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TWI868168B - 雙叉桿菌屬細菌之增殖促進方法 - Google Patents

雙叉桿菌屬細菌之增殖促進方法 Download PDF

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TWI868168B
TWI868168B TW109121553A TW109121553A TWI868168B TW I868168 B TWI868168 B TW I868168B TW 109121553 A TW109121553 A TW 109121553A TW 109121553 A TW109121553 A TW 109121553A TW I868168 B TWI868168 B TW I868168B
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加藤康介
栃谷薫
奥村剛一
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日商養樂多本社股份有限公司
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Abstract

本發明提供一種雙叉桿菌屬細菌之增殖促進方法。本發明之雙叉桿菌屬細菌之增殖促進方法之特徵在於：對含有選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之乳培養基進行加熱處理後，以上述乳培養基培養雙叉桿菌屬細菌。

Description

雙叉桿菌屬細菌之增殖促進方法
本發明係關於一種雙叉桿菌屬細菌之增殖促進方法。
半胱胺酸係非必需胺基酸之1種，天然地以L-半胱胺酸之形式構成蛋白質，且於人體內由甲硫胺酸生物合成。L-半胱胺酸具有抗氧化作用、黑色素之產生抑制作用、因醇之代謝產生之乙醛之解毒作用等，其美白效果或宿醉緩解效果受到關注，而用於食品、化妝品、醫藥品等領域。 胱胺酸係半胱胺酸2個分子被氧化並經由雙硫鍵連結而成之胺基酸之1種。胱胺酸難溶於水，容易被還原而成為半胱胺酸。天然地以L-胱胺酸之形式構成蛋白質，尤其是大量地含於毛髮、指甲等角蛋白中。
先前已知向用以使雙叉桿菌屬細菌增殖之培養基中添加半胱胺酸或胱胺酸(非專利文獻1)。其等係雙叉桿菌屬細菌之增殖所必需之胺基酸，由於半胱胺酸會降低氧化還原電位，故認為其係適於對氧或過氧化氫具有敏感性之雙叉桿菌屬細菌之增殖之成分。又，報告有向乳中添加半胱胺酸以使氧化還原電位降低，而提高保存時之雙叉乳酸桿菌之生殘性(非專利文獻2)。然而，向雙叉桿菌屬細菌增殖培養基添加半胱胺酸或胱胺酸之目的僅僅在於補充胺基酸以及降低氧化還原電位。 [先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Rajiv I. Dave & Nagendra P. Shah, International Dairy Journal, Volume 7, Issues 8-9, 1997, pp. 537 - 545. [非專利文獻2] Marie-Pierre Bolduc, et al., International Dairy Journal, Volume 16, Issue 9, 2006, pp. 1038 - 1048.
[發明所欲解決之問題]
本發明之課題在於提供一種可簡便且高效率地促進雙叉桿菌屬細菌之增殖之方法。 [解決問題之技術手段]
本發明人等鑒於上述課題進行了各種研究，結果發現，將雙叉桿菌屬細菌以乳培養基培養時，若使乳培養基含有半胱胺酸、胱胺酸或其等之鹽並進行加熱處理後，利用上述乳培養基來培養雙叉桿菌屬細菌，則與使用將乳培養基、與半胱胺酸、胱胺酸或其等之鹽個別地進行加熱處理後混合所得之乳培養基進行培養之情形相比，上述細菌之增殖得到促進。認為其原因在於，藉由乳培養基與半胱胺酸、胱胺酸或其等之鹽之同時加熱處理，乳培養基成分與半胱胺酸、胱胺酸或其等之鹽反應所生成之物質會作為雙叉桿菌屬細菌之增殖促進劑發揮作用。因此，本發明人等為了探索上述增殖促進劑而進行了各種研究，結果發現，自含有半胱胺酸、胱胺酸或其等之鹽之乳培養基之加熱處理物分取分子量未達3000之成分，以pH值8.0以上使上述成分保持於陰離子交換樹脂，進而於特定濃度之陰離子存在下使之自上述陰離子交換樹脂溶離而獲得乳培養基成分，該乳培養基成分表現雙叉桿菌屬細菌之增殖促進效果。本發明人等鑒於該等見解，完成了本發明。
即，本發明提供以下之[1]～[13]。 [1]一種雙叉桿菌屬細菌之增殖促進方法，其特徵在於：對含有選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之乳培養基進行加熱處理後，以上述乳培養基培養雙叉桿菌屬細菌。 [2]如[1]之方法，其中上述加熱處理係以60～125℃處理10～40分鐘。 [3]如[1]或[2]之方法，其中上述乳培養基含有選自由L-半胱胺酸、L-胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上。 [4]如[1]至[3]中任一項之方法，其中上述乳培養基含有L-半胱胺酸鹽酸鹽。 [5]一種醱酵乳之製造方法，其特徵在於：對含有選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之乳培養基進行加熱處理後，以上述乳培養基培養雙叉桿菌屬細菌。 [6]一種醱酵乳，其係藉由如[5]之方法所獲得。 [7]一種雙叉桿菌屬細菌之增殖促進劑，其以含有選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之乳培養基之加熱處理物作為有效成分。 [8]如[7]之增殖促進劑，其中上述加熱處理係以60～125℃處理10～40分鐘。 [9]如[7]或[8]之增殖促進劑，其中上述乳培養基含有選自由L-半胱胺酸、L-胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上。 [10]如[7]至[9]中任一項之增殖促進劑，其中上述乳培養基含有L-半胱胺酸鹽酸鹽。 [11]如[7]至[10]中任一項之增殖促進劑，其中上述加熱處理物係經加熱處理之乳培養基之分子量未達3000之成分，且係以pH值8.0以上保持於陰離子交換樹脂，於1～400 mM之陰離子存在下自上述陰離子交換樹脂溶離者。 [12]一種乳培養基成分，其係含有選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上且經加熱處理之乳培養基之分子量未達3000之成分，且係以pH值8.0以上保持於陰離子交換樹脂，於1～400 mM之陰離子存在下自上述陰離子交換樹脂溶離者。 [13]一種乳培養基成分之製造方法，其特徵在於：對含有選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之乳培養基進行加熱處理，分取所得之乳培養基加熱處理物之分子量未達3000之成分，以pH值8.0以上使所獲得之成分保持於陰離子樹脂，進而於1～400 mM之陰離子存在下使之自上述陰離子樹脂溶離。 [發明之效果]
根據本發明，藉由對含有選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之乳培養基進行加熱處理後，以上述乳培養基培養雙叉桿菌屬細菌，可簡便且高效率地促進雙叉桿菌屬細菌之增殖，能夠縮短培養時間。該雙叉桿菌屬細菌之增殖促進方法作為醱酵乳之製造方法亦有用。又，於特定條件下自含有選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之乳培養基之加熱處理物單離出之成分係作為雙叉桿菌屬細菌之增殖促進劑較為有用。
本發明之雙叉桿菌屬細菌之增殖促進方法之特徵在於：對含有選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之乳培養基進行加熱處理後，以上述乳培養基培養雙叉桿菌屬細菌。
本發明中所使用之雙叉桿菌屬細菌之種類並無特別限定，例如可列舉：短型雙叉桿菌(Bifidobacterium breve)、龍根雙叉桿菌(Bifidobacterium longum)、雙岐雙叉桿菌(Bifidobacterium bifidum)、動物雙叉桿菌(Bifidobacterium animalis)、豬雙叉桿菌(Bifidobacterium suis)、嬰兒雙叉桿菌(Bifidobacterium infantis)、青春雙叉桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、鏈狀雙叉桿菌(Bifidobacterium catenulatum)、假鏈狀雙叉桿菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、乳雙叉桿菌(Bifidobacterium lactis)、球雙叉桿菌(Bifidobacterium globosum)等。其中，短型雙叉桿菌、龍根雙叉桿菌、雙岐雙叉桿菌由於以前多用於乳製品並積累了安全性等資料，故而較佳，更佳為短型雙叉桿菌、雙岐雙叉桿菌，具體而言，尤佳為短型雙叉桿菌YIT 12272(FERM BP-11320)及雙岐雙叉桿菌YIT 10347(FERM BP-10613)。
本發明中所使用之用於使雙叉桿菌屬細菌增殖之培養基為乳培養基。此處，乳培養基只要為以乳作為主成分之培養基則並無特別限定。作為乳，可列舉：乳(全脂乳)、作為其加工品之脫脂乳、去除了酪蛋白之乳清、源自乳清之成分、源自乳之肽等。作為源自乳清之成分，較佳為乳清所含之水溶性蛋白(乳清蛋白)，具體而言，例示β-乳球蛋白、α-乳白蛋白等。作為乳培養基，較佳為脫脂乳培養基及乳清培養基。根據使用之乳原料及其調配量，可任意設定無脂乳固形物成分或脂肪成分。於乳培養基中亦可添加酵母萃取液等雙叉桿菌屬細菌之生長因子。
作為本發明中所使用之半胱胺酸或胱胺酸，可為源自天然者，亦可為藉由化學合成法、醱酵法或基因重組法所產生者。作為半胱胺酸或胱胺酸，可使用L體、D體、DL體之任一者，較佳為L體。作為半胱胺酸或胱胺酸之鹽，只要為藥理學上所容許之鹽即可，例如可列舉：與鹼金屬(鈉、鉀等)之鹽、與鹼土金屬(鈣、鎂等)之鹽、銨鹽、與無機酸(鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)之鹽、及與有機酸(乙酸、丙酸、酒石酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸等)之鹽。其等之中，就安全性及操作容易性之觀點而言，較佳為作為食品添加物之L-半胱胺酸鹽酸鹽及L-胱胺酸，更佳為L-半胱胺酸鹽酸鹽。半胱胺酸、胱胺酸或其等之鹽可分別單獨使用，亦可組合2種以上使用。
作為選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上(以下，稱為半胱胺酸等)於乳培養基中之含量，並無特別限定，就增殖促進效果之觀點而言，以最終濃度計，較佳為0.001～0.1(w/v)%，更佳為0.001～0.05(w/v)%，進而較佳為0.005～0.05(w/v)%。半胱胺酸等係於加熱處理前添加至乳培養基中。添加方式並無特別限定，可以成為上述最終濃度之方式將半胱胺酸等直接添加至乳培養基中，亦可將半胱胺酸等溶液(例如水溶液)添加至乳培養基中。
於本發明之雙叉桿菌屬細菌之增殖促進方法，對含有半胱胺酸等之乳培養基進行加熱處理。加熱處理之機構並無特別限定，例示高壓釜等。加熱溫度較佳為60～125℃，更佳為64～121℃，進而較佳為100～121℃，進而較佳為115～121℃。加熱時間較佳為10～40分鐘，更佳為15～30分鐘，進而較佳為20～30分鐘。或者，亦可以滿足相當於上述加熱處理條件之熱歷程(施加熱量之總和)或加熱殺菌強度之方式來進行加熱處理。關於經加熱處理之乳培養基之溫度，只要靜置或者使用冷卻裝置等而降低至培養溫度以下直到培養時為止即可。
其次，將雙叉桿菌屬細菌接種至經加熱處理之乳培養基中並進行培養。雙叉桿菌屬細菌之培養只要直接應用通常之培養條件即可。即，只要適當設定適於接種至培養基之雙叉桿菌屬細菌之接種量、溫度、時間、培養環境等各種條件來進行即可。例如，接種量只要設為0.01～5%、較佳為0.1～1%即可，培養溫度只要設為25～46℃、較佳為35～42℃即可，培養時間只要設為6～120小時、較佳為24～72小時即可。又，培養環境可為好氧條件，亦可為厭氧條件，較佳為於厭氧條件下進行，關於培養方法，可選擇靜置、攪拌、振盪等中之任一者，並無特別限制。
藉由本發明之雙叉桿菌屬細菌之增殖促進方法，可利用乳培養基於短時間內使雙叉桿菌屬細菌高效率地增殖，因此上述方法亦作為含有雙叉桿菌屬細菌之醱酵乳之製造方法有用。
藉由本發明之方法所獲得之雙叉桿菌屬細菌之培養物即醱酵乳可添加糖漿(甜味料)等任意成分而製成最終製品。作為糖漿，可列舉：葡萄糖、蔗糖、果糖、果糖葡萄糖液糖、葡萄糖果糖液糖、巴拉金糖、海藻糖、乳糖、木糖、麥芽糖、蜂蜜、糖蜜等糖類；山梨醇、木糖醇、赤藻糖醇、乳糖醇、異麥芽糖醇、還原飴糖、還原麥芽糖飴糖等糖醇；阿斯巴甜、索馬甜、蔗糖素、乙醯磺胺酸K、甜菊等高甜度甜味料。又，於醱酵乳中亦可調配蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、山梨醇酐脂肪酸酯、卵磷脂等乳化劑；瓊脂、明膠、角叉菜膠、瓜爾膠、三仙膠、果膠、刺槐豆膠、結冷膠、羧甲基纖維素、大豆多糖類、褐藻酸丙二醇酯等增黏(穩定)劑。除此以外，亦能夠調配維生素A、維生素B類、維生素C、維生素D、維生素E類等維生素類；鈣、鎂、鋅、鐵、錳等礦物質類、檸檬酸、乳酸、乙酸、蘋果酸、酒石酸、葡萄糖酸等酸味料；奶油、黃油、酸乳油等乳脂肪；酸酪乳系、莓果系、橙系、榅桲系、紫蘇系、柑橘系、蘋果系、薄荷系、葡萄系、杏系、梨、卡士達奶油、桃、甜瓜、香蕉、熱帶系、草藥系、紅茶、咖啡系等香料類；草藥萃取物、黑糖萃取物等。 為了製造醱酵乳製品，只要依據慣例即可。例如，對醱酵乳進行均質化處理而獲得醱酵乳基質，其次，添加另行製備之糖漿溶液並加以混合，藉由均質機等進行均質化，進而添加香料，最後加工成最終製品即可。作為醱酵乳製品，包含飲料及食品，亦可製成不含糖漿(甜味料)之原味型、軟質型、果味型、固體狀、液狀等任一形態之製品。
如下述實施例所示，若將對含有半胱胺酸等之乳培養基進行加熱處理所得者用於培養，則可促進雙叉桿菌屬細菌之增殖。認為其原因在於：藉由乳培養基與半胱胺酸等之同時加熱處理，乳培養基成分與半胱胺酸等反應所生成之物質有助於雙叉桿菌屬細菌之增殖促進。因此，含有半胱胺酸等之乳培養基之加熱處理物可用作雙叉桿菌屬細菌之增殖促進劑。作為加熱處理條件，可列舉上述條件。再者，由於半胱胺酸等為胺基酸，故假定蛋白或肽作為與半胱胺酸等反應之乳培養基成分。
如下述實施例所示，含有半胱胺酸等之乳培養基之加熱處理物中之表現雙叉桿菌屬細菌之增殖促進效果的乳培養基成分更具體而言，為上述乳培養基之加熱處理物所含之分子量未達3000之成分，且係以pH值8.0以上保持於陰離子交換樹脂，於1～400 mM、較佳為50～200 mM之陰離子存在下自該陰離子交換樹脂溶離之乳培養基成分。 上述乳培養基成分可藉由如下方式進行製造：對含有半胱胺酸等之乳培養基進行加熱處理，分取所得之乳培養基之分子量未達3000之成分，以pH值8.0以上使所得之成分保持於陰離子交換樹脂，進而於1～400 mM、較佳為50～200 mM之陰離子存在下使之自該陰離子交換樹脂溶離。
此處，作為獲得加熱處理物時之乳培養基中之半胱胺酸等之含量，並無特別限定，就製造效率之觀點而言，以最終濃度計，較佳為0.001～1(w/v)%，更佳為0.001～0.5(w/v)%，進而較佳為0.001～0.1(w/v)%，進而較佳為0.001～0.05(w/v)%，尤佳為0.005～0.05(w/v)%。半胱胺酸等係於加熱處理前添加至乳培養基。添加方式並無特別限定，可以成為上述最終濃度之方式直接將半胱胺酸等添加至乳培養基，亦可將半胱胺酸等溶液(例如水溶液)添加至乳培養基。
作為加熱處理條件，可列舉上述條件。具體而言，加熱溫度較佳為60～125℃，更佳為64～121℃，進而較佳為100～121℃，進而較佳為115～121℃。加熱時間較佳為10～40分鐘，更佳為15～30分鐘，進而較佳為20～30分鐘。或者，亦可以滿足相當於上述加熱處理條件之熱歷程(施加熱量之總和)或加熱殺菌強度之方式進行加熱處理。
其次，自獲得之乳培養基之加熱處理物分取分子量未達3000之成分。此處，作為基於分子量之成分之分取方法，只要使用公知之方法即可，例如可列舉：超過濾、凝膠過濾層析法等。例如，於利用超過濾之情形時，只要使用區分分子量為3 kDa左右之超過濾過濾器來回收過濾液即可。所獲得之成分之分子量可藉由SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，十二烷基硫酸鈉)-聚丙烯醯胺凝膠電泳法進行確認。
其次，藉由鹽酸等將所獲得之分子量未達3000之成分調整至pH值8.0以上、較佳為pH值8.0，與陰離子交換樹脂進行接觸，而使所需之成分保持於陰離子交換樹脂。pH值之調整係用於使所需之成分帶負電而吸附於陰離子交換樹脂。
此處，陰離子交換樹脂之材質、結構等並無特別限制，可適當進行選擇。作為陰離子交換樹脂之樹脂母體，例如可列舉：苯乙烯系樹脂、丙烯酸系樹脂、瓊脂糖系樹脂等。作為陰離子交換樹脂之樹脂結構，例如可列舉：凝膠型、多孔型、高孔隙型。作為陰離子交換樹脂之官能基，例如可列舉：一級胺基、二級胺基、三級胺基、四級銨基等。作為陰離子交換樹脂，可為強鹼性陰離子交換樹脂，亦可為弱鹼性陰離子交換樹脂，就分離能力之觀點而言，較佳為強鹼性陰離子交換樹脂。 作為此種陰離子交換樹脂，亦可使用市售品，例如作為強鹼性陰離子交換樹脂，可列舉：Diaion(註冊商標)SA10A、SA12A、SA11A、NSA100、UBA120、PA306S、PA308、PA312、PA316、PA318L、HPA25、SA20A、SA21A、PA408、PA412、PA418(Mitsubishi Chemical股份有限公司製造)、Q Sepharose(註冊商標)High Performance、Q Sepharose Fast Flow(GE HEALTHCARE JAPAN股份有限公司製造)等，作為弱鹼性陰離子交換樹脂，可列舉：Diaion(註冊商標)WA10、WA20、WA21J、WA30(Mitsubishi Chemical股份有限公司製造)、DEAE Sepharose Fast Flow(GE HEALTHCARE JAPAN股份有限公司製造)等。再者，陰離子交換樹脂較佳為預先利用pH值8.0下具有緩衝功能之緩衝液(例如Tris(三羥甲基胺基甲烷)緩衝液)進行平衡化。
與陰離子交換樹脂之接觸方法可為批次式，亦可為管柱式，就效率之方面而言，較佳為管柱式。於管柱式之情形時，只要使含有上述中所得之乳培養基加熱處理物之分子量未達3000之成分之溶液通過填充有陰離子交換樹脂之管柱即可。其後，使充分量之於pH值8.0下具有緩衝功能之緩衝液(例如Tris緩衝液)通過，將未吸附於陰離子交換樹脂之物質沖洗即可。此處，管柱容量或流速並無特別限制，只要考慮樣品量或陰離子交換樹脂之保持性能等適當選擇即可，例如作為管柱容量，可列舉：1～20 mL、較佳為5～20 mL，作為流速，可列舉：0.1～20 mL/min、較佳為1～10 mL/min。上述條件只要視精製量適當變更即可。 作為此種填充有陰離子交換樹脂之管柱，亦可使用市售品，例如作為填充有強鹼性陰離子交換樹脂之管柱，可列舉：HiTrap(註冊商標)Q FF、HiPrep(註冊商標)Q FF(GE HEALTHCARE JAPAN股份有限公司製造)等，作為填充有弱鹼性陰離子交換樹脂之管柱，可列舉HiTrap DEAE FF(GE HEALTHCARE JAPAN股份有限公司製造)等。
保持於陰離子交換樹脂之成分於1～400 mM、較佳為50～200 mM之陰離子存在下自該陰離子交換樹脂溶離。此處，作為陰離子之種類，並無特別限定，例如可列舉Cl- 離子等。具體而言，只要使含有1～400 mM、較佳為50～200 mM之NaCl之pH值8.0之緩衝液(例如Tris緩衝液)通過陰離子交換樹脂，回收溶出液即可。於溶離之情形時，流速亦無特別限制，只要考慮陰離子交換樹脂之保持性能等來適當選擇即可，例如可列舉：0.1～20 mL/min、較佳為1～10 mL/min。上述條件只要視精製量適當變更即可。所獲得之溶出液可直接添加至培養基中來使用，亦可視目的，藉由公知之方法進行濃縮、稀釋等後來使用。如此溶離出之乳培養基成分如下述實施例所示可促進雙叉桿菌屬細菌之增殖。
以下，關於作為本發明之增殖促進劑之乳培養基成分之製造方法，舉例詳細地進行說明，但並不限定於此。 將以最終濃度計含有0.001～1(w/v)%之半胱胺酸等之乳清培養基於115℃下加熱30分鐘。使所獲得之乳清培養基之加熱處理物通過區分分子量為3 kDa之超過濾膜，回收分子量未達3000之成分作為濾液。藉由鹽酸將所回收之濾液之pH值調整為8.0。另一方面，使pH值8.0之20 mM Tris緩衝液通過陰離子交換管柱(例如HiTrap Q FF(GE HEALTHCARE JAPAN股份有限公司製造))以進行平衡化。使調整過pH值之濾液通過經平衡化之陰離子交換管柱，而使所需之成分保持於陰離子交換管柱。對於未吸附於陰離子交換管柱之物質，使充分量之20 mM Tris緩衝液通過陰離子交換管柱來進行沖洗。其次，藉由使含有50～200 mM之NaCl之pH值8.0之Tris緩衝液通過管柱而回收溶出液。再者，於在自陰離子交換管柱回收所需之乳培養基成分時使用液體層析裝置之情形時，例如只要於以下條件下回收溶出體積為22～28 mL之組分即可。 管柱：HiTrap Q FF 1 mL 開始緩衝液：20 mM Tris緩衝液(pH值8.0) 溶出緩衝液：包含1M NaCl之20 mM Tris緩衝液(pH值8.0) 溶出方式：溢流 20 CV，梯度(0→100%，20 CV)，2 mL/溶離份，洗滌(100%，5 CV) 添加方式：直接裝入試樣(Direct sample load)10 mL 流速：1 mL/min 管柱溫度：室溫 機器：AKTA探測器(GE HEALTHCARE) [實施例]
其次，列舉實施例進一步詳細地說明本發明，但本發明並不受該等實施例任何限定。
實施例1 由乳與胱胺酸或半胱胺酸之同時加熱帶來之增殖促進效果 (1)供試菌株 使用短型雙叉桿菌YIT 12272(以下稱為BbY)、雙岐雙叉桿菌YIT 10347(以下稱為BF-1)、乾酪乳桿菌YIT 9029(以下稱為YIT 9029)及嗜酸乳桿菌YIT 0198(以下稱為YIT 0198)。
(2)培養基製備 (i)脫脂乳培養基 使脫脂粉乳(ABC；雪印惠乳業股份有限公司製造)以成為12%(w/v)之方式溶解於RO(Reverse Osmosis，逆滲透)水中，一面對帶邊之中型試管內之氣相進行氮氣置換，一面以每次10 mL之方式進行分注，用丁基橡膠栓進行密封。其後，於115℃下在高壓釜裝置(SX-500；TOMY SEIKO股份有限公司製)內加熱殺菌30分鐘而製成脫脂乳培養基(無添加培養基)。又，於厭氧條件下，製備如下脫脂乳培養基：將L-胱胺酸(KYOWA HAKKO BIO股份有限公司製造)水懸浮液或L-半胱胺酸鹽酸鹽(日理化學股份有限公司製造)水溶液以最終濃度成為0.05(w/v)%之方式於加熱殺菌前進行添加，其後進行加熱殺菌而成之脫脂乳培養基(同時加熱培養基)；及將L-胱胺酸(KYOWA HAKKO BIO股份有限公司製造)水懸浮液或L-半胱胺酸鹽酸鹽(日理化學股份有限公司製造)水溶液以最終濃度成為0.05(w/v)%之方式於加熱殺菌後且即將植菌之前添加而成之脫脂乳培養基(個別加熱培養基)。再者，L-胱胺酸水懸浮液及L-半胱胺酸鹽酸鹽水溶液係分別製備成5%(w/v)水懸浮液及水溶液，並於各培養基中添加1%(v/v)。為了於樣品之間使由添加溶液導致之樣品之濃度變化及氧化還原電位之變化一致，於同時加熱培養基中在即將植菌之前添加1%(v/v)之殺菌水，於個別加熱培養基中在加熱前添加1%(v/v)之殺菌水，於無添加培養基中在加熱前及即將植菌之前添加1%(v/v)之殺菌水2次。
(3)植菌、培養條件 於接種菌時，一面對容器內之氣相進行氮氣置換一面進行接種，用丁基橡膠栓封入氮氣以供於培養。培養係於設定為37℃之恆溫水槽中進行12小時。
(4)各種參數測定方法 (i)pH值 培養基或菌液之pH值係使用桌上pH計(F52；堀場製作所股份有限公司製造)測得。 (ii)酸度 將pH值達到8.5所需之菌液每9.0 g之0.1 N氫氧化鈉水溶液之量作為酸度。測定係使用自動滴定裝置(平沼產業股份有限公司製造)。 (iii)生菌數 不論菌株為何，均利用0.85%(w/v)氯化鈉水溶液(生理食鹽水)來適當稀釋菌液。於雙叉桿菌屬細菌之情形時，利用螺旋加樣儀EDDY JET(IUL Instruments GmbH製造)將稀釋菌液播種至TOS(Trans-galacto-oligosaccharides，反式半乳寡糖)丙酸瓊脂培養基(Yakult Pharmaceutical Industry股份有限公司製造)中；於乳桿菌屬細菌之情形時，利用螺旋加樣儀EDDY JET(IUL Instruments GmbH製造)將稀釋菌液播種至添加有BCP(BROMOCRESOL PURPLE，溴甲酚紫)之平皿計數培養基(榮研化學股份有限公司製造)之平板培養基中，於37℃下培養48～72小時後，計數所產生之群落以作為生菌數。於乳桿菌屬細菌之情形時培養係於好氧條件下進行，於雙叉桿菌屬細菌之情形時培養係於厭氧條件(Anaeropack；Mitsubishi Gas Chemical股份有限公司製造)下進行。群落之計數係使用群落計數器ProtoCOL(Synoptics Ltd.製造)。
(5)結果 於圖1中表示將脫脂乳與L-胱胺酸或L-半胱胺酸鹽酸鹽(以下稱為L-半胱胺酸)同時加熱或個別加熱之情形時各菌株之增殖性。 於2種乳桿菌屬菌株(YIT 0198及YIT 9029)時，未確認到由添加L-胱胺酸或L-半胱胺酸帶來之增殖促進，亦未確認到由L-半胱胺酸之添加時機所導致之差。 另一方面，於作為雙叉桿菌屬細菌之BbY時，確認到藉由添加L-胱胺酸，經12小時培養酸度較無添加之情形增加2.2～2.6倍，生菌數較無添加之情形增加5.6倍。又，於將L-胱胺酸與乳同時加熱之情形時，若培養12小時，則生菌數與個別加熱時相同，但酸度較高為1.3 mL/9 g。如上所述，於培養時間足夠長之條件下，生菌數於足夠多之狀態(例如109 CFU/mL以上)下為相同程度，但於酸度較高之情形時可判定為增殖性較高。其原因在於增殖性較高者之生菌數會先達到頂點，其後增殖性較低者之生菌數會趕上。因此，藉由獨立於圖1之試驗以外之試驗，對以最終濃度0.03%(w/v)添加L-胱胺酸或L-半胱胺酸之情形時BbY之增殖曲線進行了研究，結果如圖2所示，可知同時加熱時之生菌數之增加速度較快，且酸度之上升亦隨之變高。 於同為雙叉桿菌屬細菌之BF-1時，亦確認到藉由添加L-胱胺酸，經12小時培養酸度較無添加之情形增加1.1～1.5倍，生菌數較無添加之情形增加1.7～7.7倍。於將L-胱胺酸與乳同時加熱之情形時，酸度較個別加熱時高1.3倍，生菌數亦較個別加熱時高4.5倍。 關於2種雙叉桿菌屬菌株，進行同樣之實驗3次，所有結果均顯示相同之傾向。因此，提示出將脫脂乳與L-胱胺酸或L-半胱胺酸同時加熱之情形時增殖促進效果對雙叉桿菌屬細菌具有特異性。 即便於添加對水為易溶性之L-半胱胺酸以代替L-胱胺酸之情形時，與L-胱胺酸同樣地，確認到藉由與乳同時加熱而促進增殖(圖1、2)，因此，提示出利用加熱來增加L-胱胺酸之溶解量並非增殖促進作用之主要原因。
再者，針對單獨對L-半胱胺酸進行加熱並以最終濃度0.03%(w/v)添加至乳中之情形(個別加熱)；及不對L-半胱胺酸進行加熱而藉由0.22 μm過濾器進行過濾器殺菌並以最終濃度0.03%(w/v)添加至乳中之情形(過濾器殺菌)，對BbY之培養性狀進行比較，結果如以下之表1所示並未確認到差異。因此，L-半胱胺酸之增殖促進效果會因加熱而衰減之可能性被否定。
[表1]
L-半胱胺酸 添加方法 培養時間9 h 培養時間12 h
pH值 酸度 (ml/9 g) 生菌數 (CFU/ml) pH值 酸度 (ml/9 g) 生菌數 (CFU/ml)
無添加 5.83 2.61 5.17×108 5.62 2.94 5.15×108
個別加熱 5.42 3.59 7.77×108 5.02 5.04 1.78×109
過濾器殺菌 5.40 3.62 8.92×108 4.94 5.12 1.64×109
同時加熱 5.17 4.47 1.34×109 4.64 8.05 3.46×109
實施例2 胱胺酸或半胱胺酸之添加濃度對細菌之培養性狀之影響 (1)供試菌株 使用BbY及BF-1。
(2)培養基製備 (i)脫脂乳培養基 與實施例1同樣地製備乳與L-胱胺酸或L-半胱胺酸之同時加熱培養基。L-胱胺酸或L-半胱胺酸之添加濃度以最終濃度計設為0.001、0.003、0.005、0.01、0.03、0.05、0.1%(w/v)。 (ii)加熱前分離乳清培養基 藉由5 N HCl將使脫脂粉乳以成為12%(w/v)之方式溶解於RO水中而成之12%(w/v)脫脂乳之pH值調整為4.6，以3,000×g離心分離5分鐘。其後，藉由5 N NaOH將上清液之pH值調整為6.5，以10,000×g離心分離15～30分鐘。一面對帶邊之中型試管內之氣相進行氮氣置換一面以每次10 mL之方式分注上清液，用丁基橡膠栓密封。其後，於115℃下在高壓釜裝置內加熱殺菌30分鐘而製成加熱前分離乳清培養基。又，於厭氧條件下，與脫脂乳培養基之情形同樣地，製備於加熱前添加L-胱胺酸或L-半胱胺酸，其後進行加熱殺菌而成之培養基(同時加熱培養基)。L-胱胺酸或L-半胱胺酸之添加濃度以最終濃度計設為0.001、0.003、0.005、0.01、0.03、0.05、0.1%(w/v)。
(3)植菌、培養條件 僅於在脫脂乳培養基中培養BbY之情形時將培養時間設為9小時，除此以外，與實施例1同樣地進行植菌、培養。
(4)各種參數測定方法 (i)pH值、(ii)酸度、(iii)生菌數係以與實施例1相同之方式所測得。
(5)結果 將改變了添加於脫脂乳培養基或加熱前分離乳清培養基之L-胱胺酸或L-半胱胺酸之最終濃度之情形時BbY及BF-1之酸度及生菌數示於圖3～6。圖3係表示於脫脂乳培養基中培養BbY之情形，圖4係表示於乳清培養基中培養BbY之情形，圖5係表示於脫脂乳培養基中培養BF-1之情形，圖6係表示於乳清培養基中培養BF-1之情形。再者，雖未示於圖3～6，但關於L-胱胺酸及L-半胱胺酸均未添加之情形時之生菌數及酸度，於在脫脂乳培養基中培養BbY之情形時為5.67×108 CFU/mL及2.48 mL/9 g，於在乳清培養基中培養BbY之情形時為7.42×107 CFU/mL及1.05 mL/9 g，於在脫脂乳培養基中培養BF-1之情形時為3.81×108 CFU/mL及2.53 mL/9 g，於在乳清培養基中培養BF-1之情形時為5.59×107 CFU/mL及1.21 mL/9 g。 乳清(whey)係自脫脂乳去除酪蛋白所得之成分，包含乳清蛋白或乳糖、礦物質等脫脂乳中之水溶性成分。乳清係藉由將脫脂乳之pH值調整為4.6而以上清液之形式分離，將pH值再調整為6.5而供於培養。 培養之結果為，關於BbY及BF-1兩者，藉由使用添加有L-胱胺酸或L-半胱胺酸之同時加熱培養基，生菌數及酸度較使用L-胱胺酸及L-半胱胺酸均未添加之培養基之情形有所增加。 關於BbY，脫脂乳培養基、乳清培養基均於L-胱胺酸濃度0.01%(w/v)下同時加熱培養基中之生菌數成為最大。又，同時加熱培養基中之生菌數成為最大之L-半胱胺酸濃度於乳培養基中為0.03%(w/v)，於乳清培養基中為0.01%(w/v)。 關於BF-1，於脫脂乳培養基、乳清培養基中L-胱胺酸濃度分別為0.1%(w/v)及0.03%(w/v)時同時加熱培養基中之生菌數成為最大。又，同時加熱培養基中之生菌數成為最大之L-半胱胺酸濃度於脫脂乳培養基中為0.05%(w/v)，於乳清培養基中為0.03%(w/v)。 關於上述生菌數成為最大之濃度，於n=3時比較個別加熱與同時加熱，結果如圖7(BbY)及8(BF-1)所示，不論菌株及添加物質為何，與個別加熱相比，藉由同時加熱，生菌數及酸度均得到增加。尤其是於在添加有L-胱胺酸或者L-半胱胺酸之脫脂乳培養基或乳清培養基中培養BbY之情形、於在添加有L-胱胺酸之脫脂乳培養基或添加有L-胱胺酸或者L-半胱胺酸之乳清培養基中培養BF-1之情形時，確認到與個別加熱相比，藉由同時加熱而生菌數明顯增加1.3～2.6倍。 根據以上之結果，提示出藉由加熱，乳與L-胱胺酸或L-半胱胺酸反應而產生某種增殖促進因子。
實施例3 由於加熱前後自脫脂乳分離出之乳清及半胱胺酸添加時機引起之增殖促進作用之變化 (1)供試菌株 使用BbY。
(2)培養基製備 (i)加熱前分離乳清培養基 與實施例2同樣地製備加熱前分離乳清與L-半胱胺酸之同時加熱培養基。又，亦製備於加熱殺菌後且即將植菌之前添加L-半胱胺酸而成之培養基(個別加熱培養基)。L-半胱胺酸之添加濃度以最終濃度計為0.03(w/v)%。 (ii)加熱後分離乳清培養基 於基於氮氣之厭氧條件下將使脫脂粉乳以成為12%(w/v)之方式溶解於RO水中而成之12%(w/v)脫脂乳於115℃下在高壓釜裝置內加熱殺菌30分鐘後，藉由5 N HCl調整為pH值4.6，以3,000×g離心分離5分鐘。其後，藉由5 N NaOH將上清液之pH值調整為6.5，以10,000×g離心分離15～30分鐘。一面對事先殺菌過之帶邊之中型試管內之氣相進行氮氣置換，一面以每次10 mL之方式分注上清液，用丁基橡膠栓密封，加熱後製成分離乳清培養基。又，於厭氧條件下，與實施例1之脫脂乳培養基之情形同樣地製備於加熱前添加L-半胱胺酸，其後進行加熱殺菌而成之培養基(同時加熱培養基)；及於加熱殺菌後且pH值調整為4.6前添加L-半胱胺酸而成之培養基(個別加熱培養基)。
(3)植菌、培養條件 與實施例1同樣地進行植菌、培養。
(4)各種參數測定方法 (i)pH值、(ii)酸度、(iii)生菌數係以與實施例1相同之方式所測得。 (iv)生菌數比 基於(iii)之生菌數，用同時加熱培養基中之生菌數除以個別加熱培養基中之生菌數而算出生菌數比。
(5)結果 將結果示於以下之表2。
[表2]
樣品 L-半胱胺酸 添加方法 培養時間9 h 培養時間12 h
pH值 酸度 (ml/9 g) 生菌數 (CFU/ml) 生菌數比 (同時/ 個別) pH值 酸度 (ml/9 g) 生菌數 (CFU/ml) 生菌數比 (同時/ 個別)
加熱前 分離 乳清 無添加 5.32 1.40 3.97×107 2.04 5.28 1.50 2.75×107 2.31
同時加熱 5.01 2.15 2.53×108 4.85 2.29 3.29×108
個別加熱 4.97 2.15 1.24×108 4.82 2.55 1.42×108
加熱後 分離 乳清 無添加 6.07 1.65 8.13×107 1.45 5.96 1.87 1.36×108 1.68
同時加熱 4.85 4.23 1.29×109 4.32 7.28 2.22×109
個別加熱 5.14 3.43 8.89×108 4.81 4.78 1.32×109
無論是於加熱前去除了酪蛋白之情形(加熱前分離乳清培養基)，還是於包含酪蛋白之狀態下加熱後去除了酪蛋白之情形(加熱後分離乳清培養基)，均確認到由添加L-半胱胺酸帶來之BbY之增殖促進。又，於所有情形時，同時加熱培養基中之生菌數均高於個別加熱培養基中之生菌數，但同時加熱培養基與個別加熱培養基中之生菌數比於加熱前分離乳清培養基時較高，因此認為相較於酪蛋白，乳清與增殖促進因子更密切相關。
實施例4 由乳與L-胱胺酸之同時加熱溫度引起之增殖促進作用之變化 (1)供試菌株 使用BbY。
(2)培養基製備 (i)脫脂乳培養基 除加熱溫度與L-胱胺酸之添加濃度以外，與實施例1同樣地製備脫脂乳培養基與L-胱胺酸之同時加熱培養基及個別加熱培養基。加熱係於115℃下進行30分鐘或於121℃下進行30分鐘。關於L-胱胺酸之添加濃度，將L-胱胺酸以用最終濃度計成為0.03%(w/v)之方式於加熱之前或之後進行添加。
(3)植菌、培養條件 與實施例1同樣地進行植菌、培養。
(4)各種參數測定方法 (i)pH值，(ii)酸度，(iii)生菌數係以與實施例1相同之方式測得。
(5)結果 將結果示於以下之表3。
[表3]
加熱條件 胱胺酸之添加時機 pH值 酸度 (mL/9 g) 生菌數 (CFU/mL)
115℃、30分鐘 無添加 5.90 2.44 3.62×108
   加熱殺菌後(個別加熱) 5.34 3.82 1.29×109
   加熱殺菌前(同時加熱) 5.00 5.40 1.89×109
121℃、30分鐘 無添加 5.69 2.77 3.05×108
   加熱殺菌後(個別加熱) 5.26 4.00 1.12×109
   加熱殺菌前(同時加熱) 4.96 5.42 1.86×109
於所有加熱溫度下均確認到由添加L-胱胺酸帶來之BbY之增殖促進。又，於所有加熱溫度下均確認到於將脫脂乳與L-胱胺酸同時加熱之情形時，生菌數及酸度相較於將脫脂乳與L-胱胺酸個別加熱之情形有所增加。
實施例5 增殖促進因子之探索 根據實施例1～4之結果提示出，藉由加熱，乳與L-胱胺酸或L-半胱胺酸反應而產生增殖促進因子。又，認為該增殖促進因子之產生係與乳中之乳清所含之成分相關。因此，進行該增殖促進因子之探索。
(1)方法 向加熱前分離乳清培養基中添加最終濃度0.03%(w/v)之L-半胱胺酸鹽酸鹽，並於115℃下加熱30分鐘。藉由5 N NaOH將所獲得之加熱處理物之pH值調整為8.0，以13,000×g離心分離30分鐘。將上清液添加至超過濾過濾器Amicon Ultra-15 3 kDa(Merck製造)，以5,000×g離心分離60分鐘。將過濾液(分子量未達3000之組分)於下述條件下供於使用陰離子交換管柱之液體層析法(移動相為Tris緩衝液)。 管柱：HiTrap Q FF 1 mL 開始緩衝液：20 mM Tris緩衝液(pH值8.0) 溶出緩衝液：包含1 M NaCl之20 mM Tris緩衝液(pH值8.0) 溶出方式：溢流20 CV，梯度(0→100%，20 CV)，2 mL/溶離份，洗滌(100%，5 CV) 添加方式：直接裝入試樣10 mL 流速：1 mL/min 管柱溫度：室溫 機器：AKTA探測器(GE HEALTHCARE) 將所獲得之組分中之1 mL分別添加至在115℃下經過30分鐘加熱處理後之實施例1及同樣之脫脂乳培養基9 mL中，接種BbY(同時加熱樣品)。與實施例1同樣地測定於37℃下培養12小時後之生菌數與酸度。 又，針對單獨地向於115℃下經過30分鐘加熱處理之加熱前分離乳清培養基中添加最終濃度0.03%(w/v)之L-半胱胺酸鹽酸鹽而成者，亦進行同樣之操作(個別加熱樣品)。作為對照，向脫脂乳培養基中添加1 mL之Tris緩衝液而進行BbY之培養。
(2)結果 於圖9中表示將對照樣品之生菌數(5.5×108 CFU/mL)設為1時每組分之生菌數比，於圖10中表示將對照樣品之酸度設為0時每組分之酸度之差。於同時加熱樣品中，尤其是於溶出體積約為22～28 mL之組分中確認到增殖促進效果。另一方面，於個別加熱樣品中，未確認到具有增殖促進效果之組分。該溶出體積為22～28 mL之組分相當於在50～200 mM之陰離子存在下溶離之組分。 即便於使用BF-1作為雙叉桿菌屬細菌之情形時，亦獲得了同樣之結果。 因此，明確了雙叉桿菌屬細菌之增殖促進因子係含有半胱胺酸、胱胺酸或其等之鹽、尤其是L-半胱胺酸鹽酸鹽之乳培養基之加熱處理物中的分子量未達3000之成分，且係以pH值8.0以上保持於陰離子交換樹脂，於50～200 mM之陰離子存在下自陰離子交換樹脂溶離之乳培養基成分。
圖1係表示同時或個別地對乳與L-胱胺酸或者L-半胱胺酸鹽酸鹽進行加熱之情形時乳桿菌屬細菌株與雙叉桿菌屬細菌株之增殖性之圖。 圖2係同時或個別地對乳與L-胱胺酸或者L-半胱胺酸鹽酸鹽進行加熱之情形時雙叉桿菌屬細菌株之增殖曲線之圖。 圖3係表示由添加至脫脂乳培養基之L-胱胺酸或L-半胱胺酸鹽酸鹽之濃度差異所導致之短型雙叉桿菌YIT 12272(BbY)之培養性狀差異的圖。 圖4係表示由添加至乳清培養基之L-胱胺酸或L-半胱胺酸鹽酸鹽之濃度差異所導致之BbY之培養性狀差異的圖。 圖5係表示由添加至脫脂乳培養基之L-胱胺酸或L-半胱胺酸鹽酸鹽之濃度差異所導致之雙岐雙叉桿菌YIT 10347(BF-1)之培養性狀差異的圖。 圖6係表示由添加至乳清培養基之L-胱胺酸或L-半胱胺酸鹽酸鹽之濃度差異所導致之BF-1之培養性狀差異的圖。 圖7係表示確認到生菌數之最大值之L-胱胺酸或L-半胱胺酸鹽酸鹽濃度下的BbY之培養性狀之圖。 圖8係表示確認到生菌數之最大值之L-胱胺酸或L-半胱胺酸鹽酸鹽濃度下的BF-1之培養性狀之圖。 圖9係表示同時加熱樣品(上段)與個別加熱樣品(下段)之每組分之生菌數之圖。縱軸表示將對照樣品之生菌數設為1時之每組分之生菌數比，橫軸表示溶出體積。 圖10係表示同時加熱樣品(上段)與個別加熱樣品(下段)之每組分之酸度之圖。縱軸表示將對照樣品之酸度設為0時之每組分之酸度之差，橫軸表示溶出體積。

Claims (12)

  1. 一種雙叉桿菌屬細菌之增殖促進劑，其以含有選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之乳培養基之加熱處理物作為有效成分，上述乳培養基為脫脂乳培養基或乳清培養基，上述加熱處理係以100~121℃進行10~40分鐘之加熱處理，且於上述乳培養基中選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之含量係以最終濃度計為0.003~0.1(w/v)%。
  2. 如請求項1之增殖促進劑，其中上述乳培養基中選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之含量係以最終濃度計為0.003~0.05(w/v)%。
  3. 如請求項1或2之增殖促進劑，其中上述乳培養基含有選自由L-半胱胺酸、L-胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上。
  4. 如請求項1或2之增殖促進劑，其中上述乳培養基含有L-胱胺酸。
  5. 如請求項1或2之增殖促進劑，其中上述乳培養基含有L-半胱胺酸鹽酸鹽。
  6. 如請求項1或2之增殖促進劑，其中上述加熱處理物係經加熱處理之乳培養基之分子量未達3000之組分中，以pH值8.0以上保持於陰離子交換樹脂，且於1~400mM之陰離子存在下自上述陰離子交換樹脂溶離者。
  7. 一種乳培養基之組分，其係對含有選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之乳培養基進行加熱處理，分取所得之乳培養基加熱處理物之分子量未達3000之組分，以pH值8.0以上使所獲得之組分保持於陰離子交換樹脂，進而於1~400mM之陰離子存在下自上述陰離子交換樹脂溶離而得者，上述乳培養基為脫脂乳培養基或乳清培養基，上述加熱處理係以100~121℃進行10~40分鐘之加熱處理，且於上述乳培養基中選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之含量係以最終濃度計為0.003~0.1(w/v)%。
  8. 如請求項7之乳培養基之組分，其中上述乳培養基中選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之含量係以最終濃度計為0.003~0.05(w/v)%。
  9. 如請求項7或8之乳培養基之組分，其中上述乳培養基含有L-胱胺酸。
  10. 一種乳培養基之組分之製造方法，其特徵在於：對含有選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之乳培養基進行加熱處理，分取所得之乳培養基加熱處理物之分子量未達3000之組分，以pH值8.0以上使所獲得之組分保持於陰離子樹脂，進而於1~400mM之陰離子存在下使之自上述陰離子樹脂溶離，上述乳培養基為脫脂乳培養基或乳清培養基，上述加熱處理係以100~121℃進行10~40分鐘之加熱處理，且於上述乳培養基中選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群 中之1種或2種以上之含量係以最終濃度計為0.003~0.1(w/v)%。
  11. 如請求項10之方法，其中上述乳培養基中選自由半胱胺酸、胱胺酸及其等之鹽所組成之群中之1種或2種以上之含量係以最終濃度計為0.003~0.05(w/v)%。
  12. 如請求項10或11之方法，其中上述乳培養基含有L-胱胺酸。
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