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JP7308150B2 - 癌を処置するための組成物及び方法 - Google Patents

癌を処置するための組成物及び方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、任意の図面、両方がその全体において参照により本明細書中に組み込まれる２０１７年３月１６日提出の米国仮特許出願第６２／４７１，９９４号明細書及び２０１７年１１月１５日提出の米国仮特許出願第６２／５８６，２２０号明細書の利益を主張する。
配列表の参照
本願は、電子方式の配列リストと共に提出されている。本配列リストは、２０１８年３月１５日作成の「ＣＤ３９－６＿ＳＴ２５」という名称で提供されており、サイズは、５３ｋＢである。本配列リストの電子方式の情報は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
本発明は、可溶性ヒトＣＤ３９の酵素活性を阻害する抗原結合化合物（例えば、抗体）に関する。本発明は、そのような化合物を産生する細胞；そのような化合物並びにその抗体、フラグメント、バリアント及び誘導体を製造する方法；それを含む医薬組成物；疾患、例えば癌を診断、処置又は予防するためにこの化合物を使用する方法にも関する。
８種の異なるＥＮＴＰＤ遺伝子は、ＮＴＰＤアーゼタンパク質ファミリのメンバーをコードする。個々のＮＴＰＤアーゼサブタイプは、細胞内での位置と機能特性とが異なる。細胞膜結合型ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼは、ヌクレオチドのｃリン酸塩及びｂリン酸塩を加水分解することにより、細胞表面でのヌクレオチドレベルを制御する。
ＮＴＰＤアーゼ１（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１）（ＣＤ３９／ＥＮＴＰＤ１又は血管ＣＤ３９としても既知である）は、別の酵素ＣＤ７３（エクト－５’－ヌクレオチダーゼ）と一緒に機能して、細胞外アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び細胞外アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を加水分解してアデノシンを生成し、このアデノシンは、アデノシン受容体に結合してＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の応答を阻害し、それにより免疫系が抑制される。ＣＤ７３／ＣＤ３９経路を介したアデノシンの生成は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の免疫抑制機能の主要な機構として認識されている。一部のヒト癌では、ＣＤ３９＋Ｔｒｅｇの数が増加しており、いくつかのインビボモデルを使用して、腫瘍の増殖及び転移の促進におけるＣＤ３９＋Ｔｒｅｇの重要性が実証されている。しかしながら、ＣＤ３９は、腫瘍細胞によっても発現されており、ＣＤ３９＋腫瘍細胞は、アデノシン経路を介して免疫抑制を媒介する可能性がある。癌細胞中のＣＤ３９は、ＡＴＰアーゼ活性を示し、ＣＤ７３と一緒にアデノシンを生成する。ＣＤ７３＋ＣＤ３９＋癌細胞は、ＣＤ３９依存的及びアデノシン依存的に、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の増殖並びに細胞傷害性エフェクターＣＤ８Ｔ細胞（ＣＴＬ）の生成を阻害した。ＣＤ３９は、いくつかの固形腫瘍（結腸直腸癌、頭頸部癌、膵癌）及び慢性リンパ球性白血病で増加していることが報告されている。ＣＤ３９発現細胞中のＣＤ３９に結合して阻害する抗体は、特許文献１で開示されている。抗体「Ａ１」（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）は、染色用途に使用され、細胞中のＣＤ３９活性を中和する能力を示さない。非特許文献１では、ＦｃγＲに結合し、且つエフェクター機能を有する抗ＣＤ３９が使用されているが、ブロッキングであるとも述べられている。実際には、ＣＤ３９をブロックしないか又は純粋なブロッカーでない抗体の使用と組み合わされた、様々な細胞タイプ（例えば、白血球及び腫瘍細胞）によるＣＤ３９発現により、抗体の根本的な活性の評価のための設定は複雑になる。今日まで、ＣＤ３９活性部位の唯一の報告された阻害剤は、依然として、ＡＲＬ６７１５６に例示される小分子の非加水分解性ＡＴＰ類似体であり、これは、この活性部位の直接阻害が必要であることを示唆する。しかしながら、ＡＲＬ６７１５６は、ＣＤ３９に特異的ではなく、他のＮＴＰＤアーゼ（例えば、ＮＴＰＤアーゼ１、ＮＴＰＤアーゼ３、ＮＰＰ１又はマウスＮＴＰＤアーゼ８）も阻害し、さらに弱い競合阻害剤としてのものであるにすぎない（非特許文献２）。
Ｃ３９は、Ｎ末端及びＣ末端の付近の２個の膜貫通ドメインと、短い細胞質Ｎ末端セグメント及び細胞質Ｃ末端セグメントと、活性部位を含む大きい細胞外ドメインとを有する。しかしながら、ＣＤ３９は、概して、この分子の２個の端部における２個の膜貫通ドメインによって膜に固定されているが、ＣＤ３９の可溶性触媒活性型がヒト及びマウスの循環中でも見られ得ることも最近報告されている（非特許文献３）。様々な抗ＣＤ３９抗体が説明されているにもかかわらず、可溶性細胞外ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を阻害することができる抗体は、報告されていない。
国際公開第２００９／０９５４７８号パンフレット
Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ．７（６）：１１８１－１１８８ Ｌｅｖｅｓｑｕｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５２：１４１－１５０ Ｙｅｇｕｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）ＦＡＳＥＢ Ｊ．２６（９）：３８７５－３８８３
本発明者らは、可溶性（細胞外ドメイン）ヒトＣＤ３９タンパク質の酵素活性（ＡＴＰアーゼ活性）を阻害する抗体を得ている。この抗体は、さらに、腫瘍細胞等の細胞の表面で発現されるヒトＣＤ３９タンパク質上に存在するエピトープに結合し、細胞膜結合型ＣＤ３９酵素（細胞の表面で発現されるＣＤ３９）の酵素活性（ＡＴＰアーゼ活性）を強力に阻害する。この抗体を有利に使用して、膜結合型及び可溶性の両方のＣＤ３９タンパク質（溶液中での細胞外ドメインタンパク質）を中和することにより、個体でのＣＤ３９活性のより高い中和を達成し得、それにより例えば癌及び／又は感染性疾患の処置のために免疫抑制が低減される。膜結合型ＣＤ３９酵素の酵素活性（ＡＴＰアーゼ活性）を阻害する他の抗ＣＤ３９抗体が既に説明されているが、この抗体は、細胞膜に結合しない可溶性ＣＤ３９タンパク質を阻害しない。
従って、ある実施形態において、提供されるのは、可溶性ＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９）に結合し、且つそのＡＴＰアーゼ活性を阻害又は中和する抗原結合ドメイン又はそのようなものを含むタンパク質（任意選択により、抗体又は抗体フラグメント）である。ある実施形態において、このｓＣＤ３９タンパク質は、膜結合型ＣＤ３９で見出される２個の膜貫通ドメイン（すなわちＮ末端及びＣ末端の付近の膜貫通ドメイン）を欠いている。ある実施形態において、ｓＣＤ３９は、例えば、ヒト個体の循環において見出される非膜結合型ｓＣＤ３９タンパク質である。ある実施形態において、ｓＣＤ３９は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか又はこの配列からなる（任意選択により、Ｃ末端タグ又は別の非ＣＤ３９由来アミノ酸配列をさらに含む）。ある実施形態において、本タンパク質、本抗体又は本抗体フラグメントは、例えば、本明細書で開示されたように細胞の非存在下で行われる方法又はアッセイ（例えば、実施例、方法を参照されたい）に従って溶液中でｓＣＤ３９と共にインキュベートされた場合、ｓＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害する。ある実施形態において、本タンパク質、本抗体又は本抗体フラグメントは、可溶型（細胞外ドメインタンパク質）及び膜結合型の両方でヒトＣＤ３９タンパク質に特異的に結合する。
理論に拘束されることを望まないが、一部の抗体は、膜結合型ＣＤ３９（ｍｅｍＣＤ３９）のドメイン運動を阻害することにより、膜結合型ＣＤ３９を中和し得るが、可溶性ＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９）の活性に類似の影響を及ぼさない。ｍｅｍＣＤ３９は、ホモ多量体として生じるが、ｓＣＤ３９は単量体であることが報告されており、加えて、ｍｅｍＣＤ３９中の膜貫通ドメインは、活性部位との機能的関係の基礎をなす動的運動を受けることも報告されている。その結果、ｓＣＤ３９と異なり、ｍｅｍＣＤ３９は、抗体により媒介される中和を可能にする設定を提示する場合がある。１つの可能性は、（例えば、ｍｅｍＣＤ３９ホモ多量体内の）２個のｍｅｍＣＤ３９分子に同時に結合する二価抗体の使用が機能的中和に必要とされることである。
ｓＣＤ３９（及びｍｅｍＣＤ３９）の活性を中和する本抗体は、二価バインダーとしての使用に加えて、ｓＣＤ３９に加えてｍｅｍＣＤ３９を標的としているかどうかにかかわらず、一価バインダーとしても有効であり得る。その結果、ある実施形態において、提供されるのは、ヒトＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９及び／又はｍｅｍＣＤ３９）に一価で結合し、且つその酵素（ＡＴＰアーゼ）活性を中和する抗原結合タンパク質である。この抗原結合タンパク質は、任意選択により、単一のＣＤ３９タンパク質に結合し、且つ／又はＣＤ３９タンパク質に結合することができる単一の抗原結合ドメインを有するとして規定され得る。ある実施形態において、提供されるのは、ヒトＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９及び／又はｍｅｍＣＤ３９）に一価で結合し、且つその酵素（ＡＴＰアーゼ）活性を中和する抗体フラグメント（任意選択により、Ｆ（ａｂ）フラグメント、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ、多重特異的抗体）である。ある実施形態において、ヒトＣＤ３９タンパク質に一価で結合するＣＤ３９中和抗原結合タンパク質は、多重特異的抗原結合タンパク質（例えば、多重特異的抗体、二重特異的抗体、三重特異的抗体等）である。ある実施形態において、ヒトＣＤ３９タンパク質に一価で結合するＣＤ３９中和抗原結合タンパク質は、ＣＤ３９（ｓＣＤ３９及び／又はｍｅｍＣＤ３９）に結合する第１の（又は単一の）抗原結合ドメインと、ＣＤ３９以外のタンパク質に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む。
有利には、ある実施形態において、本抗体は、ヒトＦｃγ受容体（例えば、ヒトＣＤ１６、ヒトＣＤ３２ａ、ヒト３２ｂ及びヒトＣＤ６４の１つ又は複数（又は全て））への結合が減少しているか又はそれを実質的に欠いているように改変されているヒトＦｃドメインを含む。ある態様において、この抗体は、そのＣＤ３９阻害活性に関してＡＤＣＣ、ＣＤＣ又は毒素により媒介されるＣＤ３９発現細胞の枯渇に依存しない。この抗体は、「純粋な」ＣＤ３９ブロッカーとして使用され得、免疫調節活性を可能にする。
代替実施形態において、本結合分子は、この結合分子が、そのＦｃドメインを介してエフェクター機能を保持及び／又は媒介するように生成され得る。ある実施形態において、この抗体は、ヒトＦｃγ受容体（例えば、ヒトＣＤ１６、ヒトＣＤ３２ａ、ヒトＣＤ３２ｂ及びヒトＣＤ６４の１つ又は複数（又は全て））に結合するヒトＦｃドメインを含む。
別の実施形態において、このＦｃドメインは、任意選択により、１つ又は複数のヒトＦｃγ受容体への結合を保持するが、１つ又は複数の他のヒトＦｃγ受容体への結合が減少していることにより、Ｆｃγ受容体結合が減少するように改変され得る。
ある態様において、本抗体は、血管ＣＤ３９に特異的に結合し、例えば、この抗体は、配列番号１の配列を有するポリペプチドに結合するが、分泌型ＣＤ３９アイソフォームポリペプチド（例えば、ＣＤ３９－Ｌ２ポリペプチド及び／又はＣＤ３９－Ｌ４ポリペプチド）に結合しない。任意選択により、本抗ＣＤ３９抗体は、血管ＣＤ３９に特異的に結合し、例えば、この抗体は、配列番号１の配列を有するポリペプチドに結合するが、膜結合型ＣＤ３９アイソフォーム（例えば、ＣＤ３９－Ｌ１ポリペプチド及び／又はＣＤ３９－Ｌ３ポリペプチド）に結合しない。
本開示の抗体は、細胞の表面で発現される膜結合型ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害し得る。
ある態様において、この抗体は、そのＣＤ３９阻害活性に関してＣＤ３９下方調節に依存しない。
本開示の抗体は、ＣＤ３９の内部移行の誘導の有無にかかわらず及びＣＤ１６（ＦｃγＩＩＩ受容体）の結合の有無にかかわらず、並びに／又はＣＤ３９発現細胞へのＡＤＣＣ及び／若しくはＣＤＣの実質的な指向の有無にかかわらず、可溶性ＣＤ３９の阻害に加えて、細胞の表面で発現される膜結合型ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害し得る。任意選択により、この抗体は、Ｆｃドメインを保持し、且つヒトＦｃＲｎへの結合を保持する。
ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣの誘導により機能する抗体は、ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性の完全な中和／阻害を伴わなくても効率的であり得るが、十分な抗体がＣＤ３９発現細胞に結合してＡＤＣＣが誘導される限り、中和する非枯渇性抗体は、ＡＴＰアーゼの酵素活性のより強力な阻害を必要とする場合がある。ある実施形態において、非枯渇性抗体は、任意選択により、さらにヒトへの抗体の投与に適合する濃度において、（例えば、本明細書で開示された方法によって評価される場合に）可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の低下をもたらすであろう。ある実施形態において、非枯渇性抗体は、任意選択により、さらにヒトへの抗体の投与に適合する濃度において、本明細書で開示された方法によって測定される場合、（例えば、ＣＤ３９＋細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞）によるＡＭＰ生成の減少によって評価される場合にＣＤ３９発現細胞のＡＴＰアーゼ活性の少なくとも７０％、８０％、９０％の低下をもたらすであろう。
抗体が結合するＣＤ３９上のエピトープは、様々な細胞（例えば、癌細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、Ｂ細胞、遺伝子移入細胞）によって発現されるＣＤ３９ポリペプチド上に存在し、フローサイトメトリーによって決定される場合に高親和性で結合する。
抗体は、任意選択により、表面でＣＤ３９ポリペプチドを発現する細胞への結合に関して、２μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下、０．５μｇ／ｍｌ以下、０．１μｇ／ｍｌ以下又は０．０５μｇ／ｍｌ以下の、フローサイトメトリーによって決定されるＥＣ５０によって特徴付けられ得る。ある実施形態において、この細胞は、表面でＣＤ３９を発現するように作製されている細胞である。ある実施形態において、この細胞は、表面でＣＤ３９を内因的に発現する細胞であり、例えば制御性Ｔ（ＴＲｅｇ）細胞、Ｂ細胞、癌細胞、リンパ腫細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ細胞）、白血病細胞、膀胱癌細胞、神経膠腫細胞、神経膠芽腫細胞、卵巣癌細胞、黒色腫細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、食道癌細胞又は乳癌細胞である。
ある態様において、提供されるのは、（ａ）細胞の表面で発現された膜結合型ＣＤ３９タンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の酵素活性を阻害することができ、且つ（ｂ）可溶性ＣＤ３９タンパク質（例えば、配列番号４４のアミノ酸配列を含む）の酵素活性を阻害することができる抗ＣＤ３９抗体である。ある実施形態において、この抗体は、ヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ６４）及び／若しくはＣ１ｑに（例えば、この抗体のＦｃドメインを介して）実質的に結合せず、且つ／又はＡＤＣＣ及び／若しくはＣＤＣをＣＤ３９発現細胞に実質的に向けない。任意選択により、この抗体は、Ｆｃドメインを保持し、且つヒトＦｃＲｎへの結合を保持する。
ある実施形態において、この抗体は、抗ＣＤ３９抗体の次の連続投与まで、所望の期間（例えば、１週間、２週間、１ヶ月）にわたり、ｓＣＤ３９及び／又はｍｅｍＣＤ３９の酵素活性を中和するのに有効な量で投与される。
ある実施形態において、この抗体は、少なくとも、ｓＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の阻害に関するＥＣ５０、ＥＣ７０又はＥＣ１００に等しい抗体の血中濃度をもたらす投与量及び／又は頻度で投与され、任意選択により、この濃度は、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月にわたり維持されるか、又は抗ＣＤ３９抗体の次の連続投与まで維持される。
ある態様において、本抗体は、Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２（配列番号１を基準とする）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、これらの残基の１つ、２つ又は３つ）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
ある態様において、抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号１のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される残基の１つ、２つ又は３つで突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合の減少（例えば、実質的に完全な結合の喪失）を示し、任意選択により、突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異Ｒ１３８Ａ、Ｍ１３９Ａ及びＥ１４２Ｋを有する。任意選択のある態様において、この抗体は、突然変異体１９以外の表１の突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドの何れかへの結合を喪失していない。別の任意選択の態様において、この抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号１のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される残基の１つ、２つ、３つ又は４つで突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合の減少（任意選択により、減少しているが、実質的に完全ではない結合の喪失；又は任意選択により、実質的に完全な結合の喪失）を示し、任意選択により、突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異Ｑ９６Ａ、Ｎ９９Ａ、Ｅ１４３Ａ及びＲ１４７Ｅを有する。
ある態様において、本抗体は、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、これらの残基の１つ、２つ、３つ又は４つ）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。ある態様において、本抗体は、本抗体と、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの間の結合と比較して、それぞれの場合にＱ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ又は４つの残基で突然変異を含む突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドへの結合が減少している（例えば、実質的に完全な結合の喪失）。
ある態様において、本抗体は、（ａ）Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２（配列番号１を基準とする）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、これらの残基の１つ、２つ又は３つ）と、（ｂ）Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、これらの残基の１つ、２つ、３つ又は４つ）とを含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
ある態様において、抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号１のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、それぞれの場合に（ａ）Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される残基の１つ、２つ、３つ又は４つで突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドと、（ｂ）Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される残基の１つ、２つ又は３つで突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドとの両方への結合の減少（例えば、実質的に完全な結合の喪失）を示す。任意選択により、（ａ）の突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異Ｑ９６Ａ、Ｎ９９Ａ、Ｅ１４３Ａ及びＲ１４７Ｅを有する。任意選択により、（ｂ）の突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異Ｒ１３８Ａ、Ｍ１３９Ａ及びＥ１４２Ｋを有する。任意選択により、この抗体は、突然変異体５及び１９以外の表１の突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドの何れかへの結合を喪失していない。
ある態様において、本抗体は、Ｋ８７、Ｅ１００及びＤ１０７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、これらの残基の１つ、２つ、３つ又は４つ）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
ある態様において、抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号１のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、Ｋ８７、Ｅ１００及びＤ１０７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される残基の１つ、２つ、３つ又は４つで突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合の減少（実質的に完全な結合の喪失）を示し、任意選択により、突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異Ｋ８７Ａ、Ｅ１００Ａ及びＤ１０７Ａを有する。任意選択により、この抗体は、突然変異体１５以外の表１の突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドの何れかへの結合を喪失していない。
ある態様において、本抗体は、Ｎ３７１、Ｌ３７２、Ｅ３７５、Ｋ３７６及びＶ３７７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、これらの残基の１つ、２つ、３つ又は４つ）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
ある態様において、抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号１のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、Ｎ３７１、Ｌ３７２、Ｅ３７５、Ｋ３７６及びＶ３７７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される残基の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つで突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合の減少（例えば、実質的に完全な結合の喪失）を示し、任意選択により、突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異Ｎ３７１Ｋ、Ｌ３７２Ｋ、Ｅ３７５Ａ、Ｋ３７６Ｇ及びＶ３７７Ｓと、残基３７６及び３７７間のバリンの挿入とを有する。任意選択により、この抗体は、突然変異体１１以外の表１の突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドの何れかへの結合を喪失していない。
ある実施形態において、本ＣＤ３９中和抗体は、精製済形態において、細胞フリーアッセイでｓＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の低下を引き起こし得ることによって特徴付けられ得、任意選択により、少なくとも７０％、８０％又は９０％の、ｓＣＤ３９によるＡＭＰ生成の減少を引き起こし、任意選択により、例えば本明細書で開示されたアッセイで評価される場合、（陰性対照と比較して）存在するＡＴＰの増加を生じさせる。例えば、ｓＣＤ３９阻害を、抗ＣＤ３９抗体とのインキュベーション後に存在するＡＴＰの量に比例する発光ユニットを定量することによって評価し得る。ある実施形態において、このＣＤ３９中和抗体は、１μｇ／ｍｌ以下、任意選択により０．５μｇ／ｍｌ以下、任意選択により０．１μｇ／ｍｌ以下の、ｓＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の阻害に関するＥＣ５０によって特徴付けられ得る。
任意選択により、ｓＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の阻害を、試験抗体の用量範囲を３７℃で１時間にわたり実施例、方法で説明されている可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質と共にインキュベートする細胞フリーバージョンのアッセイにおいて、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して定量することによって決定し、２０μＭのＡＴＰを、３７℃でさらに３０分にわたりプレートに添加した後にＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（商標）（ＣＴＧ）試薬を添加し、暗所での５分にわたるインキュベーション後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）ルミノメーターを使用して放射光を定量する（例えば、実施例、方法を参照されたい）。
任意選択により、本ＣＤ３９中和抗体は、精製済形態において、ＣＤ３９の細胞のＡＴＰアーゼ活性の低下を引き起こし得ることによってさらに特徴付けられ得、任意選択で、少なくとも７０％、８０％又は９０％の、ＣＤ３９発現細胞によるＡＭＰ生成の減少を生じさせる。ある実施形態において、このＣＤ３９中和抗体は、１μｇ／ｍｌ以下、任意選択により０．５μｇ／ｍｌ以下、任意選択により０．１μｇ／ｍｌ以下の、細胞によって発現されるＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性の阻害に関するＥＣ５０（例えば、ＣＤ３９発現細胞によるＡＭＰ生成の阻害に関するＥＣ５０）によって特徴付けられ得る。
任意選択により、細胞によって発現されるＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性の阻害は、ＡＴＰの加水分解によって生成されたＡＭＰを定量することにより、Ｒａｍｏｓ細胞中でのＡＴＰアーゼ活性の中和を評価することによって決定される（例えば、実施例、方法を参照されたい）。
ある態様において、ＣＤ３９発現細胞によるＡＴＰアーゼ活性の中和を、ＣＤ３９発現細胞（例えば、本明細書で使用されるＲａｍｏｓリンパ腫細胞、例えばＡＴＣＣ、リファレンスＣＲＬ－１５９６から入手可能）を抗体と接触させ、且つ例えば質量分析によってＡＭＰの産生を評価することによって決定し、生成されたＡＭＰの減少は、ＡＴＰアーゼ活性の中和を示す。任意選択により、抗体は、このアッセイにおいて、少なくとも７０％、８０％又は９０％の、生成されたＡＭＰの減少を生じさせる。任意選択により、抗体は、少なくとも７０％、８０％又は９０％の、Ｂ細胞による細胞外ＡＴＰアーゼ活性の減少を生じさせる。
ある態様において、提供されるのは、ｓＣＤ３９と、細胞表面で発現されるＣＤ３９（ｍｅｍＣＤ３９）との両方に存在する抗原決定基に結合する中和抗ＣＤ３９抗体である。
提供されるある態様で提供されるのは、抗体Ｉ－３９４が結合するＣＤ３９上のエピトープへの結合に関して競合する（例えば、ＣＤ３９ポリペプチド上のエピトープへの結合に関して、Ｉ－３９４の何れかの重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域を有する抗体と競合する）中和抗ＣＤ３９抗体である。
本明細書の実施形態の何れかのある態様において、提供されるのは、モノクローナル抗体Ｉ－３９４と同一のエピトープに結合し、且つ／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合に関して競合する（例えば、Ｉ－３９４の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域を有する抗体と同一のエピトープに結合し、且つ／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合に関して競合する）抗原結合化合物である。ある実施形態において、提供されるのは、配列番号６及び配列番号７のＶＨ領域及びＶＬ領域をそれぞれ有する抗体と同一のエピトープに結合し、且つ／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合に関して競合する抗原結合化合物である。
ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、Ｉ－３９４が結合するＣＤ３９上のアミノ酸残基からなる群から選択される１つ、２つ又は３つのアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。
本明細書の実施形態の何れかのある態様において、提供されるのは、モノクローナル抗体Ｉ－３９５と同一のエピトープに結合し、且つ／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合に関して競合する（例えば、Ｉ－３９５の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲ若しくは可変領域を有する抗体と同一のエピトープに結合し、且つ／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合に関して競合する）抗原結合化合物（例えば、抗体又は抗体フラグメント）である。本明細書の実施形態の何れかのある態様において、提供されるのは、モノクローナル抗体Ｉ－３９６と同一のエピトープに結合し、且つ／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合に関して競合する（例えば、Ｉ－３９６の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲ若しくは可変領域を有する抗体と同一のエピトープに結合し、且つ／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合に関して競合する）抗原結合化合物である。本明細書の実施形態の何れかのある態様において、提供されるのは、モノクローナル抗体Ｉ－３９７と同一のエピトープに結合し、且つ／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合に関して競合する（例えば、Ｉ－３９７の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲ若しくは可変領域を有する抗体と同一のエピトープに結合し、且つ／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合に関して競合する）抗原結合化合物である。本明細書の実施形態の何れかのある態様において、提供されるのは、モノクローナル抗体Ｉ－３９８と同一のエピトープに結合し、且つ／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合に関して競合する（例えば、Ｉ－３９８の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲ若しくは可変領域を有する抗体と同一のエピトープに結合し、且つ／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合に関して競合する）抗原結合化合物である。本明細書の実施形態の何れかのある態様において、提供されるのは、モノクローナル抗体Ｉ－３９９と同一のエピトープに結合し、且つ／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合に関して競合する（例えば、Ｉ－３９９の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲ若しくは可変領域を有する抗体と同一のエピトープに結合し、且つ／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合に関して競合する）抗原結合化合物である。
ある実施形態において、本結合分子（例えば、抗体又は抗体フラグメント）は、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）であって、抗体Ｉ－３９４、Ｉ－３９５、Ｉ－３９６、Ｉ－３９７、Ｉ－３９８若しくはＩ－３９９に関する重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３（例えば、本明細書で説明されている）を含む可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）であって、それぞれＩ－３９４抗体、Ｉ－３９５抗体、Ｉ－３９６抗体、Ｉ－３９７抗体、Ｉ－３９８抗体若しくはＩ－３９９抗体に関する軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３（例えば、本明細書で説明されている）を含む可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）とを含むか、又はＣＤＲ（又は重鎖ＣＤＲ及び／若しくは軽鎖ＣＤＲのセット）が前記ＣＤＲ（又は重鎖ＣＤＲ及び／若しくは軽鎖ＣＤＲの前記セット）に対する少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書の実施形態の何れかのある態様において、本抗体は、重鎖であって、抗体Ｉ－３９４、Ｉ－３９５、Ｉ－３９６、Ｉ－３９７、Ｉ－３９８又はＩ－３９９の重鎖可変領域（ＶＨ）の３個のＣＤＲを含む重鎖と、軽鎖であって、それぞれＩ－３９４抗体、Ｉ－３９５抗体、Ｉ－３９６抗体、Ｉ－３９７抗体、Ｉ－３９８抗体又はＩ－３９９抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）の３個のＣＤＲを含む軽鎖とを含み得、任意選択により、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴのナンバリングスキームに従って決定される。
ある態様において、提供されるのは、Ｆｃドメインを含む抗体であって、このＦｃドメインは、このＦｃドメインと、ヒトＣ１６Ａポリペプチド、ヒトＣＤ１６Ｂポリペプチド、ヒトＣＤ３２Ａポリペプチド、ヒトＣＤ３２Ｂポリペプチド及び／又はヒトＣＤ６４ポリペプチドとの間の結合を（同一のアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較して）減少させるように改変されており、この抗体は、（ｉ）配列番号６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖とを含む、抗体である。ある態様において、このＦｃドメインは、このＦｃドメインとヒトＣ１ｑポリペプチドとの間の結合を（同一のアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較して）減少させるように改変されている。ある実施形態において、この抗体は、２２０、２２６、２２９、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２４３、２６４、２６８、２９７、２９８、２９９、３０９、３１０、３１８、３２０、３２２、３２７、３３０及び３３１（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）からなる群から選択される残基の何れか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はより多くで重鎖定常領域中にアミノ酸置換を含む。ある実施形態において、この抗体は、２３４、２３５、２３７、３２２、３３０及び３３１からなる群から選択される残基の何れか３つ、４つ、５つ又はより多くで重鎖定常領域中にアミノ酸置換を有する。
ある実施形態において、腫瘍微小環境及び／又は循環においてｓＣＤ３９の活性を中和するのに十分な量及び頻度において、癌を有する個体に本抗体を投与する。ある実施形態において、腫瘍微小環境中におけるアデノシンの生成及び／又は濃度を減少させるのに十分な量及び頻度で本抗体を投与する。ある実施形態において、腫瘍微小環境中におけるＡＭＰ及び／又はアデノシンの生成及び／又は濃度を減少させるのに十分な量及び頻度で本抗体を投与する。ある実施形態において、腫瘍細胞によって発現されるＣＤ３９の活性を中和するのに十分な量及び頻度で本抗体を投与する。ある実施形態において、白血球又はリンパ球（例えば、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞及び／又はＢ細胞）によって発現されるＣＤ３９の活性を中和するのに十分な量及び頻度で本抗体を投与する。
本抗体は、ＣＤ３９により媒介されるＡＴＰ加水分解の阻害で有用であり、例えばそれにより腫瘍微小環境及び／又は循環中におけるアデノシンの濃度の低下がもたらされる。従って、この抗体は、例えば、癌の処置において、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びアデノシン受容体（Ａ２Ａ受容体）を発現する他の細胞へのＣＤ３９及び／又はアデノシンの免疫抑制効果の逆転で有用であるであろう。ある実施形態において、本抗ＣＤ３９抗体は、Ｔ細胞中での増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性及び／又はＮＦκＢ活性のアデノシンにより媒介される阻害を中和する。
本抗体は、腫瘍微小環境中への及び／又は循環中でのアデノシンの産生、量及び／又は濃度の阻害で有用であるであろう。
別の態様において、提供されるのは、個体を処置するための方法であって、本明細書で説明された抗ＣＤ３９抗原結合化合物の何れかの治療的有効量を個体（例えば、疾患、腫瘍等を有する個体）に投与することを含む方法である。ある態様において、提供されるのは、個体を処置するための方法であって、ＣＤ３９ポリペプチドを阻害する本開示の抗原結合化合物の治療的有効量を個体（例えば、疾患、腫瘍等を有する個体）に投与することを含むか、それから基本的になるか、又はそれからなる方法である。ある実施形態において、この抗ＣＤ３９抗原結合化合物（例えば、抗体）を第２の治療薬、任意選択によりヒトＰＤ－１の阻害活性を中和する治療薬（例えば、抗体）、任意選択により抗ＰＤ－１抗体、任意選択により抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせて個体に投与する。ある実施形態において、この抗ＣＤ３９抗原結合化合物（例えば、抗体）を、癌を有する個体であって、ヒトＰＤ－１の阻害活性を中和する薬剤による処置への反応が不良であるか、又はこの反応に関する予後が不良である個体に投与する。ある実施形態において、この抗体は、細胞アッセイにおいてＣＤ３９ポリペプチドを阻害する。この化合物は、ある実施形態において、非枯渇性抗体（結合する細胞を枯渇させない抗体、例えばＦｃサイレント抗体）である。任意選択により、この化合物は、二価でＣＤ３９ポリペプチドに結合する。任意選択により、この抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。任意選択により、この抗体は、ヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４）への結合を排除するように改変されたＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）アイソタイプの重鎖定常領域を含む。
別の態様において、従来の医薬製剤中での安定性及び／又は溶解性が増加している抗体を医薬製剤中において他の抗体と有利に組み合わせ得る。ある実施形態において、提供されるのは、医薬製剤であって、（ｉ）ＣＤ３９ポリペプチドを阻害し、且つ安定性の増加を示す抗体、例えばＣＤＲ中に複数の芳香族残基を含み、且つＫａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３２２、３３０及び３３１での残基の何れか３つ、４つ、５つ又はより多くでアミノ酸置換を含む改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、抗体と、（ｉｉ）ヒトＩｇＧアイソタイプの第２の抗体、任意選択により、抗癌活性を有する第２の抗体とを含む医薬製剤である。ある実施形態において、第２の抗体は、この第２の抗体が結合している細胞に向かってＡＤＣＣを誘導することができ、任意選択により、この第２の抗体は、腫瘍細胞上に存在する抗原（腫瘍抗原）に結合する。ある実施形態において、第２の抗体は、この第２の抗体の超可変領域が結合するタンパク質の活性を中和することができる。ある実施形態において、提供されるのは、医薬製剤であって、（ｉ）ＣＤ３９ポリペプチドを阻害し、且つ安定性の増加を示す抗体、例えばＣＤＲ中に複数の芳香族残基を含み、且つＫａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３２２、３３０及び３３１での残基の何れか３つ、４つ、５つ又はより多くでアミノ酸置換を含む改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、抗体と、（ｉｉ）ヒトＩｇＧアイソタイプの第２の抗体であって、ヒトＰＤ－１の阻害活性、任意選択により抗ＰＤ－１抗体の阻害活性、任意選択により抗ＰＤ－Ｌ１抗体の阻害活性を中和する第２の抗体とを含む医薬製剤である。ある実施形態において、本抗ＣＤ３９抗体及び第２の抗体の両方は、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３２２、３３０及び３３１での残基の何れか３つ、４つ、５つ又はより多くでアミノ酸置換を含む改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。
ある態様において、提供されるのは、ＣＤ３９発現細胞（例えば、個体の白血球及び／又は腫瘍細胞）によるＡＴＰ加水分解を減少させるための方法又は細胞性ＣＤ３９の酵素活性の中和のための方法であって、ＣＤ３９発現細胞を、ＣＤ３９を阻害する本開示の抗体と接触させることを含む方法である。ある実施形態において、ＣＤ３９発現細胞を本開示の抗原結合化合物と接触させるステップは、ＣＤ３９を阻害する抗体の治療的有効量を個体に投与することを含む。ある実施形態において、この個体は、癌を有する。
ある態様において、提供されるのは、（例えば、個体での）腫瘍環境中に存在するアデノシンを減少させるための方法であって、ＣＤ３９ポリペプチドを阻害する本開示の抗体の治療的有効量を個体に投与することを含むか、それから基本的になるか、又はそれからなる方法である。ある実施形態において、この個体は、癌を有する。
ある実施形態において、ＣＤ３９ポリペプチドを阻害する抗体の有効量とは、個体におけるＡＴＰからＡＭＰへのＣＤ３９に媒介される異化の阻害に関する少なくともＥＣ５０（任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００）の血中濃度を（例えば、抗原結合化合物のその後の投与までに）達成及び／又は維持するのに有効な量である。ある実施形態において、ＣＤ３９ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物の有効量とは、個体の血管外組織中におけるＡＴＰからＡＭＰへのＣＤ３９に媒介される異化の阻害に関するＥＣ５０（任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００）を達成するのに有効な量である。ある実施形態において、ＣＤ３９ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物の有効量とは、個体におけるＡＴＰからＡＭＰへのＣＤ３９に媒介される異化の阻害に関するＥＣ５０（任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００）を達成するのに有効な量である。ある実施形態において、ＣＤ３９ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物の有効量は、１～２０ｍｇ／ｋｇ体重である。ある実施形態において、この有効量を１週間毎、２週間毎、１ヶ月毎又は二ヶ月毎に個体に投与する。
任意選択により、この個体は、癌を有するか又は癌を有しやすいヒトである。任意選択により、この個体は、ＣＤ３９及び／又は存在（分泌若しくは放出）又は可溶性のＣＤ３９タンパク質を発現する悪性細胞によって特徴付けられる癌を有するか又はこの癌を有しやすいヒトである。任意選択により、この個体は、癌を有するか又を有しやすく、且つ循環性の可溶性細胞外ＣＤ３９タンパク質又はＣＤ３９を発現する腫瘍浸潤性の白血球を検出可能なレベルで有するヒトである。
この抗体は、任意選択により、１０－９Ｍ未満（それよりも良好な）、好ましくは１０－１０Ｍ未満若しくは好ましくは１０－１１Ｍ未満のヒトＣＤ３９ポリペプチドに対する結合親和性（ＫＤ）によって特徴付けられ、且つ／又は１μｇ／ｍｌ未満（それよりも良好な結合）におけるＥＣ５０でのヒトＣＤ３９との結合によって特徴付けられ、好ましくは、この抗体は、細胞表面でヒトＣＤ３９を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）への結合に関して、０．５μｇ／ｍｌ以下、任意選択により０．２μｇ／ｍｌ以下、任意選択により０．１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０を有する。
この抗体は、任意選択により、キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
この抗体は、任意選択により、１μｇ／ｍｌ未満（それよりも良好な）、任意選択により０．５μｇ／ｍｌ未満の、ＣＤ３９発現細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ腫瘍細胞）中におけるＣＤ３９の酵素活性の中和に関するＥＣ５０によって特徴付けられる。
ある実施形態において、この抗体は、結合特異性と、ＣＤ３９の酵素活性を中和する能力とを保持するモノクローナル抗体又はそのフラグメントである。ある実施形態において、この抗体は、ＩｇＧ１抗体である。例えば、この抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインであって、このＦｃドメインと、Ｆｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６）との間の結合を減少させるように改変されているヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含む抗体であり得る。ある実施形態において、この抗原結合化合物は、Ｆｃドメインを欠いているか、又は抗体介在細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／若しくはＣＤＣを誘導しないＦｃドメインを含み、任意選択により、この抗原結合化合物は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドに結合しないＦｃドメインを含む。ある実施形態において、このＦｃドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ、ヒトＩｇＧ２アイソタイプ、ヒトＩｇＧ３アイソタイプ又はヒトＩｇＧ４アイソタイプに由来する）は、野生型Ｆｃドメインと比較してアミノ酸改変（例えば、置換）を含み、この置換により、このＦｃドメイン（又はこのＦｃドメインを含む抗体）のＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６）に結合する能力及び／又は補体に結合する能力が低下する。ある実施形態において、この抗原結合化合物は、毒性部分に連結されていない。
また、提供されるのは、先述の特性の何れかを有する、ヒト又はヒト化抗体又は抗体断片をコードする核酸、このような核酸を含むベクター、このようなベクターを含む細胞、抗ＣＤ３９抗体の発現に適切な条件下でこのような細胞を培養することを含むヒト抗ＣＤ３９抗体を産生させる方法である。本開示は、このようなタンパク質、核酸、ベクター及び／又は細胞及び一般的には活性成分又は本組成物の処方、送達、安定性若しくは他の特徴を促進する不活性成分であり得る１つ以上のさらなる成分（例えば、様々な担体）を含む、組成物、例えば薬学的に許容可能な組成物及びキットにも関する。本開示は、ＣＤ３９介在性生物学的活性の調整などにおいて、例えばそれに関連する疾患、特に癌の処置において、このような抗体、核酸、ベクター、細胞、生物及び／又は組成物を作製し且つ使用する、様々な新規の及び有用な方法にさらに関する。
本開示は、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）の活性の増強を、それを必要とする対象において行う方法、又はリンパ球（例えば、Ｔ細胞）の活性を回復させるための方法、又はリンパ球（例えば、Ｔ細胞）のアデノシンにより媒介される阻害を軽減する方法であって、上述の組成物の何れかの有効量を対象に投与することを含む方法も提供する。ある実施形態において、この対象は、癌に罹患している患者である。例えば、この患者は、固形腫瘍、例えば結腸直腸癌、腎癌、卵巣癌、肺癌、乳癌又は悪性の黒色腫に罹患している可能性がある。或いは、この患者は、造血癌、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫又は非ホジキンリンパ腫に罹患している可能性がある。
本開示は、個体の疾患の処置のための方法であって、この処置は、ＣＤ３９の酵素活性の中和のために（例えば、０．０５～１μｇ／ｍｌ、０．１～１μｇ／ｍｌのＥＣ１００）、少なくともＥＣ５０（例えば、０．０１～０．５μｇ／ｍｌのＥＣ５０）、任意選択によりＥＣ７０又は任意選択によりＥＣ１００に対応する血液（若しくは血清）又は血管外組織（例えば、腫瘍環境）中における濃度を抗ＣＤ３９抗体の２回の連続する投与間で達成及び／又は維持するのに有効な量で抗ＣＤ３９抗体を少なくとも１回（任意選択により少なくとも２回）投与する少なくとも１回の投与サイクルにわたり、ＣＤ３９の酵素活性を中和する抗ＣＤ３９抗体を個体に投与することを含む、方法も提供する。この抗体を、例えば少なくとも約０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ又は２μｇ／ｍｌの循環又は細胞外組織（例えば、腫瘍環境）中における濃度を達成及び／又は維持するための量で投与し得る。例えば、０．０５～１μｇ／ｍｌ又は０．１～１μｇ／ｍｌの血管外組織中における濃度を達成するために、この抗ＣＤ３９抗体を、０．５～１０μｇ／ｍｌ又は１～１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３９抗体の循環中における濃度を達成するのに有効な量で投与する。任意選択により、この抗ＣＤ３９抗体を、抗ＣＤ３９抗体の２回の連続投与間で少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間及び／又は投与サイクル全体にわたって少なくとも２回投与し、且つ抗ＣＤ３９抗体の濃度を少なくとも上述の濃度に維持するのに有効な量で投与する。
本開示は、個体の疾患の処置のための方法であって、この処置は、少なくとも１μｇ／ｍｌ、任意選択により少なくとも１０μｇ／ｍｌ、任意選択により１～１００μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３９抗体の血中濃度又は組織中濃度を抗ＣＤ３９抗体の２回の連続する投与間で達成及び／又は維持するのに有効な量で抗ＣＤ３９抗体を少なくとも１回（任意選択により少なくとも２回）投与する少なくとも１回の投与サイクルにわたり、ＣＤ３９の酵素活性を中和する抗ＣＤ３９抗体を個体に投与することを含む、方法も提供する。任意選択により、この抗ＣＤ３９抗体を抗ＣＤ３９抗体の２回の連続投与間で少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間及び／又は投与サイクル全体にわたって少なくとも２回投与し、且つ少なくとも１μｇ／ｍｌ、任意選択により少なくとも１０μｇ／ｍｌ、任意選択により１～１００μｇ／ｍｌの抗ＣＤ－３９抗体の連続した血中濃度又は組織中濃度を維持するのに有効な量で投与する。
これらの態様は、本明細書に記載された説明でより詳細に説明されており、追加の態様、特徴及び利点は、本明細書に記載された説明から明らかになるであろう。
代表的なスクリーニング結果を示し、陽性対照Ｉ－３９４抗体と比較した抗体Ｉ－３９７、Ｉ－３９８及びＩ－３９９を示す。
図２Ａは、抗体ＢＹ４０、Ｉ－３９４、Ｉ－３９５及びＩ－３９６が細胞膜結合型ＣＤ３９を阻害し、Ｉ－３９４及びＩ－３９５の両方が全ての濃度でより高い効力を示すだけでなく、ＢＹ４０と比較して細胞性ＣＤ３９のより大きい最大阻害も示すことを示す。図２Ｂは、抗体Ｉ－３９５及びＩ－３９６は、両方とも陰性対照抗体（ＢＹ４０）及び陽性対照抗体（Ｉ－３９４）と比較して可溶性ＣＤ３９を阻害することを示す。
ＣＤ３９タンパク質の表面上の突然変異体５（Ｍ５）、１５（Ｍ１５）及び１９（Ｍ１９）で突然変異した残基の位置を示す。
様々な抗体に関する突然変異体５、１５及び１９への結合の結果を示す。
フローサイトメトリーによって評価した場合の、ヒトＣＤ３９を発現する細胞への抗体Ｉ－３９４の結合を示す。Ｉ－３９４は、ヒトＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ－ｈｕＣＤ３９）、カニクイザルＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ－ｃｙＣＤ３９）及びＲａｍｏｓリンパ腫細胞に結合するが、マウスＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ－ｍｏＣＤ３９）に結合しない。
抗体Ｉ－３９４は、存在するＡＴＰの量に比例する発光単位を定量することによって評価した場合、腫瘍（Ｒａｍｏｓ）細胞、ヒトＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ－ｈｕＣＤ３９）及びカニクイザルＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ－ｃｙＣＤ３９）中でのＣＤ３９酵素活性のブロッキングで非常に強力であることを示す。
抗体Ｉ－３９４は、存在するＡＴＰの量に比例する発光単位を定量することによって評価した場合、可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質の酵素活性のブロッキングで非常に強力であることを示す。
ＥＬＩＳＡアッセイで評価した場合、抗体Ｉ－３９４は、ヒトＣＤ３９に結合するが、ヒトアイソフォームＣＤ３９－Ｌ１、ＣＤ３９－Ｌ２、ＣＤ３９－Ｌ３又はＣＤ３９－Ｌ４の何れにも結合しないことを示す。
ＣＤ４Ｔ細胞活性化へのＡＴＰにより媒介されるＤＣ活性化の効果を評価するための実験手順を示し、ＡＴＰ活性化ＤＣを洗浄し、次いで５日間の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）のために同種のＣＤ４Ｔ細胞と共に（比１ ＭｏＤＣ／４ Ｔ細胞）インキュベートした。Ｔ細胞の活性化及び増殖をフローサイトメトリーによるＣＤ２５発現及びＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ希釈により分析した。
ｍｏＤＣによるＨＬＡ－ＤＲ発現を示す。この図は、抗ＣＤ３９ブロッキング抗体Ｉ－３９４及びＣＤ３９の化学的阻害剤が０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭのそれぞれでｍｏＤＣ活性化をもたらしたことを示す。しかしながら、抗ＣＤ３９抗体ＢＹ４０又は抗ＣＤ７３抗体は、樹状細胞（ＤＣ）のＡＴＰにより誘導される活性化を促進することができず、これは、抗体が、ＡＴＰの異化を回避するのに十分に酵素活性をブロックできないことを示唆する。凡例（上から下へ）は、グラフ中のバー（左から右へ）に対応する。
ｍｏＤＣによるＣＤ８３発現を示す。この図は、抗ＣＤ３９ブロッキング抗体Ｉ－３９４及びＣＤ３９の化学的阻害剤が０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭのそれぞれでｍｏＤＣ活性化をもたらしたことを示す。しかしながら、抗ＣＤ３９抗体ＢＹ４０又は抗ＣＤ７３抗体は、樹状細胞（ＤＣ）のＡＴＰにより誘導される活性化を促進することができず、これは、抗体が、ＡＴＰの異化を回避するのに十分に酵素活性をブロックできないことを示唆する。凡例（上から下へ）は、グラフ中のバー（左から右へ）に対応する。
ＣＤ２５発現を示し、ＡＴＰの存在下で活性化されたＭｏＤＣがＭＬＲアッセイにおいてＴ細胞の活性化及び増殖を誘導できたことを示し、抗ＣＤ３９ブロッキング抗体Ｉ－３９４による、ＡＴＰにより媒介されたＭｏＤＣ活性化の増強により、Ｔ細胞の増殖及び活性化がより高くなった。凡例（上から下へ）は、グラフ中のバー（左から右へ）に対応する。
定義
「含む」が使用される場合、これは、「から基本的になる」又は「からなる」に任意選択により置き換えられ得る。
ヒトＣＤ３９（「血管」ＣＤ３９、ＮＴＰｄアーゼ１、ＥＮＴＰＤ１、ＡＴＰＤアーゼ及び血管ＡＴＰジホスホヒドロラーゼとしても既知である）は、ＡＴＰアーゼ活性を示す。ＣＤ３９は、細胞外ＡＴＰ及び細胞外ＡＤＰをＡＭＰに加水分解し、このＡＭＰは、別の酵素５－プライムヌクレオチダーゼによりアデノシンにさらに変換される。「血管」ヒトＣＤ３９成熟ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、受入番号Ｐ４９９６１においてＧｅｎｂａｎｋで示されており（この開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）、且つ下記のとおりである。
Figure 0007308150000001
ヒトＣＤ３９－Ｌ１（ＮＴＰＤアーゼ２又はＥＮＴＰＤ２としても既知である）は、受入番号ＮＰ＿００１２３７においてＧｅｎｂａｎｋで示されており（この開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）、且つ下記のとおりである。
Figure 0007308150000002
ヒトＣＤ３９－Ｌ２（ＮＴＰＤアーゼ６又はＥＮＴＰＤ６としても既知である；ＥＮＴＰＤ６アイソフォーム１）は、受入番号ＮＰ＿００１２３８においてＧｅｎｂａｎｋで示されており（この開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）、且つ下記のとおりである。
Figure 0007308150000003
ヒトＣＤ３９－Ｌ３（ＮＴＰＤアーゼ３又はＥＮＴＰＤ３としても既知である；ＥＮＴＰＤ３アイソフォーム）は、受入番号ＮＰ＿００１２３９においてＧｅｎｂａｎｋで示されており（この開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）、且つ下記のとおりである。
Figure 0007308150000004
ヒトＣＤ３９－Ｌ４（ＮＴＰＤアーゼ５又はＥＮＴＰＤ５としても既知である）は、受入番号ＮＰ＿００１２４０（前駆体）においてＧｅｎｂａｎｋで示されており（この開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）、且つ下記のとおりである。
Figure 0007308150000005
本明細書に関連して、「中和する」又は「中和すること」は、ＣＤ３９ポリペプチドを指す場合（例えば、「ＣＤ３９を中和する」、「ＣＤ３９の活性を中和する」又は「ＣＤ３９の酵素活性を中和する」）、ＣＤ３９のＡＴＰ加水分解（ＡＴＰアーゼ）活性が阻害されるプロセスを指す。これは、特にＡＭＰ及び／又はＡＤＰのＣＤ３９により媒介される生成の阻害を含み、すなわちＡＴＰからＡＭＰ及び／又はＡＤＰへのＣＤ３９により媒介される異化の阻害を含む。膜結合型ＣＤ３９の場合、これを、例えばＡＴＰからＡＭＰ及び／又はＡＤＰへの変換を阻害する試験化合物の能力を測定する細胞アッセイにおいて直接的又は間接的に測定し得る。可溶性ＣＤ３９の場合、これを、試験化合物と共に、本明細書で説明された組換え可溶性ＣＤ３９をインキュベートし、次いでＡＴＰからＡＭＰ及び／又はＡＤＰへの変換を測定することにより、直接的又は間接的に測定し得る。例えば、本明細書で説明されているように、ＡＴＰの消失及び／又はＡＭＰの生成を評価し得る。例えば、ＡＴＰの消失及び／又はＡＭＰの生成を、存在するＡＴＰの量に比例する発光単位を定量することによって評価し得る。ある実施形態において、例えば本明細書で説明されたアッセイ（例えば、ＡＴＰの消失及び／又はＡＭＰの生成）を参照すると、抗体調製物は、ＡＴＰからＡＭＰへの変換の少なくとも６０％の減少を生じさせるか、ＡＴＰからＡＭＰへの変換の少なくとも７０％の減少を生じさせるか、又はＡＴＰからＡＭＰへの変換の少なくとも８０％又は９０％の減少を生じさせる。
「癌の処置」などが抗ＣＤ３９結合物質（例えば、抗体）に関して言及される場合には常に、これは、（ａ）癌の処置の方法であって、このような治療を必要とする個体、哺乳動物、特にヒトに、癌の処置を可能にする用量で（治療的有効量）、好ましくは本明細書中で指定されるような用量（量）で（好ましくは薬学的に許容可能な担体物質中で）抗ＣＤ３９結合物質を投与する（少なくとも１回の処置）ステップを含む方法；（ｂ）（特にヒトにおける）癌の処置のための抗ＣＤ３９結合物質の使用又はその処置における使用のための抗ＣＤ３９結合物質；（ｃ）癌の処置のための医薬品の製造のための抗ＣＤ３９結合物質の使用、任意選択により、抗ＣＤ３９結合物質を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、癌の処置のための医薬品又は有効用量の癌の処置に適切な抗ＣＤ３９結合物質を含む医薬品の製造のために抗ＣＤ３９結合物質を使用する方法；又は（ｄ）本願が提出される国で特許を得ることを可能とする主題に従う、ａ）、ｂ）及びｃ）の何れかの組み合わせを含み得る。
本明細書中で使用される場合、「抗原結合ドメイン」という用語は、エピトープに免疫特異的に結合可能な三次元構造を含むドメインを指す。従って、ある実施形態において、このドメインは、超可変領域、任意選択により、抗体鎖のＶＨ及び／又はＶＬドメイン、任意選択により、少なくともＶＨドメインを含み得る。別の実施形態において、結合ドメインは、抗体鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。別の実施形態において、結合ドメインは、非免疫グロブリン骨格からのポリペプチドドメインを含み得る。
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を指す。重鎖中の定常ドメインのタイプに応じて、抗体は、下記の５種の主要なクラスの１つに割り当てられる：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ。これらのいくつかは、サブクラス又はアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４及び同類のもの）にさらに分類される。代表的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０又はそれを超えるアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ指す。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」及び「ミュー」とそれぞれ呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。ＩｇＧは、生理学的状況において最も共通する抗体であるため、及び実験室で最も容易に作製されるため、本明細書中で使用される抗体の代表的なクラスである。任意選択により、本抗体はモノクローナル抗体である。抗体の特定の例は、ヒト化、キメラ、ヒト又はそうでなければヒトに適切な抗体である。「抗体」は、本明細書中に記載の抗体の何れかの何らかの断片又は誘導体も含む。
「特異的に結合する」という語は、単離標的細胞の表面上に存在するタンパク質、その中のエピトープ又はネイティブタンパク質の何れかの組換え形態を用いて評価した場合、抗体が好ましくは競合的結合アッセイにおいて結合パートナー、例えばＣＤ３９に結合し得ることを意味する。競合的結合アッセイ及び特異的な結合を決定するための他の方法を以下でさらに記載し、これらは、当技術分野で周知である。
抗体が特定のモノクローナル抗体（例えば、抗体Ｉ－３９４、Ｉ－３９５、Ｉ－３９６、Ｉ－３９７、Ｉ－３９８又はＩ－３９９）と「競合する」と言われる場合、これは、本抗体が、組換えＣＤ３９分子又は表面発現ＣＤ３９分子の何れかを用いた結合アッセイにおいて、モノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が結合アッセイにおいて参照抗体のＣＤ３９ポリペプチド又はＣＤ３９発現細胞への結合を減少させる場合、本抗体は、参照抗体とそれぞれ「競合する」と言われる。
「親和性」という用語は、本明細書中で使用される場合、エピトープへの抗体の結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］ｘ［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］（式中、［Ａｂ－Ａｇ］は、抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は未結合抗原のモル濃度である）として定められる解離定数Ｋｄにより与えられる。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９－６０１（１９８３）で見出すことができ、この参考文献は、全体的に参照により本明細書中に組み込まれる。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知のある標準的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析など）の使用である。
本明細書に関連して、「決定基」はポリペプチド上の相互作用又は結合の部位を指す。
「エピトープ」という用語は、抗原性決定基を指し、抗体が結合する抗原上のエリア又は領域である。タンパク質エピトープは、直接結合に関与するアミノ酸残基並びに特異的な抗原結合抗体又はペプチドにより効果的に阻止されるアミノ酸残基、すなわち抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。これは、例えば、抗体又は受容体と組み合わせ得る複合抗原分子上の最も単純な形態又は最小構造領域である。エピトープは、直鎖状又は立体構造／構造であり得る。「直鎖状エピトープ」という用語は、アミノ酸の直鎖状配列（一次構造）上で隣接するアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。「立体構造又は構造エピトープ」という用語は、全てが隣接しておらず、従って分子の折り畳みにより互いに対して近接するようになるアミノ酸の直鎖状配列の分離部分を表す（二次、三次及び／又は四次構造）アミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。立体構造エピトープは三次元構造に依存する。従って、「立体構造」という用語は、「構造」と交換可能に使用されることが多い。
用語「内在化」（「細胞内内在化」と交換可能に使用される）は、細胞の細胞外表面から細胞の細胞内表面に分子を移行させるプロセスに関連する分子的な、生化学的な、及び細胞の事象を指す。分子の細胞内内在化の原因となるプロセスは、公知であり、特に細胞外分子（例えば、ホルモン、抗体及び小さい有機分子）、膜関連分子（例えば、細胞表面受容体）並びに細胞外分子に結合した膜関連分子の複合体（例えば、膜貫通受容体に結合したリガンド又は膜関連分子に結合した抗体）の内在化を伴い得る。そのため、「内在化の誘導及び／又は増加」は、細胞内内在化が開始される事象並びに／又は細胞内内在化の速度及び／若しくは程度が増加する事象を含む。
「薬剤」という用語は、本明細書中で、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生体高分子又は生体物質から作製される抽出物を指すために使用される。「治療剤」という用語は、生物学的活性を有する薬剤を指す。
本明細書中での目的のために、「ヒト化」又は「ヒト」抗体は、１つ以上のヒト免疫グロブリンの定常及び可変フレームワーク領域が動物免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲと融合される抗体を指す。このような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するために設計される。このような抗体は、抗原負荷に反応して特異的なヒト抗体を作製させるために「操作」されている、トランスジェニックマウス又は他の動物から入手し得る（例えば、全体的な教示が参照により本明細書中に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ７：１３；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎ ６：５７９を参照されたい）。全て当技術分野で公知である、遺伝学的又は染色体導入法並びにファージディスプレイ技術によって完全ヒト抗体も構築し得る（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５３を参照されたい）。ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞によっても作製し得る（例えば、参照によりそれらの全体において組み込まれる米国特許第５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照されたい）。
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるか若しくは改変されているクラス、エフェクター機能及び／若しくは種の定常領域又はキメラ抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結されるように、定常領域又はそれらの一部が改変されるか、置き換えられるか、又は交換されているか、又は（ｂ）可変領域又はそれらの一部が改変されるか、置き換えられるか、又は異なるか若しくは改変されている抗原特異性を有する可変領域と交換されている、抗体分子である。
「超可変領域」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）及び８９～９７（Ｌ３）及び重鎖可変ドメイン中の３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１）及び／又は「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）及び９１～９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメイン中の２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ１９８７；１９６：９０１－９１７）又は抗原結合に関与する必須アミノ酸を決定するための同様の系からのアミノ酸残基を含む。一般的には、この領域中のアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前出に記載の方法により行われる。「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基付番」及び「Ｋａｂａｔによる」などの句は、本明細書中で、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに対するこの付番系を指す。Ｋａｂａｔ付番系を用いて、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ若しくはＣＤＲの短縮又はそれへの挿入に対応する少数の又はさらなるアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に１つのアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、「標準的な」Ｋａｂａｔ付番配列での抗体の配列の相動性の領域でのアライメントにより、特定の抗体に対して決定され得る。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書中で使用される場合、ＣＤＲとして定められる領域を除く、抗体可変ドメインの領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離される近接領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）にさらに分けられ得る。
「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」及び「Ｆｃ領域」という用語は、例えば、ヒトγ（ガンマ）重鎖の約アミノ酸（ａａ）２３０～約ａａ４５０からの、抗体重鎖のＣ末端断片又は他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体の場合、α、δ、ε及びμ）におけるその対応配列又はその天然のアロタイプを指す。別段の指定がない限り、免疫グロブリンに対する一般的に受容されるＫａｂａｔアミノ酸付番は、この開示を通じて使用される（Ｋａｂａｔ ｅｔ． ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたい）。
「単離」、「精製」又は「生物学的に純粋」という用語は、実質的に又は基本的に、そのネイティブ状態で見られるような通常それに付随する成分を含まない物質を指す。純度及び均一性は、一般的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析学的化学技術を用いて決定される。標品中に存在する主要な種であるタンパク質は実質的に精製されている。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー並びに天然のアミノポリマー及び非天然のアミノポリマーに適用される。
「組換え」という用語は、例えば、細胞又は核酸、タンパク質又はベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが異種核酸若しくはタンパク質の導入又はネイティブ核酸若しくはタンパク質の改変により修飾されているか、又は細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態内では見出されない遺伝子を発現するか、又はそうでなければ異常に発現されるか、発現が少ないか又は全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
本明細書に関連して、ポリペプチド又はエピトープに「結合」する抗体という用語は、特異性及び／又は親和性をもって前記決定基に結合する抗体を指す。
「同一性」又は「同一である」という用語は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、２つ以上の一連のアミノ酸残基間の一致数により決定される場合のポリペプチド間の配列関連性の度合いを指す。「同一性」は、特定の数学的モデル又はコンピュータープログラム（すなわち「アルゴリズム」）により扱われるギャップアライメント（存在する場合）を用いた２つ以上の配列のより小さいものの間の完全な一致のパーセントを評価する。関連ポリペプチドの同一性は、公知の方法により容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ ＤｅｖｅｒｅｕＸ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載のものが挙げられるが限定されない。
同一性を決定するための方法は、試験される配列間の一致が最大となるように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータープログラム法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．），ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０（１９９０））を含む、ＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、前出）から公開されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用し得る。
抗体の製造
抗ＣＤ３９抗原結合ドメイン又はそのようなドメインを含むタンパク質（例えば、抗体又は抗体フラグメント）は、癌及び／又は可溶性ヒトＣＤ３９ポリペプチド（例えば、膜結合型ＣＤ３９で見出されるＮ末端及びＣ末端付近の２つの膜貫通ドメインを欠いているヒトＣＤ３９ポリペプチド（例えば、配列番号４４のアミノ酸配列を有する細胞外ドメインタンパク質））に結合する他の疾患（例えば、感染性疾患）の処置に使用され得る。ある実施形態において、この薬剤は、ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害する。ある実施形態において、この抗体は、アデノシンのＣＤ３９により媒介される生成を阻害する。ある実施形態において、この抗体は、ＡＴＰからＡＭＰへのＣＤ３９により媒介される異化を阻害する。ある実施形態において、この抗体は、リンパ球活性（例えば、Ｔ細胞）のアデノシンにより媒介される阻害を阻害する。ある態様において、この抗体は、完全長抗体、抗体フラグメント及び合成又は半合成の抗体由来分子から選択される。
可溶性（及び任意選択により膜結合型）ＣＤ３９タンパク質の酵素活性（ＡＴＰアーゼ活性）を強力に阻害する抗体は、ある実施形態において、可溶性（及び任意選択により膜結合型）ＣＤ３９タンパク質の高次構造の１つにおいて、この可溶性（及び任意選択により膜結合型）ＣＤ３９タンパク質のドメイン移動を固定又は制限し得、それにより、この可溶性ＣＤ３９タンパク質がその基質を加水分解することを防ぐ。この抗体は、これを可溶性（及び任意選択により膜結合型）ＣＤ３９のＣ末端ドメイン及びＮ末端ドメインの両方に同時に結合することによって達成し得る。
ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗原結合ドメイン又はこの抗原結合ドメインを含む抗原結合タンパク質（例えば、抗体又は抗体フラグメント、多重特異性結合タンパク質、二重特異性抗体等）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。この抗原結合ドメインを、所望の特性及び／又は改善された特性をもたらすように設計又は改変し得る。
ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗原結合タンパク質は、ヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合し、且つその活性を阻害し得、この抗原結合タンパク質は、フレームワーク（例えば、ヒト起源のアミノ酸配列を有するフレームワーク）並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含むＶＨ及びＶＬを含む。ある実施形態において、この抗原結合タンパク質は、ＣＤ３９に結合した場合、ＣＤ３９のドメイン移動を制限する。任意選択により、ＶＨフレームワーク及び／又はＶＬフレームワーク（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４）は、ヒト起源である。
特定の実施形態において、この結合分子及び結合ドメインは、例えば、２本のポリペプチド鎖で見出される関連ＶＬドメイン及び関連ＶＨドメインの形態の免疫グロブリン可変ドメインに由来し得るか、又は一本鎖抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｄＡｂ、Ｖ－ＮＡＲドメイン又はＶＨＨドメイン）に由来し得る。
ある態様において、このＣＤ３９結合剤は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体から選択される抗体である。
ある態様において、この薬剤は、本明細書でさらに開示されているように、ヒトＩｇＧ１の定常ドメイン又はＦｃドメインに由来する（例えば、改変されている）定常ドメイン又はＦｃドメインを含む抗体のフラグメントである。
ある態様において、この薬剤は、抗体フラグメントであって、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、重鎖Ｉｇ（ラマＩｇ又はラクダＩｇ）、ＶＨＨフラグメント、単一ドメインＦＶ及び一本鎖抗体フラグメントから選択される抗体フラグメントを含む。ある態様において、この薬剤は、合成又は半合成の抗体由来分子であって、ｓｃＦｖ、ｄｓＦＶ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、カッパボディ、ＩｇＮＡＲ及び多重特異性（例えば、二重特異性）抗体から選択される合成又は半合成の抗体由来分子を含む。この薬剤は、任意選択により、Ｆｃドメインをさらに含み得る。
ある態様において、この抗体は、少なくとも部分的に精製された形態である。
ある態様において、この抗体は、基本的に単離された形態である。
抗体を、当技術分野で既知の様々な技術により製造し得る。ある実施形態において、本開示の抗体を（例えば、ファージディスプレイライブライから生成された）抗体ライブラライからの選択により製造する。別の実施形態において、ＣＤ３９ポリペプチド（好ましくは、可溶性ヒトＣＤ３９細胞外ドメインポリペプチド）を含む免疫原による非ヒト動物（好ましくはマウス）への免疫付与により、抗体を産生させる。このＣＤ３９ポリペプチドは、任意選択により、完全長ＣＤ３９ポリペプチドのフラグメント又は誘導体（典型的には免疫原性フラグメント）であり得、このフラグメント又は誘導体を含み得、すなわちＣＤ３９ポリペプチドを発現する細胞の表面上に露出したエピトープを含むこのポリペプチドの一部であり得るか又はこの一部を含み得る。そのようなフラグメントは、典型的には、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７個の連続したアミノ酸を含み、さらにより好ましくは、その少なくとも約１０個の連続したアミノ酸を含む。フラグメントは、典型的には、受容体の細胞外ドメインに基本的に由来する。ある実施形態において、この免疫原は、脂質膜中（典型的には細胞の表面）に野生型ヒトＣＤ３９ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、この免疫原は、任意選択により処理されているか又は溶解している、無傷の細胞（特に無傷のヒト細胞）を含む。別の実施形態において、このポリペプチドは、組換えＣＤ３９ポリペプチドである。
抗原で非ヒト哺乳動物に免疫付与するステップを、マウス中で抗体の産生を刺激するための当技術分野で公知のあらゆる方法で実行し得る（例えば、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい。この開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この抗体を産生するハイブリドーマの単離は、公知であり、当技術分野で公知のあらゆる方法で実行し得る。
例えば、（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４、この開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）で開示されているように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリの選択によっても抗体を製造し得る。
抗体の競合が評価され得る様々な免疫学的スクリーニングアッセイの何れか１つを使用して、ＣＤ３９（特にモノクローナル抗体Ｉ－３９４と実質的に又は基本的に同一のＣＤ３９上の領域）に結合する１つ又は複数の抗体の特定を容易に決定し得る。多くのそのようなアッセイは、日常的に実行されており、且つ当技術分野で公知である（例えば、１９９７年８月２６日に刊行された米国特許第５，６６０，８２７号明細書を参照されたい。この明細書は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる）。
例えば、検査する試験抗体が異なる供給源動物から得られる場合又は異なるＩｇアイソタイプ由来である場合、対照（例えば、Ｉ－３９４）と試験抗体とを混合し（又はプレ吸着させ）、ＣＤ３９ポリペプチドを含む試料に適用させる簡単な競合アッセイを利用し得る。ウエスタンブロッティングに基づくプロトコル及びＢＩＡＣＯＲＥ分析の使用は、そのような競合研究での使用に適している。
特定の実施形態において、ＣＤ３９抗原試料への適用前に一定の期間にわたって対照抗体（例えば、Ｉ－３９４）と様々な量の試験抗体とをプレミックスする（例えば、約１：１０又は約１：１００）。他の実施形態において、対照及び様々な量の試験抗体をＣＤ３９抗原試料への曝露中に簡単に混合し得る。（例えば、分離技術又は洗浄技術を使用して非結合抗体を排除することにより）遊離抗体から結合を区別し得る限り、且つ（例えば、種特異的な若しくはアイソタイプ特異的な二次抗体を使用することにより、又は検出可能な標識でＩ－３９４を特異的に標識することにより）試験抗体からＩ－３９４を区別し得る限り、この試験抗体がそれぞれのＩ－３９４の抗原への結合を減少させるかどうかを決定し得る。完全に無関係な抗体の非存在下での（標識された）対照抗体の結合は、対照高値として役立ち得る。対照低値を、標識（Ｉ－３９４）抗体を完全に同一のタイプ（Ｉ－３９４）の非標識抗体と共にインキュベートすることにより得ることができ、競合が生じて標識抗体の結合が減少するであろう。試験アッセイでは、試験抗体の存在下での標識抗体の反応性の有意な低下は、ＣＤ３９上の同一の領域又はエピトープを認識し得る試験抗体の指標である。約１：１０～約１：１００のＩ－３９４：試験抗体の任意の比において、ＣＤ３９抗原へのＩ－３９４の結合を少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％又は９０％（例えば、約６５～１００％）減少させる試験抗体を選択し得る。好ましくは、そのような試験抗体は、ＣＤ３９抗原へのＩ－３９４の結合を少なくとも約９０％（例えば、約９５％）減少させるであろう。
例えば、フローサイトメトリー試験により競合を評価することもできる。このような試験において、ある種のＣＤ３９ポリペプチドを保有する細胞を最初に例えばＩ－３９４とインキュベートし、次いで蛍光色素又はビオチンで標識される試験抗体とインキュベートし得る。本抗体は、飽和量のそれぞれのＩ－３９４との予備インキュベーション時に得られる結合が、それぞれのＩ－３９４との予備インキュベーションを行わずに抗体により得られる結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％、２０％又は１０％）（蛍光手段により測定される場合）である場合、Ｉ－３９４と競合すると言われる。代替的に、抗体は、飽和量の試験抗体と予備インキュベートされる細胞上で（蛍光色素又はビオチンにより）それぞれの標識化Ｉ－３９４抗体と共に得られる結合が、試験抗体との予備インキュベーションを行わずに得られる結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％又はそれ未満（例えば、約３０％、２０％又は１０％）である場合、Ｉ－３９４と競合すると言われる。
試験抗体が予め吸着され、ＣＤ３９抗原が固定化される表面に飽和濃度で適用される単純な競合アッセイも使用し得る。単純競合アッセイにおける表面は、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥチップ（又は表面プラズモン共鳴分析に適切な他の媒体）である。次いで、対照抗体（例えば、Ｉ－３９４）をＣＤ３９飽和濃度で表面と接触させ、ＣＤ３９及び対照抗体の表面結合を測定する。対照抗体のこの結合を試験抗体の非存在下でのＣＤ３９含有面への対照抗体の結合と比較する。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での対照抗体によるＣＤ３９含有面の結合の顕著な減少は、試験抗体が対照抗体と「交差反応」するようになることを示す。少なくとも約３０％又はそれを超えて、好ましくは約４０％だけＣＤ３９抗原への対照（Ｉ－３９４など）抗体の結合を減少させる何らかの試験抗体は、対照（例えば、Ｉ－３９４）と競合する抗体であるとみなされ得る。好ましくは、このような試験抗体は、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％又はそれを超える）だけＣＤ３９抗原への対照抗体（例えば、Ｉ－３９４）の結合を減少させる。当然のことながら、対照及び試験抗体の順序は逆転し得、すなわち対照抗体を最初に表面に結合させ得、試験抗体をその後に競合アッセイにおいて表面と接触させる。好ましくは、ＣＤ３９抗原に対してより高い親和性を有する抗体は、（抗体が交差反応することが推測される）第２の抗体に対して見られる結合の減少がより大きい規模であると予想されるため、最初に表面に結合させる。このようなアッセイのさらなる例は、例えば、その開示が参照により本明細書中に組み込まれるＳａｕｎａｌ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３：３３－４１で提供される。
ある実施形態において、本抗体をイムノアッセイで検証して、可溶性ＣＤ３９及び／又はＣＤ３９を発現する細胞（例えば、悪性細胞）に結合する能力を試験する。例えば、血液のサンプリング又は腫瘍生検を実施し、可溶性ＣＤ３９を単離し且つ／又は腫瘍細胞を集める。次いで、当業者に公知の標準的な方法を使用して、所与の抗体のｓＣＤ３９及び／又は細胞に結合する能力を評価する。抗体は、例えば、個体又は患者の有意な割合（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又はより高く）から、ＣＤ３９を発現することが知られている細胞（例えば、腫瘍細胞）の相当な割合（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又はより高く）に結合し得る。抗体を、患者のｓＣＤ３９及び／又は悪性細胞の存在又はレベルを決定するための診断目的に使用し得、例えば患者が抗ＣＤ３９剤による処置に適しているかどうか、又は本明細書で説明された治療方法での使用に適しているかどうかを評価するためのバイオマーカーとして使用し得る。ｓＣＤ３９及び／又は細胞への抗体の結合を評価するために、この抗体を直接的又は間接的に標識し得る。間接的に標識される場合、標識された二次抗体が概して追加される。
抗体がエピトープ領域内で結合するか否かの判定は、当業者にとって公知のように行い得る。このようなマッピング／特徴評価方法の一例として、抗ＣＤ３９抗体に対するエピトープ領域は、ＣＤ３９タンパク質における露出アミン／カルボキシルの化学修飾を用いて、エピトープ「フットプリンティング」により決定され得る。このようなフットプリンティング技術のある具体例は、ＨＸＭＳ（質量分析により検出される水素－重水素交換）の使用であり、ここで受容体及びリガンドタンパク質アミドプロトンの水素／重水素交換、結合及び逆交換が起こり、タンパク質結合に加わる骨格アミド基は、逆交換から保護され、従って重水素化されたままとなる。関連領域は、この点でペプシンのタンパク質分解、ファストマイクロボア高速液体クロマトグラフィー分離及び／又はエレクトロスプレーイオン化質量分析により同定され得る。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ Ｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７（２）ｐｐ．２５２－２５９（１９９９）Ｅｎｇｅｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。適切なエピトープ同定技術の別の例は核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）であり、一般的には遊離抗原及び抗体などの抗原結合ペプチドと複合体形成する抗原の二次元ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの位置を比較する。抗原は、一般的には、１５Ｎで選択的に同位体標識され、抗原に対応するシグナルのみがＮＭＲ－スペクトルで見られ、抗原結合ペプチドからのシグナルが見られないようになる。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸由来の抗原シグナルは、一般に、遊離抗原のスペクトルと比較して、複合体のスペクトルにおいて位置をシフトさせ、結合に関与するアミノ酸はそのように同定され得る。例えば、Ｅｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｒｅｓ Ｆｏｕｎｄ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．２００４；（４４）：１４９－６７；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８１（１）ｐｐ．６１－６７（１９９８）；及びＳａｉｔｏ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９６ Ｊｕｎ；９（３）：５１６－２４を参照されたい。
エピトープマッピング／特徴評価は質量分析方法を用いて行うこともできる。例えば、Ｄｏｗｎａｒｄ，Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００ Ａｐｒ；３５（４）：４９３－５０３及びＫｉｓｅｌａｒ ａｎｄ Ｄｏｗｎａｒｄ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ｍａｙ １；７１（９）：１７９２－１８０１を参照されたい。プロテアーゼ消化技術もエピトープマッピング及び同定との関連で有用であり得る。抗原性決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化により、例えばＣＤ３９に対して約１：５０の比率でトリプシンを使用することによってｐＨ７～８でｏ／ｎ消化を使用することにより、続いてペプチド同定のために質量分析（ＭＳ）を行うことにより決定し得る。続いて、抗ＣＤ３９結合物によりトリプシン切断から保護されるペプチドは、トリプシン消化に供した試料及び抗体とインキュベートし、続いて例えばトリプシン（それにより結合物に対するフットプリントが明らかになる）による消化に供した試料の比較により同定し得る。キモトリプシン、ペプシンなどの他の酵素も又は代替的に同様のエピトープ特徴評価方法で使用し得る。さらに、酵素性消化により、可能性のある抗原性決定基配列が表面に露出していない、従っておそらく免疫原性／抗原性について関連がないと思われるＣＤ３９ポリペプチドの領域内にあるか否かを分析するための迅速な方法が提供され得る。
部位特異的突然変異誘発は、結合エピトープを明らかにするのに有用な別の技術である。例えば、「アラニンスキャニング」において、タンパク質セグメント内の各残基をアラニン残基で置き換え、結合親和性に対する結果を測定する。突然変異が結合親和性の顕著な低下につながる場合、結合に関与する可能性が高い。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち折り畳まれていないタンパク質に結合しない抗体）を使用して、アラニン置換がタンパク質の全体的な折り畳みに影響しないことを確認し得る。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５；２６７：３８３－３８６；及びＷｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６；９３：１－６を参照されたい。
エピトープ「フットプリンティング」のために電子顕微鏡も使用し得る。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９２；３５５：２７５－２７８は、低温電子顕微鏡、三次元画像再構成及びＸ結晶学の同時適用を使用して、ネイティブササゲモザイクウイルスのキャプシド表面上のＦａｂ断片の物理学的フットプリントを決定した。
エピトープ評価のための「標識不含」アッセイの他の形態としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡＣＯＲＥ）及び反射型干渉分光法（ＲｉｆＳ）が挙げられる。例えば、Ｆａｅｇｅｒｓｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ １９９０；３：２０８－１４；Ｎｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９３；６４６：１５９－１６８；Ｌｅｉｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９８；３７：３３０８－３３１１；Ｋｒｏｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ２００２；１７：９３７－９４４を参照されたい。
抗体と同じであるか又は実質的に同じであるエピトープに結合する抗体は、本明細書中に記載の代表的な競合アッセイの１つ以上で同定され得ることも注意すべきである。
脊椎動物での又は細胞での免疫付与及び抗体の産生時、特定の選択ステップを実施して、特許請求される抗体を単離し得る。これに関して、特定の実施形態において、本開示は、そのような抗体を産生する方法であって、（ａ）ＣＤ３９ポリペプチドを含む免疫原で非ヒト哺乳動物に免疫付与することと、（ｂ）前記免疫付与された動物から抗体を調製することと、（ｃ）ＣＤ３９に結合することができるステップ（ｂ）からの抗体を選択することとを含む方法にも関する。任意選択により、次いで、ＣＤ３９に結合することができる選択された抗体を精製し、（例えば、本明細書の方法の何れかに従って）ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害する能力に関して試験する。
典型的には、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体は、約１０４～約１０１１Ｍ－１（例えば、約１０８～約１０１０Ｍ－１）の範囲において、ＣＤ３９ポリペプチド（例えば、本明細書の実施例で製造された単量体ＣＤ３９ポリペプチド）に対する親和性を有する。例えば、抗ＣＤ３９抗体は、例えば、（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析による）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニングによって決定される場合、ＣＤ３９に関して１×１０－９Ｍ未満の平均解離定数（ＫＤ）を有し得る。特定のより例示的な態様において、本開示は、ＣＤ３９に関して約１×１０－８Ｍ～約１×１０－１０Ｍ又は１×１０－９Ｍ～約１×１０－１１ＭのＫＤを有する抗ＣＤ３９抗体を提供する。
抗体は、例えば、約１００、６０、１０、５又は１ナノモル以下の（すなわちより親和性の）平均ＫＤ、好ましくはサブナノモルの平均ＫＤ、又は任意選択により約５００、２００、１００又は１０ピコモル以下の平均ＫＤによって特徴付けられ得る。例えば、チップ表面上において、組換えにより産生されたヒトＣＤ３９タンパク質を固定し、その後、溶液中で試験する抗体を適用することにより、ＫＤを決定し得る。ある実施形態において、この方法は、ＣＤ３９への結合に関して抗体Ｉ－３９４、Ｉ－３９５、Ｉ－３９６、Ｉ－３９７、Ｉ－３９８又はＩ－３９９と競合することができる（ｂ）からの抗体を選択するステップ（ｄ）をさらに含む。
実施形態の何れかのある態様において、本方法に従って調製された抗体は、モノクローナル抗体である。別の態様において、本明細書の方法に従って抗体を製造するために使用される非ヒト動物は、哺乳動物、例えば齧歯動物、ウシ、ブタ、家禽、ウマ、ウサギ、ヤギ又はヒツジである。
ＣＤ３９ポリペプチド上に存在するエピトープに結合する抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマから単離し、適切な宿主へのトランスフェクションのために適切な発現ベクター中に入れる。次いで、この宿主を抗体又はそのバリアント（例えば、このモノクローナル抗体のヒト化バージョン、この抗体の活性フラグメント、この抗体の抗原認識部位を含むキメラ抗体又は検出可能な部分を含むバージョン）の組換え産生に使用する。
本開示のモノクローナル抗体（例えば、抗体Ｉ－３９４）をコードするＤＮＡを、（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）従来の手順を使用して容易に単離して配列決定し得る。ある態様において、提供されるのは、本明細書の何れかの実施形態の抗ＣＤ３９抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸である。単離すると、このＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いでこの発現ベクターを宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は通常は免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞）に遺伝子移入して、この組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得る。本明細書の他の箇所で説明されているように、そのようなＤＮＡ配列は、多数の目的の何れかのために改変され得、例えば抗体をヒト化するために、フラグメント又は誘導体を製造するために、又は例えば抗体の結合特異性を最適化するために抗原結合部位中で抗体の配列を改変するために改変され得る。ある実施形態において、提供されるのは、抗体（例えば、Ｉ－３９４）の軽鎖及び／又は重鎖をコードする単離核酸配列並びにそのような核酸を（例えば、ゲノム中に）含む組換え宿主細胞である。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，ｐｐ．２５６（１９９３）；及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０，ｐ．１５１（１９９２）を参照されたい）。
ｓＣＤ３９及び／若しくはｍｅｍＣＤ３９に結合することができ、且つ／又は他の所望の特性を有することができる抗体が特定されると、典型的には、この抗体も、他のポリペプチド（例えば、無関係のポリペプチド）に結合する能力に関して、本明細書で説明されたもの等の方法を使用して評価される。理想的には、この抗体は、ＣＤ３９のみに相当な親和性で結合するが、無関係のポリペプチド又はＮＴＰＤアーゼファミリの他のポリペプチド（特にＣＤ３９－Ｌ１、ＣＤ３９－Ｌ２、ＣＤ３９－Ｌ３及びＣＤ３９－Ｌ４若しくはＮＴＰＤアーゼ８）に有意なレベルで結合しない。しかしながら、ＣＤ３９に対する親和性が他の無関係なポリペプチド）に対するよりも相当に大きい（例えば、１０×、１００×、５００×、１０００×、１０，０００×又はより高い）限り、この抗体は、本方法での使用に適していることが認識されるであろう。
ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、それらがヒトＦｃγ受容体、例えばＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４の何れか１つ以上に実質的な特異的結合を有しないように調製され得る。このような抗体は、Ｆｃγ受容体に対する結合を欠くこと又は低い結合性を有することが知られている様々な重鎖の定常領域を含み得る。代替的に、Ｆｃ受容体結合を回避するために、Ｆ（ａｂ’）２断片など、定常領域を含まない（又は部分的に含む）抗体断片を使用し得る。Ｆｃ受容体結合は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイにおけるＦｃ受容体タンパク質への抗体の結合を試験することを含め、当技術分野で公知の方法に従い評価し得る。また、Ｆｃ受容体への結合を最小化又は除外するためにＦｃ部分が修飾される（例えば、１、２、３、４、５つ又はそれを超えるアミノ酸置換を導入することによって）何らかの抗体ＩｇＧアイソタイプを一般に使用し得る（例えば、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第０３／１０１４８５号パンフレットを参照されたい）。Ｆｃ受容体結合を評価するための細胞に基づくアッセイなどのアッセイは、当技術分野で周知であり、例えば国際公開第０３／１０１４８５号パンフレットに記載されている。
ある実施形態において、抗体は、エフェクター細胞との最小限の相互作用を有する「Ｆｃサイレント」抗体を生じるＦｃ領域における１つ以上の特異的突然変異を含み得る。サイレンシングされたエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域における突然変異によって得ることができ、当技術分野において記載されてきた。Ｎ２９７Ａ突然変異、ＬＡＬＡ突然変異（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｖｏｌ．２０（６）：６８５－６９１）；Ｄ２６５Ａ（Ｂａｕｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：６６６４－６９）及びＨｅｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開第２０１２／０６５９５０号パンフレットを参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、抗体は、ヒンジ領域に１、２、３つ又はそれを超えるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、抗体はＩｇＧ１又はＩｇＧ２であり、残基２３３～２３６、任意選択により、２３３～２３８（ＥＵ付番）において１つ、２つ又は３つの置換を含む。一実施形態では、抗体はＩｇＧ４であり、残基３２７、３３０及び／又は３３１（ＥＵ付番）に１つ、２つ又は３つの置換を含む。サイレントＦｃ ＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列におけるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ突然変異を含むＬＡＬＡ突然変異体である。Ｆｃサイレント突然変異の別の例は、例えば、ＤＡＰＡ（Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ）突然変異（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）としてＩｇＧ１抗体において用いられる、残基Ｄ２６５又はＤ２６５及びＰ３２９における突然変異である。別のサイレントＩｇＧ１抗体は、残基Ｎ２９７における突然変異（例えば、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｓ突然変異）を含み、その結果、グリコシル化／非グリコシル化抗体を生じる。他のサイレント突然変異は、残基Ｌ２３４及びＧ２３７における置換（Ｌ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ）；残基Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＲ４０９における置換（Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｒ４０９Ｋ、Ｔ、Ｍ、Ｌ）；残基Ｈ２６８、Ｖ３０９、Ａ３３０及びＡ３３１における置換（Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ）；残基Ｃ２２０、Ｃ２２６、Ｃ２２９及びＰ２３８における置換（Ｃ２２０Ｓ／Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｐ２３８Ｓ）；残基Ｃ２２６、Ｃ２２９、Ｅ２３３、Ｌ２３４及びＬ２３５における置換（Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ；残基Ｋ３２２、Ｌ２３５及びＬ２３５における置換（Ｋ３２２Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）；残基Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３３１における置換（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）；残基２３４、２３５及び２９７における置換；残基Ｅ３１８、Ｋ３２０及びＫ３２２における置換（Ｌ２３５Ｅ／Ｅ３１８Ａ／Ｋ３２０Ａ／Ｋ３２２Ａ）；残基（Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ）における置換；残基２４３及び２６４における置換；残基２９７及び２９９における置換；ＥＵ付番系によって定義される残基２３３、２３４、２３５、２３７及び２３８がＰＡＡＡＰ、ＰＡＡＡＳ及びＳＡＡＡＳから選択される配列を含む置換（国際公開第２０１１／０６６５０１号パンフレットを参照されたい）を含む。
ある実施形態において、抗体は、Ｆｃ領域に１つ以上の特異的突然変異を含むことができる。例えば、そのような抗体は、ヒトＩｇＧ１起源のＦｃドメインを含み、Ｋａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７、３３０及び／又は３３１における突然変異を含む。そのようなＦｃドメインの一例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３３１における置換（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ又は（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ））を含む。このようなＦｃドメインの別の例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７及びＰ３３１における置換（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。このようなＦｃドメインの別の例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０及びＰ３３１における置換（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。ある実施形態において、抗体は、Ｆｃドメイン、任意選択により、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含む抗体であり、Ｌ２３４Ｘ１置換、Ｌ２３５Ｘ２置換及びＰ３３１Ｘ３置換を含み、Ｘ１はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ２はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ３はプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、任意選択により、Ｘ１はアラニン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ２はグルタミン酸又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ３はセリン又はその保存的置換である。別の実施形態において、抗体は、Ｆｃドメイン、任意選択により、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含む抗体であり、Ｌ２３４Ｘ１置換、Ｌ２３５Ｘ２置換、Ｇ２３７Ｘ４置換及びＰ３３１Ｘ４置換を含み、Ｘ１はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ２はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ３はグリシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ４はプロリン以外のアミノ酸残基であり、任意選択により、Ｘ１はアラニン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ２はグルタミン酸又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ３はアラニン又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ４はセリン又はその保存的置換である。別の実施形態において、抗体は、Ｆｃドメイン、任意選択により、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含む抗体であり、Ｌ２３４Ｘ１置換、Ｌ２３５Ｘ２置換、Ｇ２３７Ｘ４置換、Ｇ３３０Ｘ４置換及びＰ３３１Ｘ５置換を含み、Ｘ１はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ２はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ３はグリシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ４はアラニン以外のアミノ酸残基、Ｘ５はプロリン以外のアミノ酸残基であり、任意選択により、Ｘ１はアラニン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ２はグルタミン酸又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ３はアラニン又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ４はセリン又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ５はセリン又はその保存的置換である。本明細書で使用されている略記法では、形式は、野生型残基：ポリペプチド中の位置：突然変異体残基であり、残基位置は、ＫａｂａｔによるＥＵ付番に従って示される。
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はそれらと少なくとも９０％、９５％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５及び３３１にアミノ酸残基を保持する（下線）。
Figure 0007308150000006
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はそれらと少なくとも９０％、９５％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５及び３３１にアミノ酸残基を保持する（下線）。
Figure 0007308150000007
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はそれらと少なくとも９０％、９５％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３３０及び３３１にアミノ酸残基を保持する（下線）。
Figure 0007308150000008
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はそれらと少なくとも９０％、９５％若しくは９９％同一の配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７及び３３１にアミノ酸残基を保持する（下線）。
Figure 0007308150000009
Ｆｃサイレント抗体は、ＡＤＣＣ活性を生じないか又は低いＡＤＣＣ活性を生じ、すなわち、Ｆｃサイレント抗体は、５０％未満の特異的細胞溶解であるＡＤＣＣ活性を示す。好ましくは、抗体は、実質的にＡＤＣＣ活性を欠き、例えば、Ｆｃサイレント抗体は、５％未満又は１％未満のＡＤＣＣ活性（特異的細胞溶解）を示す。Ｆｃサイレント抗体は、ＣＤ３９発現の表面でのＣＤ３９のＦｃγＲ媒介性架橋の欠如も生じ得る。
ある実施形態において、抗体は、２２０、２２６、２２９、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２４３、２６４、２６８、２９７、２９８、２９９、３０９、３１０、３１８、３２０、３２２、３２７、３３０、３３１及び４０９（重鎖定常領域における残基の付番はＫａｂａｔによるＥＵ付番に従う）からなる群から選択される任意の１、２、３、４、５つ又はそれを超える残基において重鎖定常領域に置換を有する。ある実施形態において、抗体は、残基２３４、２３５及び３２２における置換を含む。ある実施形態において、抗体は残基２３４、２３５及び３３１における置換を有する。ある実施形態において、抗体は、残基２３４、２３５、２３７及び３３１における置換を有する。ある実施形態において、抗体は、残基２３４、２３５、２３７、３３０及び３３１における置換を有する。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１サブタイプのものである。アミノ酸残基は、ＫａｂａｔによるＥＵ付番に従って示される。
ある実施形態において、本抗体は、この抗体のインビボ半減期を増加させるためにヒトＦｃＲｎポリペプチドへの結合を増加させるアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。例示的な突然変異がＳｔｒｏｈｌ，Ｗ．，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｖｏｌ．２０（６）：６８５－６９１で説明されており、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗体で使用される置換の例は、残基Ｍ２５２、Ｓ２５４及びＴ２５６での置換；残基Ｔ２５０及びＭ４２８での置換；残基Ｎ４３４での置換；残基Ｈ４３３及びＮ４３４での置換；残基Ｔ３０７、Ｅ３８０及びＮ４３４での置換；残基Ｔ３０７、Ｅ３８０及びＮ４３４での置換；残基Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｈ４３３、Ｎ４３４及び４３６での置換；残基Ｉ２５３での置換；残基Ｐ２５７、Ｎ４３４、Ｄ３７６及びＮ４３４での置換である。
ある実施形態において、本抗体は、プロテアーゼによる開裂に対する感受性の低下を付与するアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、腫瘍形成に関連するプロテイナーゼの最も顕著なファミリを表す。癌細胞は、ＭＭＰを発現し得るが、細胞外ＭＭＰの大部分は、様々なタイプの間質細胞によりもたらされ、この間質細胞は、腫瘍に浸潤し、且つプロテイナーゼ及びプロテイナーゼ阻害剤の特定のセットをそれぞれ産生し、これらは、細胞外空間に放出され、腫瘍周辺の環境を特異的に変更する。腫瘍微小環境中に存在するＭＭＰは、ヒンジ領域内で抗体を開裂し得、そのため腫瘍部位内で機能するように設計されている治療用抗体の不活性化につながる場合がある。ある実施形態において、アミノ酸置換を含むＦｃドメインは、ＧｌｕＶ８、ＩｄｅＳ、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ２）、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ－９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－７（ＭＭＰ－７）、ストロメリシン（ＭＭＰ－３）及びマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ－１２）からなる群から選択されるプロテアーゼの何れか１つ、２つ、３つ又はより多く（又は全て）による開裂に対する感受性が低下している。ある実施形態において、開裂に対する感受性が低下している抗体は、残基Ｅ２３３－Ｌ２３４及び／又はＬ２３５でアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。ある実施形態において、この抗体は、残基Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６でアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。ある実施形態において、この抗体は、残基２３３～２３８の１つ又は複数でアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含み、その結果、例えばＥ２３３－Ｌ２３４－Ｌ２３５－Ｇ２３６配列がＰ２３３－Ｖ２３４－Ａ２３５に置き換えられる（Ｇ２３６は欠失している）。例えば、国際公開第９９／５８５７２号パンフレット及び同第２０１２０８７７４６号パンフレットを参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
抗原結合化合物を、任意の所望の段階において、ＣＤ３９の酵素活性を阻害し（特にｓＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性をブロックし）、且つ可溶性ＣＤ３９タンパク質による（及び任意選択により、さらにＣＤ３９発現細胞による）ＡＤＰ及びＡＭＰ（及びＣＤ７３と一緒にアデノシン）の産生を減少させ、次いでリンパ球のアデノシンにより媒介される阻害の活性を回復させ、且つ／又はこの阻害を軽減する能力に関して評価し得る。
抗体の阻害活性（例えば、免疫増強能力）を、例えばＡＴＰの消失（加水分解）及び／又はＡＭＰの生成を検出するためのアッセイで評価し得る。
可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質を阻害する抗体の能力を、可溶性ＣＤ３９タンパク質（例えば、実施例、方法で産生される、配列番号４４又は配列番号４５のアミノ酸配列を有するタンパク質、任意選択により、精製タグ又は他の機能する若しくは機能しない非ＣＤ３９由来のアミノ酸配列をさらに含む）と共に試験抗体をインキュベートした後にＡＴＰを検出することにより試験し得る。例えば、実施例、方法を参照されたい。簡潔に説明すると、試験抗体の用量範囲を３７℃で１時間にわたり実施例１で説明する可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質と共にインキュベートするアッセイにおいて、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＴＰを定量し得る。３７℃でさらに３０分にわたりプレートに２０μＭのＡＴＰを添加した後、ＣＴＧ試薬を添加する。暗所での５分間の短いインキュベーション後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）ルミノメーターを使用して放射光を定量する。
ＣＤ３９タンパク質を発現する細胞を阻害する抗体の能力を、細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ細胞、ＣＤ３９が遺伝子移入された細胞等）と共に試験抗体をインキュベートした後にＡＴＰを検出することにより試験し得る。例えば、実施例、方法を参照されたい。細胞を試験抗体と共に３７℃で１時間にわたりインキュベートし得る。次いで、細胞を３７℃でさらに１時間にわたり２０μＭのＡＴＰと共にインキュベートする。プレートを４００ｇで２分にわたり遠心分離し、細胞上清を発光マイクロプレート（白色ウェル）に移す。この上清にＣＴＧを添加し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）ルミノメーターを使用して、暗所での５分間のインキュベーション後に放射光を定量する。抗ＣＤ３９抗体の有効性を、抗体の存在下での放射光と、ＡＴＰのみ（最大光放射）並びにＡＴＰ及び細胞（最小光放射）とを比較することにより決定する。
抗体の存在下でのＡＭＰへのＡＴＰの加水分解の減少、及び／又はＡＴＰの増加、及び／又はＡＭＰの生成の減少は、この抗体がＣＤ３９を阻害することを示す。ある実施形態において、例えば実施例、方法のように、試験抗体と共に、ＣＤ３９ポリペプチドを発現する細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ細胞）をインキュベートした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＴＰを検出することによって評価した場合、抗体調製物は、細胞によって発現されるＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも６０％の低下を生じさせることができ、好ましくは、この抗体は、細胞中においてＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも７０％、８０％又は９０％の低下を生じさせる。
ある実施形態において、例えば実施例、方法のように、試験抗体と共に可溶性組換えＣＤ３９ポリペプチドをインキュベートした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＴＰを検出することによって評価した場合、抗体調製物は、（例えば、細胞の非存在下で）可溶性組換えＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも６０％の低下を生じさせることができ、好ましくは、可溶性組換えＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも７０％、８０％又は９０％の低下を生じさせることができる。
抗体の活性を、例えばリンパ球活性のアデノシンにより媒介される阻害を軽減するために、又はリンパ球活性の活性化を生じさせるために免疫細胞（例えば、アデノシン受容体発現免疫細胞；Ａ２Ａ受容体発現細胞）の活性を調節する能力に関する間接アッセイでも測定し得る。これを、例えばサイトカイン放出アッセイを使用して対処し得る。別の例において、抗体を、リンパ球の増殖を調節する能力に関する間接アッセイで評価し得る。
一例において、提供されるのは、抗ＣＤ３９抗体又は抗原結合ドメインを製造又は特定するための方法であって、
（ａ）ヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合する抗体を含む複数の試料（例えば、細胞培養上清、ハイブリドーマ上清）を準備するステップと、
（ｂ）この試料を精製ステップに供して、精製されたモノクローナル抗体をそれぞれ含む複数の試料を得、（例えば、細胞の非存在下で）各抗体試料を可溶性細胞外ドメインＣＤ３９タンパク質と接触させ、そのＡＴＰアーゼ活性の中和を評価するステップと、
（ｃ）ＡＴＰアーゼ活性の中和をもたらすステップ（ｂ）の抗体を選択し、任意選択により、少なくとも７０％、任意選択により８０％又は任意選択により９０％の中和をもたらす抗体を選択するステップと
を含む方法である。ある実施形態において、ステップ（ａ）は、ＣＤ３９ポリペプチドにより１つ又は複数の非ヒト哺乳動物に免疫付与することと、そのような哺乳動物から、ヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合する抗体を含む複数の試料を得ることとを含む。
一例において、提供されるのは、抗ＣＤ３９抗体又は抗原結合ドメインを製造又は特定するための方法であって、
（ａ）ヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合する複数の精製された抗体を準備するステップと、
（ｂ）各抗体を可溶性細胞外ドメインＣＤ３９タンパク質と接触させ、そのＡＴＰアーゼ活性の中和を評価するステップと、
（ｃ）少なくとも７０％、任意選択により８０％又は任意選択により９０％のＡＴＰアーゼ活性の中和をもたらすステップ（ｂ）の抗体を選択するステップと
を含む方法である。
任意選択により、この方法は、
（ｄ）各抗体をＣＤ３９発現細胞、任意選択によりヒトＢ細胞、任意選択によりＲａｍｏｓヒトリンパ腫細胞と接触させ、ＡＴＰアーゼ活性の中和を評価するステップと、
（ｅ）少なくとも７０％、任意選択により８０％又は任意選択により９０％のＡＴＰアーゼ活性の低下をもたらすステップ（ｄ）の抗体を選択するステップと
をさらに含み得る。ステップ（ｂ）及び（ｃ）をステップ（ｄ）及び（ｅ）前又は後に実施し得る。
ＣＤ３９上のエピトープ
ある態様において、本抗体は、細胞表面で発現されたＣＤ３９上に存在する抗原決定基に結合する。
ある態様において、本抗体は、抗体Ｉ－３９４、Ｉ－３９５，Ｉ－３９６、Ｉ－３９７又はＩ－３９８と実質的に同一のエピトープに結合する。ある実施形態において、この抗体は、抗体Ｉ－３９４、Ｉ－３９５、Ｉ－３９６、Ｉ－３９７又はＩ－３９８が結合するエピトープと少なくとも部分的に重複するか、又はこのエピトープ中の少なくとも１個の残基を含むＣＤ３９のエピトープに結合する。この抗体が結合する残基は、ＣＤ３９ポリペプチドの表面上（例えば、細胞の表面上で発現されるＣＤ３９ポリペプチド中）に存在すると特定され得る。
ＣＤ３９突然変異体が遺伝子移入された細胞への抗ＣＤ３９抗体の結合を測定し得、且つ抗ＣＤ３９抗体の、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（例えば、配列番号１）に結合する能力と比較し得る。抗ＣＤ３９抗体と突然変異体ＣＤ３９ポリペプチド（例えば、表１の突然変異体）との間の結合の減少は、（例えば、特定の突然変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験のような既知の方法により測定した場合若しくは突然変異体ポリペプチドへの結合のＢｉａｃｏｒｅ試験により測定した場合に）結合親和性の減少が存在すること、及び／又は（例えば、抗ＣＤ抗体濃度対ポリペプチド濃度のプロットにおいてＢｍａｘの減少により実証される場合に）抗ＣＤ３９抗体の総結合能力の減少が存在することを意味する。結合の有意な減少は、抗ＣＤ３９抗体がＣＤ３９に結合している場合、突然変異した残基が抗ＣＤ３９抗体への結合に直接関与していること、又はこの結合タンパク質に近接していることを示す。
いくつかの実施形態において、結合の有意な減少は、抗ＣＤ３９抗体と突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドとの間の結合親和性及び／又は結合能力が、この抗体と野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの間の結合と比較して４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超又は９５％超減少していることを意味する。特定の実施形態において、結合は、検出可能な限界未満まで減少する。いくつかの実施形態において、結合の有意な減少は、突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドへの抗ＣＤ３９抗体の結合が、この抗ＣＤ３９抗体と野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの間で観測されているものの、５０％未満（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％又は１０％未満）である場合に証明される。
いくつかの実施形態において、抗体Ｉ－３９４、Ｉ－３９５、Ｉ－３９６、Ｉ－３９７、Ｉ－３９８又はＩ－３９９が結合するアミノ酸残基を含むセグメント中の残基が異なるアミノ酸に置換されている突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドの場合の結合が、そのような置換を含まない野生型ＣＤ３９ポリペプチド（例えば、配列番号１のポリペプチド）への結合と比較して有意に低いことを示す抗ＣＤ３９抗体が提供される。
いくつかの実施形態において、抗体Ｉ－３９４が結合するＣＤ３９上のエピトープに結合する抗ＣＤ３９抗体（例えば、Ｉ－３９４以外）が提供される。
本明細書の何れかの実施形態において、抗体は、ＰＣＴ公報国際公開第２００９／０９５４７８号パンフレット（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）で言及されているＢＹ４０、ＢＹ１２又はＢＡ５４ｇ以外の抗体（又はそのＣＤＲを共有する抗体）として特徴付けられ得る。
ある態様において、本抗ＣＤ３９抗体は、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１を基準にする）からなる群から選択される残基で突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合が減少しており、任意選択により、この突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異：Ｑ９６Ａ、Ｎ９９Ａ、Ｅ１４３Ａ及びＲ１４７Ｅを有する。ある態様において、この抗ＣＤ３９抗体は、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１を基準にする）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、この残基の１つ、２つ、３つ又は４つ）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
ある実施形態において、抗体は、この抗体と、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの間の結合と比較して、それぞれの場合にＲ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２（配列番号１を基準にする）からなる群から選択される残基の１つ又は複数（又は全て）で突然変異を含む突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドへの結合が減少している。
ある実施形態において、抗体は、この抗体と、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの間の結合と比較して、それぞれの場合にＫ８７、Ｅ１００及びＤ１０７（配列番号１を基準にする）からなる群から選択される残基の１つ又は複数（又は全て）で突然変異を含む突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドへの結合が減少している。
ある実施形態において、抗体は、この抗体と、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの間の結合と比較して、それぞれの場合にＮ３７１、Ｌ３７２、Ｅ３７５、Ｋ３７６及びＶ３７７（配列番号１を基準にする）からなる群から選択される残基の１つ又は複数（又は全て）で突然変異を含む突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドへの結合が減少している。
例示的な抗体可変領域の配列
本開示に係る例示的な抗ＣＤ３９ ＶＨ及びＶＬのペアは、抗体Ｉ－３９４のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されており（配列番号６）、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されている（配列番号７）。配列番号６及び配列番号７において、Ｋａｂａｔナンバリングに従うＣＤＲに下線を引いている。任意選択により、このＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、このフレームワークを組み入れるように改変されている）。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに従う）を含む。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに従う）を含む。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。
Ｉ－３９４ ＶＨ：
Figure 0007308150000010
 Ｉ－３９４ ＶＬ：
Figure 0007308150000011
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、下記を含み得る：アミノ酸配列：ＤＹＮＭＨ（配列番号８）若しくはその少なくとも４個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＹＩＶＰＬＮＧＧＳＴＦＮＱＫＦＫＧ（配列番号９）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ２であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＧＧＴＲＦＡＹ（配列番号１０）又はその少なくとも４個、５個若しくは６個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ３であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＳＥＳＶＤＮＦＧＶＳＦＭＹ（配列番号１１）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＧＡＳＮＱＧＳ（配列番号１２）又はその少なくとも４個、５個若しくは６個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ２領域；及び／又はアミノ酸配列：ＱＱＴＫＥＶＰＹＴ（配列番号１３）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個若しくは８個の連続したアミノ酸の配列を含む、Ｉ－３９４のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、欠失され得るか若しくは異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ３領域。ＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従い得る。
本開示に係る別の例示的な抗ＣＤ３９ ＶＨ及びＶＬのペアは、抗体Ｉ－３９５のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されており（配列番号１４）、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されている（配列番号１５）。配列番号１４及び配列番号１５において、Ｋａｂａｔナンバリングに従うＣＤＲに下線を引いている。任意選択により、このＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、このフレームワークを組み入れるように改変されている）。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに従う）を含む。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに従う）を含む。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。
Ｉ－３９５ ＶＨ：
Figure 0007308150000012
 Ｉ－３９５ ＶＬ：
Figure 0007308150000013
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、下記を含み得る：アミノ酸配列：ＤＹＮＭＨ（配列番号１６）若しくはその少なくとも４個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＹＩＮＰＮＮＧＧＴＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１７）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ２であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＧＧＴＲＦＡＳ（配列番号１８）又はその少なくとも４個、５個、６個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ３であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＹ（配列番号１９）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＡＡＳＴＱＧＳ（配列番号２０）又はその少なくとも４個、５個若しくは６個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ２領域；及び／又はアミノ酸配列：ＱＱＳＫＥＶＰＦＴ（配列番号２１）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個若しくは８個の連続したアミノ酸の配列を含む、Ｉ－３９６のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、欠失され得るか若しくは異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ３領域。ＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従い得る。
本開示に係る別の例示的な抗ＣＤ３９ ＶＨ及びＶＬのペアは、抗体Ｉ－３９６のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されており（配列番号２２）、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されている（配列番号２３）。配列番号２２及び配列番号２３において、Ｋａｂａｔナンバリングに従うＣＤＲに下線を引いている。任意選択により、このＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、このフレームワークを組み入れるように改変されている）。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに従う）を含む。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに従う）を含む。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。
Ｉ－３９６ ＶＨ：
Figure 0007308150000014
 Ｉ－３９６ ＶＬ：
Figure 0007308150000015
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、下記を含み得る：アミノ酸配列：ＤＴＹＩＮ（配列番号２４）若しくはその少なくとも４個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＲＩＤＰＡＮＧＮＴＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号２５）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ２であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＷＧＹＤＤＥＥＡＤＹＦＤＳ（配列番号２６）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ３であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号２７）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号２８）又はその少なくとも４個、５個若しくは６個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ２領域；及び／又はアミノ酸配列：ＨＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号２９）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個若しくは８個の連続したアミノ酸の配列を含む、Ｉ－３９６のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、欠失され得るか若しくは異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ３領域。ＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従い得る。
本開示に係る別の例示的な抗ＣＤ３９ ＶＨ及びＶＬのペアは、抗体Ｉ－３９９のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されており（配列番号３０）、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されている（配列番号３１）。配列番号３０及び配列番号３１において、Ｋａｂａｔナンバリングに従うＣＤＲに下線を引いている。任意選択により、このＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、このフレームワークを組み入れるように改変されている）。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに従う）を含む。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに従う）を含む。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。
Ｉ－３９９ ＶＨ：
Figure 0007308150000016
 Ｉ－３９９ ＶＬ：
Figure 0007308150000017
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、下記を含み得る：アミノ酸配列：ＳＦＷＭＮ（配列番号３２）若しくはその少なくとも４個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＥＩＤＰＳＤＦＹＴＮＳＮＱＲＦＫＧ（配列番号３３）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ２であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＧＤＦＧＷＹＦＤＶ（配列番号３４）又はその少なくとも４個、５個若しくは６個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ３であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＳＡＳＳＳＩＮＳＮＹＬＨ（配列番号３５）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号３６）又はその少なくとも４個、５個若しくは６個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ２領域；及び／又はアミノ酸配列：ＱＱＧＳＳＬＰＲＴ（配列番号３７）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個若しくは８個の連続したアミノ酸の配列を含む、Ｉ－３９９のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、欠失され得るか若しくは異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ３領域。ＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従い得る。
Ｉ－３９４抗体、Ｉ－３９５抗体、Ｉ－３９６抗体及びＩ－３９９抗体の何れかにおいて、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３の配列（別々に各ＣＤＲ又は全てのＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムのもの（下線を引くことにより、ＶＨ及びＶＬの配列中に示す）、Ｃｈｏｔｉａナンバリングシステムのもの若しくはＩＭＧＴナンバリングシステムのもの又は任意の他の適切なナンバリングシステムであると指定され得る。
ある態様において、指定した可変領域、ＦＲ及び／又はＣＤＲの配列は、１個又は複数の配列改変を含み得、例えば置換（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又はより多くの配列改変）を含み得る。ある実施形態において、この置換は、保存的改変である。
別の態様において、本抗ＣＤ３９化合物は、配列番号６のＶＨドメインに対して少なくとも約６０％、７０％又は８０％の配列同一性、任意選択により少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨドメインを含む。別の態様において、本抗ＣＤ３９抗体は、配列番号７のＶＬドメインに対して少なくとも約６０％、７０％又は８０％の配列同一性、任意選択により少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬドメインを含む。
抗体のフラグメント及び誘導体（別途明記しない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、本願で使用される用語１つ又は複数の「抗体」に包含される）を当技術分野で既知の技術により製造し得る。「フラグメント」は、無傷の抗体の一部を含み、一般には抗原結合部位又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例として下記が挙げられる：Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；連続したアミノ酸残基の１つの連続した配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体フラグメント（本明細書では、「一本鎖抗体フラグメント」又は「一本鎖ポリペプチド」と称される）、例えば、限定されないが、（１）一本鎖Ｆｖ分子、（２）会合した重鎖部分を有しない、１個のみの軽鎖可変ドメインを含む一本鎖ポリペプチド又はこの軽鎖可変ドメインの３個のＣＤＲを含む、この一本鎖ポリペプチドのフラグメント、及び（３）会合した軽鎖部分を有しない、１個のみの重鎖可変領域を含む一本鎖ポリペプチド又はこの重鎖可変領域の３個のＣＤＲを含む、この一本鎖ポリペプチドのフラグメント；並びに抗体フラグメントから形成された多重特異性（例えば、二重特異性）抗体。含まれるのは、特にナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体又は「ｄＡｂ」である。
特定の実施形態において、抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡを、発現ベクター中への挿入前に、例えば相同非ヒト配列の代わりにヒト重鎖定常ドメイン及びヒト軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ｐｐ．６８５１（１９８４））又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全て又は一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合的に連結させることにより改変し得る。この方法において、元々の抗体の結合特異性を有する「キメラ」抗体又は「ハイブリッド」抗体が調製される。典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインの代わりである。
任意選択により、抗体は、ヒト化されている。抗体の「ヒト化」形態は、マウス免疫グロブリンに由来する最小配列を含む特定のキメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖又はフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２若しくは抗体の他の抗原結合部分配列）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、このレシピエント抗体では、このレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が元々の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基に置き換えられており、同時に元々の抗体の所望の特異性、親和性及び能力が維持されている。
任意選択により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられ得る。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又は移入されたＣＤＲ若しくはフレームワークの配列の何れでも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに改善及び最適化するために行われる。一般に、このヒト化抗体は、少なくとも１個の（典型的には２個の）可変ドメインの実質的に全てを含み、この可変ドメインでは、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが元々の抗体のものに対応し、且つＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。このヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的には、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部も最適に含むであろう。さらなる詳細に関して、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．３２３（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２，ｐｐ．５９３（１９９２）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｐｐ．１５３４；及び米国特許第４，８１６，５６７号明細書（これらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体をヒト化するための方法は、当技術分野で公知である。
抗原性を低下させるために、ヒト化抗体の作製で使用するヒト可変ドメイン（軽及び重の両方）の選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。次いで、マウスの配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容する（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，ｐｐ．２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．１９６，１９８７，ｐｐ．９０１）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列からの特定のフレームワークを使用する。同一のフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用し得る（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８９，ｐｐ．４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，ｐ．２６２３（１９９３））。
抗体がＣＤ３９及び他の好ましい生物学的特性に対して高い親和性を保持しつつヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、ある方法によれば、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用する、親配列及び様々な概念上のヒト化産物の分析プロセスにより、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定上の三次元構造を説明する及び表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの表示の調査により、この候補免疫グロブリン配列の機能における残基のあり得る役割の分析が可能になる。このようにして、コンセンサス配列及びインポート配列からＦＲ残基を選択して組み合わせ得、その結果、所望の抗体特性が達成される。
「ヒト化」モノクローナル抗体を作製する別の方法は、免疫付与に使用されるマウスとしてＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を使用することである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、免疫グロブリン遺伝子が、機能するヒト免疫グロブリン遺伝子に置き換えられているマウス宿主である。そのため、このマウスにより産生された抗体又はこのマウスのＢ細胞から作製したハイブリドーマ中で産生された抗体は、既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、米国特許第６，１６２，９６３号明細書で説明されており、この明細書の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
同様に、ヒト抗体を様々な他の技術に従って製造し得、例えばヒト抗体のレパートリーを発現するように操作されている他のトランスジェニック動物を免疫付与のために使用することにより（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５）又はファージディスプレイ法を使用する抗体のレパートリーからの選択により製造し得る。そのような技術は、当業者に既知であり、本願で開示されたモノクローナル抗体から出発して実施され得る。
１ｍｇ／ｍＬ～５００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む医薬処方物中に抗ＣＤ３９抗体が組み込まれ得、前記処方物のｐＨは２．０～１０．０である。本処方物は、緩衝液系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤及び界面活性剤をさらに含み得る。ある実施形態において、医薬処方物は、水性処方物、すなわち水を含む処方物である。このような処方物は、一般に溶液又は懸濁液である。さらなる実施形態において、本医薬処方物は水性溶液である。「水性処方物」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む処方物として定義される。同様に「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
別の実施形態において、本医薬処方物は、凍結乾燥処方物であり、医師又は患者が使用前にそれに溶媒及び／又は希釈剤を添加する。
別の実施形態において、本医薬処方物は、事前に溶解する必要がない使用準備済みの乾燥処方物（例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥）である。
さらなる態様において、本医薬処方物は、このような抗体の水溶液及び緩衝液を含み、この抗体は１ｍｇ／ｍＬ又はそれを超える濃度で存在し、前記処方物のｐＨは約２．０～約１０．０である。
別の実施形態において、本処方物のｐＨは、約２．０～約１０．０、約３．０～約９．０、約４．０～約８．５、約５．０～約８．０及び約５．５～約７．５からなる一覧から選択される範囲である。
さらなる実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はこれらの混合物からなる群から選択される。これらの具体的な各緩衝液は、代替的な実施形態を構成する。
さらなる実施形態において、本処方物は、薬学的に許容可能な保存剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物は等張剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物はキレート剤も含む。さらなる実施形態において、本処方物は安定化剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物は界面活性剤をさらに含む。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照する。
ペプチド医薬処方物中に他の成分が存在し得る可能性がある。このようなさらなる成分としては、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、等張性調節剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）及び双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジンなどのアミノ酸）が挙げられ得る。このようなさらなる成分は、当然のことながら、医薬処方物の全体的な安定性に悪影響を与えるべきではない。
抗体を含有する医薬組成物は、いくつかの部位、例えば局所部位、例えば皮膚及び粘膜部位、吸収を迂回する部位、例えば動脈における、静脈における、心臓における投与及び吸収を含む部位、例えば皮膚、皮下における、筋肉又は腹部における投与において、このような処置を必要とする患者に投与し得る。医薬組成物の投与は、このような処置を必要とする患者への、いくつかの投与経路を通じて、例えば皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、舌、舌下、頬側、口腔における投与、経口、胃腸における投与、鼻腔、肺、例えば細気管支及び肺胞又はそれらの組み合わせを通じた投与、上皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼、例えば結膜を通じた投与、ウレタル（ｕｒｅｔａｌ）及び非経口投与であり得る。
適切な抗体処方物は、他の既に開発されている治療用モノクローナル抗体での経験を調べることによっても決定し得る。いくつかのモノクローナル抗体は、リツキサン（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ゾーレア（オマリズマブ）、ベクザー（トシツモマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、ゼバリン、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）など、臨床的状況で有効であることが示されており、抗体と共に同様の処方物を使用し得る。例えば、モノクローナル抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）又は５００ｍｇ（５０ｍＬ）の何れかの単回使用バイアルで、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０及び注射のための滅菌水中でＩＶ投与用に処方された１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給され得る。ｐＨは６．５に調整する。別の実施形態において、本抗体は、ｐＨが６．０の約２０ｍＭクエン酸Ｎａ、約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む処方物中で供給される。
疾患の診断及び処置
本明細書で説明された抗ＣＤ３９抗体を使用して個体（特にヒト個体）を処置する方法も提供される。ある実施形態において、本開示は、ヒト患者への投与のための医薬組成物の調製における、本明細書で説明された抗体の使用を提供する。典型的には、この個体は、癌又は感染性疾患（例えば、ウイルス感染、細菌感染）に罹患しているか又はこれらのリスクがある。ある実施形態において、この個体は、循環及び／又は組織サンプル（例えば、腫瘍サンプル若しくは腫瘍隣接組織サンプル）において、検出可能な可溶性（細胞外）ＣＤ３９タンパク質を有する。
例えば、ある態様において、提供されるのは、リンパ球の活性の回復又は増強を、それを必要とする個体において行う方法であって、本開示の中和抗ＣＤ３９抗体を前記個体に投与するステップを含む方法である。この抗体は、例えば、ヒト抗ＣＤ３９抗体又はヒト化抗ＣＤ３９抗体であって、ＣＤ３９－Ｌ１、ＣＤ３９－Ｌ２、ＣＤ３９－Ｌ３及び／又はＣＤ３９－Ｌ４に結合することなく、「血管」ＣＤ３９の可溶型及び膜型に特異的に結合してこれらのＡＴＰアーゼ活性を中和し、任意選択によりヒトＣＤ１６が実質的に結合しない（及び任意選択により、さらに、他のヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ又はＣＤ６４）が結合しない）ヒト抗ＣＤ３９抗体又はヒト化抗ＣＤ３９抗体であり得る。そのような抗体は、血管ＣＤ３９以外のアイソフォームでの結合の欠如に起因して、望ましくない副作用又は毒性を低減させ、且つ血管系中におけるＣＤ３９発現内皮細胞に対する枯渇効果又は他のＦｃにより媒介される効果を生じる望ましくない副作用又は毒性を低減させるであろう。
ある実施形態において、この方法は、リンパ球の活性の増加が有利である疾患又は免疫抑制、免疫抑制細胞若しくは例えばＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、Ｂ細胞）により生成されたアデノシンにより引き起こされるか、若しくはこれらによって特徴付けられる疾患を有する個体のリンパ球（例えば、Ｔ細胞）の活性を増加させることに向けられる。この方法は、例えば、腫瘍微小環境（及びこの環境中における、ＣＤ３９により媒介されるアデノシン産生）が、免疫系による認識の欠如（免疫逃避）に寄与し得ると疑われる固形腫瘍を有する個体を処置するのに特に有用であるであろう。腫瘍環境（腫瘍組織又は腫瘍隣接組織）は、例えば、ＣＤ３９発現免疫細胞（例えば、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、Ｂ細胞）の存在によって特徴付けられ得る。
より具体的には、本方法及び本組成物は、様々な癌及び他の増殖性疾患並びに感染性疾患の処置に利用される。この方法は、リンパ球の抗標的細胞（例えば、抗腫瘍）活性を阻害するアデノシンを減少させることにより機能し、任意選択により、さらに、リンパ球の抗腫瘍活性を増加させ得るＡＴＰを増加させることにより機能することから、この方法は、非常に広い範囲の癌及び感染性疾患に適用可能である。ある実施形態において、本抗ＣＤ３９組成物は、ヒトＰＤ－１の阻害活性を中和する（例えば、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する）薬剤による処置に対する応答が低い（又は感受性ではない）個体の癌を処置するのに有用である。処置し得る癌の代表例として、特に腫瘍微小環境中のアデノシンが抗腫瘍免疫応答の抑制で強力な役割を果たし得る固形腫瘍が挙げられる。ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体で処置されるヒト患者は、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む頭頸部の癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）、メラノーマ、子宮癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍の血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストにより誘導されるものを含む環境誘導性の癌、例えば多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫／縦隔原発性Ｂ細胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞型リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫及び前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫を含む血液系悪性腫瘍及び前記癌の何れかの組み合わせを有する。本開示は、転移性癌の処置にも適用可能である。患者は、処置前、処置中又は処置後、上記臨床特性の１つ以上に対して試験又は選択され得る。
ある実施形態において、本抗ＣＤ３９抗体を、例えば循環中における及び／又は組織（例えば、腫瘍若しくは腫瘍隣接組織）中における可溶性（細胞外）ＣＤ３９タンパク質の検出可能な及び／又は上昇したレベルによって特徴付けられる癌の処置で使用する。
ある実施形態において、本抗ＣＤ３９抗体を、ＣＤ３９を発現する悪性細胞によって特徴付けられる癌の処置で使用する。
ある実施形態において、本抗ＣＤ３９抗体を、ＣＤ３９、任意選択によりｓＣＤ３９、任意選択によりｍｅｍＣＤ３９の酵素活性の中和のために、少なくともＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００の血中濃度を（例えば、１週間、２週間、３週間、４週間にわたり及び／又は抗原結合化合物のその後の投与まで）個体において達成及び／又は維持するのに有効な量で投与する。ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体の有効量とは、個体の血管外組織中において、ＣＤ３９、任意選択によりｓＣＤ３９、任意選択によりｍｅｍＣＤ３９の酵素活性の中和のために、ＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００を達成するのに有効な量である。ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体の有効量は、ＣＤ３９、任意選択によりｓＣＤ３９、任意選択によりｍｅｍＣＤ３９の酵素活性の中和の阻害のために、ＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００を個体において達成（又は維持）するのに有効な量である。
任意選択により、ある実施形態において、ＡＤＣＣによるＣＤ３９発現腫瘍細胞の枯渇を対象とするいくつかの抗体（例えば、受容体飽和をもたらすものと同等の又は実質的に低い濃度で完全な効力を提供し得る）とは対照的に、本抗ＣＤ３９抗体は、実質的なＦｃγ受容体媒介活性を示さず、本抗ＣＤ３９抗体を、抗ＣＤ３９抗体の次の連続投与まで、所望の期間（例えば、１週間、２週間、１ヶ月）にわたり、ＣＤ３９発現の下方制御を実質的に生じさせることなく、任意選択により、さらにＣＤ３９の酵素活性を中和するのに有効な量で投与する。
ある実施形態において、本抗ＣＤ３９抗体を、ＡＴＰからＡＭＰへのＣＤ３９により媒介される異化の阻害のために（例えば、ｓＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性の中和を評価することによる；可溶性（細胞外）ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の中和を評価することによる、実施例５を参照されたい）、少なくともＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００の血中濃度を個体において（例えば、１週間、２週間、３週間、４週間にわたり及び／又は抗ＣＤ３９抗体のその後の投与まで）達成及び／又は維持するのに有効な量で投与する。
ある実施形態において、提供されるのは、個体の癌を処置又は予防するための方法であって、（例えば、ＰＢＭＣで評価される場合に）循環中における５０％、７０％又は完全な（例えば、９０％）の受容体飽和ＣＤ３９発現細胞に必要な濃度と比べて高い循環中の濃度、任意選択により目的の血管外組織（例えば、腫瘍又は腫瘍環境）中の濃度を指定の期間にわたり達成又は維持する量で抗ＣＤ３９抗体を、疾患を有する個体に投与することを含む方法である。任意選択により、達成される濃度は、指定の受容体飽和に必要な濃度と比べて少なくとも２０％、５０％又は１００％高い。
ある実施形態において、提供されるのは、個体の癌を処置又は予防するための方法であって、（例えば、ＣＤ３９発現細胞（例えば、実施例、方法でのＲａｍｏｓ細胞）上の抗ＣＤ３９抗体を滴定することにより、フローサイトメトリーによって評価される場合に）ＣＤ３９発現細胞への結合に関して、ＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０か又は任意選択によりＥＣ１００と比べて高い循環中の濃度、任意選択により目的の血管外組織（例えば、腫瘍又は腫瘍環境）中の濃度を指定の期間にわたり達成又は維持する量で抗ＣＤ３９抗体を個体に投与することを含む方法である。任意選択により、達成される濃度は、ＣＤ３９発現細胞への結合に関して、ＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０又は任意選択によりＥＣ１００と比べて少なくとも２０％、５０％又は１００％高い。
ＥＣ５０、ＥＣ７０又はＥＣ１００を、例えば本明細書の実施例で示されているＣＤ３９の酵素活性の中和（例えば、ＡＴＰからＡＭＰへの（又はＡＴＰから下流のアデノシンへの）加水分解を評価することによるＢ細胞中におけるＡＴＰアーゼ活性の中和）に関する細胞アッセイで評価し得る（実施例、方法を参照されたい）。ＣＤ３９の酵素活性の中和に関する「ＥＣ５０」は、この酵素活性の中和に関する最大の反応又は効果の５０％を生じる抗ＣＤ３９抗体の効率的な濃度を指す。ＣＤ３９の酵素活性の中和に関する「ＥＣ７０」は、最大の反応又は効果の７０％を生じる抗ＣＤ３９抗体の効率的な濃度を指す。ＣＤ３９の酵素活性の中和に関する「ＥＣ１００」は、この酵素活性のそのようは中和に関する実質的に最大の反応又は効果を生じる抗ＣＤ３９抗体の効率的な濃度を指す。
いくつかの実施形態において、特に固形腫瘍の処置の場合、達成される濃度は、酵素活性の中和のために少なくともＥＣ５０又はＥＣ７０（任意選択により約ＥＣ１００又は少なくとも約ＥＣ１００）に対応する組織中（血管外、例えば腫瘍又は腫瘍環境中）の濃度をもたらすように設計されている。
ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体の量は、１～２０ｍｇ／ｋｇ体重である。ある実施形態において、この量を毎週、２週間毎、毎月又は２ヶ月毎に個体に投与する。
ある実施形態において、提供されるのは、癌を有するヒト個体を処置する方法であって、少なくとも１回の投与サイクル（任意選択により、少なくとも２回、３回、４回又はより多くの投与サイクル）にわたり、本開示の抗ＣＤ３９抗体の有効量を個体に投与することを含み、このサイクルは、８週間以下の期間であり、少なくとも１回のサイクルのそれぞれに関して、抗ＣＤ３９抗体の１回、２回、３回又は４回の用量は、１～２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、方法である。ある実施形態において、この抗ＣＤ３９抗体を静脈内注入により投与する。
ヒトを処置するための適切な処置プロトコルは、例えば、抗ＣＤ３９抗体の本明細書で開示された量を患者に投与することを含み、この方法は、抗ＣＤ３９抗体の少なくとも１回の用量を投与する少なくとも１回の投与サイクルを含む。任意選択により、抗ＣＤ３９抗体の少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回又は８回の用量を投与する。ある実施形態において、投与サイクルは、２週間～８週間である。
ある実施形態において、提供されるのは、個体の疾患（例えば、癌、固形腫瘍、血液腫瘍）を処置又は予防するための方法であって、少なくとも１回の投与サイクルにわたりＣＤ３９の酵素活性を中和する抗ＣＤ３９抗体を、疾患（例えば、癌、固形腫瘍、血液腫瘍）を有する個体に投与することを含み、この投与サイクルは、抗ＣＤ３９抗体の少なくとも１回目の及び２回目の（並びに任意選択により、３回目、４回目、５回目、６回目、７回目及び／若しくは８回目の又はさらなる）投与を含み、この抗ＣＤ３９抗体は、（例えば、血液腫瘍の処置のために）少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、任意選択により少なくとも０．２μｇ／ｍｌ、任意選択により少なくとも１μｇ／ｍｌ若しくは任意選択により少なくとも２μｇ／ｍｌ又は（例えば、固形腫瘍の処置のために、血液腫瘍の処置のために）任意選択により少なくとも約１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ若しくは２０μｇ／ｍｌ、例えば１～１００μｇ／ｍｌ、１～５０μｇ／ｍｌ、１～２０μｇ／ｍｌ若しくは１～１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３９抗体の血中濃度（血清濃度）を２回の連続した投与間で達成及び維持するのに有効な量で投与される、方法である。ある実施形態において、指定の継続的な血中濃度が維持され、この血中濃度は、指定の期間の持続期間（例えば、抗体の２回の投与間で数週間、すなわち１週間、２週間、３週間、４週間）にわたり指定の血中濃度を実質的に下回らず、すなわち、血中濃度は、指定の期間中に変化する可能性があるが、維持される指定の血中濃度は、最小濃度又は「トラフ」濃度を表す。ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体の治療的有効量とは、抗体の投与後に少なくとも約１週間、約２週間又は約１ヶ月の期間にわたり、ＣＤ３９の酵素活性の中和のために、血液及び／又は組織中において（少なくとも）ＥＣ５０濃度、任意選択によりＥＣ７０濃度、任意選択によりＥＣ１００濃度をもたらすことができるそのような酵素の量である。
本開示の抗ＣＤ３９抗体による処置の前又は処置中、可溶性（細胞外）ＣＤ３９タンパク質、ＣＤ３９発現細胞、アデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰレベルの存在又はレベルを患者の腫瘍内で及び／又は患者の腫瘍に隣接して評価し、この患者が処置に適しているかどうかを評価し得る（例えば、患者が処置に反応する可能性があるかどうかを予測し得る）。可溶性（細胞外）ＣＤ３９、ＣＤ３９発現細胞、アデノシンのレベル、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰの存在又はレベルの増加は、個体が本開示の抗ＣＤ３９抗体（例えば、限定されないが、基質に結合したＣＤ３９を阻害する抗体）による処置に適している（例えば、この抗ＣＤ３９抗体から利益を得る可能性が高い）ことを示す場合がある。
本開示の抗ＣＤ３９抗体による処置の前又は処置中、アデノシン、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰのレベルを任意選択により患者の腫瘍内で及び／又は患者の腫瘍に隣接して評価し、この患者が抗ＣＤ３９抗体による処置から利益を得ているかどうかも評価し得る。処置（又は抗体の投与）前のレベルと比較した、投与（又は抗体の投与）後の比較されたアデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰのレベルの低下は、個体が本開示の抗ＣＤ３９抗体（例えば、限定されないが、基質に結合したＣＤ３９を阻害する抗体）による処置から利益を得ていることを示す場合がある。任意選択により、患者が抗ＣＤ３９抗体による処置から利益を得ている場合、方法は、この患者に抗ＣＤ３９抗体のさらなる用量を投与することをさらに含み得る（例えば、継続的な処置）。
ある実施形態において、患者の腫瘍内で及び／又は患者の腫瘍に隣接してアデノシン、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰのレベルを評価することは、癌患者由来の組織（例えば、癌組織、癌の近位又周辺の組織、癌隣接組織、隣接非腫瘍組織又は正常隣接組織）からなる群から選択されるヒト組織の生物学的サンプルを患者から得ることと、この組織内のアデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰのレベルを検出することとを含む。患者からのレベルは、このレベルを、例えば健康な個体に対応する参照レベルと比較し得る。
ある実施形態において、本開示は、癌の処置又は予防を、それを必要とする個体において行うための方法であって、
ａ）循環又は腫瘍環境、任意選択的に腫瘍及び／又は隣接組織内において可溶性（細胞外）ＣＤ３９タンパク質及び／又はＣＤ３９発現細胞を検出することと、
ｂ）任意選択により、参照レベル（例えば、健康な個体又は抗ＣＤ３９抗体から実質的な利益を引き出していない個体に対応する）と比較して増加しているレベルにおいて、可溶性（細胞外）ＣＤ３９タンパク質及び／又はＣＤ３９発現細胞が循環又は腫瘍環境中に含まれていると決定すると、この個体に抗ＣＤ３９抗体を投与することと
を含む方法を提供する。ＣＤ３９発現細胞は、腫瘍細胞又は白血球、例えば循環細胞又は腫瘍浸潤細胞、例えばＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞、Ｂ細胞を含み得る。
ある実施形態において、本開示は、癌の処置又は予防を、それを必要とする個体において行うための方法であって、
ａ）この個体が、任意選択により循環、任意選択により腫瘍及び／又は隣接組織において、検出可能な可溶性（細胞外）ＣＤ３９を有するかどうかを評価することと、
ｂ）任意選択により、参照レベル（例えば、健康な個体又は本開示の抗ＣＤ３９抗体から実質的な利益を引き出していない個体に対応する）と比較して増加しているレベルにおいて、可溶性（細胞外）ＣＤ３９タンパク質を検出すると、この個体に本開示の抗ＣＤ３９抗体を投与することと
を含む方法を提供する。
任意選択により、これらの方法の何れかにおいて、腫瘍環境内で可溶性ＣＤ３９タンパク質及び／又はＣＤ３９発現細胞（又はアデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／若しくはＡＭＰ）を検出することは、癌組織及び／又は癌に近位の若しくは周辺の組織（例えば、癌隣接組織、隣接非腫瘍組織又は正常隣接組織）を含む生物学的サンプルを個体から得ることと、ｓＣＤ３９タンパク質、ＣＤ３９発現細胞（又はアデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／若しくはＡＭＰ）のレベルを検出することとを含む。ＣＤ３９発現細胞は、例えば、腫瘍細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞、Ｂ細胞を含み得る。
癌を有する個体は、循環細胞上での又は腫瘍微小環境中の細胞上での（例えば、腫瘍細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞、Ｂ細胞上での）ｓＣＤ３９の存在及び／又はＣＤ３９の発現を評価するための事前検出ステップなしで本抗ＣＤ３９抗体により処置し得る。任意選択により、この処置方法は、個体からの血液からの又は腫瘍の生物学的サンプル（例えば、癌組織、癌の近位又周辺の組織、癌隣接組織、隣接非腫瘍組織又は正常隣接組織）におけるＣＤ３９の核酸又はポリペプチドを検出するステップを含み得る。生物学的サンプルが、ＣＤ３９を発現する細胞を含むという決定（例えば、参照と比較した顕著な発現；高レベルでのＣＤ３９の発現、抗ＣＤ３９抗体による高強度の染色）は、患者が、ＣＤ３９を阻害する薬剤による処置から強い利益を有し得る癌を有することを示す。ある実施形態において、この方法は、生物学的サンプル中におけるＣＤ３９の核酸又はポリペプチドの発現のレベルを決定することと、このレベルを、健康な個体に対応する参照レベルと比較することとを含む。生物学的サンプルが、ｓＣＤ３９タンパク質及び／又は参照レベルと比較して増加したレベルでＣＤ３９の核酸若しくはポリペプチドを発現する細胞を含むという決定は、患者が、本開示の抗ＣＤ３９抗体により有利に処置され得る癌を有することを示す。ある実施形態において、生物学的サンプル中におけるＣＤ３９ポリペプチドを検出することは、可溶性細胞外ＣＤ３９タンパク質を検出することを含む。ある実施形態において、生物学的サンプル中におけるＣＤ３９ポリペプチドを検出することは、悪性細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞、Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ３９ポリペプチドを検出することを含む。ある実施形態において、生物学的サンプルが、ＣＤ３９の核酸又はポリペプチドを顕著に発現する細胞を含むという決定は、患者が本開示の抗ＣＤ３９抗体により有利に処置され得る癌を有することを示す。「顕著に発現される」は、ＣＤ３９ポリペプチドに言及する場合、ＣＤ３９ポリペプチドが、所与の患者から採取した相当な数の細胞中で発現されることを意味する。用語「顕著に発現される」の定義は、正確なパーセンテージ値に拘束されないが、いくつかの例では、「顕著に発現される」と言われている受容体は、患者から採取した腫瘍細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又はより多くで存在するであろう。
個体が、ＣＤ３９ポリペプチドを発現する細胞によって特徴付けられる癌を有するかどうかを決定することは、例えば、癌環境（例えば、腫瘍又は腫瘍隣接組織）からの細胞を含む個体から生物学的サンプルを（例えば、生検を実施することにより）得ることと、前記細胞を、ＣＤ３９ポリペプチドに結合する抗体と接触させることと、細胞がその表面上でＣＤ３９を発現するかどうかを検出することとを含み得る。任意選択により、個体が、ＣＤ３９を発現する細胞を有するかどうかを決定することは、免疫組織化学アッセイを実行することを含む。
本抗体組成物は、単剤療法において、又はその抗体が投与されている特定の治療目的のために通常利用される薬剤を含む１つ以上の他の治療剤との併用処置において使用され得る。さらなる治療剤は、通常、処置されている特定の疾患又は状態に対する単剤療法においてその薬剤に対して一般的に使用される量及び治療計画で投与される。このような治療剤としては、抗癌剤及び化学療法剤、例えば腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を生じさせることができる化学療法剤が挙げられるが限定されない。
ある実施形態において、抗ＣＤ３９中和抗体は、ヒトＣＤ１６への結合を欠くが、ＣＤ１６発現エフェクター細胞（例えば、ＮＫ又はエフェクターＴ細胞）の活性を増強する。従って、ある実施形態において、第２の又はさらなる第２の治療薬は、（例えば、ＮＫ細胞によって発現されるＣＤ１６を介して）それが結合している細胞に対してＡＤＣＣを誘導することができる抗体又は他のＦｃドメイン含有タンパク質である。一般的には、このような抗体又は他のタンパク質は、目的の抗原、例えば腫瘍細胞上に存在する抗原（腫瘍抗原）及びＦｃドメイン又はその一部に結合するドメインを含み、Ｆｃドメインを介した抗原結合ドメイン及びＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６）への結合を示す。ある実施形態において、そのＡＤＣＣ活性は、少なくとも部分的にＣＤ１６によって媒介される。ある実施形態において、さらなる治療薬は、天然又は改変ヒトＦｃドメイン、例えばヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３抗体由来のＦｃドメインを有する抗体である。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」又は「ＡＤＣＣ」という用語は、当技術分野で十分に理解されている用語であり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する非特異的細胞傷害性細胞には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球及び好酸球が含まれる。「ＡＤＣＣ誘導抗体」という用語は、当業者に公知のアッセイによって測定されるＡＤＣＣを示す抗体を指す。そのような活性は、典型的には、Ｆｃ領域の様々なＦｃＲとの結合によって特徴付けられる。いかなる特定の機構によっても限定されるものではないが、当業者は、抗体がＡＤＣＣを示す能力が、例えば、そのサブクラス（ＩｇＧ１又はＩｇＧ３など）による、Ｆｃ領域に導入された突然変異によるか又は抗体のＦｃ領域における糖パターンの改変によるものであり得ることを認識するであろう。ＡＤＣＣを誘発する抗体の例には、リツキシマブ（リンパ腫、ＣＬＬの処置用、トラスツズマブ（乳癌の処置用）、アレムツズマブ（慢性リンパ球性白血病の処置用）及びセツキシマブ（結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌の処置用）が挙げられる。ＡＤＣＣ増強抗体の例としては、ＧＡ－１０１（低フコシル化抗ＣＤ２０）、ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｆｃ増強抗ＨＥＲ２）、メポリズマブ、ＭＥＤＩ－５５１（Ｆｃ操作抗ＣＤ１９）、オビヌツズマブ（糖操作／低フコシル化抗ＣＤ２０）、オカラツズマブ（Ｆｃ操作抗ＣＤ２０）、ＸｍＡｂ（登録商標）５５７４／ＭＯＲ２０８（Ｆｃ操作抗ＣＤ１９）が挙げられるが限定されない。
ある実施形態において、抗ＣＤ３９中和抗体は、ヒトＰＤ－１の阻害活性（例えば、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する）を中和する薬剤の有効性を、とりわけヒトＰＤ－１の阻害活性を中和する薬剤による処置に対する応答が弱い（又は敏感でない）個人において増強する。従って、ある実施形態において、第２の又はさらなる第２の治療剤は、ヒトＰＤ－１の阻害活性を中和する抗体又は他の薬剤である。
プログラム死１（ＰＤ－１）（「プログラム細胞死１」とも呼ばれる）は、ＣＤ２８ファミリの受容体の阻害性メンバーである。完全なヒトＰＤ－１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ６４８６３に見出すことができる。ＰＤ－１の阻害活性の阻害又は中和は、ＰＤ－Ｌ１誘導ＰＤ－１シグナル伝達を妨げるポリペプチド剤（例えば、抗体、Ｆｃドメインに融合したポリペプチド、イムノアドヘシンなど）の使用を含み得る。現在、市販又は臨床評価中のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を阻止する少なくとも６つの薬剤が存在する。１つの薬剤は、ＢＭＳ－９３６５５８（ニボルマブ／ＯＮＯ－４５３８、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、以前はＭＤＸ－１１０６）である。ニボルマブ（商品名Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））は、ＰＤ－１及びＣＤ８０の両方へのＰＤ－Ｌ１リガンドの結合を阻害するＦＤＡ認可完全ヒトＩｇＧ４抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂであり、国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットにおいて抗体５Ｃ４として記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。メラノーマ患者では、３ｍｇ／ｋｇの用量で最も有意なＯＲが観察されたが、他の癌のタイプでは１０ｍｇ／ｋｇであった。ニボルマブは、一般に癌の進行まで３週間毎に１０ｍｇ／ｋｇで投与される。「ヒトＰＤ－１の阻害活性を低下させる」、「ＰＤ－１を中和する」又は「ヒトＰＤ－１の阻害活性を中和する」という用語と、ＰＤ－１が、ＰＤ－１と、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２などの１つ以上のその結合パートナーとの間の相互作用から生じるシグナル伝達能力において阻害される過程を指す。ＰＤ－１の阻害活性を中和する薬剤は、ＰＤ－１と、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２などのその結合パートナーの１つ以上との間の相互作用に起因するシグナル伝達を減少、阻止、阻害又は抑制する。従って、このような薬剤は、増殖、サイトカイン産生及び／又は細胞傷害性などのＴ細胞エフェクター機能を増強するように、Ｔリンパ球上に発現される細胞表面タンパク質によって媒介されるか又はそれを介した負の共刺激シグナルを減少させることができる。
ランブロリズマブ又はペンブロリズマブ（商品名Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標））とも呼ばれるＭＫ－３４７５（Ｍｅｒｃｋ社製ヒトＩｇＧ４抗ＰＤ１ｍＡｂ）は、メラノーマの治療のためにＦＤＡによって承認され、他の癌において試験されている。ペンブロリズマブは、疾患の進行まで２週間又は３週間毎に２ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇで試験した。Ｍｅｒｃｋ３７４５又はＳＣＨ－９００４７５としても知られているＭＫ－３４７５は、国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットにも記載されている。
ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ７４４６（アテゾリズマブ、商品名Ｔｅｃｅｎｔｒｉｇ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社製抗ＰＤ－Ｌ１）は、ＦｃγＲ結合及びその結果としての抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を最小限に抑えることによって効力及び安全性を最適化するように設計された、操作されたＦｃドメインを含むヒト抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂである。１、１０、１５及び２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量のＭＰＤＬ３２８０Ａを３週間毎に最高１年間投与した。第３相試験では、ＭＰＤＬ３２８０ＡをＮＳＣＬＣにおいて３週間毎に静脈内注入により１２００ｍｇで投与する。
ＡＭＰ－２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ及びＧＳＫ）は、Ｆｃドメインに融合したＰＤ－Ｌ２細胞外ドメインを含むイムノアドヘシンである。ＰＤ－１を中和する薬剤の他の例は、ＰＤ－Ｌ２に結合する抗体（抗ＰＤ－Ｌ２抗体）を含み得、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を阻止する。
ピディリズマブ（ＣＴ－０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）（ＣｕｒｅＴｅｃｈ／Ｔｅｖａ社製ヒト化ＩｇＧ１抗ＰＤ１ｍＡｂ）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１； ＣｕｒｅＴｅｃｈ）（例えば、国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットを参照されたい）は別の例である。薬剤はリツキシマブ感受性再発性ＦＬを有する３０人の患者において試験され、患者は、４週間毎の３ｍｇ／ｋｇでの静脈内ＣＴ－０１１の４回にわたる注入に、ＣＴ－０１１の最初の注入の２週間後に始まって毎週３７５ｍｇ／ｍ２で４週間にわたり投与されるリツキシマブを組み合わせて処置された。
さらなる公知のＰＤ－１抗体及び他のＰＤ－１阻害剤としては、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫにライセンスされたＢ７－ＤＣ／ＩｇＧ１融合タンパク質）、国際公開第２０１２／１４５４９３号パンフレットに記載のＡＭＰ－５１４、国際公開第２０１１／０６６３８９号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１３／０３４５５９号明細書に記載の抗体ＭＥＤＩ－４７３６（デュルバルマブ、商品名Ｉｍｆｉｎｚｉ（商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅにより開発された抗ＰＤ－Ｌ１）、国際公開第２０１０／０７７６３４号パンフレットに記載の抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（抗ＰＤ－Ｌ１）、ＢＭＳ－９３６５５９としても知られているＭＤＸ－１１０５は、国際公開第２００７／００５８７４号パンフレットに記載のＢｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂにより開発された抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレット、国際公開第２００９／０１４７０８号パンフレット、国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレット及び国際公開第２０１３／０１９９０６号パンフレットに記載の抗体及び阻害剤が挙げられ、これらの開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。抗ＰＤ１抗体のさらなる例は、国際公開第２０１５／０８５８４７号パンフレット（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）に開示されており、例えばそれぞれ配列番号６、配列番号７及び／又は配列番号８の軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、２及び３並びにそれぞれ配列番号３、配列番号４又は配列番号５の抗体重鎖可変ドメインＣＤＲ１、２及び３を有する抗体であり、配列番号は国際公開第２０１５／０８５８４７号パンフレットに従った付番であり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１への結合についてこれらの抗体の何れかと競合する抗体も使用することができる。代表的な抗ＰＤ－１抗体は、ペンブロリズマブ（Ｍｅｒｋ＆Ｃｏ．によってＫｅｙｔｒｕｄａ（商標）として販売）である（参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットも参照されたい）。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－１中和剤は、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害する抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂである。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１中和剤は、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を阻害する抗ＰＤ１ｍＡｂである。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１中和剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の細胞外又はＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシンである。
処置方法において、ＣＤ３９結合化合物及び第２の治療剤は、個別に、一緒に、又は連続して、又はカクテルにして投与し得る。いくつかの実施形態において、本抗原結合化合物は、第２の治療剤の投与前に投与される。例えば、ＣＤ３９結合化合物は、第２の治療剤の投与のおよそ０～３０日前に投与し得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ３９結合化合物は、第２の治療剤の投与の、約３０分～約２週間、約３０分～約１週間、約１時間～約２時間、約２時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～１日又は約１～５日前に投与する。いくつかの実施形態において、ＣＤ３９結合化合物は、治療剤の投与と同時に投与する。いくつかの実施形態において、ＣＤ３９結合化合物は、第２の治療剤の投与後に投与する。例えば、ＣＤ３９結合化合物は、第２の治療剤の投与からおよそ０～３０日後に投与し得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ３９結合化合物は、第２の治療剤の投与から、約３０分～約２週間、約３０分～約１週間、約１時間～約２時間、約２時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～１日又は約１～５日後に投与する。
方法
ＣＤ３９突然変異体の生成
ＣＤ３９突然変異体をＰＣＲにより生成した。増幅した配列をアガロースゲル上で泳動させ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（リファレンス７４０６０９）を使用して精製した。次いで、各突然変異体に関して生成した精製済ＰＣＲ産物をＣｌｏｎＴｅｃｈ ＩｎＦｕｓｉｏｎシステムにより発現ベクターに連結した。突然変異した配列を含むベクターをＭｉｎｉｐｒｅｐとして調製し、次いで配列決定した。配列決定後、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、突然変異した配列を含むベクターをＭｉｄｉｐｒｅｐとして調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用してベクターを遺伝子移入し、４８時間にわたりＣＯ２インキュベータ中で３７℃においてインキュベートした後、導入遺伝子の発現に関して試験した。下記の表に示すように、突然変異体をＨｅｋ－２９３Ｔ細胞に遺伝子移入した。下記の表１において標的となるアミノ酸突然変異を、配列番号１のナンバリングを使用して示す。
Figure 0007308150000018
可溶性ｈｕＣＤ３９のクローニング、産生及び精製
分子生物学
下記のプライマー：ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＡＣＡＡＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号４２）（フォワード）、及び
Figure 0007308150000019
 （リバース）を使用して、ヒトＰＢＭＣ ｃＤＮＡからｈｕＣＤ３９タンパク質をクローニングした。次いで、精製済ＰＣＲ産物を、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングシステムを使用して発現ベクター中にクローニングした。精製ステップのためにタンパク質のＣ末端部分中にＭ２タグ（ＦＬＡＧタグ、配列番号４５において下線を引いた）を追加しており、（例えば、配列番号４５の）ＣＤ３９細胞外ドメインタンパク質は、何れの実施形態においても、Ｍ２タグを欠くように任意選択により指定され得ることが認識されるであろう。
ｈｕＣＤ３９タンパク質の発現及び精製
クローニングした配列の検証後、ＣＨＯ細胞をヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ）し、次いで産生プールをサブクローニングして、ｈｕＣＤ３９タンパク質を産生する細胞クローンを得た。ローラー中で増殖したｈｕＣＤ３９クローンから上清を回収し、Ｍ２クロマトグラフィーカラムを使用して精製し、Ｍ２ペプチドを使用して溶出させた。次いで、精製済タンパク質をＳ２００サイズ排除クロマトグラフィーカラム上にロードした。単量体に相当する精製済タンパク質をＴＢＳ ＰＨ７．５緩衝液で製剤化した。Ｍ２タグを有しないＣＤ３９－Ｍ２細胞外ドメイン組換えタンパク質のアミノ酸配列は、下記のとおりであった。
Figure 0007308150000020
Ｍ２タグを有するＣＤ３９－Ｍ２細胞外ドメイン組換えタンパク質の最終アミノ酸配列は、下記のとおりであった。
Figure 0007308150000021
可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害
産生された可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を、存在するＡＴＰの量に比例して発光シグナルを生じる試薬の使用によりＡＴＰ加水分解の評価を可能にするＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、リファレンスＧ７５７１）を使用して評価した。この方法では、可溶性ＣＤ３９により媒介されるＡＴＰ加水分解の阻害を評価し得る。簡潔に説明すると、１００μｇ／ｍｌ～６×１０－３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３９抗体の用量範囲を３７℃で１時間にわたり、方法セクションで説明したアミノ酸配列（配列番号４５）を有する４００ｎｇ／ｍｌの可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質と共にインキュベートした。このプレートに３７℃でさらに３０分にわたり２０μＭのＡＴＰを添加した後、ＣＴＧ（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ）試薬を添加した。暗所での５分間の短いインキュベーション期間後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）ルミノメーターを使用して放射光を定量した。抗体の存在下での放射光と、ＡＴＰのみ（最大光放射）並びにＡＴＰ及び可溶性ＣＤ３９タンパク質（最小光放射）との比較により、抗ＣＤ３９抗体の効力を決定した。
細胞性ＣＤ３９の酵素活性の阻害
抗体による、ＣＤ３９を発現する細胞におけるＣＤ３９酵素活性の阻害を、存在するＡＴＰの量に比例して発光シグナルを生じる試薬の使用によりＡＴＰ加水分解の評価を可能にするＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、リファレンスＧ７５７１）を使用して評価した。そのため、このアッセイを、細胞培養上清中においてＣＤ３９により加水分解されるＡＴＰの阻害の評価を可能にするように設計した。簡潔に説明すると、５×１０４個のＲａｍｏｓヒトリンパ腫細胞、５×１０３個の、ヒトＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞、カニクイザルＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞及びマウスＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞を、３０μｇ／ｍｌ～５×１０－４μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３９抗体と共に３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を３７℃でさらに１時間にわたり２０μＭのＡＴＰと共にインキュベートした。プレートを４００ｇで２分にわたり遠心分離し、細胞上清５０μｌを発光マイクロプレート（白色ウェル）に移す。この上清にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（ＣＴＧ）５０μｌを添加し、暗所での５分間のインキュベーション後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）ルミノメーターを使用して放射光を定量した。抗体の存在下での放射光と、ＡＴＰのみ（最大光放射）並びにＡＴＰ及び細胞（最小光放射）との比較により、抗ＣＤ３９抗体の効力を決定した。
抗体の生成：マウスにおける免疫付与及びスクリーニング
抗ヒトＣＤ３９抗体を得るために、上記で説明した組換えヒトＣＤ３９－Ｍ２細胞外ドメイン組換えタンパク質によりＢａｌｂ／ｃマウスに免疫付与した。マウスに、腹腔内で、ＣＤ３９タンパク質５０μｇ及びＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔの乳濁液による１回の１回目の免疫付与を行い、腹腔内でＣＤ３９タンパク質５０μｇ及びＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔの乳濁液による２回目の免疫付与を行い、最後に静脈内でＣＤ３９タンパク質１０μｇによる追加免疫を行った。免疫脾臓細胞を追加免疫の３日後にＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞と融合させ、放射線照射した脾臓細胞の存在下で培養した。ハイブリドーマを半固体メチルセルロース含有培地に播種し、増殖中のクローンを、ｃｌｏｎｅｐｉｘ ２装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して採取した。
実施例１：既知の中和ＣＤ３９ ｍＡｂのエピトープマッピング
抗体がどのように細胞性ＣＤ３９の酵素（ＡＴＰアーゼ）活性を阻害することができるかについての洞察を得るために、本発明者らは、細胞アッセイにおいてＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害することが報告されている抗体（国際公開第２００９／０９５４７８号パンフレットで開示されたＢＹ４０）が結合するエピトープを調べた。
抗ＣＤ３９抗体のエピトープを定義するために、本発明者らは、ＣＤ３９の表面上に分子表面で露出したアミノ酸の置換により定義されるＣＤ３９突然変異体を設計した。配列番号１のナンバリングを使用して表１に示す突然変異体をＨｅｋ－２９３Ｔ細胞に遺伝子移入した。
Ｉ－３９４の用量範囲（１０～２．５～０．６２５～０．１５６３～０．０３９１～０．００９８～０．００２４～０．０００６μｇ／ｍｌ）を、フローサイトメトリーにより、２０種の生成した突然変異体で試験する。ＢＹ４０抗体は、両方ともＣＤ３９の突然変異体５を発現する細胞への結合が完全に喪失していたが、あらゆる他の突然変異体への結合を喪失していなかった。突然変異体５は、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７でアミノ酸置換を含む。ＣＤ３９の表面上での突然変異体５の位置を図３Ａに示す。
実施例２：既知の中和ＣＤ３９ ｍＡｂは、組換え可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を阻害することができない
細胞アッセイにおいてＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害することが報告されている２種の抗体（ＢＹ４０及びＢＹ１２）を、組換え可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を阻害することができるかどうかを決定するために評価した。上記で説明したように産生された可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、リファレンスＧ７５７１）を使用して評価した。細胞性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を上記で示したように評価した。
予想したように、ＢＹ４０は、細胞中においてＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を阻害した。しかしながら、ＢＹ４０は、可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害することができなかった。図２Ｂは、ＢＹ４０と、本明細書で特定された新規の抗体との比較を示す。
実施例３：ｓＣＤ３９の活性をブロックするための新規のｍＡｂのスクリーニング
ｓＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を中和する抗体を探すために一連の免疫付与を実行した。抗ヒトＣＤ３９抗体を得るために、上記で説明した組換えヒトＣＤ３９－Ｍ２細胞外ドメイン組換えタンパク質で動物に免疫付与した。様々なプロトコルを使用して及び様々な動物において、合計で１５の系列の免疫付与を実行した。含まれているのは、様々なマウス株、ラット及びウサギであった。
最初の免疫付与プロトコルでは、一次スクリーニングは、野生型ＣＨＯ細胞系及びｈｕＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞系を使用するフローサイトメトリーによる増殖中のクローンの上清（ＳＮ）の試験を含んだ。細胞をそれぞれ０．１μＭ及び０．００５μＭのＣＦＳＥで染色した。フリーサイトメトリースクリーニングのために、全ての細胞を同程度に混合し、ＡＰＣで標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）により、上清中における反応性抗体の存在が明らかになった。次いで、ｈｕＣＤ３９に結合した抗体に関して、開発して上記（方法）で説明したスクリーニングアッセイを使用して、可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害に関して上清をスクリーニングした。
結果は、多数の特異的ＣＤ３９結合抗体を得ることができるが、これらの免疫付与の何れからの抗体も可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害を全く示さないことを示した。１つの可能性は、ＣＤ３９上の優性エピトープが、ＣＤ３９の触媒部位に又はこの触媒部位の付近に適切に配置されたエピトープを含まないことである。細胞性ＣＤ３９を阻害する利用可能な抗体の少なさと、抗体を使用した酵素の触媒部位の阻害における既知の困難さとを考慮すると、ｓＣＤ３９を中和する抗体の非存在は、可溶性（細胞外ドメイン）ＣＤ３９を阻害する抗体を得ることができないことを示す可能性がある。他の可能性は、機能しないスクリーニングアッセイ及び／又は不適切に折りたたまれた若しくは機能する可溶性ＣＤ３９タンパク質に関し、なぜなら、特に可溶性ＣＤ３９を阻害し得る抗体の欠如により、ｓＣＤ３９遮断アッセイの検証が妨げられるからである。
可溶性ＣＤ３９を阻害し得る抗体の非存在を考慮して、抗体ＢＹ４０のエピトープにより特定されるようにＣＤ３９の活性部位に結合する抗体の生成を促進するように設計されたスクリーニングプロトコルにより、さらなる免疫付与を実行した。簡潔に説明すると、一次スクリーニングは、上述の免疫付与と同様に野生型ＣＨＯ細胞系及びｈｕＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞系を使用するフローサイトメトリーによる増殖中のクローンの上清（ＳＮ）の試験、これに続く、野生型ＣＤ３９と比較して表１に示すＣＤ３９突然変異体５を発現するＨｅｋ－２９３Ｔ細胞への結合の喪失に関するスクリーニングを含んだ。突然変異体５は、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７で置換を有する。しかしながら、再び結果は、突然変異体５への結合の喪失を示す多数の特異的ＣＤ３９結合抗体を得ることができるが、最初の免疫付与の何れからの抗体も可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害を全く示さないことを示した。
実施例４：エピトープ特異的スクリーニングの一部としての、ｓＣＤ３９活性を阻害する一次抗体の特定
本発明者らは、ＢＹ４０様抗体と競合しない抗体を有するために、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７領域（突然変異体５により定義される）に結合しない抗ＣＤ３９抗体を特定しようとした。ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性をブロックする能力を必要としないそのような抗体は、例えば、細胞性ＣＤ３９を阻害するＢＹ４０抗体又はＢＹ４０様抗体の存在下で細胞上の遊離ＣＤ３９タンパク質を検出して定量するための、ＢＹ４０結合部位に結合する細胞性ＣＤ３９を阻害する抗体の薬理学的研究に有用であり得る。
ＣＤ３９突然変異体５への結合の喪失に関してハイブリドーマをスクリーニングした実施例３の免疫付与の結果から出発して、ＣＤ３９突然変異体５への結合の喪失を示すものの中の１つではないハイブリドーマを選択した。このハイブリドーマ（Ｉ－３９４）は、おそらく突然変異体５への結合の部分的減少に起因するより広いプールの中の１つであったが、突然変異体５への結合を喪失せず、従って最初に保持されなかった。
可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害のためのさらなる免疫付与からの上清の継続的なスクリーニングに関連して、クローン化して産生した抗体Ｉ－３９４を対照として含めた。驚くべきことに、抗体Ｉ－３９４は、エピトープ特異的スクリーニングで保持されるクローンの中の１つでないにもかかわらず、この抗体は、上記（方法）で説明したアッセイにおいて可溶性ＣＤ３９の酵素活性の強い阻害を示した。
Ｎ結合型グリコシル化の欠如及びヒトＦｃγ受容体ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ６４への結合の欠如をもたらす突然変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）を有するＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有するヒト定常領域を有するように改変されたＩ－３９４を産生させた。簡潔に説明すると、Ｉ－３９４抗体のＶＨ配列及びＶｋ配列（それぞれ配列番号６及び配列番号７に示すＶＨ可変領域及びＶｋ可変領域）を、上述の突然変異及びｈｕＣｋ定常ドメインをそれぞれ有するｈｕＩｇＧ１定常ドメインを含む発現ベクターにクローニングした。これら２種の得られたベクターをＣＨＯ細胞系に共遺伝子移入した。細胞の確立されたプールを使用して、ＣＨＯ培地中で抗体を産生させた。次いで、この抗体を、プロテインＡを使用して精製した。Ｉ－３９４のぞれぞれの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を下記に示す（Ｋａｂａｔ ＣＤＲに下線を引いている）。
Ｉ－３９４重鎖可変ドメイン配列：
Figure 0007308150000022
 Ｉ－３９４軽鎖可変ドメイン配列：
Figure 0007308150000023
次いで、抗体Ｉ－３９４を、ＣＤ３９の表面上に分子表面で露出したアミノ酸の置換により定義されるＣＤ３９突然変異体への結合の喪失に関して試験した。配列番号１のナンバリングを使用して表１に示す突然変異体をＨｅｋ－２９３Ｔ細胞に遺伝子移入した。抗体Ｉ－３９４の用量範囲をフローサイトメトリーによって２０種の突然変異体で試験した。図３Ｂに示すように、Ｉ－３９４は、ＣＤ３９の突然変異体１９を発現する細胞への結合の完全な喪失を示した。突然変異体１９は、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２で置換を含む。そのため、Ｉ－３９４のコアエピトープは、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２の１つ又は複数（又は全て）を含む。
突然変異体５への結合を喪失し、且つ細胞性ＣＤ３９を阻害する能力を有するが可溶性ＣＤ３９を阻害する能力を有しない先行の抗体ＢＹ４０と異なり、抗体Ｉ－３９４は、隣接する突然変異体１９への結合を喪失し、突然変異体５への結合が強く減少する（しかし、いくつかの残基は、突然変異体５に結合する）。興味深いことに、突然変異体１９の残基は、残基５のものに近接しているか又は隣接しており、その結果、Ｉ－３９４は、ＢＹ４０と比較してエピトープのシフトを表す可能性がある。そのため、抗体Ｉ－３９４は、可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の阻害を可能にする抗ＣＤ３９抗体に関する有用な新規のエピトープを提示する。同様に、可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を中和するさらなる抗体を検出するためのスクリーニングアッセイの検証及び試験を可能とする特異的陽性対照も提供される。
実施例５：ｓＣＤ３９中和ｍＡｂに関する非エピトープ特異的スクリーニング
可溶性ＣＤ３９の抗体により媒介される阻害が可能であることを示す実施例４の結果に基づいて、ｓＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を中和する抗体を探すために、実施例３と異なるプロトコルを使用する異なる免疫付与からの融合を再検討した。
次いで、ＡＴＰアーゼ阻害に関するスクリーニングのための様々なアプローチを評価した。一実験では、Ｉ－３９４抗体を使用して、可溶性ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害する能力が陰性であることが分かった実施例３の免疫付与のハイブリドーマから上清をスパイクした。上清へのＩ－３９４のこの添加により、ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害する陰性上清の能力は、回復しなかった。次いで、抗体Ｉ－３９４を、プロテインＡ被覆ビーズを使用して陰性上清から精製し、本発明者らは、精製されたＩ－３９４が再びＡＴＰ活性を阻害し得ることを観察した。
上述の結果を考慮して、可溶性ＣＤ３９又は細胞性ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性の阻害を評価することなく、且つエピトープに関するスクリーニングバイアスなしに、野生型ＣＨＯ細胞系及びｈｕＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞系を使用するフローサイトメトリーにより、新たな免疫付与及び過去の免疫付与からの増殖クローンをスクリーニングする新たな免疫付与及びスクリーニングのプロトコルを開発した。突然変異体５又は突然変異体１９への結合の喪失に関するデータが一部のハイブリドーマに関して利用可能であったが、そのようなデータをクローン選択に使用せず、ＡＴＰアーゼブロッキングアッセイにおいて陰性結果の場合にクローニングのためにハイブリドーマを救出する目的で保持するのみであった。ＣＤ３９に結合するハイブリドーマを選択してクローニングし、次いで下記のプロトコルに従ってプロテインＡを使用して精製した：
－ ハイブリドーマ上清３００μｌにプロテインＡビーズ１０μｌを添加する
－ 最終濃度が１，５μＭとなるようにＮａＣｌを添加する
－ ４℃で３～４時間にわたりチューブを回転させる
－ １５００ｒｐｍで１分間遠心分離する
－ 上清を除去し、ＴＢＳ １ｍｌによる３回の洗浄を実施する
－ ３回目の洗浄後にＴＢＳを全て除去する
－ クエン酸塩０，１Ｍ ｐＨ３ ５０μｌを添加し、ホモジナイズし、次いで５分にわたりＲＴでインキュベートする
－ １５００ｒｐｍで１分にわたりビーズを遠心分離する
－ 溶出液５０μｌを回収し、ＴＢＳ ４５０μｌを速やかに添加し、次いで４℃で貯蔵する。
次いで、得られた抗体を、Ｉ－３９４と同程度までＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害する能力に関して比較アッセイでスクリーニングした。可溶性ＣＤ３９及び細胞性ＣＤ３９の酵素活性の阻害に使用するアッセイは、上記（方法）で説明したとおりであった。驚くべきことに、この方法で製造した例示的抗体のいくつかは、可溶性ＣＤ３９の阻害（及び細胞性ＣＤ３９の阻害）を示した。図１は、代表的なスクリーニング結果を示し、陽性対照Ｉ－３９４抗体と比較して抗体Ｉ－３９７、Ｉ－３９８及びＩ－３９９を示す。同様に、異なる免疫付与からの抗体Ｉ－３９５及びＩ－３９６は、可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害した。図２Ａ及び図２Ｂは、抗体Ｉ－３９５及びＩ－３９６の結果を示しており、より多くの抗体が可溶性ＣＤ３９中和及び細胞性ＣＤ３９中和の両方の追加実験に利用可能であった。図２Ａは、抗体Ｉ－３９５及びＩ－３９６が、両方ともＢＹ４０抗体及びＩ－３９４抗体と比較して細胞膜結合型ＣＤ３９を阻害し、Ｉ－３９４及びＩ－３９５が、両方ともＢＹ４０と比較して大きい効力及び細胞性ＣＤ３９の最大阻害を示すことを示す。図２Ｂは、抗体Ｉ－３９５及びＩ－３９６が、両方ともＢＹ４０抗体及びＩ－３９４抗体と比較して可溶性ＣＤ３９を阻害することを示す。ＢＹ４０は、いかなる濃度でも可溶性ＣＤ３９を阻害しないが、Ｉ－３９４、Ｉ－３９５及びＩ－３９６は、全て可溶性ＣＤ３９を阻害し、Ｉ－３９４が最大の効力を示し、続いてＩ－３９５がより低い効力を示し、次いでＩ－３９６がより低い効力を示す。
得られた結果は、ハイブリドーマ上清中の因子が、細胞培養と可溶性ＣＤ３９アッセイとの両方でＡＴＰを迅速に加水分解する可能性を高め、その結果、従来の方法を使用した抗体のスクリーニングではＡＴＰに関するシグナルが検出されない。可溶性因子は、ＣＤ３９又は例えば融合パートナーにより産生されるいくつかの他の酵素であり得る。
次いで、Ｉ－３９４に関して本明細書で示したのと同一の方法において、Ｎ結合型グリコシル化の欠如及びヒトＦｃγ受容体ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ６４への結合の欠如をもたらす突然変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）を有するＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有するヒト定常領域を有するように改変された抗体をクローニングした。次に、得られた抗体を滴定にかけ、次いで効力に従って抗体をランク付けするためにＥＣ５０及びＩＣ５０の決定を評価するために、実施例７～９（滴定、ＡＴＰアーゼ活性の阻害）に示すようにより詳細な活性評価にかけることができる。
実施例６：ｓＣＤ３９中和ｍＡｂのエピトープマッピング
実施例４で示すように、Ｉ－３９４は、ＣＤ３９の突然変異体１９を発現する細胞への結合の完全な喪失を示したが、突然変異体５への結合を喪失していなかった。実施例５のさらなる抗ＣＤ３９抗体のエピトープを定義するために、これらを、実施例１及び表１で説明されているＣＤ３９突然変異体のパネルへの結合の喪失に関して試験した。配列番号１のナンバリングを使用して表１に示す突然変異体をＨｅｋ－２９３Ｔ細胞に遺伝子移入した。試験抗体の用量範囲（１０～２．５～０．６２５～０．１５６３～０．０３９１～０．００９８～０．００２４～０．０００６μｇ／ｍｌ）を、フローサイトメトリーにより、２０種の生成された突然変異体で試験する。
結果は、可溶性ＣＤ３９を阻害する能力に関して実施例５で選択された抗体がいくつかの異なるエピトープを表すことを示した。実施例５において可溶性細胞外ＣＤ３９の阻害を示した抗体のうち、抗体Ｉ－３９５は、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７で置換を有する突然変異体５への結合の喪失を示し、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２で置換を有する突然変異体１９への結合の装置も示した抗体の一例である。突然変異体１９は、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２で置換を含む。そのため、Ｉ－３９５のＣＤ３９上のコアエピトープは、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７の１つ、２つ、３つ又は４つと、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２の１つ、２つ又は３つとを含む。
一方、抗体Ｉ－３９８は、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２で置換を有する突然変異体１９への結合の喪失を示したが、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７で置換を有する突然変異体５への結合が減少していないか又は喪失していない抗体の一例である。
実施例５において可溶性細胞外ＣＤ３９の阻害を示した他の抗体は、非常に異なるエピトープを有し、且つ突然変異体５又は突然変異体１９の何れかへの結合の喪失を示さず、これは、可溶性ＣＤ３９がｓＣＤ３９上の他の部位への結合によっても阻害され得ることを示唆する。一部の抗体の場合、表１の２０種の突然変異体の１つへの結合の喪失により、ＣＤ３９上の結合部位の位置特定が可能となり、他の場合、結合部位は、依然として決定されておらず、なぜなら、２０種の突然変異体の何れに対しても結合が喪失されなかったからである。実施例５において可溶性ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性の阻害を示す抗体のうち、抗体Ｉ－３９６は、他の２０種の突然変異体の何れに対しても結合を喪失することなく、置換Ｋ８７Ａ、Ｅ１００Ａ及びＤ１０７Ａを有する突然変異体１５への結合の喪失を示した。そのため、この抗体のＣＤ３９上のコアエピトープは、残基Ｋ８７、Ｅ１００及びＤ１０７の１つ又は複数（又は全て）を含む。抗体Ｉ－３９９は、他の２０種の突然変異抗体の何れに対しても結合を喪失することなく、置換Ｎ３７１Ｋ、Ｌ３７２Ｋ、Ｅ３７５Ａ、Ｋ３７６Ｇ、Ｖ３７７Ａを有し、且つＫ３７６とＶ３７７との間にバリンの挿入（表１では「挿入３７７Ｖ」と称される）を有する突然変異体１１への結合の喪失を示した。そのため、この抗体のＣＤ３９上のコアエピトープは、残基Ｎ３７１、Ｌ３７２、Ｅ３７５、Ｋ３７６及びＶ３７７の１つ又は複数（又は全て）を含む。図３Ａは、ＣＤ３９タンパク質の表面上の突然変異体５（Ｍ５）、突然変異体１５（Ｍ１５）及び突然変異体１９（Ｍ１９）中で突然変異した残基の位置を示す。図３Ｂは、様々な抗体に関する突然変異体５、突然変異体１５及び突然変異体１９への結合の結果を示す。
そのため、この結果は、可溶性ＣＤ３９を阻害する抗体を様々なエピトープに対して得ることができることを示す。これらのエピトープとして下記が挙げられる：細胞性ＣＤ３９のみを阻害し可溶性ＣＤ３９を阻害しない（突然変異体５への結合を喪失している）ＢＹ４０抗体又はＢＹ４０様抗体の結合部位に隣接して位置する突然変異体１９の１個又は複数の残基により定義されるエピトープ、突然変異体１９の１個又は複数の残基により定義されるが、突然変異体５によっても部分的に定義されるエピトープ（ＢＹ４０抗体又はＢＹ４０様抗体と比較して小さいシフトを示す可能性がある）、突然変異体１９の１個又は複数の残基により定義され、且つ突然変異体５の残基により定義されないエピトープ並びに他のエピトープ、例えば突然変異体１１の１個若しくは複数の残基又は突然変異体１５の１個若しくは複数の残基により定義されるか、又は突然変異体５、突然変異体１５若しくは当然変異体１９の何れかへの結合が全く減少していない他の抗体によりさらに定義されるもの（エピトープの位置特定が依然として決定されていない）。
実施例７：フローサイトメトリーによる、ＣＤ３９発現細胞に対する抗体滴定
抗体Ｉ－３９４を、ヒトＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞、カニクイザル（マカカ・ファスキクラリス（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞、マウスＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞及びヒトＲａｍｏｓリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ（商標）、リファレンスＣＲＬ－１５９６）への結合に関して２回の反復実験で試験した。細胞を４℃で３０分にわたり３０μｇ／ｍｌ～５×１０－４μｇ／ｍｌの様々な濃度の非標識抗ＣＤ３９と共にインキュベートした。洗浄後、４℃で３０分にわたり細胞をヤギ抗マウスＨ＋Ｌ標識二次抗体と共にインキュベートした。
結果を図４に示す。抗体Ｉ－３９４は、ヒトＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ－ｈｕＣＤ３９）、カニクイザルＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ－ｃｙＣＤ３９）及びＲａｍｏｓリンパ腫細胞に結合したが、マウスＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ－ｍｏＣＤ３９）に結合しなかった。Ｉ－３９４は、実験の第１のセット及び第２のセットそれぞれにおいて０．１６μｇ／ｍｌ及び０．１９μｇ／ｍｌのＥＣ５０値でＲａｍｏｓ細胞に結合した。いくつかの他の抗ＣＤ３９抗体は、Ｒａｍｏｓ細胞への結合に関して同等のＥＣ５０値を示した。
実施例８：細胞性ＡＴＰアーゼ活性の阻害に関するＩＣ５０の決定
上記（方法）で説明した細胞性ＣＤ３９の酵素活性の阻害に関して使用したアッセイを使用して、ＣＤ３９発現細胞中におけるＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性の抗体Ｉ－３９４による阻害を評価した。
結果を図５に示す。Ｉ－３９４は、腫瘍（Ｒａｍｏｓ）細胞中におけるＣＤ３９酵素活性のブロックで非常に強力であり、試験した全ての他の抗体と比較して効力が高い。Ｉ－３９４は、ヒトＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ－ｈｕＣＤ３９）中及びカニクイザルＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ－ｃｙＣＤ３９）中においてＣＤ３９酵素活性もブロックする。マウスＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ－ｍｏＣＤ３９）を陰性対照として示す。算出したＩＣ５０（５０，０００個のＲａｍｏｓ細胞によって発現されたＣＤ３９の酵素活性の５０％の阻害）は、０．０５μｇ／ｍｌである。達成された最大阻害は、８１．６％である。アイソタイプ対照は、効果がなかった。
実施例９：組換え可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の阻害に関するＩＣ５０の決定
上記（方法）で説明した可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害に関して使用したアッセイを使用して、可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の抗体Ｉ－３９４による阻害を評価した。結果を図６に示す。Ｉ－３９４は、可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害する。比較すると、抗体ＢＹ４０は、可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害しなかった。算出したＩＣ５０は、０．００３μｇ／ｍｌである。達成された最大阻害は、７４．９％である。
実施例１０：ＣＤ３９－Ｌ１アイソフォーム、ＣＤ３９－Ｌ２アイソフォーム、ＣＤ３９－Ｌ３アイソフォーム、ＣＤ３９－Ｌ４アイソフォームに対するＥＬＩＳＡ滴定
抗体Ｉ－３９４を、一晩４℃で５００ｎｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌにおいてＰＢＳ １Ｘで９６ウェルプレートにコーティングした、下記に示すアミノ酸配列を有する組換えヒトＣＤ３９アイソフォーム（Ｒｅｃ－ｈｕＣＤ３９アイソフォーム）への結合に関して試験した。ウェルをＴＢＳ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、ＴＢＳブロッキング緩衝液でＲＴにおいてさらに２時間飽和させた。一次抗体の用量範囲濃度をＲＴで２時間にわたりＴＢＳブロッキング緩衝液中でインキュベートした。ウェルをＴＢＳ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した。二次抗体（ＴＢＳブロッキング緩衝液中のＧＡＭ－ＨＲＰ又はＧＡＨ－ＨＲＰ）をＲＴで１時間にわたりインキュベートし、ＴＭＢで明らかにした。光学密度をＯＤ＝４５０でＥｎｓｐｉｒｅ（商標）により測定した。
クローニングしたｈｕＣＤ３９（血管アイソフォーム）のアミノ酸配列：
ヒトＣＤ３９－Ｌ１（ＮＴＰＤアーゼ２又はＥＮＴＰＤ２としても既知である）：
Figure 0007308150000024
 ヒトＣＤ３９－Ｌ２（ＮＴＰＤアーゼ６又はＥＮＴＰＤ６としても既知である）：
Figure 0007308150000025
 ヒトＣＤ３９－Ｌ３（ＮＴＰＤアーゼ３又はＥＮＴＰＤ３としても既知である）：
Figure 0007308150000026
 ヒトＣＤ３９－Ｌ４（ＮＴＰＤアーゼ５又はＥＮＴＰＤ５としても既知である）：
Figure 0007308150000027
Ｉ－３９４は、ＣＤ３９に結合したが、アイソフォームＣＤ３９－Ｌ１、ＣＤ３９－Ｌ２、ＣＤ３９－Ｌ３又はＣＤ３９－Ｌ４の何れにも結合しなかった。アイソタイプ対照抗体（ＩＣ）は、何れのＣＤ３９分子又はＣＤ３９－Ｌ分子にも結合しなかった。結果を図７に示す。
実施例１１：樹状細胞の活性化
ＡＴＰは、炎症誘発性を有するが、ＡＴＰのＣＤ３９により媒介される異化により、樹状細胞（ＤＣ）活性化を損ない得、次いで腫瘍抗原に対するより広範な適応免疫反応が変化すると考えられる。抗ＣＤ３９抗体を使用するＣＤ３９遮断が、ＡＴＰの存在下での樹状細胞（ＤＣ）活性化のＣＤ３９により媒介される変化を克服し得たかどうかを評価するために、本発明者らは、ＡＴＰの存在下で抗ＣＤ３９抗体と共に単球由来のＤＣ（ｍｏＤＣ）をインキュベートした。
簡潔に説明すると、ヒト単球をヒトの健康な血液から精製し、６日にわたりＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４の存在下でＭｏＤＣに分化させた。次いで、ＭｏＤＣを２４時間にわたりＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ、０．２５～１ｍＭ）の存在下で活性化させ、フローサイトメトリーにより、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＨＬＡ－ＤＲの発現を分析することによりＤＣ活性化を評価した。任意選択により、ＣＤ３９阻害剤：ＡＲＬ６７１６（Ｔｏｃｒｉｓ、２５０μＭ）、ＣＤ７３阻害剤：ＡＰＣＰ（Ｔｏｃｒｉｓ ５０μＭ）、抗ＣＤ３９ブロッキング抗体Ｉ－３９４若しくはＢＹ４０（ＢＹ４０に関して、国際公開第２００９／０９５４７８号パンフレットを参照されたい）又は抗ＣＤ７３ブロッキング抗体の存在下で１時間にわたりＭｏＤＣをプレインキュベートした。ＬＰＳ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、１０ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。ＣＤ４Ｔ細胞活性化へのＡＴＰにより媒介されるＤＣ活性化の生じた効果を評価するために、ＡＴＰにより活性化されたＤＣを洗浄し、次いで５日にわたる混合リンパ球反応（ＭＬＲ）のために同種ＣＤ４Ｔ細胞と共にインキュベートした（比１ ＭｏＤＣ／４ Ｔ細胞）。Ｔ細胞の活性化及び増殖をフローサイトメトリーによるＣＤ２５発現及びＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ希釈により分析した（図８）。
結果を図９、図１０及び図１１に示す。陰性対照（培地）の存在下では、１ｍＭのＡＴＰの存在下でｍｏＤＣの活性化を観察したが、０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭでのＡＴＰではｍｏＤＣの活性化は可能でなかった。活性部位への結合によりＣＤ３９酵素活性を完全にブロックすると考えられるＣＤ３９の化学阻害剤の添加により、０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭのそれぞれでｍｏＤＣ活性化がもたらされる。しかしながら、抗ＣＤ３９抗体（例えば、ＢＹ４０抗体又は抗ＣＤ７３抗体）は、樹状細胞（ＤＣ）のＡＴＰにより誘導される活性化を促進することができず、これは、抗体が、ＡＴＰの異化を回避するのに十分に酵素活性をブロックできないことを示唆する。驚くべきことに、ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を実質的に完全にブロックし、従ってＡＴＰの蓄積を可能にし得る抗ＣＤ３９ブロッキング抗体Ｉ－３９４（図面では、濃度１０μｇ／ｍｌで示す）は、０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭのそれぞれでＨＬＡ－ＤＲ又はＣＤ８３の発現によって評価した場合、ｍｏＤＣ活性化を可能にした（図９及び図１０）。興味深いことに、ＡＴＰの存在下で活性化されたＭｏＤＣは、ＭＬＲアッセイにおいてより良好なＴ細胞の活性化及び増殖を誘導し得た。さらに、抗ＣＤ３９ブロッキング抗体Ｉ－３９４による、ＡＴＰにより媒介されるＭｏＤＣの活性化の増強により、より高いＴ細胞の増殖及び活性化がもたらされた（図１１）。
ＡＴＰの存在下でＣＤ３９阻害剤がＤＣを活性化する能力の評価により、ＣＤ３９の高度な阻害を達成し得る抗ＣＤ３９抗体を特定して評価するための方法が提供される。
ＤＣへのＣＤ３９によりもたらされる免疫抑制効果を緩和するための抗ＣＤ３９抗体の使用の可能性により、（特に腫瘍細胞上の）抗原に対する適応免疫反応の増強がもたらされ得る。さらに、そのような抗ＣＤ３９抗体は、化学療法剤の免疫原性効果を増強するために使用される場合、特に興味深い場合がある。腫瘍細胞の壊死を生じさせる多くの化学療法剤は、ＡＴＰを誘導することができ、抗ＣＤ３９抗体との併用は、この設定で抗腫瘍反応を増強するのに特に有用であり得る。
本明細書中で引用される刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、本明細書中の他の箇所でなされる特定の文献の何れかの個別に提供される組み込みにかかわらず、（法律によって許される最大の限度で）各参考文献が個々に及び具体的に参照により組み込まれることが示され、本明細書中でその全体において記載されているかのように、同定度に参照により全体的に本明細書に組み込まれる。
「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という語及び同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り又は文脈に明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈すべきである。
別段の指定がない限り、本明細書中で提供される全ての厳密値は、対応する近似値の代表である（例えば、特定の要因に関して提供される全ての代表的厳密値又は測定値は、必要に応じて、「約」により修飾される対応する近似測定値も提供するとみなされ得る）。
１つ又は複数の要素に関する「含む」、「有する」、「包含する」又は「含有する」などの語を使用した本明細書における何らかの態様又は実施形態の本明細書中の記述は、別段の指定がない限り又は内容に明らかに矛盾しない限り、その特定の１つ又は複数の要素「からなる」、「から基本的になる」又はそれを「実質的に含む」、本明細書における同様の態様又は実施形態に対する支持を提供するものとする（例えば、特定の要素を含む場合の本明細書中に記載の組成物は、別段の指定がない限り又は内容に明らかに矛盾しない限り、その要素からなる組成物も記載するものとしても理解されるべきである）。
本明細書中で提供されるあらゆる実施例又は代表的な語（例えば、「など」）の使用は、本発明を単により良好に明らかにするものとして意図され、別段の主張がない限り、本発明の範囲において限定を提起しない。本明細書中のいかなる語も、何らかの請求項に記載されていない要素を本発明の実施に必須であるものとして示すものと解釈すべきではない。

Claims (20)

  1. 可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤアーゼ１）タンパク質に結合し、且つそのＡＴＰアーゼ活性を阻害することができる抗体又は抗体フラグメントであって、抗体が、
    （ａ）アミノ酸配列ＤＹＮＭＨ（配列番号８）を含むＨＣＤＲ１；アミノ酸配列ＹＩＶＰＬＮＧＧＳＴＦＮＱＫＦＫＧ（配列番号９）を含むＨＣＤＲ２；アミノ酸配列ＧＧＴＲＦＡＹ（配列番号１０）を含むＨＣＤＲ３；アミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＤＮＦＧＶＳＦＭＹ（配列番号１１）を含むＬＣＤＲ１；アミノ酸配列ＧＡＳＮＱＧＳ（配列番号１２）を含むＬＣＤＲ２領域；及びアミノ酸配列ＱＱＴＫＥＶＰＹＴ（配列番号１３）を含むＬＣＤＲ３領域
    を含む、抗体又は抗体フラグメント。
  2. 抗体又は抗体フラグメントが、外因的に添加されたＡＴＰの存在下で前記ＣＤ３９タンパク質の前記ＡＴＰアーゼ活性を阻害し、任意選択により、外因的に添加されたＡＴＰは、２０μＭの濃度で提供される、請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  3. 抗体又は抗体フラグメントが、細胞の表面でヒトＣＤ３９タンパク質に結合することができ、且つ細胞の表面で前記ＣＤ３９タンパク質の前記ＡＴＰアーゼ活性を阻害することができる、請求項１又は２に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  4. 抗体が、ヒトＦｃドメインを有する抗体であり、前記ヒトＦｃドメインは、前記ＦｃドメインとヒトＦｃγ受容体との間の結合を減少させるように改変されている、請求項１～３の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  5. 抗体が、改変されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み、前記改変されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ｋａｂａｔ残基Ｎ２９７でＮ結合グリコシル化を含み、且つＫａｂａｔ残基２３４及び２３５でアミノ酸置換を含む、請求項１～４の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  6. 請求項１～５の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  7. 請求項１～５の何れか一項に記載の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸。
  8. 請求項１～５の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを産生する組換え宿主細胞。
  9. 癌の処置における使用のための、請求項１～５の何れか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  10. 癌の処置における使用のための、請求項６に記載の組成物。
  11. ヒトＰＤ－１の阻害活性を中和する抗体と組み合わせての使用のための、請求項９に記載の抗体。
  12. ヒトＰＤ－１の阻害活性を中和する抗体と組み合わせての使用のための、請求項１０に記載の組成物。
  13. 前記癌は、白血病、膀胱癌、神経膠腫、神経膠芽腫、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、甲状腺癌、食道癌又は乳癌である、請求項９または１１に記載の抗体。
  14. 前記癌は、白血病、膀胱癌、神経膠腫、神経膠芽腫、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、甲状腺癌、食道癌又は乳癌である、請求項１０または１２に記載の組成物。
  15. 前記癌は、肺癌である、請求項９または１１に記載の抗体。
  16. 前記癌は、肺癌である、請求項１０または１２に記載の組成物。
  17. 前記癌は、膵臓癌である、請求項９または１１に記載の抗体。
  18. 前記癌は、膵臓癌である、請求項１０または１２に記載の組成物。
  19. 前記癌は、頭頸部の癌である、請求項９または１１に記載の抗体。
  20. 前記癌は、頭頸部の癌である、請求項１０または１２に記載の組成物。
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