性可易於例如藉由無菌濾膜過濾來實現。通常，藉由將各種滅菌后的活性成分摻入含有基本分散介質和/或其他成分的無菌載劑中來製備分散液。對於用於製備無菌注射液、混懸劑或乳劑的無菌粉末，優選的製備方法是真空乾燥或冷凍乾燥技術，該技術可從先前過濾後的無菌液體介質中得到活性成分與任何其他所需成分的粉末。如有必要，應適當緩衝液體介質，並且在註射足夠的鹽水或葡萄糖之前先使液體稀釋劑等滲。組成物必須在製造和儲存條件下保持穩定，並且必須能夠抵抗諸如細菌和真菌等微生物的污染作用。應當理解，內毒素污染應最小限度地保持在安全濃度，例如，小於 0.5 ng/mg 蛋白質。合適的醫藥上可接受之載劑包括但不限於：緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑 (例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨；芐索銨氯化物；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑 (例如 EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物 (例如鋅蛋白錯合物)；和/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇 (PEG)。水性注射懸浮液可包含提高混懸劑粘度的化合物，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、右旋葡萄聚糖等。可選地，懸浮液還可包含合適的穩定劑或提高化合物溶解度的試劑，以製備高濃度溶液。另外，可將活性化合物的懸浮液製備為合適的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或載劑包括脂肪油 (例如芝麻油) 或合成脂肪酸酯 (例如 ethyl cleats 或甘油三酯) 或脂質體。
活性成分可以包載在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。此等技術公開於 Remington’s Pharmaceutical Sciences (第 18 版，Mack Printing Company，1990) 中。可以製備緩釋製劑。緩釋製劑的適宜的實例包括含有多肽的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成形物品的形式，例如膜或微囊。在特定實施例中，可以藉由在組成物中使用延遲吸收的物質 (例如單硬脂酸鋁、明膠或其組合) 來產生可注射組成物的延長吸收。
除之前描述的組合物外，該雙特異性抗原結合分子還可以配製為儲存製劑。此等長效製劑可以透過植入 (例如皮下或肌內) 或透過肌內注射施用。因此，例如抗體或雙特異性抗原結合分子可以用適宜的聚合物質或疏水物質 (例如作為可用油中的乳狀液) 或離子交換樹脂配製，或作為微溶的衍生物，例如作為微溶的鹽配製。
包含本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的醫藥組成物可以利用習用的混合、溶解、乳化、包封、包載或凍幹方法來製備。可使用一種或多種有助於將蛋白質加工成可藥用製劑的生理上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑以習用方式配製醫藥組成物。適宜的製劑視所選的給藥途徑而定。
抗體或雙特異性抗原結合分子可以以游離酸或鹼，中性或鹽形式配製成組成物。醫藥上可接受之鹽為基本上保持游離酸或鹼的生物學活性的鹽。這些包括酸加成鹽，例如與蛋白質組成物的游離氨基形成的那些，或與無機酸 (例如，鹽酸、磷酸或磷酸) 或有機酸 (諸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸) 形成的那些。與游離羧基形成的鹽還可以衍生自：無機鹼，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因。藥用鹽趨向於比對應的游離鹼形式更易溶於水性溶劑和其他質子性溶劑。
治療方法和組成物
本文中提供的抗體或雙特異性抗原結合分子中的任一種都可以用於治療方法。本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子可以用作免疫治療劑，例如用於癌症的治療中。
為了在治療方法中使用，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子將以符合良好醫療實踐的方式予以配製、給藥和施用。此背景中考慮的因素包括待治療的具體障礙、待治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的原因、遞送藥物的部位、施用方法、施用日程及醫療從業者已知的其他因素。
在一個方面，提供了本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子用作藥物。在另一方面，提供了本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子用於治療疾病。在某些實施例中，提供了本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子以用於治療的方法中。在一個實施例中，本發明提供了本文中所述之抗體或雙特異性抗原結合分子用於在有需要的個體中治療疾病。在某些實施例中，本發明提供了抗體或雙特異性抗原結合分子用於治療患有疾病的個體的方法，該方法包括對該個體施用治療有效量的抗體或雙特異性抗原結合分子。在某些實施例中，待治療之疾病為增生性疾病。在一個特定實施例中，疾病為癌症。在某些實施例中，該方法進一步包括對該個體施用治療有效量的至少一種其他治療劑，例如抗癌劑 (如果該待治療的疾病為癌症)。在另外的實施例中，本發明提供了如本文所述之抗體或雙特異性抗原結合分子用於誘導標靶細胞、特別是腫瘤細胞裂解。在某些實施例中，本發明提供了抗體或雙特異性抗原結合分子用於在個體中誘導標靶細胞、特別是腫瘤細胞裂解的方法中，該方法包括對個體施用有效量的抗體或雙特異性抗原結合分子以誘導標靶細胞裂解。根據上述任一實施例中的「個體」為哺乳動物，較佳地為人。在某些實施例中，待治療之疾病為自體免疫疾病，特別地為全身性紅斑狼瘡和/或類風濕關節炎。自身反應性漿細胞產生致病性自身抗體為自體免疫疾病的標誌。因此，GPRC5D 可用於靶向自體免疫疾病中的自反應漿細胞。
本發明之另一方面提供了本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子在藥物的製造或製備中的用途。在一個實施例中，藥物用於治療有需要的個體的疾病。在另一個實施例中，藥物用於治療疾病的方法中，該方法包括向患有疾病的個體施用治療有效量的藥物。在某些實施例中，待治療之疾病為增生性疾病。在一個特定實施例中，疾病為癌症。在一個實施例中，該方法進一步包括對該個體施用治療有效量的至少一種其他治療劑，例如抗癌劑 (如果待治療的疾病為癌症)。在另一個實施例中，藥物用於誘導標靶細胞、特別是腫瘤細胞裂解。在又一個實施例中，藥物用於在個體中誘導標靶細胞、特別是腫瘤細胞裂解的方法中，該方法包括對個體施用有效量的藥物以誘導標靶細胞裂解。根據上述任一實施例中「個體」可為哺乳動物，較佳地為人。
本發明之另一方面提供了一種治療疾病的方法。在一個實施例中，該方法包括向患有此等疾病的個體施用治療有效量的本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，向所述個體施用包含本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的組成物，該組成物呈醫藥上可接受之形式。在某些實施例中，待治療之疾病為增生性疾病。在一個特定實施例中，疾病為癌症。在某些實施例中，該方法進一步包括對該個體施用治療有效量的至少一種其他治療劑，例如抗癌劑 (如果該待治療的疾病為癌症)。根據上述任一實施例中「個體」可為哺乳動物，較佳地為人。
本發明之另一方面提供了一種誘導標靶細胞、特別是腫瘤細胞裂解的方法。在一個實施例中，該方法包括在 T 細胞、特別是細胞毒性 T 細胞的存在下，使標靶細胞與本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子接觸。在另一方面，提供了一種誘導個體中標靶細胞、特別是腫瘤細胞裂解的方法。在一個此等實施例中，該方法包括對個體施用有效量的抗體或雙特異性抗原結合分子以誘導標靶細胞裂解。在一個實施例中，「個體」為人。
在某些實施例中，待治療之疾病為增生性疾病，特別地為癌症。癌症的非限制性實例包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、子宮內膜癌、食管癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌和腎癌。可使用本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子治療的其他細胞增殖性疾病包括但不限於定位在以下部位中的腫瘤：腹部、骨骼、乳腺、消化系統、肝、胰腺、腹膜、內分泌腺 (腎上腺、甲狀旁腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭和頸、神經系統 (中樞和外周)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾、胸部和泌尿生殖系統。還包括癌前狀況或病變和癌症轉移。在某些實施例中，癌症選自腎癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳腺癌、腦癌和頭頸癌。在一個實施例中，癌症為前列腺癌。熟練的技術人員容易地認識到，在許多情況下，該抗體或雙特異性抗原結合分子可能無法提供治愈，而只能提供部分益處。在一些實施例中，還認為具有某種益處的生理變化在治療上有益。因此，在一些實施例中，認為提供生理變化的抗體或雙特異性抗原結合分子的量被認為是「有效量」或「治療有效量」。需要治療的受試者、患者或個體通常為哺乳動物，更具體地為人。
在一些實施例中，對細胞施用有效量的本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子。在其他實施例中，對個體施用治療有效量的本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子以治療疾病。
對於疾病的預防或治療，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的適當劑量 (單獨使用或與一種或多種其他其他治療劑組合使用) 將取決於待治療的疾病的類型、給藥途徑、患者的體重、抗體或雙特異性抗原結合分子的類型、疾病的嚴重度和病程、為了預防或是治療的目的施用該抗體或雙特異性抗原結合分子、之前或並行的治療干預、患者的臨床病史和對該抗體或雙特異性抗原結合分子的反應及主治醫師的判斷。在任何情況下，負責給藥的從業者將確定組成物中一種或多種活性成分的濃度以及單個受試者的合適劑量。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次給藥、快速注射給藥和脈衝輸注。
在一次或一系列的治療中適宜地對患者施用抗體或雙特異性抗原結合分子。根據疾病的類型和嚴重程度不同，約 1 µg/kg 至 15 mg/kg (例如 0.1 mg/kg – 10 mg/kg) 的抗體或雙特異性抗原結合分子可為例如透過一次或多次分開的施用或透過連續輸注來對患者施用的初始候選劑量。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約 1 µg/kg 至 100 mg/kg 或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複給藥，視病症而定，治療通常將持續直至出現所需的疾病症狀抑制。抗體或雙特異性抗原結合分子的一種例示性劑量將在從 0.005 mg/kg 至約 10 mg/kg 的範圍內。在其他非限制性實例中，劑量還可以包含每次施用從約 1 微克/千克體重、約 5 微克/千克體重、約 10 微克/千克體重、約 50 微克/千克體重、約 100 微克/千克體重、約 200 微克/千克體重、約 350 微克/千克體重、約 500 微克/千克體重、約 1 毫克/千克體重、約 5 毫克/千克體重、約 10 毫克/千克體重、約 50 毫克/千克體重、約 100 毫克/千克體重、約 200 毫克/千克體重、約 350 毫克/千克體重、約 500 毫克/千克體重至約 1000 毫克/千克體重或更多及可從其衍生的任意範圍。在從本文中所列的數字衍生的範圍的非限制性實例中，可基於上述數字施用約 5 毫克/千克體重至約 100 毫克/千克體重、約 5 微克/千克體重至約 500 毫克/千克體重範圍內的劑量。因此，可以對患者施用約 0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg 或 10 mg/kg 中的一種或多種劑量 (或其任意組合)。此等劑量可以間歇施用，例如每週或每三周施用 (例如，使得患者接受約 2 種至約 20 種或例如約 6 種劑量的抗體或雙特異性抗原結合分子)。可以施用初始較高的負荷劑量，然後施用一種或多種較低的劑量。但是，可以使用其他劑量方案。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展。
本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子通常將以對達到預期目的有效的量使用。為用於治療或預防疾病病症，以治療有效量施用或應用本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子或其醫藥組成物。尤其是鑒於本文中提供的詳細揭露，確定治療有效量完全在本技術領域具有通常知識者的能力範圍之內。
對於全身施用，最初可以從諸如細胞培養物測定的體外測定估計治療有效劑量。然後可以在動物模型中製定劑量，以達到包括細胞培養物中確定的 IC50 在內的循環濃度範圍。此等資訊可用於更準確地確定對人體有用的劑量。
也可以使用本技術領域中熟知的技術，根據體內數據 (例如動物模型) 估計初始劑量。本技術領域具有通常知識者可以根據動物數據容易地優化對人的給藥。
可以單獨調節劑量和間隔來提供足以維持治療效果的抗體或雙特異性抗原結合分子的血漿濃度。透過注射施用的常見患者劑量在約 0.1-50 mg/kg/天的範圍內，典型範圍為 0.5-1 mg/kg/天。可以透過每天施用多種劑量來達到治療有效的血漿濃度。血漿中的濃度可以例如透過 HPLC 來測量。
在局部施用或選擇性攝取的情況下，抗體或雙特異性抗原結合分子的有效局部濃度可能與血漿濃度無關。本技術領域的習知者將能夠在無需過度實驗的情況下優化治療有效的局部劑量。
本文中所述的抗體或雙特異性抗原結合分子的治療有效劑量通常將提供治療益處而不引起實質性毒性。可透過標準藥學方法在細胞培養物或實驗動物中測定抗體或雙特異性抗原結合分子的毒性和治療有效性。可以用細胞培養物測定和動物研究來測定 LD50 (致死群體的 50% 的劑量) 和 ED50 (在群體的 50% 中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數，其可以表示為比值 LD50 /ED50 。優選為具有大治療指數的抗體或雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子具有高治療指數。從細胞培養測定法和動物研究中得到的數據可用於配製適用於人類的一系列劑量。劑量較佳地在包括很小毒性或無毒性的 ED50 的循環濃度範圍內。劑量可根據多種因素 (例如所採用的劑型、所利用的給藥途徑、受試者的狀況等) 在此範圍內變化。精確的製劑、給藥途徑和劑量可以由個別醫師基於患者的病症來選擇 (參見例如 Fingl 等人，1975，在：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第 1 章第 1 頁，該文獻全文以引用方式併入本文)。
用本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子治療的患者的主治醫師將指導如何及何時由於毒性、器官功能障礙等而終止、中斷或調整施用。相反，主治醫師還將知道在臨床反應不充分 (排除毒性) 時如何將治療調整至更高的水平。在目標疾病的治療中，給藥劑量的大小將隨待治療疾病的嚴重程度、給藥途徑等而變化。病症的嚴重程度可部分地透過例如標準預後評價法來評價。此外，劑量以及可能的給藥頻率也將根據個體患者的年齡、體重和反應而變化。
其他藥物和治療
本發明之抗體和雙特異性抗原結合分子可以在治療中與一種或多種其他藥物聯合施用。例如，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子可以與至少一種其他治療劑聯合施用。術語「治療劑」涵蓋為治療需要此等治療的個體中的症狀或疾病而施用的任何藥劑。此等另外的治療劑可包含適合於所治療的特定適應症的任何活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。在某些實施例中，該另外的治療劑為免疫調節劑、細胞生長抑製劑、細胞粘附抑製劑、細胞毒劑、細胞凋亡啟動劑或增加細胞對凋亡誘導劑敏感性的藥物。在一個特定實施例中，該另外的治療劑為抗癌劑，例如微管破壞劑、抗代謝藥、拓撲異構酶抑製劑、DNA 嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑製劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡啟動劑或抗血管發生劑。
此等其他藥物適宜地以對預期目的有效的量組合存在。此等其他藥物的有效量視所使用的抗體或雙特異性抗原結合分子的量、疾病或治療的類型以及上文討論的其他因素而定。抗體或雙抗體抗原結合分子通常以與本文中所述相同的劑量和給藥途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量和透過任意途徑使用。
上面提到的此等聯合療法涵蓋聯合施用 (其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的組成物中)，以及單獨施用，在這種情況下，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的施用可在施用其他治療劑和/或佐劑之前、同時和/或之後發生。本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子還可以與放射療法聯合使用。
製成品
本發明的另一方面提供包含用於治療、預防和/或診斷上述疾病的製成品。製成品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或包裝說明書。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV 溶液袋等。容器可以由多種材料例如玻璃或塑膠形成。該容器可容納組成物，該組成物本身或與有效治療、預防和/或診斷疾病的另一組成物結合使用，並可能具有無菌入口 (例如，容器可為具有可透過皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組成物中的至少一種活性劑為本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子。標籤或包裝說明書指示該組成物用於治療所選擇的疾病。此外，該製品可以包括 (a) 其中包含有組成物的第一容器，其中，該組成物包含本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子；及 (b) 其中包含有組成物的第二容器，其中，組成物包含其他細胞毒性或其他治療劑。本發明之此實施例中的製成品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的包裝說明書。可替代地或另外地，製成品可以進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer 溶液和葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。
用於診斷和檢測之方法及組成物
在某些實施例中，本文提供的任何抗 GPRC5D 抗體可用於檢測生物樣品是否存在 GPRC5D。如本文所用的術語「檢測」，涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物樣品包括細胞或組織 (諸如前列腺組織)。
在一個實施例中，提供了一種用於診斷或檢測方法中的抗 GPRC5D 抗體。在另一方面，提供了一種檢測生物樣品中是否存在 GPRC5D 的方法。在某些實施例中，該方法包括在允許抗 GPRC5D 抗體與 GPRC5D 結合的條件下使生物樣品與本文所述之抗 GPRC5D 抗體接觸，並檢測抗 GPRC5D 抗體與 GPRC5D 之間是否形成複合物。此等方法可為體外或體內方法。在一個實施例中，使用抗 GPRC5D 抗體來選擇適合使用抗 GPRC5D 抗體進行治療的受試者，例如 GPRC5D 為用於選擇患者的生物標志物。
可使用本發明之抗體診斷的例示性疾病包括癌症，特別是多發性骨髓瘤。
在某些實施例中，提供了標記的抗 GPRC5D 抗體。標記包括但不限於直接檢測的標記或部分 (例如螢光、髮色、電子緻密、化學發光和放射性標記)，以及間接檢測 (例如，透過酶促反應或分子相互作用) 的部分，例如酶或配體。例示性標記包括但不限於：放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H 及131 I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；玫瑰紅及其衍生物；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶 (美國專利號 4,737,456)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；辣根過氧化物酶 (HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖 6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫氧化染料前體 (例如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶) 的酶結合使用；生物素/抗生物素蛋白；旋轉標記；噬菌體標記；穩定自由基等。
本發明的另一方面涉及與 GPRC5D 結合之抗體 (10B10)，該抗體包含重鏈變異區 (VL)，其中，VL 可包含與 SEQ ID NO: 81 之序列至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。該抗體可包含輕鏈變異區 (VL)，其中，VL 包含與 SEQ ID NO: 82 之序列至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。該抗體可包含 VH 及 VL，其中，VL 可包含與 SEQ ID NO: 81 之序列至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列，且其中，VL 包含與 SEQ ID NO: 82 之序列至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。優選地，該抗體包含：VH，該 VH 包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列；及 VL，該 VL 包含 SEQ ID NO: 82 之胺基酸序列。
本發明的另一方面涉及一種抗體 (10B10-TCB)。該抗體可包含第一輕鏈，其中，第一輕鏈包含與 SEQ ID NO: 67 之序列至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。該抗體可包含第二輕鏈，其中，第二輕鏈包含與 SEQ ID NO: 68 之序列至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。該抗體可包含第一重鏈，其中，第一重鏈包含與 SEQ ID NO: 69 之序列至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。該抗體可包含第二重鏈，其中，第二重鏈包含與 SEQ ID NO: 70 之序列至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。在一個特定實施例中，該抗體包含：第一輕鏈，該第一輕鏈包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；第二輕鏈，該第二輕鏈包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列；第一重鏈，該第一重鏈包含 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列；及第二重鏈，該第二重鏈包含 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列。胺基酸序列
胺基酸序列 序列識別號
5E11-VH-HCDR1 GFTFSKYAMA 1
5E11-VH-HCDR2 STGGVNTYYRDSVKA 2
5E11-VH-HCDR3 HTGDYFDY 3
5E11-VL-LCDR1 ASQSVSISGINLMN 4
5E11-VL-LCDR2 HASILAS 5
5E11-VL-LCDR3 QQTRESPLT 6
5F11-VH-HCDR1 GFSFSNYGMA 7
5F11-VH-HCDR2 STGGGNTYYRDSVKG 8
5F11-VH-HCDR3 HDRGGLY 9
5F11-VL-LCDR1 RSSKSLLHSNGITYVY 10
5F11-VL-LCDR2 RMSNLAS 11
5F11-VL-LCDR3 GQLLENPYT 12
5E11-VH ELQLEQSGGGLVQPGGSLTLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPTKGLEWVASISTGGVNTYYRDSVKARFTISRDNAKNTQYLQMDSLRSEDTATYYCATHTGDYFDYWGQGVMVTVSS 13
5E11-VL DIVLTQSPALAVSPGQRATISCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGIPTRFSGSGSGTDFTLTIDPVQADDIATYYCQQTRESPLTFGSGTNLEIK 14
5F11-VH EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAATKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFIVSRDNAKNTQYLQMDSLRSEDTATYYCTRHDRGGLYWGQGVMVTVSS 15
5F11-VL DIVMTQAPLSVSVTPGESASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYFQKPGKSPQVLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSETDFTLKISRVEAEDVGIYHCGQLLENPYTFGAGTELELK 16
5E11-TCB-LC1(GPRC5D) DIVLTQSPALAVSPGQRATISCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGIPTRFSGSGSGTDFTLTIDPVQADDIATYYCQQTRESPLTFGSGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 17
5E11-TCB-LC2(CD3) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 18
5E11-TCB-HC “臼” (hole) ELQLEQSGGGLVQPGGSLTLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPTKGLEWVASISTGGVNTYYRDSVKARFTISRDNAKNTQYLQMDSLRSEDTATYYCATHTGDYFDYWGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 19
5E11-TCB-HC “杵” (knob) ELQLEQSGGGLVQPGGSLTLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPTKGLEWVASISTGGVNTYYRDSVKARFTISRDNAKNTQYLQMDSLRSEDTATYYCATHTGDYFDYWGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 20
5F11-TCB-LC1(GPRC5D) DIVMTQAPLSVSVTPGESASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYFQKPGKSPQVLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSETDFTLKISRVEAEDVGIYHCGQLLENPYTFGAGTELELKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 21
5F11-TCB-LC2(CD3) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 22
5F11-TCB-HC “臼” (hole) EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAATKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFIVSRDNAKNTQYLQMDSLRSEDTATYYCTRHDRGGLYWGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 23
5F11-TCB-HC “杵” (knob) EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAATKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFIVSRDNAKNTQYLQMDSLRSEDTATYYCTRHDRGGLYWGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 24
ET150-5-TCB-LC1(GPRC5D) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSRSNVGGNYVFWYQQVPGATPKLLIYRSNQRPSGVPDRFAGSKSGSSASLAISGLRSEDEADYYCATWDDSLSGFVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSKKLQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 25
ET150-5-TCB-LC2(CD3) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 26
ET150-5-TCB-HC “臼” (hole) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGKAYDQWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 27
ET150-5-TCB-HC “杵” (knob) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGKAYDQWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 28
CD3-VH-HCDR1 TYAMN 29
CD3-VH-HCDR2 RIRSKYNNYATYYADSVKG 30
CD3-VH-HCDR3 HGNFGNSYVSWFAY 31
CD3-LH-LCDR1 GSSTGAVTTSNYAN 32
CD3-LH-LCDR2 GTNKRAP 33
CD3-LH-LCDR3 ALWYSNLWV 34
CD3-VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 35
CD3-VL QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 36
人 κ CL 域 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 37
人 λ CL 域 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 38
人 IgG1 重鏈恒定(CH1-CH2-CH3) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 39
hCD3 MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI 40
cynoCD3 MQSGTRWRVLGLCLLSIGVWGQDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILTCSQHLGSEAQWQHNGKNKEDSGDRLFLPEFSEMEQSGYYVCYPRGSNPEDASHHLYLKARVCENCMEMDVMAVATIVIVDICITLGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQQDLYSGLNQRRI 41
hIgG1 Fc 區域 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 42
連接子 GGGGSGGGGS 43
連接子 DGGGGSGGGGS 44
人 GPRC5D MYKDCIESTGDYFLLCDAEGPWGIILESLAILGIVVTILLLLAFLFLMRKIQDCSQWNVLPTQLLFLLSVLGLFGLAFAFIIELNQQTAPVRYFLFGVLFALCFSCLLAHASNLVKLVRGCVSFSWTTILCIAIGCSLLQIIIATEYVTLIMTRGMMFVNMTPCQLNVDFVVLLVYVLFLMALTFFVSKATFCGPCENWKQHGRLIFITVLFSIIIWVVWISMLLRGNPQFQRQPQWDDPVVCIALVTNAWVFLLLYIVPELCILYRSCRQECPLQGNACPVTAYQHSFQVENQELSRARDSDGAEEDVALTSYGTPIQPQTVDPTQECFIPQAKLSPQQDAGGV 45
5E11_VH1a EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYRDSVKARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS 46
5E11_VH1b ELQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYRDSVKARFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS 47
5E11_VH1c EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS 48
5E11_VH1d ELQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS 49
5E11_VL1a DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 50
5E11_VL1c DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 51
5E11_VL2a EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPRLLIYHASILASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 52
5E11_VL2b EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 53
5E11_VL3a DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGKQPKLLIYHASILASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 54
5E11_VL3b DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 55
5F11_VH1a QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 56
5F11_VH1b EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 57
5F11_VH1c QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 58
5F11_VH1d EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 59
5F11_VH2b EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 60
5F11_VH2d EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 61
5F11_VL1a DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGQSPQVLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 62
5F11_VL1b DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGKSPQVLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 63
5F11_VL2a DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGQSPQLLIYRMSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 64
5F11_VL2b DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSKSLLHSNGITYVYWYQQKPGQPPKLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 65
5F11_VL2c EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASKSLLHSNGITYVYWYQQKPGQAPRLLIYRMSNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 66
10B10 TCB_LC1 DIQLTQSPHSLSASLGETVSIECLASEGISNYLAWFHQKPGKSPQLLIYYASSLQDGVPSRFSGSGSGTQYSLKISNMQPEDEGVYYCQQGYKYPLTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 67
10B10 TCB_LC2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 68
10B10TCB_HC (Fc “臼” (hole)) EVQLVESGGGLVQPGRSMKLSCAASGFTFTNFYMAWVRQAPTKALEWVASINTGGGYTYYRDSVKGRFTVSRDNTRSTLYLQMDSLRSEETATYYCARHLTYYGRYYYFDYWGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 69
10B10TCB_HC (Fc “杵” (knob)) EVQLVESGGGLVQPGRSMKLSCAASGFTFTNFYMAWVRQAPTKALEWVASINTGGGYTYYRDSVKGRFTVSRDNTRSTLYLQMDSLRSEETATYYCARHLTYYGRYYYFDYWGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 70
07A04 IgG_LC DVQMTQSPYNLAASPGESVSINCKASKSISKYLAWYQQKPGKANKLLIYDGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLEPEDFGLYYCQQHNEYPLTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 71
07A04 IgG_HC QVTLKESGPGILQPSHTLSLTCSFSGFSLSTYGMGVNWIRQPSGKGLEWLASIWWNGNTYNNPSLKSRLTVSKDTSNNQAFLKVTSVDTADTATYYCVHTRGIIRGRGLFFDYWGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 72
B72-TCB_HC1 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 73
B72-TCB_LC1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 74
B72-TCB_HC2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNSDTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARVALRVALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 75
B72-TCB_LC2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVATHVGWYQQKPGKAPKRLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCQQYNRYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 76
BCMA-TCB-HC1 (“臼” (hole)) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAITASGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMSLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 77
BCMA-TCB-LC1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSAYYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYERWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 78
BCMA-TCB-HC2 (“杵” (knob)) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAITASGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMSLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 79
BCMA-TCB-LC2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 80
10B10_VH DIQLTQSPHSLSASLGETVSIECLASEGISNYLAWFHQKPGKSPQLLIYYASSLQDGVPSRFSGSGSGTQYSLKISNMQPEDEGVYYCQQGYKYPLTFGSGTKLEIK 81
10B10_VL EVQLVESGGGLVQPGRSMKLSCAASGFTFTNFYMAWVRQAPTKALEWVASINTGGGYTYYRDSVKGRFTVSRDNTRSTLYLQMDSLRSEETATYYCARHLTYYGRYYYFDYWGQGVMVTVSS 82
5E11_P1AE5706_PARENT-VH-HCDR1 GFTFSKYAMA 83
5E11_P1AE5706_PARENT-VH-HCDR2 SISTGGVNTYYRDSVKA 84
5E11_P1AE5723_P1AE5728_VH-HCDR2 SISTGGVNTYYADSVKG 85
5E11_P1AE5706_PARENT-VH-HCDR3 HTGDYFDY 86
5E11_P1AE5706_PARENT-VL-LCDR1 RASQSVSISGINLMN 87
5E11_P1AE5706_PARENT-VL-LCDR2 HASILAS 88
5E11_P1AE5706_PARENT-VL-LCDR3 QQTRESPLT 89
5F11_P1AE5733_PARENT-VH-HCDR1 GFSFSNYGMA 90
5F11_P1AE5733_PARENT-VH-HCDR2 SISTGGGNTYYRDSVKG 91
PF11_P1AE5745_VL-HCDR2 SISTGGGNTYYADSVKG    92
5F11_P1AE5733_PARENT-VH-HCDR3 HDRGGLY 93
5F11_P1AE5733_PARENT-VL-LCDR1 RSSKSLLHSNGITYVY 94
5F11_P1AE5733_PARENT-VL-LCDR2 RMSNLAS 95
5F11_P1AE5741_VL_LCDR2 RMSNRAS 96
5F11_P1AE5733_PARENT-VL-LCDR3 GQLLENPYT 97
CD3-Cl22-VH-HCDR1 SYAMN 98
CD3-Cl22-VH-HCDR2 RIRSKYNNYATYYADSVKG 99
CD3-Cl22-VH-HCDR3 HTTFPSSYVSYYGY 100
CD3-Cl22-VH-LCDR1 GSSTGAVTTSNYAN 101
CD3-Cl22-VH-LCDR2 GTNKRAP 102
CD3-Cl22-VH-LCDR3 ALWYSNLWV 103
CD3-Cl22-VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQA PGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGT LVTVSS 104
CD3-Cl22-VL QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQE KPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQ PEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 105
CD3-V9-VH-HCDR1 GYSFTGYTMN 106
CD3-V9-VH-HCDR2 LINPYKGVSTYNQKFKD 107
CD3-V9-VH-HCDR3 SGYYGDSDWYFDV 108
CD3-V9-VH-LCDR1 RASQDIRNYLN 109
CD3-V9-VH-LCDR2 YTSRLES 110
CD3-V9-VH-LCDR3 QQGNTLPWT 111
CD3-V9-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS 112
CD3-V9-VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEI 113
5F11(VH1b + VL2a)-Cl22-TCB- LC1(antiGPRC5D)  (P1AE6623) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGQSPQLLIYRMSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 114
5F11(VH1b + VL2a)-Cl22-TCB- LC2(antiCD3)  (P1AE6623) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 115
5F11(VH1b + VL2a)-Cl22-TCB- HC1(Fc “臼” (hole))  (P1AE6623) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 116
5F11(VH1b + VL2a)-Cl22-TCB- HC2(Fc “杵” (knob))  (P1AE6623) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 117
5F11(VH1c+VL1b)-Cl22-TCB- LC1(antiGPRC5D)  (P1AE6624) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGKSPQVLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 118
5F11(VH1c+VL1b)-Cl22-TCB- LC2(antiCD3)  (P1AE6624) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 119
5F11(VH1c+VL1b)-Cl22-TCB- HC1(Fc “臼” (hole))  (P1AE6624) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 120
5F11(VH1c+VL1b)-Cl22-TCB- HC2(Fc “杵” (knob))  (P1AE6624) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 121
5E11(VH1c+VL2b)-Cl22-TCB- LC1(antiGPRC5D)  (P1AE6625) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 122
5E11(VH1c+VL2b)-Cl22-TCB- LC2(antiCD3)  (P1AE6625) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 123
5E11(VH1c+VL2b)-Cl22-TCB- HC1(Fc “臼” (hole))  (P1AE6625) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 124
5E11(VH1c+VL2b)-Cl22-TCB- HC2(Fc “杵” (knob))  (P1AE6625) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 125
5E11(VH1d+VL2a)-Cl22-TCB- LC1(antiGPRC5D)  (P1AE6626) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPRLLIYHASILASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 126
5E11(VH1d+VL2a)-Cl22-TCB- LC2(antiCD3)  (P1AE6626) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 127
5E11(VH1d+VL2a)-Cl22-TCB- HC1(Fc “臼” (hole))  (P1AE6626) ELQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 128
5E11(VH1d+VL2a)-Cl22-TCB- HC2(Fc “杵” (knob))  (P1AE6626) ELQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 129
5F11(VH1c+VL1b)-V9-TCB-LC1(antiGPRC5D) (P1AF1336) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGKSPQVLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 130
5F11(VH1c+VL1b)-V9-TCB-LC2(antiCD3) (P1AF1336) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 131
5F11(VH1c+VL1b)-V9-TCB-HC1 (Fc “臼” (hole)) (P1AF1336) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 132
5F11(VH1c+VL1b)-V9-TCB-HC2 (Fc “杵” (knob)) (P1AF1336) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 133
實例
以下為本發明之方法和組成物的實例。應當理解，鑒於上文給出的一般描述，可以實施各種其他實施例。
實例 1 ： 腫瘤標靶的表現
為鑑定多發性骨髓瘤在正常漿細胞上表現的差異基因，對來自多發性骨髓瘤 (MM) 患者的 10 個樣品和來自健康供體骨髓的 10 個漿細胞 (PC) 進行 RNAseq。根據製造商的說明，使用 RNeasy Micro 試劑盒 (Qiagen) 萃取 RNA。在 RNA 萃取過程中，使用無 Rnase 的 Dnase 套裝 (Qiagen) 去除基因組 DNA。萃取的 RNA 的質量由 Agilent Eukaryote Total RNA pico 晶片 (Agilent Technologies) 進行控制。根據製造商的說明，利用 Illumina 測序所用的 SMARTer 超低 RNA 試劑盒 (Clontech) 由 1.6 ng 總 RNA 製備和擴增 cDNA。然後，按照製造商的說明對 1 ng 擴增的 cDNA 進行 Nextera XT 文庫製備 (Illumina)。測序文庫使用 Kapa Library Quantification 試劑盒 (Kapa Biosystems) 進行定量，並使用高靈敏度晶片 (Agilent Technologies) 在 Bioanalyzer 上藉由毛細管電泳進行質量控制。使用第 4 版簇生成試劑盒和第 4 版測序試劑 (Illumina)，在 HiSeq2500 測序儀 (Illumina) 上對文庫進行 2 x 50 個循環的測序。
B 細胞成熟抗原 (BCMA) 為一種細胞表面蛋白，在惡性漿細胞上表現，因此被視為多發性骨髓瘤的標靶 (Tai YT＆Anderson Kc，Targeting B-cell maturation antigen in multiple myeloma，Immunotherapy.2015 Nov；7(11): 1187–1199)。使用 RNAseq 技術的深入分析表明，GPRC5D 在多發性骨髓瘤患者的漿細胞中的表現與 BCMA 一樣高 (圖 2)。更重要地，多發性骨髓瘤患者的漿細胞與健康漿細胞之間 GPRC5D 的表現差異約為 20 倍。相反，來自多發性骨髓瘤患者的漿細胞與健康漿細胞之間的 BCMA 表現差異僅為 2 倍。GPRC5D 的總體表現遠高於其他已知的多發性骨髓瘤標靶分子，例如 SLAM7、CD138 和 CD38。另外，健康的初始或記憶性 B 細胞幾乎不表現 GPRC5D。
實例 2 ： GPRC5D 結合物的產生和 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體的製備
GPRC5D 結合物透過大鼠的 DNA 免疫產生，然後產生雜交瘤，並對雜交瘤進行篩選和測序。利用 ELISA，藉由其與表現 GPRC5D 的轉染子的結合來測量特異性結合的篩選。在下文中，鑑定出兩種 GPRC5D 結合物，分別稱為 5E11 (SEQ ID No 13 和 14) 和 5F11 (SEQ ID No 15 和 16)。一旦鑑定出特異性結合物，IgG 將轉化為 T 細胞雙特異性抗體。將結合物轉化為 T 細胞雙特異性抗體的原理在本技術領域的例如 PCT 公開號 WO 2014/131712 A1 中舉例說明並描述，該專利全文以引用方式併入本文。如圖 3 所示，T 細胞雙特異性抗體包含兩個 GPRC5D 結合部分和一個 CD3 結合部分 (抗 GPRC5D/抗 CD3 T 細胞雙特異性抗體)。製備了以下抗 GPRC5D/CD3 T 細胞雙特異性抗體：i) 5E11-TCB (SEQ ID NO: 17、18、19 和 20)；ii) 5F11-TCB (SEQ ID NO: 21、22、23 和 24)；iii) ET150-5-TCB (SEQ ID NO: 25、26、27 和 28)；iv) B72-TCB (SEQ ID NO: 73、74、75 和 76)；及 v) BCMA-TCB (SEQ ID NO: 77、78、79 和 80)。ET150-5 GPRC5D 結合部分描述於 PCT 公開號 WO 2016/090329A2 中。術語 “ET-150-5” 在本文中同義地用於術語 “ET150-5”，反之亦然。作為陰性對照，製備了非靶向 DP47-TCB。DP47-TCB 為一種非靶向 T 細胞雙特異性抗體，其僅與 CD3 結合而不與 GPRC5D 結合。DP47-TCB 描述於 PCT 公開號 WO 2014/131712 A1 中，該專利全文以引用方式併入本文。B72-TCB 衍生自 WO 2018 / 0117786 A2 的表 23 中公開的 GCDB72 抗體，並且包含 GCDB72 的 GPRC5D 結合部分。B72-TCB 以 crossmab 1+1 形式生成 (SEQ ID No: 73、74、75 和 76)。BCMA-TCB 衍生自 WO 2016/166629 A1，並且包含如本文所公開的 A02_Rd4_6nM_C01 的 GPRC5D 結合部分。BCMA-TCB 以 crossmab 2+1 形式生成 (SEQ ID No: 77、78、79 和 80)。
實例 3 ： T 細胞雙特異性抗體與多發性骨髓瘤細胞株之結合
為測量與 GPRC5D 之結合，對報告的多發性骨髓瘤細胞株 (Lombardi 等人Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics: insights into the biology of the disease；Genes Chromosomes Cancer. 2007 Mar;46(3):226-38) 進行基於 FACS 的結合測定。在 RPMI 1640 + Glutamax 培養基 (Gibco) 中培養細胞株 AMo-1、L363 和 oPM-2，該培養基中添加有 20% 熱滅活的胎牛血清 (FBS，Gibco) 和 1% 青黴素–鏈黴素 100X (Gibco)。採用僅添加 10% FBS 的相同培養基對細胞株 WSU-DLCL2 (陰性對照) 進行培養。細胞株 NCI-H929 和 RPMI-8226 也用添加 50 µM 巰基乙醇 (Gibco) 和 1 mM 丙酮酸鈉 (Gibco) 的相同培養基進行培養。在 75 cm2 燒瓶 (TPP) 中培養細胞株，每週傳代兩次。
使用間接染色評估不同抗人 GPRC5D-TCB 抗體 (5E11-TCB、5F11-TCB 和 ET150-5 TCB) 的結合。用濃度為 10 μg/ml 至 0.00064 μg/ml 的抗人 GPRC5D-TCB 構建體 5E11-TCB、5F11-TCB 或 ET150-5 TCB 對細胞進行孵育，使用 0.2 倍連續稀釋，或用無構建體的 100 µL 磷酸鹽緩衝鹽溶液 (PBS；Gibco) 在 4℃ 下孵育 1 小時。在 4℃ 下，用在 PBS 中以 1:800 稀釋的 Live blue 染料 (Life Technologies) 對細胞染色 20 min，然後用 PE 複合的山羊抗人 IgG 進行染色；在流式細胞儀染色緩衝液 (eBioscience) 中，用稀釋 1/300 的 Fcγ 片段特異性抗體 (Jackson Laboratories) 在 4℃ 下孵育 30 分鐘。在自訂設計的 BD Biosciences Fortessa 上進行流式細胞儀採集，並使用 FlowJo 軟體 (Tree Star，Ashland，OR) 和 GraphPad Prism 軟體進行分析。
圖 4A 至圖 4C 顯示 5E11-TCB 和 5F11-TCB 均以劑量依賴性方式結合所有測試的多發性骨髓瘤細胞株。相比之下，ET150-5-TCB 與被測細胞株的結合弱得多。未觀察到抗 GPRC5D-TCB 與 WSU-DLCL2 細胞 (非霍奇金淋巴瘤的 GPRC5D- 細胞株) 之結合。
實例 4 ： 抗 GPRC5D-TCB 介導的 T 細胞毒性
為測量抗 GPRC5D-TCB 抗體的功能，實施了體外 T 細胞毒性測定。簡言之，在 RPMI 1640 + Glutamax 培養基 (Gibco) 中培養細胞株 AMo-1、L363 和 oPM-2，該培養基中添加有 20% 熱滅活的胎牛血清 (FBS；Gibco) 和 1% 青黴素–鏈黴素 100X (PS；Gibco)。採用僅添加 10% FBS 的相同培養基對細胞株 WSU-DLCL2 進行培養。細胞株 NCI-H929 和 RPMI-8226 用添加 50 µM 巰基乙醇 (Gibco) 和 1 mM 丙酮酸鈉 (Gibco) 的相同培養基進行培養。在 75 cm2 燒瓶 (TPP) 中培養細胞株，每週傳代兩次。
使用泛人 T 細胞分離試劑盒 (Miltenyi Biotec)，在添加有 10% FBS (Gibco) + 1% PS (Gibco) 的 IMDM 培養基 (Gibco) 中，以比例為 1:10 的 Target:Effector，用 3.105 分離自外周血單核細胞 (PBMC) (Buffspende Schlieren 的血沉棕黃層) 的異源性 T 細胞對細胞株與共培養。將抗人 GPRC5D-TCB 抗體 (5E11-TCB、5F11-TCB、ET150-5 TCB 或 DP47-TCB) 以 1 μg/ml 至 0.000001 μg/ml 範圍內的不同濃度添加至共培養物中，其連續稀釋因子為 0.1 或 0 μg/ml。在 37℃ 和 5% CO2 中孵育 20 小時後，將每孔 75 μl 的上清液轉移到 96 孔白板 (Greiner bio-one) 中，每孔包含 25 μl CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay (Promega)。在室溫下孵育 15 min 後，在 PerkinElmer EnVision 上進行發光收集，並使用 GraphPad Prism 和 XLfit 軟體進行分析。繪製 LDH 釋放的發光信號數據。
圖 5A 至圖 5E 顯示 5E11-TCB 和 5F11-TCB 均在多發性骨髓瘤細胞株上、特別是在 NCI-H929 (圖 5B)、RPMI-8226 (圖 5C)、L363 (圖 5D) 和 AMO-1 (圖 5A) 上介導強 T 細胞毒性，而在陰性對照細胞株 WSU-DLCL2 (圖 5E) 上未觀察到殺滅作用。相比之下，ET150-5-TCB 對所測試的多發性骨髓瘤細胞株的殺滅作用幾乎沒有下降或明顯下降。表 1 匯總了從圖 5A 至圖 5E 中顯示的數據得出的 EC50 值。EC50 值使用 Excel 中的 XLfit 附加功能透過將信號的原始數據相對於滴定的 TCB 進行繪圖而計算得出。
表 1. 抗 GPRC5D-TCB 介導的殺滅的 EC50
   NCI-H929 RPMI-8226 L363 AMO-1 WSI-DLCL2
5E11-TCB 0.007 nM 0.024 nM 0.012 nM 0.014 nM /
5F11-TCB 0.001 nM 0.002 nM 0.001 nM 0.003 nM /
ET150-5-TCB 0.833 nM 0.797 nM 0.768 nM 0.0835 nM /
實例 5 ： 抗 GPRC5D-TCB 介導的 T 細胞活化
為了從機理上解釋抗 GPRC5D-TCB 的作用方式，在存在抗 GPRC5D-TCB 的情況下，與標靶多發性骨髓瘤細胞株共培養後，測量 T 細胞的活化。與實例 4 和圖 5A 至圖 5E 中所述的實驗類似，使用泛人 T 細胞分離試劑盒，在添加有 10% FBS (Gibco) + 1% PS (Gibco) 的 IMDM 培養基 (Gibco) 中，以比例為 1:10 的 Target:Effector 的細胞株與 3.105 分離自 PBMC (Buffspende Schlieren 的血沉棕黃層) 的異源性 T 細胞共培養。將抗人 GPRC5D-TCB 抗體 (5E11-TCB、5F11-TCB、ET150-5 TCB 或 DP47-TCB) 以 1 μg/ml 至 0.000001 μg/ml 範圍內的不同濃度添加至共培養物中，其連續稀釋因子為 0.1 或 0 μg/ml。在 37℃ 和 5% CO2 中孵育 20 小時後，將細胞染色以評估 T 細胞活化。首先在 4℃ 下用在 PBS (Gibco) 中以 1:800 稀釋的 Live blue 染料 (Life Technologies) 染色細胞 20 min。然後，流式細胞儀染色緩衝液 (eBioscience) 中，在 4℃ 下用 AF700 抗人 CD4 (選殖株 OKT4)、BV711 抗人 CD8 (選殖株 SK1)、BV605 抗人 CD25 (選殖株 BC96)、APC-Cy7 抗人 CD69 (選殖株 FN50) (全部來自 BioLegend) 以及 PE-Cy5.5 抗人 CD3 (clone SK7；eBioscience) 對細胞染色 30 min。在自訂設計的 BD Biosciences Fortessa 上進行流式細胞儀採集，並使用 FlowJo 軟體 (Tree Star，Ashland，OR) 和 GraphPad Prism 軟體進行分析。
圖 6 顯示 5F11-TCB 藉由上調活化標志物 CD25 和 CD69 而在與 NCI-H929 細胞的共培養物中誘導 T 細胞活化，而對照 (例如非靶向 DP47-TCB 且不含任何 TCB) 則不誘導 T 細胞活化。作為另一種陰性對照，將經過 5F11-TCB 處理的 T 細胞與 WSU-DLCL2 細胞共培養，其中 T 細胞也未活化。這些活化特性在所研究的多種細胞株中保持一致，例如 AMo-1、NCI-H929、RPMI-8226、L363 (圖 7A-J)。與較弱的殺滅力一致，除最高測試濃度 1 mg/kg 外，ET150-5-TCB 不誘導 T 細胞活化。
實例 6 ：抗 GPRC5D-TCB 的定位和內部化
用 CMFDA (Invitrogen) 對 NCI-H929 細胞染色，並將其接種到 24 孔板中塗有聚-L-離胺酸 (Sigma) 的圓形蓋玻片上。用 Alexa Fluor 647 琥珀酰亞胺酯 (InVitrogen，目錄號 A201106) 以 2.5 的摩爾比標記抗體 (5E11-IgG、5E11-TCB、5F11-IgG、5F11-TCB)。將細胞在 37℃ 粘附過夜，然後在不同持續時間和溫度下將螢光標記的抗體 (Alexa Fluor 647 標記的 5E11-IgG、-5E11-TCB、-5F11-IgG、-5F11-TCB) 直接添加至生長培養基中 (在冰上，30 分鐘；在 37℃ 下，1 小時；在 37℃ 下，3 小時)。在每個時間點後，使用冷 PBS (Lonza) 淬滅反應並洗去未結合的抗體。然後在 4℃ 下用 Cytofix (BD) 固定細胞 20 分鐘，並用 PBS 洗滌兩次。然後轉移蓋玻片，用 Fluoromount G (eBioscience) 將其固定在載玻片上，並在成像前於 4℃ 的黑暗環境中放置過夜。用來自 Zeiss 的倒置 LSM 700 和 60x 油鏡進行螢光共聚焦顯微鏡檢查。使用與顯微鏡相連的 Zen 軟體 (Zeiss) 收集影像，並在 IMARIS 軟體 (Bitplane) 上查看。圖 8A 顯示所有抗體在 4℃ 或 37℃ 下都將多發性骨髓瘤細胞株的表面 (質膜) 染色。如果抗體被細胞內化，則在 37℃ 下培養時，螢光染色將出現在細胞質中。未觀察到 GPRC5D+ 細胞株對 GPRC5D-結合 IgG 或 GPRC5D-結合 TCB 的內化。藉由應用來自細胞膜和細胞質定義區域的目標區域的強度總和 (3 小時)，進一步證實了這一結果。利用 IMARIS 軟體分析並定量膜與細胞質的信號比。圖 8B 表明，用不同抗體孵育 3 小時後，膜與細胞質強度的比率不變 (約 4)，意味著螢光信號集中在表面而不是細胞質中。
實例 7 ：表徵 GPRC5D 結合物：透過 ELISA 進行重組細胞結合
利用表現人 GPRC5D 或食蟹猴 GPRC5D 或鼠 GPRC5D 或人 GPRC5A 的穩定轉染的 CHO 選殖株分析潛在的前導候選抗體作為 IgG 的結合。具體而言，使用新鮮培養基將 104 個細胞 (活力 ≥98%) 接種到 384 孔微量滴定板中 (BD Poly D-Lysin，#356662，體積：25 µl/孔)。在 37℃ 下孵育過夜後，在 4℃ 下在 2 小時內向細胞中添加 25 µl/孔的抗體稀釋液 (在 1xPBS 中 15 x 1:3 稀釋，測定濃度從 30 µg/ml 開始)。使用 90 μl/孔 PBST (10x PBS，Roche，#11666789001 + 0.1% Tween 20) 進行一步洗滌後，隨後在室溫 (RT) 下添加 50 μl/孔 0.05% 戊二醛 (Sigma 目錄號：G5882，溶於 1xPBS 中) 對細胞固定 10 min。在使用 90 µl/孔 PBST 的三個附加洗滌步驟後，添加第二抗體進行檢測：對於人類抗體，使用在封閉緩衝液 (1x PBS (Roche # 11666789001) + 2% BSA (牛血清白蛋白組分 V，無脂肪酸，Roche # 10735086001) + 0,05% Tween 20) 中按 1:2000 稀釋的山羊抗人 Ig κ 鏈抗體 HRP 複合體 (Millipore #AP502P) (25 µl/孔)。對於大鼠抗體，使用山羊抗大鼠 IgG1 抗體 HRP 複合體 (Bethyl #A110-106P)、山羊抗大鼠 IgG2a 抗體 HRP 複合體 (Bethyl #A110-109P) 和山羊抗大鼠 IgG2b 抗體 HRP 複合體 (Bethyl #A110-111P) 的混合物，各種抗體在封閉緩衝液中按 1:10000 稀釋 (25 µl/孔)。在室溫下孵育 1 h 並使用 90 µl/孔 PBST 完成三個額外的洗滌步驟後，在 10 min 內添加 25 µl/孔 TMB 底物 (Roche 訂單號 11835033001)，並透過在 370 nm/492 nm 下測量以確定最終 OD 的顯色。
所有測試的抗體均以 pM 範圍內的 EC50 值 (反映親和力) 顯示出與人 GPRC5D 的陽性結合。僅大鼠 IgG 10B10 和 07A04 在表現食蟹猴 GPRC5D 的 CHO 細胞上表現出交叉反應，其 EC50 值與人受體相當 (圖 9)。還檢測到所有其他抗體的食蟹猴交叉反應性，但水平低於 10B10 和 07A04 (圖 9)。未檢測到與表現小鼠 GPRC5D 的 CHO 細胞的顯著結合，也未檢測到與表現 GPRC5A 的人 CHO 細胞的結合 (圖 9)。結合 EC50 值匯總於表 2 中。
表 2. 物種間基於 ELISA 的 GPRC5D 結合特性
人 GPRC5D+ CHo cyno GPRC5D+ CHo
IgG 抗體 EC50 (ng/ml) EC50 (nM) EC50 (ng/ml) EC50 (nM)
5E11 29.57 0.198 - -
5F11 21.67 0.144 - -
10B10 16.34 0.109 12 0,080
07A04 24.26 0.162 114.54 0,764
實例 8 ： GPRC5D 結合物：重組 GPRC5D-TCB 介導 MM 細胞株上的 T 細胞毒性
為比較 GPRC5D-TCB 或其他靶向 TCB 的功能，對多種 MM 細胞株進行體外 T 細胞毒性測定：MoLP-2 (圖 10B)、AMo-1 (圖 10C)、EJM (圖 10D) 和 NCI-H929 (圖 10G)。簡言之，在 RPMI 1640 + Glutamax 培養基 (Gibco) 中培養細胞株，該培養基中添加有 20% 熱滅活的胎牛血清 (FBS；Gibco) 和 1% 青黴素–鏈黴素 100X (PS；Gibco)。用添加有 GlutaMax 1X (Gibco) 的培養基對 MoLP-2 進行培養。用僅添加有 10% FBS 的培養基對 OPM-2 (圖 10A)、RPMI-8226 (圖 10E) 和 L-363 (圖 10F) 細胞株進行培養。在添加有 50 µM 巰基乙醇 (Gibco)、1mM 丙酮酸鈉 (Gibco) 和 GlutaMax 1X (Gibco) 的培養基中對 NCI-H929 進行培養。在 IMDM (Gibco) + 10% FBS (Gibco) 和 1% PS (Gibco) 中對 EJM 進行培養。在 75 cm2 燒瓶 (TPP) 中培養所有細胞株，每週傳代兩次。
使用泛人 T 細胞分離試劑盒 (Miltenyi Biotec)，在添加有 10% FBS (Gibco) + 1% PS (Gibco) 的 RPMI 培養基 (Gibco) 中，以比例為 10:1 的 Effector:Target，用分離自 PBMC 的 30 萬異源性 T 細胞 (Buffspende Schlieren 的血沉棕黃層) 對細胞株進行共培養。將抗人 GPRC5D TCB 構建體 (5E11-TCB、5F11-TCB、10B10-TCB、B72-TCB、BCMA-TCB 和 DP47-TCB) 以 12.5 nM 至 0.0000125 nM 範圍內的不同濃度加入共培養物中，按 1/10 連續稀釋，並與未處理的樣品進行比較。在 37℃ 和 5% CO2 中孵育 20 小時後，將每孔 75 μl 的上清液轉移到 96 孔白板 (Greiner bio-one) 中，每孔包含 25 μl CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay (Promega)。在室溫下孵育 15 min 後，在 PerkinElmer EnVision 上進行發光收集，並使用 GraphPad Prism 和 XLfit 軟體進行分析。繪製 LDH 釋放的發光信號數據 (圖 10)。圖 10A-G 總結了表明在 MM 細胞株 5E11-TCB 和 5F11-TCB 相比於 BCMA-TCB、10B10-TCB 和 B72-TCB 具有更強的 T 細胞毒性介導作用的數據。TCB 介導的殺滅的 EC50 示於表 3 中，並根據不同供體 T 細胞的不同實驗的平均值計算得出 (n = 2 或 n = 3)。
表 3. 體外殺滅試驗的 EC50 值
EC50 (pM) n=3 n=2
細胞系 NCI-H929 (圖 10G) AMo-1 (圖 10C) MoLP-2 (圖 10B) L363(圖 10F) EJM (圖 10D) OPM-2 (圖 10A) RPMI (圖 10E)
5F11-TCB 4 6 1 3 3 1 6
5E11-TCB 7 8 18 17 11 2 64
10B10-TCB 56 84 160 34 79 28 965
B72-TCB 58 109 124 58 60 171 193
BCMA-TCB 311 518 32 127 132 33 11
實例 9 ：健康人體骨髓細胞中的體外 T 細胞活化
在採樣後 1 天或 2 天，對四個不同的健康供體 (Lonza#1M-105，批號 0000739254；0000739255；0000739256 和 0000734008) 的新鮮未經處理的骨髓進行處理。在室溫下使用 BD Pharm Lysis 緩衝液 (BD#555899；1X，溶於無菌水中) 進行快速紅細胞裂解 5 分鐘後，藉由離心和分別在 126g 和 443g 進行緩衝液交換，將細胞洗滌 2 次。對細胞進行計數，並以 300 000 cells/mL 的濃度懸浮在 RPMI 1640 Glutamax + 20%HI 胎牛血清 + 2% 人血清 + 1% 青黴素/鏈黴素 (均來自 Gibco) 中，並將 100 µL 細胞懸液接種接種到 96 孔板圓底 (TPP) 的各個孔中。向每個孔中加入培養基或添加有 50 µL 濃度為 200 nM (4X) 至 20 pM 的 B72-TCB、5F11-TCB、5E11-TCB、BCMA-TCB、10B10-TCB 或 DP47-TCB 的培養基，按 1/10 進行連續稀釋。最後，以 6 Mio/mL (效應物 T 與健康骨髓靶細胞的比例為 10:1) 加入來自健康供體 PBMC 的泛 T 細胞 (Miltenyi Biotec，#130-096-535) 的 50 µL 異源性經單離之 T 細胞。在加濕培養箱中於 37℃ 下孵育過夜後，將細胞用 PBS 洗滌一次，並在 4℃ 下用 50 μL 在 PBS 中按 1/800 稀釋的 Live blue (Invitrogen, # L23105) 染色 20 分鐘。洗滌後，將細胞與以下在 FAC 緩衝液 (PBS 1X，2% 胎牛血清；1% 0.5M EDTA PH 8；0.25% NaN3 疊氮化鈉 (20%)) 中稀釋的抗體混合物 於 4℃ 下孵育 30 分鐘：CD25 BV605、CD69 APC-Cy7、BCMA BV421、CD38 BV510、CD138 FITC、按 1/100 稀釋的 FcRH5 PE 和 CD8 BV711、CD3 PE-Cy5 以及按 1/300 稀釋的 CD4 AlexaFluor 700 (均來自 BioLegend) 和 GPRC5D AlexaFluor 647 (內部製備，選殖株 5E11 IgG)。洗滌後，將細胞重懸於 100 µL FAC 緩衝液中，並用 Fortessa (BD Biosciences) 收集數據。
圖 11A-F 中顯示的數據表明，B72-TCB 誘導健康骨髓中 T 細胞的非特異性活化 (透過 CD69 的上調測得)，但測試的其他任何 TCB 均不存在此誘導作用。如圖所示，B72-TCB 誘導的非特異性活化為一種濃度依賴性效應，在 50 nM 下比 5 nM 下更明顯 (圖 12A 和 12B)。
實例 10 ： TCB 的體內效力
在效力研究中，比較了攜帶完全人源化 NSG 小鼠的多發性骨髓瘤中不同 TCB 構建體 (GPRC5D 5F110-TCB、5E11-TCB、BCMA-TCB 和 B72-TCB) 的腫瘤消退率。NCI-H929 細胞最初從 ATCC 取得，而 OPM-2 細胞則從 DSMZ 取得。兩種細胞株均得到擴增。在包含 10% FCS 和 2 mM L-麩醯胺酸、10 mM HEPES、1 mM 丙酮酸鈉的 RPMI 中，對培養基進行培養。將細胞置於水飽和氣氛和 5% CO2 中進行培養。以 2.5 x 106 NCI-H929 和 5 x 106 OPM-2 細胞/動物的濃度，將 RPMI 細胞培養基 (Gibco) 和 GFR matrigel (1:1，總體積為 100 μl) 中的細胞皮下注射到動物右脅，活力 ＞ 95.0%。
實驗開始時 4-5 週齡的雌性 NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) 小鼠 (在法國里昂的 Charles River 繁殖) 保持無病原體條件，根據規定的指南每天光照 12 h/黑暗 12 h (GV-Solas；Felasa；TierschG)。實驗研究方案已經由地方政府審查和批准 (RoB-55.2-2532.Vet_03-16-10)。收到動物後，將動物飼養一周以適應新環境並進行觀察。定期進行持續的健康狀況監測。
根據方案，經腹膜內註射，對雌性 NSG 小鼠給予15 mg/kg Busulfan，一天后靜脈注射從臍帶血中分離出的 1 x 105 人造血幹細胞。在幹細胞注射後第 16-20 週，對小鼠放血，並利用流式細胞儀分析血液是否成功實現人源化。將有效移植的小鼠根據其人 T 細胞頻率隨機分入不同的給藥組中 (n = 10/組)。那時，將腫瘤細胞注射到小鼠中。如上所述，在腫瘤大小達到約 200 mm3 時，每周用化合物或 PBS (載劑) 治療一次。向所有小鼠靜脈注射不同劑量的 TCB 分子 (見圖 13A 至圖 13D 和圖 14A 至圖 14D)。
為了得到適當量的化合物，用組胺酸緩衝液 (20 mM 組胺酸，140 mM NaCl，pH 6.0) 稀釋儲備液。使用卡尺每週測量兩次腫瘤生長，並依據以下方法計算腫瘤體積：
Tv ：(W2 /2) x L                (W：寬；L：長)
終止研究並在四次注射化合物後處死所有小鼠，分離出腫瘤並稱重。
圖 13A 至圖 13D 顯示了在治療後接受 NCI-H929 注射的所有動物的腫瘤生長動力學。5F11-TCB 在 1 mg/kg 或 0.1 mg/kg 下誘導所有動物完全腫瘤緩解 (圖 13A)，而 B72-TCB 在 1 mg/kg 的劑量下僅誘導部分腫瘤緩解，而 0.1 mg/kg 的劑量下則無效果 (圖 13C)。BCMA-TCB 還以 1 mg/kg 的劑量誘導部分腫瘤緩解 (圖 13B)。
圖 14A 至圖 14D 顯示了在治療後接受 OPM-2 注射的所有動物的腫瘤生長動力學。5F11-TCB (圖 14A，上圖) 和 5E11-TCB (圖 14B，上圖) 以 0.1 mg/kg 的劑量導致大多數動物完全緩解，而 B72-TCB (圖 14C，上圖) 在 0.1 mg/kg 的劑量下在控制腫瘤生長方面效力較弱。與 B72-TCB (圖 14C，下圖) 相比，在 0.01 mg/kg 的劑量下， 5F11-TCB (圖 14A，下圖) 和 5E11-TCB (圖 14B，下圖) 更有效地抑制了腫瘤的生長。
實例 11 ：抗 GPRC5D 抗體的人源化
藉由查詢人 V 區和 J 區序列的 BLASTp 數據庫中的鼠輸入序列 (裁剪為可變部分)，確定合適的人受體框架。選擇人受體框架的選擇標準為序列同源性、相同或相似的 CDR 長度、人種系的估計頻率以及 VH-VL 域介面的某些胺基酸的保守性。在種系鑑定步驟之後，將鼠輸入序列的 CDR 移植到人受體框架區。評估這些初始 CDR 移植物與親本抗體之間每個胺基酸的差異，以評估可能對相應變異區的結構完整性的影響，並在認為適當時引入針對親本序列的「反向突變」。結構評估基於親本抗體和人源化變異體的 Fv 區域同源性模型，這些模型使用內部抗體結構同源性建模方案建立，該方案使用 BIoVIA Discovery Studio Environment 17R2 版實現。在某些人源化變異體中，包括「正向突變」，即，胺基酸交換將在親本結合劑的給定 CDR 位置上發生的原始胺基酸改變為在人受體種系的等效位置上發現的胺基酸。目的在於增加人源化變異體的總體人類特徵 (超出框架區域)，以進一步降低免疫原性風險。
使用內部開發的電腦模擬工具預測配對的 VH 和 VL 人源化變異體的 VH-VL 域方向 (如 WO 2016/062734A1 所述，該專利全文以引用方式併入本文)。將結果與親本結合劑的預測的 VH-VL 域取向進行比較，以選擇幾何形狀與原始抗體接近的構架組合。合理的做法為檢測 VH-VL 介面區域中可能的胺基酸交換，這些交換可能導致兩個域的配對發生破壞性變化，進而對結合特性產生不利影響。
GPRC5D 結合物 5E11 的受體框架選擇及其適應性
根據下表 4 選擇受體框架。
表 4. GPRC5D 結合物 5E11 的受體框架
   小鼠 (Rattus norvegicus) V 區種系 人受體 V 區種系的選擇
VH1abcd IGHV5S13*01 IGHV3-23*03
VL1ac IGKV3S18*01 IGKV4-1*01_human
VL2ab IGKV3-20*01_human
VL3ab IGKV1-39*01_human
CDR3 後框架區來自人 IGHJ 種系 IGHJ3*02 (DAFDIWGQGTMVTVSS) 和人 IGHJ 種系 IGKJ5*01 (ITFGQGTRLEIK)。與受體框架相關的部分以粗體顯示。
基於結構上的考慮，在 5E11 人源化變異體的某些位置引入從人受體框架到親本結合物中胺基酸的反向突變 (表 5 和 6)。此外，某些位置被確定為正向突變的有前景的候選位置，其中親本結合劑的 CDR 中的胺基酸被人受體種系中發現的胺基酸取代。下表中詳細列出了這些變化。
註：反向突變以 b 為前綴，反向突變以 f 為前綴，例如 bS49A 指位置 49 發生從絲胺酸到丙胺酸的反向突變 (人種系胺基酸到親代抗體胺基酸)。所有殘基索引在 Kabat 編號中給出。
表 5. VH/VL 5E11 人源化變異體列表
變異體名稱 與人 V 區種系 (BLASTp) 的同一性
5E11_VH1a (bS49A_bK94T) 89.7
5E11_VH1b (bV2L_bS49A_bS74A_bK94T) 87.6
5E11_VH1c (bS49A_fR60A_fA65G_bK94T) 91.8
5E11_VH1d (bV2L_bS49A_fR60A_fA65G_bS74A_bK94T) 89.7
5E11_VL1a (bP43Q) 80.2
5E11_VL1c (fR24K_fA25S_bP43Q) 82.2
5E11_VL2a (bA43Q) 86.2
5E11_VL2b (bA43Q_bR45K) 85.1
5E11_VL3a (bA43Q) 83.8
5E11_VL3b (bK42Q_bA43Q) 82.8
表 6. VH/VL 5E11 人源化變異體之序列
名稱 胺基酸序列 SEQ ID NO.
5E11_VH1a EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYRDSVKARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS 46
5E11_VH1b ELQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYRDSVKARFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS 47
5E11_VH1c EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS 48
5E11_VH1d ELQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS 49
5E11_VL1a DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 50
5E11_VL1c DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 51
5E11_VL2a EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPRLLIYHASILASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 52
5E11_VL2b EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 53
5E11_VL3a DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGKQPKLLIYHASILASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 54
5E11_VL3b DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 55
GPRC5D 結合物 5F11 的受體框架選擇及其適應性
根據下表 7 選擇受體框架。
表 7. GPRC5D 結合物 5F11 的受體框架
   小鼠 (Rattus norvegicus) V 區種系 人受體 V 區種系的選擇
VH1abcd IGHV5S13*01 IGHV3-30*03
VH2bd IGHV3-23*04
VL1ab, VL2a IGKV2S17*01 IGKV2-28*01
VL2b IGKV4-1*01
VL2c IGKV3-20*01
CDR3 後框架區來自人 IGHJ 種系 IGHJ3*02 (DAFDIWGQGTMVTVSS ) 和人 IGHJ 種系 IGKJ2*01 (YTFGQGTKLEIK )。與受體框架相關的部分以粗體顯示。
基於結構上的考慮，在 5F11 人源化變異體的某些位置引入從人受體框架到親本結合物中胺基酸的反向突變 (表 8 和 9)。此外，某些位置被確定為正向突變的有前景的候選位置，其中親本結合劑的 CDR 中的胺基酸被人受體種系中發現的胺基酸取代。下表中詳細列出了這些變化。
註：反向突變以 b 為前綴，反向突變以 f 為前綴，例如 bA93T 指位置 93 發生從丙胺酸到穌胺酸的反向突變 (人種系胺基酸到親代抗體胺基酸)。所有殘基索引在 Kabat 編號中給出。
表 8. VH/VL 5F11 人源化變異體列表
變異體名稱 與人 V 區種系 (BLASTp) 的同一性
5F11_VH1a (bA93T) 89.8
5F11_VH1b (bQ1E_bS74A_bA93T) 87.8
5F11_VH1c (fR60A_bA93T) 90.8
5F11_VH1d (bQ1E_fR60A_bS74A_bA93T) 88.8
5F11_VH2b (bS49A_bS74A_bA93T_bK94R) 86.7
5F11_VH2d (bS49A_fR60A_bS74A_bA93T_bK94R) 87.8
5F11_VL1a (bL46V_bY87H) 86.0
5F11_VL1b (bQ42K_bL46V_bY87H) 85.0
5F11_VL2a (bY87H) 88.0
5F11_VL2b (bY87H) 80.2
5F11_VL2c (fS25A_bY87H) 80.0
表 9. VH/VL 5F11 人源化變異體之序列
變異體 胺基酸序列 SEQ ID NO.
5F11_VH1a QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 56
5F11_VH1b EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 57
5F11_VH1c QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 58
5F11_VH1d EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 59
5F11_VH2b EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 60
5F11_VH2d EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS 61
5F11_VL1a DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGQSPQVLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 62
5F11_VL1b DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGKSPQVLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 63
5F11_VL2a DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGQSPQLLIYRMSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 64
5F11_VL2b DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSKSLLHSNGITYVYWYQQKPGQPPKLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 65
5F11_VL2c EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASKSLLHSNGITYVYWYQQKPGQAPRLLIYRMSNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 66
利用 ELISA 表徵人源化變異體
為表徵 GPRC5D 結合物的 VH 和 VL 域的人源化變異體，使用如上文所述之 ELISA 方案 (參見實例 7)。表 10 中匯總了 5E11 的人源化變異體數據，表 11 中匯總了 5F11 的人源化變異體數據。表 12 顯示了親本 5E11 和親本 5E11 以及所選的人源化變異體的 CDR 序列。
表 10. 5E11 的人源化變異體的表徵
人源性 CHo hu GPCR5D CHo cy GPCR5D
貘 排序 VH VL VH huID VL huID Fv huID EC/IC50 rel (ng/ml) EC/IC50 rel (nM) EC/IC50 rel (ng/ml)
P1AE5706 1 親本 親本 10,4 0,07 na
P1AE5707 2 VH1a VL1a 89,7 80,2 84,95 14,2 0,09 na
P1AE5708 3 VH1a VL1c 89,7 82,2 85,95 12,0 0,08 na
P1AE5709 4 VH1a VL2a 89,7 86,2 87,95 19,1 0,13 na
P1AE5710 5 VH1a VL2b 89,7 85,1 87,4 10,1 0,07 na
P1AE5712 6 VH1a VL3a 89,7 83,8 86,75 13,1 0,09 na
P1AE5713 7 VH1a VL3b 89,7 82,8 86,25 16,5 0,11 na
P1AE5714 8 VH1b VL1a 87,6 80,2 83,9 12,9 0,09 na
P1AE5715 9 VH1b VL1c 87,6 82,2 84,9 21,1 0,14 na
P1AE5716 10 VH1b VL2a 87,6 86,2 86,9 15,1 0,10 na
P1AE5717 11 VH1b VL2b 87,6 85,1 86,35 13,9 0,09 na
P1AE5718 12 VH1b VL3a 87,6 83,8 85,7 12,1 0,08 na
P1AE5719 13 VH1b VL3b 87,6 82,8 85,2 16,6 0,11 na
P1AE5720 14 VH1c VL1a 91,8 80,2 86 21,7 0,14 na
P1AE5721 15 VH1c VL1c 91,8 82,2 87 18,3 0,12 na
P1AE5722 16 VH1c VL2a 91,8 86,2 89 19,7 0,13 na
P1AE5723 17 VH1c VL2b 91,8 85,1 88,45 6,0 0,04 na
P1AE5724 18 VH1c VL3a 91,8 83,8 87,8 5,3 0,04 na
P1AE5725 19 VH1c VL3b 91,8 82,8 87,3 5,1 0,03 na
P1AE5726 20 VH1d VL1a 89,7 80,2 84,95 7,6 0,05 na
P1AE5727 21 VH1d VL1c 89,7 82,2 85,95 8,7 0,06 na
P1AE5728 22 VH1d VL2a 89,7 86,2 87,95 7,9 0,05 na
P1AE5729 23 VH1d VL2b 89,7 85,1 87,4 10,4 0,07 na
P1AE5730 24 VH1d VL3a 89,7 83,8 86,75 8,0 0,05 na
P1AE5731 25 VH1d VL3b 89,7 82,8 86,25 5,2 0,03 na
表 10. 續
人源性 CHo hu GPCR5A CAR-J2 EC50
貘 排序 VH VL VH huID VL huID Fv huID EC/IC50 rel (ng/ml) [ng/mL]
P1AE5706 1 親本 親本 na 3,9
P1AE5707 2 VH1a VL1a 89,7 80,2 84,95 na 42,4
P1AE5708 3 VH1a VL1c 89,7 82,2 85,95 na 455,8
P1AE5709 4 VH1a VL2a 89,7 86,2 87,95 na 59,4
P1AE5710 5 VH1a VL2b 89,7 85,1 87,4 na 3,5
P1AE5712 6 VH1a VL3a 89,7 83,8 86,75 na 16,1
P1AE5713 7 VH1a VL3b 89,7 82,8 86,25 na 76,9
P1AE5714 8 VH1b VL1a 87,6 80,2 83,9 na 5,5
P1AE5715 9 VH1b VL1c 87,6 82,2 84,9 na 3,6
P1AE5716 10 VH1b VL2a 87,6 86,2 86,9 na 3,3
P1AE5717 11 VH1b VL2b 87,6 85,1 86,35 na 79,9
P1AE5718 12 VH1b VL3a 87,6 83,8 85,7 na 105,4
P1AE5719 13 VH1b VL3b 87,6 82,8 85,2 na 2,8
P1AE5720 14 VH1c VL1a 91,8 80,2 86 na 6,3
P1AE5721 15 VH1c VL1c 91,8 82,2 87 na 25
P1AE5722 16 VH1c VL2a 91,8 86,2 89 na 4,6
P1AE5723 17 VH1c VL2b 91,8 85,1 88,45 na 3,7
P1AE5724 18 VH1c VL3a 91,8 83,8 87,8 na 3,6
P1AE5725 19 VH1c VL3b 91,8 82,8 87,3 na 10,9
P1AE5726 20 VH1d VL1a 89,7 80,2 84,95 na 37,8
P1AE5727 21 VH1d VL1c 89,7 82,2 85,95 na 6,3
P1AE5728 22 VH1d VL2a 89,7 86,2 87,95 na 5,6
P1AE5729 23 VH1d VL2b 89,7 85,1 87,4 na 61,3
P1AE5730 24 VH1d VL3a 89,7 83,8 86,75 na 3,5
P1AE5731 25 VH1d VL3b 89,7 82,8 86,25 na 2,3
表 11. 5F11 的人源化變異體的表徵
人源性 CHo hu GPCR5D
排序 VH VL VH huID VL huID Fv huID EC/IC50 rel (ng/ml) EC/IC50 rel (nM)
P1AE5733 1 親本 親本 5,8 0,04
P1AE5734 2 VH1a VL1a 89,8 86 87,9 5,5 0,04
P1AE5735 3 VH1a VL1b 89,8 85 87,4 6,6 0,04
P1AE5736 4 VH1a VL2a 89,8 88 88,9 3,7 0,02
P1AE5737 5 VH1a VL2b 89,8 80,2 85 5,9 0,04
P1AE5738 6 VH1a VL2c 89,8 80 84,9 4,1 0,03
P1AE5739 7 VH1b VL1a 90,8 86 88,4 4,0 0,03
P1AE5740 8 VH1b VL1b 90,8 85 87,9 6,3 0,04
P1AE5741 9 VH1b VL2a 90,8 88 89,4 6,7 0,04
P1AE5742 10 VH1b VL2b 90,8 80,2 85,5 6,1 0,04
P1AE5743 11 VH1b VL2c 90,8 80 85,4 7,6 0,05
P1AE5744 12 VH1c VL1a 90,8 86 88,4 8,6 0,06
P1AE5745 13 VH1c VL1b 90,8 85 87,9 9,7 0,06
P1AE5746 14 VH1c VL2a 90,8 88 89,4 10,7 0,07
P1AE5747 15 VH1c VL2b 90,8 80,2 85,5 9,0 0,06
P1AE5749 16 VH1c VL2c 90,8 80 85,4 7,4 0,05
P1AE5750 17 VH1d VL1a 89,8 86 87,9 9,4 0,06
P1AE5751 18 VH1d VL1b 89,8 85 87,4 12,4 0,08
P1AE5752 19 VH1d VL2a 89,8 88 88,9 6,2 0,04
P1AE5753 20 VH1d VL2b 89,8 80,2 85 10,4 0,07
P1AE5754 21 VH1d VL2c 89,8 80 84,9 9,0 0,06
P1AE5755 22 VH2b VL1a 90,8 86 88,4 7,8 0,05
P1AE5756 23 VH2b VL1b 90,8 85 87,9 7,8 0,05
P1AE5757 24 VH2b VL2a 90,8 88 89,4 2,9 0,02
P1AE5758 25 VH2b VL2b 90,8 80,2 85,5 2,6 0,02
P1AE5759 26 VH2b VL2c 90,8 80 85,4 3,1 0,02
P1AE5760 27 VH2d VL1a 89,8 86 87,9 4,0 0,03
P1AE5761 28 VH2d VL1b 89,8 85 87,4 3,7 0,02
P1AE5762 29 VH2d VL2a 89,8 88 88,9 4,6 0,03
P1AE5763 30 VH2d VL2b 89,8 80,2 85 6,0 0,04
P1AE5764 31 VH2d VL2c 89,8 80 84,9 4,5 0,03
表 11. 續。
人源性 CHo cy GPCR5D CHo hu GPCR5A CAR-J2 EC50
排序 VH VL VH huID VL huID Fv huID EC/IC50 rel (ng/ml) EC/IC50 rel (ng/ml) [ng/mL]
P1AE5733 1 親本 親本 na na 2,65
P1AE5734 2 VH1a VL1a 89,8 86 87,9 na na 41,53
P1AE5735 3 VH1a VL1b 89,8 85 87,4 na na 82,08
P1AE5736 4 VH1a VL2a 89,8 88 88,9 na na 1,38
P1AE5737 5 VH1a VL2b 89,8 80,2 85 na na 2,95
P1AE5738 6 VH1a VL2c 89,8 80 84,9 na na 397,43
P1AE5739 7 VH1b VL1a 90,8 86 88,4 na na 23,54
P1AE5740 8 VH1b VL1b 90,8 85 87,9 na na 8,96
P1AE5741 9 VH1b VL2a 90,8 88 89,4 na na 1,4
P1AE5742 10 VH1b VL2b 90,8 80,2 85,5 na na 61,93
P1AE5743 11 VH1b VL2c 90,8 80 85,4 na na 583,32
P1AE5744 12 VH1c VL1a 90,8 86 88,4 na na 3,63
P1AE5745 13 VH1c VL1b 90,8 85 87,9 na na 1,62
P1AE5746 14 VH1c VL2a 90,8 88 89,4 na na 514,19
P1AE5747 15 VH1c VL2b 90,8 80,2 85,5 na na 182,79
P1AE5749 16 VH1c VL2c 90,8 80 85,4 na na 82,59
P1AE5750 17 VH1d VL1a 89,8 86 87,9 na na 20,58
P1AE5751 18 VH1d VL1b 89,8 85 87,4 na na 6,44
P1AE5752 19 VH1d VL2a 89,8 88 88,9 na na 508,96
P1AE5753 20 VH1d VL2b 89,8 80,2 85 na na 30,03
P1AE5754 21 VH1d VL2c 89,8 80 84,9 na na 8,89
P1AE5755 22 VH2b VL1a 90,8 86 88,4 na na 151,74
P1AE5756 23 VH2b VL1b 90,8 85 87,9 na na 170,2
P1AE5757 24 VH2b VL2a 90,8 88 89,4 na na 144,74
P1AE5758 25 VH2b VL2b 90,8 80,2 85,5 na na 189,51
P1AE5759 26 VH2b VL2c 90,8 80 85,4 na na 15,7
P1AE5760 27 VH2d VL1a 89,8 86 87,9 na na 189,94
P1AE5761 28 VH2d VL1b 89,8 85 87,4 na na 74,56
P1AE5762 29 VH2d VL2a 89,8 88 88,9 na na 84,16
P1AE5763 30 VH2d VL2b 89,8 80,2 85 na na 5,47
P1AE5764 31 VH2d VL2c 89,8 80 84,9 na na 78,22
表 12. 一系列人源化變異體之 CDR 序列
   HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR1 LCDR3
5E11 親本 SEQ ID NO: 83 SEQ ID NO: 84 SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 87 SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 89
5E11_P1AE5723 SEQ ID NO: 83 SEQ ID NO: 85 SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 87 SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 89
5E11_P1AE5728 SEQ ID NO: 83 SEQ ID NO: 85 SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 87 SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 89
5F11_parental SEQ ID NO: 90 SEQ ID NO: 91 SEQ ID NO: 93 SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 95 SEQ ID NO: 97
5F11_P1AE5741 SEQ ID NO: 90 SEQ ID NO: 91 SEQ ID NO: 93 SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 96 SEQ ID NO: 97
5F11_P1AE5745 SEQ ID NO: 90 SEQ ID NO: 92 SEQ ID NO: 93 SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 95 SEQ ID NO: 97
實例 12 ：在存在所選的抗 GPRC5D IgG 的不同人源化變異體的情況下， CAR-J 細胞的體外活化
依據以下方法對不同人源化抗 GPRC5D IgG 活化 PGLALA-CAR-J 效應細胞的能力。將表現 GPRC5D 的多發性骨髓瘤標靶細胞 L363 (Diehl 等人，Blut 36: 331-338 (1978)) 與抗 PGLALA-CAR-J 效應細胞 (表現針對 IgG 分子的 Fc 部分中的 PGLALA (P329G L234A L235A) 突變的 TCR 且包含 NFAT 啟動子的 Jurkat-NFAT 人急性淋巴白血病報告細胞株，如 PCT 申請號 PCT/EP2018/086038 和 PCT 申請號 PCT/EP2018/086067 中所公開) 共培養。在 IgG 分子與 L363 細胞和 PGLALA-CAR-J 細胞上的 GPRC5D 同時結合後，NFAT 啟動子被活化並導致活性螢火蟲螢光素酶的表現。
在分析中，將人源化 IgG 變異體在 RPMI 1640 培養基 (包含 Glutamax、15% HI 胎牛血清、1% 青黴素-鏈黴素；均來自 GIBCO) 中稀釋，並轉移至圓底 96 孔板中 (最終濃度為 0.2 pg/ml 至 10 µg/ml)。每孔添加 20000 個 L363 細胞，並加入抗 PGLALA-CAR-J 效應細胞，使最終效應物 (抗 PGLALA-CAR-J) 與標靶 (L363) 細胞的比例為 5:1，且每個孔的最終體積為 200 µl。在加濕培養箱中，將細胞置於 37℃ 下孵育大約 16 h。在孵育時間結束時，將 100 µl/孔的上清液轉移到白色平底 96 孔板 (Costar) 中，並與另外 100 µl/孔的 ONE-Glo 螢光素酶底物 (Promega) 孵育 5 min，然後使用 PerkinElmer Envision 讀取發光。使用 GraphPad Prism 將行數據相對於 IgG 濃度的相對發光信號 (RLU) 作圖，並使用 XL-fit 軟體計算 EC50。
如圖 15A 至圖 15B 和表 13 所示，所有評估的 GPRC5D IgG 在與表現 GPRC5D 的標靶細胞和抗-PGLALA-CAR-J 細胞同時結合時誘導 CAR-J 活化。對於抗 GPRC5D 結合物 5F11 和 5E11，與親本抗體預人源化相比，可以鑑定出具有類似或甚至改善的 EC50 值的人源化變異體。對於結合物 5F11，分子 P1AE5741 可誘導最強的活化作用 (圖 15A)。對於結合物 5E11，分子 P1AE5730 和 P1AE5723 可誘導最強的活化作用 (圖 15B)。
表 13. CAR-J 活化的 EC50 值
結合物 5F11 結合物 5E11
P1AE5733 (親本) P1AE5741 P1AE5745 P1AE5744 P1AE5763 P1AE5706 (親本) P1AE5723 P1AE5728 P1AE5730 P1AE5718
EC50 (ng/ml) 2.65 1.4 1.62 3.63 5.47 3.9 3.7 5.6 3.5 105.4
實例 13 ：進一步 T 細胞雙特異性抗體的製備
將結合物轉化為 T 細胞雙特異性抗體的原理在本技術領域的例如 PCT 公開號 WO 2014/131712 A1 中舉例說明並描述，該專利全文以引用方式併入本文。如圖 3 所示，T 細胞雙特異性抗體包含兩個 GPRC5D 結合部分和一個 CD3 結合部分 (抗 GPRC5D/抗 CD3 T 細胞雙特異性抗體)。製備以下抗 GPRC5D/抗 CD3 T 細胞的雙特異性抗體：i) 6623 (SEQ ID NO 114、115、116 和 117)；ii) 6624 (SEQ ID NO 118、119、120 和 121)；iii) 6625 (SEQ ID NO 122、123、124 和 125)；iv) 6626 (SEQ ID NO 126、127、128 和 129)。DP47-TCB (「非靶向 TCB」) 描述於 PCT 公開號 WO 2014/131712 A1 中，該專利全文以引用方式併入本文。B72-TCB 衍生自 WO 2018/0117786 A2 的表 23 中公開的 GCDB72 抗體，並且包含 GCDB72 的 GPRC5D 結合部分 (實例 7)。術語「B72 TCB」在本文中也指術語「B72」。BCMA-TCB 衍生自 WO 2016/166629 A1，並且包含如本文所公開的 A02_Rd4_6nM_C01 的 GPRC5D 結合部分。如實例 2 所述，BCMA-TCB 以 crossmab 2+1 形式生成 (SEQ ID No 77、78、79、80)。術語「5F11-TCB」和「5F11p-CH2527」在本文中可互換使用。術語「5E11-TCB」和「5E11p-CH2527」在本文中可互換使用。
實例 14.1 ： T 細胞雙特異性抗體與多發性骨髓瘤細胞株和 Jurkat-NFAT 細胞之結合
為測量與 GPRC5D 之結合，對報告的多發性骨髓瘤細胞株 (Lombardi 等人Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics: insights into the biology of the disease；Genes Chromosomes Cancer. 2007 Mar;46(3):226-38) 進行基於流式細胞儀的結合測定。將細胞株 NCI-H929 (ATCC® CRL-9068) 置於添加有 10% FBS、1x 青黴素/鏈黴素 (Gibco)、1x 丙酮酸鈉 (Gibco) 和 50 µM β-巰基乙醇 (Gibco) 的 RPMI 1640 和 Glutamax 培養基 (Gibco) 中進行培養。將 Jurkat-NFAT 報告細胞 (帶有 NFAT 啟動子的表現 CD3 的人急性淋巴白血病報告細胞，GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega #CS176501) 在 RPMI 1640 中培養，該溶液中包含 2 g/l 葡萄糖、2 g/l NaHCO3、10% FCS、25 mM HEPES、2 mM L-麩醯胺酸、1 x NEAA、1 x 丙酮酸鈉和 200 µg/ml 潮黴素 B。
將 96 圓底孔板中每個孔中的 0.1 Mio 細胞與 100 nM 至 1.3 pM (連續稀釋倍數 1:5) 的指定 GPRC5D-TCB 構建體 5E11p-CH2527、6625、6626、5F11p-CH2527、6623 或 6624 或無構建體在 4℃ 下孵育 30 min。用 FACS 緩衝液 (PBS，2%胎牛血清；1% 0.5 M EDTA pH 8；0.25% NaN3 疊氮化鈉 (20%)) 將細胞洗滌兩次，並用 FACS 緩衝液中按 1/100 稀釋 PE-複合的山羊抗人 IgG、Fcγ 染色片段特異性 (Jackson Laboratories，109-606-008) 在 4℃ 下再染色 30 min。
使用自訂設計的 BD Biosciences Fortessa 進行流式細胞儀採集，並使用 BD Diva 進行分析。使用 GraphPad Prism 軟體計算 EC50 值。
圖 16 表明所有 TCB 分子均能夠以濃度依賴性方式與人 GPRC5D 以及人 CD3 結合。簡言之，5E11p-CH2527 的兩個人源化版本 (即 6625 和 6626) 與親本 TCB 之結合均表現出與人 GPRC5D 的增強結合，這也導致結合 EC50 值降低 (圖 16A 和 表 14.1)。此外，與 5F11p-CH2527 和 6623 相比，6624 與人 GPRC5D 之結合略有增強 (圖 16B)。通常，所有基於 5F11 的分子都比基於 5E11 的分子表現出更出色的與人 GPRC5D 的結合。所有基於 5E11 的 TCB 分子表現出相當的與人 CD3 的濃度依賴性結合 (圖 16C)，而與表現人 CD3 的 Jurkat-NFAT 細胞一起孵育時，5F11p-CH2527 的兩種人源化變異體 (即 6623 和 6624) 在最高抗體濃度下表現出比親本更強的整體結合信號 (圖 16D)。
表 14.1：所顯示的 GPRC5D-TCB 分子與 NCI-H929 上表現的人 GPRC5D 或 Jurkat 細胞上表現的人 CD3 結合的 EC50 值 (nM)。
EC50 (nM) 5E11p-CH2527 6625 6626 5F11p-CH2527 6623 6624
NCI-H929 3.36 1.15 0.85 0.18 0.36 0.1
Jurkat 3.67 11.47 7.8 2.31 n.c. n.c.
實例 14.2 ： T 細胞雙特異性抗體與多發性骨髓瘤細胞株之結合
由於實例 14.1 中顯示的數據被錯誤地計算為 10 倍，因此 EC50 值過低。因此，為重新評估與 GPRC5D 之結合，對報告的多發性骨髓瘤細胞株 (Lombardi 等人Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics: insights into the biology of the disease；Genes Chromosomes Cancer. 2007 Mar;46(3):226-38) 進行一系列基於 FACS 的結合測定。在添加有 20% 熱滅活的胎牛血清 (FBS，Gibco) 的 RPMI 1640 + 1% Glutamax 培養基 (Gibco) 中對細胞株 OPM-2 進行培養。在添加有 10% 熱滅活的胎牛血清 (FBS, Gibco)、50 µM 巰基乙醇 (Gibco) 和 1 mM 丙酮酸鈉 (Gibco) 的 RPMI 1640 + 1% Glutamax 培養基 (Gibco) 中對細胞株 NCI-H929 進行培養，並在添加有 10% 熱滅活的胎牛血清 (FBS，Gibco) 的 RPMI 1640 + 1% Glutamax 培養基 (Gibco) 中對 RPMI-8226 進行培養。在 75 cm2 燒瓶 (TPP) 中培養細胞株，每週傳代兩次。
簡言之，收穫懸浮細胞，對其計數並評估生存力。所有後續步驟均在 4℃ 下進行。
將細胞以每毫升 0.5 Mio 個細胞重懸於 PBS 中。接下來，將 0.05 Mio 細胞接種到圓底 96 孔板的每個孔中，離心並棄去上清液。用包含 Fc 阻斷劑 (BioLegend #422302，按 1:400 的比例預稀釋) 的 zombie aqua 生存力染色劑 (BioLegend #423102，按 1:400 的比例預稀釋) 對細胞染色 20 分鐘，每個孔的總體積為 50 μl。用 FACS 緩衝液洗滌細胞，並與濃度遞增的 5E11(6625)-TCB (在本文中也稱為 6625) (0.7 nM - 500 nM，每個孔的總體積為 25 μl) 一起在 4℃ 下孵育 30 分鐘。對測定板進行離心，並棄去上清液。
此後，藉由平穩的渦旋將細胞重懸，並在 4℃ 下以每個孔總體積 25 μl 的溫度再孵育 30 min，在 FACS 緩衝液中包含 500 nM 二級抗體 (aPGLALA mulG2b Alexa 647，內部製備)。將細胞洗滌一次，並在配備 FACS Diva 的 BD 流式細胞儀上進行分析。使用 GraphPadPrism6 取得結合曲線和 EC50 值。重複分析 1 的 EC50 值對應於圖 25A、圖 25B 和圖 25C 中所示的圖。重複分析 2 的 EC50 值對應於圖 25D、圖 25E 和圖 25F 中所示的圖。重複分析 3 的 EC50 值對應於圖 25G、圖 25H 和圖 25I 中所示的圖。
圖 25 顯示了 5E11(6625)-TCB 與表現各種水平的人 GPRC5D 的 MM 細胞株的濃度依賴性結合。結合的 EC50 為 20 nM 至 158 nM，並且由於細胞上標靶表現量的變化而顯示出一些測定變化。
表 14.2. 5E11(6625)-TCB 與在不同確定的 MM 細胞株上表現的人 GPRC5D 之結合的 EC50 值
EC50 (nM) OPM-2 NCI-H929 RPMI-8226
重複分析 1 34.5 75.8 26.8
重複分析 2 75.5 ~ 123.2 20.4
重複分析 3 54.2 ~ 158.2 55
實例 15
使用 RPMI-8226 (ATCC® CCL-155) 細胞與 Jurkat-NFAT 報告細胞 (Promega #CS176501) 的共培養物，評估 GPRC5D-TCB 在同時結合人 CD3 和人 GPRC5D 時誘導 CD3 介導的 Jurkat-NFAT 效應細胞活化的能力。在 TCB 分子與 RPMI-8226 細胞上的人 GPRC5D 和 Jurkat-NFAT 報告細胞上的人 CD3 抗原同時結合後，NFAT 啟動子被活化並導致活性螢火蟲螢光素酶的表現。發光信號的強度 (藉由添加螢光素酶底物取得) 與 CD3 活化和信號傳導的強度成正比。
在測定時，在 96 孔板的每個孔中接種 20000 個 RPMI8226 細胞，並在包含 20% FBS 和 1% Pen/Strep 的 RPMI 中以 1:10 連續稀釋倍數添加指示的 TCB 分子以取得 50 nM 至 5 fM 的最終濃度範圍。向每個孔中添加 50000 Jurkat-NFAT 細胞，取得 2.5:1 的最終 E:T 比率。在 37℃ 和 5% CO2 中孵育過夜後，將 100 µl ONE-Glo 試劑 (Promega) 加入等體積的測定上清液中，並在室溫下避光保存 5 分鐘。使用 Perkin Elmer 讀板儀分析發光。
如圖 17A 所示，所有評估的 GPRC5D TCB 分子均以劑量依賴性方式誘導 Jurkat-NFAT 活化，而在兩種非靶向 DP47 TCB 對照分子中任一個的存在下均未得到明顯的信號。非靶向 DP47 TCB 1 包含 CD3 結合物，該結合物包含 SEQ ID No:104 之 VH 和 SEQ ID No: 105 之 VL。非靶向 DP47 TCB 2 包含 CD3 結合物，該結合物包含 SEQ ID No:35 之 VH 和 SEQ ID No: 36 之 VL。使用 GraphPadPrism6 計算 Jurkat 活化的相應 EC50 值，並列於表 15 中。考慮到 EC50 以及 AUC (見表 15)，分子的排序如下：6624 ＞ 6623 ＞ 5F11p-CH2527 ＞ 6626 ~6625 ＞ 5E11p-CH2527。
在存在其他 (多發性骨髓瘤) 細胞株的情況下進行了類似的測定，該細胞株表現各種濃度的人 GPRC5D (透過流量 (Quantum Simply Cellular，Bangslabs) 測定)，並以細胞株名稱旁邊括號中的 GPRC5D 結合位點編號指示。
使用 GraphPadPrism 計算 EC50 和 AUC，並將其繪製在 x 軸與 y 軸上 (圖 17B 至圖 17G)。
如圖 17B 至圖 17G 所示，在存在具有各種相對 GPRC5D 表現的細胞株的情況下，所有分子均表現出濃度依賴性 Jurkat 活化；分子排序類似，且與存在的靶細胞株無關。
表 15：EC50 值 (pM) 或曲線下面積 (AUC) 由存在 RPMI-8226 細胞的情況下 GPRC5D-TCB 介導的 Jurkat-NFAT 報告細胞的活化計算得出，其藉由過夜孵育 (~20 h) 後的發光進行測量。
5E11p-CH2527 6625 6626 5F11p-CH2527 6623 6624
EC50 (pM) 157 40 49.7 14.0 8.9 4.5
AUC 265 250 571 600 582 400 393 460 778 140 880 720
實例 16 ： GPRC5D-TCB 介導的 T 細胞毒性
為進一步測量抗 GPRC5D-TCB 抗體的功能，實施了體外腫瘤細胞裂解測定。簡言之，將 AMo-1 (DSMZ ACC 538)、NCI-H929 ATCC® CRL-9068、LP-1 (DSMZ ACC 41) 和 IM-9 (ATCC® CCL-159) 細胞株與作為效應細胞的泛人 T 細胞共培養，最終效應細胞與目標細胞的比率為 10:1。使用泛人 T 細胞分離試劑盒 (Miltenyi Biotec)，從健康供體的外周血單核細胞 (PBMC) 中分離出泛人 T 細胞。加入濃度遞減 (在 50 nM 至 5 pM 的範圍內，稀釋倍數為 1:10) 的指示 GPRC5D- (6625 和 B72) 或靶向 BCMA 的 T 細胞結合雙分子。納入非靶向 TCB 作為陰性對照。
在 37℃ 和 5% CO2 下孵育 20 小時後，按照製造商的手冊藉由定量發光信號 (CytoTox-Glo 細胞毒性測定法，Promega) 確定細胞死亡。將相對發光信號 (RLU) 顯示為確定細胞死亡的直接指標。使用 GraphPadPrism 計算 EC50 和 AUC，並匯總於表 16 中。
圖 18A 至圖 18D 表明，所有 TCB 分子均能夠分別誘導人 GPRC5D 和 BCMA 的相對表現量變化的各種腫瘤細胞株的濃度依賴性裂解。6625 和 B72 的直接比較結果顯示，6625 分子具有更高的效力和效價。6625 與 BCMA-TCB 的比較結果顯示，在存在 AMo-1 (圖 18A)、NCI-H929 (圖 18B) 和 LP-1 (圖 18C) 的情況下，6625 的體外效力和效價更高。而 BCMA-TCB 誘導 IM-9 的更強腫瘤細胞裂解 (圖 18D)，其表現的 GPRC5D 濃度較低。在測試的細胞株上，6625 和 BCMA-TCB 的不同排序可能透過 GPRC5D 與 BCMA 在這些細胞株上的不同相對表達濃度來解釋。
表 16：在存在指定的細胞株的情況下由 GPRC5D- 或 BCMA-TCB 介導的腫瘤細胞裂解計算 EC50 值 (pM)，並在孵育過夜 (~20 h) 後藉由發光確定。
EC50 (pM) 腫瘤適應症 6625 B72 BCMA-TCB
AMO-1 漿細胞瘤 8.3 79.9 137.1
NCI-H929 MM 0.597 26.95 171
LP-1 MM 7.99 48.95 76.36
IM-9 來自 MM 患者的 B 類淋巴母細胞 266.9 197.5 55.69
表 17：在存在指定的細胞株的情況下由 GPRC5D- 或 BCMA-TCB 介導的腫瘤細胞裂解計算曲線下面積，並在孵育過夜 (~20 h) 後藉由發光確定。
AUC 腫瘤適應症 6625 B72 BCMA-TCB
AMO-1 漿細胞瘤 80117761 54494020 47326610
NCI-H929 MM 17872547 10854134 10684467
LP-1 MM 15438497 11504124 11100680
IM-9 來自 MM 患者的 B 類淋巴母細胞 9268093 8600921 10994563
實例 17 ：在存在初代性 MM 樣本的情況下，抗 GPRC5D-TCB 介導的 T 細胞活化
為評估 GPRC5D TCB 分子在初代多發性骨髓瘤樣本上的活性，使用 BD Pharm Lysis 緩衝液 (#555899) 解凍冷凍的未經處理的骨髓樣本 (Proteogenex)，並進行快速的紅細胞裂解。然後，洗滌細胞，將其重懸於 RPMI 1640 Glutamax 中，其中包含 20% 熱滅活的胎牛血清、2% 人血清和 1% 青黴素/鏈黴素 (均來自 Gibco)，並以每孔 100 µL 細胞懸液 (30000 個細胞) 的量將其接種到 96 孔板圓底 (TPP) 中。加入自體 T 細胞，使得混合 BM 樣本中的每個細胞對應 10 個 T 細胞。加入指示的分子，使最終濃度範圍為 50 nM 至 0.05 nM (按 1:10 稀釋)，96 孔板中每個孔中的總體積為 200 µl。
在加濕培養箱中於 37℃ 下孵育過夜後，將細胞用 PBS 洗滌一次，並在 4℃ 下用 50 µL Live blue (Invitrogen，# L23105) 染色 20 分鐘，以區分活細胞與死細胞。根據製造商的建議，使用以下抗體的混合物進行表面染色：CD25 BV605、CD69 APC-Cy7、CD38 BV510、CD138 FITC、CD8 BV711、CD3 PE-Cy5 和 CD4 AlexaFluor700 (均來自 BioLegend)。在最終分析中，將細胞重懸於 100 µL FAC 緩衝液中，並用 Fortessa (BD Biosciences) 收集數據。圖 19 顯示了由存活的 CD8 T 細胞的百分比確定的 T 細胞活化百分比，其中早期活化標志物 CD69 呈陽性。T 細胞活化的 EC50 由 Graph Pad Prism 計算得出，並匯總於表 18 中。靶向 GPRC5D 的兩種代表性雙分子，即 6624 和 6625，均能夠誘導濃度依賴性 T 細胞活化，其 EC50 分別為 1.06 pM 和 14.8 pM，而在存在非靶向 TCB 對照的情況下，則未誘導 T 細胞活化。在所示的情況下，BCMA-TCB 活化的 T 細胞的程度小於所評估的兩種 GPRC5D TCB 分子。潛在的原因可能為 GPRC5D 和 BCMA 的相對表現量差異 (未評估)。僅在比使用 6624 和 6625 觀察到的濃度高得多的濃度下，B72 分子才誘導顯著的 T 細胞活化，但是在測得的兩種最高濃度下，B72 導致更高的總體活化。正如我們在健康供體的骨髓樣本中觀察到的在類似的 B72 濃度下的 T 細胞活化一樣，目前尚不清楚在存在初代性 MM 樣本的情況下觀察到的 B72 效應是否純粹具有標靶依賴性 (見圖 21)。
表 18：EC50 值 (pM)，由 GPRC5D- 或 BCMA-TCB 介導的自體 T 細胞活化計算得出，與初代性 MM 樣品一起孵育，並在大約 24 h 後藉由流式細胞術分析 CD8 T 細胞上的 CD69 進行定量。
6624 6625 B72 BCMA-TCB
EC50 (pM) 1.06 14.8 ~ 612.5 52.54
實例 18 ：健康供體的 PBMC 孵育後的 B 細胞耗竭
利用經典的密度梯度離心，從健康供體的血液中分離出人 PBMC。在包含 10% FBS 和 1% Pen/Strep 的 RPMI 1640 培養基中，以每孔 200000 個 PBMC 的量將其接種到 96 孔板中。加入指示的雙特異性分子，使其最終濃度達到 50 nM、5 nM、0.5 nM 或 0.05 nM，每個孔的總體積為 200 µl。在加濕培養箱中於 37℃ 下培養 48 h 後，用 FACS 緩衝液洗滌細胞，並根據製造商的操作規程將細胞與 Human TruStain FcX™ (Fc block，BioLegend) 一起孵育以封閉 Fc 受體。使用 Live blue (Invitrogen，# L23105) 區分活細胞與死細胞 (參見實例 17)。在 4℃ 下對以下標志物進行 30 min 的表面表現：CD19、CD45、CD4、CD38、CD8、CD138 (均來自 BioLegend)。為了對每個孔中的 B 細胞進行絕對定量，在使用 BD FACS Fortessa 進行流式細胞分析之前，向每個孔中加入 10 µl CountBright 絕對計數珠 (Invitrogen #C36950)。圖 20A 至圖 20D 顯示了 5 種不同健康供體的總結，這些供體已經用指定的雙特異性分子在不同抗體濃度下進行了評估，所述濃度分別為 50 nM (圖 20A)、5 nM (圖 20B)、0.05 nM (圖 20C) 和 0.05 nM (圖 20D)。根據重複測定結果的 SD (每個供體)，按照未經處理的對照對 B 細胞計數進行歸一化。在 BCMA-TCB 以及 GPRC5D-TCB 6626 中均觀察到健康 B 細胞的大量消耗，而其他靶向 GPRC5D 的 TCB (包括 B72) 在大多數供體中均未顯著消耗 B 細胞。利用 6626 觀察到的 B 細胞耗竭作用僅限於高於約 5 nM 的濃度，而 BCMA-TCB 耗竭在 0.05 nM 的濃度下已導致健康 B 細胞耗竭。總之，結果表明，靶向 GPRC5D 的分子耗竭健康 B 細胞的風險似乎要低得多，這可能體現了它的安全性優勢。
實例 19 ：健康供體骨髓樣本孵育後對 T 細胞活化的影響
在採樣後 1 天，對健康供體 (Lonza) 的未經處理的骨髓進行評估。使用 (BD Pharm 裂解緩衝液 #555899) 快速裂解紅細胞後，洗滌細胞，將其重懸於 RPMI 1640 Glutamax 中，其中包含 20% 熱滅活的胎牛血清、2% 人血清和 1% 青黴素/鏈黴素 (均來自 Gibco)，並以每孔 100 µL 細胞懸液 (30000 個細胞) 的量將其接種到 96 孔板圓底 (TPP) 中。加入指示的分子，使最終濃度範圍為 5 nM 至 0.05 nM (按 1:10 稀釋)，96 孔板中每個孔中的總體積為 200 µl。
在加濕培養箱中於 37℃ 下孵育過夜後，將細胞用 PBS 洗滌一次，並在 4℃ 下用 50 µL Live blue (Invitrogen，# L23105) 染色 20 分鐘，以區分活細胞與死細胞。根據製造商的建議，使用以下抗體的混合物進行表面染色：CD25 BV605、CD69 APC-Cy7、CD38 BV510、CD138 FITC、CD8 BV711、CD3 PE-Cy5 和 CD4 AlexaFluor700 (均來自 BioLegend)。在最終分析中，將細胞重懸於 100 µL FAC 緩衝液中，並用 Fortessa (BD Biosciences) 收集數據。圖 21 顯示了 T 細胞活化，其藉由指定治療後的 CD69 陽性 CD8+ (A) 或 CD4+ T 細胞 (B) 的百分比確定。
利用 BCMA-TCB 或 B72 檢測到骨髓樣本中存在明顯的濃度依賴性 T 細胞活化，而利用 6624 或 6625 則檢測不到。這說明以更高的劑量使用時，6624 和 6625 等分子比 BCMA-TCB 或 B72 具有潛在的安全性優勢。
實例 20 ：健康供體人全血中的細胞因子釋放
在 BD Vacutainer 鋰肝素管中收集來自 6 位健康供體的全血，並在 3 小時內進行分析。在 PBS (Gibco#14190) 中稀釋 GPRC5D-TCB 6624 和 6625 以及非靶向 TCB 對照分子，並在圓底 96 孔板 (Corning#Costar 3799) 中將 5 µL 加入 195 µL 全血中，使最終濃度達到 50、0.5 和 0.005 nM。單株抗體 Gazyva (阿托珠單抗) 和 Lemtrada (阿侖單抗) 的相似檢測濃度分別為 50、0.5 和 0.005 nM，而 Erbitux (西妥昔單抗) 的檢測濃度為 50 nM。PBS 僅用作載劑對照。在 37℃ 下孵育 24 h 後，將板以 1800 g (3000 rpm) 離心 5 min。根據製造商的建議，在使用 Millipore 試劑盒 (HCYToMAG-60K) 和 Luminex 閱讀器 LX 200 進行多重細胞因子檢測之前，收集血漿上清液 (~70 µl) 並保存在 -80℃ 下。如圖 22A (人 TNFa) 和圖 22B (人 IL-6) 所匯總的，6624 誘導的低水平 TNFa 和 IL-6 的分泌水平與 Gazyva 類似，而 6625 誘導的水平甚至更低，表明 6624 可能在細胞因子釋放方面表現出良好的安全性。
實例 21 ： NCI-H929 (hNSG 小鼠 ) 中不同 GPRC5DxCD3 雙特異性 TCB 分子的體內效力
為進一步評估 GPRC5D TCB 分子 6623、6624、6625 和 6626 的效力，評估了它們在具有多發性骨髓瘤的完全人源化 NSG 小鼠中誘導腫瘤消退的潛力。將生存力 ＞ 95.0% 的 2.5 x106 NCI-H929 細胞重懸於 RPMI 細胞培養基 (Gibco) 和 GFR matrigel (1:1，總體積為 100 µl) 中，並皮下注射到人源化雌性 NSG (NoD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) 小鼠右脅。
小鼠的人源化方法如下：實驗開始時 4-5 週齡的小鼠 (在法國里昂的 Charles River 繁殖) 保持無病原體條件，根據規定的指南每天光照 12 h/黑暗 12 h (GV-Solas；Felasa；TierschG)。實驗研究方案已經由地方政府審查和批准 (RoB-55.2-2532.Vet_03-16-10)。收到動物後，將動物飼養一周以適應新環境並進行觀察。定期進行持續的健康狀況監測。根據方案，經腹膜內註射，對雌性 NSG 小鼠給予15 mg/kg Busulfan，一天后靜脈注射從臍帶血中分離出的 1 x 105 人造血幹細胞。在幹細胞注射後第 16-20 週，對小鼠放血，並利用流式細胞儀分析血液是否成功實現人源化。將有效移植的小鼠根據其人 T 細胞頻率隨機分入不同的給藥組中 (n = 10/組)。
那時，將腫瘤細胞注射到小鼠中。如上所述，在腫瘤大小達到平均尺寸 308 mm3 (範圍 92 - 841 mm3 ) 時，每周用化合物或 PBS (載劑) 治療一次。向所有小鼠靜脈注射 0.05 mg/kg 和 0.005 mg/kg 的所示 TCB 分子 (參見圖 23A 和 23B)。
為了得到適當量的化合物，用組胺酸緩衝液 (20 mM 組胺酸，140 mM NaCl，pH 6.0) 稀釋儲備液。使用卡尺每週測量兩次腫瘤生長，並依據以下方法計算腫瘤體積：
Tv ：(W2 /2) x L                (W：寬；L：長)
在腫瘤細胞接種後第 41 天終止研究，並在三次注射化合物後處死所有小鼠，分離出腫瘤並稱重。根據雙向兩性方差分析 (Tukey 試驗) 進行統計。
如圖 23A 和 23B 所示，在 0.005 mg/kg 的低劑量下，評估的 GPRC5D-TCB 分子未表現出有效的腫瘤生長抑制。相比之下，在 0.05 mg/kg 的劑量下，與載劑組相比，評估結果表明所有四種 GPRC5D TCB 分子均具有顯著的抗腫瘤生長反應。圖 23C 至圖 23G 進一步示出每個治療組的單隻小鼠的腫瘤生長抑制。但是，在評估的四種分子之間無顯著差異，證實了所有四種 GPRC5D TCB 分子的高臨床前效力。
實例 22 ： hFcRn Tg 和 Ko 小鼠體內的 SDPK
為評估 GPRC5D TCB 分子 6623、6624、6625 和 6626 的 PK 特性，分別以 1 mg/kg 的劑量經由尾靜脈將各自的分子透過靜脈內 (推注) 到 -/- huFcRn Tg 系 32 (B6.Cg-Fcgrt＜tm1Dcr＞ Tg(FCGRT)32Dcr) 小鼠或 -/- muFcRn (B6.129X1-Fcgrttm1Dcr/DcrJ) (JAX 實驗室，Bar harbor，USA) 中。所有研究均在當地獸醫當局的批准下嚴格遵守瑞士聯邦關於動物保護的法規和國際實驗動物管理評鑑及認證協會 (AAALAC) 的規定。在給藥後的指定時間點透過靜脈穿刺 (尾靜脈) 採集血液以得到血清用於分析：對於 -/- huFcRn Tg 系，給藥後 0.083、7、24、48、72、168、336、504 和 672 h；對於 -/- muFcRn 系，給藥後 32、0.083、2、7、24、31、48、72 和 96 h。將血液在室溫下保存 20 分鐘以進行 coting，並藉由在 4℃ 下以 15000 rpm 離心 5 min 得到血清，然後立即將其冷凍。所有血清樣品均保存在 -20℃ 下，直至藉由電化學發光免疫分析法 (ECLIA) 進行分析，該方法為一種針對所施用的抗體及其變異體的人 Fab 部分的特異性方法。
簡言之，將預先用測定緩衝液稀釋的樣品與捕獲和檢測分子在 37℃ 下孵育 9 分鐘。使用生物素化 mAb＜H-Fab(κ)＞M-IgG-Bi 作為捕獲分子，並使用釕(II)三(聯吡啶基)32+ 標記的 mAb＜H-Fab (CH1)＞M-1.19.31-IgG-S-Ru 小鼠單株抗體進行檢測。加入抗生蛋白鏈菌素包被的磁性微粒，並在 37℃ 下額外孵育 9 min，以使由於生物素與抗生蛋白鏈菌素的相互作用而形成複合物。將複合物磁性捕獲在電極上，並藉由光電倍增管檢測器測量使用共反應物三丙胺 (TPA) 產生的化學發光信號。以四重複的方式，分析所有血清樣品和陽性或陰性對照樣品，並利用施用的相應抗體進行校準。
如圖 24 和表 19 所示，所有四種 GPRC5D TCB 分子在 hFcRn tg32 小鼠中均表現出可接受的 PK 分佈，其範圍在經典 IgG 的一個範圍內。在 FcRn ko 小鼠中產生的數據被視為與評估非特異性細胞攝取有關，這可能與免疫原性相關。如圖 10B 所匯總，6625 和 6626 的清除率相當，而 6623 和 6624 的清除率則升高，表明非特異性細胞攝取的可能性略高。
表 19：根據 SDPK 研究計算出的 hFcRn Tg32 或 FcRn Ko 小鼠中的清除率及相應的半衰期
hFcRn Tg32 小鼠 FcRn Ko 小鼠
分子 清除率 (mL/d/kg) 半衰期 (d) 清除率 (mL/d/kg) 半衰期 (d)
6623 13.6 5.6 97.3 0.3
6624 22.5 6.2 143 0.6
6625 13.0 7.2 61.3 1.2
6626 9.6 7.3 57.8 1.1
*    *     *
儘管為了清楚理解起見，藉由圖示和實例的方式對上述發明進行了詳細描述，但是這些描述和實例不應被解釋為限製本發明的範圍。本文引用的所有專利和科學文獻的公開內容均以引用的方式明確納入其全部內容。
圖 1A 至圖 1Z. 本發明之雙特異性抗原結合分子之例示性組態。(圖 1A、圖 2D)「1+1 CrossMab」分子之圖示。(圖 1B、圖 1E)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有 Crossfab 和 Fab 組成之順序替換 (「反向 (inverted)」)。(圖 1C、圖 1F)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示。(圖 1G、圖 1K)「1+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有 Crossfab 和 Fab 組成之順序替換 (「反向 (inverted)」)。(圖 1H、圖 1L)「1+1 IgG Crossfab」分子之圖示。(圖 1I、圖 1M)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有二個 CrossFab。(圖 1J、圖 1N)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有二個 CrossFab 及 Crossfab 和 Fab 組成之順序替換 (「反向 (inverted)」)。(圖 1O、圖 1S)「Fab-Crossfab」分子之圖示。(圖 1P、圖 1T)「Crossfab-Fab」分子之圖示。(圖 1Q、圖 1U)「(Fab)2 -Crossfab」分子之圖示。(圖 1R、圖 1V)「Crossfab-(Fab)2 」分子之圖示。(圖 1W、圖 1Y)「Fab-(Crossfab)2 」分子之圖示。(圖 1X、圖 1Z)「(Crossfab)2 -Fab」分子之圖示。黑點：Fc 域中的可選修飾，其促進異二聚體化 (heterodimerization)。++、--：在 CH1 和 CL 域中可選地引入相反電荷的胺基酸。Crossfab 分子被描述為包含 VH 和 VL 區域的交換，但可以-在其中，CH1 和 CL 域中沒有引入電荷修飾的實施例中-交替地包含 CH1 和 CL 域的交換。 圖 2. 藉由 RNAseq 分析漿細胞和 B 細胞上腫瘤標靶的基因表現。 圖 3. 本發明之 5E11-雙特異性抗原結合分子之例示性組態。黑點：Fc 域中的可選修飾，其促進異二聚體化 (heterodimerization)。++、--：在 CH1 和 CL 域中可選地引入相反電荷的胺基酸。 圖 4A 至圖 4C. 雙特異性抗原結合分子 5F11-TCB (圖 4A) 和 5E11-TCB (圖4B) 以及對照抗體 ET150-5-TCB (圖4C) 與表現 GPRC5D 的多發性骨髓瘤細胞株 AMO-1、L636、NCI-H929、RPMI-8226、OPM-2 和對照細胞 WSU-DLCL2 的結合分析。 圖 5A 至圖 5E. GPRC5D-TCB 介導的 T 細胞毒性對多發性骨髓瘤細胞株 AMO-1 (圖 5A)、NCI-H929 (圖 5B)、RPMI-8226 (圖 5C) 和 L363 (圖 5D) 的分析。對照細胞株為 WSU-DL CL2 (圖 5E)。所測試之分子：5E11-TCB、5F11-TCB。對照分子：DP47-TCB (未經靶定) 和 ET150-5-TCB。 圖 6. 經 GPRC5D-TCB 活化之 T 細胞接合 (engagement) 與多發性骨髓瘤細胞株 NCI-H929 和陰性對照細胞株 WSU-DLCL2 上調 CD25 和 CD69 的分析。 圖 7A 至圖 7J. 在 AMO-1 (圖 7A)、NCI-H929 (圖 7B)、RPMI-8226 (圖 7C)、L363 (圖 7D) 和 WSU-DLCL2 (圖 7E) 存在下，用濃度漸增的 GPRC5D-TCB 或陰性對照 DP47-TCB 培育 T 細胞時，藉由 CD8+T 細胞上的 CD25 上調來確定 T 細胞活化；以及在存在 AMO-1 (圖 7F)、NCI-H929 (圖 7G)、RPMI-8226 (圖 7H)、L363 (圖 7I) 和 WSU-DLCL2 (圖 7J) 的情況下，用增加漸增的 GPRC5D-TCB 或陰性對照 DP47-TCB 培育 T 細胞時，藉由 CD8+T 細胞上的 CD69 上調來確定 T 細胞活化。 圖 8A 至圖 8B. 藉由螢光共焦顯微鏡視覺化抗體定位和內化 (圖 8A) 和分析胞膜與胞質的訊號強度 (圖 8B)。 圖 9. 藉由 ELISA、利用表現人 GPRC5D (選殖株 12) 或食蟹獼猴 GPRC5D (選殖株 13)、鼠 GPRC5D (選殖株 4) 或人 GPRC5A (選殖株 30) 的穩定轉染 CHO 選殖株，評估不同抗 GPRC5D 抗體與人、犬和鼠 GPRC5D 的結合。 圖 10A 至圖 10G. 藉由不同的 GPRC5D 靶向或 BCMA 靶向 T 細胞雙特異性分子誘導 T 細胞介導的各種多發性骨髓瘤 (MM) 細胞株的溶裂 (共培育20小時的期間 (E:T = 10: 1，人泛 T 細胞))。所繪示的為重複數加上SD。 圖 11A 至圖 11F. 不同的 GPRC5D 靶向或 BCMA 靶向 T 細胞雙特異性分子誘導的 T 細胞活化 (圖 11A 中的 5E11-TCB；圖 11B 中的 5F11-TCB；圖 11C 中的 10B10-TCB；圖 11D 中的 BCMA-TCB；圖 11E 中的 B72-TCB；圖 11F 中的 DP47-TCB)，為來自健康供體的同種異源 (allogenic) 泛人 T 細胞和未處理的骨髓細胞 (E:T = 10:1，泛人 T 細胞) 共培育約 20 小時期間。所描繪的為來自一個代表性供體的 FACS 點圖，顯示 CD4 T 細胞 (上排) 或 CD8 T 細胞 (下排) 上的活化標記 CD69 的上調，為所有 CD4 各自的 CD8 T 細胞中陽性細胞的百分比。 圖 12A 至圖 12B. 不同的 GPRC5D 靶向或 BCMA 靶向 T 細胞雙特異性分子誘導的 T 細胞活化，為來自健康供體的同種異源泛人 T 細胞和未處理的骨髓細胞 (E:T = 10:1，泛人 T 細胞) 共培育約 20 小時期間。描繪的為所有四個評估供體的總結，顯示在選定的固定劑量的 50 nM 的 TCB (圖 12A) 或 5 nM (圖 12B)下，CD8 T 細胞上的活化標記 CD69 上調。 圖 13A 至圖 13D. 不同的 GPRC5D 靶向 T 細胞雙特異性分子 (圖 13A 中的 5F11-TCB；圖 13B 中的 BCMA-TCB；圖 13C 中的 B72-TCB；圖 13D 中的載劑) 所誘導的體內療效，在人源化 NSG 小鼠模式 (經植入 NCI-H929 腫瘤細胞) 中，藉由腫瘤生長動力學隨時間的變化來描繪。所繪製的為蜘蛛圖，每條線指的是單一小鼠。 圖 14A 至圖 14D. 不同的 GPRC5D 靶向 T 細胞雙特異性分子 (圖 14A 中的 5F11-TCB；圖 14B 中的 5E11-TCB；圖 14C 中的 B72-TCB；圖 14D 中的載劑) 所誘導的體內療效，在人源化 NSG 小鼠模式 (經植入 OPM-2 腫瘤細胞) 中，藉由腫瘤生長動力學隨時間的變化來描繪。所繪製的為蜘蛛圖，每條線指的是單一小鼠。 圖 15A 至圖 15B. PGLALA-CAR-J 活化後約 16 小時的培育，由發光確定。後者為在 GPRC5D IgG (圖 15A 中的 5F11-IgG；圖 15B 中的 5E11-IgG) 與表現 GPRC5D 的多發性骨髓瘤細胞株 L-363 和 經 PGLALA 修飾的 Fc 域與 Jurkat-NFAT 報導細胞同時結合時誘導的，Jurkat-NFAT 報導細胞為經基因工改造程以表現針對這些 IgG 分子 Fc 部分中 PGLALA 突變的 TCR。所繪示的為重複數加上SD。 圖 16A 至圖 16D. 人源化 TCB 分子相對親本 TCB 結合在 NCI-H929 細胞上的人 GPRC5D (圖 16A 和 16B) 和 Jurkat 細胞上的人 CD3 (圖 16C 和 16D) 表現的細胞。 圖 17A 至圖 17G. Jurkat-NFAT 活化檢定在不同的 GPRC5DxCD3 雙特異性 TCB 分子的存在下 (圖 17A至 17G) 與未經靶定對照 TCB，如所示。 圖 18A 至圖 18D. 腫瘤細胞溶裂檢定比較如本文中所提出的 GPRC5D-TCB 分子和本技術領域中已知的靶向 GPRC5D 或 BCMA 的分子相對未經靶向的參考 TCB 分子。 圖 19. 用不同的 CD3 參與的雙特異性分子培育初代 MM 樣本時自體 T 細胞的活化。如本文中所提出的 GPRC5D-TCB 與本技術領域中已知的靶向 GPRC5D 或 BCMA 的分子與未經靶定的參考 TCB 分子比較。 圖 20A 至圖 20D. 健康供體的 PBMC 與不同的 CD3 參與的雙特異性分子培育後 B 細胞的耗竭。如本文中所提出的 GPRC5D-TCB 與本技術領域中已知的靶向 GPRC5D 抑或是 BCMA 的分子與未經靶定的參考 TCB 分子比較。使用濃度為50 nM (圖 20A)、5 nM (圖 20B)、0.5 nM (圖 20C) 和 0.05 nM (圖 20D) 的抗體。 圖 21A 至圖 21B. 健康供體的骨髓樣本與不同的 CD3 參與的雙特異性分子培育後 T 細胞的活化。將如本文中所提出的 GPRC5D-TCB 與本技術領域中已知的分子進行比較。藉由檢測 CD69+ CD8+ T 細胞 (圖 21A) 和 CD69+ CD4+ T 細胞 (圖 21B) 在所有 CD8+ 各自的 CD4+ T 細胞中的百分比來確定活化。 圖 22A 至圖 22B. 健康供體的人全血中細胞因子的釋放 (圖 22A 中 TNFa 讀數；圖 22B 中 IL6 讀數)。比較如在本文中所述的 GPRC5D-TCB 和陽性 (Gazyva, Lemtrada) 和陰性 (Erbitux) 參考分子。 圖 23A 至圖 23G. 不同 GPRC5DxCD3 雙特異性 TCB 分子在 NCI-H929 (hNSG 小鼠) 中的體內療效，包括每個治療組在治療過程中的平均腫瘤體積 (圖 23A)、第 37 天的腫瘤體積 (圖 23B)、以及腫瘤生長，針對分子，每一行代表單一小鼠 (載劑：圖 23C；6623：圖.23D；6624：圖 23E、6625：圖.23F；6626：圖 23G)。 圖 24. hFcRn Tg 和 KO 小鼠體內 SDPK 和所指示的 TCB 分子的廓清數據。 圖 25A 至圖 25I. 雙特異性抗原結合分子 5E11(6625)-TCB 與表現人 GPRC5D 的多發性骨髓瘤細胞株 OPM-2 (圖 25A、圖 25D、圖 25G)、NCI-H929 (圖 25B、圖 25E、圖 25H) 和 RPMI-8226 (圖 25C、圖 25F、圖 25I) 的結合分析代表例。每個細胞株的 GPRC5D 抗體結合位點 (ABS) 的數量在括號中給出，並先前藉由 QSC 確定 (Quantum Simply Cellular，BangsLabs)。所描繪的為相對中位數的螢光值 (MFI)，來自三重複實驗結果加上 SD。藉由 GraphPadPrism 計算出結合的 EC50 值，並匯總於表 14.2 中。
<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司(F.Hoffmann-La Roche AG)
<120> 與GPRC5D結合之抗體
<140> TW 109125498
<141> 2020-07-29
<150> EP 19189255.3
<151> 2019-07-31
<160> 133
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 12
Figure 109125498-A0305-15-0004-12
<210> 13
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 13
Figure 109125498-A0305-15-0004-13
Figure 109125498-A0305-15-0005-15
<210> 14
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 14
Figure 109125498-A0305-15-0005-16
Figure 109125498-A0305-15-0006-17
<210> 15
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 15
Figure 109125498-A0305-15-0006-18
Figure 109125498-A0305-15-0007-19
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 16
Figure 109125498-A0305-15-0007-20
<210> 17
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 17
Figure 109125498-A0305-15-0008-21
Figure 109125498-A0305-15-0009-22
<210> 18
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 18
Figure 109125498-A0305-15-0009-23
Figure 109125498-A0305-15-0010-24
<210> 19
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 19
Figure 109125498-A0305-15-0010-25
Figure 109125498-A0305-15-0011-26
Figure 109125498-A0305-15-0012-27
Figure 109125498-A0305-15-0013-28
<210> 20
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 20
Figure 109125498-A0305-15-0013-29
Figure 109125498-A0305-15-0014-30
Figure 109125498-A0305-15-0015-31
Figure 109125498-A0305-15-0016-32
<210> 21
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 21
Figure 109125498-A0305-15-0016-33
Figure 109125498-A0305-15-0017-34
<210> 22
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 22
Figure 109125498-A0305-15-0018-35
Figure 109125498-A0305-15-0019-36
<210> 23
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 23
Figure 109125498-A0305-15-0019-37
Figure 109125498-A0305-15-0020-38
Figure 109125498-A0305-15-0021-39
<210> 24
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 24
Figure 109125498-A0305-15-0021-40
Figure 109125498-A0305-15-0022-41
Figure 109125498-A0305-15-0023-42
Figure 109125498-A0305-15-0024-43
Figure 109125498-A0305-15-0025-44
<210> 25
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 25
Figure 109125498-A0305-15-0025-45
Figure 109125498-A0305-15-0026-46
<210> 26
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 26
Figure 109125498-A0305-15-0026-47
Figure 109125498-A0305-15-0027-48
Figure 109125498-A0305-15-0028-49
<210> 27
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 27
Figure 109125498-A0305-15-0028-50
Figure 109125498-A0305-15-0029-51
Figure 109125498-A0305-15-0030-52
<210> 28
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 28
Figure 109125498-A0305-15-0030-53
Figure 109125498-A0305-15-0031-54
Figure 109125498-A0305-15-0032-55
Figure 109125498-A0305-15-0033-56
Figure 109125498-A0305-15-0034-57
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 29
Figure 109125498-A0305-15-0034-60
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 30
Figure 109125498-A0305-15-0034-58
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 31
Figure 109125498-A0305-15-0034-59
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 32
Figure 109125498-A0305-15-0035-61
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 33
Figure 109125498-A0305-15-0035-62
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 34
Figure 109125498-A0305-15-0035-63
<210> 35
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 35
Figure 109125498-A0305-15-0036-64
<210> 36
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 36
Figure 109125498-A0305-15-0036-65
Figure 109125498-A0305-15-0037-66
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 37
Figure 109125498-A0305-15-0037-67
Figure 109125498-A0305-15-0038-68
<210> 38
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 38
Figure 109125498-A0305-15-0038-69
<210> 39
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 39
Figure 109125498-A0305-15-0039-70
Figure 109125498-A0305-15-0040-71
<210> 40
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Figure 109125498-A0305-15-0040-72
Figure 109125498-A0305-15-0041-73
<210> 41
<211> 198
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 41
Figure 109125498-A0305-15-0042-74
Figure 109125498-A0305-15-0043-75
<210> 42
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 42
Figure 109125498-A0305-15-0043-76
Figure 109125498-A0305-15-0044-77
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 43
Figure 109125498-A0305-15-0044-78
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 44
Figure 109125498-A0305-15-0045-79
<210> 45
<211> 345
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Figure 109125498-A0305-15-0045-80
Figure 109125498-A0305-15-0046-81
<210> 46
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 46
Figure 109125498-A0305-15-0047-82
<210> 47
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 47
Figure 109125498-A0305-15-0048-83
<210> 48
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 48
Figure 109125498-A0305-15-0048-84
Figure 109125498-A0305-15-0049-85
<210> 49
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 49
Figure 109125498-A0305-15-0049-86
Figure 109125498-A0305-15-0050-87
<210> 50
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 50
Figure 109125498-A0305-15-0050-88
Figure 109125498-A0305-15-0051-89
<210> 51
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 51
Figure 109125498-A0305-15-0051-90
<210> 52
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 52
Figure 109125498-A0305-15-0052-91
<210> 53
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 53
Figure 109125498-A0305-15-0052-92
Figure 109125498-A0305-15-0053-93
<210> 54
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 54
Figure 109125498-A0305-15-0053-94
Figure 109125498-A0305-15-0054-95
<210> 55
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 55
Figure 109125498-A0305-15-0054-96
<210> 56
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 56
Figure 109125498-A0305-15-0055-97
<210> 57
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 57
Figure 109125498-A0305-15-0056-98
<210> 58
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 58
Figure 109125498-A0305-15-0056-99
Figure 109125498-A0305-15-0057-100
<210> 59
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 59
Figure 109125498-A0305-15-0057-101
Figure 109125498-A0305-15-0058-102
<210> 60
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 60
Figure 109125498-A0305-15-0058-103
Figure 109125498-A0305-15-0059-104
<210> 61
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 61
Figure 109125498-A0305-15-0059-105
<210> 62
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 62
Figure 109125498-A0305-15-0060-106
<210> 63
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 63
Figure 109125498-A0305-15-0060-107
Figure 109125498-A0305-15-0061-108
<210> 64
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 64
Figure 109125498-A0305-15-0061-109
Figure 109125498-A0305-15-0062-111
<210> 65
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 65
Figure 109125498-A0305-15-0062-112
<210> 66
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 66
Figure 109125498-A0305-15-0063-113
<210> 67
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 67
Figure 109125498-A0305-15-0064-114
Figure 109125498-A0305-15-0065-115
<210> 68
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 68
Figure 109125498-A0305-15-0065-116
Figure 109125498-A0305-15-0066-117
<210> 69
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 69
Figure 109125498-A0305-15-0066-118
Figure 109125498-A0305-15-0067-119
Figure 109125498-A0305-15-0068-120
<210> 70
<211> 677
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 70
Figure 109125498-A0305-15-0069-121
Figure 109125498-A0305-15-0070-122
Figure 109125498-A0305-15-0071-123
Figure 109125498-A0305-15-0072-124
<210> 71
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 71
Figure 109125498-A0305-15-0072-126
Figure 109125498-A0305-15-0073-127
<210> 72
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 72
Figure 109125498-A0305-15-0074-128
Figure 109125498-A0305-15-0075-129
Figure 109125498-A0305-15-0076-130
<210> 73
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 73
Figure 109125498-A0305-15-0076-131
Figure 109125498-A0305-15-0077-132
Figure 109125498-A0305-15-0078-133
<210> 74
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 74
Figure 109125498-A0305-15-0079-134
Figure 109125498-A0305-15-0080-135
<210> 75
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 75
Figure 109125498-A0305-15-0080-136
Figure 109125498-A0305-15-0081-137
Figure 109125498-A0305-15-0082-138
<210> 76
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 76
Figure 109125498-A0305-15-0083-139
Figure 109125498-A0305-15-0084-140
<210> 77
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 77
Figure 109125498-A0305-15-0084-141
Figure 109125498-A0305-15-0085-142
Figure 109125498-A0305-15-0086-143
<210> 78
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 78
Figure 109125498-A0305-15-0086-144
Figure 109125498-A0305-15-0087-145
<210> 79
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 79
Figure 109125498-A0305-15-0088-146
Figure 109125498-A0305-15-0089-147
Figure 109125498-A0305-15-0090-148
Figure 109125498-A0305-15-0091-149
<210> 80
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 80
Figure 109125498-A0305-15-0091-150
Figure 109125498-A0305-15-0092-151
<210> 81
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 81
Figure 109125498-A0305-15-0093-152
<210> 82
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 82
Figure 109125498-A0305-15-0093-153
Figure 109125498-A0305-15-0094-154
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 83
Figure 109125498-A0305-15-0094-155
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 84
Figure 109125498-A0305-15-0094-156
Figure 109125498-A0305-15-0095-157
<210> 85
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 85
Figure 109125498-A0305-15-0095-158
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 86
Figure 109125498-A0305-15-0095-160
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 87
Figure 109125498-A0305-15-0095-159
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 88
Figure 109125498-A0305-15-0096-161
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 89
Figure 109125498-A0305-15-0096-162
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 90
Figure 109125498-A0305-15-0096-163
<210> 91
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 91
Figure 109125498-A0305-15-0097-164
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 92
Figure 109125498-A0305-15-0097-165
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 93
Figure 109125498-A0305-15-0097-166
<210> 94
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 94
Figure 109125498-A0305-15-0098-167
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 95
Figure 109125498-A0305-15-0098-168
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 96
Figure 109125498-A0305-15-0098-169
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 97
Figure 109125498-A0305-15-0098-170
<210> 98
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 98
Figure 109125498-A0305-15-0099-171
<210> 99
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 99
Figure 109125498-A0305-15-0099-172
<210> 100
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 100
Figure 109125498-A0305-15-0099-173
<210> 101
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 101
Figure 109125498-A0305-15-0100-177
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 102
Figure 109125498-A0305-15-0100-176
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 103
Figure 109125498-A0305-15-0100-175
<210> 104
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 104
Figure 109125498-A0305-15-0100-174
Figure 109125498-A0305-15-0101-178
<210> 105
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 105
Figure 109125498-A0305-15-0101-179
Figure 109125498-A0305-15-0102-180
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 106
Figure 109125498-A0305-15-0102-181
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 107
Figure 109125498-A0305-15-0102-182
<210> 108
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 108
Figure 109125498-A0305-15-0103-183
<210> 109
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 109
Figure 109125498-A0305-15-0103-184
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 110
Figure 109125498-A0305-15-0103-185
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 111
Figure 109125498-A0305-15-0104-186
<210> 112
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 112
Figure 109125498-A0305-15-0104-187
<210> 113
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 113
Figure 109125498-A0305-15-0105-188
<210> 114
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 114
Figure 109125498-A0305-15-0105-189
Figure 109125498-A0305-15-0106-190
<210> 115
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 115
Figure 109125498-A0305-15-0107-191
Figure 109125498-A0305-15-0108-192
<210> 116
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 116
Figure 109125498-A0305-15-0108-193
Figure 109125498-A0305-15-0109-194
Figure 109125498-A0305-15-0110-195
<210> 117
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 117
Figure 109125498-A0305-15-0111-196
Figure 109125498-A0305-15-0112-197
Figure 109125498-A0305-15-0113-198
Figure 109125498-A0305-15-0114-199
<210> 118
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 118
Figure 109125498-A0305-15-0114-200
Figure 109125498-A0305-15-0115-201
<210> 119
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 119
Figure 109125498-A0305-15-0115-202
Figure 109125498-A0305-15-0116-203
Figure 109125498-A0305-15-0117-204
<210> 120
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 120
Figure 109125498-A0305-15-0117-205
Figure 109125498-A0305-15-0118-206
Figure 109125498-A0305-15-0119-207
<210> 121
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 121
Figure 109125498-A0305-15-0119-208
Figure 109125498-A0305-15-0120-209
Figure 109125498-A0305-15-0121-210
Figure 109125498-A0305-15-0122-211
Figure 109125498-A0305-15-0123-212
<210> 122
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 122
Figure 109125498-A0305-15-0123-213
Figure 109125498-A0305-15-0124-214
<210> 123
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 123
Figure 109125498-A0305-15-0124-215
Figure 109125498-A0305-15-0125-216
<210> 124
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 124
Figure 109125498-A0305-15-0126-217
Figure 109125498-A0305-15-0127-218
Figure 109125498-A0305-15-0128-219
<210> 125
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 125
Figure 109125498-A0305-15-0128-220
Figure 109125498-A0305-15-0129-221
Figure 109125498-A0305-15-0130-222
Figure 109125498-A0305-15-0131-223
<210> 126
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 126
Figure 109125498-A0305-15-0132-224
Figure 109125498-A0305-15-0133-225
<210> 127
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 127
Figure 109125498-A0305-15-0133-226
Figure 109125498-A0305-15-0134-227
<210> 128
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 128
Figure 109125498-A0305-15-0134-228
Figure 109125498-A0305-15-0135-229
Figure 109125498-A0305-15-0136-230
<210> 129
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 129
Figure 109125498-A0305-15-0137-231
Figure 109125498-A0305-15-0138-232
Figure 109125498-A0305-15-0139-233
Figure 109125498-A0305-15-0140-234
<210> 130
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 130
Figure 109125498-A0305-15-0140-235
Figure 109125498-A0305-15-0141-236
<210> 131
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 131
Figure 109125498-A0305-15-0142-237
Figure 109125498-A0305-15-0143-238
<210> 132
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 132
Figure 109125498-A0305-15-0143-239
Figure 109125498-A0305-15-0144-240
Figure 109125498-A0305-15-0145-241
<210> 133
<211> 669
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 133
Figure 109125498-A0305-15-0145-242
Figure 109125498-A0305-15-0146-243
Figure 109125498-A0305-15-0147-244
Figure 109125498-A0305-15-0148-245
Figure 109125498-A0305-15-0149-246

Claims (32)

  1. 一種雙特異性抗原結合分子，其包含：與第一抗原結合之第一抗原結合部分，其中，該第一抗原為GPRC5D，且該第一抗原結合部分包含：重鏈變異區(VH)，其包含SEQ ID NO：83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：85之HCDR 2和SEQ ID NO：86之HCDR 3；及輕鏈變異區(VL)，其包含SEQ ID NO：87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：88之LCDR 2和SEQ ID NO：89之LCDR 3；以及與第二抗原結合之第二抗原結合部分，其中，該第二抗原為CD3，且該第二抗原結合部分包含：重鏈變異區(VH)，其包含SEQ ID NO：98之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：99之HCDR 2和SEQ ID NO：100之HCDR 3；及輕鏈變異區(VL)，其包含SEQ ID NO：101之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：102之LCDR 2和SEQ ID NO：103之LCDR 3。
  2. 如請求項1之雙特異性抗原結合分子，其中，該第一抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO：48之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，且其中，該第一抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO：53之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中，該第二抗原結合部分之該VH包含胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：104之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同，並且該第二抗原結合部 分之該VL包含的胺基酸序列與SEQ ID NO：105之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
  4. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中，該第一抗原結合部分和/或該第二抗原結合部分為Fab分子。
  5. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中，該第二抗原結合部分為Fab分子，其中，該Fab輕鏈和該Fab重鏈之變異域VL和VH或恆定域CL和CH1為彼此取代。
  6. 如請求項5之雙特異性抗原結合分子，其中，該變異域VL和VH為彼此取代。
  7. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中，該第一抗原結合部分為Fab分子，其中，在恆定域CL中，根據Kabat編號，位置124的胺基酸被離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)獨立取代，且根據Kabat編號，位置123的胺基酸被離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)()獨立取代，並且在恆定域CH1中，根據Kabat EU索引編號，位置147的胺基酸被麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)獨立取代，且根據Kabat EU索引編號，位置213的胺基酸被麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)獨立取代。
  8. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中，該第一抗原結合部分和該第二抗原結合部分為彼此融合。
  9. 如請求項8之雙特異性抗原結合分子，其中，該第一抗原結合部分和該第二抗原結合部分為經由胜肽連接子彼此融合。
  10. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中，該第一抗原結合部分和該第二抗原結合部分各自為Fab分子，且其中，(i)該第二抗原結合部分在該Fab重鏈的C端與該第一抗原結合部分的該Fab重鏈的N端融合，或(ii) 該第一抗原結合部分在該Fab重鏈的C端與該第二抗原結合部分的該Fab重鏈的N端融合。
  11. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其包含第三抗原結合部分。
  12. 如請求項11之雙特異性抗原結合分子，其中，該第三抗原結合部分與該第一抗原結合部分相同。
  13. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其包含由第一次單元和第二次單元所構成之Fc域。
  14. 如請求項13之雙特異性抗原結合分子，其中，該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分各自為Fab分子；且其中，(i)該第二抗原結合部分在該Fab重鏈的C端與該第一抗原結合部分的該Fab重鏈的N端融合，且該第一抗原結合部分在該Fab重鏈的C端與該Fc域的該第一次單元的N端融合，抑或是(ii)該第一抗原結合部分在該Fab重鏈的C端與該第二抗原結合部分的該Fab重鏈的N端融合，且該第二抗原結合部分在該Fab重鏈的C端與該Fc域的該第一次單元的N端融合。
  15. 如請求項14之雙特異性抗原結合分子，其進一步包含第三抗原結合部分，該第三抗原結合部分為Fab分子；且其中，該第三抗原結合部分在該Fab重鏈的C端與該Fc域的該第二次單元的N端融合。
  16. 如請求項13之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為IgG Fc域。
  17. 如請求項16之雙特異性抗原結合分子，其中，該Fc域為IgG1 Fc域。
  18. 如請求項13之雙特異性抗原結合分子，其中，該Fc域為人Fc域。
  19. 如請求項13之雙特異性抗原結合分子，其中，該Fc域的第一次單元的CH3域中的胺基酸殘基被具有較大側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在該第一次單元的該CH3域內產生突起，該突起可定位在該第二次單元的CH3域內的空腔中，並且該Fc域的第二次單元的CH3域中的胺基酸殘基被具有較小側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在該第二次單元的CH3域內產生空腔，該第一次單元的CH3域內的突起可定位在該空腔內。
  20. 如請求項13之雙特異性抗原結合分子，其中，該Fc域包含降低與Fc受體的結合和/或效應功能的一或多個胺基酸取代。
  21. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其包含：包含與SEQ ID NO：122之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列之多肽、包含與SEQ ID NO：123之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列之多肽、包含與SEQ ID NO：124之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列之多肽、及包含與SEQ ID NO：125之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列之多肽。
  22. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其包含：包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列之多肽、包含SEQ ID NO：123的胺基酸序列之多肽、包含SEQ ID NO：124的胺基酸序列之多肽及包含SEQ ID NO：125的胺基酸序列之多肽。
  23. 一種經單離之多核苷酸，其編碼如請求項1至22中任一項之雙特異性抗原結合分子。
  24. 一種載體，其包含如請求項23之多核苷酸。
  25. 如請求項24之載體，其為表現載體。
  26. 一種宿主細胞，其包含如請求項23之多核苷酸或如請求項24或25之載體。
  27. 一種用於生產與GPRC5D結合之雙特異性抗原結合分子之方法，其包含在適合表現該雙特異性抗原結合分子之條件下培養如請求項26之宿主細胞之步驟。
  28. 如請求項27之方法，其進一步包含回收該雙特異性抗原結合分子之步驟。
  29. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至22中任一項之雙特異性抗原結合分子以及醫藥上可接受之載劑。
  30. 一種如請求項1至22中任一項之雙特異性抗原結合分子或如請求項29之醫藥組合物之用途，其係用於製造治療與GPRC5D相關的疾病之藥物。
  31. 如請求項30之用途，其中，該疾病為癌症。
  32. 如請求項30之用途，其中，該疾病為多發性骨髓瘤。
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