TWI736550B - 製備ｐａｒｐ抑制劑、結晶形式的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明涉及製備Parp1/2抑制劑，即(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮(在下文中稱為化合物A)的方法，化合物A或其水合物或溶劑化物的結晶形式(多晶型物)，尤其是化合物A倍半水合物的結晶形式C，製備所述結晶形式的方法及其用途。

Description

製備PARP抑制劑、結晶形式的方法及其用途

本發明涉及製備Parp1/2抑制劑，即(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮(在下文中稱為化合物A)的方法，化合物A或其水合物或溶劑化物的結晶形式(多晶型物)，尤其是化合物A倍半水合物的結晶形式C，製備所述結晶形式的方法及其用途。

癌症的特點和驅動力之一是遺傳不穩定性[Hanahan D and Weinberg R A,Hallmarks of cancer：the next generation.Cell,2011.144(5)：p.646-74.]。特別是在家族性癌症中，乳腺癌易感性BRCA1和BRCA2腫瘤抑制基因中的突變(同源重組(HR)中的關鍵因素)已與發展乳腺癌或卵巢癌的風險增加相關[Li X and Heyer W D,Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance.Cell Res,2008.18(1)：p.99-113.]。正是在該患者群體中多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的抑制劑最近獲得關注。PARP家族成員PARP1和PARP2在DNA複製、轉錄調控和DNA損傷修復中發揮著重要作用[Rouleau M,Patel A,Hendzel M J,et al.,PARP inhibition：PARP1 and beyond.Nat Rev Cancer,2010.10(4)：p.293-301.]。在2005年，兩篇突破性的《自然》雜誌(Nature)文章表明單獨投予的PARP抑制劑可殺死癌細胞，所述癌細胞具有先前存在的DNA修復缺陷，特別是BRCA1/2基因的突變[Bryant H E,Schultz N,Thomas H D,et al.,Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose)polymerase.Nature,2005.434(7035)：p.913-7；Farmer H,McCabe N,Lord C J,et al.,Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.Nature,2005.434(7035)：p.917-21]。

PARP抑制和突變的BRCA在臨床前模型中綜合起來是致命的，表明這是一種簡潔的、具有靶向性且毒性最小的治療患者的方式。

近幾年臨床中對PARP抑制劑的測試以指數方式增長。這些臨床試驗以使用PARP抑制劑作為單一藥物或與另一種DNA損傷劑的組合作為起始來治療遺傳性腫瘤，並且現已轉而用於治療多種不同類型的散發性腫瘤。當發現奧拉帕尼(olaparib)(AZD2281,KU0059436；AstraZeneca/KuDOS)在患有BRCA-缺陷性乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌的患者中具有活性時，再次對有關PARP抑制劑產生了最初的興奮[Fong P C,Boss D S,Yap T A,et al.,Inhibition of poly(ADP-ribose)polymerase in tumors from BRCA mutation carriers.N Engl J Med,2009.361(2)：p.123-34.]。在這些特定患者中具有最小的不良事件(AE)並且BRCA攜帶者中AE的頻率相比於非攜帶者沒有增加。隨後在卵巢癌和乳腺癌患者中的概念驗證性(proof-of-concept)II期試驗證實了該組BRCA突變的癌症患者中奧拉帕尼的響應以及低的副作用特徵[Audeh M W,Carmichael J,Penson R T,et al.,Oral poly(ADP-ribose)polymerase inhibitor olaparib in patients with BRCA1 or BRCA2 mutations and recurrent ovarian cancer：a proof-of-concept trial.Lancet,2010.376(9737)：p.245-51；Tutt A,Robson M,Garber J E,et al.,Oral poly(ADP-ribose)polymerase inhibitor olaparib in patients with BRCA1 or BRCA2 mutations and advanced breast cancer：a proof-of-concept trial.Lancet,2010.376(9737)：p.235-44.]。

令人感興趣的是，攜帶BRCA1/2突變的卵巢癌患者對PARP抑制劑的響應與其對先前鉑療法的敏感性相關[Fong P C,Yap T A,Boss D S,et al.,Poly(ADP)-ribose polymerase inhibition：frequent durable responses in BRCA carrier ovarian cancer correlating with platinum-free interval.J Clin Oncol,2010.28(15)：p.2512-9.]。與鉑敏感性的類似相關也見於不具有BRCA突變的高度嚴重性卵巢癌患者中[Gelmon K A,Tischkowitz M,Mackay H,et al.,Olaparib in patients with recurrent high-grade serous or poorly differentiated ovarian carcinoma or triple-negative breast cancer：a phase 2,multicentre,open-label,non-randomised study.Lancet Oncol,2011.12(9)：p.852-61.]。另一項II期臨床研究已表明奧拉帕尼作為維持療法在對鉑敏感的患有復發的高度嚴重性卵巢癌患者中是有益的[Ledermann J,Harter P,Gourley C,et al.,Olaparib maintenance therapy in platinum-sensitive relapsed ovarian cancer.N Engl J Med,2012.366(15)：p.1382-92.]。基於這些數據，針對奧拉帕尼在乳腺癌和卵巢癌患者中的III期注册試驗已經啟動。

在最近的II期研究中，當在一線治療後進展的患有復發及轉移性胃癌患者中與紫杉醇(paclitaxel)聯合投予時，奧拉帕尼展示了良好的臨床活性[Bang Y-J,Im S-A,Lee K-W,et al.,Olaparib plus paclitaxel in patients with recurrent or metastatic gastric cancer：A randomized,double-blind phase II study.J Clin Oncol,2013.31(suppl；abstr 4013).]。符合條件的患者藉由其共濟失調-毛細血管擴張症突變(ATM)狀態進行分組(stratify)。與紫杉醇單一藥物相比，紫杉醇/奧拉帕尼組合延長了患者的總體存活期(OS)，尤其是在ATM低的亞組中。ATM是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其在DNA損傷誘導的信號傳導和對DNA損傷劑諸如電離放射響應的細胞周期檢查點的啟動中發揮著關鍵作用[Stracker T H,Roig I, Knobel P A,et al.,The ATM signaling network in development and disease.Front Genet,2013.4：p.37.]。

在2014年12月19日，美國食品藥品監督管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准了奧拉帕尼膠囊(Lynparza,AstraZeneca Pharmaceuticals LP)作為用於治療具有有害或疑似有害的種系BRCA突變的(gBRCAm)(如藉由FDA批准的測試所檢測)晚期卵巢癌的患者的單一療法，所述患者已經用三種或更多種在先行列的化學療法治療。與該舉動同時的是，FDA批准了BRACAnalysis CDx(Myriad Genetics)用於BRCA1和BRCA2基因中變異體的定量檢測和分類。

臨床上還有幾種其它研究中的PARP抑制劑，包括維利帕尼(veliparib)(ABT-888；Abbott Laboratories)、瑞卡帕布(rucaparib)(AG014669；Clovis)、尼拉帕尼(niraparib)(MK-4827；Tesaro)、BMN-673(Biomarin)、CEP-9722(Cephalon)和E7016(Eisai)。所有這些PARP抑制劑在其效能、選擇性和DNA捕獲活性態樣是不同的。最近的報導表明藉由PARP-抑制劑複合物的DNA捕獲是PARP抑制劑經其在細胞中誘導細胞毒性的主要機制之一[Murai J,Huang S Y,Das B B,et al.,Trapping of PARP1 and PARP2 by Clinical PARP Inhibitors.Cancer Res,2012.72(21)：p.5588-99.]。維利帕尼是有效的PARP1/2抑制劑，但在BRCA突變細胞中具有弱的DNA捕獲活性和細胞毒性。大部分其臨床進展均已聚焦於與化學治療劑的組合。最近，II期試驗顯示向標準新輔助化學療法(neoadjuvant chemotherapy)中添加維利帕尼與卡鉑(carboplatin)的組合改善了患有三陰性乳腺癌的婦女的結果[Rugo H,Olopade O,DeMichele A,et al.,Veliparib/carboplatin plus standard neoadjuvant therapy for high-risk breast cancer：First efficacy results from the I-SPY 2 TRIAL.2013.Abstract S5-02.]。對於瑞卡帕布、尼拉帕尼和BMN-673，單一療法在BRCA突變癌症患者中已展示出良好的臨床活性[Shapiro G,Kristeleit R,Middleton M,et al.,Pharmacokinetics of orally administered rucaparib in patients with advanced solid tumors.Mol Cancer Ther,2013.12(11 Suppl)：Abstract nr A218；Michie C O,Sandhu S K,Schelman W R,et al.,Final results of the phase I trial of niraparib(MK4827),a poly(ADP)ribose polymerase(PARP)inhibitor incorporating proof of concept biomarker studies and expansion cohorts involving BRCA 1/2 mutation carriers,sporadic ovarian,and castration resistant prostate cancer(CRPC).J Clin Oncol,2013.31(suppl；abstr 2513)；Bono J S D,Mina L A,Gonzalez M,et al.,First-in-human trial of novel oral PARP inhibitor BMN 673 in patients with solid tumors.J Clin Oncol,2013.31(suppl；abstr 2580)]。

目前在具有BRCA突變或鉑敏感性疾病的乳腺癌和/或卵巢癌患者中進行針對這些PARP抑制劑的III期臨床試驗。

(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮(或“化合物A”)為高選擇性PARP1/2抑制劑。化合物A有效地抑制細胞內PARP活性並特異性抑制具有BRCA1/2突變或其它HR缺陷的細胞系的增殖。化合物A在比奧拉帕尼低的多的劑量下顯著誘導BRCA1突變乳腺癌異種移植物模型中的腫瘤消退。化合物A具有卓越的DMPK性質和顯著的腦滲透性。

臨床前生化研究、基於細胞的研究和動物研究中產生的數據表明化合物A可在抑制具有BRCA基因突變或同源性重組缺陷的腫瘤中提供顯著的患者益處。化合物A具有良好腦滲透性且可在更多適應症諸如成膠質細胞瘤中顯示出活性。這些獨特的特徵使得有必要在臨床研究中進一步評價化合物A。

游離鹼，即(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮(或“化合物A”)已被披露為高選擇性且有效的Parp1/2抑制劑，參見WO 2013/097225 A1，藉由引用的方式將其並入本申請。

化合物A為具有一個季碳對掌性中心的多環稠合的複雜分子。呈游離鹼形式的化合物A最初藉由“對掌性池(chiral pool)”方法獲得，該方法非常低效且難以放大(scale-up)，因為針對中間體和終產物的純化需要多個層析柱。此外，由於在製造過程中發生部分消旋化(雖然潛在的原因仍不確定)，因此以此種方式製備的化合物具有不令人滿意的光學純度。因此，非常需要一種適於大規模製備化合物A(尤其是其結晶形式)且具有用於製劑開發的重複性和良好品質的方法。

本申請的公開內容解决了上述挑戰和需要。

在第一態樣，本申請提供了大規模製備呈游離鹼形式的化合物A的方法，其避免了使用針對純化中間體和終產物的多個層析柱且因此具有成本效益和商業益處。

在第二態樣，本申請提供了化合物A或其水合物或其溶劑化物的結晶形式，其具有適於藥物製劑的優異的物理性質且可以高質量和良好的可再現性進行商業大規模製備。

發明人預料不到且令人驚訝地發現化合物A的游離鹼可形成呈結晶形式的水合物和/或溶劑化物，特別是呈結晶形式的倍半水合物。具體地，令人驚訝地發現化合物A游離鹼水合物/溶劑化物可以多種結晶形式(多晶型物)存在，其在本申請中稱為結晶形式A、B、C、C*、C**、D、E、F、G、H、I、J、K和L。化合物A游離鹼及其水合物/溶劑化物的結晶形式，特別是結晶形式C， 相比於所篩選的其它鹽而言具有優異的性質，諸如優良的化學穩定性，特別是長期化學/物理穩定性，這使其成為製劑和臨床應用的合適API候選物。結晶形式C(即化合物A倍半水合物)在水中具有低溶解度(約0.04mg/mL)。所述在水中的低溶解度簡化了大規模製備API的方法，因為API的重結晶和漿化可在水/醇溶液中完成。相當令人驚訝的是，其在低pH水性介質諸如模擬胃液(SGF，例如，約4.5mg/mL,pH=1.2)中的溶解度使得在胃中的快速溶出成為可能且可在動物和人中獲得良好的藥物吸收。在水中的低溶解度和高結晶穩定性還使得化合物A倍半水合物結晶形式C特別適於藥品生產中的濕法製粒和包衣方法。

因此，在一個態樣，本發明提供了式I的化合物，其為化合物A的水合物/溶劑化物：

其中n為約0.0至約2.0的數字；m為約0.0至約20.0的數字；且其中所述溶劑為異丙醇、乙醇、甲醇、丙酮、THF、1,4-二噁烷、乙酸、乙腈、水或它們的組合。

在另一實施方案中，本發明提供了式II的化合物，其為化合物A的水合物：

其中n為約0.0至約2.0的數字。

在另一優選的實施方案中，式II的化合物呈結晶形式。

在另一優選的實施方案中，n為約1.5，且所述化合物為式III的(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮的結晶倍半水合物：

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式A，其特徵在於粉末X射線線衍射圖包括具有獨立選自由下列組成之群組的2θ角值的三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或更多個衍射峰：6.3±0.2°、8.5±0.2°、8.6±0.2°、9.9±0.2°、10.4±0.2°、11.0±0.2°、11.1±0.2°、12.6±0.2°、12.8±0.2°、14.7±0.2°、18.0±0.2°、18.1±0.2°、20.1±0.2°、21.4±0.2°、22.2±0.2°、24.6±0.2°、25.7±0.2°和30.0±0.2°。

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式B，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有獨立選自由下列組成之群組的2θ角值的三個、四個、五個、六個、七個或更多個衍射峰：6.3±0.2°、8.7±0.2°、11.1±0.2°、12.6±0.2°、14.5±0.2°、14.8±0.2°、15.2±0.2°、18.0±0.2°、23.9±0.2°、25.3±0.2°和25.8±0.2°。

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式C，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有獨立選自由下列組成之群組的2θ角值的三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或更多個衍射峰：5.3±0.2°、6.3±0.2°、6.5±0.2°、6.9±0.2°、8.7±0.2°、10.6±0.2°、11.1±0.2°、11.6±0.2°、12.6±0.2°、13.1±0.2°、13.7±0.2°、 14.4±0.2°、14.8±0.2°、15.1±0.2°、15.9±0.2°、16.2±0.2°、17.3±0.2°、18.0±0.2°、18.7±0.2°、19.0±0.2°、19.4±0.2°、20.2±0.2°、20.6±0.2°、21.0±0.2°、2±0.2°、21.5±0.2°、22.3±0.2°、22.7±0.2°、23.4±0.2°、23.8±0.2°、24.3±0.2°、24.7±0.2°、25.3±0.2°、25.7±0.2°、26.1±0.2°、26.4±0.2°、27.4±0.2°。

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式C*，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有獨立選自由下列組成之群組的2θ角值的三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或更多個衍射峰：6.1±0.2°、6.3±0.2°、6.9±0.2°、8.5±0.2°、11.1±0.2°、11.6±0.2°、13.2±0.2°、14.5±0.2°、15.2±0.2°、16.3±0.2°、18.1±0.2°、20.3±0.2°、22.5±0.2°、24.8±0.2°、26.1±0.2°、26.6±0.2°和27.7±0.2°。

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式D，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有獨立選自由下列組成之群組的2θ角值的三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或更多個衍射峰：5.7±0.2°、6.4±0.2°、6.8±0.2°、9.3±0.2°、9.8±0.2°、10.3±0.2°、11.5±0.2°、12.4±0.2°、12.9±0.2°、13.4±0.2,13.9±0.2°、17.8±0.2°、18.3±0.2°、18.8±0.2°、18.9±0.2°、23.7±0.2°、25.0±0.2°、25.7±0.2°、25.9±0.2°和26.7±0.2°。

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式E，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有獨立選自由下列組成之群組的2θ角值的三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或更多個衍射峰：6.2±0.2°、8.6±0.2°、9.5±0.2°、11.0±0.2°、11.5±0.2°、12.0±0.2°、12.5±0.2°、13.4±0.2°、13.8±0.2°、14.4±0.2°、14.7±0.2°、15.1±0.2°、15.3±0.2°、16.2±0.2°、16.9±0.2°、17.9±0.2°、18.3±0.2°、19.0±0.2°、19.5±0.2°、20.1±0.2°、21.3±0.2°、22.2±0.2°、22.9±0.2°、23.3±0.2°、24.2±0.2°、24.6±0.2°、25.1±0.2°、25.7±0.2°、26.3±0.2°、27.0±0.2°、27.4±0.2°和30.9±0.2°。

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式F，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有獨立選自由下列組成之群組的2θ角值的三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或更多個衍射峰：5.2±0.2°、6.3±0.2°、7.7±0.2°、9.7±0.2°、10.4±0.2°、11.8±0.2°、13.7±0.2°、15.6±0.2°、17.5±0.2°、18.0±0.2°、19.5±0.2°、20.2±0.2°、21.7±0.2°、23.1±0.2°、24.7±0.2°、25.3±0.2°和27.3±0.2°。

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式G，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有獨立選自由下列組成之群組的2θ角值的三個、四個、五個或更多個衍射峰：6.3±0.2°、8.6±0.2°、9.6±0.2°、10.3±0.2°、11.0±0.2°、12.6±0.2°、17.5±0.2°和25.4±0.2°。

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式H，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有獨立選自由下列組成之群組的2θ角值的三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或更多個衍射峰：9.5±0.2°、12.0±0.2°、13.5±0.2°、15.4±0.2°、17.0±0.2°、19.0±0.2°、23.0±0.2°、24.2±0.2°、27.0±0.2°、27.4±0.2°、31.0±0.2°、34.7±0.2°和34.8±0.2°。

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式I，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有獨立選自由下列組成之群組的2θ角值的三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或更多個衍射峰：9.8±0.2°、10.0±0.2°、11.1±0.2°、11.7±0.2°、12.9±0.2°、13.3±0.2°、13.9±0.2°、14.4±0.2°、17.1±0.2°、17.4±0.2°、17.6±0.2°、17.9±0.2°、18.4±0.2°、18.5±0.2°、19.4±0.2°、20.8±0.2°、21.9±0.2°、23.7±0.2°、26.4±0.2°、26.9±0.2°和29.4±0.2°。

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式J，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有獨立選自由下列組成之群組的2θ角值的三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或更多個衍射峰：6.4±0.2°、8.7±0.2°、9.9±0.2°、10.3±0.2°、 11.7±0.2°、12.8±0.2°、13.9±0.2°、18.1±0.2°、19.3±0.2°、23.0±0.2°、23.8±0.2°和25.8±0.2°。

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式K，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有獨立選自由下列組成之群組的2θ角值的三個、四個、五個、六個、七個或更多個衍射峰：6.4±0.2°、10.8±0.2°、12.6±0.2°、12.8±0.2°、19.2±0.2°、25.2±0.2°、25.8±0.2°、32.4±0.2°和34.1±0.2°。

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式L，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有獨立選自由下列組成之群組的2θ角值的三個、四個或更多個衍射峰：6.8±0.2°、17.8±0.2°、20.6±0.2°、23.4±0.2°和27.6±0.2°。

在另一實施方案中，式II的化合物呈結晶形式，其基本上特徵在於如選自由下列組成之群組的粉末X射線衍射圖：圖5、6、7A、7B、8、9、10、11、12、13、14、15和16。

在另一態樣，本發明提供了製備式III的化合物A倍半水合物的結晶形式的方法，其包括以下步驟中的任一項：(a)使(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮的游離鹼溶於溶劑或溶劑混合物中以形成溶液或混懸液；並使(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮倍半水合物以目標結晶形式析出；(b)使(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮倍半水合物溶於或混懸於溶劑或溶劑混合物中；並使(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮溶劑化物/水合物以目標結晶形式析出； (c)儲存結晶(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮水合物/溶劑化物達較長的一段時間以獲得目標結晶形式；(d)加熱結晶(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮水合物/溶劑化物至高溫，並冷却所述水合物以獲得目標結晶形式；和(e)使結晶(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮水合物/溶劑化物暴露於溶劑的蒸氣以獲得目標結晶形式。

在該態樣的一個實施方案中，化合物A的游離鹼視情况地與拆分劑(諸如對掌性酸，例如，(+)-二-對甲基苯甲醯基-D-酒石酸)於適當溶劑(諸如，醇，進一步諸如異丙醇)中在鹼(alkaline)存在下反應，然後進行步驟(a)。

在該態樣的一個實施方案中，步驟(a)或(b)還包括獨立選自由下列組成之群組的一個或多個步驟：加熱、過濾除去不溶性雜質、蒸餾溶劑、添加反萃溶劑或溶劑混合物、添加晶種、添加一種或多種析晶誘導劑、冷却、析晶和過濾收集結晶產物。

在該態樣的另一實施方案中，在步驟(a)或(b)中，所述溶劑或溶劑混合物選自由下列組成之群組：水、低級烷基醇、酮、醚、酯、低級脂族羧酸、低級脂族腈、視情况鹵代的芳香溶劑以及它們的組合。

在該態樣的另一實施方案中，在步驟(a)或(b)中，所述溶劑為異丙醇、乙醇、甲醇、丙酮、THF、1,4-二噁烷、乙酸、乙腈、水或它們的組合。

在該態樣的另一實施方案中，在步驟(a)中，所述溶劑為水與以下中任一種的混合物：異丙醇、乙醇、甲醇、丙酮、THF、1,4-二噁烷、乙酸或乙腈。在該態樣的另一實施方案中，在步驟(a)中，所述溶劑為水與異丙醇的混合物。

在該態樣的另一實施方案中，在步驟(a)中，所述游離鹼為經分離且純化的游離鹼、經分離但未純化的游離鹼或含有游離鹼的粗反應產物。

在該態樣的另一實施方案中，在步驟(c)中，所述較長的一段時間為至少三天、至少一周或至少兩周。

在該態樣的另一實施方案中，在步驟(d)中，所述高溫為至少40℃、至少60℃、至少80℃或至少100℃，但低於所述倍半水合物的分解溫度。

在該態樣的另一實施方案中，在步驟(e)中，所述蒸氣為乙酸的蒸氣。

在該態樣的另一實施方案中，所述方法選自由下列組成之群組：1)步驟(a)或(b)，其使用異丙醇-水(v/v=20/40)作為溶劑以產生結晶形式C**；2)步驟(a)或(b)，其使用MTBE作為溶劑以產生結晶形式B；3)步驟(a)或(b)，其使用i-PrOH/H₂O作為溶劑以產生結晶形式C或C*；4)步驟(c)，其將甲苯加至HOAc中作為溶劑以產生結晶形式D；5)步驟(d)，其使結晶形式A與DMA蒸氣相互作用以產生結晶形式E；6)步驟(e)，其使結晶形式A與乙酸蒸氣相互作用以產生結晶形式F；7)步驟(d)，其使結晶形式A(De/ad)在DVS中吸附以產生結晶形式G；8)步驟(d)，其加熱結晶形式E至80℃以產生結晶形式H；9)步驟(d)，其加熱結晶形式E至150℃以產生結晶形式I；10)步驟(d)，其加熱結晶形式A至150℃以產生結晶形式J；11)步驟(e)，其使結晶形式A與MeOH蒸氣相互作用以產生結晶形式K；12)步驟(d)，其加熱結晶形式K至150℃以產生結晶形式L。

在一些實施方案中，本發明提供了製備結晶形式C(即，化合物A倍半水合物)的方法，包括在低於回流溫度的溫度混合，例如在約80℃使化合物A 在i-PrOH和H₂O的混合溶劑中混合；或在低於回流溫度的溫度混合，例如在約70℃使化合物A在i-PrOH和H₂O的混合溶劑中混合；或在低於回流溫度的溫度混合，例如在約50℃使化合物A在i-PrOH和H₂O的混合溶劑中混合，其中如i-PrOH和水的總體積計，i-PrOH的量大於40vol%，優選60vol%，且更優選90vol%。在某些優選的實施方案中，用i-PrOH替代上面提及的混合溶劑。在其它實施方案中，所述方法還包括在冷却至室溫後將晶種添加至所得混合物中，然後使所述混合物靜置一段時間，諸如12小時、24小時、2天、3天或4天或1周、2周。

本發明的另一目的是提供用於製備式I、式II和式III的化合物(化合物A倍半水合物-結晶形式C)的可調整的合成方法。

在另一態樣，本發明提供了一種醫藥組合物，其包含根據本申請所述的任一實施方案的式I或式II或式III的化合物和醫藥上可接受之載體。

在一個實施方案中，所述醫藥組合物適於口服投予。

在另一實施方案中，所述醫藥組合物呈片劑或膠囊的形式。

在另一實施方案中，所述片劑或膠囊的單位劑量為1-160mg。

在另一實施方案中，醫藥組合物中化合物的重量百分比為1-99%。

在另一態樣，本發明提供了治療或預防患者的疾病或病症的方法，包括對所述患者投予治療有效量的根據本申請所述的任一實施方案的式I或式II或式III的化合物或包含式I或式II或式III的化合物的醫藥組合物。

在一個實施方案中，所述疾病或病症為選自由下列組成之群組的癌症：腦癌、肺癌(包括小細胞肺癌)、腎癌、骨癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸癌、卵巢癌、黑素瘤、皮膚癌、腎上腺癌、子宮頸癌、淋巴瘤或甲狀腺腫瘤以及它們的併發症。

在另一實施方案中，所述疾病選自BRCA1和BRCA2突變的乳腺癌、卵巢癌、胃癌以及它們的併發症。

在另一實施方案中，化合物的投予劑量為5-320mg/天，且投予頻率為每日一至三次。

在另一實施方案中，化合物的投予劑量為5-240mg/天，且投予頻率為每日一至三次。

在另一實施方案中，化合物的投予劑量為10-200mg/天，且投予頻率為每日兩次。

在另一實施方案中，所述化合物為(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮游離鹼或其溶劑化物或水合物，其呈選自由下列組成之群組的結晶形式：結晶形式A、B、C、C*、C**、D、E、F、G、H、I、J、K和L。

在另一態樣，本發明提供了根據本申請所述的任一實施方案的式I或式II或式III的化合物在製備用於治療與BRCA1和BRCA2突變體活性和HR-缺陷相關的疾病或病症的藥物中的用途。

在優選的實施方案中，所述疾病為病症。

本發明的這些和其它態樣將在參照以下附圖、具體實施方式和權利要求而得到更好的理解。

圖1示出化合物A的絕對結構(absolute structure)。

圖2示出呈單晶形式的化合物A倍半水合物的結晶形式C**的晶胞。

圖3圖示說明呈單晶形式的化合物A倍半水合物的結晶形式C**的氫鍵。

圖4示出呈單晶形式的化合物A倍半水合物的結晶形式C**的模擬性和實驗性XRPD圖。

圖5示出化合物A的結晶形式A(藉由從異丙醇/水中重結晶獲得)的X射線衍射圖。

圖6示出化合物A的結晶形式B的X射線衍射圖。

圖7A和7B分別示出化合物A倍半水合物的結晶形式C和C*的X射線衍射圖，其中結晶形式C如實例1所公開藉由從異丙醇/水中重結晶以大規模製備，而結晶形式C*如實例5所公開以實驗室規模製備。

圖8示出化合物A的結晶形式D的X射線衍射圖。

圖9示出化合物A的結晶形式E的X射線衍射圖。

圖10示出化合物A的結晶形式F的X射線衍射圖。

圖11示出化合物A的結晶形式G的X射線衍射圖。

圖12示出化合物A的結晶形式H的X射線衍射圖。

圖13示出化合物A的結晶形式I的X射線衍射圖。

圖14示出化合物A的結晶形式J的X射線衍射圖。

圖15示出化合物A的結晶形式K的X射線衍射圖。

圖16示出化合物A的結晶形式L的X射線衍射圖。

圖17示出化合物A倍半水合物的結晶形式C的¹H-NMR譜。

圖18示出化合物A倍半水合物的結晶形式C的¹³C-NMR譜。

圖19示出化合物A倍半水合物的結晶形式C的DVS譜。

圖20示出化合物A倍半水合物的結晶形式C的TGA譜。

圖21示出化合物A倍半水合物的結晶形式C的DSC譜。

在一個態樣，本發明提供了呈單晶形式的化合物A倍半水合物的結晶形式C**。使用由藉由在室溫從IPA/水中蒸氣擴散而生長得到的單晶所採集的一組衍射數據，確定化合物A倍半水合物的結晶形式C**的結構為單晶。結晶數據和結構精修(structure refinement)列於表1。

使用一組由經在室溫從IPA/水蒸氣擴散生長得到的單晶所採集的衍射數據，已成功確定了化合物A倍半水合物的結晶形式C**的晶體結構。化合物A的絕對結構展示於圖1中。結果顯示獲得倍半水合物的單晶。確定了C4(R)的構型。呈單晶形式的化合物A倍半水合物的結晶形式C**的晶胞示於圖2中。呈單晶形式的化合物A倍半水合物的結晶形式C**的氫鍵示於圖3中。經氫鍵N11--H11...N5,N7--H7...O4和N15--H15...O2形成鋸齒鏈(zigzag chain)。這些鋸齒鏈藉由(N2--H2...O6,O6--H6A...N9,O9--H9A...N1和N6--H6...O9)之間的及在(O8--H8B...O5,N10--H10...O7,N14--H14...O8,O5--H5B...O1,O7--H7A...N8,O7--H7B...O5,O8--H8A...O3和O10--H10B...O3)之內的氫鍵連接，這些鏈形成三維結構。由單晶結構計算出的理論性XRPD圖和實驗性XRPD圖非常相似且展示於圖4中。

在另一實施方案中，本發明提供了化合物A的結晶形式A。如圖5所示，結晶形式A的X射線粉末衍射譜圖通常具有以下峰衍射角(其中“間距”在圖5中顯示為“d-值”)：

在另一實施方案中，本發明提供了化合物A的結晶形式B。如圖6所示，結晶形式B的X射線粉末衍射譜圖通常具有以下峰衍射角(其中“間距”在圖6中顯示為“d-值”)：

在另一實施方案中，本發明提供了化合物A(倍半水合物)的結晶形式C，其藉由實例1公開的方法以大規模製備。如圖7所示，結晶形式C的X射線粉末衍射譜圖通常具有以下峰衍射角(其中“間距”在圖7中顯示為“d-值”)：

在再一實施方案中，本發明提供了化合物A(倍半水合物)的結晶形式C*，其藉由實例5中公開的方法以實驗室規模製備。亦如圖7B所示，結晶形式C*的X射線粉末衍射譜圖通常具有以下峰衍射角(其中“間距”在圖7中顯示為“d-值”)：

化合物A倍半水合物的結晶形式C是具有大約50微米平均粒度(D90)的相當穩定的結晶形式，其可容易地配製成供臨床使用的藥物產品。如圖7A和7B所示，化合物A倍半水合物的結晶形式C和化合物A倍半水合物的結晶形式C*具有基本上相同的峰位置，而相對強度有所變化。

在另一實施方案中，本發明提供了化合物A的結晶形式D。如圖8所示，結晶形式D的X射線粉末衍射譜圖通常具有以下峰衍射角(其中“間距”在圖8中顯示為“d-值”)：

在另一實施方案中，本發明提供了化合物A的結晶形式E。如圖9所示，結晶形式E的X射線粉末衍射譜圖通常具有以下峰衍射角(其中“間距”在圖9中顯示為“d-值”)：

在另一實施方案中，本發明提供了化合物A的結晶形式F。如圖10所示，結晶形式F的X射線粉末衍射譜圖通常具有以下峰衍射角(其中“間距”在圖10中顯示為“d-值”)：

在另一實施方案中，本發明提供了化合物A的結晶形式G。如圖11所示，結晶形式G的X射線粉末衍射譜圖通常具有以下峰衍射角(其中“間距”在圖11中顯示為“d-值”)：

在另一實施方案中，本發明提供了化合物A的結晶形式H。如圖12所示，結晶形式H的X射線粉末衍射譜圖通常具有以下峰衍射角(其中“間距”在圖12中顯示為“d-值”)：

在另一實施方案中，本發明提供了化合物A的結晶形式I。如圖13所示，結晶形式I的X射線粉末衍射譜圖通常具有以下峰衍射角(其中“間距”在圖13中顯示為“d-值”)：

在另一實施方案中，本發明提供了化合物A的結晶形式J。如圖14所示，結晶形式J的X射線粉末衍射譜圖通常具有以下峰衍射角(其中“間距”在圖14中顯示為“d-值”)：

在另一實施方案中，本發明提供了化合物A的結晶形式K。如圖15所示，結晶形式K的X射線粉末衍射譜圖通常具有以下峰衍射角(其中“間距”在圖15中顯示為“d-值”)：

在另一實施方案中，本發明提供了化合物A的結晶形式L。如圖16所示，結晶形式L的X射線粉末衍射譜圖通常具有以下峰衍射角(其中“間距”在圖16中顯示為“d-值”)：

對於如上所述的結晶形式A、B、C、C*、D、F、G、H、I、J、K和L，僅總結了主峰(即最具有特徵性的、顯著的、獨特的和/或可重現的峰)；其它峰可經常規方法由衍射譜圖獲得。如上所述的主峰可在誤差界限(在最後給出的小數位+或-2，或在指定值+或-0.2)內重現。

基於TGA中的重量損失(wt%)，化合物A的結晶形式A、B、C、C*、D、F、G、H、I、J、K和L被推測為無水物、水合物和溶劑化物：

在分解前未觀察到任何樣品的熔融吸熱。

結晶形式A、B、C、C*、D、F、G、H、I、J、K和L的相互轉化如表15中所示(形式A被用作多晶型物篩選工作的起始物質)：

表15.結晶形式A、B、C、C*、D、F、G、H、I、J、K和L的相互轉化

在四種水合物(形式A、C、C*和G)中，發現形式C是生產作為API的化合物A過程中最實用且最穩定的結晶形式。在非常高的溫度加熱水合物或水合物/溶劑化物導致水或溶劑的損失並產生無水物，然而，值得注意的是，該方法用於研究各種結晶形式的相互轉化且可能不適用於化合物A的製備。

在另一態樣，本發明提供了基本上純的化合物A的結晶形式A、B、C、C*、C**、C***、D、F、G、H、I、J、K和L。也就是說，每種結晶形式在一種化合物I的具體結晶形式中是基本上純的且基本上不含有化合物I的其它結晶形式。在一個實施方案中，本發明提供了基本上純的結晶形式A，諸如純度水平為97.0%、97.5%、98.0、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%或更高。在另一實施方案中，本發明提供了基本上純的結晶形式B，諸如純度水平為97.0%、97.5%、98.0、98.5%、98.6%、 98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%或更高。在另一實施方案中，本發明提供了基本上純的結晶形式C，諸如純度水平為97.0%、97.5%、98.0、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%或更高。在另一實施方案中，本發明提供了基本上純的結晶形式D，諸如純度水平為97.0%、97.5%、98.0、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%或更高。在另一實施方案中，本發明提供了基本上純的結晶形式F，諸如純度水平為97.0%、97.5%、98.0、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%或更高。在另一實施方案中，本發明提供了基本上純的結晶形式G，諸如純度水平為97.0%、97.5%、98.0、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%或更高。在另一實施方案中，本發明提供了基本上純的結晶形式H，諸如純度水平為97.0%、97.5%、98.0、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%或更高。在另一實施方案中，本發明提供了基本上純的結晶形式I，諸如純度水平為97.0%、97.5%、98.0、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%或更高。在另一實施方案中，本發明提供了基本上純的結晶形式J，諸如純度水平為97.0%、97.5%、98.0、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%或更高。在另一實施方案中，本發明提供了基本上純的結晶形式K，諸如純度水平為97.0%、97.5%、98.0、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%或更高。在另一實施方案中，本發明提供了基本上純的結晶形式L，諸如純度水平為97.0%、97.5%、98.0、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%或更高。

在另一態樣，本發明提供了用於製備式I、式II和式III的化合物的方法。

在一個實施方案中，本發明提供了根據方案1中所述的操作製備或純化的化合物A倍半水合物的結晶形式C。本申請公開的新型合成方法和結晶/重結晶方法解决了許多與先前所報導的方法相關的問題，諸如經與對掌性酸諸如(+)-二-對甲基苯甲醯基-D-酒石酸形成非對映異構體鹽並使其重結晶而改善化合物A游離鹼的光學純度，並提供了許多相對於現有方法的優點。值得注意的是，本申請公開的方法尤其適用於以高品質和良好產率可重現地以商業規模製備化合物A倍半水合物。

如方案1中所例示，本申請提供了用於大規模製備呈游離鹼形式的化合物A的方法，包括以下步驟：

其中R₁和R₂獨立選自C_1-6烷基或鹵代C_1-6烷基；且LG為離去基團諸如Ts。

如方案2中所例示，本申請提供了用於大規模製備化合物A倍半水合物的結晶形式的方法，包括以下步驟：i.使化合物A的游離鹼與拆分劑(諸如對掌性酸，例如，(+)-二-對甲基苯甲醯基-D-酒石酸)於適當溶劑(諸如，醇，進一步諸如異丙醇)中在鹼存在下反應以獲得化合物A-粗品2；ii.使化合物A-粗品2於混合溶劑諸如i-PrOH和水中在某一溫度重結晶達一段時間以獲得化合物A的結晶形式。

化合物A的結晶形式可藉由以下通用方法製備：將化合物A倍半水合物的結晶形式C與溶劑加熱直至完全溶解。過濾、冷却、結晶、過濾並乾燥後，獲得相應的不同結晶形式。用於製備化合物A的結晶形式A的結晶方法的實例述於實例3中(下文)。上述結晶可在單一溶劑、有機溶劑的混合物、水與一種或多種有機溶劑的混合物中進行。用於結晶的合適有機溶劑可選自，但不限 於，低級烷基醇、酮、醚、酯、鹵代烴、烷烴、鹵代苯、脂族腈及其它芳族溶劑。優選的溶劑包括，例如，異丙醇、乙酸乙酯、水、N,N-二甲基甲醯胺、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈及它們的混合物。

本申請的術語“低級烷基醇”包括直鏈或支鏈C₁-C₈烷基醇，優選C₁-C₆烷基醇，更優選C₁-C₄烷基醇。具體實例包括，但不限於，甲醇、乙醇、異丙醇和丁醇。

除非另外說明，否則本申請使用的術語“約”是指數字(例如，溫度、pH、體積等)可在±10%，優選±5%內變化。

本申請的溶劑化物被定義為藉由溶劑化形成的化合物，例如作為溶劑分子與溶質的分子或離子的組合。已知的溶劑分子包括水、醇及其它極性有機溶劑。醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇和叔丁醇。醇還包括聚合醇諸如聚亞烷基二醇(例如，聚乙二醇、聚丙二醇)。優選的溶劑通常是水。藉由與水的溶劑化形成的溶劑化物化合物有時稱為水合物。

本發明的結晶形式的結晶也可在含有至少一種溶劑的適當的溶劑系統中藉由以下方式進行：蒸發溶劑、冷却和/或添加抗溶劑(不能使化合物A倍半水合物溶解的溶劑，包括但不限於本申請所述的那些)以實現在所述溶劑系統中的過飽和。

結晶可使用或不使用晶種來進行，其述於本發明中。

本申請公開的各個結晶形式在取决於結晶過程的具體熱力學和平衡性質的特定條件下開發。因此，本領域技術人員將認識到形成的結晶是結晶方法的動力學和熱力學性質的結果。在某些條件(例如，溶劑、溫度、壓力和化合物濃度)下，具體的結晶形式相比於其它結晶形式可以是更穩定的(或者事實上相比於其它結晶形式是更穩定的)。然而，具體晶體的相對低的熱力學穩定性可具 有有利的動力學穩定性。除了動力學之外的其它因素，諸如時間、雜質分布、攪拌和存在或不存在晶種等，也可影響結晶形式。

在另一態樣，本發明提供了醫藥組合物，其各自含有有效量的化合物A和醫藥上可接受之載體，所述化合物A具體為呈上述結晶形式A、B、C、C*、C**、D、E、F、G、H、I、J、K和L中任一種的化合物A倍半水合物。所述一種或多種活性化合物可占組合物的1-99%(按重量計)，優選1-70%(按重量計)，或更優選1-50%(按重量計)，或最優選5-40%(按重量計)。

醫藥組合物可以如下形式口服投予：諸如膠囊；片劑；丸劑；粉末；持續釋放注射劑，諸如無菌溶液、混懸液或乳液的形式；經局部處理形式投予，諸如糊劑、乳膏劑或軟膏劑；或經直腸形式投予，諸如栓劑。醫藥組合物可呈適於精確投予施用的單位劑型。此外，醫藥組合物可包含其它活性成分。

合適的藥物載體包括水、各種有機溶劑和各種惰性稀釋劑或填充劑。需要時，醫藥組合物可含有各種添加劑，諸如香料、粘合劑和賦形劑。對於口服投予，片劑和膠囊可含有各種賦形劑諸如檸檬酸；各種崩解劑諸如澱粉、海藻酸和一些矽酸鹽；和各種粘合劑諸如蔗糖、明膠和阿拉伯膠。此外，通常在製備片劑中使用潤滑劑，包括硬脂酸鎂和滑石填充劑。相同類型的固體組分也可用於配製軟和硬明膠膠囊。當口服投予需要水性混懸液時，活性化合物可與各種增甜劑或矯味劑、色素或染料組合混合。需要時，可採用各種乳化劑或產生混懸液；可採用稀釋劑諸如水、乙醇、丙二醇、甘油或它們的組合。

上述醫藥組合物優選口服投予。

上述醫藥組合物優選呈膠囊或片劑形式。

在另一態樣，本發明提供了本發明的化合物(即，化合物A倍半水合物及其任一種上述結晶形式A、B、C、C*、C**、D、E、F、G、H、I、J、K和L)在製備用於治療對Parp1和Parp2的抑制響應的癌症的藥物中的用途。

在一個實施方案中，本發明提供了本發明的化合物(即，化合物A倍半水合物及其任一種上述結晶形式A、B、C、C*、C**、D、E、F、G、H、I、J、K和L)在製備用於治療或預防哺乳動物胰腺炎、腎病、癌症、血管發生或血管發生相關疾病的藥物中的用途。

本發明的化合物A倍半水合物和其它游離鹼結晶形式A、B、C、C*、C**、D、E、F、G、H、I、J、K和L可用於治療或預防選自但不限於以下的疾病：腫瘤血管發生；慢性炎性疾病，諸如類風濕性關節炎、動脉粥樣硬化；皮膚病，諸如銀屑病和硬皮病；糖尿病誘導的皮膚病、糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病、年齡相關的變性色斑、血管瘤、膠質瘤、卡波西內部腫瘤、卵巢癌、乳腺癌；肺癌，包括小細胞肺癌；胰腺癌、淋巴瘤、前列腺癌、結腸癌和皮膚腫瘤，以及它們的併發症。在本申請提及的哺乳動物中，優選人類。

待藉由上述治療方法治療的疾病優選選自BRCA1和BRCA2突變體腫瘤，諸如BRCA1和BRCA2突變體乳腺癌、卵巢癌以及它們的併發症。

上述方法可與任何化學療法(例如，TMZ和多西他賽(docetaxel))、生物療法或放射療法聯合使用。

當投予時，活性成分或化合物的劑量將藉由以下因素確定：待治療患者的個體需求、投予途徑、疾病或病症的嚴重度、投予時間表以及指定醫生的評價和判斷。然而，基於活性化合物，單一或分開劑量中有效劑量的優選範圍可為約每日0.01-320mg/kg體重；或更優選每日0.1-10mg/kg體重。

本發明的另一態樣提供用於臨床應用的化合物A的結晶形式。具體地，本發明涉及使用針對癌症患者的以下治療選擇以化合物A的結晶形式進行的臨床治療：選自結晶形式A、B、C、C*、C**、D、E、F、G、H、I、J、K和L的化合物A的結晶形式的劑量可為1-320mg/天，其中投予頻率為每日1-3 次；優選的劑量為5-240mg/天，其中投予頻率為每日1-3次；更優選的劑量為10-200mg/天，其中投予頻率為每日2次。

以下合成方法、具體實例和效能測試進一步描述了本發明的某些態樣。它們不應當以任何方式限制或限定本發明的範圍。

實例

如下實例意在示例說明且著重於確保關於所使用的數字(例如，量、溫度等)的準確性，但應當考慮到在本領域技術人員認知範圍內的一些實驗誤差和偏差。除非另作說明，否則溫度以℃(攝氏度)計。試劑購自商業供應商諸如Sigma-Aldrich、Alfa Aesar或TCI，且無需進一步純化即可使用，除非另作說明。

除非另作說明，否則下文闡述的反應在氮氣或氬氣的正壓下或使用乾燥管在無水溶劑中進行；反應燒瓶配備有用於經注射器引入底物和試劑的橡膠隔膜；且將玻璃器皿烘乾和/或加熱乾燥。

在以400MHz操作的Varian儀器上記錄¹H NMR譜和¹³C NMR。

獲自無色板狀晶體的X射線強度數據在173(2)K使用Bruker APEX-II CCD衍射儀(Cu K輻射，λ=1.54178Å)測量。偏振光顯微鏡照片在室溫捕獲。

使用TA Instruments Q500 TGA進行TGA。使用鎳校準溫度並使用TA提供的標準砝碼校準重量且針對草酸鈣一水合物脫水和分解進行驗證。

DSC如下進行：使用TA instruments Q2000 DSC，25℃至期望溫度，以10℃/min的加熱速率，使用N2作為吹掃氣體，使用卷邊盤(pan crimped)。

在以下實例中，可是以下縮寫：

實例1

呈游離鹼形式的化合物A和化合物A倍半水合物的結晶形式C的大規模製備

步驟1：化合物-2的合成

將溴乙酸叔丁酯(51.7Kg)溶於無水乙腈(72Kg)中。將溫度升至65-75℃，然後添加甲基吡咯啉(22Kg)。反應完成後將反應混合物濃縮，藉由添加THF然後濃縮除去殘餘的乙腈。GC顯示完全除去乙腈後，添加更多THF並攪拌。過濾並收集所得固體。獲得44.1Kg灰白色固體化合物-2。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 4.91(s,2H),4.15(m,2H),3.29(m,2H),2.46(s,3H),),2.14(m,2H),1.46(s,9H)ppm。

步驟2：化合物-3的合成

向三甲基甲矽烷基乙炔(12.4Kg)於THF中的冷(-60℃)溶液中添加正丁基鋰(43.4Kg)於己烷中的溶液。完成添加正丁基鋰溶液後，將所得混合物再攪拌1-2h，然後將全部溶液轉移至在-60℃冷却的化合物-2(31Kg)於THF中的混懸液中。轉移完成後，將所得混合物溫熱至室溫並攪拌1h。將反應混合物用水淬滅，用石油醚萃取。將有機相用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，濃縮得到25.1Kg化合物-3。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 3.34(d,J=16.0Hz,1H),3.15(m,1H),2.78(d,J=16.0Hz,1H),2.27(m,1H),1.93(m,1H),1.68(m,3H),1.41(s,9H),1.24(s,3H),0.13(s,9 H)ppm。

步驟3：化合物-4的合成

向70.1Kg化合物-3於THF中的冷(0-5℃)溶液中添加四丁基氟化銨(13.3Kg)於THF中的溶液。脫甲矽基化完成後，用水淬滅反應混合物，用石油 醚(290Kg)萃取並將有機相濃縮且藉由矽膠墊。濃縮濾液得到48Kg化合物-4。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 3.36(d,J=16.0Hz,1H),3.15(m,1H),2.82(d,J=16.0Hz,1H),2.28(m,1H),1.97(m,1H),1.70(m,3H),1.41(s,9H),1.26(s,3H)ppm。

步驟4：化合物-5的合成

將化合物-4(48Kg)於THF中的溶液溫熱至50-60℃。向上述溶液中添加(-)-二-對甲基苯甲醯基-L-酒石酸(69.6Kg)於THF中的溶液。將所得混合物在50-60℃攪拌1-2h，然後逐漸冷却至0-10℃。將所得鹽固體過濾並重新混懸於甲基第三丁基醚中且在50-60℃加熱1h。將混合物逐漸冷却至0-5℃。過濾所得固體得到13.1Kg灰白色固體。將固體用氫氧化鈉水溶液處理，用石油醚萃取，濃縮得到13.1Kg化合物-5(ee

96%)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 3.36(d,J=16.0Hz,1H),3.15(m,1H),2.82(d,J=16.0Hz,1H),2.29(m,1H),1.97(m,1H),1.70(m,3H),1.41(s,9H),1.26(s,3H)ppm。

步驟5：化合物-6的合成

將中間體B(14Kg)、雙(三苯基)二氯化鈀(0.7Kg)、CuI(0.42Kg)和四甲基胍(11.5Kg)溶於DMF(48.1Kg)中。攪拌所得溶液並脫氣，然後在氮氣下 加熱。滴加化合物-5(9.24Kg)於DMF(16Kg)中的溶液。冷却後，濃縮有機相，殘餘物與水(145Kg)和甲基第三丁基醚(104Kg)攪拌，使全部混合物藉由矽藻土墊，分離。將有機相用硫脲(14Kg)於水(165kg)和鹽水(100Kg)中的溶液洗滌，濃縮。將殘餘物溶於正庚烷(120Kg)和乙酸乙酯(28Kg)的混合物中。將溶液與炭(1.4kg)混合，在40-50℃加熱1-2h，經矽膠墊過濾。濃縮濾液得到化合物-6固體(14.89Kg)和液體濾液(13Kg庚烷溶液，含1.24Kg化合物-6)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.85(d,J=9.6Hz,1H),7.55(m,3H),7.32(m,2H),3.87(s,3H),3.37(d,J=16.0Hz,1H),3.22(m,1H),2.94(d,J=16.0,Hz,1H),2.60(m,1H),2.48(m,1H),2.29(s,3h),2.26(m,1H),1.82(m,2H),1.49(s,3H),1.43(s,9H)ppm。

步驟6：化合物-7的合成

將上述化合物-6的庚烷溶液加至冷的三氟甲磺酸(66.1Kg)中，同時保持內部溫度低於25℃。然後分批添加固體化合物-6(14.87Kg)。完成添加化合物-6後，將反應混合物溫熱至25-30℃並攪拌直至反應完成。將全部混合物傾入乙酸鈉(123.5Kg)於水(240Kg)中的溶液中。然後藉由添加固體碳酸鉀(46.1Kg)將溶液的調節至pH 7-8。用二氯甲烷(509Kg)萃取殘餘物，濃縮。將殘餘物與正庚烷(41Kg)混合，再濃縮，得到析出物，將析出物過濾並用正庚烷(8Kg)洗滌且乾燥。獲得8.78Kg化合物-7。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 12.30(s,1H),7.35(dd,J=9.2,1.6Hz,1H),7.08(dd,J=9.2,1.6Hz,1H),3.79(s,3H),3.68(d,J=17.2Hz,1H),3.21(d,J=17.2Hz,1H),3.06(m,1H),2.68(m,1H),1.96(m,1H),1.74(m,1H),1.49(s,3H)ppm。

步驟7：化合物A-粗品1的合成

將化合物-7(8.76Kg)溶於甲醇(69Kg)中並內部冷却低於25℃。添加乙酸(9.3Kg)和水合肼(7.4Kg,85%)，同時保持內部溫度低於25℃。脫氣並用氮氣再充填(重複三次)後，將反應混合物在55-60℃攪拌4h。反應完成後，將混合物與水(29Kg)混合。將有機相濃縮並添加碳酸鉀(12.5Kg)於水(40Kg)中的溶液。將所得固體過濾，用水(18.3Kg)洗滌。將固體用水(110Kg)打漿，離心，乾燥並用乙醇(9.4Kg)打漿，離心，用乙醇洗滌，真空乾燥，得到化合物A-粗品1(7.91Kg)。¹H-NMR(600MHz,DMSO-d ₆)δ 12.0(s,1H),10.2(s,1H),7.31(dd,1H,J=9.6,2.0Hz),7.19(dd,1H,J=9.6,2.0Hz),3.77(d,1H,J=16.4Hz),3.34(d,1H,J=16.4Hz),2.97-3.02(m,1H),2.54-2.58(m,1H),2.35-2.40(m,1H),1.90-1.94(m,1H),1.73-1.75(m,1H),1.47(s,3H),1.43-1.45(m,1H)ppm.MS(ESI)m/e[M+1]⁺ 299。

步驟8：化合物A-粗品2的合成

在氮氣保護下，將化合物A(粗品1)(7.88Kg)與異丙醇(422Kg)攪拌並在70-80℃加熱1-2h直至固體完全消失。添加(+)-二-對甲基苯甲醯基-D-酒石酸(10.25Kg)於異丙醇(84.4Kg)中的溶液。將混合物攪拌14-16h，過濾並用異丙 醇(16Kg)洗滌，乾燥。將所得鹽加至碳酸鉀(6.15Kg)於水(118Kg)中的經攪拌溶液中。將析出物離心，過濾，用水(18Kg)洗滌。將固體用水(110Kg)打漿，離心，乾燥。將固體溶於THF(75Kg)中，添加活性炭(0.8Kg)。將混合物脫氣，再用氮氣保護，攪拌並在40-45℃加熱1-2h，冷却，經矽藻土過濾，濃縮，得到固體，其進一步用乙醇(6.5Kg)打漿，過濾，得到5.6Kg化合物A粗品2。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 12.0(s,1H),10.2(s,1H),7.31(dd,1H,J=9.6,2.0Hz),7.19(dd,1H,J=9.6,2.0Hz),3.77(d,1H,J=16.4Hz),3.34(d,1H,J=16.4Hz),2.97-3.02(m,1H),2.54-2.58(m,1H),2.35-2.40(m,1H),1.90-1.94(m,1H),1.73-1.75(m,1H),1.47(s,3H),1.43-1.45(m,1H)ppm.MS(ESI)m/e[M+1]⁺ 299。

步驟9：化合物A倍半水合物的合成

將化合物A-粗品2(5.3Kg)與異丙醇(41.6Kg)和水(15.9Kg)的溶液混合。將混合物脫氣並在氮氣下再進行保護，然後加熱至60℃並攪拌2-4h直至固體完全溶解。將溫度升至70-80℃並添加水(143Kg)。將所得混合物加熱至內部溫度為70-80℃，然後停止加熱，但輕微攪拌16h。將析出物過濾，用水(19Kg)洗滌並用水(21kg)打漿2h。將所得固體過濾，用水(20Kg)洗滌。將經過濾的固體在低於45℃的溫度乾燥24-36h。獲得化合物A倍半水合物(4.22kg)，粒度為D90=51.51um，D50=18.62um，D10=7.63um。該該PSD範圍對於製劑開發幾乎是理想的。

粉末X射線衍射圖方法用於表徵結晶形式C的結構，參見圖7A。化合物A倍半水合物的結晶形式C的¹H-NMR譜示於圖17中。化合物A倍半水合物的結晶形式C的¹³C-NMR譜示於圖18中。化合物A倍半水合物的結晶形式C的DVS譜示於圖19中。化合物A倍半水合物結晶形式C的TGA譜示於圖20中，其中0.5個水分子在50℃損失且另外1.0個水分子在100℃損失，由此確定結晶形式中水的摩爾數為1.5。化合物A倍半水合物結晶形式C的DSC譜示於圖21中。

化合物A倍半水合物的結晶形式C的定量元素分析示於表16中。實測的和計算的C、H、N含量的絕對差值低於0.3%並與其分子式C₁₆H₁₅FN₄O．1.5H₂O一致。分析一式兩份進行。

在臨床批次(03035-20131201)中測試在化合物A倍半水合物的結晶形式C的產生中所使用的所有溶劑的殘留水平並良好地控制低於ICH標準。

化合物A倍半水合物的結晶形式C的水含量實測為8.6%(KF方法)，其與其分子式C₁₆H₁₅FN₄O．1.5H₂O的理論水含量(如圖20中TGA圖所證實的8.3%)一致。

化合物A倍半水合物的結晶形式C的水溶性非常小(約0.04mg/mL)，然而，其在胃液中的溶解度(SGF)却非常高(約4.5mg/mL)。這一顯著的溶解度差異使得化合物A倍半水合物的結晶形式C作為良好藥品(API)形式。化合物A API的重結晶和漿化可在水-醇溶液(用於API生產的優選溶劑系統)中進行。在SGF中的高溶解度使得化合物A倍半水合物將在胃中被快速溶解和吸收。

步驟1’：化合物-9的合成

將市售化合物-8(50Kg)溶於濃硫酸(349.5Kg)中並攪拌。添加濃硝酸(95%,24.9Kg)和濃硫酸(50.0Kg)的混合物，同時將內部溫度控制在35-43℃。將反應混合物傾入冰-水中。將所得混懸液離心並收集固體且用水(245Kg)打漿，離心並在45℃用空氣流乾燥，得到48.5Kg化合物-9。

步驟2’：化合物-10的合成

將化合物-9(48.5Kg)溶於甲醇(121.5Kg)中並添加亞硫醯氯(49.5Kg)。酯化完成後，將反應混合物冷却至0-5℃並保持2-12h。將析出物離心並過濾，用甲醇洗滌，用水打漿，離心並再次過濾，乾燥，得到26.4Kg化合物-10。¹H-NMR(600MHz,DMSO-d ₆)δ 8.31(dd,J=8.0,2.8Hz,1H),7.98(dd,J=8.0,2.8Hz,1H),3.91(s,3H)ppm。

步驟3’：化合物-11的合成

將化合物-10溶於乙醇(106Kg)和水(132Kg)的混合物中。添加氯化銨(26.4Kg)，然後分批添加鐵粉(26.4Kg)。將混合物在75-85℃攪拌3h，冷却至室溫(RT)，用乙酸乙酯(236Kg)萃取。將有機相先後用NaHCO₃水溶液(230Kg)和硫酸鹽水溶液洗滌，濃縮，得到24Kg化合物-11。¹H-NMR(600MHz,DMSO-d ₆)δ 6.73(dd,J=8.0,2.8Hz,1H),6.63(dd,J=8.0,2.8Hz,1H),5.92(s,2H),3.82(s,3H)ppm。

步驟4’：中間體B的合成

將化合物-11(24.6Kg)溶於二氯甲烷(240Kg)和吡啶(24.3Kg)的混合物中並攪拌30min。添加甲苯磺醯氯(18.5Kg)。將混合物攪拌並在38-45℃加熱20-22h。添加水(187Kg)並攪拌且分離。將有機相用濃鹽酸(49Kg)和水(49Kg)洗滌，濃縮並添加石油醚。大量析出物形成。過濾並乾燥，得到粗中間體B。將粗產物溶於甲苯(32Kg)中並在60-65℃加熱直至所有析出物完全溶解。將溶液攪拌20min並冷却至5-15℃且靜置。將混懸液離心並分離。將所得固體用甲苯(24.6Kg)和石油醚(37Kg)的混合物打漿，過濾並用石油醚洗滌，乾燥，得到品質良好的中間體B。¹H-NMR(600MHz,DMSO-d ₆)δ 10.27(s,1H),7.69(m,2H),7.45(m,3H),7.18(dd,J=9.6,3.2Hz,1H)ppm。

化合物A倍半水合物的結晶形式C的長期穩定性研究顯示當在25℃/60%RH儲存至多12個月(測定w/w：T0=99.1%和T12=99.0%)時以及在40℃/75%RH條件儲存至多12個月(測定w/w：T0=99.0%和T12=98.9%)時沒有發生明顯的化學純度變化。此外，當在25℃/60%RH儲存至多12個月以及在40℃/75%RH條件儲存至多12個月時沒有觀察到晶體形式和光學純度變化。

溶解度研究顯示化合物A倍半水合物的結晶形式C幾乎不溶於水中(0.04mg/mL)，然而，其非常易溶於SGF(胃液)中且獲得的溶解度為4.5mg/mL。

發現化合物A倍半水合物的結晶形式C稍有吸濕性。

實例2

化合物A單晶形式C**的製備

單晶生長篩選在94種不同條件(藉由改變溶劑、溫度和重結晶方法)下進行，由此藉由在室溫由IPA/水緩慢擴散獲得了適於結構確定的單晶。化合物A的晶體結構已使用一組由單晶採集的衍射數據成功確定。

實例3

化合物A的結晶形式A的製備

藉由使化合物A游離鹼於i-PrOH/H₂O的溶液中重結晶獲得化合物A的結晶形式A。

藉由與實例1中類似的操作製備結晶形式A，即，從i-PrOH/H₂O中重結晶，而真空乾燥導致部分失水。

操作：將化合物A(23g,77.2mmol)混懸於i-PrOH/H₂O的溶劑(240ml/360ml)中並加熱至回流(約86℃)，回流攪拌約3.0h直至全部固體溶解。伴隨攪拌將混合物逐漸冷却(約1℃/min)下來至65℃，並添加晶種(約20mg,99.1% ee)，然後繼續冷却下來至室溫，在室溫保持過夜(約16h)。然後將混合物過濾，用水(80mL×2)洗滌。將固體在40℃真空乾燥2h，得到標題產物(18g)，其為結晶性晶體。粉末X射線衍射圖方法用於表徵結晶形式A的結構；參見圖6。結果顯示結晶形式A為水合物，且TGA結果表明直至150℃重量損失為4.7wt%，如前述表14所示。DSC結果顯示在285.0℃(起始溫度)的熔融吸熱。

實例4

化合物A的結晶形式B的製備

經由在室溫將游離鹼結晶形式A於MTBE中打漿獲得化合物A游離鹼結晶形式B樣品。

操作：將15.1mg形式A固體稱入1.5-mL小瓶中，並將0.3mL MTBE添加至該小瓶中以得到混懸液。將混合物在室溫以800RPM的速度磁力攪拌2天，獲得結晶形式B。粉末X射線衍射圖方法用於表徵結晶形式B的結構；參 見圖6。TGA結果表明直至150℃重量損失為6.0wt%。DSC結果顯示在283.5℃(起始溫度)分解之前有三個重疊的吸熱。

實例5

用於製備化合物A倍半水合物的結晶形式C*的備選操作

經由在2-甲基四氫呋喃溶液與水之間的蒸氣擴散以實驗室規模獲得結晶形式C*。為了與實例1中大規模製備的結晶形式C相區別，將實例5中以實驗室規模製備的該結晶形式稱作結晶形式C*(結晶形式C*有時也稱作以實驗室規模製備的結晶形式C，而結晶形式C有時也稱作以大規模製備的結晶形式C)。

將18.9mg形式A固體稱入3-mL玻璃小瓶中並添加0.4mL 2-甲基四氫呋喃以得到澄清溶液。將該3-mL小瓶密封於含3mL水的20-mL玻璃小瓶中。將系統在室溫保持2天，使得蒸氣與溶液相互作用，從而獲得結晶形式C*。粉末X射線衍射圖方法用於表徵所得結晶形式的結構，其與圖7B一致。該實驗規模的TGA結果表明直至150℃重量損失為8.9wt%。DSC結果顯示在281.9℃分解之前有兩個吸熱和一個放熱。

實例6

化合物A的結晶形式D的製備

經由向化合物A的結晶形式A的乙酸溶液中添加甲苯的抗溶劑獲得化合物A的結晶形式D樣品。

操作：將16.3mg形式A固體稱入20-mL玻璃小瓶中。將0.2mL乙酸添加至該小瓶中以得到澄清溶液。在室溫攪拌後觀察到渾濁。向溶液中分步添加2mL甲苯以誘導更多析晶，從而獲得結晶形式D。粉末X射線衍射圖方法用於表徵結晶形式D的結構；參見圖8。TGA結果顯示直至160℃重量損失為34.5。DSC結果顯示在269.5℃分解之前有三個重疊的吸熱。

實例7

化合物A的結晶形式E的製備

經由在化合物A游離鹼結晶形式A固體與DMA蒸氣之間進行蒸氣擴散製備化合物A的結晶形式E樣品。

操作：將12.2mg形式A固體稱入3-mL玻璃小瓶中。將該3-mL小瓶密封於含2mL DMA的20-mL玻璃小瓶中。將該系統在室溫保持7天，使得蒸氣與固體相互作用，獲得結晶形式E。粉末X射線衍射圖方法用於表徵結晶形式E的結構；參見圖9。TGA結果顯示直至150℃重量損失為38.3wt%(含結晶水合物的分子)。DSC結果顯示在277.1℃(起始溫度)分解之前有兩個吸熱。

實例8

化合物A的結晶形式F的製備

經由在化合物A的結晶形式A固體與乙酸蒸氣之間進行蒸氣擴散製備化合物A的結晶形式F樣品。

操作：將11.0mg形式A固體稱入3-mL玻璃小瓶中。將該3-mL小瓶密封於含有2mL乙酸的20-mL玻璃小瓶中。將該系統在室溫保持7天，使得蒸氣與固體相互作用，獲得結晶形式F。粉末X射線衍射圖方法用於表徵結晶形式F的結構；參見圖10。TGA結果表明直至160℃兩步重量損失為34.5wt%。DSC結果顯示分解之前有四個重疊的吸熱。

實例9

化合物A的結晶形式G的製備

經由在25℃在DVS(動態蒸氣吸附)期間化合物A結晶形式A的濕度誘導的相變製備化合物A的結晶形式G樣品。粉末X射線衍射圖方法用於表徵結晶形式G的結構；參見圖11。TGA結果表明直至150℃兩步重量損失為6.5wt%。DSC結果顯示在284.9℃(起始溫度)分解之前有三個重疊的吸熱。

實例10

化合物A的結晶形式H的製備

經由在氮氣保護下將化合物A的結晶形式E加熱至80℃並冷却至室溫，製備化合物A的結晶形式H樣品。粉末X射線衍射圖方法用於表徵結晶形式H的結構；參見圖12。TGA結果表明直至150℃兩步重量損失為24.8wt%。DSC結果顯示在277.9℃(起始溫度)分解之前有兩個重疊的吸熱。

實例11

化合物A的結晶形式I的製備

經由在氮氣保護下將化合物A的結晶形式E加熱至150℃並冷却至室溫，獲得化合物A的結晶形式I。粉末X射線衍射圖方法用於表徵結晶形式I的結構；參見圖13。TGA結果顯示直至150℃重量損失為1.8wt%。DSC結果顯示在277.0℃(起始溫度)有一個分解放熱。

實例12

化合物A的結晶形式J的製備

經由在氮氣保護下將化合物A的結晶形式A加熱至150℃並冷却至室溫，獲得化合物A的結晶形式J樣品。粉末X射線衍射圖方法用於表徵結晶形式J的結構；參見圖14。TGA結果顯示直至150℃重量損失為1.1wt%。DSC結果顯示在285.1℃(起始溫度)有一個分解放熱。

實例13

化合物A的結晶形式K的製備

經由在室溫緩慢蒸發化合物A的結晶形式A的MeOH溶液，獲得化合物A的結晶形式K樣品。

操作：將18.3mg形式A固體稱入3-mL玻璃小瓶中，並向該小瓶中添加1.8mL MeOH以得到澄清溶液。將該溶液在室溫蒸發以誘導析晶，從而獲 得結晶形式K。粉末X射線衍射圖方法用於表徵結晶形式K的結構；參見圖15。TGA結果顯示直至150℃重量損失為12.8wt%。DSC結果顯示在284.2℃(起始溫度)分解之前有吸熱和放熱。

實例14

化合物A的結晶形式L的製備

經由在氮氣保護下將化合物A的結晶形式K加熱至150℃並冷却至室溫，獲得化合物A的結晶形式L。粉末X射線衍射圖方法用於表徵結晶形式L的結構；參見圖16。TGA結果顯示直至150℃重量損失為1.8wt%。DSC結果顯示在281.7℃(起始溫度)分解之前有一個吸熱。

效能測試

測試1：化合物A倍半水合物(測試的結晶形式C)對多聚(ADP-核糖基)化(PAR化)酶的抑制和選擇性

藉由使用市售的PARP1/2化學發光測定套組(Chemiluminescent Assay Kit)(BPS Bioscience Inc.)確定化合物A倍半水合物在抑制PARP1、PARP2、TNKS1和TNKS2的多聚(ADP-核糖基)化(PAR化)活性態樣的生化效能，並從杆狀病毒感染的Sf9細胞中表達且純化經GST標簽的酶(參見用於酶構建物的表18)。PARP1和PARP2酶來自測定套組，而TNKS1和TNKS2酶是自製的(produced in-house)。根據廠商的說明書進行該測定。簡言之，將H2A和H2B蛋白固定在板的表面上，然後與連續稀釋的化合物和靶標酶溫育0.5小時。然後，向孔中添加生物素化的NAD和DNA(對於TNKS1或TNKS2不需要DNA)以啟動反應。藉由添加鏈黴親和素(streptavidin)-HRP和HRP底物後的化學發光，測量生物素化的PAR化產物。使用Graphpad Prism軟體將劑量-響應%抑制數據擬合至四參數邏輯模型，獲得化合物A倍半水合物的IC₅₀。

表18總結了化合物A倍半水合物針對PARP1、PARP2、TNKS1和TNKS2酶的IC₅₀。如表18中所示，化合物A倍半水合物有效地抑制PARP1和PARP2的催化活性，其中IC₅₀分別為1.3和0.92nM。在對TNKS1和TNKS2的抑制作用中，其比對PARP1或PARP2的抑制作用弱超過100倍。

n：測定的次數；未指定時n=1。

測試2：細胞內靶標抑制

HeLa細胞獲贈於國家生物科學研究所(National Institute of Biological Sciences(北京))並保存於補充有胎牛血清(10% FBS)、100單位/mL青黴素和0.1mg/mL鏈黴素的DMEM中且在95%濕度和5% CO₂保持於37℃培養箱中。經由過氧化氫(H₂O₂)溫育後，誘導細胞內PARP活性並提高內源性PAR水平。如下進行該測定：

將細胞以5000個細胞/孔(100μL)的密度接種於具有透明底和黑色壁的96孔板中。將板在37℃在5% CO₂氣氛下溫育4小時，然後與特定濃度(通常為0.01nM-10μM)的受試化合物溫育。翌日，添加H₂O₂於PBS中的溶液(終濃度200μM)並將板在37℃保持5分鐘。然後藉由板翻轉輕微地除去培養基，並用冰冷的MeOH在-20℃將細胞固定20分鐘。除去固定液並用PBS的重複洗滌後，添加檢測緩衝液(50μL/孔，含有PBS、Tween(0.1%)和BSA(1mg/mL))以及 初級PAR mAb(Alexis ALX-804-220,1：2000)、二級抗-小鼠Alexa Fluor 488抗體(Molecular Probes A11029,1：2000)和核染料DAPI(Molecular Probes D3571,150nM)並在4℃在暗處溫育過夜。除去溶液並用PBS重複洗滌後，藉由ArrayScan VTI(ThermoFisher)評估PAR多聚物水平。在增加的PARP抑制劑濃度存在下基於殘餘酶活性確定抑制百分比。藉由使用XLfit軟體將劑量依賴性數據擬合至四參數邏輯模型來計算IC₅₀值。

在這些條件下，化合物A倍半水合物的結晶形式C抑制細胞內PAR形成，其中IC₅₀為0.24nM，並且比維利帕尼和奧拉帕尼(其所具有的細胞PAR形成IC₅₀分別為2.66nM和0.47nM)更有效。

測試3：癌細胞殺死的合成致死性

將非BRCA基因突變或其它同源性重組缺陷的MDA-MB-231細胞保存於補充有胎牛血清(10% FBS)、100單位/ml青黴素0.1mg/ml鏈黴素的DMEM中。將BRCA1-缺陷的細胞系MDA-MB-436保存於補充有10% FBS、100單位/ml青黴素和0.1mg/ml鏈黴素的RPMI-1640中。在95%濕度和5% CO₂將兩種細胞系保持於37℃培養箱中。

針對每個細胞係使96孔板中每孔所接種的腫瘤細胞數目最優化以確保歷經7天治療期的對數生長。使細胞貼壁16小時，然後用特定濃度的受試化合物處理。使化合物暴露7天後，使用CellTiter-Glo發光細胞存活力測定(Promega)確定化合物的生長抑制活性。使用PHERAstar FS讀取器(BMG Labtech)測量發 光信號。細胞存活力以相對於模擬治療對照(mock treatment control)表示。藉由使用XLfit軟體將劑量依賴性數據擬合至四參數邏輯模型來計算生長抑制的EC₅₀值。

在這些條件下，MDA-MB-231(其BRCA基因為野生型)對於EC₅₀為約9μM的化合物A相對耐藥。相比之下，BRCA1缺陷的腫瘤細胞系(MDA-MB-436)對化合物A極度敏感。在受試的腫瘤細胞中，化合物A顯示比維利帕尼更有效且與奧拉帕尼類似。

測試5：化合物A倍半水合物的結晶形式C的體內藥理學

在攜帶皮下人MDA-MB-436(BRCA1突變體)乳腺癌的BALB/c裸鼠中評價化合物A對PARP的體內藥效學(PD)活性。此外，在該異種移植物模型中探討血漿和腫瘤組織中化合物A濃度(PK，藥代動力學)與其對PAR化的作用(PD，藥效學)之間的關係。在小鼠的MDA-MB-436乳腺癌異種移植物中，口服投予化合物A引起PAR化的時間依賴性和劑量依賴性抑制。腫瘤組織中PAR化的抑制與化合物A的腫瘤藥物濃度相關性良好。在以0.34mg/kg或更高的單一口服劑量投予化合物A後4小時觀察到對PAR化的有效抑制。在5.45mg/kg，化合物A在MDA-MB-436腫瘤組織中誘導強烈且持續的PAR化抑制。在單一口服投予0.17至10.9mg/kg化合物A後4小時，化合物A在MDA-MB-436異種移植物中誘導對PAR水平的劑量依賴性抑制。在5.45mg/kg，化合物A誘導 對PAR水平的快速和有效抑制。在處理後0.5小時PAR化抑制為98%。經過前12小時抑制保持在高水平(>80%)，但在24小時回至53%。在小鼠異種移植物模型的效能研究中，這些數據支持BID投予。劑量滴定和時間過程研究均表明腫瘤組織中的化合物A濃度需要超過0.5μmol/kg以實現至少80% PAR化抑制。

在H209 SCLC異種移植物模型中探究化合物A的體內效能以評價化合物A與替莫唑胺(TMZ，一種DNA烷化劑)的組合功效。在該模型中TMZ單藥非常有效。一個治療周期導致所有動物均無腫瘤。然而，在第二個周期迅速發生耐藥。化合物A與TMZ的組合明顯延遲耐藥且不具有另外的毒性。在多個周期後腫瘤仍對組合治療敏感。為了探討化合物A是否能夠克服TMZ耐藥，藉由在體內用多個周期的TMZ處理H209腫瘤產生TMZ-耐藥性(TR)H209腫瘤。在該異種移植物小鼠模型中，衍生的H209-TR細胞系仍然對化合物A與TMZ的組合敏感。化合物A具有明顯的腦滲透性，使得其在與TMZ組合用於治療腦腫瘤或與具有腦轉移的腫瘤態樣具有吸引力。具有已建立的顱內H209異種移植物的小鼠用於進一步探究化合物A與TMZ對腦中SCLC的組合活性。在該顱內模型中，與TMZ單藥相比，添加化合物A明顯延長了動物存活。

測試6：化合物A倍半水合物(結晶形式C)的毒理學

在大鼠和犬中在單次和重複劑量研究中在多達28天表徵了化合物A的非臨床毒性分布。不良反應包括體重或體重增加和食物消耗量的减少；WBC、NEUT、LYMP、RBC、HGB、HCT和APTT的减少；以及PLT的增加。骨髓被認為是主要靶標器官且組織病理學變化的嚴重度從最小變化至明顯。毒性為劑量依賴性的，與全身暴露相關且在28天恢復期後可逆。化合物A顯示出對hERG電流無明顯影響，其中IC₅₀=25.97μM。在Ames測定中未記錄到致突變性(mutagenicity)。總之，可獲得的毒理學數據充分支持了化合物A在I期研究中對晚期和進展性癌症患者的臨床進展。毒性可進行臨床監測和處理。

測試7：化合物A倍半水合物結晶形式C的藥代動力學

針對藥代動力學研究所用的物種是大鼠和犬。在兩種物種中化合物A均具有良好至優異的口服生物利用度(>40%)。口服投予後，大鼠中的消除半衰期範圍為3.1至5.0小時，而犬中的消除半衰期範圍為1.5至2.5小時。在大鼠(8.67-15.2mL/min/kg)和犬(18.3-18.5mL/min/kg)中清除均是中等的。大鼠和犬中的穩態分布體積分別為2.4L/kg和1.9L/kg。在兩個物種多次口服投予後沒有化合物A的累積。

測試8：化合物A倍半水合物的結晶形式C的ADME

人、猴、犬、大鼠和小鼠血漿中化合物A的血漿蛋白結合(PPB)分別為95.7%、88.9%、79.0%、84.9%和85.0%。在大鼠中口服投予後，在所有檢查的器官中均檢測到化合物A。藥物濃度在投予後0.25至1小時達到最大並在投予後24小時降至小於峰濃度的10%。

化合物A在人、犬、大鼠和小鼠肝微粒體中緩慢代謝，而在猴肝微粒體中迅速代謝，其中鑒定出共計5種代謝物(M1、M2、M3、M4和M5)。口服投予後，在大鼠的糞便、血漿、尿和膽汁中實測到六種代謝物M1、M2、M3、M5、M6和M7。化合物A主要在糞便中排泄。口服投予後，糞便中化合物A的累積排泄量為15%至20%(直至48小時)。在大鼠中低於1%的化合物A在尿和膽汁中排泄。

CYP3A是負責化合物A代謝的主要CYP同工型，而CYP2C8有助於化合物A代謝至較小的程度。對於CYP2C9，化合物A是中等抑制劑(IC₅₀=6.48μM)，而其對於其它CYP同工型的IC₅₀均大於10μM。化合物A不是人CYP1A2、CYP2B6和CYP3A的誘導劑。

測試9：臨床試驗

使用化合物A倍半水合物的結晶形式C製備膠囊，對25位受試者(每日兩次(bid)投予劑量為2.5、5、10、20、40、80和120mg)完成了I期臨床安全性研究。結果顯示2.5-120mg每日兩次劑量是安全的且耐受良好。在BRCA1/2突變體卵巢癌患者中化合物A治療引起部分或完全響應。這些初步數據證明化合物A倍半水合物(結晶形式C)在BRCA1/2突變體或HR-缺陷的癌症治療中是有效的。

前述實例和某些實施方案的描述應當理解為示例說明的，而不是如權利要求所限定的那樣限制本發明。將容易地認識到，可採用如上闡述的特徵的各種變化和組合而不偏離如在權利要求中所闡述的本發明。所有此種變化意在包括在本發明的範圍內。將所有引用的參考文獻的全部內容藉由引用的方式並入本申請。

Claims (14)

1. 一種式III化合物的結晶形式，所述的化合物為(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮的倍半水合物：

   

   所述結晶形式選自結晶形式C，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有下列2θ角值的衍射峰：5.3±0.2°、6.3±0.2°、6.5±0.2°、6.9±0.2°、8.7±0.2°、10.6±0.2°、11.1±0.2°、11.6±0.2°、12.6±0.2°、13.1±0.2°、13.7±0.2°、14.4±0.2°、14.8±0.2°、15.1±0.2°、15.9±0.2°、16.2±0.2°、17.3±0.2°、18.0±0.2°、18.7±0.2°、19.0±0.2°、19.4±0.2°、20.2±0.2°、20.6±0.2°、21.0±0.2°、21.2±0.2°、21.5±0.2°、22.3±0.2°、22.7±0.2°、23.4±0.2°、23.8±0.2°、24.3±0.2°、24.7±0.2°、25.3±0.2°、25.7±0.2°、26.1±0.2°、26.4±0.2°、27.4±0.2°；或結晶形式C*，其特徵在於粉末X射線衍射圖包括具有下列2θ角值的衍射峰：6.1±0.2°、6.3±0.2°、6.9±0.2°、8.5±0.2°、11.1±0.2°、11.6±0.2°、13.2±0.2°、14.5±0.2°、15.2±0.2°、16.3±0.2°、18.1±0.2°、20.3±0.2°、22.5±0.2°、24.8±0.2°、26.1±0.2°、26.6±0.2°和27.7±0.2°；或結晶形式C**，其為基本上如圖4中所例示的單晶。
2. 如請求項1所述的結晶形式，其特徵在於所述結晶形式C具有如圖7A所示的粉末X射線衍射圖，以及所述結晶形式C*具有如圖7B所示的粉末X射線衍射圖。
3. 一種製備如請求項1所述的(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮倍半水合物的結晶形式C或C*的方法，其包括以下操作中的任一項：(a)使(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮的游離鹼或水合物溶於溶劑或溶劑混合物中以形成溶液或混懸液；並使(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮倍半水合物以目標結晶形式析出；或(b)使(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮水合物溶於或混懸於溶劑或溶劑混合物中；並用抗溶劑使(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮倍半水合物以目標結晶形式析出。
4. 如請求項3所述的方法，其中該操作(a)或(b)還包括獨立選自由下列組成之群組的一個或多個操作：加熱、過濾除去不溶性雜質、蒸餾溶劑、添加反萃溶劑或溶劑混合物、添加晶種、添加一種或多種析晶誘導劑、冷卻、析晶和過濾收集結晶產物。
5. 如請求項3所述的方法，包括該操作(a)或(b)，其中該溶劑或溶劑混合物選自由下列組成之群組：水、低級烷基醇、酮、醚、酯、低級脂族羧酸、低級脂族腈、視情況鹵代的芳香溶劑以及它們的組合。
6. 如請求項4所述的方法，包括該操作(a)或(b)，其中該溶劑或溶劑混合物選自由下列組成之群組：水、低級烷基醇、酮、醚、酯、低級脂族羧酸、低級脂族腈、視情況鹵代的芳香溶劑以及它們的組合。
7. 如請求項3所述的方法，其中該溶劑為異丙醇、乙醇、甲醇、丙酮、THF、1,4-二噁烷、乙酸、乙腈、水或它們的組合。
8. 如請求項4所述的方法，其中該溶劑為異丙醇、乙醇、甲醇、丙酮、THF、1,4-二噁烷、乙酸、乙腈、水或它們的組合。
9. 如請求項3所述的方法，包括該操作(a)，其中該游離鹼為經分離且純化的游離鹼、經分離但未純化的游離鹼或含有游離鹼的粗反應產物。
10. 如請求項3所述的方法，其中：1)該步驟(a)或(b)，其使用i-PrOH/H₂O作為溶劑以產生結晶形式C或C*。
11. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量的如請求項1或2所述的結晶形式和醫藥上可接受之載體。
12. 一種如請求項1或2所述的結晶形式的用途，其用於製備用以治療癌症的藥物，其中該癌症為選自由下列組成之群組的癌症：腦癌、肺癌包括小細胞肺癌、腎癌、骨癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸癌、卵巢癌、黑素瘤、皮膚癌、腎上腺癌、子宮頸癌、淋巴瘤或甲狀腺腫瘤。
13. 如請求項12所述的用途，其中該癌症選自BRCA1和BRCA2突變的乳腺癌或卵巢癌。
14. 如請求項12所述的用途，其中該化合物為(R)-2-氟-10a-甲基-7,8,9,10,10a,11-六氫-5,6,7a,11-四氮雜環庚並[def]環戊並[a]芴-4(5H)-酮的倍半水 合物，其呈選自由下列組成之群組的結晶形式：如請求項1所述的結晶形式C、C*和C**。

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