TWI853077B

TWI853077B - 新型抗ｃｄ３９抗體

Info

Publication number: TWI853077B
Application number: TW109129335A
Authority: TW
Inventors: 邱陽生; 孫美玲; 邢柔媚; 徐丹; 時玉菲; 趙金鳳; 杜慶林; 吳志浩; 高瑞; 羅伯特Ｈ阿奇; 宏韜盧
Original assignee: 中國大陸商科望（蘇州）生物醫藥科技有限公司; 中國大陸商科望（上海）生物醫藥科技有限公司
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2024-08-21
Also published as: CN112714768B; TW202124453A; AU2020286284B2; EP3820907A4; EP3820907A1; JP7727387B2; KR20220050971A; US20210388105A1; CN112714768A; CA3102329A1; WO2021037037A1; JP2022545585A; US12312410B2; AU2020286284A1

Abstract

本發明提供了抗CD39抗體或其抗原結合片段、編碼上述抗體或其抗原結合片段之分離的多核苷酸、包括上述抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物及其用途。

Description

新型抗CD39抗體

本發明總體上涉及新型抗CD39抗體。

CD39，亦稱為外核苷三磷酸二磷酸水解酶1 (ENTPDase1)，為一種完整的膜蛋白，可將ATP或ADP轉化為AMP，然後CD73將AMP脫磷酸化為腺苷，腺苷為有效的免疫抑制劑，且與位於CD4、CD8 T細胞及自然殺傷(NK)細胞表面的腺苷受體(例如，A2A受體)結合，且抑制T細胞及NK細胞應答，從而抑制免疫系統。腺苷亦與巨噬細胞及樹突細胞上的A2A或A2B受體結合，抑制吞噬作用及抗原呈遞，且增加促癌因子(例如VEGF、TGFb及IL-6)的分泌。CD39及CD73的酶活性在校準分別藉由ADP及ATP轉化為AMP及AMP轉化為腺苷而傳遞給免疫細胞的嘌呤能信號的持續時間、強度及化學性質方面具有戰略性作用(Luca Antonioli等人,Trends Mol Med. 2013 Jun; 19(6):355-367)。由CD39及CD73介導的腺苷水準升高會產生免疫抑制環境，從而促進癌症的發生及發展。

仍需要新型抗CD39抗體。

本申請全文中的冠詞「一種」(a/an)、「一個」(a/an)及「上述」在此用於指一種(個)或多於一種(個)(即，至少一種(個))該冠詞的文法對象。舉例而言，「一種抗體」係指一種抗體或多於一種抗體。

在一個態樣中，本發明提供了一種能夠特異性結合人類CD39的抗體或其抗原結合片段，其包括重鏈可變區及/或輕鏈可變區，上述重鏈可變區包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，上述輕鏈可變區包括LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： (a) 上述HCDR1包括選自下組之胺基酸序列：NYGMN(SEQ ID NO：1)、KYWMN(SEQ ID NO：2)、NYWMN(SEQ ID NO：3)、DTFLH(SEQ ID NO：4)、DYNMY(SEQ ID NO：5)、DTYVH(SEQ ID NO：6)；且 (b) 上述HCDR2包括選自下組之胺基酸序列：LINTYTGEPTYADDFKD(SEQ ID NO：7)、EIRLKSNKYGTHYAESVKG(SEQ ID NO：8)、QIRLNPDNYATHX₁ AESVKG(SEQ ID NO：9)、X₅₈ IDPAX₅₉ X₆₀ NIKYDPKFQG(SEQ ID NO：151)、FIDPYNGYTSYNQKFKG(SEQ ID NO：11)、RIDPAIDNSKYDPKFQG(SEQ ID NO：12)；且 (c) 上述HCDR3包括選自下組之胺基酸序列：KGIYYDYVWFFDV(SEQ ID NO：13)、QLDLYWFFDV(SEQ ID NO：14)、HGX₂ RGFAY(SEQ ID NO：15)、SPYYYGSGYRIFDV(SEQ ID NO：16)、IYGYDDAYYFDY(SEQ ID NO：17)、YYCALYDGYNVYAMDY(SEQ ID NO：18)；且 (d) 上述LCDR1包括選自下組之胺基酸序列：KASQDINRYIA(SEQ ID NO：19)，RASQSISDYLH(SEQ ID NO：20)，KSSQSLLDSDGRTHLN(SEQ ID NO：21)，SAFSSVNYMH(SEQ ID NO：22)，SATSSVSYMH(SEQ ID NO：23)，RSSKNLLHSNGITYLY(SEQ ID NO：24)；且 (e) 上述LCDR2包括選自下組之胺基酸序列：YTSTLLP(SEQ ID NO：25)、YASQSIS(SEQ ID NO：26)、LVSKLDS(SEQ ID NO：27)、TTSNLAS(SEQ ID NO：28)、STSNLAS(SEQ ID NO：29)、RASTLAS(SEQ ID NO：30)；且 (f) 上述LCDR3包括選自下組之胺基酸序列：LQYSNLLT(SEQ ID NO：31)、QNGHSLPLT(SEQ ID NO：32)、WQGTLFPWT(SEQ ID NO：33)、QQRSTYPFT(SEQ ID NO：34)、QQRITYPFT(SEQ ID NO：35)、AQLLELPHT(SEQ ID NO：36)；其中X₁ 為Y或F，X₂ 為S或T，X₅₈ 為R或K，X₅₉ 為N、G、S或Q，X₆₀ 為G、A或D。

在一些實施例中，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列，及/或上述HCDR2包括如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列，及/或上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR1包括如SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR2包括如SEQ ID NO：27所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR3包括如SEQ ID NO：33所示之胺基酸序列，其中X₁ 及X₂ 如以上所定義。

在一些實施例中，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列，及/或上述HCDR2包括選自下組之胺基酸序列：SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38，及/或上述HCDR3包括選自下組之胺基酸序列：SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：41，及/或上述LCDR1包括如SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR2包括如SEQ ID NO：27所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR3包括如SEQ ID NO：33所示之胺基酸序列。

在一些實施例中，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列，及/或上述HCDR2包括如SEQ ID NO：151所示之胺基酸序列，及/或上述HCDR3包括如SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR2包括如SEQ ID NO：28所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR3包括如SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列，其中X₅₈ 、X₅₉ 及X₆₀ 如以上所定義。

在一些實施例中，本申請提供的上述抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包括： (a) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：7所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：13所示之序列；或 (b) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：2所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：8所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：14所示之序列；或 (c) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：3所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：37所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：40所示之序列；或 (d) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：3所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：38所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：41所示之序列；或 (e) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：4所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：10所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：16所示之序列；或 (f) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：4所示之序列，上述HCDR2包括選自下組之序列：SEQ ID NO：134、135、136、137、138及139，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：16所示之序列；或 (g) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：5所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：11所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列；或 (h) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：6所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：12所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：18所示之序列。

在一些實施例中，本文提供的上述抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包括： (a) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：19所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：25所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：31所示之序列；或 (b) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：20的序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：32所示之序列；或 (c) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：21所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：27所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：33所示之序列；或 (d) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：28所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：34所示之序列；或 (e) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：23所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：29所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：35所示之序列；或 (f) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：24所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：30所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列。

在一些實施例中，本申請提供的上述抗體或其抗原結合片段包括： (a) 所述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：7所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：13所示之序列；上述LCDR1包括如SEQ ID NO：19所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：25所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：31所示之序列；或 (b) 上述HCDR1包括如SEQ ID NO：2所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：8所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：14所示之序列；上述LCDR1包括如SEQ ID NO：20所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：32所示之序列；或 (c) 上述HCDR1包括如SEQ ID NO：3所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：37所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：40所示之序列；上述LCDR1包括如SEQ ID NO：21所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：27所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：33所示之序列；或 (d) 上述HCDR1包括如SEQ ID NO：3所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：38所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：41所示之序列；上述LCDR1包括如SEQ ID NO：21所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：27所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：33所示之序列；或 (e) 上述HCDR1包括如SEQ ID NO：4所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：10所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：16所示之序列；上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：28所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：34所示之序列；或 (f) 上述HCDR1包括如SEQ ID NO：4所示之序列，上述HCDR2包括選自下組之序列：SEQ ID NO：134、135、136、137、138及139，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：16所示之序列；上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：28所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：34所示之序列；或 (g) 上述HCDR1包括如SEQ ID NO：5所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：11所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列；上述LCDR1包括如SEQ ID NO：23所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：29所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：35所示之序列；或 (h) 上述HCDR1包括如SEQ ID NO：6所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：12所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：18所示之序列；上述LCDR1包括如SEQ ID NO：24所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：30所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列。

在一些實施例中，本申請提供的上述抗體或其抗原結合片段進一步包括重鏈HFR1、HFR2、HFR3及HFR4中之一或多者，及/或輕鏈LFR1、LFR2、LFR3及LFR4中之一或多者，其中： (a) 上述HFR1包括如X₁₉ VQLVX₂₀ SGX₂₁ X₂₂ X₂₃ X₂₄ KPGX₂₅ SX₂₆ X₂₇ X₂₈ SCX₂₉ ASGX₃₀ X₃₁ X₃₂ X₃₃ (SEQ ID NO：76)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， (b) 上述HFR2包括如WVX₃₄ QX₃₅ PGX₃₆ X₃₇ LEWX₃₈ X₃₉ (SEQ ID NO：77)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， (c) 上述HFR3序列包括如X₄₀ X₄₁ TX₄₂ X₄₃ X₄₄ DX₄₅ SX₄₆ X₄₇ TX₄₈ YX₄₉ X₅₀ X₅₁ X₅₂ SLX₅₃ X₅₄ EDTAVYYCX₅₅ X₅₆ (SEQ ID NO：78)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， (d) 上述HFR4包括如WGQGTX₅₇ VTVSS(SEQ ID NO：126)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， (e) 上述LFR1包括如X₃ IVX₄ TQSPATLX₅ X₆ SPGERX₇ TX₈ X₉ C(SEQ ID NO：80)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， (f) 上述LFR2包括如WYQQKPGQX₁₀ PX₁₁ LLIY(SEQ ID NO：81)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， (g) 上述LFR3包括如GX₁₂ PX₁₃ RFSGSGSGTX₁₄ X₁₅ TLTISSX₁₆ EPEDFAVYX₁₇ C(SEQ ID NO：82)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，及 (h) 上述LFR4包括如FGX₁₈ GTKLEIK(SEQ ID NO：152)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，其中X₃ 為E或Q；X₄ 為L或M；X₅ 為S或T；X₆ 為L、V或A；X₇ 為A或V；X₈ 為L或I；X₉ 為S或T；X₁₀ 為A或S；X₁₁ 為R或K；X₁₂ 為I或V；X₁₃ 為A或T；X₁₄ 為D或S；X₁₅ 為F或Y；X₁₆ 為L、M或V；X₁₇ 為Y或F；X₁₈ 為G或Q；X₁₉ 為Q或E；X₂₀ 為E或Q；X₂₁ 為G或A；X₂₂ 為G或E；X₂₃ 為L或V；X₂₄ 為V或K；X₂₅ 為G或A；X₂₆ 為L、M或V；X₂₇ 為R或K；X₂₈ 為V或L；X₂₉ 為A或K；X₃₀ 為F或Y；X₃₁ 為N或T；X₃₂ 為F或L；X₃₃ 為S或K；X₃₄ 為R或K；X₃₅ 為A或S；X₃₆ 為K或Q；X₃₇ 為R或G；X₃₈ 為M、I或V；X₃₉ 為G或A；X₄₀ 為R或K；X₄₁ 為V、A或F；X₄₂ 為I或L；X₄₃ 為S或T；X₄₄ 為R或A；X₄₅ 為D或T；X₄₆ 為K、A或S；X₄₇ 為S或N；X₄₈ 為L、V或A；X₄₉ 為M或L；X₅₀ 為Q或E；X₅₁ 為M或L；X₅₂ 為S、I或N；X₅₃ 為R或K；X₅₄ 為S或T；X₅₅ 為A或T；X₅₆ 為R、N或T；以及X₅₇ 為T或L。

在一些實施例中，上述HFR1包括如EVQLVESGGGLVKPGGSX₆₁ RLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：154)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述HFR2包括如WVRQX₆₂ PGKGLEWVX₆₃ (SEQ ID NO：155)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述HFR3包括如RFTISRDDSKNTX₆₄ YLQMNSLKTEDTAVYYCTT(SEQ ID NO：156)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述HFR4包括如WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：79)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述LFR1包括如EIVX₆₅ TQSPATLSX₆₆ SPGERX₆₇ TLSC(SEQ ID NO：157)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述LFR2包括如WYQQKPGQX₆₈ PRLLIY(SEQ ID NO：158)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述LFR3包括如GIPARFSGSGSGTDFTLTISSX₆₉ EPEDFAVYX₇₀ C(SEQ ID NO：159)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，及上述LFR4包括如FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：153)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，其中X₆₁ 為L或M；X₆₂ 為A或S；X₆₃ 為G或A；X₆₄ 為L或V；X₆₅ 為L或M；X₆₆ 為L或V；X₆₇ 為A或V；X₆₈ 為A或S；X₆₉ 為L或V；X₇₀ 為Y或F。

在一些實施例中，上述HFR1包括如X₇₁ VQLVQSGAEVKKPGASVKX₇₂ SCKASGYX₇₃ LK(SEQ ID NO：160)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述HFR2包括如WVX₇₄ QAPGQX₇₅ LEWX₇₆ G(SEQ ID NO：161)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述HFR3包括如X₇₇ X₇₈ TX₇₉ TX₈₀ DTSX₈₁ X₈₂ TAYX₈₃ ELX₈₄ SLRSEDTAVYYCAX₈₅ (SEQ ID NO：149)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述HFR4包括如WGQGTX₅₇ VTVSS(SEQ ID NO：126)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述LFR1包括如X₈₆ IVLTQSPATLX₈₇ X₈₈ SPGERX₈₉ TX₉₀ X₉₁ C(SEQ ID NO：150)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述LFR2包括如WYQQKPGQX₁₀ PX₁₁ LLIY(SEQ ID NO：81)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述LFR3包括如GX₉₂ PX₉₃ RFSGSGSGTX₉₄ X₉₅ TLTISSX₉₆ EPEDFAVYYC(SEQ ID NO：148)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，及上述LFR4包括如FGQGTKLEIK(SEQ ID NO：83)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，其中X₁₀ 、X₁₁ 及X₅₇ 如以上所定義，X₇₁ 為Q或E；X₇₂ 為V或L；X₇₃ 為N或T；X₇₄ 為R或K；X₇₅ 為R或G；X₇₆ 為M或I；X₇₇ 為R或K；X₇₈ 為V或A；X₇₉ 為I或L；X₈₀ 為R或A；X₈₁ 為A或S；X₈₂ 為S或N；X₈₃ 為M或L；X₈₄ 為S或I；X₈₅ 為R或N；X₈₆ 為E或Q；X₈₇ 為S或T；X₈₈ 為L或A；X₈₉ 為A或V；X₉₀ 為L或I；X₉₁ 為S或T；X₉₂ 為I或V；X₉₃ 為A或T；X₉₄ 為D或S；X₉₅ 為F或Y；X₉₆ 為L或M。

在一些實施例中，上述HFR1包括選自下組之序列：SEQ ID NO：84-86、115、119-120及131；上述HFR2包括選自下組之序列：SEQ ID NO：87-90及121-123；上述HFR3包括選自下組之序列：SEQ ID NO：91-97、116-117及124-125；上述HFR4包括選自下組之序列：SEQ ID NO：79及118；上述LFR1包括選自下組之序列：SEQ ID NO：98-103及127-129；上述LFR2包括選自下組之序列：SEQ ID NO：104、105及130；上述LFR3包括選自下組之序列：SEQ ID NO：106-110及132-133，及上述LFR4包括選自下組之序列：SEQ ID NO：83及153。

在一些實施例中，本申請提供之上述抗體或其抗原結合片段包括包括重鏈可變區及輕鏈可變區，上述重鏈可變區包括選自下組之序列：SEQ ID NO：60、62、64、66、140、141、142、146、147、39，以及與其具有至少80%序列同一性，但仍然保持與人類CD39特異性結合親和性之同源序列；上述輕鏈可變區包括選自下組之序列：SEQ ID NO：61、63、65、67、143、144、145、111、112、63，以及與其具有至少80%序列同一性，但仍然保持與人類CD39特異性結合親和性之同源序列。

在一些實施例中，本申請提供之上述抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區及輕鏈可變區，上述重鏈可變區包括選自下組之序列：SEQ ID NO：68、70、72、74，以及與其具有至少80%序列同一性，但仍然保持與人類CD39特異性結合親和性之同源序列；上述輕鏈可變區包括選自下組之序列：SEQ ID NO：69、71、73、75，以及與其具有至少80%序列同一性，但仍然保持與人類CD39特異性結合親和性之同源序列。

在一些實施例中，本文提供之上述抗體或其抗原結合片段包括： (1) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：42所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：51所示之序列，或 (2) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：52所示之序列，或 (3) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：44所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：53所示之序列，或 (4) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：45所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：54所示之序列，或 (5) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：47所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：56所示之序列，或 (6) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：49所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：58所示之序列，或 (7) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：50所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：59所示之序列，或 (8) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：60所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：61所示之序列，或 (9) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：62所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：61所示之序列，或 (10) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：64所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：61所示之序列，或 (11) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：66所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：61所示之序列，或 (12) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：60所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：63所示之序列，或 (13) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：62所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：63所示之序列，或 (14) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：64所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：63所示之序列，或 (15) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：66所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：63所示之序列，或 (16) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：60所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：65所示之序列，或 (17) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：62所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：65所示之序列，或 (18) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：64所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：65所示之序列，或 (19) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：66所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：65所示之序列，或 (20) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：60所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：67所示之序列，或 (21) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：62所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：67所示之序列，或 (22) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：64所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：67所示之序列，或 (23) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：66所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：67所示之序列，或 (24) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：140所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：61所示之序列，或 (25) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：141所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：61所示之序列，或 (26) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：142所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：61所示之序列，或 (27) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：60所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：143所示之序列，或 (28) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：140所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：143所示之序列，或 (29) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：141所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：143所示之序列，或 (30) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：142所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：143所示之序列，或 (31) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：60所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：144所示之序列，或 (32) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：140所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：144所示之序列，或 (33) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：141所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：144所示之序列，或 (34) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：142所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：144所示之序列，或 (35) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：60所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：145所示之序列，或 (36) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：140所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：145所示之序列，或 (37) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：141所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：145所示之序列，或 (38) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：142所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：145所示之序列，或 (39) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：146所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：111所示之序列，或 (40) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：146所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：112所示之序列，或 (41) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：147所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：111所示之序列，或 (42) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：39所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：63所示之序列，或 (43) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：68所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：69所示之序列，或 (44) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：70所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：69所示之序列，或 (45) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：72所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：69所示之序列，或 (46) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：74所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：69所示之序列，或 (47) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：68所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：71所示之序列，或 (48) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：70所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：71所示之序列，或 (49) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：72所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：71所示之序列，或 (50) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：74所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：71所示之序列，或 (51) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：68所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：73所示之序列，或 (52) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：70所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：73所示之序列，或 (53) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：72所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：73所示之序列，或 (54) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：74所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：73所示之序列，或 (55) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：68所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：75所示之序列，或 (56) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：70所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：75所示之序列，或 (57) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：72所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：75所示之序列，或 (58) 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：74所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：75所示之序列。

在一些實施例中，本申請提供之上述抗體或其抗原結合片段進一步包括一或多個胺基酸殘基取代或修飾，但仍然保持與人類CD39的特異性結合親和性。在一些實施例中，上述取代或修飾中之至少一者在上述重鏈可變區或輕鏈可變區中之一或多個CDR序列及/或一或多個非CDR序列中。在一些實施例中，上述取代或修飾中之至少一者為保守取代。

在一些實施例中，本申請提供之上述抗體或其抗原結合片段進一步包括Fc區，視情況包括人類免疫球蛋白(Ig)的Fc區，或視情況包括人類IgG的Fc區。在一些實施例中，上述Fc區源自人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgM。在一些實施例中，上述Fc區源自人類IgG1或IgG4。在一些實施例中，源自人類IgG1或IgG4的上述Fc區具有降低的效應功能。在一些實施例中，源自人類IgG1的上述Fc區包括L234A及/或L235A突變。在一些實施例中，源自人類IgG4的上述Fc區視情況具有降低的效應功能。在一些實施例中，源自人類IgG4的上述Fc區包含S228P突變及/或L235E突變及/或F234A及L235A突變。

在一些實施例中，本申請提供之上述抗體或其抗原結合片段為人源化的。在一些實施例中，本申請提供之上述抗體或其抗原結合片段為單株抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、重組抗體、嵌合抗體、標記抗體、雙價抗體、抗獨特型抗體(anti-idiotypic antibody)或融合蛋白。

在一些實施例中，本申請提供之上述抗體或其抗原結合片段為雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')₂ 、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂ 、雙特異性dsFv (dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定的雙抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價的雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single chain domain antibody)、奈米抗體(nanobody)、域抗體(domain antibody)或雙價域抗體。

在一些實施例中，本申請提供之上述抗體或其抗原結合片段能夠以不超過10^-8 M的EC₅₀ 特異性地與人類CD39結合，上述EC₅₀ 藉由FACS (流式細胞螢光分選技術)檢定法測定。

在一些實施例中，本申請提供之上述抗體或其抗原結合片段具有選自下組的一或多種性質： (a) 藉由FACS檢定法測定，特異性地與人類CD39結合，但不與小鼠CD39特異性地結合； (b) 以不超過10^-8 M的EC₅₀ 特異性地與食蟹猴CD39結合，上述EC₅₀ 藉由FACS檢定法測定； (c) 以不超過10^-7 M(例如，不超過5×10^-8 M、不超過3×10^-8 M、不超過2×10^-8 M、不超過1×10^-8 M、或不超過8×10^-9 M)的K_D 值特異性地與人類CD39結合，上述K_D 值藉由Biacore檢定法測定； (d) 以不超過10^-8 M(例如，不超過8×10^-9 M、不超過5×10^-9 M、不超過4×10^-9 M、不超過3×10^-9 M、不超過1×10^-9 M、或不超過9×10^-10 M)的K_D 值特異性與人類CD39結合，上述K_D 值藉由Octet分析測定； (e) 以不超過50 nM(例如，不超過1 nM、不超過5 nM、不超過10 nM、或不超過30 nM)的IC₅₀ 抑制在表現CD39的細胞中的ATP酶活性，上述IC₅₀ 藉由ATP酶活性分析測定； (f) 能夠以不超過50 nM(例如，不超過40 nM、不超過30 nM、不超過20 nM、不超過10 nM、不超過5 nM、不超過3 nM、不超過2 nM、不超過1 nM、不超過0.5 nM、或不超過0.2 nM)的濃度增強ATP介導的單核細胞活化，上述濃度藉由FACS分析CD80、CD86及/或CD40的表現測定； (g) 能夠以不超過25 nM的濃度增強外周血單核細胞(PBMC)中ATP介導的T細胞活化，上述濃度藉由IL-2分泌、IFN-γ分泌、CD4⁺ 或CD8⁺ T細胞增殖測定； (h) 能夠以不超過25 nM(或不超過10 nM、或不超過5 nM、或不超過1 nM、或不超過0.5 nM、或不超過0.2 nM)的濃度增強ATP介導的樹突細胞(DC)活化，上述濃度藉由FACS檢定法、或藉由活化的DC促進T細胞增殖的能力、或藉由活化的DC促進混合淋巴細胞反應(MLR)分析中的IFN-γ產生的能力來分析CD83的表現測定； (i) 能夠以不超過1 nM(例如，不超過0.1 nM、不超過0.01 nM)的濃度阻斷由腺苷(由ATP水解)誘導的CD4⁺ T細胞增殖的抑制，上述濃度藉由FACS檢定法測定； (j) 能夠以NK細胞或巨噬細胞依賴性方式抑制哺乳動物中的腫瘤生長； (k) 能夠逆轉經細胞外ATP(eATP)抑制的人CD8⁺ T細胞增殖，藉由T細胞增殖、CD25⁺ 細胞及活細胞群體測定；以及 (l) 能夠以不超過50 nM(或不超過12.5 nM、或不超過3.13 nM、或不超過0.78 nM、或不超過0.2 nM、或不超過0.049 nM、或不超過0.012 nM、或不超過0.003 nM、或不超過0.0008 nM)的濃度增強由LPS刺激誘導的人類巨噬細胞IL1β釋放，上述濃度藉由ELISA檢定法測定。

在另一態樣中，本發明提供了一種抗CD39抗體或其抗原結合片段，其與本申請提供的抗體或其抗原結合片段競爭結合人類CD39。在一些實施例中，上述抗CD39抗體或其抗原結合片段與包括重鏈可變區及輕鏈可變區的抗體競爭結合人類CD39，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：52所示之序列。在一些實施例中，上述抗CD39抗體或其抗原結合片段與包括重鏈可變區及輕鏈可變區的抗體競爭結合人類CD39，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：44所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：53所示之序列；或與包括重鏈可變區及輕鏈可變區的抗體競爭結合人類CD39，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：45所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：54所示之序列。在一些實施例中，上述抗CD39抗體或其抗原結合片段與包括重鏈可變區及輕鏈可變區的抗體競爭結合人類CD39，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：47所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：56所示之序列。

在另一態樣中，本發明提供了與CD39的抗原決定基特異性結合的抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中上述抗原決定基包括選自下組之一或多個殘基：Q96、N99、E143、R147、R138、M139、E142、K5、E100、D107、V81、E82、R111及V115。

在一些實施例中，上述抗原決定基包括選自下組之一或多個殘基：Q96、N99、E143及R147。在一些實施例中，上述抗原決定基包括選自下組之一或多個殘基：R138、M139及E142。在一些實施例中，上述抗原決定基包括選自下組之一或多個殘基：K5、E100及D107。在一些實施例中，上述抗原決定基包括選自下組之一或多個殘基：V81、E82、R111及V115。在一些實施例中，上述CD39為人類CD39。在一些實施例中，上述CD39為人類CD39，其包含如SEQ ID NO：162所示之胺基酸序列。

在一些實施例中，上述抗CD39抗體或其抗原結合片段不為抗體9-8B、抗體T895及抗體I394中之任一者，其中：抗體9-8B包括重鏈可變區及輕鏈可變區，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：46所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：48所示之序列；抗體T895包括重鏈可變區及輕鏈可變區，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：55所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：57所示之序列；以及抗體I394包括重鏈可變區及輕鏈可變區，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：113所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：114所示之序列。

在一些實施例中，本申請提供之上述抗體或其抗原結合片段為雙特異性的。在一些實施例中，本申請提供之上述抗體或其抗原結合片段能夠特異性地與除CD39之外的第二抗原或CD39上的第二抗原決定基結合。在某些實施例中，上述第二抗原選自下組：TGFβ、CD73、PD1、PDL1、4-1BB、CTLA4、TIGIT、GITA、VISTA、TIGIT、B7-H3、B7-H4、B7-H5、CD112R、Siglec-15、LAG3及TIM-3。

在一些實施例中，本申請提供之上述抗體或其抗原結合片段，其與一或多個綴合物部分連接。在一些實施例中，上述綴合物部分包括清理修飾劑、化療劑、毒素、放射性同位素、鑭系元素，發光標記、螢光標記、酶受質標記、DNA烷化劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白結合劑、純化部分或其他抗癌藥物。

在另一態樣中，本發明提供了一種醫藥組合物，其包括本發明所述之抗體或其抗原結合片段以及一或多種醫藥學上可接受之載劑。

在另一態樣中，本發明提供了一種分離的多核苷酸，其編碼本發明所述之抗體或其抗原結合片段。

在另一態樣中，本發明提供了一種載體，其包括本發明所述的分離的多核苷酸。

在另一態樣中，本發明提供了一種宿主細胞，其包括本發明所述的載體。

在另一態樣中，本發明提供了一種套組，其包括本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或所述的醫藥組合物，以及第二治療劑。

在另一態樣中，本發明提供了一種表現本發明所述之抗體或其抗原結合片段的方法，其包括在表現本發明所述的載體的條件下培養本發明所述的宿主細胞。

在另一態樣中，本發明提供了一種在個體中治療、預防或減輕與CD39相關的疾病、病症或狀況的方法，其包括向上述個體投與治療有效量的本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明所述之醫藥組合物。

在另一態樣中，本發明提供了一種在個體中治療、預防或減輕可藉由降低CD39的ATP酶活性而可治療的疾病的方法，其包括向上述個體投與治療有效量的本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明所述之醫藥組合物。

在另一態樣中，本發明提供了一種在個體中治療、預防或減輕與腺苷介導的T細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、抗原呈遞細胞、NK及/或B細胞活性的抑制相關的疾病的方法，其包括向上述個體投與治療有效量的本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明所述之醫藥組合物。

在一些實施例中，上述疾病、病症或狀況為癌症。在一些實施例中，上述癌症為肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、基底細胞癌、膽囊癌、胃癌、肺癌、支氣管癌、骨癌、肝膽管癌、胰臟癌、乳癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、腎癌、腎盂及輸尿管癌、唾液腺癌、小腸癌、尿道癌、膀胱癌、頭頸癌、脊椎癌、腦癌、子宮頸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、結腸癌、結直腸癌、直腸癌、食道癌、胃腸道癌、皮膚癌、前列腺癌、垂體癌、陰道癌、甲狀腺癌、喉癌、膠質母細胞瘤、黑素瘤、骨髓增生異常綜合症、肉瘤、畸胎瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T或B細胞淋巴瘤、胃腸道間質瘤、軟組織腫瘤、肝細胞癌或腺癌。在一些實施例中，上述癌症為白血病、淋巴瘤、膀胱癌、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、食道癌或乳癌。在一些實施例中，上述個體已被鑑定為具有表現CD39的癌細胞或浸潤腫瘤的免疫細胞或免疫抑制細胞，視情況其水準顯著地高於非癌細胞或非免疫抑制細胞上正常發現的水準。表現CD39的免疫抑制細胞的示例包括源自骨髓的抑制細胞(MDSC)或調節性T細胞(Tregs)。

在一些實施例中，上述疾病、病症或狀況為自體免疫性疾病或感染。在一些實施例中，上述自體免疫性疾病為免疫性血小板減少症、系統性硬皮病、硬化症、成人型呼吸窘迫症候群、濕疹、哮喘、乾燥症候群、艾迪生氏病、巨細胞動脈炎、免疫複合體腎炎、免疫性血小板減少性紫癜、自體免疫性血小板減少症、乳糜瀉、牛皮癬、皮炎、結腸炎或系統性紅斑狼瘡。在一些實施例中，上述感染為病毒感染或細菌感染。在一些實施例中，上述感染為HIV感染、HBV感染、HCV感染、炎性腸病或克羅恩氏病。

在一些實施例中，上述個體為人類。上述投與係經由口服、鼻內、靜脈內、皮下、舌下或肌內投與。在一些實施例中，上述方法進一步包括投與治療有效量的第二治療劑。在一些實施例中，上述第二治療劑選自下組：化療劑、抗癌藥、放射治療劑、免疫治療劑、抗血管生成劑、靶向治療劑、細胞治療劑、基因治療劑、激素治療劑、抗病毒劑、抗生素、鎮痛藥、抗氧化劑、金屬螯合劑及細胞因子。

在另一態樣中，本發明提供了一種調節CD39陽性細胞中CD39活性的方法，其包括將上述CD39陽性細胞暴露於本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明所述之醫藥組合物。在一些實施例中，上述細胞為免疫細胞。

在另一態樣中，本發明提供了一種偵測樣品中CD39的存在或含量的方法，其包括將上述樣品與本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明所述之醫藥組合物接觸，以及確定上述樣品中CD39的存在或含量。

在另一態樣中，本發明提供了一種在個體中診斷與CD39相關的疾病、病症或狀況的方法，其包括：a)將獲取自上述個體的樣品與本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明所述之醫藥組合物接觸；b)測定在上述樣品中CD39的存在或含量；c)將上述CD39的存在或含量與上述個體的與CD39相關的疾病、病症或狀況的存在或狀態相關聯。

在另一態樣中，本發明提供了本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明所述之醫藥組合物在製備用於治療、預防或減輕個體中與CD39相關的疾病、病症或狀況的藥物中的用途。

在另一態樣中，本發明提供了本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明所述之醫藥組合物在製備用於診斷個體中與CD39相關疾病、病症或狀況的診斷試劑中的用途。

在另一態樣中，本發明提供了一種用於偵測CD39的套組，其包括本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明所述之醫藥組合物。

本發明的以下描述只為說明本發明的多種實施例。因此，此處討論的具體修改方式不應理解為對申請範圍的限制。熟習此項技術者在不偏離本發明範圍的情況下即可很容易地得出多種等同方式，變化及修改，應理解此類等同實施例包括在本發明範圍內。在本發明中引用的所有文獻，包括公佈出版物、專利及專利申請均以引用的方式全文併入。定義

本發明中之術語「抗體」包括任何可結合某特定抗原的免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多價抗體、雙價抗體、單價抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體。一個天然的完整抗體包含兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈。哺乳動物的重鏈可分為α、δ、ε、γ及μ，每條重鏈由一個可變區(VH)以及第一、第二、第三及第四(視情況存在的)恆定區(分別為CH1、CH2、CH3、CH4)組成；哺乳動物的輕鏈可分為λ或κ，而每條輕鏈由一個可變區(VL)以及一個恆定區組成。抗體呈「Y」型，「Y」型結構的莖部由經由二硫鍵結合的兩條重鏈的第二及第三恆定區組成。「Y」型結構的每條臂包括與單條輕鏈的可變區及恆定區結合的單條重鏈的可變區及第一恆定區。輕鏈及重鏈的可變區決定抗原的結合。每條鏈的可變區通常含有三個高變區，稱互補決定區(CDR)(輕鏈CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重鏈CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本發明中揭示之抗體及抗原結合片段之CDR邊界可藉由Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani命名法命名或識別(Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M.,J. Mol. Biol. , 273(4), 927 (1997); Chothia, C.等人,J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C.及Lesk, A.M.,J. Mol. Biol. , 196,901 (1987); Chothia, C.等人,Nature . Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989); Kabat E.A.等人, Sequences of Proteins of immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Marie-Paule Lefranc等人,Developmental and Comparative Immunology , 27: 55-77 (2003); Marie-Paule Lefranc等人,Immunome Research , 1(3), (2005); Marie-Paule Lefranc, Molecular Biology of B cells (第二版), 第26章, 481-514, (2015))。其中，三個CDR由稱為框架區(FR)(輕鏈FR包含LFR1、LFR2、LFR3及LFR4，重鏈FR包含HFR1、HFR2、HFR3及HFR4)的側翼部分間隔開，框架區比CDR更加高度保守，且形成一個支架支撐高度可變環。重鏈及輕鏈的恆定區與抗原結合無關，但具有多種效應功能。抗體依據其重鏈恆定區的胺基酸序列可分成幾類。根據是否含有α、δ、ε、γ及μ重鏈，抗體可分別分為五個主要的分類或同種型：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。幾個主要的抗體分類亦可分為亞類，如IgG1(γ1重鏈)、IgG2(γ2重鏈)、IgG3(γ3重鏈)、IgG4(γ4重鏈)、IgA1(α1重鏈)或IgA2(α2重鏈)等。

在某些實施例中，本發明提供之上述抗體包括其任何抗原結合片段。本發明中之術語「抗原結合片段」係指由含有一或多個CDR的抗體的一部分形成的抗體片段，或與抗原結合但不具有完整的天然抗體結構的任何其他抗體片段。抗原結合片段的例子包括，但不限於，如雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')₂ 、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂ 、雙特異性dsFv(dsFv－dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價的雙功能抗體)、雙特異性抗體、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、奈米抗體(nanobody)、域抗體(domain antibody)及雙價域抗體(bivalent domain antibody)。抗原結合片段能夠與親本抗體結合相同的抗原。

抗體之「Fab」係指由單條輕鏈(包括可變區及恆定區)及單條重鏈的可變區及第一恆定區經二硫鍵結合起來組成的抗體的一部分。

「Fab'」係指包含部分鉸鏈區之Fab片段。

「F(ab')₂ 」係指Fab'之二聚體。

抗體(例如IgG、IgA或IgD同種型)的「Fc」係指由第一重鏈的第二及第三恆定區經由二硫鍵與第二重鏈的第二及第三恆定區連接組成的抗體的一部分。IgM及IgE同種型抗體的Fc亦包含第四恆定區。抗體的Fc部分負責多種不同的效應功能，例如，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)，但在抗原結合中不起作用。

抗體的「Fv」係指含有完整抗原結合位點的最小抗體片段。Fv片段由單條輕鏈的可變區與單條重鏈的可變區結合組成。

「單鏈Fv抗體」或「scFv」係指由輕鏈可變區與重鏈可變區直接相互連接或藉由肽連接子序列連接而成的經改造的抗體(Huston JS等人,Proc Natl Acad Sci USA , 85:5879 (1988))。

「單鏈Fv-Fc抗體」或「scFv-Fc」係指由與抗體Fc部分連接的scFv組成的經改造的抗體。

「駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)」、「重鏈抗體」或「HCAb(Heavy-chain-only antibody)」均指含有兩個V_H 域而不含有輕鏈的抗體(Riechmann L.及Muyldermans S.,J Immunol Methods. Dec 10; 231(1-2):25-38 (1999); Muyldermans S.,J Biotechnol. Jun; 74(4):277-302 (2001); WO94/04678; WO94/25591; 美國專利號6,005,079)。重鏈抗體最初來源於駝科(駱駝、單峰駝及美洲駝)。雖然缺失輕鏈，但駱駝化抗體(camelized antibody)有確證的抗原結合全部功能(Hamers-Casterman C.等人,Nature . Jun 3; 363(6428):446-8 (1993); Nguyen VK.等人,Immunogenetics. Apr; 54(1):39-47 (2002); Nguyen VK.等人, Immunology. May; 109(1):93-101 (2003))。重鏈抗體的可變區(VHH域)為獲得性免疫產生的已知最小的抗原結合單位(Koch-Nolte F.等人,FASEB J. Nov; 21(13):3490-8. Epub 2007 Jun 15 (2007))。

「奈米抗體(nanobody)」係指一種抗體片段，其由來自重鏈抗體的VHH域以及兩個恆定區CH2及CH3組成。

「雙功能抗體(diabody)」或「dAb」包括帶有兩個抗原結合位點的小抗體片段，其中上述片段含有在同一條多肽鏈上相連的V_H 域及V_L 域(V_H -V_L 或V_L -V_H )(請參見，例如，Holliger P.等人,Proc Natl Acad Sci USA . Jul 15;90(14):6444-8 (1993); EP404097; WO93/11161)。兩個域之間的連接子很短，使同一條鏈上的兩個域不能互相配對，從而迫使兩個域與另一條鏈的互補域配對，從而形成兩個抗原結合位點。此兩個抗原結合位點可靶向相同或不同的抗原(或抗原決定基)。在一些實施例中，「雙特異性ds雙功能抗體」為靶向兩種不同抗原(或抗原決定基)的雙功能抗體。

「域抗體(domain antibody)」係指僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區的抗體片段。在某些情況下，兩個或多個V_H 域由肽連接子共價連接形成雙價或多價域抗體。雙價域抗體的兩個V_H 域可靶向相同或不同的抗原。

本發明中使用之術語「價」係指給定分子中存在特定數量的抗原結合位點。術語「單價」係指僅具有一個抗原結合位點的抗體或抗原結合片段。術語「多價」係指具有多個抗原結合位點的抗體或抗原結合片段。由此，術語「雙價」、「四價」及「六價」分別表示抗原結合分子中存在兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。在一些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段為雙價的。

在本發明中，「雙特異性」抗體係指具有來源於兩個不同的單株抗體的片段，且能夠與兩個不同的抗原決定基結合的人工抗體。上述兩個抗原決定基可存在於同一個抗原，或其可存在於兩個不同的抗原。

在一些實施例中，「scFv二聚體」為雙價雙功能抗體或雙特異性scFv(BsFv)，包含二聚化的兩個V_H -V_L (由肽連接子連接)部分，使得一個部分的V_H 與另一個部分的V_L 協作形成兩個結合位點，此兩個結合位點可靶向相同抗原(或抗原決定基)或不同抗原(或抗原決定基)。在另一些實施例中，「scFv二聚體」為雙特異性雙功能抗體，包含相互連接的V_L1 -V_H2 (由肽連接子連接)及V_H1 -V_L2 (由肽連接子連接)，使得V_H1 及V_L1 協作，V_H2 及V_L2 協作，且各協作之配對具有不同的抗原特異性。

「dsFv」係指二硫鍵穩定的Fv片段，其單條輕鏈的可變區與單條重鏈的可變區之間的連接為二硫鍵。在一些實施例中，「(dsFv)₂ 」或「(dsFv-dsFv')」含有三條肽鏈：兩個V_H 部分藉由肽連接子(例如長的可撓性連接子)相連，且藉由二硫鍵分別與兩個V_L 部分結合。在一些實施例中，dsFv-dsFv'具有雙特異性，其中每對藉由二硫鍵配對的重鏈及輕鏈具有不同的抗原特異性。

本發明中使用之術語「嵌合」係指具有來源於一種物種的重鏈及/或輕鏈的一部分，且上述重鏈及/或輕鏈的其餘部分來源於另一不同物種的抗體或抗原結合片段。在一個例示性的實例中，嵌合抗體可包括來源於人的恆定區及來源於非人動物(例如小鼠)的可變區。在一些實施例中，上述非人動物為哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豚鼠或倉鼠。

本發明中使用之術語「人源化」係指包括來源於非人動物的CDR、來源於人的FR區、以及來源於人的恆定區(當適用時)的抗體或抗原結合片段。

本發明中使用之術語「親和力」係指免疫球蛋白分子(即，抗體)或其片段與抗原之間非共價相互作用的強度。

本發明中之「特異性結合」或「特異性地結合」係指兩分子間的非隨機結合反應，例如，抗體及抗原間的反應。特異性結合的特徵可在於結合親和力，例如由K_D 值表示，即，當抗原及抗原結合分子之間的結合達到平衡時解離速度與結合速度的比值(k_off /k_on )。可藉由使用此項技術中熟知的任何傳統方法測定K_D ，包括但不限於，表面等離子共振法、Octet方法、微量熱泳法、HPLC-MS方法及FACS檢定法。≤10^-6 M(例如 ≤5×10^-7 M、≤2×10^-7 M、≤10^-7 M、≤5×10^-8 M、≤2×10^-8 M、≤10^-8 M、≤5×10^-9 M、≤4×10^-9 M、≤3×10^-9 M、≤2×10^-9 M、或≤10^-9 M)的K_D 值可表示抗體或其抗原結合片段與CD39(例如人類CD39)之間的特異性結合。

本發明中之「競爭結合人類CD39」的能力係指第一抗體或其抗原結合片段抑制人類CD39與第二抗CD39抗體之間結合的相互作用至任何可偵測的程度的能力。在一些實施例中，競爭結合人類CD39的抗體或抗原結合片段可將人類CD39與第二抗CD39抗體之間結合的相互作用抑制至少85%或至少90%。在一些實施例中，此類抑制作用可大於95%或大於99%。

本發明中使用之術語「抗原決定基」係指抗原上與抗體結合的特定的原子基團或胺基酸。若兩種抗體表現出對抗原的競爭性結合，則可能結合抗原上相同或密切相關的抗原決定基。抗原決定基可為線性或構形的(即包括間隔開的胺基酸殘基)。例如，若抗體或其抗原結合片段對參考抗體與抗原的結合阻斷達到至少85%、或至少90%或至少95%，則上述抗體或其抗原結合片段可被視為與上述參考抗體結合相同/密切相關的抗原決定基。

本發明所用之術語「胺基酸」係指含有胺基(-NH₂ )及羧基(-COOH)官能基以及每個胺基酸特有的側鏈的有機化合物。胺基酸名稱在本發明中亦以標準的單字母或三字母代碼表示，總結如下：

名稱	三字母代碼	單字母代碼
丙胺酸	Ala	A
精胺酸	Arg	R
天冬醯胺	Asn	N
天冬胺酸	Asp	D
半胱胺酸	Cys	C
麩胺酸	Glu	E
麩醯胺酸	Gln	Q
甘胺酸	Gly	G
組胺酸	His	H
異白胺酸	Ile	I
白胺酸	Leu	L
離胺酸	Lys	K
甲硫胺酸	Met	M
苯丙胺酸	Phe	F
脯胺酸	Pro	P
絲胺酸	Ser	S
蘇胺酸	Thr	T
色胺酸	Trp	W
酪胺酸	Tyr	Y
纈胺酸	Val	V

在本發明中當「保守取代」用於胺基酸序列時，係指將一個胺基酸殘基用另一個具有相似理化性質的側鏈的胺基酸殘基替代。例如，可在具有疏水側鏈的胺基酸殘基之間(例如Met、Ala、Val、Leu及Ile)、具有中性親水側鏈的胺基酸殘基之間(例如Cys、Ser、Thr、Asn及Gln)、具有酸性側鏈的胺基酸殘基之間(例如Asp、Glu)、具有鹼性側鏈的胺基酸殘基之間(例如His、Lys及Arg)或具有芳香側鏈的胺基酸殘基之間(例如Trp、Tyr及Phe)進行保守取代。此項技術中已知，保守取代通常不會引起蛋白構形結構的顯著變化，因此能夠保留蛋白質的生物活性。

本發明所述之術語「同源的」係指當最佳比對時核酸序列(或其互補鏈)或胺基酸序列與另一條序列具有至少60%(例如，至少65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性。

當「百分比(%)序列同一性」用於胺基酸序列(或核酸序列)時，係指在進行序列比對，且必要時引入間隔使相同胺基酸(或核酸)數目達到最多後，在候選序列中，與參比序列相同的胺基酸(或核酸)殘基占上述候選序列的胺基酸(或核酸)殘基的百分比。換言之，可藉由用與其比較的參比序列相同的胺基酸殘基(或鹼基)數除以候選序列或參比序列(以較短者為準)中的胺基酸殘基(或鹼基)總數來計算胺基酸序列(或核酸序列)的百分比(%)序列同一性。上述胺基酸殘基的保守取代可視為或可不視為相同殘基。可藉由此項技術中揭示之工具，例如BLASTN、BLASTp(美國國家生物技術資訊中心網站(NCBI)，亦可參見Altschul S.F.等人,J. Mol. Biol. , 215:403–410 (1990); Stephen F.等人,Nucleic Acids Res. , 25:3389–3402 (1997))、ClustalW2(歐洲生物資訊研究所網站，可參見Higgins D.G.等人,Methods in Enzymology , 266:383-402 (1996); Larkin M.A.等人, Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007))及ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體，對序列進行比對以確定胺基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。熟習此項技術者可使用上述工具的默認參數或根據比對的需要適當調整參數，例如藉由挑選合適的算法。

本發明中使用之「效應功能」係指抗體的Fc區與其效應子(例如，C1複合體及Fc受體)結合的生物活性。例示性的效應功能包括抗體與C1複合體上的C1q相互作用介導的補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體的Fc區與效應細胞上的Fc受體結合介導的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)以及吞噬作用。可使用各種檢定法(例如Fc受體結合測定、C1q結合測定及細胞裂解測定)評估效應功能。

「分離的」物質已經人工由自然狀態改變。若自然界中出現某種「分離的」組合物或物質，則其已被改變或脫離其原始狀態，或二者均有發生。例如，某一活體動物體內天然存在的多核苷酸或多肽並非「分離的」，但若此等多核苷酸或多肽與之在天然狀態下共存的物質足夠分離且以基本上純的狀態存在，則可視為「分離的」。「分離的核酸序列」係指分離的核酸分子的序列。在一些實施例中，「分離的抗體或其抗原結合片段」係指純度為至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗體或其抗原結合片段，其中純度由電泳方法(例如，SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳)，或層析法(例如，離子交換層析或反相HPLC)確定。

本發明中之術語「載體」係指可將遺傳元件操作性地插入其中且使該遺傳元件獲得表現的一種運載工具，例如生產由該遺傳元件編碼的蛋白質、RNA或DNA，或複製上述遺傳元件。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳元件在宿主細胞內得以表現。舉例而言，載體包括：質體、噬菌粒、黏質體(cosmid)、人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1衍生的人工染色體(PAC)、噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體，以及動物病毒等。載體可含有多種控制表現的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報導基因。另外，載體亦可含有複製起始位點。載體亦可包括協助其進入細胞的成分，包括但不限於，病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼。載體可為表現載體或選殖載體。本發明提供的載體(例如表現載體)含有本發明所述的編碼抗體或其抗原結合片段的核酸序列、至少一個可操作地連接至上述核酸序列的啟動子(例如，SV40、CMV、EF-1α)，以及至少一個選擇標記。

本發明中「宿主細胞」係指可導入或已導入外源多核苷酸及/或載體的細胞。

術語「個體」包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物及非哺乳動物(例如，非人類靈長類、小鼠、大鼠、貓、兔子、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物及爬行動物)。除另有說明外，否則術語「患者」或「個體」在本發明中可互換使用。

術語「抗腫瘤活性」係指腫瘤細胞增殖、生存力或轉移活性的降低。例如，抗腫瘤活性可藉由在治療期間出現的異常細胞的生長速率的下降或腫瘤尺寸的穩定或減少、或由於與無治療的對照相比由於治療導致的更長的生存期來顯示。可使用可接受的體外或體內腫瘤模型(包括但不限於異種移植物模型、同種異體移植物模型、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)模型及此項技術中已知的研究抗腫瘤活性的其他已知模型)來評估抗腫瘤活性。

本發明中使用之對某種疾病、病症或狀況的「治療」或「療法」包括預防或減輕某種疾病、病症或狀況，降低某種疾病、病症或狀況發生或發展的速度，降低發展出某種疾病、病症或狀況的風險，預防或延遲與某種疾病、病症或狀況相關的症狀發展，減少或終止與某種疾病、病症或狀況相關的症狀，產生某種疾病、病症或狀況的完全或部分的逆轉，治癒某種疾病、病症或狀況，或以上的組合。

術語「診斷(diagnosis)」、「診斷(diagnose)」或「診斷(diagnosing)」係指病理狀態、疾病或狀況的鑑定，例如CD39相關疾病的鑑定，或指患有CD39相關疾病的可能會受益於特定的治療方案的個體的鑑定。在一些實施例中，診斷包含鑑定CD39的異常含量或活性。在一些實施例中，診斷係指在個體中鑑定癌症或自體免疫性疾病。

如本發明所用，術語「生物樣品」或「樣品」係指獲自或源自目標個體的生物組合物，其包含待表徵及/或待鑑定的細胞及/或其他分子實體，例如基於物理、生化、化學及/或生理特徵來表徵及/或鑑定。生物樣品包括但不限於藉由熟習此項技術者已知的任何方法獲得的個體的細胞、組織、器官及/或生物流體。在一些實施例中，生物樣品為流體樣品。在一些實施例中，流體樣品為全血、血漿、血清、黏液(包括鼻腔排泄物及痰)、腹膜液、胸膜液、胸腔液、唾液、尿液、滑液、腦脊髓液(CSF)、胸腔穿刺液、腹部流體、腹水或心包積液。在一些實施例中，生物學樣品為獲自個體的心臟、肝、脾、肺、腎、皮膚或血管的組織或細胞。

如本發明所用之，「CD39」亦稱為ENTPD1或ENTPD酶1，係指一種可將ATP轉化為AMP的完整膜蛋白。在結構上，CD39的特徵在於兩個跨膜域、一個較小的胞質域及一個較大的胞外疏水域。在某些實施例中，上述CD39為人類CD39。本發明所用之CD39可來自其他動物物種，例如小鼠及食蟹猴等。人類CD39蛋白的例示性序列揭示於NCBI Ref Seq No. NP_001767.3中。小鼠(Mus musculus )CD39蛋白的例示性序列揭示於NCBI Ref Seq No.NP_033978.1中。食蟹猴(Cynomolgus )CD39蛋白的例示性序列揭示於NCBI Ref Seq No.XP_015311945.1中。

除了CD39之外，ENTPD酶家族亦包含其他幾個成員，包括ENTPD酶2、3、4、5、6、7及8(亦稱為ENTPD2、3、4、5、6、7及8，在本發明中可互換使用)。四種ENTPD酶為典型的細胞表面定位酶，具有面向細胞外的催化位點(ENTPD酶1、2、3、8)。ENTPD酶5及6在異源表現後表現出細胞內定位且分泌。ENTPD酶4及7完全位於細胞內，面向細胞質細胞器內腔。在一些實施例中，本發明提供之抗體或其抗原結合片段特異性結合CD39(即ENTPD酶1)，但不與其他家族成員結合，例如ENTPD酶2、3、5或6。

術語「抗CD39抗體」係指能夠與CD39(例如，人類或猴CD39)特異性結合的抗體。術語「抗人類CD39抗體」係指能夠與人類CD39特異性結合的抗體。

如本發明所用，「CD39相關」的疾病、病症或狀況係指由CD39的表現或活性的增加或減少引起的、加劇的或與之相關的任何疾病或狀況。在一些實施例中，CD39相關的疾病、病症或狀況為免疫相關病症，例如自體免疫性疾病。在一些實施例中，CD39相關的疾病、病症或狀況係與過度細胞增殖有關的病症，例如癌症。在某些實施例中，CD39相關的疾病或狀況的特徵在於表現或過表現CD39及或CD39相關基因，例如ENTPD1、2、3、4、5、6、7或8基因。

術語「醫藥學上可接受之」係指所指的載劑、溶媒、稀釋劑、賦形劑及/或鹽，總的而言在化學上及/或在物理上與製劑中的其他配料相容，且在生理上與其接收者相容。

如本發明所用，術語「CD39陽性細胞」係指在細胞表面上表現CD39的細胞(例如，吞噬細胞)。抗 CD39 抗體

本發明提供了抗CD39抗體及其抗原結合片段。本發明提供之抗CD39抗體及抗原結合片段能夠與CD39特異性結合。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段以不超過10^-7 M、不超過8×10^-8 M、不超過5×10^-8 M、不超過2×10^-8 M、不超過8×10^-9 M、不超過5×10^-9 M、不超過2×10^-9 M、不超過10^-9 M、不超過8×10^-10 M、不超過7×10^-10 M或不超過6×10^-10 M的K_D 值與人類CD39特異性結合，上述K_D 值係藉由Biacore檢定法測定。Biacore檢定法基於表面電漿子共振技術(參見，例如，Murphy, M.等人,Current protocols in protein science , 第19章, 第19.14單元, 2006)。在某些實施例中，藉由本發明之實例5.1中所述的方法測定K_D 值。在某些實施例中，K_D 值在約25℃或約37℃下量測。在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段的在25℃下量測的K_D 值與在37℃下量測的K_D 值相當，例如在25℃下量測的K_D 值為在37℃下測得的K_D 值的約80%至約150%、約90%至約130%、或約90%至約120%、約90%至約110%。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段，以不超過10^-8 M、不超過8×10^-9 M、不超過5×10^-9 M、不超過4×10^-9 M、不超過3×10^-9 M、不超過2×10^-9 M、不超過1×10^-9 M、不超過9×10^-10 M、不超過8×10^-10 M、不超過7×10^-10 M或不超過6×10^-10 M的K_D 值特異性與人類CD39結合，上述K_D 值係藉由Octet檢定法測定。Octet檢定法係基於生物層干涉技術(參見，例如，Abdiche, Yasmina N.,等人Analytical biochemistry 386.2 (2009): 172-180及Sun Y S., Instrumentation Science & Technology, 2014, 42(2): 109-127)。在某些實施例中，藉由本發明之實例5.1中所述之方法測定K_D 值。

本發明提供之抗體或其抗原結合片段與人類CD39的結合亦可用「半最大有效濃度」(EC₅₀ )值表示，該值係指觀察到抗體的最大結合的50%時的抗體濃度。可藉由此項技術中已知的結合檢定法，例如直接或間接結合檢定法(例如酶聯免疫吸附檢定法(ELISA)、FACS檢定法及其他結合檢定法)來測定EC₅₀ 值。在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段以不超過10^-7 M、不超過8×10^-8 M、不超過5×10^-8 M、不超過2×10^-8 M、不超過10^-8 M、不超過8×10^-9 M、不超過5×10^-9 M、不超過2×10^-9 M、不超過10^-9 M、不超過8×10^-10 M、不超過7×10^-10 M或不超過6×10^-10 M的EC₅₀ (即50%結合濃度)與人類CD39特異性結合，上述EC₅₀ 值係藉由FACS(流式細胞螢光分選技術)檢定法測定。在某些實施例中，上述結合係藉由ELISA或FACS檢定法測定。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段與人類CD39(即ENTPD酶1)特異性結合。在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段不與ENTPD酶家族的其他成員結合。在某些實施例中，根據ELISA檢定法測定，本發明提供之抗體及其抗原結合片段與人類CD39特異性結合，但不與ENTPD酶2、3、5或6特異性結合。

在某些實施例中，例如，根據FACS檢定法測定，本發明提供之抗體及其抗原結合片段與人類CD39特異性結合，但不與小鼠CD39特異性結合。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段以不超過10^-7 M、不超過8×10^-8 M、不超過5×10^-8 M、不超過2×10^-8 M、不超過10^-8 M、不超過8×10^-9 M、不超過5×10^-9 M、不超過2×10^-9 M、不超過10^-9 M、不超過8×10^-10 M、或不超過7×10^-10 M或不超過6×10^-10 M的EC₅₀ 特異性地與食蟹猴CD39結合，上述EC₅₀ 藉由FACS檢定法測定。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段以不超過50 nM、不超過40 nM、不超過30 nM、不超過20 nM、不超過10 nM、不超過8 nM、不超過5 nM、不超過3 nM、不超過1 nM、不超過0.9 nM、不超過0.8 nM、不超過0.7 nM、不超過0.6 nM、不超過0.5 nM、不超過0.4 nM、不超過0.3 nM、不超過0.2 nM、不超過0.1 nM、不超過0.09 nM、不超過0.08 nM、不超過0.07 nM、不超過0.06 nM、不超過0.05 nM的IC₅₀ 抑制在表現CD39的細胞中的ATP酶活性，上述IC₅₀ 藉由ATP酶活性分析測定。可使用此項技術中已知的方法來確定ATP酶活性測定，例如藉由比色偵測作為ATP酶活性的結果而釋放的磷酸鹽。在某些實施例中，藉由本發明之實例3.3中描述之彼等方法確定ATP酶活性。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段能夠以不超過50 nM(例如，不超過40 nM、不超過30 nM、不超過20 nM、不超過10 nM、不超過5 nM、不超過3 nM、不超過2 nM、不超過1 nM、不超過0.5 nM或不超過0.2 nM)的濃度增強ATP介導的單核細胞活化，上述濃度藉由FACS分析CD80、CD86及/或CD40的表現來測定，其中CD80、CD86及/或CD40的上調指示單核細胞活化。可使用此項技術中已知的方法(例如本發明之實例5.5中描述之彼等方法)來確定ATP介導的單核細胞的活性。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段能夠以不超過25 nM、不超過20 nM、不超過15 nM、不超過10 nM、不超過9 nM、不超過8 nM、不超過7 nM、不超過6 nM、不超過5 nM、不超過4 nM、不超過3 nM、不超過2 nM或不超過1 nM的濃度增強PBMC中ATP介導的T細胞活化，上述濃度藉由IL-2分泌、IFN-γ分泌、CD4⁺ 或CD8⁺ T細胞增殖測定，例如本發明之實例5.5中描述之彼等方法來測定。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段能夠以不超過25 nM(或不超過10 nM、或不超過5 nM、或不超過1 nM、或不超過0.5 nM)的濃度增強ATP介導的樹突細胞(DC)活化，上述濃度藉由FACS檢定法分析CD83的表現來測定。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段能夠以不超過25 nM(或不超過10 nM、或不超過5 nM、或不超過1 nM、或不超過0.5 nM)的濃度增強ATP介導的DC活化，上述濃度藉由活化的DC促進T細胞增殖的能力來測定。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段能夠以不超過25 nM(或不超過10 nM、或不超過5 nM、或不超過1 nM、或不超過0.5 nM)的濃度增強ATP介導的DC活化，上述濃度藉由活化的DC促進混合淋巴細胞反應(MLR)分析中的IFN-γ產生的能力來測定。

可使用此項技術中已知的方法(例如本發明之實例5.5中描述之彼等方法)來確定ATP介導的DC成熟。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段能夠以不超過1 nM(例如，不超過0.1 nM、不超過0.01 nM)的濃度阻斷由腺苷(由ATP水解)誘導的CD4⁺ T細胞增殖的抑制，上述濃度藉由FACS檢定法來測定。可使用此項技術中已知的方法(例如本發明之實例3.4中描述之彼等方法)來確定T細胞增殖。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段能夠以NK細胞或巨噬細胞依賴性方式抑制哺乳動物中的腫瘤生長。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段能夠逆轉經eATP抑制的人CD8⁺ T細胞增殖，藉由T細胞增殖、CD25⁺ 細胞及活細胞群體測定。可使用此項技術中已知的方法(例如本發明之實例3.4中描述之彼等方法)來確定T細胞增殖百分比(%)、CD25⁺ 細胞百分比(%)及活細胞百分比(%)。

在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段能夠以不超過50 nM(或不超過12.5 nM、或不超過3.13 nM、或不超過0.78 nM、或不超過0.2 nM、或不超過0.049 nM、或不超過0.012 nM、或不超過0.003 nM、或不超過0.0008 nM)的濃度增強由LPS刺激誘導的人類巨噬細胞IL1β釋放，上述濃度藉由ELISA檢定法測定。可使用此項技術中已知的方法(例如本發明之實例5.5.4中描述之彼等方法)來確定巨噬細胞IL1β釋放。例示的抗 CD39 抗體

在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體(例如，抗人類CD39抗體)及其抗原結合片段包括一或多個(例如，1個、2個、3個、4個、5個或6個)CDR，上述CDR包括選自下組之序列：NYGMN (SEQ ID NO：1)、KYWMN (SEQ ID NO：2)、NYWMN (SEQ ID NO：3)、DTFLH (SEQ ID NO：4)、DYNMY (SEQ ID NO：5)、DTYVH (SEQ ID NO：6)、LINTYTGEPTYADDFKD (SEQ ID NO：7)、EIRLKSNKYGTHYAESVKG (SEQ ID NO：8)、QIRLNPDNYATHX₁ AESVKG (SEQ ID NO：9)、X₅₈ IDPAX₅₉ X₆₀ NIKYDPKFQG (SEQ ID NO：151)、FIDPYNGYTSYNQKFKG (SEQ ID NO：11)、RIDPAIDNSKYDPKFQG (SEQ ID NO：12)、KGIYYDYVWFFDV (SEQ ID NO：13)、QLDLYWFFDV (SEQ ID NO：14)、HGX₂ RGFAY (SEQ ID NO：15)、SPYYYGSGYRIFDV (SEQ ID NO：16)、IYGYDDAYYFDY (SEQ ID NO：17)、YYCALYDGYNVYAMDY (SEQ ID NO：18)、KASQDINRYIA (SEQ ID NO：19)、RASQSISDYLH (SEQ ID NO：20)、KSSQSLLDSDGRTHLN (SEQ ID NO：21)、SAFSSVNYMH (SEQ ID NO：22)、SATSSVSYMH (SEQ ID NO：23)、RSSKNLLHSNGITYLY (SEQ ID NO：24)、YTSTLLP (SEQ ID NO：25)、YASQSIS (SEQ ID NO：26)、LVSKLDS (SEQ ID NO：27)、TTSNLAS (SEQ ID NO：28)、STSNLAS (SEQ ID NO：29)、RASTLAS (SEQ ID NO：30)、LQYSNLLT (SEQ ID NO：31)、QNGHSLPLT (SEQ ID NO：32)、WQGTLFPWT (SEQ ID NO：33)、QQRSTYPFT (SEQ ID NO：34)、QQRITYPFT (SEQ ID NO：35)及AQLLELPHT (SEQ ID NO：36)，其中X₁ 為Y或F，X₂ 為S或T，X₅₈ 為R或K，X₅₉ 為N、G、S或Q，X₆₀ 為G、A或D。在某些實施例中，本發明進一步包括對SEQ ID NO：1-9、11-36及151中的任一個序列具有不超過一個、兩個或三個胺基酸殘基取代的抗體及其抗原結合片段。

本發明所使用之抗體「mAb13」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區的單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：42所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：51所示之序列。

本發明所使用之抗體「mAb14」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區的單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：43所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：52所示之序列。

本發明所使用之抗體「mAb19」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區的單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：44所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：53所示之序列。

本發明所使用之抗體「mAb21」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區的單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：45所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：54所示之序列。

本發明所使用之抗體「mAb23」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區的單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：47所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：56所示之序列。

本發明所使用之抗體「mAb34」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區的單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：49所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：58所示之序列。

本發明所使用之抗體「mAb35」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區的單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：50所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：59所示之序列。

在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體及其抗原結合片段包括抗體mAb13、mAb14、mAb19、mAb21、mAb23、mAb34或mAb35的一或多個(例如，1個、2個、3個、4個、5個或6個)CDR序列。

在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括選自下組之胺基酸序列：SEQ ID NO：1-6；上述HCDR2包括選自下組之胺基酸序列：SEQ ID NO：7-9、11-12及151；上述HCDR3包括選自下組之胺基酸序列：SEQ ID NO：13-18；上述LCDR1包括選自下組之胺基酸序列：SEQ ID NO：19-24；上述LCDR2包括選自下組之胺基酸序列：SEQ ID NO：25-30；上述LCDR3包括選自下組之胺基酸序列：SEQ ID NO：31-36。

在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：7所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：13所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：19所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：25所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：31所示之序列。

在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：2所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：8所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：14所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：20所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：32所示之序列。

在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：3所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：37所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：40所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：21所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：27所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：33所示之序列。

在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：3所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：38所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：41所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：21所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：27所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：33所示之序列。

在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：4所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：10所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：16所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：28所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：34所示之序列。

在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：5所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：11所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：23所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：29所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：35所示之序列。

在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：6所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：12所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：18所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：24所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：30所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列。

以下的表1中顯示了抗體mAb13、mAb14、mAb19、mAb21、mAb23、mAb34及mAb35的CDR胺基酸序列。CDR邊界根據Kabat規則定義或鑑定。以下的表2中顯示了抗體mAb13、mAb14、mAb19、mAb21、mAb23、mAb34及mAb35的重鏈可變區及輕鏈可變區的胺基酸序列。表 1 ： 7 個單株抗體的 CDR 胺基酸序列

抗體		CDR1	CDR2	CDR3
mAb13	HCDR	SEQ ID NO：1 NYGMN	SEQ ID NO：7 LINTYTGEPTYADDFKD	SEQ ID NO：13 KGIYYDYVWFFDV
LCDR	SEQ ID NO：19 KASQDINRYIA	SEQ ID NO：25 YTSTLLP	SEQ ID NO：31 LQYSNLLT
mAb14	HCDR	SEQ ID NO：2 KYWMN	SEQ ID NO：8 EIRLKSNKYGTHYAESVKG	SEQ ID NO：14 QLDLYWFFDV
LCDR	SEQ ID NO：20 RASQSISDYLH	SEQ ID NO：26 YASQSIS	SEQ ID NO：32 QNGHSLPLT
mAb19	HCDR	SEQ ID NO：3 NYWMN	SEQ ID NO：37 QIRLNPDNYATHYAESVKG	SEQ ID NO：40 HGSRGFAY
LCDR	SEQ ID NO：21 KSSQSLLDSDGRTHLN	SEQ ID NO：27 LVSKLDS	SEQ ID NO：33 WQGTLFPWT
mAb21	HCDR	SEQ ID NO：3 NYWMN	SEQ ID NO：38 QIRLNPDNYATHFAESVKG	SEQ ID NO：41 HGTRGFAY
LCDR	SEQ ID NO：21 KSSQSLLDSDGRTHLN	SEQ ID NO：27 LVSKLDS	SEQ ID NO：33 WQGTLFPWT
mAb23	HCDR	SEQ ID NO：4 DTFLH	SEQ ID NO：10 RIDPANGNIKYDPKFQG	SEQ ID NO：16 SPYYYGSGYRIFDV
LCDR	SEQ ID NO：22 SAFSSVNYMH	SEQ ID NO：28 TTSNLAS	SEQ ID NO：34 QQRSTYPFT
mAb34	HCDR	SEQ ID NO：5 DYNMY	SEQ ID NO：11 FIDPYNGYTSYNQKFKG	SEQ ID NO：17 IYGYDDAYYFDY
LCDR	SEQ ID NO：23 SATSSVSYMH	SEQ ID NO：29 STSNLAS	SEQ ID NO：35 QQRITYPFT
mAb35	HCDR	SEQ ID NO：6 DTYVH	SEQ ID NO：12 RIDPAIDNSKYDPKFQG	SEQ ID NO：18 YYCALYDGYNVYAMDY
LCDR	SEQ ID NO：24 RSSKNLLHSNGITYLY	SEQ ID NO：30 RASTLAS	SEQ ID NO：36 AQLLELPHT

表 2 ： 7 個單株抗體的可變區胺基酸序列

抗體	VH	VL
mAb13	SEQ ID NO：42 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGLINTYTGEPTYADDFKDRFAFSLETSASTAFLQINNLKDEDMATYFCARKGIYYDYVWFFDVWGAGTTVTVSS	SEQ ID NO：51 DIQMTQSPSSLSTSLGGKVSITCKASQDINRYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLLPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYFCLQYSNLLTFGGGTKLEIK
mAb14	SEQ ID NO：43 EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSKYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNKYGTHYAESVKGRFTISRDDSKNNVYLQMNNLRPEDTGIYYCTTQLDLYWFFDVWGAGTTVTVSS	SEQ ID NO：52 DIVMTQSPAILSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSNFTLSINSVEPEDVGVYFCQNGHSLPLTFGAGTKLELR
mAb19	SEQ ID NO：44 EVKLEKSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRLNPDNYATHYAESVKGRFTISRDDYKNSVYLQMSSLRAEDSGIYYCTQHGSRGFAYWGQGTLVTVS	SEQ ID NO：53 DVVMTQTPHTMSITIGQPASISCKSSQSLLDSDGRTHLNWLFQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTLFPWTFGGGTKLEIK
mAb21	SEQ ID NO：45 EVKLEKSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRLNPDNYATHFAESVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTEHGTRGFAYWGQGTLVTVSE	SEQ ID NO：54 DVVMTQTPLTLSITIGQPASISCKSSQSLLDSDGRTHLNWFFQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTLFPWTFGGGTKLEIK
mAb23	SEQ ID NO：47 EVQLQQSGAELLRPGASVKLSCTASGYNLKDTFLHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNIKYDPKFQGKATLTADTSSNTAYLQLISLTSEDTAVYYCANSPYYYGSGYRIFDVWGAGTTVTVSS	SEQ ID NO：56 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSAFSSVNYMHWYQQKPGTSPKLLIYTTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSTYPFTFGSGTKLEIQ
mAb34	SEQ ID NO：49 EIQVQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMYWVKQSHGKSLEWIGFIDPYNGYTSYNQKFKGKATLTIDKSSSTAFMHLNSLTSEDSAVYYCAIYGYDDAYYFDYWGQGTTLTVSS	SEQ ID NO：58 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSATSSVSYMHWFRQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMAAEDAATYYCQQRITYPFTFGSGTKLEIT
mAb35	SEQ ID NO：50 EVRLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIEDTYVHWMKQRPEQGLEWIGRIDPAIDNSKYDPKFQGKATITAVSSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCALYDGYNVYAMDYWGQGTSVTVSS	SEQ ID NO：59 DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKNLLHSNGITYLYWYLQRPGQSPQLLIYRASTLASGVPNRFSGSESGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQLLELPHTFGGGTKLEIK

假設抗體mAb13、mAb14、mAb19、mAb21、mAb23、mAb34及mAb35均可結合至CD39，且抗原結合特異性主要由CDR1、CDR2及CDR3區提供，抗體mAb13、mAb14、mAb19、mAb21、mAb23、mAb34及mAb35的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列以及LCDR1、LCDR2及LCDR3序列可經「混合且匹配」(即，來自不同抗體的CDR可經混合且匹配，但每個抗體必須包含HCDR1、HCDR2及HCDR3以及LCDR1、LCDR2及LCDR3)，以產生本發明的抗CD39結合分子。可使用上文及實例中所述的結合測定法來測試此類「混合且匹配」抗體的CD39結合。較佳地，當VH CDR序列經混合且匹配時，來自特定VH序列的HCDR1、HCDR2及/或HCDR3序列經結構相似的CDR序列取代。同樣，當VL CDR序列經混合且匹配時，來自特定VL序列的LCDR1、LCDR2及/或LCDR3序列較佳經結構相似的CDR序列取代。例如，抗體mAb13及mAb19的HCDR1具有一些結構相似性，因此易於混合且匹配。對於熟習此項技術者顯而易見的是，可藉由將一或多個VH及/或VL CDR序列用本發明揭示之單株抗體mAb13、mAb14、mAb19、mAb21、mAb23、mAb34及mAb35的CDR序列中結構相似的序列替換來產生新的VH及VL序列。

已知CDR負責抗原結合。然而，已發現並非所有6個CDR均為必不可少的或不可改變的。換言之，可替換或改變或修飾抗CD39抗體mAb13、mAb14、mAb19、mAb21、mAb23、mAb34及mAb35中之一或多個CDR，但基本上保留與CD39的特異性結合親和性。

在某些實施例中，本發明所述之抗體及其抗原結合片段包含適當的框架區(FR)序列，只要所述之抗體及其抗原結合片段可與CD39特異性結合。上述表1中所示之CDR序列獲取自小鼠抗體，但可使用此項技術中熟知之合適方法(例如，重組技術)將其移植至任何合適物種(例如，小鼠、人、大鼠、兔以及其他)之任何合適的FR序列。

在某些實施例中，本發明所述之抗體及其抗原結合片段為人源化的。預期人源化抗體或其抗原結合片段在人體具有降低的免疫原性。人源化抗體或其抗原結合片段在其可變區為嵌合的，因為非人CDR序列被移植至人或基本上為人的FR序列中。抗體或抗原結合片段之人源化基本上可藉由在人類免疫球蛋白基因上用非人(例如，小鼠)CDR基因替換對應的人CDR基因來完成(參見，例如Jones等人 (1986)Nature 321:522-525; Riechmann等人 (1988)Nature 332:323-327; Verhoeyen等人 (1988)Science 239:1534-1536)。

可使用此項技術中熟知之方法選擇合適的人重鏈及輕鏈可變域，以達到此目的。在一個例示性實例中，可使用「最佳擬合(best-fit)」方法，其中對非人(例如，嚙齒動物)抗體可變域序列進行篩選，或將其與已知的人可變域序列之資料庫進行BLAST比對，且識別出最接近非人查詢序列之人序列，用作用於移植非人CDR序列之人框架(參見，例如Sims等人, (1993)J. Immunol. 151:2296; Chothia等人 (1987)J. Mot. Biol. 196:901)。或者，可將源自所有人抗體之共有序列之框架用於移植非人CDR(參見例如Carter等人 (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 89:4285; Presta等人 (1993)J. Immunol. ,151:2623)。

在某些實施例中，本發明提供c14之16種人源化抗體，其分別被命名為hu14.H1L1、hu14.H2L1、hu14.H3L1、hu14.H4L1、hu14.H1L2、hu14.H2L2、hu14.H3L2、hu14.H4L2、hu14.H1L3、hu14.H2L3、hu14.H3L3、hu14.H4L3、hu14.H1L4、hu14.H2L4、hu14.H3L4及hu14.H4L4。c14之每種人源化抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區的SEQ ID NO如實例5.1之表16所示。c14之16種人源化抗體中之每一者均包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：2所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：8所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：14所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：20所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：32所示之序列。CDR邊界係根據Kabat規則定義或鑑定。

在一些實施例中，本發明提供c23之31種人源化抗體，其分別被命名為hu23.H1L1、hu23.H2L1、hu23.H3L1、hu23.H4L1、hu23.H1L2、hu23.H2L2、hu23.H3L2、hu23.H4L2、hu23.H1L3、hu23.H2L3、hu23.H3L3、hu23.H4L3、hu23.H1L4、hu23.H2L4、hu23.H3L4、hu23.H4L4、hu23.H5L1、hu23.H6L1、hu23.H7L1、hu23.H1L5、hu23.H5L5、hu23.H6L5、hu23.H7L5、hu23.H1L6、hu23.H5L6、hu23.H6L6、hu23.H7L6、hu23.H1L7、hu23.H5L7、hu23.H6L7及hu23.H7L7。c23之每種人源化抗體之重鏈及輕鏈可變區的SEQ ID NO如實例5.1之表13及14所示。c23之31種人源化抗體中之每一者均包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：4所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：10所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：16所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：28所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：34所示之序列。CDR邊界係根據Kabat規則定義或鑑定。

在一些實施例中，本發明亦提供6種人源化抗體，其與c23具有相同的CDR，不同之處在於HCDR2之胺基酸序列不同。在一些實施例中，此等c23變體(c23')之人源化抗體之HCDR2的胺基酸序列包括如X₅₈ IDPAX₅₉ X₆₀ NIKYDPKFQG(SEQ ID NO：151)所示之胺基酸序列，其中X₅₈ 為R或K，X₅₉ 為N、G、S或Q，X₆₀ 為G、A或D。在一些實施例中，此等c23變體(c23')之人源化抗體之HCDR2的胺基酸序列包括選自下組之序列：RIDPAGGNIKYDPKFQG(SEQ ID NO：134)、RIDPASGNIKYDPKFQG(SEQ ID NO：135)、RIDPAQGNIKYDPKFQG(SEQ ID NO：136)、RIDPANANIKYDPKFQG(SEQ ID NO：137)、RIDPANDNIKYDPKFQG(SEQ ID NO：138)及KIDPANGNIKYDPKFQG(SEQ ID NO：139)。CDR邊界係根據Kabat規則定義或鑑定。

在一些實施例中，本發明亦提供藉由酵母展示之c23變體之4種人源化抗體，其被命名為hu23.201、hu23.203、hu23.207及hu23.211。人源化抗體hu23.201、hu23.203、hu23.207及hu23.211之重鏈可變區及輕鏈可變區如實例5.1之表15所示。4種人源化抗體hu23.201、hu23.203、hu23.207及hu23.211中之每一者均包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：4所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：10所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：16所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：28所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：34所示之序列。CDR邊界係根據Kabat規則定義或鑑定。

下表3示出了人源化c14重鏈可變區之4個變體(即hu14.VH_1、hu14.VH_2、hu14.VH_3及hu14.VH_4)及人源化c14輕鏈可變區之4個變體(即hu14.VL_1、hu14.VL_2、hu14.VL_3及hu14.VL_4)。下表4示出了人源化c14重鏈及輕鏈可變區之FR之胺基酸序列。下表5示出了嵌合抗體c14之16種人源化抗體之重鏈及輕鏈的FR胺基酸序列，16種人源化抗體分別被命名為hu14.H1L1、hu14.H2L1、hu14.H3L1、hu14.H4L1、hu14.H1L2、hu14.H2L2、hu14.H3L2、hu14.H4L2、hu14.H1L3、hu14.H2L3、hu14.H3L3、hu14.H4L3、hu14.H1L4、hu14.H2L4、hu14.H3L4、hu14.H4L4。此16種人源化抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區如實例5.1之表16所示。表 3 ： c14 人源化抗體之人源化可變區之胺基酸序列

抗體	VH	VL
hu14.H1L1	hu14.VH_1; SEQ ID NO：68 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSKYWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRLKSNKYGTHYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTQLDLYWFFDVWGQGTTVTVSS	hu14.VL_1; SEQ ID NO：69 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQAPRLLIYYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSLPLTFGGGTKLEIK
hu14.H2L2	hu14.VH_2; SEQ ID NO：70 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSKYWMNWVRQSPGKGLEWVGEIRLKSNKYGTHYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTQLDLYWFFDVWGQGTTVTVSS	hu14.VL_2; SEQ ID NO：71 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQSPRLLIYYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQNGHSLPLTFGGGTKLEIK
hu14.H3L3	hu14.VH_3; SEQ ID NO：72 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSKYWMNWVRQSPGKGLEWVAEIRLKSNKYGTHYAESVKGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCTTQLDLYWFFDVWGQGTTVTVSS	hu14.VL_3; SEQ ID NO：73 EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQSPRLLIYYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQNGHSLPLTFGGGTKLEIK
hu14.H4L4	hu14.VH_4; SEQ ID NO：74 EVQLVESGGGLVKPGGSMRLSCAASGFTFSKYWMNWVRQSPGKGLEWVAEIRLKSNKYGTHYAESVKGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCTTQLDLYWFFDVWGQGTTVTVSS	hu14.VL_4; SEQ ID NO：75 EIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQSPRLLIYYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQNGHSLPLTFGGGTKLEIK

表 4 ： c14 人源化抗體之人源化 FR 之胺基酸序列

SEQ ID NO.	序列
79	WGQGTTVTVSS
98	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC
104	WYQQKPGQAPRLLIY
106	GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
119	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS
120	EVQLVESGGGLVKPGGSMRLSCAASGFTFS
121	WVRQAPGKGLEWVG
122	WVRQSPGKGLEWVG
123	WVRQSPGKGLEWVA
124	RFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTT
125	RFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCTT
127	EIVLTQSPATLSVSPGERATLSC
128	EIVMTQSPATLSVSPGERVTLSC
130	WYQQKPGQSPRLLIY
132	GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFC
133	GIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFC
153	FGGGTKLEIK

表 5 ： c14 人源化抗體之每種人源化重鏈可變區及輕鏈可變區之 FR 胺基酸序列

VH 或VL 名稱	FR1 (SEQ ID NO.)	FR2 (SEQ ID NO.)	FR3 (SEQ ID NO.)	FR4 (SEQ ID NO.)
hu14.VH_1	119	121	124	79
hu14.VH_2	119	122	124	79
hu14.VH_3	119	123	125	79
hu14.VH_4	120	123	125	79
hu14.VL_1	98	104	106	153
hu14.VL_2	98	130	132	153
hu14.VL_3	127	130	133	153
hu14.VL_4	128	130	133	153

下表6示出了人源化c23重鏈可變區之7個變體(即hu23.VH_1、hu23.VH_2、hu23.VH_3、hu23.VH_4、hu23.VH_5、hu23.VH_6及hu23.VH_7)及人源化c23輕鏈可變區之7個變體(即hu23.VL_1、hu23.VL_2、hu23.VL_3、hu23.VL_4、hu23.VL_5、hu23.VL_6及hu23.VL_7)。下表7示出了藉由酵母展示獲得的用於嵌合抗體c23之4種人源化抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區的胺基酸序列。下表8示出了c23之35種人源化抗體之FR胺基酸序列。下表9示出了c23之35種人源化抗體之每條重鏈及輕鏈的FR胺基酸序列。表 6 ： c23 人源化抗體可變區之胺基酸序列

抗體	VH	VL
hu23.H1L1	hu23.VH_1, SEQ ID NO：60 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNLKDTFLHWVRQAPGQRLEWMGRIDPANGNIKYDPKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSPYYYGSGYRIFDVWGQGTTVTVSS	hu23.VL_1, SEQ ID NO：61 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAFSSVNYMHWYQQKPGQAPRLLIYTTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSTYPFTFGQGTKLEIK
hu23.H2L2	hu23.VH_2, SEQ ID NO：62 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNLKDTFLHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNIKYDPKFQGRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANSPYYYGSGYRIFDVWGQGTTVTVSS	hu23.VL_2, SEQ ID NO：63 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAFSSVNYMHWYQQKPGQAPRLLIYTTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSTYPFTFGQGTKLEIK
hu23.H3L3	hu23.VH_3, SEQ ID NO：64 QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYNLKDTFLHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGNIKYDPKFQGRATITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANSPYYYGSGYRIFDVWGQGTTVTVSS	hu23.VL_3, SEQ ID NO：65 EIVLTQSPATLSASPGERATLSCSAFSSVNYMHWYQQKPGQAPRLLIYTTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSMEPEDFAVYYCQQRSTYPFTFGQGTKLEIK
hu23.H4L4	hu23.VH_4, SEQ ID NO：66 QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYNLKDTFLHWVKQAPGQGLEWIGRIDPANGNIKYDPKFQGRATLTADTSASTAYLELSSLRSEDTAVYYCANSPYYYGSGYRIFDVWGQGTTVTVSS	hu23.VL_4, SEQ ID NO：67 EIVLTQSPATLSASPGERVTISCSAFSSVNYMHWYQQKPGQAPRLLIYTTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSMEPEDFAVYYCQQRSTYPFTFGQGTKLEIK
hu23.H5L5	hu23.VH_5, SEQ ID NO：140 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNLKDTFLHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNIKYDPKFQGRVTITADTSANTAYMELISLRSEDTAVYYCANSPYYYGSGYRIFDVWGQGTTVTVSS	hu23.VL_5, SEQ ID NO：143 QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAFSSVNYMHWYQQKPGQAPRLLIYTTSNLASGIPTRFSGSGSGTSYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSTYPFTFGQGTKLEIK
hu23.H6L6	hu23.VH_6, SEQ ID NO：141 EVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYNLKDTFLHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGNIKYDPKFQGRATITADTSANTAYMELISLRSEDTAVYYCANSPYYYGSGYRIFDVWGQGTTVTVSS	hu23.VL_6, SEQ ID NO：144 QIVLTQSPATLSASPGERATLSCSAFSSVNYMHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYTLTISSMEPEDFAVYYCQQRSTYPFTFGQGTKLEIK
hu23.H7L7	hu23.VH_7, SEQ ID NO：142 EVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYNLKDTFLHWVKQAPGQGLEWIGRIDPANGNIKYDPKFQGKATLTADTSANTAYLELISLRSEDTAVYYCANSPYYYGSGYRIFDVWGQGTTVTVSS	hu23.VL_7, SEQ ID NO：145 QIVLTQSPATLSASPGERVTITCSAFSSVNYMHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYTLTISSMEPEDFAVYYCQQRSTYPFTFGQGTKLEIK

表 7 ：藉由酵母展示獲得的 c23 之人源化抗體之人源化可變區的胺基酸序列

抗體	VH	VL
hu23.201	SEQ ID NO：146 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLKDTFLHWVRQAPGQRLEWMGRIDPANGNIKYDPKFQGRVTLTADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCANSPYYYGSGYRIFDVWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO：111 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAFSSVNYMHWYQQKPGQSPRLLIYTTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSTYPFTFGQGTKLEIK
hu23.203	SEQ ID NO：146 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLKDTFLHWVRQAPGQRLEWMGRIDPANGNIKYDPKFQGRVTLTADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCANSPYYYGSGYRIFDVWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO：112 EIVLTQSPATLTLSPGERATLSCSAFSSVNYMHWYQQKPGQAPRLLIYTTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSTYPFTFGQGTKLEIK
hu23.207	SEQ ID NO：147 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLKDTFLHWVRQAPGQRLEWMGKIDPANGNIKYDPKFQGRVTLTADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCANSPYYYGSGYRIFDVWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO：111 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAFSSVNYMHWYQQKPGQSPRLLIYTTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSTYPFTFGQGTKLEIK
hu23.211	SEQ ID NO：39 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLKDTFLHWVRQAPGQRLEWMGRIDPANGNIKYDPKFQGRVTITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCANSPYYYGSGYRIFDVWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO：63 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAFSSVNYMHWYQQKPGQAPRLLIYTTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSTYPFTFGQGTKLEIK

表 8 ： c23 人源化抗體之人源化 FR 之胺基酸序列

SEQ ID NO.	序列
79	WGQGTTVTVSS
83	FGQGTKLEIK
84	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNLK
85	QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYNLK
86	EVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYNLK
87	WVRQAPGQRLEWMG
88	WVRQAPGQGLEWMG
89	WVRQAPGQGLEWIG
90	WVKQAPGQGLEWIG
91	RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
92	RVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAN
93	RATITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAN
94	RATLTADTSASTAYLELSSLRSEDTAVYYCAN
95	RVTITADTSANTAYMELISLRSEDTAVYYCAN
96	RATITADTSANTAYMELISLRSEDTAVYYCAN
97	KATLTADTSANTAYLELISLRSEDTAVYYCAN
98	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC
99	EIVLTQSPATLSASPGERATLSC
100	EIVLTQSPATLSASPGERVTISC
101	QIVLTQSPATLSLSPGERATLSC
102	QIVLTQSPATLSASPGERATLSC
103	QIVLTQSPATLSASPGERVTITC
104	WYQQKPGQAPRLLIY
105	WYQQKPGQAPKLLIY
106	GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
107	GIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC
108	GIPARFSGSGSGTDYTLTISSMEPEDFAVYYC
109	GIPTRFSGSGSGTSYTLTISSLEPEDFAVYYC
110	GVPTRFSGSGSGTSYTLTISSMEPEDFAVYYC
115	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLK
116	RVTLTADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAN
117	RVTITADTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAN
118	WGQGTLVTVSS
129	EIVLTQSPATLTLSPGERATLSC
130	WYQQKPGQSPRLLIY
131	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLK

表 9 ： c23 之人源化抗體之每種人源化重鏈可變區及輕鏈可變區的 FR 胺基酸序列

VH 或VL 名稱	FR1 (SEQ ID NO.)	FR2 (SEQ ID NO.)	FR3 (SEQ ID NO.)	FR4 (SEQ ID NO.)
hu23.VH_1	84	87	91	79
hu23.VH_2	84	88	92	79
hu23.VH_3	85	89	93	79
hu23.VH_4	85	90	94	79
hu23.VH_5	84	88	95	79
hu23.VH_6	86	89	96	79
hu23.VH_7	86	90	97	79
hu23.VH_201	131	87	116	118
hu23.VH_207	115	87	116	118
hu23.VH_211	115	87	117	118
hu23.VL_1	98	104	106	83
hu23.VL_2	98	104	107	83
hu23.VL_3	99	104	108	83
hu23.VL_4	100	104	108	83
hu23.VL_5	101	104	109	83
hu23.VL_6	102	105	110	83
hu23.VL_7	103	105	110	83
hu23.VL_201	98	130	107	83
hu23.VL_203	129	104	107	83
hu23.VL_211	98	104	107	83

在某些實施例中，本發明提供之人源化抗體或其抗原結合片段基本上由除了非人CDR序列以外的所有人的序列組成。在一些實施例中，可變區FR及恆定區(若存在)全部或基本上來自人類免疫球蛋白序列。人FR序列及人恆定區序列可源自不同的人類免疫球蛋白基因，例如，源自一種人抗體之FR序列及源自另一種人抗體之恆定區。在一些實施例中，人源化抗體或其抗原結合片段包含人重鏈HFR1-4及/或輕鏈LFR1-4。

在一些實施例中，源自人之FR區可包含與其所源自之人類免疫球蛋白相同的胺基酸序列。在一些實施例中，人FR之一或多個胺基酸殘基由來自親本非人抗體之對應殘基取代。此在某些實施例中係需要的，以使人源化抗體或其片段密切接近非人親本抗體結構，以最優化結合特徵(例如，增加結合親和性)。在某些實施例中，本發明所述之人源化抗體或其抗原結合片段包含在各個人FR序列中不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基取代，或在重鏈可變區或輕鏈可變區之所有FR序列中不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基取代。在一些實施例中，此類胺基酸殘基之變化可能僅存在於重鏈FR區、僅存在於輕鏈FR區，或在兩條鏈上均存在。在某些實施例中，人FR序列之一或多個胺基酸經隨機突變以增加結合親和性。在某些實施例中，人FR序列之一或多個胺基酸經反向突變為親本非人抗體之相應胺基酸，以增加結合親和性。

在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗CD39抗體及其抗原結合片段，其包括重鏈HFR1、重鏈HFR2、重鏈HFR3及重鏈HFR4，其中上述重鏈HFR1包括如X₁₉ VQLVX₂₀ SGX₂₁ X₂₂ X₂₃ X₂₄ KPGX₂₅ SX₂₆ X₂₇ X₂₈ SCX₂₉ ASGX₃₀ X₃₁ X₃₂ X₃₃ (SEQ ID NO：76)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述重鏈HFR2包括如WVX₃₄ QX₃₅ PGX₃₆ X₃₇ LEWX₃₈ X₃₉ (SEQ ID NO：77)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述重鏈HFR3包括如X₄₀ X₄₁ TX₄₂ X₄₃ X₄₄ DX₄₅ SX₄₆ X₄₇ TX₄₈ YX₄₉ X₅₀ X₅₁ X₅₂ SLX₅₃ X₅₄ EDTAVYYCX₅₅ X₅₆ (SEQ ID NO：78)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述重鏈HFR4包括如WGQGTX₅₇ VTVSS (SEQ ID NO：126)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，其中X₁₉ 為Q或E，X₂₀ 為E或Q，X₂₁ 為G或A，X₂₂ 為G或E，X₂₃ 為L或V，X₂₄ 為V或K，X₂₅ 為G或A，X₂₆ 為L、M或V，X₂₇ 為R或K，X₂₈ 為V或L，X₂₉ 為A或K，X₃₀ 為F或Y，X₃₁ 為N或T，X₃₂ 為F或L，X₃₃ 為S或K，X₃₄ 為R或K，X₃₅ 為A或S，X₃₆ 為K或Q，X₃₇ 為R或G，X₃₈ 為M、I或V，X₃₉ 為G或A，X₄₀ 為R或K，X₄₁ 為V、A或F，X₄₂ 為I或L，X₄₃ 為S或T，X₄₄ 為R或A，X₄₅ 為D或T，X₄₆ 為K、A或S，X₄₇ 為S或N，X₄₈ 為L、V或A，X₄₉ 為M或L，X₅₀ 為Q或E，X₅₁ 為M或L，X₅₂ 為S、I或N，X₅₃ 為R或K，X₅₄ 為S或T，X₅₅ 為A或T，X₅₆ 為R、N或T，以及X₅₇ 為T或L。

在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗CD39抗體及其抗原結合片段，其包括輕鏈LFR1、輕鏈LFR2、輕鏈LFR3及輕鏈LFR4，其中上述輕鏈LFR1包括如X₃ IVX₄ TQSPATLX₅ X₆ SPGERX₇ TX₈ X₉ C (SEQ ID NO：80)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述輕鏈LFR2包括如WYQQKPGQX₁₀ PX₁₁ LLIY (SEQ ID NO：81)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述輕鏈LFR3包括如GX₁₂ PX₁₃ RFSGSGSGTX₁₄ X₁₅ TLTISSX₁₆ EPEDFAVYX₁₇ C (SEQ ID NO：82)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述輕鏈LFR4包括如FGX₁₈ GTKLEIK (SEQ ID NO：152)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，其中X₃ 為E或Q，X₄ 為L或M，X₅ 為S或T，X₆ 為L、V或A，X₇ 為A或V，X₈ 為L或I，X₉ 為S或T，X₁₀ 為A或S，X₁₁ 為R或K，X₁₂ 為I或V，X₁₃ 為A或T，X₁₄ 為D或S，X₁₅ 為F或Y，X₁₆ 為L、M或V，X₁₇ 為Y或F，X₁₈ 為G或Q。

在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗CD39抗體及其抗原結合片段，其包括重鏈HFR1、重鏈HFR2、重鏈HFR3及重鏈HFR4，上述重鏈HFR1包括如EVQLVESGGGLVKPGGSX₆₁ RLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：154)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述重鏈HFR2包括如WVRQX₆₂ PGKGLEWVX₆₃ (SEQ ID NO：155)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述重鏈HFR3包括如RFTISRDDSKNTX₆₄ YLQMNSLKTEDTAVYYCTT(SEQ ID NO：156)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述重鏈HFR4包括如WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：79)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，其中X₆₁ 為L或M，X₆₂ 為A或S，X₆₃ 為G或A，X₆₄ 為L或V。

在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗CD39抗體及其抗原結合片段，其包括輕鏈LFR1、輕鏈LFR2、輕鏈LFR3及輕鏈LFR4，上述輕鏈LFR1包括如EIVX₆₅ TQSPATLSX₆₆ SPGERX₆₇ TLSC(SEQ ID NO：157)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述輕鏈LFR2包括如WYQQKPGQX₆₈ PRLLIY(SEQ ID NO：158)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述輕鏈LFR3包括如GIPARFSGSGSGTDFTLTISSX₆₉ EPEDFAVYX₇₀ C(SEQ ID NO：159)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述輕鏈LFR4包括如FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：153)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，其中X₆₅ 為L或M，X₆₆ 為L或V，X₆₇ 為A或V，X₆₈ 為A或S，X₆₉ 為L或V，X₇₀ 為Y或F。

在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗CD39抗體及其抗原結合片段，其包括重鏈HFR1、重鏈HFR2、重鏈HFR3及重鏈HFR4，上述重鏈HFR1包括如X₇₁ VQLVQSGAEVKKPGASVKX₇₂ SCKASGYX₇₃ LK(SEQ ID NO：160)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述重鏈HFR2包括如WVX₇₄ QAPGQX₇₅ LEWX₇₆ G(SEQ ID NO：161)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述重鏈HFR3包括如X₇₇ X₇₈ TX₇₉ TX₈₀ DTSX₈₁ X₈₂ TAYX₈₃ ELX₈₄ SLRSEDTAVYYCAX₈₅ (SEQ ID NO：149)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述重鏈HFR4包括如WGQGTX₅₇ VTVSS(SEQ ID NO：126)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，其中X₅₇ 如以上所定義，X₇₁ 為Q或E，X₇₂ 為V或L，X₇₃ 為N或T，X₇₄ 為R或K，X₇₅ 為R或G，X₇₆ 為M或I，X₇₇ 為R或K，X₇₈ 為V或A，X₇₉ 為I或L，X₈₀ 為R或A，X₈₁ 為A或S，X₈₂ 為S或N，X₈₃ 為M或L，X₈₄ 為S或I，X₈₅ 為R或N。

在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗CD39抗體及其抗原結合片段，其包括輕鏈LFR1、輕鏈LFR2、輕鏈LFR3及輕鏈LFR4，上述輕鏈LFR1包括如X₈₆ IVLTQSPATLX₈₇ X₈₈ SPGERX₈₉ TX₉₀ X₉₁ C(SEQ ID NO：150)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述輕鏈LFR2包括如WYQQKPGQX₁₀ PX₁₁ LLIY(SEQ ID NO：81)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述輕鏈LFR3包括如GX₉₂ PX₉₃ RFSGSGSGTX₉₄ X₉₅ TLTISSX₉₆ EPEDFAVYYC(SEQ ID NO：148)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述輕鏈LFR4包括如FGQGTKLEIK(SEQ ID NO：83)所示之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，其中X₁₀ 及X₁₁ 如以上所定義，X₈₆ 為E或Q，X₈₇ 為S或T，X₈₈ 為L或A，X₈₉ 為A或V，X₉₀ 為L或I，X₉₁ 為S或T，X₉₂ 為I或V，X₉₃ 為A或T，X₉₄ 為D或S，X₉₅ 為F或Y，X₉₆ 為L或M。

在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗CD39抗體及其抗原結合片段，其包括重鏈HFR1、重鏈HFR2、重鏈HFR3及重鏈HFR4及/或輕鏈LFR1、輕鏈LFR2、輕鏈LFR3及輕鏈LFR4，上述重鏈HFR1包括選自下組之序列：SEQ ID NO：84-86、115、119-120及131，上述重鏈HFR2包括選自下組之序列：SEQ ID NO：87-90及121-123，上述重鏈HFR3包括選自下組之序列：SEQ ID NO：91-97、116-117及124-125；上述重鏈HFR4包括選自下組之序列：SEQ ID NO：79及118，上述輕鏈LFR1包括選自下組之序列：SEQ ID NO：98-103及127-129，上述輕鏈LFR2包括選自下組之序列：SEQ ID NO：104、105及130，上述輕鏈LFR3包括選自下組之序列：SEQ ID NO：106-110及132-133，上述輕鏈LFR4包括選自下組之序列：SEQ ID NO：83及153。

在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗CD39抗體及其抗原結合片段，其包括重鏈可變區內之HFR1、HFR2、HFR3及/或HFR4序列，上述重鏈可變區包括選自下組之序列：hu14.VH_1(SEQ ID NO：68)、hu14.VH_2(SEQ ID NO：70)、hu14.VH_3(SEQ ID NO：72)、hu14.VH_4(SEQ ID NO：74)、hu23.VH_1(SEQ ID NO：60)、hu23.VH_2(SEQ ID NO：62)、hu23.VH_3(SEQ ID NO：64)、hu23.VH_4(SEQ ID NO：66)、hu23.VH_5(SEQ ID NO：140)、hu23.VH_6(SEQ ID NO：141)、hu23.VH_7(SEQ ID NO：142)、hu23.201H(SEQ ID NO：146)、hu23.207H(SEQ ID NO：147)及hu23.211H(SEQ ID NO：39)。

在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗CD39抗體及其抗原結合片段，其包括輕鏈可變區內之LFR1、LFR2、LFR3及/或LFR4序列，上述輕鏈可變區包括選自下組之序列：hu14.VL_1(SEQ ID NO：69)、hu14.VL_2(SEQ ID NO：71)、hu14.VL_3(SEQ ID NO：73)、hu14.VL_4(SEQ ID NO：75)、hu23.VL_1(SEQ ID NO：61)、hu23.VL_2(SEQ ID NO：63)、hu23.VL_3(SEQ ID NO：65)、hu23.VL_4(SEQ ID NO：67)、hu23.VL_5(SEQ ID NO：143)、hu23.VL_6(SEQ ID NO：144)、hu23.VL_7(SEQ ID NO：145)、hu23.201L(SEQ ID NO：111)、hu23.203L(SEQ ID NO：112)及hu23.211L(SEQ ID NO：63)。

在某些實施例中，本發明提供人源化抗CD39抗體及其抗原結合片段，其包括包括選自下組之重鏈可變區序列：SEQ ID NO：39、60、62、64、66、68、70、72、74、140、141、142、146、147，及/或選自下組之輕鏈可變區序列：SEQ ID NO：61、63、65、67、69、71、73、75、111、112、143、144及145。

本發明亦提供了嵌合抗體c14之例示性人源化抗體，包括： 1) 「hu14.H1L1」，其包括如hu14.VH_1(SEQ ID NO：68)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_1(SEQ ID NO：69)所示之輕鏈可變區； 2) 「hu14.H2L1」，其包括如hu14.VH_2(SEQ ID NO：70)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_1(SEQ ID NO：69)所示之輕鏈可變區； 3) 「hu14.H3L1」，其包括如hu14.VH_3(SEQ ID NO：72)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_1(SEQ ID NO：69)所示之輕鏈可變區； 4) 「hu14.H4L1」，其包括如hu14.VH_4(SEQ ID NO：74)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_1(SEQ ID NO：69)所示之輕鏈可變區； 5) 「hu14.H1L2」，其包括如hu14.VH_1(SEQ ID NO：68)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_2(SEQ ID NO：71)所示之輕鏈可變區； 6) 「hu14.H2L2」，其包括如hu14.VH_2(SEQ ID NO：70)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_2(SEQ ID NO：71)所示之輕鏈可變區； 7) 「hu14.H3L2」，其包括如hu14.VH_3(SEQ ID NO：72)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_2(SEQ ID NO：71)所示之輕鏈可變區； 8) 「hu14.H4L2」，其包括如hu14.VH_4(SEQ ID NO：74)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_2(SEQ ID NO：71)所示之輕鏈可變區； 9) 「hu14.H1L3」，其包括如hu14.VH_1(SEQ ID NO：68)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_3(SEQ ID NO：73)所示之輕鏈可變區； 10) 「hu14.H2L3」，其包括如hu14.VH_2(SEQ ID NO：70)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_3(SEQ ID NO：73)所示之輕鏈可變區； 11) 「hu14.H3L3」，其包括如hu14.VH_3(SEQ ID NO：72)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_3(SEQ ID NO：73)所示之輕鏈可變區； 12) 「hu14.H4L3」，其包括如hu14.VH_4(SEQ ID NO：74)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_3(SEQ ID NO：73)所示之輕鏈可變區； 13) 「hu14.H1L4」，其包括如hu14.VH_1(SEQ ID NO：68)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_4(SEQ ID NO：75)所示之輕鏈可變區； 14) 「hu14.H2L4」，其包括如hu14.VH_2(SEQ ID NO：70)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_4(SEQ ID NO：75)所示之輕鏈可變區； 15) 「hu14.H3L4」，其包括如hu14.VH_3(SEQ ID NO：72)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_4(SEQ ID NO：75)所示之輕鏈可變區； 16) 「hu14.H4L4」，其包括如hu14.VH_4(SEQ ID NO：74)所示之重鏈可變區及如hu14.VL_4(SEQ ID NO：75)所示之輕鏈可變區。

本發明亦提供嵌合抗體c23之例示性人源化抗體，其包括： 1) 「hu23.H1L1」，其包括如hu23.VH_1(SEQ ID NO：60)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_1(SEQ ID NO：61)所示之輕鏈可變區； 2) 「hu23.H2L1」，其包括如hu23.VH_2(SEQ ID NO：62)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_1(SEQ ID NO：61)所示之輕鏈可變區； 3) 「hu23.H3L1」，其包括如hu23.VH_3(SEQ ID NO：64)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_1(SEQ ID NO：61)所示之輕鏈可變區； 4) 「hu23.H4L1」，其包括如hu23.VH_4(SEQ ID NO：66)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_1(SEQ ID NO：61)所示之輕鏈可變區； 5) 「hu23.H1L2」，其包括如hu23.VH_1(SEQ ID NO：60)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_2(SEQ ID NO：63)所示之輕鏈可變區； 6) 「hu23.H2L2」，其包括如hu23.VH_2(SEQ ID NO：62)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_2(SEQ ID NO：63)所示之輕鏈可變區； 7) 「hu23.H3L2」，其包括如hu23.VH_3(SEQ ID NO：64)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_2(SEQ ID NO：63)所示之輕鏈可變區； 8) 「hu23.H4L2」，其包括如hu23.VH_4(SEQ ID NO：66)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_2(SEQ ID NO：63)所示之輕鏈可變區； 9) 「hu23.H1L3」，其包括如hu23.VH_1(SEQ ID NO：60)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_3(SEQ ID NO：65)所示之輕鏈可變區； 10) 「hu23.H2L3」，其包括如hu23.VH_2(SEQ ID NO：62)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_3(SEQ ID NO：65)所示之輕鏈可變區； 11) 「hu23.H3L3」，其包括如hu23.VH_3(SEQ ID NO：64)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_3(SEQ ID NO：65)所示之輕鏈可變區； 12) 「hu23.H4L3」，其包括如hu23.VH_4(SEQ ID NO：66)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_3(SEQ ID NO：65)所示之輕鏈可變區； 13) 「hu23.H1L4」，其包括如hu23.VH_1(SEQ ID NO：60)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_4(SEQ ID NO：67)所示之輕鏈可變區； 14) 「hu23.H2L4」，其包括如hu23.VH_2(SEQ ID NO：62)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_4(SEQ ID NO：67)所示之輕鏈可變區； 15) 「hu23.H3L4」，其包括如hu23.VH_3(SEQ ID NO：64)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_4(SEQ ID NO：67)所示之輕鏈可變區； 16) 「hu23.H4L4」，其包括如hu23.VH_4(SEQ ID NO：66)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_4(SEQ ID NO：67)所示之輕鏈可變區； 17) 「hu23.H5L1」，其包括如hu23.VH_5(SEQ ID NO：140)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_1(SEQ ID NO：61)所示之輕鏈可變區； 18) 「hu23.H6L1」，其包括如hu23.VH_6(SEQ ID NO：141)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_1(SEQ ID NO：61)所示之輕鏈可變區； 19) 「hu23.H7L1」，其包括如hu23.VH_7(SEQ ID NO：142)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_1(SEQ ID NO：61)所示之輕鏈可變區； 20) 「hu23.H1L5」，其包括如hu23.VH_1(SEQ ID NO：60)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_5(SEQ ID NO：143)所示之輕鏈可變區； 21) 「hu23.H5L5」，其包括如hu23.VH_5(SEQ ID NO：140)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_5(SEQ ID NO：143)所示之輕鏈可變區； 22) 「hu23.H6L5」，其包括如hu23.VH_6(SEQ ID NO：141)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_5(SEQ ID NO：143)所示之輕鏈可變區； 23) 「hu23.H7L5」，其包括如hu23.VH_7(SEQ ID NO：142)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_5(SEQ ID NO：143)所示之輕鏈可變區； 24) 「hu23.H1L6」，其包括如hu23.VH_1(SEQ ID NO：60)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_6(SEQ ID NO：144)所示之輕鏈可變區； 25) 「hu23.H5L6」，其包括如hu23.VH_5(SEQ ID NO：140)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_6(SEQ ID NO：144)所示之輕鏈可變區； 26) 「hu23.H6L6」，其包括如hu23.VH_6(SEQ ID NO：141)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_6(SEQ ID NO：144)所示之輕鏈可變區； 27) 「hu23.H7L6」，其包括如hu23.VH_7(SEQ ID NO：142)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_6(SEQ ID NO：144)所示之輕鏈可變區； 28) 「hu23.H1L7」，其包括如hu23.VH_1(SEQ ID NO：60)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_7(SEQ ID NO：145)所示之輕鏈可變區； 29) 「hu23.H5L7」，其包括如hu23.VH_5(SEQ ID NO：140)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_7(SEQ ID NO：145)所示之輕鏈可變區； 30) 「hu23.H6L7」，其包括如hu23.VH_6(SEQ ID NO：141)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_7(SEQ ID NO：145)所示之輕鏈可變區； 31) 「hu23.H7L7」，其包括如hu23.VH_7(SEQ ID NO：142)所示之重鏈可變區及如hu23.VL_7(SEQ ID NO：145)所示之輕鏈可變區； 32) 「hu23.201」，其包括如hu23.201H(SEQ ID NO：146)所示之重鏈可變區及如hu23.201L(SEQ ID NO：111)所示之輕鏈可變區； 33) 「hu23.203」，其包括如hu23.201H(SEQ ID NO：146)所示之重鏈可變區及如hu23.203L(SEQ ID NO：112)所示之輕鏈可變區； 34) 「hu23.207」，其包括如hu23.207H(SEQ ID NO：147)所示之重鏈可變區及如hu23.201L(SEQ ID NO：111)所示之輕鏈可變區； 35) 「hu23.211」，其包括如hu23.211H(SEQ ID NO：39)所示之重鏈可變區及如hu23.211L(SEQ ID NO：63)所示之輕鏈可變區。

此等例示性人源化抗CD39抗體保留了對CD39之特異性結合能力或親和性，且在該方面至少與親本小鼠抗體mAb14或mAb23相當或甚至更好。

在某些實施例中，本發明所述之抗CD39抗體或其抗原結合片段包括上述重鏈可變區之全部或一部分，及/或上述輕鏈可變區之全部或一部分。在某些實施例中，本發明所述之抗CD39抗體或其抗原結合片段為單域抗體，其由本發明所述之重鏈可變區之全部或一部分組成。關於單域抗體之更多資訊為此項技術中已知的(參見，例如，美國專利號6,248,516)。

在某些實施例中，本發明所述之抗CD39抗體或其抗原結合片段進一步包括免疫球蛋白(Ig)恆定區，其視情況進一步包含重鏈及/或輕鏈恆定區。在某些實施例中，重鏈恆定區包含CH1、鉸鏈及/或CH2-CH3區(或視情況存在之CH2-CH3-CH4區)。在某些實施例中，本發明所述之抗CD39抗體或其抗原結合片段包括人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgM之重鏈恆定區。在某些實施例中，輕鏈恆定區包含Cκ或Cλ。本發明所述之抗CD39抗體或其抗原結合片段可與野生型恆定區序列相同或在一或多個突變點上不同。

在某些實施例中，上述重鏈恆定區包括Fc區。已知Fc區介導效應功能，例如抗體之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。不同Ig同種型之Fc區誘導效應功能的能力不同。例如，已認識到IgG1及IgG3之Fc區比IgG2及IgG4之Fc區更有效地誘導ADCC及CDC。在某些實施例中，本發明所述之抗CD39抗體或其抗原結合片段包括IgG1或IgG3同種型之Fc區，其可誘導ADCC或CDC；或包括IgG4或IgG2同種型之恆定區，其具有降低的或耗竭的效應功能。在一些實施例中，源自人類IgG1之上述Fc區具有降低的效應功能。在一些實施例中，源自人類IgG1之上述Fc區包括L234A及/或L235A突變。在某些實施例中，本發明所述之抗CD39抗體或其抗原結合片段包括野生型人類IgG4之Fc區或其他野生型人類IgG4對偶基因。在某些實施例中，本發明所述之抗CD39抗體或其抗原結合片段包括人類IgG4之Fc區，上述Fc區包括S228P突變及/或L235E突變及/或F234A及L235A突變。在某些實施例中，源自人類IgG4之上述Fc區包括S228P突變及/或F234A及L235A突變。

在某些實施例中，本發明所述之抗體或其片段具有足以用於診斷及/或治療用途的與人類CD39特異結合的親和性。

本發明所述之抗體或其片段可為單株抗體、多株抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、標記抗體、二價抗體、抗獨特型抗體或融合蛋白。重組抗體為在體外使用重組方法(而非在動物體內)製備之抗體。

在某些實施例中，本發明提供抗CD39抗體或其抗原結合片段，其與根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段競爭結合人類CD39。在某些實施例中，本發明提供抗CD39抗體或其抗原結合片段，其與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類CD39，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：52所示之序列。在某些實施例中，本發明提供抗CD39抗體或其抗原結合片段，其與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類CD39，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：44所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：53所示之序列。在某些實施例中，本發明提供抗CD39抗體或其抗原結合片段，其與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類CD39，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：45所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：54所示之序列，或與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類CD39，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：47所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如上述SEQ ID NO：56所示之序列。

在某些實施例中，本發明提供了與CD39之抗原決定基特異性結合之抗CD39抗體或其抗原結合片段，其中上述抗原決定基包括選自下組之一或多個殘基：Q96、N99、E143、R147、R138、M139、E142、K5、E100、D107、V81、E82、R111及V115。

在某些實施例中，上述抗原決定基包括選自下組之一或多個殘基：Q96、N99、E143及R147。在某些實施例中，上述抗原決定基包括殘基Q96、N99、E143及R147。

在某些實施例中，上述抗原決定基包括選自下組之一或多個殘基：R138、M139及E142。在某些實施例中，上述抗原決定基包括殘基R138、M139及E142。

在某些實施例中，上述抗原決定基包括選自下組之一或多個殘基：K5、E100及D107。在某些實施例中，上述抗原決定基包括殘基K5、E100及D107。

在某些實施例中，上述抗原決定基包括選自下組之一或多個殘基：V81、E82、R111及V115。在某些實施例中，上述抗原決定基包括殘基V81、E82、R111及V115。

在某些實施例中，上述CD39為人類CD39。在某些實施例中，上述CD39為人類CD39，其包含如SEQ ID NO：162所示之胺基酸序列。

在某些實施例中，所述之抗CD39抗體或其抗原結合片段不為抗體9-8B、抗體T895及抗體I394中之任一者。

本發明所使用之「9-8B」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：46所示之胺基酸序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：48所示之胺基酸序列。

本發明所使用之「T895」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：55所示之胺基酸序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：57所示之胺基酸序列。

本發明所使用之「I394」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：113所示之胺基酸序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：114所示之胺基酸序列。抗體變體

本發明提供之抗體及其抗原結合片段亦包含本發明提供之抗體序列之多種變體。

在某些實施例中，抗體變體在以上表1所示之一或多個CDR序列中、以上表4、5、8及9所示之本發明所述之重鏈可變區或輕鏈可變區序列的一或多個非CDR序列中、及/或恆定區(例如，Fc區)中包含一或多個修飾或取代。此等抗體變體保持其親本與CD39特異結合的親和性，但具有一或多種上述修飾或取代帶來的所需特性。例如上述抗體變體可具有改善的抗原結合親和性、改善的糖基化模式、降低的糖基化風險、減少的脫胺基作用、減少的或耗竭的效應功能、改善的FcRn受體結合、提高的藥代動力學半衰期、pH敏感性，及/或對綴合的相容性(例如一或多個引入之半胱胺酸殘基)。

可使用此項技術中熟知之方法，例如「丙胺酸掃描誘變」，篩選親本抗體序列以識別合適的或較佳的經修飾或取代之殘基(參見，例如Cunningham及Wells, (1989) Science，244:1081-1085)。簡要地說，可識別目標殘基(例如帶電的殘基，如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且由不帶電的或帶負電的胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)取代，產生經修飾之抗體，且針對目標特性對其進行篩選。若在一個特定胺基酸位置上之取代表現出了目標功能性改變，則該位置可被識別為潛在的用於修飾或取代之殘基。可藉由用另一種殘基(例如半胱胺酸殘基、帶正電荷的殘基等)取代來進一步評估上述潛在的殘基。親和性變體

抗體之親和性變體可在以上表1所示之一或多個CDR序列、以上表4、5、8、9所示之一或多個FR序列，或以上表2、3、6及7所示之重鏈或輕鏈可變區序列中包含修飾或取代。熟習此項技術者基於以上表1中之CDR序列以及以上表2、3、6及7中之可變區序列可容易地確定FR序列，因為在此項技術中眾所周知，在可變區中，CDR區之兩側為兩個FR區。上述親和性變體保持親本抗體的與CD39特異性結合之親和性，或甚至相對於親本抗體具有改進的與CD39特異性結合之親和性。在某些實施例中，CDR序列、FR序列或可變區序列中之至少一者(或全部)取代包含保守取代。

熟習此項技術者將理解，在以上表1所提供之CDR序列、在以上表2、3、6及7提供的可變區序列中，一或多個胺基酸殘基可經取代，而得到的抗體或抗原結合片段仍然保持與CD39的結合親和性或結合能力，或甚至具有改進的結合親和性或能力。可使用此項技術中熟知的各種方法來達到此目的。例如，可生成抗體變體庫(例如，Fab或scFv變體)，且用噬菌體展示技術表現，隨後針對與人類CD39結合的親和性對其進行篩選。又例如，可使用電腦軟體虛擬抗體與人類CD39的結合，且識別抗體上形成結合界面的胺基酸殘基。在取代中可避開此等殘基以防止結合親和性的降低，或可作為取代的目標以獲得更強的結合。

在某些實施例中，本發明所述之人源化抗體或其抗原結合片段在一或多個CDR序列中及/或一或多個FR序列中包含一或多個胺基酸殘基取代。在某些實施例中，親和性變體在CDR序列及/或FR序列中包含總共不超過20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個取代。

在某些實施例中，上述抗CD39抗體或其抗原結合片段包含1、2或3個CDR序列，上述CDR序列與以上表1中列出的序列具有至少80%(例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性，而同時保持相對於其親本抗體水準相似或更高的與CD39特異的結合親和性。

在某些實施例中，上述抗CD39抗體或其抗原結合片段包含一或多個可變區序列，上述可變區序列與以上表2、3、6及7中列出之序列具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性，而同時保持相對於其親本抗體水準相似或更高的與CD39特異的結合親和性。在一些實施例中，在以上表2、3、6及7列出之可變區的序列中，總共有1至10個胺基酸經取代、插入或缺失。在一些實施例中，上述取代、插入或缺失發生在CDR之外的區域(例如，在FR)。糖基化 變體

本發明所述之抗CD39抗體或其抗原結合片段亦包含糖基化變體，可獲取該糖基化變體以提高或降低抗體或其抗原結合片段的糖基化程度。

上述抗體或其抗原結合片段可包括一或多個引入或移除糖基化位點的修飾。糖基化位點為一種帶有側鏈的胺基酸殘基，碳水化合物部分(例如，寡糖結構)可附接至上述側鏈。抗體的糖基化通常為N連接的或O連接的。N連接的係指碳水化合物部分附接至天冬胺酸殘基的側鏈，例如，三肽序列中的天冬胺酸殘基，如天冬胺酸-X-絲胺酸及天冬胺酸-X-蘇胺酸，其中X為除脯胺酸以外的任何胺基酸。O連接的糖基化係指N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一的糖附接至羥基胺基酸，最常見的為附接至絲胺酸或蘇胺酸。可方便地移除天然糖基化位點，例如藉由改變胺基酸序列，使得存在於該序列中的上述三肽序列(對於N連接的糖基化位點)或絲胺酸或蘇胺酸殘基(對於O連接的糖基化位點)中的一個經取代。用相似的方式，可藉由引入此類三肽序列或絲胺酸或蘇胺酸殘基，產生新的糖基化位點。

某些實施例中，本發明提供抗CD39抗體或其抗原結合片段，在選自N55、G56及N297之位置上包含一或多個突變，以移除一或多個脫醯胺位。某些實施例中，本發明提供抗CD39抗體或其抗原結合片段，包括N55的突變(例如N55G、N55S或N55Q)及/或G56的突變(例如G56A、G56D)及/或N297的突變(例如N297A、N297Q或N297G)。測試了此等突變，且認為其不會對本發明提供抗體的結合親和力有負面影響。半胱胺酸 工程化的變體

本發明所述之抗CD39抗體及抗原結合片段亦包括半胱胺酸工程化的變體，其包括一或多個引入的游離半胱胺酸胺基酸殘基。

游離半胱胺酸殘基為並非二硫鍵之一部分的半胱胺酸殘基。半胱胺酸工程化的變體可用於藉由例如順丁烯二醯亞胺或鹵乙醯基，在工程化的半胱胺酸的位點與例如細胞毒性化合物及/或成像化合物、標籤或放射性同位素以及其他物質綴合。用於改造抗體或其抗原結合片段以引入游離半胱胺酸殘基的方法為此項技術中熟知的，參見例如WO2006/034488。Fc 變體

本發明所述之抗CD39抗體或其抗原結合片段亦包括Fc變體，其包括在Fc區及/或鉸鏈區的一或多個胺基酸殘基修飾或取代，例如，以提供改變的效應功能，例如ADCC及CDC。藉由抗體工程化改變ADCC活性的方法已經描述於先前技術中，參見，例如Shields RL.等人,J Biol Chem. 2001. 276(9): 6591-604; Idusogie EE.等人,J Immunol. 2000.164(8):4178-84; Steurer W.等人,J Immunol . 1995, 155(3): 1165- 74; Idusogie EE.等人,J Immunol . 2001, 166(4): 2571-5; Lazar GA.等人,PNAS , 2006, 103(11): 4005-4010; Ryan MC.等人,Mol. Cancer Ther. , 2007, 6: 3009-3018; Richards JO,.等人,Mol Cancer Ther. 2008, 7(8): 2517-27; Shields R. L.等人,J. Biol. Chem , 2002, 277: 26733-26740; Shinkawa T.等人,J. Biol. Chem , 2003, 278: 3466-3473。

本發明提供之抗體或抗原結合片段的CDC活性亦可例如藉由改善或減少C1q結合及/或CDC而改變(參見，例如WO99/51642；Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)；美國專利號5648260；美國專利號5624821；及關於Fc區變體的其他實例的WO94/29351)。可將選自Fc區的胺基酸殘基329、331及322的一或多個胺基酸替換為不同的胺基酸殘基，以改變C1q結合及/或減少或消除補體依賴性細胞毒性(CDC)(參見No. Idusogie等人的美國專利號6194551)。亦可引入一或多個胺基酸取代，以改變抗體固定補體的能力(參見Bodmer等人的PCT公開號WO 94/29351)。

在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體或其抗原結合片段具有降低的效應功能，且在IgG1選自下組的位點中包含一或多個胺基酸取代：234、235、237、238、268、297、309、330及331。在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體或其抗原結合片段為IgG1同種型，且包含一或多個選自下組之胺基酸取代：N297A、N297Q、N297G、L235E、L234A、L235A、L234F、L235E、P331S及其任何組合。在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體或其抗原結合片段為IgG1同種型，且包含L234A及L235A突變。在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體或其抗原結合片段為IgG2同種型，且包含一或多個選自下組之胺基酸取代：H268Q、V309L、A330S、P331S、V234A、G237A、P238S、H268A及其任何組合(例如，H268Q/V309L/A330S/P331S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S)。在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體或其抗原結合片段為IgG4同種型，且包含一或多個選自下組之胺基酸取代：S228P、N297A、N297Q、N297G、L235E、F234A、L235A及其任何組合。在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體或其抗原結合片段為IgG2/IgG4交叉同種型。IgG2/IgG4交叉同種型的實例在Rother RP等人,Nat Biotechnol 25:1256–1264 (2007)中進行了描述。

在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體及其抗原結合片段為IgG4同種型，且在228、234及235的一或多個位點包含一或多個胺基酸取代。在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體及抗原結合片段為IgG4同種型，且在Fc區具有S228P及/或L235E及/或F234A及L235A突變。

在某些實施例中，所述的抗CD39抗體或其抗原結合片段包含一或多個胺基酸取代，上述胺基酸取代可改善與新生兒Fc受體(FcRn)的pH依賴性結合。此類變體可具有延長的藥代動力學半衰期，因為其在酸性pH下與FcRn結合，使其得以免於在溶酶體中降解，且隨後經轉移且釋放至細胞外。工程化抗體或其抗原結合片段以改善與FcRn的結合親和性的方法為此項技術中熟知的，參見，例如，Vaughn, D.等人,Structure , 6(1): 63-73, 1998；Kontermann, R.等人,Antibody Engineering , 第1卷, 第27章: Engineering of the Fc region for improved PK, 由Springer出版, 2010；Yeung, Y.等人,Cancer Research , 70: 3269-3277 (2010)；及Hinton, P.等人,J. Immunology , 176:346-356 (2006)。

在某些實施例中，所述的抗CD39抗體或抗原結合片段包含位於Fc區界面的一或多個胺基酸取代，以便於及/或促進異二聚體化。此等修飾包括將突起引入至第一Fc多肽，以及將空腔引入第二Fc多肽，其中上述突起可位於上述空腔內，以促進上述第一及第二Fc多肽的相互作用，以形成異二聚體或複合體。產生具有此等修飾的抗體的方法為此項技術中熟知的，例如，如美國專利號5731168所述。抗原結合片段

本發明亦提供了抗CD39抗原結合片段。抗原結合片段的多種類型為此項技術中熟知的，且可基於本發明所述的抗CD39抗體進行研發，包括例示性抗體，其CDR示於上述的表1中，其可變區序列示於上述的表2、3、6及7中，及其不同的變體(例如，親和力變體、糖基化變體、Fc變體、半胱胺酸工程化抗體等等)。

在某些實施例中，本發明所述的抗CD39抗原結合片段為雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')₂ 、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂ 、雙特異性dsFv(dsFv－dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價的雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、奈米抗體(nanobody)、域抗體(domain antibody)及雙價域抗體。

多種技術可用於此類抗原結合片段的生產。例示性方法包括對完整抗體進行酶消化(參見例如Morimoto等人,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 以及Brennan等人,Science , 229:81 (1985))、由宿主細胞(如大腸桿菌)重組表現(例如對於Fab、Fv及ScFv抗體片段)、如上文討論的噬菌體展示庫篩選(例如對於ScFv)，以及化學耦合兩個Fab'-SH片段以形成F(ab')₂ 片段(Carter等人,Bio/Technology 10:163-167 (1992))。生產抗體片段的其他技術對於熟習此項技術者將為顯而易見的。

在某些實施例中，上述抗原結合片段為scFv。scFv的生成記述於例如WO 93/16185；美國專利號5571894；及5587458。scFv可在胺基末端或羧基末端與效應蛋白融合以獲得融合蛋白(參見例如Antibody Engineering，Borrebaeck編)。

在某些實施例中，本發明提供之抗CD39抗體或其抗原結合片段為二價、四價、六價或多價的。任何大於二價的分子被視為多價的，包括例如三價、四價、六價等。

若兩個結合位點均能特異性結合相同抗原或相同抗原決定基，則二價分子可為單特異性的。在某種實施例中，此提供了比對應的單價分子更強的與抗原或抗原決定基的結合。類似地，多價分子亦可為單特異性的。在某些實施例中，在二價或多價抗原結合部分中，結合位點的第一價及結合位點的第二價在結構上相同(即，具有相同的序列)或在結構上不同(即，具有不同的序列，但具有相同的特異性)。

若兩個結合位點對不同的抗原或抗原決定基具有特異性，則二價亦可為雙特異性的。此亦適用於多價分子。例如，當兩個結合位點對於第一抗原(或抗原決定基)而言為單特異性的，而第三結合位點對第二抗原(或抗原決定基)而言為特異性時，三價分子可為雙特異性的。雙特異性抗體

在某些實施例中，所述的抗CD39抗體或其抗原結合片段為雙特異性的。在某些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段進一步與具有不同於上述CD39抗體或其抗原結合片段的結合特異性的第二功能部分連接。

在某些實施例中，本發明提供的雙特異性抗體或其抗原結合片段能夠特異性結合至除CD39以外的第二抗原或CD39上之第二抗原決定基。在某些實施例中，上述第二抗原選自下組：TGFβ、CD73、PD1、PDL1、4-1BB、CTLA4、TIGIT、GITA、VISTA、TIGIT、B7-H3、B7-H4、B7-H5、CD112R、Siglec-15、LAG3及TIM-3。綴合物

在一些實施例中，上述抗CD39抗體或其抗原結合片段亦包括一或多個綴合物部分。上述綴合物部分可連接至上述抗體或其抗原結合片段。綴合物部分為可附接至上述抗體或其抗原結合片段的部分。可設想，本發明所述之抗體或其抗原結合片段可與多種綴合物部分連接(參見例如「Conjugate Vaccines」, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse及R. E. Lewis, Jr. (編), Carger Press, New York, (1989))。此等綴合物部分可藉由共價結合、親和結合、嵌入、協同結合(coordinate binding)、錯合(complexation)、結合(association)、混合(blending)或加入(addition)等其他方式與上述抗體或其抗原結合片段連接。在某些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段經連接子與一或多個綴合物連接。

在某些實施例中，本發明中提供的抗體或其抗原結合片段可經工程化以在抗原決定基結合部分之外含有特定位點，上述特定位點可用於與一或多個綴合物部分結合。例如，該位點可包括一或多個反應性的胺基酸殘基(例如半胱胺酸或組胺酸殘基)，以便於與綴合物部分的共價連接。

在某些實施例中，所述的抗體或其抗原結合片段可間接地或藉由另一綴合物部分與綴合物部分連接。例如，本發明提供之抗體或其抗原結合片段可與生物素綴合，然後間接地與第二綴合物綴合，上述第二綴合物與抗生物素蛋白綴合。在某些實施例中，上述綴合物部分包括清除修飾劑(例如，延長半衰期的聚合物(例如PEG))、化療劑、毒素、放射性同位素、鑭系元素、可偵測標記(例如，發光標記、螢光標記、酶受質標記)、DNA烷化劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白結合劑、純化部分或其他抗癌藥物。

「毒素」可為對細胞有害或可損害或殺死細胞之任何試劑。毒素之示例包括但不限於：紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊甙、長春新鹼、MMAE、MMAF、DM1、長春鹼、秋水仙鹼、阿黴素、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-去氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤黴素及其類似物、抗代謝物(例如甲胺蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪)、烷化劑(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法侖、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲黴素、絲裂黴素C及二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環類抗生素(例如柔紅黴素(以前的道諾黴素)及阿黴素)、抗生素(例如更生黴素(以前稱為放線菌素)、博來黴素、光神黴素及胺茴黴素(AMC))、抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)、拓樸異構酶抑制劑及微管蛋白結合劑。

可偵測標記之實例可包括螢光標記(例如螢光素、若丹明、丹磺醯、藻紅蛋白或德克薩斯紅)、酶-受質標記(例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如¹²³ I、¹²⁴ I、¹²⁵ I、¹³¹ I、³⁵ S、³ H、¹¹¹ In、¹¹² In、¹⁴ C、⁶⁴ Cu、⁶⁷ Cu、⁸⁶ Y、⁸⁸ Y、⁹⁰ Y、¹⁷⁷ Lu、²¹¹ At、¹⁸⁶ Re、¹⁸⁸ Re、¹⁵³ Sm、²¹² Bi及³² P、其他鑭系元素)、發光標記、發色團部分、地高辛、生物素/親和素、DNA分子或用於偵測的金。

在某些實施例中，綴合物部分可為清除修飾劑，其有助於增加抗體的半衰期。說明性實例包括水溶性聚合物(例如PEG、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、乙二醇/丙二醇共聚物等)。該聚合物可具有任何分子量，且可為支鏈或非支鏈的。連接至抗體的聚合物的數量可變化，且若連接的聚合物多於一種，則其可為相同或不同的分子。

在某些實施例中，綴合物部分可為純化部分，例如磁珠。

在某些實施例中，本發明提供之抗體或其抗原結合片段用作綴合物的基礎。多核苷酸及重組方法

本發明提供編碼上述抗CD39抗體或其抗原結合片段的分離的多核苷酸。本發明所用之術語「核酸」或「多核苷酸」係指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非另有說明，否則特定的多核苷酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾的變體(例如簡併的密碼子取代)、對偶基因、直向同源物、SNP及互補序列以及明確指出的序列。具體而言，簡併的密碼子取代可藉由產生此類序列來實現：其中一或多個選定的(或全部)密碼子的第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代(參見Batzer等人,Nucleic Acid Res . 19:5081 (1991); Ohtsuka等人,J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；及Rossolini等人,Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。

使用傳統的步驟，可容易地對編碼上述單株抗體的DNA進行分離及定序(例如藉由使用能夠與編碼上述抗體的重鏈及輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。編碼DNA亦可藉由合成方法獲得。

使用此項技術中熟知的重組技術，可將編碼上述抗CD39抗體或其抗原結合片段的分離的多核苷酸插入載體，用於進一步的選殖(DNA的擴增)或用於表現。有多種載體可供選擇。載體組分通常包括但不限於下列的一或多種：信號序列、複製起始點、一或多種標記基因、增強子元件、啟動子(例如SV40、CMV、EF-1α)及轉錄終止序列。

本發明提供包括分離的多核苷酸的載體。在某些實施例中，本發明提供的多核苷酸編碼抗體或其抗原結合片段、與核酸序列可操作連接的至少一種啟動子(例如SV40、CMV、EF-1α)及至少一種選擇標記。載體的實例包括但不限於：逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(例如單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌體及M13噬菌體、質體pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。

可將包含編碼上述抗體或其抗原結合片段之多核苷酸序列之載體引入宿主細胞，用於選殖或基因表現。適用於選殖或表現本發明中所述的載體中的DNA的宿主細胞為上述的原核、酵母或高等真核細胞。適用於本發明用途的原核細胞包括真細菌，如革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌，例如，腸桿菌科(Enterobacteriaceae )，例如，埃希氏菌屬(Escherichia )(例如，大腸桿菌(E. coli ))、腸桿菌屬(Enterobacter )、歐文氏菌屬(Erwinia )、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella )、變形桿菌屬(Proteus )、沙門氏菌屬(Salmonella )(例如，鼠傷寒沙門(氏)桿菌(Salmonella typhimurium ))、沙雷氏菌屬(Serratia )(例如，黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans ))、志賀氏菌屬(Shigella )、桿菌屬(Bacilli )(例如，枯草芽孢桿菌(B. subtilis )及地衣芽孢桿菌(B. licheniformis ))、假單胞菌屬(Pseudomonas )(例如，綠膿桿菌(P. aeruginosa )、以及鏈黴菌屬(Streptomyces )。

除了原核細胞以外，真核微生物如絲狀真菌或酵母亦可用作編碼抗CD39抗體之載體之合適的選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )，或麵包酵母為最常用的低等真核宿主微生物。但是，許多其他屬、種及株均比較常用且在本發明中適用，例如，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )；克魯維酵母屬(Kluyveromyces )宿主，例如，乳酸克魯維酵母(K. lactis )、脆壁克魯維酵母(K. fragilis )(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus )(ATCC 16,045)、魏氏克魯維酵母(K. wickeramii )(ATCC 24,178)、克魯雄酵母(K. waltii )(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum )(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans )及馬克斯克魯維酵母(K. marxianus )；解脂耶氏酵母(yarrowia )(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris )(EP 183,070)；假絲酵母(Candida )；里氏木黴(Trichoderma reesia )(EP 244,234)；鏈孢黴(Neurospora crassa )；西方許旺酵母(Schwanniomyces )，例如，西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentali )；及絲狀真菌，例如，脈孢菌(Neurospora )、青黴菌(Penicillium )、彎頸黴(Tolypocladium )及曲黴菌(Aspergillus )(例如，鉤巢麴黴(A. nidulans )及黑麴黴(A. niger ))。

本發明中提供的適用於表現糖基化抗體或其抗原結合片段的宿主細胞由多細胞生物衍生得到。無脊椎細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已發現多種桿狀病毒株(baculoviral strains)及其變體以及對應的許可性昆蟲宿主細胞(permissive insect host cells)，來自於諸如以下的宿主：草地夜蛾(Spodoptera frugiperda )(毛蟲)、埃及斑蚊(Aedes aegypti )(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus )(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster )(果蠅)及家蠶(Bombyx mori )。多種用於轉染的病毒株為公眾可得，例如苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica NPV)的L-1變種，以及家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori NPV)的Bm-5變種，此等病毒均可在本發明中使用，特別是用於轉染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda )細胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛花、番茄及菸草的植物細胞培養亦可用作宿主。

但是，最感興趣的為脊椎細胞，且脊椎細胞的培養(組織培養)已經成為習知操作。可用的哺乳動物宿主細胞實例有，SV40轉化的猴腎細胞CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎細胞株(293或懸浮培養的293細胞次純系，Graham等人,J. Gen Virol. 36:59 (1977))；幼地鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；小鼠睾丸支持細胞(TM4，Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人,Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人肝癌細胞株(Hep G2)。在某些實施例中，上述宿主細胞為哺乳動物培養的細胞株，例如CHO、BHK、NS0、293及其衍生物。

用上述的可產生抗CD39抗體的表現或選殖載體轉化宿主細胞，且將其在習知營養培養基中培養，上述營養培養基經修飾後適宜於誘導啟動子、選擇轉化細胞或擴增編碼目的序列的基因。在另一實施例中，上述抗體可藉由此項技術中熟知的同源重組的方法製得。在某些實施例中，上述宿主細胞能夠產生本發明中之抗體或其抗原結合片段。

本發明亦提供了一種表現本發明的抗體或其抗原結合片段的方法，包括在表現本發明所述的載體的條件下培養本發明提供的宿主細胞。本發明中用於產生上述抗體或其抗原結合片段的宿主細胞可在多種培養基中培養。市售的培養基如Ham's F10(Sigma)、最低基本培液(MEM，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)，Sigma)可用於培養上述宿主細胞。另外，任何在Ham等人,Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等人,Anal. Biochem. 102:255 (1980)，美國專利號4767704；4657866；4927762；4560655；或5122469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利號Re. 30985中描述的培養基均可用作上述宿主細胞的培養基。此等培養基均可添加必要的激素及/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽類(如氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂及磷酸鹽)、緩衝液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸及胸腺嘧啶)、抗生素(如慶大黴素)、微量元素(定義為終濃度通常在微莫耳範圍無機化合物)，及葡萄糖或與之等同的能量源。上述培養基亦可含有此項技術中熟知的適當濃度的任何其他必要的添加劑。上述培養基之條件，如溫度、pH值等類似條件，為選擇用於表現的宿主細胞此前所使用的條件，為一般熟習此項技術者所熟知。

使用重組技術時，可在壁膜間隙細胞內產生抗體，或直接分泌進入基質。若在細胞內產生抗體，則第一步為移除顆粒碎片(宿主細胞或裂解的片段)，例如藉由離心或超濾。Carter等人,Bio/Technology 10:163-167 (1992)描述了將分泌至大腸桿菌的壁膜間隙的抗體分離的方法。簡要地說，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)的存在下將細胞漿解凍30分鐘以上。可藉由離心移除細胞碎片。抗體分泌進入基質時，通常首先使用市售的蛋白濃縮過濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置，將來自該表現系統的上清濃縮。任何前述步驟可包括蛋白酶抑制劑，如PMSF，以抑制蛋白水解，且可包括抗生素，以防止偶然污染物的生長。

自上述細胞中製得的抗CD39抗體或其抗原結合片段可採用純化方法進行純化，例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析、DEAE-纖維素離子交換層析管柱、硫酸銨沈澱、鹽析以及親和層析，其中親合層析為較佳的純化技術。

在某些實施例中，固定於固相之蛋白A用於上述抗體及其抗原結合片段的免疫親和純化。上述抗體之種類以及上述抗體中存在任何免疫球蛋白之Fc域決定了蛋白A作為親和配體是否適合。蛋白A可用於純化基於人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等人, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。蛋白G適用於所有鼠源同種型及人γ3(Guss等人,EMBO J. 5:1567 1575 (1986))。瓊脂糖為最常用的親和配體附著基質，但亦可選用其他基質。機械力穩定的基質如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯與用瓊脂糖相比可實現更快的流速及更短的處理時間。如該抗體含有CH3域，則可用Bakerbond ABX^TM 樹脂進行純化(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)。亦可根據需要獲得的抗體確定其他蛋白純化的技術，如離子交換管柱中的分餾、乙醇沈澱、反相HPLC、矽膠層析、基於陰離子或陽離子交換樹脂的肝素瓊脂糖凝膠層析(如聚天冬胺酸管柱)、層析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸銨沈澱。

在任何初步純化步驟之後，可用低pH疏水相互作用層析的方法處理包含目標抗體及雜質的混合物，用pH約2.5-4.5的洗滌緩衝液，較佳在低鹽濃度下進行(例如，約0至0.25M鹽濃度)。醫藥組合物

本發明進一步提供包含本發明所述之抗CD39抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物，及一或多個醫藥學上可接受之載劑。

用於本發明中揭示之醫藥組合物的醫藥學上可接受之載劑可包括，例如，醫藥學上可接受之液體、凝膠或固體載劑、水相溶媒、非水相溶媒、抗微生物物質、等滲物質、緩衝液、抗氧化劑、麻醉劑、懸浮劑/分散劑、螯合劑、稀釋劑、佐劑、輔料或無毒輔助物質，其他此項技術中熟知的組分或以上的多種組合。

適用的組分可包括，例如，抗氧劑、填充劑、黏合劑、崩解劑、緩衝液、防腐劑、潤滑劑、攪味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑例如糖及環糊精。適用的抗氧劑可包括，例如，甲硫胺酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱胺酸、巰基甘油、巰基乙酸、巰基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羥基甲苯及/或沒食子酸丙酯。如本發明所揭示，在包含本發明揭示之抗體或其抗原結合片段的組合物中包括一或多種抗氧劑如甲硫胺酸，可降低上述抗體或其抗原結合片段的氧化。對氧化作用的減少可防止或減少結合親和力的降低，從而提高抗體穩定性且延長保質期。因此，在某些實施例中，本發明提供的醫藥組合物中包含一或多種本發明所述之抗體或其抗原結合片段以及一或多種抗氧化劑例如甲硫胺酸。本發明進一步提供多種防止上述抗體或其抗原結合片段氧化、延長其保質期及/或提高其活性的方法，例如，藉由將本發明中提供的抗體或其抗原結合片段與一或多種抗氧劑(例如，甲硫胺酸)混合來實現。

進一步的說，醫藥學上可接受之載劑可包括，例如，水相介質如氯化鈉注射液、林格氏液注射液、等滲葡萄糖注射液、無菌水注射液、或葡萄糖及乳酸林格注射液、非水介質例如：植物來源的不揮發性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或花生油、細菌抑制或真菌抑制濃度下的抗菌物質、等滲劑如：氯化鈉或葡萄糖、緩衝液如：磷酸鹽或檸檬酸酸鹽緩衝液，抗氧化劑如：硫酸氫鈉，局部麻醉劑如：鹽酸普魯卡因，助懸劑及分散劑如：羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯啶酮，乳化劑如：聚山梨醇酯80(Tween-80)、螯合試劑如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇雙(2-胺基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。作為載劑的抗菌劑可加入多劑量容器中的醫藥組合物中，其包括酚類或甲酚、汞製劑、苯甲醇、氯代丁醇、甲基及丙基對羥基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷銨及氯苯乙銨。適用的輔料可包括，例如，水、鹽、葡萄糖、甘油或乙醇。適用的無毒輔助物質可包括，例如，濕潤劑、乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、增溶劑，或醋酸鈉、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環糊精之類的物質。

上述醫藥組合物可為液體溶液、懸浮液、乳劑、丸劑、膠囊、片劑、持續釋放製劑或粉末。口服製劑可包括標準載劑如醫藥級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。

在某些實施例中，上述醫藥組合物被製備成可注射組合物。可注射醫藥組合物可以任何習知形式製備，例如，液體溶劑、懸浮劑、乳化劑或適用於產生液體溶劑、懸浮劑或乳化劑的固體形式。注射製劑可包括現用的無菌及/或無熱原溶液、使用前現與溶劑結合的無菌乾燥的可溶物，如凍乾粉，包括皮下片、注射即用的無菌懸浮劑、使用前現與介質結合的無菌乾燥不溶產品，及無菌及/或無熱原的乳劑。溶劑可為水相或非水相。

在某些實施例中，單位劑量的注射製劑包裝在一個安瓿、一支管或一支帶有針的針筒中。此項技術中習知，所有注射給藥的製劑應為無菌無熱原。

在某些實施例中，藉由將本發明中揭示之抗體或其抗原結合片段溶解於某適當的溶劑中可製備無菌凍乾的粉末。上述溶劑可含有一種可提高粉末或由粉末製得的重組溶液的穩定性，或改善粉末或重組溶液的其他藥理組分。適用的輔料包括，但不限於，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他適用的物質。溶劑可含有緩衝液，如檸檬酸緩衝液、磷酸鈉或磷酸鉀緩衝液或其他熟習此項技術者熟知的緩衝液，在一種實施例中，緩衝液的pH為中性。在此項技術中熟知的標準條件下進行對上述溶解進行隨後的過濾除菌，然後凍乾製得理想的製劑。在一個實施例中，將所得的溶劑分裝至小管中凍乾。每支小管可容納單次劑量或多次劑量的上述抗CD39抗體或其抗原結合片段或其組合物。每支小管中的裝入量可略微高於每次劑量所需或多次劑量所需(例如10%過量)，從而保證取樣精確及給藥精確。凍乾粉可在適當的條件下儲存，如在約4℃至室溫範圍。

用注射用水將凍乾粉重溶得到用於注射給藥的製劑。在一個實施例中，可將凍乾粉加至無菌無熱原水或其他適用的液體載劑中重溶。精確的量由選擇的療法決定，可根據經驗值決定。套組

在某些實施例中，本發明提供了一種套組，其包含本發明提供之抗體或其抗原結合片段及/或本發明提供的醫藥組合物。在某些實施例中，本發明提供了一種套組，其包含本發明提供之抗體或其抗原結合片段及第二治療劑。在某些實施例中，第二治療劑選自化療劑、抗癌藥物、放療劑、免疫治療劑、抗血管生成劑、靶向治療劑、細胞治療劑、基因治療劑、激素治療劑、抗病毒劑、抗生素、鎮痛藥、抗氧化劑、金屬螯合劑及細胞因子。

若需要，此類套組可進一步包括各種習知藥物套組組分中之一或多者，例如具有一或多種醫藥學上可接受之載體的容器、另外的容器等，此對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。套組中亦可包括指示要投與的組分的量的說明書(作為插入物或標籤)、投與指南及/或混合組分的指南。使用方法

本發明亦提供了在個體中治療與CD39相關的疾病、病症或狀況的方法，其包括向上述個體投與治療有效量的根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或根據本發明所述之醫藥組合物。在某些實施例中，上述個體為人類。

在一些實施例中，與CD39相關的疾病、病症或狀況之特徵在於表現或過表現CD39。

在一些實施例中，與CD39相關的疾病、病症或狀況上述疾病、病症或狀況為癌症。在一些實施例中，上述癌症為表現CD39的癌症。本發明中所用之「表現CD39的」癌症係指特徵在於在癌細胞或浸潤腫瘤的免疫細胞或免疫抑制細胞中表現CD39，且在癌細胞或浸潤腫瘤的免疫細胞或免疫抑制細胞表現CD39的水準顯著高於正常細胞所預期的水準的癌症。可使用多種方法來確定來自個體的測試生物樣品中CD39的存在或含量。例如，測試生物樣品可暴露於抗CD39抗體或其抗原結合片段，其結合至且偵測表現的CD39蛋白。或者，亦可使用諸如qPCR、逆轉錄酶PCR、微陣列、SAGE、FISH等方法在核酸表現水準上偵測CD39。在一些實施例中，上述測試樣品來自癌細胞或組織或浸潤腫瘤的免疫細胞。參考樣品可為自健康或未患病的個體獲得的對照樣品，或為自獲得測試樣品的同一個人獲得的健康或未患病的樣品。例如，參考樣品可為與測試樣品(例如腫瘤)相鄰或附近的未患病樣品。

在某些實施例中，上述癌症選自下組：肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、基底細胞癌、膽囊癌、胃癌、肺癌、支氣管癌、骨癌、肝膽管癌、胰臟癌、乳癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、腎癌、腎盂及輸尿管癌、唾液腺癌、小腸癌、尿道癌、膀胱癌、頭頸癌、脊椎癌、腦癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、結腸癌、結直腸癌、直腸癌、食道癌、胃腸道癌、皮膚癌、前列腺癌、垂體癌、陰道癌、甲狀腺癌、喉癌、膠質母細胞瘤、黑素瘤、骨髓增生異常症候群、肉瘤、畸胎瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T或B細胞淋巴瘤、胃腸道間質瘤、軟組織腫瘤、肝細胞癌及腺癌。在某些實施例中，上述癌症為白血病、淋巴瘤、膀胱癌、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、食道癌或乳癌。

在一些實施例中，上述個體已被鑑定為具有表現CD39的癌細胞或浸潤腫瘤的免疫細胞或免疫抑制細胞，視情況其水準顯著地高於非癌細胞或非免疫抑制細胞上正常發現的水準。

在另一態樣中，提供在將自CD39活性的調節中受益的個體中治療疾病、病症或狀況的方法，上述方法包含向有需要的個體投與如本發明所述的治療有效量的抗體或其抗原結合片段及/或醫藥組合物。在某些實施例中，上述疾病、病症或狀況為以上定義的與CD39相關的疾病、病症或狀況。

本發明所述之抗體或其抗原結合片段的治療有效劑量依賴於此項技術中熟知的多種因素，例如體重、年齡、過往病史、現用治療、對象的健康狀況及交叉感染的潛力、過敏、超敏及副作用，以及給藥途徑及腫瘤發展的程度。熟習此項技術者(例如醫生或獸醫)可根據此等或其他條件或要求按比例降低或升高劑量。

在某些實施例中，如本發明所述之抗體或抗原結合片段可在治療有效劑量約0.01 mg/kg至約100 mg/kg之間給藥。在某些實施例中，給藥劑量可隨治療進程變化。例如，在某些實施例中，初始給藥劑量可比後續給藥劑量高。在某些實施例中，給藥劑量在治療進程中根據給藥對象的反應進行調整。

給藥方案可藉由調整達到最優反應(如治療反應)。例如，可進行單劑量給藥或在一段時間分多個分隔的劑量給藥。

本發明中揭示之抗體或其抗原結合片段可藉由此項技術中熟知的給藥方式給藥，例如腸胃外給藥(如，皮下注射、腹腔注射、靜脈注射，包括靜脈滴注，肌肉注射或皮內注射)或非腸胃外給藥途徑(如，口服給藥、鼻腔給藥、舌下給藥、直腸給藥或外用給藥)。

在一些實施例中，本發明中揭示之抗體或其抗原結合片段可單獨給藥或與治療有效量的第二治療劑聯合給藥。例如，本發明揭示之抗體或其抗原結合片段可與第二治療劑(例如，化療劑、抗癌藥、放療劑、免疫治療劑、抗血管生成劑、靶向治療劑、細胞治療劑、基因治療劑、激素治療劑、抗病毒劑、抗生素、鎮痛藥、抗氧化劑、金屬螯合劑或細胞因子)聯合給藥。

本發明使用之術語「免疫療法」係指刺激免疫系統對抗疾病(例如癌症)或以一般方式增強免疫系統的一種療法。免疫療法的實例包括但不限於檢查點調節劑、過繼性細胞轉移、細胞因子、溶瘤病毒及治療性疫苗。

「靶向療法」為一種作用於與癌症有關的特定分子的療法，例如存在於癌細胞中但不存在於正常細胞中或在癌細胞中更為豐富的特定蛋白質，或癌症微環境中有助於癌症生長及生存的目標分子。靶向療法將治療劑瞄準腫瘤，從而使正常組織免受治療劑的影響。

在某些此類實施例中，本發明揭示之抗體或其抗原結合片段與一或多種另外的治療劑聯用時，可與所述的一或多種另外的治療劑同時給藥，在某些此類實施例中，上述的抗體或其抗原結合片段及上述另外的治療劑可作為同一個醫藥組合物的一部分同時給藥。但是，與其他治療劑「聯用」的抗體或其抗原結合片段不需要同時給藥或與該治療劑在同一組合物中給藥。本發明中「聯用」的含義亦包括，在另一個治療劑之前或之後給藥的抗體或其抗原結合片段亦被視為與該治療劑「聯用」，即使上述抗體或其抗原結合片段與第二種物質藉由不同給藥方式給藥。在可能的情況下，與本發明中揭示之抗體或其抗原結合片段聯用的其他治療劑可參照該其他治療劑的產品說明書的方法用藥，或參照外科醫生的案頭參考書2003(Physicians' Desk Reference, 第57版; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 第57版 (2002年11月))，或參照其他此項技術中熟知的方法。

在另一態樣中，本發明進一步提供了調節CD39陽性細胞中CD39活性的方法，包括將CD39陽性細胞暴露於本發明提供之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，CD39陽性細胞為免疫細胞。

在另一態樣中，本發明提供了偵測樣品中CD39的存在或含量的方法，其包括將上述樣品與上述抗體或其抗原結合片段及/或本發明提供的醫藥組合物接觸，以及確定樣品中CD39的存在或含量。

在另一態樣中，本發明提供了一種在個體中診斷與CD39相關的疾病、病症或狀況的方法，其包括：a)將獲取自上述個體的樣品與本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明提供的醫藥組合物接觸；b)確定在上述樣品中CD39的存在或含量；以及c)將CD39的存在或含量與上述與CD39相關的疾病、病症或狀況在個體中的存在情況或狀況相關聯。

在另一態樣中，本發明提供套組，上述套組包含本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明提供的醫藥組合物，其視情況與可偵測部分綴合，可用於偵測與CD39相關的疾病、病症或狀況。上述套組可進一步包括使用說明書。

在另一態樣中，本發明亦提供本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明提供的醫藥組合物在製備用於在個體中治療、預防或減輕與CD39相關的疾病、病症或狀況的藥物中的用途、在製備用於診斷與CD39相關的疾病、病症或狀況的診斷試劑中的用途。

在另一態樣中，本發明提供了一種在個體中治療、預防或減輕可藉由降低CD39的ATP酶活性而可治療的疾病的方法，包括向個體投與本發明提供的治療有效量的抗體或其抗原結合片段及/或本發明提供的醫藥組合物。例如，可投與本發明提供之抗體或其抗原結合片段以降低表現CD39的癌細胞或浸潤腫瘤的免疫細胞或免疫抑制細胞的ATP酶活性。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，個體具有選自下組的疾病、病症或狀況：癌症、自體免疫性疾病及感染。

在另一態樣中，本發明提供了一種在個體中治療、預防或減輕與腺苷介導的T細胞、單核細胞、巨噬細胞、DC、APC、NK及/或B細胞活性的抑制相關的疾病的方法，其包括向上述個體投與治療有效量的本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明所述之醫藥組合物。

以下實例旨在更好地說明本發明，且不應理解為限制本發明的範圍。所有下述的特定組合物、材料及方法，其整體或部分，均在本發明的範圍內。此等特定的組合物、材料及方法並非為了限制本發明，而僅為說明特定的實施例在本發明的範圍內。熟習此項技術者可不經過創造性勞動以及不偏離本發明範圍而開發出等同的組合物、材料及方法。應理解，在對本發明的方法作出的多種改動仍可包括在本發明範圍內。發明人意在將此類變動包括在本發明的範圍內。實例實例 1. 製備材料 1.1 參考抗體之產生

基於已揭示之序列產生抗CD39參考抗體。專利申請WO2016/073845A1中揭示了抗體9-8B，其重鏈及輕鏈可變區序列在本申請中分別為SEQ ID NO：46及48。抗體T895在專利申請WO 2019/027935A1中被揭示為抗體31895，且其重鏈及輕鏈可變區序列在本申請中分別為SEQ ID NO：55及57。專利申請WO 2018/167267A1中揭示了抗體I394，其重鏈及輕鏈可變區序列在本申請中分別為SEQ ID NO：113及114。抗體9-8B、T895及I394的重鏈可變區及輕鏈可變區如下表10所示。在Expi293細胞(Invitrogen)中選殖且表現編碼參考抗體的DNA序列。收集細胞培養基且離心除去細胞沈澱。使用蛋白A親和層析管柱(Mabselect Sure，GE Healthcare)純化收穫的上清液，以獲得參考抗體製劑。表 10. 三種參考抗體之可變區胺基酸序列

抗體	VH	VL
9-8B	SEQ ID NO：46 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGELTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARRAYYRYDYVMDYWGQGTSVTVSS	SEQ ID NO：48 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASHNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPGRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCHQYNNYPYTFGGGTKLEIK
T895	SEQ ID NO：55 EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGRTLEWIGYIVPLNGGSTFNQKFKGRATLTVNTSSRTAYMELRSLTSEDSAAYYCARGGTRFAYWGQGTLVTVSA	SEQ ID NO：57 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFGVSFMYWFQQKPGQPPNLLIYGASNQGSGVPARFRGSGSGTDFSLNIHPMEADDTAMYFCQQTKEVPYTFGGGTKLEIK
I394	SEQ ID NO：113 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFKSYEMHWVRQAPGQGLEWMGRINPSVGSTWYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGKREGGTEYLRKWGQGTLVTVSS	SEQ ID NO：114 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVASSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASNRHTGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYHNAITFGGGTKVEIK

1.2 人、食蟹猴及小鼠 CD39 穩定表現細胞株的建立

分別將編碼全長人CD39(NP_001767.3)、食蟹猴CD39(XP_015311944.1)及小鼠CD39(NP_033978.1)的DNA序列選殖至表現載體中，然後在HEK293細胞中轉染且表現。在選擇培養基中分別培養表現人CD39、食蟹猴CD39及小鼠CD39的轉染細胞。藉由有限稀釋分離穩定表現人CD39、食蟹猴CD39或小鼠CD39的單細胞純系。然後使用抗人CD39抗體(BD，Cat#555464)、抗食蟹猴CD39抗體(9-8B)、抗小鼠CD39抗體(Biolegend，Cat#143810)藉由FACS篩選細胞。

以類似的方式，在選擇培養基中培養經人CD39、食蟹猴CD39或小鼠CD39表現質體轉染的CHOK1細胞(Invitrogen)。藉由有限稀釋分離穩定表現人CD39、食蟹猴CD39或小鼠CD39的單細胞純系，然後使用上述抗人CD39抗體、上述抗食蟹猴CD39抗體或上述抗小鼠CD39抗體藉由FACS篩選細胞。

將穩定細胞株分別命名為HEK293-hCD39、HEK293-cynoCD39、HEK293-mCD39、CHOK1-hCD39、CHEK1-cynoCD39及CHOK1-mCD39，其均顯示出高表現及ATP酶活性。1.3 重組蛋白之產生

將編碼人CD39的胞外區(ECD)的DNA序列選殖至表現載體中，且轉染至HEK293細胞中，以表現ECD重組蛋白。實例 2. 抗體之產生 2.1 免疫及雜交瘤之產生與篩選

為了產生針對CD39的抗體，用重組表現的人CD39抗原或其片段或編碼全長人CD39的DNA及/或表現人CD39的細胞免疫Balb/c及SJL/J小鼠(SLAC)。在免疫操作的過程中，藉由尾靜脈或眼眶後取血獲得血漿及血清樣品，來監測免疫反應。將具有足夠滴度的抗CD39抗體的小鼠用於融合實驗。分離來自免疫小鼠的脾細胞及/或淋巴結細胞，且將其與小鼠骨髓瘤細胞株(SP2/0)融合。藉由用人CD39 ECD重組蛋白進行ELISA分析，或藉由用穩定表現人CD39的CHOK1-hCD39細胞進行Acumen分析(TTP Labtech)篩選出能產生CD39特異性抗體的雜交瘤。藉由FACS及酶活性阻斷實驗證實了雜交瘤純系對hCD39的特異性，且對其進行次選殖以獲得穩定的雜交瘤純系。在1-2輪次選殖後，擴增單株雜交瘤以產生抗體，且冷凍貯存。

藉由有限稀釋法，將分泌抗體的雜交瘤進行次選殖。在體外培養穩定的次純系，以在組織培養基中產生用於表徵的抗體。在1-2輪次選殖後，擴增單株雜交瘤以產生抗體。

培養約14天後，收集雜交瘤細胞培養基且藉由蛋白A親和層析管柱(GE)純化。雜交瘤純系抗體分別命名為mAb13、mAb14、mAb19、mAb21、mAb23、mAb34及mAb35。實例 3. 抗體表徵 3.1 抗體

在以下詳述的一系列結合及功能分析中，對雜交瘤選殖抗體mAb13、mAb14、mAb19、mAb21、mAb23、mAb34及mAb35進行表徵分析。3.2 與人 CD39 、食蟹猴 CD39 及小鼠 CD39 之結合親和力

使用FACS來確定抗體與天然表現CD39的細胞株(SK-MEL-28)或重組表現CD39的細胞株(CHOK1-hCD39、CHOK1-cynoCD39及CHOK1-mCD39)、或作為陰性對照的缺乏CD39表現的細胞(CHOK1-blank)的結合。

根據ATCC步驟，將CHOK1-hCD39、CHOK1-cCD39、CHOK1-mCD39及CHOK1-blank細胞培養於培養基中。收集細胞，且以3×10⁶ 個細胞/ ml的密度將細胞重懸於封閉緩衝液中。將細胞以100微升/孔(3×10⁵ 個細胞/孔)的密度轉移至96孔FACS盤中，將盤離心且用FACS緩衝液(PBS、1% FBS、0.05% Tween-20)洗滌兩次。自30µg/ml開始，用FACS緩衝液製備抗CD39抗體的4倍系列稀釋液。分別使用參考抗體9-8B及小鼠/人類IgG對照作為陽性對照及陰性對照。將細胞重懸於100微升/孔稀釋的抗體中，且將盤在4℃下培育60分鐘。用FACS緩衝液洗滌盤，將Alexa Fluor®488標記的二抗(在FACS緩衝液中1：1000)添加至每個孔中，且在4℃下培育30分鐘。用FACS緩衝液洗滌盤，且將細胞重懸於100微升/孔的PBS中。然後用FACSVerse™分析細胞，且確定平均螢光強度。藉由偵測一系列抗體的濃度，生成CD39表現細胞的完整的結合曲線。使用Prism軟體確定每種抗體的表觀親和力。

同樣，將表現人CD39的細胞SK-MEL-5、SK-MEL-28或MOLP-8在4℃下與梯度濃度的抗CD39抗體培育30分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞3次，然後與螢光標記的二抗(山羊抗小鼠IgG或山羊抗人類IgG)在4℃下培育30分鐘。將細胞洗滌3次，然後重懸於FACS緩衝液中，且在BD Celesta上藉由流動式細胞測量術進行分析。使用GraphPad Prism 8.02繪製及分析資料。

與已知的抗CD39抗體9-8B相比，7種純化的雜交瘤抗體的結合親和力如表11所示。所有雜交瘤抗體均以劑量依賴性方式與人及食蟹猴CD39結合，但在FACS分析中無雜交瘤抗體識別小鼠CD39。表 11. 抗 CD 39 雜交瘤抗休之表徵總結

ES - 編號	結合親和力 EC₅₀ (M)	基於 SK-MEL-28 細胞的 ATP 酶抑制 %	T 細胞增殖抑制實驗	Octet 結合親和力	抗原決定基
人	食蟹猴	小鼠	SK-MEL-28	10 nM	EC₅₀	100nM	EC₅₀	KD	K-off
mAb13	3.0E-08	2.1E-08	-	1.1E-08	43%	3.5E-10	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
mAb14	2.5E-09	3.4E-09	-	2.8E-08	57%	4.5E-09	++	n.d.	2.4E-10	2.2E-04	IV
mAb19	4.5E-09	5.8E-09	-	4.6E-08	65%	4.0E-09	++	n.d.	2.6E-10	1.5E-04	I
mAb21	6.7E-09	1.1E-08	-	9.0E-08	70%	1.5E-09	++	1.4E-10	4.4E-10	2.2E-04	I
mAb23	1.7E-09	2.3E-09	-	1.6E-09	75%	6.0E-11	++	〜1.0E-10	8.2E-10	3.6E-04	II
mAb34	4.4E-09	3.1E-09	-	4.7E-09	72%	1.3E-10	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
mAb35	5.2E-09	5.3E-09	-	1.8E-09	56%	1.6E-09	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
9-8B	1.7E-09	1.6E-09	-	8.0E-10	21%	5.0E-11	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	III

-：陰性 ++：p＜0.01 n.d.：尚未確定3.3 偵測 ATP 酶之抑制

用PBS緩衝液洗滌表現CD39的細胞SK-MEL-5及MOLP-8，且在37℃下與梯度抗體一起培育30分鐘。向每個孔中加入50 mM ATP，且與細胞一起培育16小時。收集上清液，且根據製造商的使用手冊，用孔雀綠磷酸鹽偵測套組(Malachite Green Phosphate Detection Kit, R＆D system, Catalog#DY996)偵測來自ATP降解的正磷酸鹽產物。同種型及/或9-8B用作對照。使用GraphPad Prism 8.02繪製及分析資料。EC₅₀ 為在該分析中達到50%信號時所示抗體的濃度。

如表11中總結的，與參考抗體9-8B相比，所有7種純化的雜交瘤抗體均具有良好的ATP酶抑制活性。3.4 ATP 介導的 T 細胞增殖抑制分析

在ATP存在下，將用CSFE標記且用抗CD3及抗CD28刺激的人T細胞與抗CD39抗體或同種型對照一起培育。藉由CSFE稀釋在FACS中分析T細胞的增殖。mIgG2a用作同種型對照。

所選的抗CD39抗體mAb21及mAb23的T細胞增殖活性如圖1所示，且彙總於表11中。EC₅₀ 為在該分析中達到50%信號時所示抗體的濃度。兩種抗體均以劑量依賴性方式增強T細胞增殖，即兩種抗體均阻斷對T細胞增殖的ATP介導的抑制作用。3.5 抗原決定基分組 (Eptiope Binning)

使用Alex488標記套組標記抗CD39抗體，且進行一系列濃度稀釋，然後再與CHOK1-hCD39細胞混合，以使用FACS偵測結合EC₈₀ 。偵測了未標記抗體對標記抗體的阻斷功效。簡而言之，將CHOK1-hCD39單核細胞製備至密度為2 × 10⁶ /ml，且以50μl/孔接種至96孔盤中，然後與梯度抗體混合至100μl的終體積，然後以兩倍的EC₈₀ 濃度添加等體積的Alex488標記抗體。將96孔盤在4℃下培育1小時，離心且用200μl FACS緩衝液洗滌3次。在FACScelesta機器上進行FACS分析，且藉由Flowjo軟體分析資料。與無競爭孔(僅Alex488標記抗體)相比，計算了阻斷百分比，且將其中競爭率高於80%的歸入同一抗原決定基群中。

競爭結果如表12所示。基於競爭結果，可將4種抗CD39雜交瘤抗體(mAb14、mAb19、mAb21、mAb23)分為4個不同的抗原決定基群，如表11所示。具體而言，抗CD39抗體mAb19及mAb21競爭高度相似的抗原決定基，且歸為抗原決定基群I，如表11所示。mAb14不與所測試的任何其他抗體競爭，歸為抗原決定基群IV，如表11所示。mAb23顯示與mAb19及mAb21交叉競爭，且在表11中歸為抗原決定基群II。表 12. 抗 CD39 雜交瘤抗體之抗原決定基分組總結

	mAb19- Alexa488	mAb21- Alexa488	mAb23- Alexa488	9-8B- Alexa488	mAb14- Alexa488
mAb19	96%	83%	91%	6%	23%
mAb21	98%	90%	97%	20%	24%
mAb23	98%	93%	100%	98%	86%
9-8B	19%	16%	100%	98%	55%
mAb14	6%	10%	-26%	-11%	98%

3.6 雜交瘤定序

自單株雜交瘤細胞中分離出RNA，且用商業套組反轉錄成cDNA。然後以cDNA為模板，用Mouse Ig-Primer Set (Novagen)的引子擴增出重鏈可變區及輕鏈可變區。收集且純化大小正確的PCR產物，然後用合適的質體載體連接。連接產物轉化至DH5α感受態細胞。篩選純系，且藉由DNA定序分析插入片段。雜交瘤抗體的可變區序列如下表2中所示。實例 4. 嵌合抗體之產生及表徵 4.1. 嵌合抗體之產生與生產

合成編碼4種選擇的雜交瘤抗體(mAb14、mAb19、mAb21及mAb23)可變區的DNA，且將其次選殖至預先包含人類IgG恆定基因的表現載體中。將載體轉染至哺乳動物細胞中用於重組蛋白表現，且使用蛋白A親和層析管柱純化表現的抗體。所得的嵌合抗體在本申請中被稱為c14、c19、c21及c23，其中前綴「c」表示「嵌合」，數字表示雜交瘤抗體純系，例如數字「14」表示其來自雜交瘤抗體mAb14。4.2. 嵌合抗體之表徵

偵測4種純化的嵌合抗體阻斷ATP介導的T細胞增殖抑制的活性(與實例3.4中描述的方法類似)。如圖2所示，抗CD39嵌合抗體c14、c19、c21及c23以劑量依賴性方式(在100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM及0.001 nM的濃度範圍)阻斷CD4⁺ T細胞增殖的抑制。CFSE-CD4⁺ T及hIgG4分別作為ATP介導的T細胞增殖的陽性對照及陰性對照。

進一步偵測純化的4種嵌合抗體在存在ATP的情況下增強ATP誘導的樹突狀細胞(DC)活化及成熟的能力。ATP藉由刺激單核細胞來源的樹突狀細胞的P2Y11受體來誘導DC成熟。

簡而言之，自健康人血液中分離出人單核細胞，且在存在GM-CSF及IL-4的情況下分化為MoDC，持續6天。然後用4種不同劑量的抗CD39嵌合抗體在存在ATP的情況下再將分化的MoDC處理24小時。然後，用FACS分析CD86、CD83及HLA-DR的表現來評價DC成熟。

圖3顯示了FACS偵測之DC表面之CD39水準。圖4A至4C分別顯示了抗體處理後的CD86(圖4A)、CD83(圖4B)及HLA-DR(圖4C)表現。ATP誘導的DC成熟表現為，與溶媒(vehicle)處理相比，CD86、CD83及HLA-DR的表現增加。4種抗CD39抗體c14、c19、c21及c23均對ATP誘導的DC成熟有顯著促進作用。

亦偵測了嵌合抗體的體內抗腫瘤活性。在NOD-SCID小鼠的右後脅腹區域皮下接種0.1 ml PBS混合基質膠(1：1)中的腫瘤細胞(10 × 10⁶ )，用於腫瘤發展。當腫瘤平均大小達到約80mm³ 時，將小鼠隨機分組。在隨機分組的同一天開始處理，劑量為30mg / kg，每週兩次。隨機分組後，每週用卡尺在二維層面上量測腫瘤體積兩次，且使用以下公式以mm³ 表示體積：V =(L × W × W)/ 2，其中V為腫瘤體積，L為腫瘤長度(最長的腫瘤尺寸)，W為腫瘤的寬度(垂直於L的最長的腫瘤尺寸)。在層流櫃(Laminar Flow Cabinet)中進行給藥，且量測腫瘤及體重。使用Graphpad Prism進行雙因素方差分析。

嵌合抗CD39抗體c23的腫瘤生長結果如圖5所示。獲得且偵測了c23的人類IgG1型及IgG4型。與溶媒組相比，c23-hIgG4及c23-hIgG1嵌合抗體均顯示出抗腫瘤的作用，c23-hIgG4及c23-hIgG1之間無顯著性差異。實例 5. 抗體之人源化與親和力成熟 5.1 人源化

選擇嵌合抗體c23及c14作為人源化純系。將抗體序列與人種系序列比對以確定最佳擬合模型。基於與原始小鼠抗體序列的同源性，選擇最匹配的人種系序列作為人源化的模板。然後將來自小鼠抗體序列的CDR與保持抗體的上核及中心核結構的殘基一起移植至模板上。將優化的突變引入框架區以產生人源化重鏈可變區的變體及人源化輕鏈可變區的變體，將其混合且匹配以提供多個人源化抗體純系。移植及突變後，人源化抗體對表現人CD39的細胞保持相似的結合親和力。藉由CD39 ATP酶抑制實驗及體外免疫細胞活化實驗進一步評估人源化抗體。亦對一些人源化抗體進行了體內研究。

總共獲得了c23的31種人源化抗體純系，混合且匹配人源化c23重鏈可變區的7種變體(即hu23.VH_1、hu23.VH_2、hu23.VH_3、hu23.VH_4、hu23.VH_5、hu23.VH_6及hu23.VH_7)及人源化c23輕鏈可變區的7種變體(即hu23.VL_1、hu23.VL_2、hu23.VL_3、hu23.VL_4、hu23.VL_5、hu23.VL_6及hu23.VL_7)。31種人源化抗體純系被命名為hu23.H1L1，hu23.H1L2等，如上表9及下表13、14及15所示，其中前綴「hu」表示「人源化」，後綴例如「H1L1」表示具有hu23.VH_1可變區變體及hu23.VL_1可變區變體的編號為c23的人源化抗體純系。表 13. c23 之人源化抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區

	hu23.VL_1 (SEQ ID NO：61)	hu23.VL_2 (SEQ ID NO：63)	hu23.VL_3 (SEQ ID NO：65)	hu23.VL_4 (SEQ ID NO：67)
hu23.VH_1 (SEQ ID NO：60)	hu23.H1L1 (SEQ ID NOs：60/61)	hu23.H1L2 (SEQ ID NOs：60/63)	hu23.H1L3 (SEQ ID NOs：60/65)	hu23.H1L4 (SEQ ID NOs：60/67)
hu23.VH_2 (SEQ ID NO：62)	hu23.H2L1 (SEQ ID NOs：62/61)	hu23.H2L2 (SEQ ID NOs：62/63)	hu23.H2L3 (SEQ ID NOs：62/65)	hu23.H2L4 (SEQ ID NOs：62/67)
hu23.VH_3 (SEQ ID NO：64)	hu23.H3L1 (SEQ ID NOs：64/61)	hu23.H3L2 (SEQ ID NOs：64/63)	hu23.H3L3 (SEQ ID NOs：64/65)	hu23.H3L4 (SEQ ID NOs：64/67)
hu23.VH_4 (SEQ ID NO：66)	hu23.H4L1 (SEQ ID NOs：66/61)	hu23.H4L2 (SEQ ID NOs：66/63)	hu23.H4L3 (SEQ ID NOs：66/65)	hu23.H4L4 (SEQ ID NOs：66/67)

表 14. c23 之人源化抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區

	hu23.VL_1 (SEQ ID NO：61)	hu23.VL_5 (SEQ ID NO：143)	hu23.VL_6 (SEQ ID NO：144)	hu23.VL_7 (SEQ ID NO：145)
hu23.VH_1 (SEQ ID NO：60)	hu23.H1L1 (SEQ ID NOs：60/61)	hu23.H1L5 (SEQ ID NOs：60/143)	hu23.H1L6 (SEQ ID NOs：60/144)	hu23.H1L7 (SEQ ID NOs：60/145)
hu23.VH_5 (SEQ ID NO：140)	hu23.H5L1 (SEQ ID NOs：140/61)	hu23.H5L5 (SEQ ID NOs：140/143)	hu23.H5L6 (SEQ ID NOs：140/144)	hu23.H5L7 (SEQ ID NOs：140/145)
hu23.VH_6 (SEQ ID NO：141)	hu23.H6L1 (SEQ ID NOs：141/61)	hu23.H6L5 (SEQ ID NOs：141/143)	hu23.H6L6 (SEQ ID NOs：141/144)	hu23.H6L7 (SEQ ID NOs：141/145)
hu23.VH_7 (SEQ ID NO：142)	hu23.H7L1 (SEQ ID NOs：142/61)	hu23.H7L5 (SEQ ID NOs：142/143)	hu23.H7L6 (SEQ ID NOs：142/144)	hu23.H7L7 (SEQ ID NOs：142/145)

表 15. c23 之人源化抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區

	hu23.VL_201 (SEQ ID NO：111)	hu23.VL_203 (SEQ ID NO：112)	hu23.VL_211 (SEQ ID NO：63)
hu23.VH_201 (SEQ ID NO：146)	hu23.201 (SEQ ID NOs：146/111)	hu23.203 (SEQ ID NOs：146/112)	-
hu23.VH_207 (SEQ ID NO：147)	hu23.207 (SEQ ID NOs：147/111)	-	-
hu23.VH_211 (SEQ ID NO：39)	-	-	hu23.211 (SEQ ID NOs：39/63)

類似地，總共獲得了c14的16種人源化抗體，混合且匹配了人源化c14重鏈可變區的4種變體(即hu14.VH_1、hu14.VH_2、hu14.VH_3及hu14.VH_4)及人源化c14輕鏈可變區的4種變體(即hu14.VL_1、hu14.VL_2、hu14.VL_3及hu14.VL_4)。16種人源化抗體純系分別被命名為hu14.H1L1、hu14.H1L2等以此類推，如下表16所示。表 16. c14 之 16 種人源化抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區

	hu14.VL_1 (SEQ ID NO：69)	hu14.VL_2 (SEQ ID NO：71)	hu14.VL_3 (SEQ ID NO：73)	hu14.VL_4 (SEQ ID NO：75)
hu14.VH_1 (SEQ ID NO：68)	hu14.H1L1 (SEQ ID NOs：68/69)	hu14.H1L2 (SEQ ID NOs：68/71)	hu14.H1L3 (SEQ ID NOs：68/73)	hu14.H1L4 (SEQ ID NOs：68/75)
hu14.VH_2 (SEQ ID NO：70)	hu14.H2L1 (SEQ ID NOs：70/69)	hu14.H2L2 (SEQ ID NOs：70/71)	hu14.H2L3 (SEQ ID NOs：70/73)	hu14.H2L4 (SEQ ID NOs：70/75)
hu14.VH_3 (SEQ ID NO：72)	hu14.H3L1 (SEQ ID NOs：72/69)	hu14.H3L2 (SEQ ID NOs：72/71)	hu14.H3L3 (SEQ ID NOs：72/73)	hu14.H3L4 (SEQ ID NOs：72/75)
hu14.VH_4 (SEQ ID NO：74)	hu14.H4L1 (SEQ ID NOs：74/69)	hu14.H4L2 (SEQ ID NOs：74/71)	hu14.H4L3 (SEQ ID NOs：74/73)	hu14.H4L4 (SEQ ID NOs：74/75)

亦藉由酵母展示獲得了c23的幾種人源化抗體純系。簡而言之，將小鼠重鏈及輕鏈序列與人抗體序列的內部資料庫進行比對。分別選擇同源性最高的模板IGHV1-3*01及IGKV3-11*01用於重鏈及輕鏈CDR移植。藉由使用酵母展示的高通量方法識別反向突變。具體而言，識別了有助於CDR構形的位置(游標區殘基)，且藉由在DNA合成過程中在每個位置摻入模板及小鼠殘基來創建反向突變庫。藉由定序人類CD39蛋白的主要結合物來確定最終候選物。藉由酵母展示獲得的c23的人源化抗體被命名為hu23.201(具有SEQ ID NO：146/111的VH/VL)、hu23.203(具有SEQ ID NO：146/112的VH/VL)、hu23.207(具有SEQ ID NO：147/111的VH/VL)及hu23.211(具有SEQ ID NO：39/63的VH/VL)。

表13、14、15及16中的人源化抗體由重組產生，隨後進行結合親和力偵測，顯示其能夠保留結合人CD39的特異性。在包括CD39阻斷實驗及體外免疫細胞活化實驗在內的功能實驗中進一步評估具有相對較高親和力的彼等抗體。

具體地，使用Biacore(GE)表徵人源化抗體hu23.H5L5、hu23.201、hu14.H1L1以及參考抗體I394及T895對人CD39的結合親和力。簡而言之，使用人類抗體捕獲套組(Human Antibody Capture Kit, GE)將待測抗體捕獲至CM5晶片(GE)中。將6xHis標記的人CD39抗原連續稀釋多次，且以30μl/ min的速度注射180秒。維持緩衝液流解離400秒。使用3M MgCl₂ 進行晶片再生。將締合及解離曲線與1：1結合模型擬合，且計算每種抗體的Ka/Kd/K_D 值。下表17總結了所偵測的抗體親和力的資料。表 17. 藉由 Biacore 測定法偵測的抗體對人 CD39 之結合親和力。

抗體	ka (1/Ms)	kd (1/s)	K_D (M)
hu23.H5L5	8.22E+04	1.60E-03	1.95E-08
hu23.201	6.75E+04	1.62E-03	2.40E-08
hu14.H1L1	9.03E+05	4.55E-03	5.03E-09
I394	2.03E+05	1.26E-03	6.21E-09
T895	1.33E+05	1.39E-01	1.04E-06

此外，根據製造商的使用說明書，使用Octet測定法(Creative Biolabs)，對人源化抗體hu23.H5L5及hu14.H1L2以及參考抗體I394、T895及9-8B的抗人CD39結合親和力進行表徵。簡而言之，將抗體偶聯至感測器上，然後將感測器浸入CD39梯度液中(起始濃度為200 nM，2倍稀釋，共8個劑量)。對其結合反應進行實時量測，且對結果進行全局擬合。下表18中總結了偵測的抗體的親和力資料。表 18. 藉由 Octet 測定法偵測的抗體與人 CD39 之結合親和力

抗體	K_D (M)	kon (1/Ms)	kdis (1/s)
hu23.H5L5	6.87E-10	1.36E+05	9.36E-05
hu14.H1L2	8.39E-10	3.89E+05	3.26E-04
I394	4.54E-10	2.56E+05	1.16E-04
T895	6.62E-09	6.71E+05	4.44E-03
9-8B	2.02E-08	1.20E+05	2.43E-03

另外，在c23抗體的人源化抗體純系(例如hu23.H5L5)的HCDR2中鑑定出了一個易於脫醯胺的NG基序(N55G56)。為了除去脫醯胺位點，將不同的突變引入N55或G56，發現N55及G56可各自突變為多種殘基，但仍保留與人CD39結合的特異性。例如，發現當N55經G、S或Q單點替換時，抗體結合親和力得以保留，且對其與人CD39的結合無負面影響。類似地，當G56經A或D替換時，突變抗體亦保留其對人CD39的特異性結合及結合親和力。預計其他突變亦起同樣作用。5.2 結合特異性偵測

藉由ELISA測定法偵測純化的人源化抗體hu23.H5L5對ENTPDase家族成員的結合特異性。簡而言之，將ENTPD1(即CD39)及ENTPD 2/3/5/6蛋白包被在96孔ELISA盤上，在4℃下放置過夜，第二天，用200微升/孔的封閉緩衝液(含1% BSA的PBS與0.05% Tween20混合液)洗滌且封閉ELISA盤2小時。然後將hu23.H5L5梯度液轉移至孔中，且用抗hIgG-HRP染色。盤洗滌後，將盤用TMB受質顯影，且用2N HCl終止反應。使用讀盤器記錄OD450，且用Graphpad Prism作圖。hu23.H5L5的結合特異性如圖6所示。自圖6A可見，人源化抗體hu23.H5L5特異性結合人CD39，但不結合ENTPD 2/3/5/6蛋白中之任一者。圖6B顯示陰性對照hIgG4不結合ENTPD 1/2/3/5/6蛋白中之任一者。5.3. 人源化抗體之表徵

使用與實例3.2中所述類似的方法，藉由FACS偵測c23的人源化抗體的結合親和力。顯示出良好結合親和力的c23人源化抗體純系列於下表19及表20中，且亦示於圖7A、7B及圖8中。EC₅₀ 為在該分析中信號指示達到50%時所示之抗體濃度。表 19. c23 人源化抗體與 MOLP8 細胞之結合活性

抗體	hu23.H1L1	hu23.H1L2	hu23.H1L3	hu23.H1L4	hu23.H2L1
EC₅₀ (nM)	~77.07	1.158	2.775	1.498	65.91
抗體	hu23.H2L2	hu23.H2L3	hu23.H2L4	c23
EC₅₀ (nM)	0.979	2.033	1.46	1.035
抗體	hu23.H3L1	hu23.H3L2	hu23.H3L3	hu23.H3L4	hu23.H4L1
EC₅₀ (nM)	~15.40	1.341	3.29	1.612	ND
抗體	hu23.H4L2	hu23.H4L3	hu23.H4L4	同種型
EC₅₀ (nM)	1.151	1.868	1.014	ND
抗體	hu23.H1L1	hu23.H1L5	hu23.H1L6	hu23.H1L7	hu23.H5L1
EC₅₀ (nM)	~78.25	ND	ND	ND	0.262
抗體	hu23.H5L5	hu23.H5L6	hu23.H5L7	c23
EC₅₀ (nM)	0.177	0.2021	0.179	0.3973
抗體	hu23.H6L1	hu23.H6L5	hu23.H6L6	hu23.H6L7	hu23.H7L1
EC₅₀ (nM)	0.2459	0.593	0.237	0.122	0.366
抗體	hu23.H7L5	hu23.H7L6	hu23.H7L7	同種型
EC₅₀ (nM)	0.25	0.271	0.25	ND

ND：在該實驗條件下未偵測到。表 20. c23 的人源化抗體對 MOLP8 之結合活性

抗體	hu23.201	hu23.203	hu23.207	hu23.211	c23	hIgG4
EC₅₀ (nM)	1.289	0.429	2.246	1.557	1.279	ND

ND：在該實驗條件下未偵測到。

在SK-MEL-28細胞上偵測所選的c23人源化抗體以進行ATP酶抑制分析(如實例3.3中所述)。圖9A及9B顯示了所示之抗體的抑制圖，且總結在表21中。選擇hu23.H5L5及hu23.201用於進一步驗證。表 21. c23 之人源化抗體對 SK-MEL-28 細胞之 ATP 酶抑制活性

抗體	hu23.H7L1	hu23.H7L5	hu23.H7L6	hu23.H1L2	hu23.H1L4	hu23.H2L2	c23
IC₅₀ (nM)	0.147	0.144	0.121	0.964	0.59	0.767	0.158
抗體	hu23.H4L4	hu23.H5L5	hu23.H5L6	hu23.201	hu23.203	hu23.211	c23
IC₅₀ (nM)	0.487	0.122	0.13	0.264	0.32	0.386	0.2092

使用與實例3.2中所描述的類似方法，利用表現人CD39的MOLP-8細胞藉由FACS偵測c14的人源化抗體的結合親和力。

顯示出良好結合親和力的c14的人源化抗體純系如圖10A、10B及10C所示。表22總結了EC₅₀ 值。表 22. c14 之人源化抗體與 MOLP8 細胞之結合活性

抗體	hu14.H1L1	hu14.H2L2	hu14.H3L1	hu14.H3L3	hu14.H3L4	hu14.H4L4	c14
EC₅₀ (nM)	7.212	6.908	5.952	6.088	6.046	5.459	17.52

5.4. 抗原決定基分組 (Epitope Binning)

偵測所選擇的人源化抗體的競爭性結合(方法如實例3.5所描述)。人源化抗體hu23.H5L5及hu14.H1L1與參考抗體的抗原決定基分組結果如圖19A所示。

根據競爭結果(如圖19A所示)，可將2種人源化抗CD39抗體hu23.H5L5及hu14.H1L1分為2個不同的抗原決定基群(參見圖19B)。具體而言，抗CD39抗體hu23.H5L5與參考抗體I394、T895及9-8B競爭高度相似的抗原決定基，被歸為抗原決定基群I。hu14.H1L1、c34及c35除與T895部分競爭以外，未與測試的任何其他抗體競爭，因此被歸為抗原決定基群II。5.5 優化的人源化抗體之表徵 5.5.1 hu23.H5L5 對 CD39 的阻斷增強了在存在細胞外 ATP(eATP) 之情況下的人 T 細胞增殖。

在存在ATP的情況下，將用抗CD3抗體及抗CD28抗體刺激的人PBMC分別與25 nM人源化抗CD39抗體hu23.H5L5及溶媒一起培育。收集細胞培養上清液，分別用於偵測IL-2及IFN-γ的分泌。第5天時，在FACS中藉由Cell Trace Violet稀釋染料分析CD4⁺ T及CD8⁺ T細胞的增殖。

如圖11A至11D所示，hu23.H5L5在25 nM的濃度下顯著增強了CD4⁺ 及CD8⁺ T細胞的增殖，且激活了其IL-2及IFN-γ的產生。如圖11A、11B及11D所示，在增強PBMC中的T細胞活化方面，hu23.H5L5顯示出比I394明顯更高的活性。

自健康供體PBMC中分離人CD8⁺ T細胞，然後用細胞增殖染料標記，用抗CD3看台及抗CD28抗體激活，然後用不同劑量的人源化抗CD39抗體hu23.H5L5或參考抗體I394處理5天。在第3天，在開始CD39阻斷處理之後，向細胞中加入200μM ATP。在第5天，用流動式細胞測量術分析CD8⁺ T細胞增殖百分比(%)、CD25⁺ 細胞百分比(%)及活細胞百分比(%)。

如圖23A至23C所示，hu23.H5L5顯著地逆轉了由eATP抑制的人CD8⁺ T細胞增殖。

按照實例3.2中所描述的相似方法，藉由FACS在不同細胞上偵測了人源化抗體hu23.H5L5及hu14.H1L1的結合親和力。

圖12A至12E顯示了抗體hu23.H5L5及hu14.H1L1分別對SK-MEL-5(圖12A)、SK-MEL-28(圖12B)、MOLP-8(圖12C)、CHOK1-cynoCD39(圖12D)及CHOK1-mCD39(圖12E)的結合親和力。平行偵測了參考抗體T895及I394作為對照抗體。如圖12所示及表23所示，抗體hu23.H5L5及hu14.H1L1均以劑量依賴性方式結合表現人CD39及食蟹猴CD39的細胞，且在亞奈莫耳或奈莫耳水準上具有相似的EC₅₀ 親和力。其均未在FACS研究中識別出小鼠CD39。每種抗體在細胞之間的最大信號(平均螢光強度，MFI)不同可能係由於其表現量不同所致。表 23. 藉由 FACS 偵測抗體親和力 EC₅₀ (nM)

細胞	hu23.H5L5	hu14.H1L1	T895	I394
SK-MEL-5	0.69	7.88	0.21	0.49
SK-MEL-28	0.99	29.14	0.36	0.94
MOLP-8	0.14	0.35	0.11	0.11
CHO-K1/cynoCD39	3.375	ND	4.192	2.708
CHO-K1/mCD39	ND	ND	ND	ND

ND：在該實驗條件下未偵測到。

圖13顯示hu23.H5L5阻斷了SK-MEL-5細胞(圖13A)或MOLP-8細胞(圖13B)上的CD39 ATP酶活性，與參考抗體T895及I394的結果相似(方法如實例3.3所描述)。結果總結在表24中。

hu23.H5L5在SK-MEL-5細胞中顯示酶促阻斷IC₅₀ 值為70 pM，在MOLP-8細胞中顯示酶促阻斷IC₅₀ 值為330 pM，此與參考抗體T895及I394相似或比參考抗體T895及I394稍好。但是，hu14.H1L1在此兩種細胞上均未達到飽和阻斷，在該偵測中9-8B被鑑定為非阻斷劑。表 24. 人源化抗體之 ATP 酶活性抑制 (IC₅₀ )(nM)

IC₅₀ (nM)	hu23.H5L5	hu14.H1L1	T895	I394	9-8B
SK-MEL-5	0.07	NA	0.09	0.10	ND
MOLP-8	0.33	26.51	0.51	0.21	ND

NA：無法獲得 ND：在該實驗條件下未偵測到。 5.5.2 hu23.H5L5 對 CD39 的阻斷增強了 ATP 介導的單核細胞活化。

亦在ATP介導的單核細胞活化測定中偵測了人源化抗體hu23.H5L5。ATP介導的促炎活性在調節多種免疫細胞類型(包括單核細胞)的功能中具有重要作用。為了評估CD39阻斷是否可增強ATP介導的單核細胞活化，自人類健康血液中純化出人類單核細胞，然後在存在ATP的情況下，將抗CD39抗體以0.2 nM至100 nM的不同濃度進行培育。顯示hu23.H5L5可在0.2 nM的濃度(即，最低偵測濃度)下有效誘導單核細胞活化。藉由FACS檢定法分析CD80(圖14A)、CD86(圖14B)及CD40(圖14C)的表現來評估單核細胞的活化(hu23.H5L5的濃度為50 nM)。參考抗CD39抗體I394及T895用作對照，hIgG4用作同種型對照。

結果顯示在圖14中。單獨刺激ATP證明了CD80及CD86的表現上調，表明單核細胞活化。人源化的抗CD39抗體hu23.H5L5進一步增強了ATP介導的單核細胞活化，此由CD80、CD86及CD40的上調所證明，其水準與參考抗體I394相當。參考抗體T895對ATP誘導的活化單核細胞無顯著影響。 5.5.3 hu23.H5L5 對 CD39 的阻斷增強了 ATP 介導的 DC 活化。

亦在ATP介導的DC活化測定中偵測了選擇的人源化抗體hu23.H5L5(按照實例4.2中描述的類似方法)。簡而言之，藉由FACS測定法分析CD83表現來評估DC成熟。ATP藉由顯示CD83的表現增加來誘導DC成熟(圖15A)。自低至0.2 nM的水準開始，hu23.H5L5以劑量依賴性方式增加CD83的表現，且在抗體水準為0.6 nM時，hu23.H5L5顯著地增加了CD83的表現。此比參考抗體T895及I394中之任一者均更有效。

為了進一步評估ATP介導的DC活化對T細胞活化的影響，洗滌ATP活化的DC，然後與同種異體T細胞一起培育以進行混合淋巴細胞反應(MLR)。分析了T細胞增殖(圖15B)及由活化的T細胞產生的IFN-γ(圖15C)。

與參考抗體I394及T895相比，抗CD39抗體hu23.H5L5對促進ATP誘導的DC成熟具有劑量依賴性及顯著地影響，參考I394顯示出相似但稍弱的活性，而T895的作用非常輕微。同樣，如圖15B及15C所示，在MLR分析中，抗CD39阻斷抗體hu23.H5L5增強了ATP介導的MoDC成熟，導致更高的T細胞增殖及IFN-γ產生。 5.5.4 hu23.H5L5 對 CD39 的阻斷促進了由 LPS 刺激誘導的人類巨噬細胞 IL1β 釋放。

自健康人PBMC中分離人CD14⁺ T細胞，然後以2×10⁶ /孔的密度將富集的CD14⁺ 單核細胞接種至6孔盤，且與100 ng/mL人GM-CSF一起培育6天，產生M1樣巨噬細胞。用劑量增加的hu23.H5L5或參考抗體I394處理體外分化的巨噬細胞1小時，然後用10 ng/mL LPS刺激3小時，然後加入800 µM ATP培育2小時。用ELISA定量細胞培養上清液裏的IL-1β。

結果如圖20所示。星號表示各個條件之間的顯著性差異。如圖20所示，hu23.H5L5顯著地促進了由LPS刺激誘導的人類巨噬細胞IL1β釋放，且在促進由LPS刺激誘導的人類巨噬細胞IL1β釋放方面，hu23.H5L5表現出了比參考抗體I394顯著更高的活性。5.6 體內研究

根據實例4.2中描述的方法，在MOLP-8異種移植小鼠上測定了人源化抗體hu23.H5L5及hu14.H1L1的作用。

結果顯示在圖16中，與溶媒組相比，所有抗CD39抗體均抑制腫瘤生長。I394觀察到的功效略弱於其他抗體，包括hu23.H5L5及hu14.H1L1。

根據實例4.2中描述的方法，亦在PBMC移植動物模型(NCG小鼠，接種MOLP-8細胞，5M/小鼠)中考察了不同劑量(0.03 mg/kg、0.3 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg，腹膜內給藥，每週兩次，6個劑量)的人源化抗體hu23.H5L5的抗腫瘤作用。

結果顯示在圖21中。如圖21所示，人源化抗體hu23.H5L5在測試的所有劑量下均能有效地抑制腫瘤生長。

發明人亦確定了抗CD39抗體的抗腫瘤作用是否依賴於NK細胞或巨噬細胞。在第7天開始抗-去唾液酸-GM1 NK耗竭處理，20μl/小鼠腹膜內給藥，每5天一次。在第7天及第9天亦開始氯膦酸鹽脂質體的巨噬細胞耗竭處理，200μl/小鼠靜脈內給藥，每週一次。血液樣品分析資料表明該試劑可顯著移除單核吞噬細胞或NK。

在NK細胞(圖17)或巨噬細胞(圖18)被耗竭的模型中，hu23.H5L5的腫瘤生長抑制作用被消除，表明抗CD39抗體的抗腫瘤作用依賴於NK細胞及巨噬細胞。

具體地，如圖17所示，與溶媒相比，抗-去唾液酸-GM1在晚期階段略微增強了腫瘤的生長。且，與hu23.H5L5處理組相比，hu23.H5L5與抗-去唾液酸-GM1的組合完全消除了hu23.H5L5的腫瘤生長抑制作用。如圖18所示，與溶媒相比，氯膦酸鹽脂質體對腫瘤的生長無影響。但是，氯膦酸鹽脂質體處理完全消除了hu23.H5L5的腫瘤生長抑制作用。實例 6. 抗原決定基作圖 (Epitope Mapping)

為了確定抗CD39抗體的抗原決定基，發明人設計了CD39突變體且用人CD39分子表面上暴露的胺基酸的取代來定義。將突變體選殖至融合了C末端EGFP序列的表現載體，且轉染至HEK-293F細胞，如以下的表25所示。使用UniProtKB - P49961 (ENTP1_HUMAN)的編號來表示目標胺基酸突變，UniProtKB - P49961 (ENTP1_HUMAN)為人CD39的野生型胺基酸序列，其序列如SEQ ID NO：162所示。例如，V77G表示SEQ ID NO：162之第77位的纈胺酸經甘胺酸替換。表 25. 人 CD39 突變體

突變體代號	取代
KW27-1	V77G, H79Q, Q444K, G445D
KW27-2	V81S, E82A, R111A, V115A
KW27-3	E110A, R113T, E114A
KW27-4	R118A, S119A, Q120K, Q122H, E123A
KW27-5	D150A, E153S, R154A, S157K, N158A, L278F
KW27-6	Q96A, N99A, E143A, R147E
KW27-7	K188R, 190-206(SQKTRWFSIVPYETNNQ)經KTPGGS替換
KW27-8	A273S, N275A, I277S, R279A
KW27-9	S294A, K298G, K303A, E306A, T308K, Q312A
KW27-10	K288E, K289A, V290A, E315R
KW27-11	Q354A, D356S, E435A, H436Q
KW27-12	H428A, T430A, A431D, D432A
KW27-13	N371K, L372K, E375A, K376G, V377S
KW27-14	K388N, Q392K, P393S, E396A
KW27-15	A402P, G403A, K405A, E406A
KW27-16	K5A, E100A, D107A
KW27-17	Q323A, Q324A, Q327A, E331K
KW27-18	N334A, S336A, Y337G, N346A
KW27-19	Q228A, I230S, D234A, Q238A
KW27-20	R138A, M139A, E142K
KW27	SEQ ID NO：162 (野生型人CD39) MEDTKESNVK TFCSKNILAI LGFSSIIAVI ALLAVGLTQN KALPENVKYG IVLDAGSSHT SLYIYKWPAE KENDTGVVHQ VEECRVKGPG ISKFVQKVNE IGIYLTDCME RAREVIPRSQ HQETPVYLGA TAGMRLLRME SEELADRVLD VVERSLSNYP FDFQGARIIT GQEEGAYGWI TINYLLGKFS QKTRWFSIVP YETNNQETFG ALDLGGASTQ VTFVPQNQTI ESPDNALQFR LYGKDYNVYT HSFLCYGKDQ ALWQKLAKDI QVASNEILRD PCFHPGYKKV VNVSDLYKTP CTKRFEMTLP FQQFEIQGIG NYQQCHQSIL ELFNTSYCPY SQCAFNGIFL PPLQGDFGAF SAFYFVMKFL NLTSEKVSQE KVTEMMKKFC AQPWEEIKTS YAGVKEKYLS EYCFSGTYIL SLLLQGYHFT ADSWEHIHFI GKIQGSDAGW TLGYMLNLTN MIPAEQPLST PLSHSTYVFL MVLFSLVLFT VAIIGLLIFH KPSYFWKDMV

簡而言之，藉由基因合成產生人CD39突變體，且選殖至表現載體pCMV3-GFPSpark。製備包含經確證的突變體序列的載體，且轉染至HEK293F細胞。轉染後3天，收集細胞且偵測EGFP以確認轉基因表現。在產生的20種突變體中藉由FACS測試一系列劑量(自100 nM開始，3倍稀釋，11個點)的抗體，且用AlexFluor647標記的抗hIgG染色。將抗體結合描述為AlexFluor647強度除以GFP強度的相對結合。結果顯示在圖22中。

如圖22所示，人源化抗體hu23.H5L5與突變體KW27-6及KW27-20失去結合，但並未與其他突變體失去結合。突變體KW27-6在殘基Q96、N99、E143及R147處有胺基酸取代，表明該突變體的上述殘基中之一或多者或全部對於hu23.H5L5的核心抗原決定基為至關重要的；突變體KW27-20在殘基R138、M139及E142處有胺基酸取代，表明該突變體的上述殘基中之一或多者或全部對於hu23.H5L5的核心抗原決定基亦為至關重要的。

如圖22所示，嵌合抗體c34與突變體KW27-16失去結合，但並未與其他突變體失去結合。突變體KW27-16在殘基K5、E100及D107處有胺基酸取代，表明該突變體的上述殘基中之一或多者或全部對於c34的核心抗原決定基為至關重要的。

如圖22所示，嵌合抗體c35與突變體KW27-2失去結合，但並未與其他突變體失去結合。突變體KW27-2在殘基V81、E82、R111及V115處有胺基酸取代，表明該突變體的上述殘基中之一或多者或全部對於c35的核心抗原決定基為至關重要的。

如圖22所示，參考抗體T895與突變體KW27-20失去結合，但並未與其他突變體失去結合。突變體KW27-20在殘基R138、M139及E142處有胺基酸取代，表明該突變體的上述殘基中之一或多者或全部對於T895的核心抗原決定基為至關重要的。

如圖22所示，參考抗體I394與突變體KW27-6及KW27-20失去結合，但並未與其他突變體失去結合。突變體KW27-6在殘基Q96、N99、E143及R147處有胺基酸取代，表明該突變體的上述殘基中之一或多者或全部對於I394的核心抗原決定基為至關重要的；突變體KW27-20在殘基R138、M139及E142處有胺基酸取代，表明該突變體的上述殘基中之一或多者或全部對於I394的核心抗原決定基亦為至關重要的。

如圖22所示，參考抗體9-8B與突變體KW27-6失去結合，但並未與其他突變體失去結合。突變體KW27-6在殘基Q96、N99、E143及R147處有胺基酸取代，表明該突變體的上述殘基中之一或多者或全部對於9-8B的核心抗原決定基為至關重要的。

圖1顯示了抗CD39單株抗體mAb21及mAb23增強ATP介導的T細胞增殖。圖2顯示了抗CD39嵌合抗體c14、c19、c21及c23對ATP介導的T細胞增殖抑制的阻斷。hIgG4指人類IgG4同種型對照抗體。圖3顯示了樹突細胞(DC)上的CD39表現量。圖4A至圖4C顯示了抗CD39嵌合抗體c14、c19、c21及c23的ATP介導的DC活化，藉由使用FACS偵測的CD86(圖4A)、CD83(圖4B)及HLA-DR(圖4C)的表現來測定。圖5顯示了在用MOLP-8細胞(人多發性骨髓瘤細胞株)接種的小鼠中，用抗CD39嵌合抗體c23-hIgG4及c23-hIgG1處理後的腫瘤生長。圖6A分別顯示了人源化抗體hu23.H5L5與ENTPD1(即CD39)、ENTPD2(即CD39L1)、ENTPD3(即CD39L3)、ENTPD5(即CD39L4)及ENTPD6(即CD39L2)蛋白的結合特性。圖6B分別示出了陰性對照hIgG4與ENTPD1(即CD39)、ENTPD2(即CD39L1)、ENTPD3(即CD39L3)、ENTPD5(即CD39L4)及ENTPD6(即CD39L2)蛋白的結合。圖7A及圖7B顯示了藉由FACS測定的c23人源化抗體與MOLP-8細胞的結合活性。圖8顯示了c23人源化抗體(藉由酵母展示獲得)與MOLP-8細胞的結合活性。圖9A及圖9B顯示了藉由FACS測定的c23人源化抗體對SK-MEL-28細胞的ATP酶抑制。圖10A至圖10C顯示了藉由FACS測定的c14人源化抗體與MOLP-8細胞的結合活性。圖11A至圖11D顯示了人源化抗體hu23.H5L5在PBMC中的ATP介導的T細胞活化，藉由IL-2(圖11A)、IFN-γ(圖11B)、CD4⁺ T細胞增殖(圖11C)及CD8⁺ T細胞增殖(圖11D)測定。圖12A至圖12E顯示了藉由FACS測定的人源化抗體hu23.H5L5及hu14.H1L1與SK-MEL-5細胞(圖12A)、SK-MEL-28細胞(圖12B)、MOLP-8細胞(圖12C)、CHOK1-cynoCD39細胞(圖12D)及CHOK1-mCD39細胞(圖12E)的結合活性。圖13A至圖13B顯示了人源化抗體hu23.H5L5及hu14.H1L1對SK-MEL-5(圖13A)及MOLP-8(圖13B)的ATP酶抑制活性。圖14A至圖14C顯示了抗CD39人源化抗體hu23.H5L5的ATP介導的單核細胞活化，藉由CD80(圖14A)、CD86(圖14B)及CD40(圖14C)的表現來測定。圖15顯示了藉由測定CD83表現(圖15A)，人源化抗體hu23.H5L5增加了ATP介導的DC活化，且增強了T細胞增殖(圖15B)及T細胞活化(圖15C)。圖16顯示了人源化抗體hu23.H5L5及hu14.H1L1對MOLP-8異種移植小鼠中的腫瘤生長抑制。圖17顯示了抗CD39人源化抗體hu23.H5L5對NK耗竭的MOLP-8異種移植小鼠中的腫瘤生長抑制。圖18顯示了抗CD39人源化抗體hu23.H5L5對巨噬細胞耗竭的MOLP-8異種移植小鼠中的腫瘤生長抑制。圖19A顯示了人源化抗體hu23.H5L5及hu14.H1L1與參考抗體的抗原決定基分組結果。圖19B示出了所測試抗體的抗原決定基分組。圖20顯示了人源化的抗CD39抗體hu23.H5L5對由LPS刺激誘導的人類巨噬細胞IL1β釋放的影響。圖21顯示了不同劑量(0.03 mg/kg、0.3 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg)的人源化抗體hu23.H5L5在PBMC移植小鼠中對腫瘤生長的抑制。圖22顯示了人源化抗體hu23.H5L5、嵌合抗體c34及c35以及參考抗體T895、I394及9-8B的抗原決定基作圖(epitope mapping)結果。圖23A至23C顯示了藉由測定T細胞增殖(圖23A)、CD25⁺ 細胞(圖23B)及活細胞群體(圖23C)，人源化抗體hu23.H5L5逆轉由細胞外ATP抑制的CD8⁺ T細胞增殖。

<110> 中國大陸商科望(蘇州)生物醫藥科技有限公司(Elpiscience(Suzhou)Biopharma,Ltd.) 中國大陸商科望(上海)生物醫藥科技有限公司(Elpiscience Biopharma,Ltd.)

<120> 新型抗CD39抗體

<140> TW 109129335

<141> 2020-08-27

<150> PCT/CN2019/102778

<151> 2019-08-27

<150> CN 202010842863.9

<151> 2020-08-20

<160> 162

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 1

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 2

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 3

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 6

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 7

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 8

<210> 9

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> Xaa可為Tyr或Phe。

<400> 9

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 11

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 12

<210> 13

<211> 13

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 13

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 14

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為Ser或Thr。

<400> 15

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 16

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 17

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 18

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 19

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 20

<210> 21

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 21

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 22

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 23

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 24

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 25

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 26

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 27

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 28

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 29

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 30

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 31

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 32

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 33

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 34

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 35

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 36

<210> 37

<211> 19

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 37

<210> 38

<211> 19

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 38

<210> 39

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 39

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 40

<210> 41

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 41

<210> 42

<211> 122

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 42

<210> 43

<211> 121

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 43

<210> 44

<211> 118

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 44

<210> 45

<211> 119

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 45

<210> 46

<211> 121

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 46

<210> 47

<211> 123

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 47

<210> 48

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 48

<210> 49

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 49

<210> 50

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 50

<210> 51

<211> 106

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 51

<210> 52

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 52

<210> 53

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 53

<210> 54

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 54

<210> 55

<211> 116

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 55

<210> 56

<211> 106

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 56

<210> 57

<211> 111

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 57

<210> 58

<211> 106

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 58

<210> 59

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 59

<210> 60

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 60

<210> 61

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 61

<210> 62

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 62

<210> 63

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 63

<210> 64

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 64

<210> 65

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 65

<210> 66

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 66

<210> 67

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 67

<210> 68

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 68

<210> 69

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 69

<210> 70

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 70

<210> 71

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 71

<210> 72

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 72

<210> 73

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 73

<210> 74

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 74

<210> 75

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 75

<210> 76

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為Gln或Glu。

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可為Glu或Gln。

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(12)

<223> 第9位之Xaa可為Gly或Ala，第10位之Xaa可為Gly或Glu，第11位之Xaa可為Leu或Val，第12位之Xaa可為Val或Lys。

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> Xaa可為Gly或Ala。

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(20)

<223> 第18位之Xaa可為Leu、Met或Val，第19位之Xaa可為Arg或Lys，第20位之Xaa可為Val或Leu。

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> Xaa可為Ala或Lys。

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(30)

<223> 第27位之Xaa可為Phe或Tyr，第28位之Xaa可為Asn或Thr，第29位之Xaa可為Phe或Leu，第30位之Xaa可為Ser或Lys。

<400> 76

<210> 77

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為Arg或Lys。

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可為Ala或Ser。

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(9)

<223> 第8位之Xaa可為Lys或Gln，第9位之Xaa可為Arg或Gly。

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> 第13位之Xaa可為Met、Ile或Val，第14位之Xaa可為Gly或Ala。

<400> 77

<210> 78

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> 第1位之Xaa可為Arg或Lys，第2位之Xaa可為Val,Ala或Phe。

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(6)

<223> 第4位之Xaa可為Ile或Leu，第5位之Xaa可為Ser或Thr，第6位之Xaa可為Arg或Ala。

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可為Asp或Thr。

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> 第10位之Xaa可以是Lys、Ala或Ser，第11位之Xaa可為Ser或Asn。

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> Xaa可為Leu、Val或Ala。

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(18)

<223> 第15位之Xaa可為Met或Leu，第16位之Xaa可為Gln或Glu，第17位之Xaa可為Met或Leu，第18位之Xaa可為Ser、Ile或Asn。

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(22)

<223> 第21位之Xaa可為Arg或Lys，第22位之Xaa可為Ser或Thr。

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(32)

<223> 第31位之Xaa可以是Ala或Thr，第32位的Xaa可為Arg、Asn或Thr。

<400> 78

<210> 79

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 79

<210> 80

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為Glu或Gln。

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為Leu或Met。

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> 第12位之Xaa可為Ser或Thr，第13位之Xaa可為Leu、Val或Ala。

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> Xaa可為Ala或Val。

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(22)

<223> 第21位之Xaa可為Leu或Ile，第22位之Xaa可為Ser或Thr。

<400> 80

<210> 81

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可為Ala或Ser。

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa可為Arg或Lys。

<400> 81

<210> 82

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可為Ile或Val。

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為Ala或Thr。

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> 第14位之Xaa可為Asp或Ser，第15位之Xaa可為Phe或Tyr。

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> Xaa可為Leu、Met或Val。

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> Xaa可為Tyr或Phe。

<400> 82

<210> 83

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 83

<210> 84

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 84

<210> 85

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 85

<210> 86

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 86

<210> 87

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 87

<210> 88

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 88

<210> 89

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 89

<210> 90

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 90

<210> 91

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 91

<210> 92

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 92

<210> 93

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 93

<210> 94

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 94

<210> 95

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 95

<210> 96

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 96

<210> 97

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 97

<210> 98

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 98

<210> 99

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 99

<210> 100

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 100

<210> 101

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 101

<210> 102

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 102

<210> 103

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 103

<210> 104

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 104

<210> 105

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 105

<210> 106

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 106

<210> 107

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 107

<210> 108

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 108

<210> 109

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 109

<210> 110

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 110

<210> 111

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 111

<210> 112

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 112

<210> 113

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人

<400> 113

<210> 114

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 114

<210> 115

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 115

<210> 116

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 116

<210> 117

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 117

<210> 118

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 118

<210> 119

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 119

<210> 120

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 120

<210> 121

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 121

<210> 122

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 122

<210> 123

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 123

<210> 124

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 124

<210> 125

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 125

<210> 126

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可為Thr或Leu。

<400> 126

<210> 127

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 127

<210> 128

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 128

<210> 129

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 129

<210> 130

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 130

<210> 131

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 131

<210> 132

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 132

<210> 133

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 133

<210> 134

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 134

<210> 135

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 135

<210> 136

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 136

<210> 137

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 137

<210> 138

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 138

<210> 139

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 139

<210> 140

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 140

<210> 141

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 141

<210> 142

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 142

<210> 143

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 143

<210> 144

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 144

<210> 145

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 145

<210> 146

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 146

<210> 147

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 147

<210> 148

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可為Ile或Val。

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為Ala或Thr。

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> 第14位之Xaa可為Asp或Ser，第15位之Xaa可為Phe或Tyr。

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> Xaa可為Leu或Met。

<400> 148

<210> 149

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> 第1位之Xaa可為Arg或Lys，第2位之Xaa可為Val或Ala。

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為Ile或Leu。

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可為Arg或Ala。

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> 第10位之Xaa可為Ala或Ser，第11位之Xaa可為Ser或Asn。

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> Xaa可為Met或Leu。

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> Xaa可為Ser或Ile。

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> Xaa可為Arg或Asn。

<400> 149

<210> 150

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為Glu或Gln。

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> 第12位之Xaa可為Ser或Thr，第13位之Xaa可為Leu或Ala。

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> Xaa可為Ala或Val。

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(22)

<223> 第21位之Xaa可為Leu或Ile，第22位之Xaa可為Ser或Thr。

<400> 150

<210> 151

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為Arg或Lys。

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(7)

<223> 第6位之Xaa可為Asn、Gly、Ser或Gln，第7位之Xaa可為Gly、Ala或Asp。

<400> 151

<210> 152

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為Gly或Gln。

<400> 152

<210> 153

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 153

<210> 154

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> Xaa可為Leu或Met。

<400> 154

<210> 155

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可為Ala或Ser。

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> Xaa可為Gly或Ala。

<400> 155

<210> 156

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> Xaa可為Leu或Val。

<400> 156

<210> 157

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為Leu或Met。

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> Xaa可為Leu或Val。

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> Xaa可為Ala或Val。

<400> 157

<210> 158

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可為Ala或Ser。

<400> 158

<210> 159

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> Xaa可為Leu或Val。

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> Xaa可為Tyr或Phe。

<400> 159

<210> 160

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為Gln或Glu。

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> Xaa可為Val或Leu。

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> Xaa可為Asn或Thr。

<400> 160

<210> 161

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為Arg或Lys。

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可為Arg或Gly。

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> Xaa可為Met或Ile。

<400> 161

<210> 162

<211> 510

<212> PRT

<213> 智人

<400> 162

Claims

一種能夠特異性結合至人類CD39之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，該輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中：(a)該HCDR1由SEQ ID NO：1之序列所組成、該HCDR2由SEQ ID NO：7之序列所組成、該HCDR3由SEQ ID NO：13之序列所組成、該LCDR1由SEQ ID NO：19之序列所組成、該LCDR2由SEQ ID NO：25之序列所組成、且該LCDR3由SEQ ID NO：31之序列所組成；或(b)該HCDR1由SEQ ID NO：2之序列所組成、該HCDR2由SEQ ID NO：8之序列所組成、該HCDR3由SEQ ID NO：14之序列所組成、該LCDR1由SEQ ID NO：20之序列所組成、該LCDR2由SEQ ID NO：26之序列所組成、且該LCDR3由SEQ ID NO：32之序列所組成；或(c)該HCDR1由SEQ ID NO：3之序列所組成、該HCDR2由SEQ ID NO：37之序列所組成、該HCDR3由SEQ ID NO：40之序列所組成、該LCDR1由SEQ ID NO：21之序列所組成、該LCDR2由SEQ ID NO：27之序列所組成、且該LCDR3由SEQ ID NO：33之序列所組成；或(d)該HCDR1由SEQ ID NO：3之序列所組成、該HCDR2由SEQ ID NO：38之序列所組成、該HCDR3由SEQ ID NO：41之序列所組成、該LCDR1由SEQ ID NO：21之序列所組成、該LCDR2由SEQ ID NO：27之序列所組成、且該LCDR3由SEQ ID NO：33之序列所組成；或(e)該HCDR1由SEQ ID NO：4之序列所組成、該HCDR2由SEQ ID NO：151之序列所組成、該HCDR3由SEQ ID NO：16之序列所組成、該LCDR1由SEQ ID NO：22之序列所組成、該LCDR2由SEQ ID NO：28之序列所組成、且該LCDR3由SEQ ID NO：34之序列所組成，其中X₅₈為R或K，X₅₉為N、G、S或Q，X₆₀為G、A或D；或(f)該HCDR1由SEQ ID NO：5之序列所組成、該HCDR2由SEQ ID NO：11之序列所組成、該HCDR3由SEQ ID NO：17之序列所組成、該LCDR1由SEQ ID NO：23之序列所組成、該LCDR2由SEQ ID NO：29之序列所組成、且該LCDR3由SEQ ID NO：35之序列所組成；或(g)該HCDR1由SEQ ID NO：6之序列所組成、該HCDR2由SEQ ID NO：12之序列所組成、該HCDR3由SEQ ID NO：18之序列所組成、該LCDR1由SEQ ID NO：24之序列所組成、該LCDR2由SEQ ID NO：30之序列所組成、且該LCDR3由SEQ ID NO：36之序列所組成。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中：(a)該HCDR1由SEQ ID NO：4之序列所組成、該HCDR2由SEQ ID NO：10之序列所組成、該HCDR3由SEQ ID NO：16之序列所組成、該LCDR1由SEQ ID NO：22之序列所組成、該LCDR2由SEQ ID NO：28之序列所組成、且該LCDR3由SEQ ID NO：34之序列所組成；或(b)該HCDR1由SEQ ID NO：4之序列所組成、該HCDR2由選自下組之序列所組成：SEQ ID NO：134、135、136、137、138及139、該HCDR3由SEQ ID NO：16之序列所組成、該LCDR1由SEQ ID NO：22之序列所組成、該LCDR2由SEQ ID NO：28之序列所組成、且該LCDR3由SEQ ID NO：34之序列所組成。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其進一步包含重鏈HFR1、HFR2、HFR3及HFR4中之一或多者，及/或輕鏈LFR1、LFR2、LFR3及LFR4中之一或多者，其中：(a)該HFR1包含X₁₉VQLVX₂₀SGX₂₁X₂₂X₂₃X₂₄KPGX₂₅SX₂₆X₂₇X₂₈SCX₂₉ASGX₃₀X₃₁X₃₂X₃₃(SEQ ID NO：76)之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，(b)該HFR2包含WVX₃₄QX₃₅PGX₃₆X₃₇LEWX₃₈X₃₉(SEQ ID NO：77)之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，(c)該HFR3序列包含X₄₀X₄₁TX₄₂X₄₃X₄₄DX₄₅SX₄₆X₄₇TX₄₈YX₄₉X₅₀X₅₁X₅₂SLX₅₃X₅₄EDTAVYYCX₅₅X₅₆(SEQ ID NO：78)之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，(d)該HFR4包含WGQGTX₅₇VTVSS(SEQ ID NO：126)之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，(e)該LFR1包含X₃IVX₄TQSPATLX₅X₆SPGERX₇TX₈X₉C(SEQ ID NO：80)之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，(f)該LFR2包含WYQQKPGQX₁₀PX₁₁LLIY(SEQ ID NO：81)之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，(g)該LFR3包含GX₁₂PX₁₃RFSGSGSGTX₁₄X₁₅TLTISSX₁₆EPEDFAVYX₁₇C(SEQ ID NO：82)之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，及(h)該LFR4包含FGX₁₈GTKLEIK(SEQ ID NO：152)之序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，其中X₃為E或Q；X₄為L或M；X₅為S或T；X₆為L、V或A；X₇為A或V；X₈為L或I；X₉為S或T；X₁₀為A或S；X₁₁為R或K；X₁₂為I或V；X₁₃為A或T；X₁₄為D或S；X₁₅為F或Y；X₁₆為L、M或V；X₁₇為Y或F；X₁₈為G或Q；X₁₉為Q或E；X₂₀為E或Q；X₂₁為G或A；X₂₂為G或E；X₂₃為L或V；X₂₄為V或K；X₂₅為G或A；X₂₆為L、M或V；X₂₇為R或K；X₂₈為V或L；X₂₉為A或K；X₃₀為F或Y；X₃₁為N或T；X₃₂為F或L；X₃₃為S或K；X₃₄為R或K；X₃₅為A或S；X₃₆為K或Q；X₃₇為R或G；X₃₈為M、I或V；X₃₉為G或A；X₄₀為R或K；X₄₁為V、A或F；X₄₂為I或L；X₄₃為S或T；X₄₄為R或A；X₄₅為D或T；X₄₆為K、A或S；X₄₇為S或N；X₄₈為L、V或A；X₄₉為M或L；X₅₀為Q或E；X₅₁為M或L；X₅₂為S、I或N；X₅₃為R或K；X₅₄為S或T；X₅₅為A或T；X₅₆為R、N或T；以及X₅₇為T或L。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含選自由以下組成之序列：SEQ ID NO：60、62、64、66、68、70、72、74、140、141、142、146、147、39，以及與其具有至少80%序列同一性，但仍然保持與人類CD39特異性結合親和性之同源序列；且該輕鏈可變區包含選自由以下組成之序列：SEQ ID NO：61、63、65、67、69、71、73、75、143、144、145、111、112、63，以及與其具有至少80%序列同一性，但仍然保持與人類CD39特異性結合親和性之同源序列。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：42之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：51之序列，或(b)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：43之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：52之序列，或(c)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：44之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：53之序列，或(d)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：45之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：54之序列，或(e)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：47之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：56之序列，或(f)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：49之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：58之序列，或(g)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：50之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：59之序列，或(h)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：60之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：63之序列，或(i)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：62之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：63之序列，或(j)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：64之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：63之序列，或(k)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：66之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：63之序列，或 (l)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：60之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：65之序列，或(m)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：62之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：65之序列，或(n)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：64之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：65之序列，或(o)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：66之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：65之序列，或(p)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：60之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：67之序列，或(q)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：62之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：67之序列，或(r)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：64之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：67之序列，或(s)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：66之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：67之序列，或(t)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：140之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：61之序列，或(u)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：141之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：61之序列，或(v)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：142之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：61之序列，或(w)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：140之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：143之序列，或(x)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：141之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：143之序列，或(y)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：142之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：143之序列，或(z)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：140之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：144之序列，或(aa)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：141之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：144之序列，或(bb)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：142之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：144之序列，或(cc)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：140之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：145之序列，或(dd)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：141之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：145之序列，或(ee)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：142之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：145之序列，或(ff)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：146之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：111之序列，或(gg)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：146之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：112之序列，或(hh)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：147之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：111之序列，或 (ii)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：39之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：63之序列，或(jj)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：68之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：69之序列，或(kk)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：70之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：69之序列，或(ll)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：72之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：69之序列，或(mm)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：74之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：69之序列，或(nn)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：68之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：71之序列，或(oo)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：70之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：71之序列，或(pp)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：72之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：71之序列，或(qq)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：74之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：71之序列，或(rr)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：68之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：73之序列，或(ss)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：70之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：73之序列，或(tt)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：72之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：73之序列，或(uu)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：74之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：73之序列，或(vv)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：68之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：75之序列，或(ww)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：70之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：75之序列，或(xx)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：72之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：75之序列，或(yy)重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：74之序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：75之序列。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其進一步包含一或多個胺基酸殘基取代或修飾，但仍然保持與人類CD39之特異性結合親和性；其中該一或多個胺基酸殘基取代或修飾在該重鏈可變區或輕鏈可變區中之一或多個非CDR序列中。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其進一步包含Fc區，視情況包含人類免疫球蛋白(Ig)之Fc區，或視情況包含人類IgG之Fc區，或視情況包含源自人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgM之Fc區，或視情況包含源自含有L234A及L235A突變之人類IgG1之Fc區。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為人源化的；或其中該抗體或其抗原結合片段為單株抗體、雙特異性抗體、雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定的雙抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single chain domain antibody)、奈米抗體(nanobody)、重組抗體、嵌合抗體、標記抗體、域抗體(domain antibody)、雙價域抗體、雙價抗體、抗獨特型(idiotypic)抗體或融合蛋白。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其與以下抗體競爭結合人類CD39：(i)包含含有SEQ ID NO：43之序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：52之序列之輕鏈可變區之抗體；(ii)包含含有SEQ ID NO：44之序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：53之序列之輕鏈可變區之抗體；(iii)包含含有SEQ ID NO：45之序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：54之序列之輕鏈可變區之抗體；或(iv)包含含有SEQ ID NO：47之序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：56之序列之輕鏈可變區之抗體；其中該抗體不為抗體9-8B、抗體T895及抗體I394中之任一者，其中：抗體9-8B包含：包含SEQ ID NO：46之序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：48之序列之輕鏈可變區；抗體T895包含：包含SEQ ID NO：55之序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：57之序列之輕鏈可變區；以及抗體I394包含：包含SEQ ID NO：113之序列之重鏈可變區及包含 SEQ ID NO：114之序列之輕鏈可變區。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其特異性結合至CD39之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自下組之一或多個殘基：Q96、N99、E143、R147、R138、M139、E142、K5、E100、D107、V81、E82、R111及V115。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其與一或多個綴合物部分(conjugate moieties)連接。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段，以及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
一種分離的多核苷酸，其編碼如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段。
一種載體，其包含如請求項13之分離的多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項14之載體。
一種套組，其包含如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項12之醫藥組合物，以及第二治療劑。
一種表現如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段之方法，其包含在表現載體之條件下培養包含該載體之宿主細胞，該載體包含編碼該抗體或其抗原片段之分離的多核苷酸。
一種如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項12之醫藥組合物之用途，其係用於製備治療、預防或減輕在個體中a)與CD39相關之疾病、病症或狀況、b)藉由降低CD39之ATP酶活性而可治療之疾病或c)與腺苷介導之T細胞、單核細胞、巨噬細胞、DC、APC、NK及/或B細胞活性之抑制相關的疾病之藥劑。
如請求項18之用途，其中該疾病、病症或狀況為癌症、自體免疫性疾病或感染，及視情況其中該癌症為肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、基底細胞癌、膽囊癌、胃癌、肺癌、支氣管癌、骨癌、肝膽管癌、胰臟癌、乳癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、腎癌、腎盂及輸尿管癌、唾液腺癌、小腸癌、尿道癌、膀胱癌、頭頸癌、脊椎癌、腦癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、結腸癌、結直腸癌、直腸癌、食道癌、胃腸道癌、皮膚癌、前列腺癌、垂體癌、陰道癌、甲狀腺癌、喉癌、膠質母細胞瘤、黑素瘤、骨髓增生異常綜合症、肉瘤、畸胎瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T或B細胞淋巴瘤、胃腸道間質瘤、軟組織腫瘤、肝細胞癌或腺癌；該自體免疫性疾病為免疫性血小板減少症、系統性硬皮病、硬化症、成人型呼吸窘迫症候群、濕疹、哮喘、乾燥症候群、艾迪生氏病、巨細胞動脈炎、免疫複合體腎炎、免疫性血小板減少性紫癜、自體免疫性血小板減少症、乳糜瀉(Celiac disease)、牛皮癬、皮炎、結腸炎或系統性紅斑狼瘡；該感染為HIV感染、HBV感染、HCV感染、炎性腸病或克羅恩氏病。
如請求項18之用途，其中該藥劑進一步包含第二治療劑或與第二治療劑組合使用。
一種調節CD39陽性細胞中CD39活性之體外(in vitro)方法，其包含將該CD39陽性細胞暴露於如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項12之醫藥組合物。
一種偵測樣品中CD39之存在或含量之方法，其包含將該樣品與如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項12之醫藥組合物接觸，且確定該樣品中CD39之存在或含量。
一種在個體中診斷與CD39相關之疾病、病症或狀況之方法，其包含：a)將獲取自該個體之樣品與如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項12之醫藥組合物接觸；b)測定在該樣品中CD39之存在或含量；c)將該CD39之存在或含量與該個體之與CD39相關之疾病、病症或狀況之存在或狀態相關聯。
一種用於偵測CD39之套組，其包含如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項12之醫藥組合物。