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TWI840941B - 製造自體交聯透明質酸凝膠之方法及其產物 - Google Patents

製造自體交聯透明質酸凝膠之方法及其產物 Download PDF

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TWI840941B
TWI840941B TW111133781A TW111133781A TWI840941B TW I840941 B TWI840941 B TW I840941B TW 111133781 A TW111133781 A TW 111133781A TW 111133781 A TW111133781 A TW 111133781A TW I840941 B TWI840941 B TW I840941B
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陳拓成
陳俊彰
林伯烜
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科妍生物科技股份有限公司
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Abstract

本揭示提供一種製造自體交聯透明質酸凝膠之方法，其包含將透明質酸膠體於低溫連續進行酸反應及高溫蒸汽處理，以獲得高黏度之自體交聯透明質酸凝膠。

Description

製造自體交聯透明質酸凝膠之方法及其產物
本揭示係關於一種透明質酸之製造方法，具體而言，係關於一種製造自體交聯透明質酸凝膠之方法及其產物。
透明質酸為一多醣，其結構由β-1,3-葡萄糖乙醯胺(β-1,3-N-acetyl glucosamine)及β-1,4-葡萄糖酸(β-1,4-glucuronic acid)以β-1-4鍵結形成分子量約為400 D之雙醣重覆單位，此雙醣重覆單位再以β-1-3鍵結重覆連結，形成之直鏈高分子聚合物。其商業來源可由菌種如鏈球菌屬的醱酵以及動物組織如雞冠中萃取得到。直鏈的透明質酸在生物體內易因酵素(如透明質酸水解酵素)及自由基的作用而發生降解，因而降低在生物體內的滯留時間，亦因缺乏機械強度而限制其應用範圍，故於實際應用時，常將透明質酸進行交聯。
自體交聯透明質酸(Auto-crosslinked hyaluronic acid)是一種在活化劑或催化劑的存在下，經由透明質酸分子間或分子內的羥基(-OH)與羧基(-COOH)產生酯化反應而到的酯類。由於沒有使用交聯劑，不會有交聯基的分子片段在所生成自體交聯透明質酸上，使得它得保有透明質酸優異的生物相容性及黏彈性質(viscoelastic properties)，已廣泛用於 不同的醫療應用。例如，可應用於關節病(arthropathy)(例如US 6,251,876所揭露)的治療及術後防沾黏(prevention of post-surgical adhesion)(例如US 7,504,386)，或用於做為皮膚填充劑(dermal fillers)(例如Andrea Alessandrini等人，Plastic and Reconstructive Surgery,vol.118,pp.341-346(2006))，也被廣泛推薦應用於組織工程。目前市面上已有以自體交聯透明質酸為成份的術後防沾黏凝膠產品，例如Hyalobarrier®和HYALOGLIDE®。已知自體交聯透明質酸可由活化劑2-氯-1-甲基吡啶碘化物(2-chloro-1-methylpyridinium iodide,CMPI)的存在下，行自體交聯反應而得(US 5,676,964所揭露)，或亦可由酸(例如硝酸或鹽酸)的存在下於低溫下反應而得(例如日本特許專利第4460663號)，但是現有這兩種技術都有其缺點。
以CMPI當活化劑進行透明質酸自體交聯酯化反應時，其反應步驟複雜，使用到大量的有機溶劑、離子交換樹脂和有毒性的試劑。反應過程包括：先將透明質酸鈉經由充填滿樹脂的管柱轉換成可溶於極性有機溶劑的透明質酸四級銨鹽，其中樹脂須先以有毒的四丁基氫氧化銨(TBAOH,Tetrabutylammonium Hydroxide)處理。所得含有透明質酸四級銨鹽的水溶液經過冷凍乾燥後，溶於有機溶劑例如二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，DMSO)中，並加入CMPI來進行反應。反應過程中再加入三乙胺，中和因反應生成而造成溶液酸鹼值(pH值)降低的鹽酸。反應後混合物加入氯化鈉水溶液脫除保護基後，再以溶劑(例如乙醇)進行將自體交聯透明質酸酯沉澱出來後，再經乾燥得到自體交聯透明質酸。再者，透明質酸在樹脂管柱中進行官能基團的置換反應時，因為透明質酸溶液黏度高的特性，置換時透明質酸的濃度低(約0.5至1.0wt%透明質酸左右)，使得溶液 的體積大，需使用大量的溶劑(例如乙醇)進行沉澱。經樹脂離子交換所得的透明質酸四級銨鹽在有機溶劑中的溶解度亦是有限，這同樣使得在進行酯化反應過程需使用大量的有機溶劑，產生了溶劑回收的問題。
另一種合成自體交聯透明質酸的方法是在低溫及酸的存在下進行，沒有使用到有機溶劑及有毒的活化劑。此方法最早由藤田充成等人所發明(日本特許專利第4460663號)，是將1%透明質酸溶液，以酸溶液(例如鹽酸、硝酸和硫酸)調整至pH值2.0以下，置於-20℃下120小時後，經pH 7.0的緩衝溶液清洗及破碎後所製得的一種透明質酸凝膠。由於生產過程有清洗步驟，會將可溶的透明質酸去除，所得的透明質酸凝膠的黏度不高，不利於實際在醫藥用途上的使用。再者，此種在低透明質酸反應濃度下所得凝膠，無法在高溫蒸汽加熱或滅菌後保持其原有之凝膠狀態，應用於產品時無菌狀態難以維持。
另一方面，在製備含高濃度透明質酸及酸成分(例如硫酸、鹽酸或硝酸)之反應物時，由於透明質酸與含有酸的水溶液直接混合時容易結成內部包含有透明質酸粉末的團狀塊狀物，這種塊狀物不容易經由攪拌而分散開來，使得透明質酸無法有效地與含有酸的水溶液混合或者需較長的攪拌時間，導致透明質酸鈉的水解，造成隨後低溫反應過程中無法進行有效地進行，並會在反應後的清洗中和過程中造成大量未經自體交聯或者是低度自體交聯透明質酸的溶解流失，在實際生產的過程中無法得到性質穩定的自體交聯透明質酸顆粒和凝膠。
為了提高做為生物降解性醫療用材料的自體透明質酸凝膠的性能，須保持高分子量和高濃度(例如10wt%以上)的透明質酸做為反應條件。然而，由於具備高分子量的透明質酸膠體隨著透明質酸濃度的增加 而變得黏度非常高，需較長的攪拌時間。在酸性條件下過長的攪拌溶解時間，亦使得透明質酸容易水解。例如，日本特許專利第4383035號的比較實施例1指出，將15克濃度為1N的硝酸置於研缽中，並向其中加入6克分子量為2百萬道爾頓(Dalton)的透明質酸鈉粉末(透明質酸鈉反應濃度為28.6wt%)，並將混合物充分捏合直至均勻。由於透明質酸鈉立即與硝酸形成塊狀物，即使連續捏合約30分鐘也難以均勻地捏合。當繼續捏合時，透明質酸納的分子量被硝酸降低而使混合物液化，隨後將其置於設定在-20℃的冰箱中，冷凍至預定天數後，當此冷凍產物在磷酸鹽緩衝液中解凍時，將會溶解在磷酸鹽緩衝液中，甚至不能獲得透明質酸凝膠。該發明提出一種改善的透明質酸與酸溶液的混合攪拌方式，方式是通過先將酸溶液冷凍成細粒狀或粉碎形式，並在0℃至-20℃低溫下再和透明質酸粉末混合，透明質酸反應的濃度保持在10wt%以上。但此方法須先將酸溶液冷凍成細粒狀或粉碎形式，且攪拌須持續在低溫下進行，程序複雜且低溫下攪拌不易控制溫度，不利於實際的生產與製造。
US 9,216,193揭露一種自體交聯透明質酸組合物，其含有平衡溶脹倍率(equilibrium swelling capacity)為3至10倍、交聯透明質酸顆粒粒徑在10至100μm、透明質酸含量在3至8wt%的自體交聯透明質酸顆粒。該交聯透明質組合物在25±2℃、50秒-1的剪切速率下，測定所得的剪切黏度在300mPa．s以下，以改善製備成高濃度關節腔注射針劑時推力過大的問題。然而，該專利是沿用日本特許專利第4383035號所使用的方法，通過先將酸溶液冷凍成細粒狀或粉碎形式，並在-10℃再和透明質酸粉末混合，故仍有需於低溫下混合及程序複雜的缺點，不利於實際生產中使用。同時使用此方法所得的自體交聯透明質酸組合物本身為顆粒狀，黏 度低僅為300mPa．s以下，不適合做為需要有高黏度的醫療產品之用，例如傷口敷料或術後防沾黏等產品。
其餘在低溫及酸的存在下合成自體交聯透明質酸凝膠的技術，尚包括有US 6,387,413、US 6,790,461、US 6,635,267及US 7,014,860。但這些發明所得的凝膠同樣地在經過清洗去除酸及中和的步驟後，所得凝膠顆粒的黏度偏低，也未證實所得到的凝膠是否在經高溫蒸汽加熱或滅菌後，還能保持應有的凝膠狀態和交聯性質，不利於實際生產及做為醫療用途。
為改善前述問題之至少一或多項，本揭示提供特殊低溫酸反應以製造經高溫蒸汽處理之高黏度自體交聯透明質酸凝膠。
本揭示提供一種製造自體交聯透明質酸凝膠之方法，其包含：(a)提供透明質酸或其金屬鹽膠體；(b)混合該膠體及酸，並於約-10℃至約-30℃反應約7日至約42日；(c)將步驟(b)之產物進行高溫蒸汽處理，以獲得該自體交聯透明質酸凝膠；其中該自體交聯透明質酸凝膠之損耗正切δ(loss tangent，tan δ)小於或等於1，量測條件為該自體交聯透明質酸凝膠包含約1.5wt%至約7.5wt%之透明質酸時，於25℃及0.1赫茲至10.0赫茲測量頻率量測所得。
在本揭示之具體實施例中，該透明質酸之金屬鹽係為鹼金屬鹽，其包含但不限於鉀鹽、鈉鹽、鋅鹽或鋰鹽，於本揭示之一具體實施例中，該透明質酸之金屬鹽為鈉鹽。
在本揭示之具體實施例中，該方法不使用交聯劑，係以步驟(b)之酸反應使該透明質酸自體交聯。
在本揭示之具體實施例中，步驟(b)中該透明質酸或其金屬鹽膠體之反應濃度為約10wt%至約30wt%，在本揭示之其他具體實施例中，步驟(b)中該透明質酸或其金屬鹽膠體之反應濃度為約11wt%至約28wt%、約12wt%至約26wt%、約13wt%至約24wt%、約14wt%至約22wt%、約15wt%至約20wt%、約16wt%至約18wt%、約10wt%至約20wt%、或約10wt%至約14.5wt%。
在本揭示之具體實施例中，步驟(b)中該酸之反應濃度為自約0.5N至約1.5N，在本揭示之其他具體實施例中，步驟(b)中該酸之反應濃度為自約0.51N至約1.4N、自約0.52N至約1.3N、自約0.53N至約1.2N、自約0.54N至約1.1N、自約0.55N至約1.0N、自約0.56N至約0.9N、自約0.57N至約0.8N、自約0.58N至約0.7N、或自約0.59N至約0.6N。
在本揭示之具體實施例中，其中該酸係為鹽酸、硝酸或硫酸。
在本揭示之具體實施例中，步驟(b)中該酸之反應溫度為約-12℃至約-28℃、約-14℃至約-26℃、約-16℃至約-24℃、約-18℃至約-22℃、約-10℃、約-20℃、或約-30℃。
在本揭示之具體實施例中，步驟(b)中該酸之反應時間為約9日至約40日、約11日至約40日、約13日至約38日、約15日至約36日、約17日至約34日、約19日至約32日、約21日至約30日、約23日至約28日、約25日至約27日、約7日、約14日、約21日、或約28日。
在本揭示之具體實施例中，步驟(b)係於室溫混合該膠體及酸，並於約-10℃至約-30℃靜置反應約7日至約42日。
在本揭示之具體實施例中，步驟(b)為：該酸之反應濃度為自約0.58N至約1.0N，於約-10℃反應約7天至約42天；該酸之反應濃度為自約0.58N至約1.5N，於約-20℃反應約7天至約35天；該酸之反應濃度為自約0.58N至約1.0N，於約-20℃反應約7天至約28天；該酸之反應濃度為自約1.0N至約1.5N，於約-30℃反應約14天至35天；或該酸之反應濃度為自約0.58N至約1.0N，於約-30℃反應約14天至約35天。
在本揭示之具體實施例中，步驟(b)於約-10℃至約-30℃反應為連續反應，且該方法僅包含於約-10℃至約-30℃反應一次。
在本揭示之具體實施例中，其中步驟(c)前，膠體之平衡溶脹倍率於自約12至約30及/或平均粒徑於自約200μm至約3000μm。
在本揭示之具體實施例中，步驟(c)前另包含將步驟(b)所得之產物均質及/或清洗中和之步驟。
在本揭示之具體實施例中，其中步驟(c)前，另包含將步驟(b)產物pH值調整至自約6.0至約7.0；在本揭示之另一具體實施例中，其中步驟(c)前，另包含將步驟(b)產物pH值調整至自約6.3至約6.8。於本揭示之具體實施例中，該pH值之調整為於均質及/或清洗中和步驟後進行。
本揭示之高溫蒸汽處理之溫度及處理時間不限，惟可製得根據本揭示之自體交聯透明質酸凝膠即可。在本揭示之具體實施例中，步驟(c)之高溫蒸汽處理為自約110℃至約130℃蒸汽下處理約10分鐘至約60分鐘。在本揭示之具體其他實施例中，該高溫蒸汽處理之蒸汽溫度為約112℃至約128℃、約114℃至約126℃、約116℃至約124℃、約118℃至約122℃、或約121℃。
在本揭示之具體實施例中，其中當該自體交聯透明質酸凝膠包含約1.5wt%至約7.5wt%之透明質酸時，於25℃及1.0赫茲量測該自體交聯透明質酸凝膠之彈性模數於自約30Pa至約8000Pa及/或黏性模數於自約20Pa至約2000Pa；在25℃及剪切速率為1秒-1時剪切黏度為自約20Pa．s至約900Pa．s。
本揭示亦提供一種自體交聯透明質酸凝膠，其中該自體交聯透明質酸凝膠之損耗正切δ小於或等於1，量測條件為該自體交聯透明質酸凝膠包含約1.5wt%至約7.5wt%之透明質酸時，於25℃及0.1赫茲至10.0赫茲測量頻率量測所得，且經微生物測試為無菌。
本揭示亦提供一種根據本揭示之自體交聯透明質酸凝膠之用途，其係用以製造用以治療骨的再生與缺陷、術後防沾黏、皮下填充及/或關節病的藥物。
圖1顯示蒸汽加熱前後自體交聯透明質酸顆粒與凝膠兩者剪切黏度的變化，反應溫度-10℃，透明質酸(HA)反應濃度14.5wt%，HCl反應濃度1.0N，反應14天，蒸汽加熱前交聯透明質酸顆粒pH值6.5，121℃蒸汽加熱15分鐘。
圖2顯示自體交聯透明質酸凝膠彈性模數(G’)與黏性模數(G”)隨測量頻率的變化，反應溫度-30℃，HA反應濃度14.5wt%，HCl反應濃度1.5N，反應14天，121℃蒸汽加熱15分鐘，蒸汽加熱前自體交聯透明質酸顆粒pH值為6.5。
圖3顯示自體交聯透明質酸凝膠剪切黏度隨剪切速率的變化，反應溫度-30℃，HA反應濃度14.5wt%，HCl反應濃度1.5N，反應14天，121℃蒸汽加熱15分鐘，蒸汽加熱前自體交聯透明質酸顆粒pH值為6.5。
圖4顯示自體交聯透明質酸顆粒pH值對蒸汽加熱後所得自體交聯透明質酸膠彈性模數的影響，反應溫度-20℃，HA反應濃度14.5wt%，HCl反應濃度1.5N，反應21天，121℃蒸汽加熱20分鐘。
圖5顯示自體交聯透明質酸顆粒pH值對蒸汽加熱後所得自體交聯透明質酸膠黏性模數的影響，反應溫度-20℃，HA反應濃度14.5wt%，HCl反應濃度1.5N，反應21天，121℃蒸汽加熱20分鐘。
圖6顯示以體積計算顱骨缺損後新生骨佔比及數據分析統計圖。No.1：控制組：進行顱骨缺損手術後，再覆蓋Bio-Gide membrane；No.2：進行顱骨缺損手術後，植入對照組，最後再覆蓋Bio-Gide membrane；No.3：進行顱骨缺損手術後，植入實驗組1之凝膠，最後再覆蓋Bio-Gide membrane；No.4：進行顱骨缺損手術後，植入實驗組2之凝膠，最後再覆蓋Bio-Gide membrane；No.5：進行顱骨缺損手術後，植入實驗組3之凝膠，最後再覆蓋Bio-Gide membrane；No.6：進行顱骨缺損手術後，植入實驗組4之凝膠，最後再覆蓋Bio-Gide membrane；No.7：正控制組：進行顱骨缺損手術後，植入 CoreBone1000骨粉，最後再覆蓋Bio-Gide membrane。正控制組作為為國外骨粉市售品之一，為以色列CoreBone公司生產並通過歐盟認證，是為天然骨材且對動物體的相容性較高的優點。控制組、對照組及各實驗組織組成及物性如表十四所述。
除非特定說明，否則當術語之定義偏離術語之常用含義時，申請人意欲使用下文中提供之定義。
除非內容另有明確指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。
如本文中所使用，除非另有說明，否則「或」之使用意謂「及/或」。在多重附屬項之情況下，使用「或」僅以替代之方式重新提及超過一個前述獨立項或附屬項。
本文中所使用之「透明質酸或其金屬鹽膠體(colloid)」乙詞係指透明質酸或其金屬鹽之固體粉末或固體絲狀物經吸收水相溶劑澎潤後所形成之膠體，水相溶劑之實例包含但不限於蒸餾水、去離子水、生理食鹽水或緩衝溶液。
本文中所使用之「凝膠」乙詞係指使用AR2000ex流變儀(TA儀器)在恆定頻率下測量之儲存(G')模數大於損失(G")模數之材料。例如以流變儀測定，在25℃、0.1至10赫茲(Hz)測量頻率(Frequency)下，所測得的彈性模數(modulus of elasticity，G’)會大於或等於黏性模數(modulus of viscosity，G”)及tan δ(等於黏性模數/彈性模數，G”/G’)的數值小於或等於1之透明質酸凝膠，且在25℃、1秒-1剪切速率下，其剪切黏度至少在20Pa．s以上。
本揭示提供一種在低溫及酸的存在下合成自體交聯透明質酸凝膠之方法，其可經高熱蒸汽處理，具有高黏度且無菌，該凝膠可應用於防沾黏及骨的再生與修復、皮下填充劑及關節病治療等醫療用途。
詳言之，本揭示提供一種製造自體交聯透明質酸凝膠之方法，其包含：(a)提供透明質酸或其金屬鹽膠體；(b)混合該膠體及酸，並於約-10℃至約-30℃反應約7日至約42日；(c)將步驟(b)之產物進行高溫蒸汽處理，以獲得該自體交聯透明質酸凝膠；其中該自體交聯透明質酸凝膠之損耗正切δ(loss tangent，tan δ)小於或等於1，量測條件為該自體交聯透明質酸凝膠包含約1.5wt%至約7.5wt%之透明質酸時，於25℃及0.1赫茲至10.0赫茲測量頻率量測所得。
於本揭示之一具體實施例中，其係將透明質酸或其金屬鹽以水相溶劑先進行澎潤形成近似固態狀的透明質酸或其金屬鹽膠體後，再與酸進行混合。於本揭示之一具體實施例中，其係先將已經吸收水相溶劑澎潤後的透明質酸或其金屬鹽膠體先適當的過篩或破碎成較小的膠體，再與酸進行混合。於本揭示之一具體實施例中，水相溶劑是蒸餾水或去離子水。雖不願為理論所限制，但咸信由於透明質酸或其金屬鹽粉末已先由吸收水相溶劑加以均勻地澎潤並形成膠體，加入酸進行攪拌時，酸可以容易地與經澎潤(或溶脹)後的透明質酸或其金屬鹽膠體充分地混合。於本揭示之一具體實施例中，該透明質酸或其金屬鹽膠體與酸之可以在室溫下進行，且不會有結成內部包含有透明質酸粉末的團狀塊狀物，可克服先前技 術中透明質酸與酸混合攪拌時需在低溫環境下進行且會結成團狀塊狀物等缺點。再將混合後含有酸的透明質酸或其金屬鹽膠體置於低溫下反應適當時間後，視需要經均質、清洗中和及去除懸浮的水相溶劑後，可得自體交聯透明質酸顆粒。經高溫蒸汽加熱可得到無菌的、高黏度的自體交聯透明質酸凝膠，可以改善以往低溫合成法所得交聯透明質酸黏度低的缺點，並可應用在術後防沾黏及骨的再生與缺陷的修復、皮下填充劑及關節病治療等醫療應用。
於本揭示之一具體實施例中，透明質酸凝膠之交聯為透明質酸分子間或分子內的羥基(-OH)與羧基(-COOH)產生酯化反應而到的酯類，且該方法不使用交聯劑，僅由步驟(b)進行自體交聯反應。
根據本揭示之透明質酸或其金屬鹽之平均分子量並無特殊限制，惟可能用以形成膠體及凝膠之分子量即可。於本揭示之一具體實施例中，該透明質酸或其金屬鹽之平均分子量約在76.6萬以上(極限黏度η=1.4m3/kg，平均分子量以Laurent公式(分子量={[η]×105/3.6}1/0.78)計算為76.6萬)，於本揭示之一些具體實施例中，該透明質酸或其金屬鹽之平均分子量於自約76.6萬至約203.6萬(極限黏度約在1.4至3.0m3/kg)，於本揭示之一些具體實施例中，該透明質酸或其金屬鹽之平均分子量於自約98.3萬至約121.1萬(極限黏度約在1.7至2.0m3/kg)。透明質酸或其金屬鹽之極限黏度可以藥典的方法測量得到，例如歐洲藥典9.0版所述之方法。
於本揭示之一具體實施例中，步驟(a)之透明質酸或其金屬鹽膠體在實施步驟(b)前，先將透明質酸或其金屬鹽膠體破碎，破碎的方法沒有限制，例如可經過針筒、篩網或者以金屬如刀片破碎或切碎。
根據本揭示之方法，其中步驟(b)之自體交聯反應時添加之 酸種類可為硫酸、硝酸和鹽酸，且酸之濃度理論上沒有限制，只要可以達到本揭示所揭露之酸濃度，例如自約0.5N至約1.5N，以及經本揭示之方法可以製造交聯透明質酸或其金屬鹽凝膠即可。於本揭示之一具體實施例中，該酸為14N濃硝酸、12N濃鹽酸或12N濃硫酸；於本揭示之另一具體實施例中，該酸為自約6N至約12N之鹽酸、硝酸和硫酸。
於本揭示之具體實施例中，步驟(b)之反應溫度為自約-10℃至約-20℃。
本揭示中透明質酸需有一定的反應濃度，於一具體實施例中，該透明質酸或其金屬鹽膠體的反應濃度為自約10wt%至約30wt%，於另一具體實施例中，為自約10wt%至約20wt%；於再一具體實施例中，為自約10wt%至約14.5wt%。
本揭示混合該透明質酸或其金屬鹽膠體及酸之方式理論上沒有任何限制，只要可以達到均勻混合的目的即可，可以以人力攪拌或者是機器進行攪拌。例如但不限於以手持攪拌棒攪拌，或者是以機器例如捏合機、攪拌機或者是公自轉攪拌機來進行攪拌。
於本揭示之一具體實施例中，步驟(b)係於室溫混合該透明質酸或其金屬鹽膠體及酸，並於約-10℃至約-30℃靜置反應約7日至約42日。
根據本揭示，合適的反應混合物中酸的濃度與反應時的溫度以及透明質酸的反應濃度有關。於本揭示之一具體實施例中，約-10℃時，反應混合物中酸的濃度於自約0.58N至約1.0N。於本揭示之一具體實施例中，在約-20℃時，於自約0.58N至約1.5N。於本揭示之一具體實施例中，在約-30℃時，於自約1.0N至約1.5N。於本揭示之一具體實施 例中，在透明質酸反應濃度為10wt%，在約-10℃至約-30℃時，反應混合物中酸的濃度於自約0.58N至約1.0N。
於本揭示之具體實施例中，步驟(b)之反應時間至少約須7天或14天以上，視反應時的溫度及透明質酸的反應濃度而定。
於本揭示之一具體實施例中，在14.5wt%透明質酸的反應濃度及約-10℃的反應溫度下，合適的反應天數自約14天至約42天，於本揭示之另一具體實施例中，反應天數自約21天至約28天。
於本揭示之一具體實施例中，在14.5wt%透明質酸的反應濃度及約約-20℃的反應溫度下，合適的反應天數自約7天至約35天，於本揭示之另一具體實施例中，反應天數自約14天至約28天。
於本揭示之一具體實施例中，在14.5wt%透明質酸的反應濃度及約-30℃的反應溫度下，合適的反應天數自約14天至約35天，於本揭示之另一具體實施例中，反應天數自約14天至約28天。
於本揭示之一具體實施例中，在10wt%透明質酸的反應濃度及約-10℃反應溫度下，合適的反應天數自約7天至約28天，於本揭示之另一具體實施例中，反應天數自約14天至約28天。
於本揭示之一具體實施例中，在10wt%透明質酸的反應濃度及約-20℃的反應溫度下，合適的反應天數自約7天至約28天，於本揭示之另一具體實施例中，反應天數自約14天至約28天。
於本揭示之一具體實施例中，在10wt%透明質酸的反應濃度及約-30℃的反應溫度下，合適的反應天數自約14天至約35天，於本揭示之另一具體實施例中，反應天數自約14天至約28天。
於本揭示之一具體實施例中，步驟(b)於約-10℃至約- 30℃反應為連續反應，亦即於自體交聯反應時，反應物皆處於約-10℃至約-30℃，且該方法僅包含於約-10℃至約-30℃反應一次。
於本揭示之一具體實施例中，步驟(c)前另包含將步驟(b)所得之產物均質及/或清洗中和之步驟；於本揭示之另一具體實施例中，步驟(c)前另包含將步驟(b)所得之產物均質及清洗中和之步驟，以製得一透明質酸顆粒。
於本揭示之一具體實施例中，先實施均質再實施清洗中和，本揭示之均質包含破碎，其方式沒有限制，可以均質機進行或是經篩網進行。於本揭示之一具體實施例為使用均質機。
本文所指之「清洗中和」是指以水、蒸餾水、去離子水、生理食鹽水或緩衝溶劑對自體交聯反應後之產物進行均質後的清洗步驟，該清洗步驟會移除反應後在產物內部的酸成分例如硝酸、鹽酸或硫酸，並使其酸鹼值趨近於中性。
雖不願為理論所限制，但咸信交聯透明質酸顆粒在蒸汽加熱前的pH值會影響高溫蒸汽處理後交聯透明質酸凝膠的流變性質。於本揭示之一具體實施例中，在步驟(c)高溫蒸汽處理前先以緩衝溶液、弱酸或/和弱鹼調整其pH值。由於經均質、清洗中和後的交聯透明質酸顆粒其懸浮的水相溶劑已由過濾方式去除，不容易量測其pH值，故其pH值是測量清洗中和後或酸鹼值調整後之懸浮溶液的穩定pH值來代替。在高溫蒸汽處理前的pH值可調整於自約pH7.0至約pH 6.0，於本揭示之一具體實施例中為於自約pH 6.3至約6.8。
本揭示低溫反應後含有酸的透明質酸膠體的清洗中和及調整pH值的操作，其方式理論上沒有限制，只要能達到預定的透明質酸膠 體或顆粒的pH值即可。例如，可以是單獨以目標pH值的緩衝溶液單獨進行，或是以低濃度的酸或鹼溶液的滴定的協助下進行。由於在自體交聯的透明質酸顆粒容易在鹼性緩衝溶液中快速水解，故為保護其不因清洗過程的pH值太高，而使得膠體水解。於本揭示之一具體實施例中，清洗中和及調整pH值的操作方式，是以中性緩衝溶液清洗中和至接近中性酸鹼值，過濾去除水相之懸浮溶劑後，再以目標的酸鹼值的緩衝溶液清洗至少一次後，再以低濃度的酸或鹼(例如0.1N的鹽酸或氫氧化鈉溶液)將透明質酸膠體或顆粒滴定至正確的目標酸鹼值。例如，經低溫反應得到透明質酸膠體先置於室溫一段時間後，加入一定量的100mM、pH 7.0的磷酸鹽緩衝溶液後進行均質破碎，經過濾去除緩衝溶液後，再以新鮮的100mM pH 7.0的磷酸鹽緩衝溶液反覆清洗及過濾數次，至溶液酸鹼值為7.0左右，再以清洗的目標pH值(例如pH 7.0、pH6.8、pH6.5、pH6.3及pH6.0)的緩衝溶液清洗至少一次後，以弱酸或弱鹼滴定至目標pH值，以降低所得的膠體在清洗中和或/和滴定的過程產生溶解的現象。
本揭示使用的緩衝溶液的種類和濃度沒有特別的限制，只要適合做為醫療用途和能使用在人體即可。較合適的緩衝溶液可以是磷酸鹽緩衝溶液，濃度可以於自約1mM至約1000mM之間，自約10mM至約300mM，或自約10mM至100mM。合適的緩衝溶液的酸鹼值於自約pH6.0至約7.0。例如，可以使用100mM磷酸鈉緩衝溶液或磷酸鉀緩衝溶液，pH約6.0至約7.0的磷酸鈉緩衝溶液。
本揭示所得交聯的透明質酸膠體或顆粒在均質、清洗中和及靜置後，可從均質、清洗中和的水相溶劑中自行地分層。無法自行分層的或是會形成懸浮的自體交聯透明質酸膠體或顆粒，由於其交聯結構較 弱，在經高溫蒸汽加熱後不會維持其交聯狀態。
本揭示之方法包含步驟(c)之將步驟(b)之產物進行高溫蒸汽處理，例如自約110℃至約130℃蒸汽下處理約10分鐘至約60分鐘，以獲得該自體交聯透明質酸凝膠。
根據本揭示，可藉由不同的蒸汽加熱條件，包括蒸汽溫度及加熱時間，改變所得的自體交聯透明質酸凝膠的結構，進而改變其黏彈性質如彈性模數(G’)、黏性模數(G”)及剪切黏度。
本揭示的高溫蒸汽加熱的方式並沒有特別的限制，只要能將交聯透明質酸顆粒轉變成無菌的、高黏度的交聯透明質酸凝膠即可。於本揭示之一具體實施例中，將經過調整pH值的交聯透明質酸顆粒裝入玻璃或塑膠容器後以高溫蒸汽加熱。例如，充填於玻璃或塑膠針筒中進行高溫蒸汽加熱。合適的蒸汽加熱溫度於自約110℃至約130℃，較佳的加熱溫度於自約115℃至約125℃，最佳的加熱溫度於自約120℃至約121℃。蒸汽加熱的時間依據所使用的蒸汽加熱溫度及凝膠所需的黏彈性質而定，只要能將交聯透明質酸由顆粒狀轉變成無菌的凝膠狀，並維持其交聯狀態即可。例如在121℃蒸汽下，合適的加熱時間於自約10分鐘至約60分鐘、自約15分鐘至約60分鐘、或約15分鐘至約35分鐘。不同的加熱時間，會得到具有不同黏彈性質的交聯透明質酸凝膠。本揭示所得交聯透明質酸凝膠的無菌狀態是經由藥典(如歐洲藥典9.0版)的無菌試驗方法加以證實。
本揭示蒸汽加熱中所使用的針筒或瓶器的體積於自約0.5mL至約50mL、約1mL至約10mL、或約3mL至約10mL。
文獻指出(K.EDSMAN等人，“Gel properties of hyaluronic acid dermal fillers”,Dermatol Surg.,Vol.38,p1170-1179(2012))，直鏈 的透明質酸在低的測量頻率下，其彈性模數會低於黏性模數，高的頻率下則彈性模數(modulus of elasticity,G’)會高於黏性模數(modulus of viscousity,G”)。若是交聯狀態的透明質酸，由於網狀的交聯結構，不管頻率的高低，其彈性模數會高於黏性模數，這可用來判定膠體是直鏈狀態或是為交聯的狀態。所以，本揭示的交聯自體透明質酸凝膠是指在25℃、測量頻率0.1至10.0赫茲條件下，量測經高溫蒸汽處理後的透明質酸凝膠其彈性模數皆大於或等於其黏性模數的凝膠及tan δ小於或等於1，且在25℃、1秒-1剪切速率下，其剪切黏度至少在20Pa．s以上。反之，若在測量頻率0.1至10.0赫茲之下，所得的凝膠其彈性模數數值有低於黏性模數的情況發生，則判定其為直鏈的透明質酸凝膠。
本揭示的自體交聯透明質酸凝膠的黏彈性質是以流變儀(TA，AR2000ex)在25℃及1.0赫茲下，以20mm的金屬平板測定，其彈性模數(G’)於自約30Pa至約8000Pa、自約200Pa至約1000Pa、或自約300Pa至約800Pa；黏性模數(G”)於自約20Pa至約2000Pa、自約100Pa至約600Pa、或自約150Pa至約500Pa。自體交聯透明質酸凝膠的彈性模數及黏性模數之數值會隨著高溫蒸汽處理時間的增加而減少。
本揭示經高溫蒸汽加熱後的自體交聯透明質酸凝膠，在25℃、1.0秒-1的剪切速率下，其剪切黏度於自約20Pa．s至約900Pa．s、自約100Pa．s至約800Pa．s、或自約250Pa．s至約700Pa．s。
本揭示的交聯透明質酸顆粒的平衡溶脹倍率的測定方法是取約1克經均質、清洗中和後約pH7.0的樣品，再以含0.9wt%氯化鈉、pH 6.0、10mM磷酸鈉緩衝溶液於5℃下平衡溶脹24小時後，於25℃下乾燥至恆重後，由於經緩衝溶液平衡後交聯透明質酸顆粒是顆粒狀，其密度不易 測得，故本揭示的平衡溶脹倍率以下列公式測定之。
平衡溶脹倍率=(經緩衝溶液平衡後交聯透明質酸顆粒之濕重/經緩衝溶液平衡後交聯透明質酸顆粒之乾重)
本揭示所得的交聯透明質酸顆粒經測定其平衡溶脹倍率大於10，自約12至約30、約12至約20、約13至約18、或約13至約16。
通常，較有效率的透明質酸交聯，膠體會產生較緊密的交聯網絡，膠體也較為堅硬，使得其溶脹比(swelling ratio)的數值愈小(Mohammed Al-Sibani等人，“Study of the effect of mixing approach on cross-linking efficiency of hyaluronic acid-based hydrogel cross-linked with 1,4-butanediol diglycidyl ether”,European Journal of Pharmaceutical Sciences,Vol.91,pp.131-137(2016))；另一文獻也指出較高的交聯密度(cross-linking density)會有較低的溶脹比(swelling ratio)(Noel L.Davison等人，“Degradation of Biomaterials”,Tissue Engineering(Second Edition),chapter 6,Elsevier Inc.,pp.197(2014))。
隨著反應時間增加，所得自體透明質酸顆粒的透明質酸含量會增加，回收率亦會增加，平衡溶脹比則越來越低；反應溫度降低，自體透明質酸顆粒的透明質酸含量會降低，回收率亦會降低，平衡溶脹比則越來越高。本揭示透明質酸之回收率在約70%至100%之間。
另外，經pH值調整為pH6.0至pH7.0後，不同pH值的交聯透明質酸顆粒，若直接於25℃下乾燥至恆重後所測得其平衡溶脹倍率，在pH6.0至pH7.0下是幾乎相同的，不受pH值的影響，也會和前述在0.9wt%氯化鈉、pH 6.0、10mM磷酸鈉緩衝溶液於5℃下平衡24小時後的平衡溶脹倍率，有幾乎相同的數值。
本揭示的自體交聯透明質酸顆粒在經蒸汽加熱前的平均粒徑基本上沒有特別限制，能以不同的均質機，在不同轉速下及不同均質時間下得到。於本揭示之一具體實施例中，平均粒徑於自約200μm至約3000μm、約600μm至約2500μm、或約1500μm至約2200μm。平均粒徑的測定是以生理食鹽水作為懸浮溶劑，在25℃下，以粒徑測定儀器(PARTICA LA-960,HORIBA)測定得到。
本揭示經高溫蒸汽加熱後的自體交聯透明質酸凝膠的pH值範圍約4.5至約6.5、約5.0至約6.0、或約5.1至約5.8。
本揭示的自體交聯透明質酸凝膠之透明質酸含量是以藥典(如歐洲藥典9.0版)的咔唑硫酸法(Carbazole Assay)測定之。本揭示所得的交聯透明質酸凝膠其透明質酸含量會隨著反應時間和反應溫度的增加而增加，於自約1.5wt%至約7.5wt%、自約2.0wt%至約6.0wt%、自約3.0wt%至約6.0wt%、或自約4.0wt%至約6.0wt%。在本揭示中，經高溫蒸汽處理後的自體交聯透明質酸凝膠的透明質酸含量會與高溫蒸汽處理前的自體交聯透明質酸顆粒的透明質酸含量相同。
本揭示的交聯透明質酸凝膠也可由直鏈的透明質酸溶液或者是水相溶劑(例如蒸餾水、生理食鹽水或緩衝溶液)混入本揭示的交聯的透明質酸顆粒後進行蒸汽加熱得到，只要所得到的產物經測定是符合本揭示對交聯透明質酸凝膠的定義，都是在本揭示之範圍內。
本揭示經蒸汽加熱後的自體交聯透明質酸凝膠的滲透壓可由清洗中和的水溶液的滲透壓或緩衝溶液的滲透壓來加以控制，故理論上其數值沒有限制，只要是適合做為人體使用的醫療目的滲透壓即可。本揭示經高溫蒸汽處理後的自體交聯透明質酸凝膠的滲透壓可於自約10至約 350mOsm/kg、自約30至約200mOsm/kg、或自約50至約150mOsm/kg。
本揭示的自體交聯透明質酸凝膠可用來治療骨的再生與缺陷。實驗方法是以大白鼠顱骨缺損的動物實驗(Patrick P Spicer等人，“Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect”,Nature Protocol,vol.7,pp.1918-1929(2012))將自體交聯透明質酸凝膠覆蓋傷口，並於手術後三個月時將大鼠犧牲取下骨頭，並以微量斷層掃描儀進行分析，並與市售品組、直鏈透明質酸組、空白對照組(手術後不添加任何物質)及正控制組進行比對。本揭示所使用的自體交聯透明質酸凝膠製造方法簡單，不使用有毒的有機溶劑或交聯劑，且動物試驗證實有良好的骨的修復和再生效果。
本揭示經由一改良的低溫合成的製造方法合成自體交聯透明質酸顆粒，該自體交聯透明質酸顆粒在調整至適當pH值後，可經蒸汽加熱，得到無菌的、具有高黏度的自體交聯透明質酸凝膠，可做為應用在骨的再生與缺陷修復、術後防沾黏、皮下填充劑及關節病治療等醫療用途。
以下之非限制性之實例有助於本揭示所屬技術領域中具通常知識者實施本揭示。該等實例不應視為過度地限制本揭示。本揭示所屬技術領域中具有通常知識者可在不背離本揭示之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本揭示之範圍。
實例
實施例1：透明質酸反應濃度14.5wt%、反應的酸濃度0.58N HCl、反應溫度-10℃
取12克含水率3.65wt%，極限黏度1.7m3/kg，平均分子量 為98.3萬之透明質酸，加入59.57克蒸餾水並置於攪拌機(士邦公司，型號：SP-502A)，在轉速253rpm下攪拌5分鐘後，得到經水澎潤的透明質酸膠體。再以孔徑約0.2公分的金屬篩網擠壓成條狀後，加入8.43克6N鹽酸(密度1.1g/cm3)，再以攪拌機在相同轉速下攪拌5分鐘，得到均勻含有酸的透明質酸膠體。將所得膠體裝於血清瓶中，置於如表1所示之的低溫冰箱中反應14天。反應後的透明質酸先置於室溫下解凍後，加入600mL、100mM pH 7.00的磷酸鹽緩衝溶液，以均質機(IKA公司，型號：T-25)在10,000rpm下均質1分鐘，再以篩網過濾去除緩衝溶液。再加入600mL新鮮的100mM pH 7.0的磷酸鹽緩衝溶液，以高速乳化均質機(高頓公司，型號：HM25)在6,000rpm下均質5分鐘。以篩網過濾去除緩衝溶液後，重複加入3000mL新鮮緩衝溶液的清洗步驟數次，直至緩衝溶液有穩定酸鹼值至pH 7.00±0.10，將過濾後所得的膠體秤重，再將其分成5等分，分別以10倍膠體重量之100mM之目標pH值(pH 7.00、pH 6.80、pH 6.50、pH 6.30及pH 6.00)的緩衝溶液清洗，再以0.1N鹽酸或氫氧化鈉水溶液滴定至溶液有穩定的酸鹼值(pH 7.00、pH 6.80、pH 6.50、pH 6.30及pH 6.00)。將所得透明質酸顆粒以篩網過濾去除溶液後，充填於1mL針筒並以121℃蒸汽及不同的固定時間下進行加熱，交聯的透明質酸顆粒將轉變成透明質酸凝膠。21天、28天、35天及42天之反應天數的反應，則重複上述步驟，僅有低溫反應的時間(天數)不同，其餘操作的條件皆相同。所得之交聯透明質酸凝膠經過微生物無菌試驗培養十四天，證實是無微生物生長，呈陰性反應。
表1：-10℃反應溫度、0.58N HCl反應濃度下，自體交聯透明質酸凝膠的合成條件及性質
Figure 111133781-A0305-02-0024-1
Figure 111133781-A0305-02-0025-2
實施例2：透明質酸反應濃度14.5wt%、反應的酸濃度1.0N HCl、反應溫度-10℃
除加入53.47克蒸餾水、14.53克6N鹽酸，反應天數為14天、21天、28天外，其餘反應條件同實施例1。
Figure 111133781-A0305-02-0025-3
Figure 111133781-A0305-02-0026-4
實施例3：透明質酸反應濃度14.5wt%、反應的酸濃度0.58N HCl、反應溫度-20℃
除反應溫度為-20℃及反應天數為14天、21天、28天、35天外，其餘反應條件同實施例1。
Figure 111133781-A0305-02-0026-5
Figure 111133781-A0305-02-0027-6
實施例4：透明質酸反應濃度14.5wt%、反應的酸濃度1.5N HCl、反應溫度-20℃
除加入46.18克蒸餾水、21.82克6N鹽酸，反應天數為7天、14天、21天及28天外，其餘反應條件同實施例1。
Figure 111133781-A0305-02-0027-10
Figure 111133781-A0305-02-0028-8
實施例5：透明質酸反應濃度14.5wt%、反應的酸濃度1.0N HCl、反應溫度-30℃
除反應溫度為-30℃及反應天數為14天、21天、28天、35天外，其餘反應條件同實施例2。
Figure 111133781-A0305-02-0028-9
Figure 111133781-A0305-02-0029-11
實施例6：透明質酸反應濃度14.5wt%、反應的酸濃度1.5N HCl、反應溫度-30℃
除反應溫度為-30℃及反應天數為14天、21天、28天、35天外，其餘反應條件同實施例4。
Figure 111133781-A0305-02-0029-12
Figure 111133781-A0305-02-0030-13
實施例7：透明質酸反應濃度10wt%、反應的酸濃度0.58N HCl、反應溫度-10℃
除加入8.3克透明質酸、63.27克蒸餾水、8.43克6N鹽酸反應天數為7天、14天、21天、28天外，其餘反應條件同實施例1。
Figure 111133781-A0305-02-0030-25
Figure 111133781-A0305-02-0031-15
實施例8：透明質酸反應濃度10wt%、反應的酸濃度1.0N HCl、反應溫度-10℃
除加入57.17克蒸餾水、14.53克6N鹽酸反應天數為14天、21天、28天外，其餘反應條件同實施例7。
Figure 111133781-A0305-02-0031-16
Figure 111133781-A0305-02-0032-17
實施例9：透明質酸反應濃度10wt%、反應的酸濃度0.58N HCl、反應溫度-20℃
除反應溫度為-20℃及反應天數為7天、14天、21天、28外，其餘反應條件同實施例7。
表9：-20℃反應溫度、0.58N HCl反應濃度下，自體交聯透明質酸凝膠的合成條件及性質
Figure 111133781-A0305-02-0033-18
實施例10：透明質酸反應濃度10wt%、反應的酸濃度1.0N HCl、反應溫度-20℃
除反應溫度為-20℃外，其餘反應條件同實施例8。
表10：-20℃反應溫度、1.0N HCl反應濃度下，自體交聯透明質酸凝膠的合成條件及性質
Figure 111133781-A0305-02-0034-19
實施例11：透明質酸反應濃度10wt%、反應的酸濃度0.58N HCl、反應溫度-30℃
除反應溫度為-30℃及反應天數為14天、21天、28天、35 天，其餘反應條件同實施例7。
Figure 111133781-A0305-02-0035-20
實施例12：透明質酸反應濃度10wt%、反應的酸濃度1.0N HCl、反應溫度-30℃
除反應溫度為-30℃及反應天數為14天、21天、28天，其餘反應條件同實施例8。
Figure 111133781-A0305-02-0036-21
各實施例之物性示於表13及圖1至5。
Figure 111133781-A0305-02-0036-22
Figure 111133781-A0305-02-0037-23
實施例13：動物試驗的樣品製備及動物試驗的進行
體重約360至390克之雄性Wistar大白鼠經過7天檢疫期。室內溫度控制在24℃、濕度保持60-70%，並控制光週期12小時光照及12小時黑夜。動物飼養於壓克力專用飼育籠中，並給予自由獲得飼料和水。大白鼠於isoflurane進行全身麻醉，且為避免老鼠因術後感染死亡，手術全程使用之器械需事先經高溫滅菌。所有動物實驗的操作和使用均遵照美國生理學協會動物照護和使用指導原則。
動物試驗模式Spicer等人(“Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect”,nature protocols,Vol.7,no.10,pp.1918-1929(2012))和Chen等人所使用的方法(“Bone Formation Using Cross-Linked Chitosan Scaffolds in Rat Calvarial Defects”,Implant Dent.,Vol/27,no.6,pp.1-7(2017))。首先，利用氣體麻醉劑異氟烷(isoflourane)進行動物麻醉，剃毛後用優碘和70%酒精消毒手術區域，再注射ampicillin。接著用已滅菌的擦手紙剪一個洞覆蓋在大鼠頭上，只露出手術區域。於頭的正上方，切開皮膚和骨膜約1.5公分大小。利用骨膜剝離器分開頭骨和骨膜。頭蓋骨上正中央有一條隆起，是為中軸矢狀縫，兩側為頂骨，以此矢狀縫為中心在正中央以直徑5毫米骨環鑽鋸頭(trephine bur)製造直徑5毫米之骨缺損，並視組別需求敷上基質，最後覆蓋上Bio-Gide membrane(3M,Geistlich Bio-Oss®,Switzerland)。接著以5-0羊腸線縫合骨膜後再用4-0尼龍線縫合皮膚。手術中動物如果有從麻醉狀態中甦醒情形，則以氣體麻醉機經由呼吸面罩讓動物吸入麻醉氣體維持。
手術後分別植入0.15至0.2克之直鏈透明質酸(2.05wt%)和 不同透明質酸含量的自體交聯透明質酸凝膠，以及正控制組(CoreBone1000骨粉)，最後再覆蓋Bio-Gide membrane。於三個月後將動物犧牲進行電腦斷層掃描。動物試驗樣品的製備條件及樣品性質，依據表14所示。
Figure 111133781-A0305-02-0039-24
實驗進行3個月後將動物犧牲。將大鼠深度麻醉後將頭蓋骨取下，首先以10%三聚甲醛(paraformaldehyde)浸泡四天固定樣本，然後送至台灣小鼠診所(Taiwan Mouse Clinic(TMC),Taiwan)，以SkyScan 1076微型CT(micro-CT,SkyScan 1076,Bruker,Antwerp,Belgium)三維成像系統進行掃描分析。參數設定為Image Pixel Size(um)=9,Source Voltage(kV)=70,Source Current(uA)=200,Filter=Al 0.5mm,Exposure(ms)=453,Rotation Step(deg)=0.2。Region of Interest(ROI)：直徑5.5 mm X高0.5mm。利用矢狀斷層影像與組織型態學分析Micro-CT之掃描數據。數據則以新生骨佔比(Bone volume/Total volume,BV/TV(%))來評估骨質新生之量化。
其結果示於圖6，可知控制組和對照組的新生骨佔比最低，分別是在21%及40%，實驗組1至4則分別為48%、61%、49%及57%，正對照組則為45%。因此本揭示之自體交聯透明質酸凝膠具有比市售品(正對照組)、直鏈透明質酸凝膠及控制組有更好的新生骨的再生功能。
上述實施例僅為說明本揭示之原理及其功效，而非限制本揭示。本揭示所屬技術領域中具通常知識者對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本揭示之精神。本揭示之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。

Claims (15)

  1. 一種製造自體交聯透明質酸凝膠(gel)之方法，其包含：(a)提供透明質酸或其金屬鹽膠體(colloid)；(b)混合該膠體及酸，並於約-10℃至約-30℃反應約7日至約42日，其中該透明質酸或其金屬鹽膠體之反應濃度為約10wt%至約30wt%；(c)將步驟(b)之產物進行高溫蒸汽處理，以獲得該自體交聯透明質酸凝膠；其中該自體交聯透明質酸凝膠之損耗正切δ(loss tangent，tan δ)小於或等於1，量測條件為該自體交聯透明質酸凝膠包含約1.5wt%至約7.5wt%之透明質酸時，於25℃及0.1赫茲至10.0赫茲測量頻率量測所得。
  2. 如請求項1之方法，其不使用交聯劑。
  3. 如請求項1之方法，其中步驟(b)中該酸之反應濃度為自約0.5N至約1.5N。
  4. 根據請求項1之方法，其中該酸係為鹽酸、硝酸或硫酸。
  5. 根據請求項1之方法，其中步驟(b)係於室溫混合該透明質酸或其金屬鹽膠體及酸，並於約-10℃至約-30℃靜置反應約7日至約42日。
  6. 如請求項1之方法，其中步驟(b)為：該酸之反應濃度為自約0.58N至約1.0N，於約-10℃反應約7天至約42天；該酸之反應濃度為自約0.58N至約1.5N，於約-20℃反應約7天至約35天；該酸之反應濃度為自約0.58N至約1.0N，於約-20℃反應約7天至約28天；該酸之反應濃度為自約1.0N至約1.5N，於約-30℃反應約14天至約35天；或該酸之反應濃度為自約0.58N至約1.0N，於約-30℃反應約14天至約35天。
  7. 根據請求項1之方法，其中步驟(b)於約-10℃至約-30℃反應為連續反應，且該方法僅包含於約-10℃至約-30℃反應一次。
  8. 如請求項1之方法，其中步驟(c)前另包含將步驟(b)所得之產物均質及/或清洗中和之步驟。
  9. 如請求項1之方法，其中步驟(c)前，膠體之平衡溶脹倍率於自約12至約30及/或平均粒徑於自約200μm至約3000μm。
  10. 如請求項1之方法，其中步驟(c)前，另包含將步驟(b)產物pH值調整至自約6.0至約7.0。
  11. 如請求項1之方法，其中步驟(c)前，另包含將步驟(b)產物pH值調整至自約6.3至約6.8。
  12. 如請求項1之方法，其中步驟(c)之高溫蒸汽處理為自約110℃至約130℃蒸汽下處理約10分鐘至約60分鐘。
  13. 根據請求項1至12任何一項之方法，其中當該自體交聯透明質酸凝膠包含約1.5wt%至約7.5wt%之透明質酸時，於25℃及1.0赫茲量測該自體交聯透明質酸凝膠之彈性模數於自約30Pa至約8000Pa及/或黏性模數於自約20Pa至約2000Pa；在25℃及剪切速率為1秒-1時剪切黏度為自約20Pa．s至約900Pa．s。
  14. 一種自體交聯透明質酸凝膠，其中該自體交聯透明質酸凝膠之損耗正切δ小於或等於1，量測條件為該自體交聯透明質酸凝膠包含約1.5wt%至約7.5wt%之透明質酸時，於25℃及0.1赫茲至10.0赫茲測量頻率量測所得，且經微生物測試為無菌，其中當該自體交聯透明質酸凝膠包含約1.5wt%至約7.5wt%之透明質酸時，於25℃及1.0赫茲量測該自體交聯透明質酸凝膠之彈性模數於自約30Pa至約8000Pa及/或黏性模數於自約20Pa至約2000Pa；在25℃及剪切速率為1秒-1時剪切黏度為自約20Pa．s至約900Pa．s。
  15. 一種根據請求項14之自體交聯透明質酸凝膠之用途，其係用以製造用以治療骨的再生與缺陷、術後防沾黏、皮下填充及/或關節病的藥物。
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