TWI721461B

TWI721461B - 反義核酸

Info

Publication number: TWI721461B
Application number: TW108121749A
Authority: TW
Inventors: 渡辺直樹; 戸根悠一郎; 武田伸一; 永田哲也
Original assignee: 日商日本新藥股份有限公司; 國立研究開發法人國立精神神經醫療研究中心
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2015-06-16
Publication date: 2021-03-11
Also published as: RU2017101172A; AU2021203383A1; US20250084412A1; MX420315B; CA2951221A1; CN111575282A; EP3159409B1; EP3660154B1; CO2017000357A2; JP2022082539A; BR112016029369B1; JP2024023899A; SI3159409T1; AU2015277924B2; SG11201610130VA; JP7041879B2; JP2020182459A; JP2018027087A; TWI666317B; RU2695430C2

Abstract

本發明之課題為提供使外顯子高效率跳讀(skipping)之藥劑。

本發明之解決手段為提供一種反義寡聚物，其係將以相同外顯子內互不連續或重複之序列為標的之2個以上單元寡聚物連結而成。

Description

反義核酸

本發明係關於一種外顯子跳讀(skipping)用反義寡聚物，其包含與與標的外顯子內之不同2處以上之序列互補的核苷酸序列。更具體而言，係關於可使人類肌縮蛋白基因之第44號外顯子跳讀的反義寡聚物及含該寡聚物的醫藥組成物。

杜興氏肌肉營養不良((Duchenne Muscular Disorder(DMD))為發病頻率最高的遺傳性進行性肌肉疾患，約3,500名出生男子中有1人發病。此等患者在乳幼兒期顯示與正常人類幾乎無差異的運動功能，然而從約4至5歲即出現肌力降低。然後，肌力降低繼續進行，至約12歲即變得不能步行，於二十歲時期因心臟衰竭或呼吸衰竭而死亡，是嚴重的疾病。現今並無對DMD有效之治療法，而強烈地尋求新治療藥之開發。

已知DMD之原因為肌縮蛋白基因之變異。肌縮蛋白基因係存在於X染色體，由220萬個鹼基之DNA所形成的巨大基因。從DNA轉錄為mRNA前驅體，進一步藉由剪接(splicing)，使得除內含子外結合有79個外顯子之 mRNA成為13,993個鹼基。從該mRNA轉譯成3,685個胺基酸，生成肌縮蛋白蛋白質。肌縮蛋白蛋白質參與肌肉細胞之膜安定性的維持，為肌肉細胞不易壞死所必需。由於DMD患者之肌縮蛋白基因有變異，在肌肉細胞中維持功能之肌縮蛋白蛋白質幾乎未表現。因此，在DMD患者體內，變得無法維持肌肉細胞之構造，大量鈣離子流入肌肉細胞內。其結果，生成類似炎症之反應，由於纖維化進行，肌肉細胞變得不易再生。

貝克型肌肉營養不良(BMD)亦是以肌縮蛋白基因之變異為其原因，其症狀雖呈現肌力降低，然而一般比DMD輕，肌力降低之進行亦遲緩，在許多情況，係於成人期發病。DMD與BMD在臨床症狀上的差異，研判係視肌縮蛋白之mRNA轉譯為肌縮蛋白蛋白質時，胺基酸讀取框因變異而被破壞或仍維持而定(非專利文獻1)。亦即，在DMD中，因胺基酸讀取框具有偏離變異，維持功能之肌縮蛋白蛋白質幾乎未表現，然而在BMD中，雖因變異而外顯子一部分缺失，然而由於維持胺基酸讀取框，所以產生不完全但仍具有功能之肌縮蛋白蛋白質。

就DMD之治療法而言，可期待外顯子跳讀法。此種方法係藉由改變剪接而修復肌縮蛋白之mRNA的胺基酸讀取框，誘導回復部分功能之肌縮蛋白蛋白質之表現的方法(非專利文獻2)。為外顯子跳讀對象之胺基酸序列部分變成缺失。因此藉由此種治療所表現之肌縮蛋白蛋白質變得比正常者短，不過由於維持胺基酸讀取框，而部分保持將肌肉細胞安定化之功能。因此，藉由外顯子跳讀，期待DMD呈現與較輕症之BMD相同的症狀。外顯子跳讀法經過使用小鼠及犬之動物實驗，目前正進行對人類DMD患者的臨床試驗。

外顯子跳讀可藉由以5’或3’剪接部位之任一方或兩方、或者以外顯子之內部為標的之反義核酸的結合而誘導。外顯子包含於兩方之剪接部位只被剪接體複合體識別的mRNA。因此，藉由以反義核酸打靶(targeting)剪接部位，可誘導外顯子跳讀。又，為了被外顯子剪接之機構識別，研判富於絲胺酸及精胺酸之SR蛋白質必須結合於外顯子剪接增強子(ESE)，因此即使打靶ESE，亦可誘導外顯子之跳讀。

由於肌縮蛋白基因之變異隨DMD患者而異，因此必須依照基因變異之情況及種類而決定反義核酸。有關針對肌縮蛋白基因之單一外顯子，以一連續序列為標的來誘導外顯子跳讀的反義核酸，有數則報導(專利文獻1至6、及非專利文獻1及2)。又，據報導若將以肌縮蛋白基因之相同外顯子為標的之二種反義核酸混合，使其作用(二重標的化)，有時比單獨使用個別反義核酸之情況更能使跳讀活性增強(專利文獻7)。

然而，尚未報導以相同外顯子內之2處以上為標的而連結的單股反義核酸(連結型)可顯示跳讀活性(專利文獻1)。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開公報第2004/048570號

[專利文獻2]國際公開公報第2009/139630號

[專利文獻3]國際公開公報第2010/048586號

[專利文獻4]美國專利公開公報第2010/0168212號

[專利文獻5]國際公開公報第2011/057350號

[專利文獻6]國際公開公報第2006/000057號

[專利文獻7]國際公開公報第2007/135105號

[非專利文獻]

[非專利文獻1] Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77

[非專利文獻2] Wilton S. D., e t al., Molecular Therapy 2007: 15: p. 1288-96

在如上述之狀況中，本發明之主要目的為提供一種以肌縮蛋白基因之同一外顯子內之分開2處的鹼基序列為標的，誘導外顯子跳讀的新穎連結型反義寡聚物及包含該寡聚物之肌肉營養不良治療藥。

本發明人等詳細研究上述文獻記載之技術內容及肌縮蛋白基因之構造等，結果發現將以人類肌縮蛋白基因之外顯子44之相異2處為標的之寡聚物連結所得到的反義寡聚物可誘導該外顯子之跳讀。本發明人等基於此發現而完成本發明。

亦即，本發明如以下所述。

[1]

一種誘導標的外顯子之跳讀之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物為由下列(a)及(b)連結而成之15至30個鹼基長的反義寡聚物，(a)第1單元寡聚物，含有與前述標的外顯子內之連續7至15個鹼基之第1核苷酸序列互補的鹼基序列；及(b)第2單元寡聚物，含有與前述標的外顯子內之連續7至15個鹼基之第2核苷酸序列互補的鹼基序列；其中該第1核苷酸序列及第2核苷酸序列非為連續或互相重複者。

[2]

如前述[1]記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該第1及/或第2單元寡聚物含有與鄰接前述標的外顯子之內含子的部分核苷酸序列互補之鹼基序列。

[3]

如前述[1]或[2]記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該標的外顯子係人類肌縮蛋白基因之外顯子。

[4]

如前述[1]或[2]記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該第1核苷酸序列係從序列編號1所示之核苷酸序列所選出之連續7至15個鹼基的核苷酸序列。

[5]

如前述[1]至[3]中任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該第2核苷酸序列係從序列編號2所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基的核苷酸序列。

[6]

如前述[1]或[2]記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物係由選自以下(c)至(e)所構成之群組中的2個單元寡聚物連結而成者：(c)包含與從序列編號3所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基的核苷酸序列互補之鹼基序列的單元寡聚物；(d)包含與從序列編號4所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基的核苷酸序列互補之鹼基序列的單元寡聚物；及(e)包含與從序列編號5所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基的核苷酸序列互補之鹼基序列的單元寡聚物。

[7]

如前述[1]或[2]記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物係包含選自序列編號6至9構成之群組中之任一鹼基序列。

[8]

如前述[1]至[7]中任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物係寡核苷酸。

[9]

如前述[8]記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中構成該寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分及/或磷酸鍵部分係經過修飾。

[10]

如前述[8]或[9]記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中構成該寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分係其2’位之-OH基以選自OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及I所構成之群組中的任一基置換的核糖(上述R表示烷基或芳基，上述R’表示伸烷基)。

[11]

如前述[8]至[10]中任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中構成該寡核苷酸之至少1個核苷酸的磷酸鍵部分係選自硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基膦酸酯鍵、胺基磷酸酯(phosphoroamidate)鍵、及硼烷化磷酸酯(boranophosphate)鍵所構成之群組中之任一者。

[12]

如前述[1]至[7]中任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物係N-嗎啉基寡聚物(morpholino oligomer)。

[13]

如前述[12]記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物係二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物。

[14]

如前述[12]或[13]記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物之5’末端係下述化學式(1)至(3)之任一基。

[15]

一種肌肉營養不良治療用醫藥組成物，係以前述[1]至[14]中任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物作為有效成分。

[16]

如前述[15]記載之醫藥組成物，其進一步含有醫藥上可容許之支持體。

[17]

一種肌肉營養不良之治療方法，包含將前述[1]至[12]中任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物或前述[15]或[16]記載之前述醫藥組成物投與至肌肉營養不良患者的步驟。

[18]

如前述[17]記載之治療方法，其中該肌肉營養不良患者係在肌縮蛋白基因具有變異的患者，該變異為外顯子44跳讀之對象。

[19]

如前述[17]或[18]記載之治療方法，其中該患者為人類。

[20]

如前述[1]至[14]中任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物之用途，其係用於製造肌肉營養不良治療用醫藥組成物。

[21]

如前述[1]至[14]中任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其係用於治療肌肉營養不良。

[22]

如前述[21]記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中在該治療中，肌肉營養不良患者係在肌縮蛋白基因具有變異的患者，該變異係外顯子44跳讀的對象。

[23]

如前述[21]或[22]記載之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該患者係人類。

[24]

一種製造前述[1]之反義寡聚物的方法，其包含藉由將下列(a)與(b)連結而製作15至30鹼基長之反義寡聚物的步驟，(a)第1單元寡聚物，含有與標的外顯子內之連續7至15個鹼基之第1核苷酸序列互補之鹼基序列；(b)第2單元寡聚物，含有與前述標的外顯子內之連續7至15個鹼基之第2核苷酸序列互補之鹼基序列；其中，該第1核苷酸序列及第2核苷酸序列非為連續或互相重複者。

[25]

如前述[24]記載之方法，其進一步包含：測定該步驟中所得到之反義寡聚物之跳讀效率的步驟；及選擇具有超過基準值之跳讀效率之反義寡聚物的步驟。

[26]一種反義寡聚物之篩選方法，包含：(a)選擇下列(i)及(ii)之步驟：(i)第1單元寡聚物，含有與標的外顯子內之連續7至15個鹼基之第1核苷酸序列互補之鹼基序列；(ii)第2單元寡聚物，含有與該標的外顯子內之連續7至15個鹼基之第2核苷酸序列互補之鹼基序列 (其中，該第1核苷酸序列及第2核苷酸序列非為連續或互相重複者)；(b)藉由將該第1及第2單寡聚物連結而製作15至30鹼基長之反義寡聚物的步驟；(c)測定該步驟(b)中所得到之反義寡聚物之跳讀效率的步驟；及(d)選擇具有超過基準值之跳讀效率之反義寡聚物的步驟。

藉由本發明之反義寡聚物，可高效率地誘導人類肌縮蛋白基因之外顯子44的跳讀。又，藉由投與本發明之醫藥組成物，可有效地減輕杜興氏肌肉營養不良的症狀。

第1圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因的外顯子44之跳讀效率的的圖。

第2圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第3圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第4圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第5圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第6圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第7圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第8圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第9圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第10圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第11圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第12圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第13圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第14圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第15圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第16圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第17圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第18圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第19圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第20圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第21圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第22圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第23圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第24圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第25圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第26圖係顯示人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率(寡聚物濃度別)的圖。

第27圖係比較將以相異部位為標的之2條單元寡聚物連結者與混合者，在人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率的圖。

第28圖係比較將以相異部位為標的之2條單元寡聚物連結者與混合者，在人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率的圖。

第29圖係比較將以相異部位為標的之2條單元寡聚物連結者與混合者，在人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率的圖。

第30圖係比較將以相異部位為標的之2條單元寡聚物各自單獨者、連結者與混合者，在人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率的圖。

第31圖係比較以相異部位為標的之2條單元寡聚物各自單獨者、連結者與混合者，在人類橫紋肌腫瘤細胞(RD細胞)中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率的圖。

第32圖係顯示來自外顯子45缺損型DMD患者之細胞中之人類肌縮蛋白基因之外顯子44之跳讀效率的圖。

[用於實施發明之態樣]

以下，將詳細說明本發明。以下之實施態樣係用於說明本發明之例示，然而本發明之旨趣並非僅限定於此實施態樣。本發明在不超脫此要旨之範圍，可藉由各種態樣實施。

再者，在本說明書中所引用之全部文獻、及公開公報、專利公報、其他專利文獻，均以參考文獻方式納入本說明書中。又，本說明書包含於2014年6月17日申請，為本案優先權主張基礎之日本專利申請案(特願2014-124157號)之說明書及圖式記載的內容。

1.反義寡聚物

本發明提供一種可誘導標的外顯子之跳讀的反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物係由下列(a)及(b)連結而成之15至30個鹼基長的反義寡聚物，(a)第1單元寡聚物，含有與前述標的外顯子內之連續7至15個鹼基之第1核苷酸序列互補的鹼基序列；及(b)第2單元寡聚物，含有與前述標的外顯子內之連續7至15個鹼基之第2核苷酸序列互補的鹼基序列；其中該第1核苷酸序列及第2核苷酸序列非為連續或互相重複者。

以下，有時將「反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物」簡稱為「反義寡聚物」。

上述反義寡聚物可藉由以下製造方法而製造，該製造方法包含藉由將下列(a)及(b)連結而製作15至30個鹼基長之反義寡聚物的步驟，(a)第1單元寡聚物，含有與標的外顯子內之連續7至15個鹼基之第1核苷酸序列互補的鹼基序列；及(b)第2單元寡聚物，含有與該標的外顯子內之連續7至15個鹼基之第2核苷酸序列互補的鹼基序列；其中，該第1核苷酸序列及第2核苷酸序列非為連續或互相重複者。

上述製造方法可進一步包含測定前述步驟中所得到之反義寡聚物之跳讀效率的步驟；及選擇具有超過基準值之跳讀效率之反義寡聚物的第2步驟。

在前述製造方法之第2步驟中，跳讀效率可藉由將含有標的外顯子之基因的mRNA從受檢細胞回收，測定該mRNA中，為標的外顯子跳讀之區帶的聚核苷酸量「A」，及標的外顯子未跳讀之區帶的聚核苷酸量「B」，基於此等「A」及「B」之測定值，依據以下之式計算。

跳讀效率(%)=A/(A+B)x 100

又關於跳讀效率之計算，亦可參照國際公開公報第2012/029986號。

在第2步驟中，成為基準值之跳讀效率為10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、或90%以上。

藉由此種複數個單元寡聚物連結，即使在單元寡聚物之個別跳讀活性低(或無同等活性)的情況，變得亦可得到跳讀活性提高的反義寡聚物。

同樣地，提供一種反義寡聚物之篩選方法，其包含(a)選擇下列(i)及(ii)之步驟：(i)第1單元寡聚物，含有與標的外顯子內之連續7至 15個鹼基之第1核苷酸序列互補之鹼基序列；(ii)第2單元寡聚物，含有與該標的外顯子內之連續7至15個鹼基之第2核苷酸序列互補之鹼基序列(其中，該第1核苷酸序列及第2核苷酸序列非為連續或互相重複者)；(b)藉由將該第1及第2單元寡聚物連結而製作15至30鹼基長之反義寡聚物的步驟；(c)測定該步驟(b)中所得到之反義寡聚物之跳讀效率的步驟；及(d)選擇具有超過基準值之跳讀效率之反義寡聚物的步驟。

在上述反義寡聚物中，前述第1及第2單元寡聚物，任一者均能以5’側或3’側之位置連結，而在某種實施態樣中，第1單元寡聚物以5’側之位置，第2單元寡聚物以3’側之位置連結。

又，前述反義寡聚物亦可含有第3單元寡聚物，該第3單元寡聚物含有與前述標的外顯子內之連續7至15個鹼基之第3核苷酸序列互補的鹼基序列。

其中，「連結」意指2個單元寡聚物直接連結、或經由媒介物結合。在2個單元寡聚物直接連結之情況，意指位於5’末端側之單元寡聚物的3’末端與位於3’末端側之單元寡聚物的5’末端形成磷酸鍵或以下之基。就媒介物之例而言，除1至5個殘基之核酸(鏈)外，可使用通常用於連結核酸或N-嗎啉基核酸衍生物之周知者，而可列舉如：3-胺基丙基、琥珀醯基、2,2’-二乙醇磺醯基、長鏈烷基胺基(LCAA)。

(式中，X表示-OH、-CH₂R¹、-O-CH₂R¹、-S-CH₂R¹、-NR²R³或F；R¹表示H、烷基；R²及R³為相同或相異，表示H、烷基、環烷基、或芳基；Y₁表示O、S、CH₂或NR¹；Y₂表示O、S或NR¹；Z表示O或S)。

前述第1及/或第2單元寡聚物亦可含有與鄰接前述標的外顯子之內含子的部分核苷酸序列互補之鹼基序列。例如，在第1單元寡聚物位於5’側，第2單元寡聚物位於3’側而連結之實施態樣中，亦可含有與在第1單元寡聚物之5’側，鄰接於標的外顯子之5’側之內含子的3’末端周邊部分核苷酸序列互補的鹼基序列，及/或含有與在第2單元寡聚物之3’側，鄰接於標的外顯子之3’側之內含子的5’末端周邊部分核苷酸序列互補的鹼基序列。

前述第1及/或第2單元寡聚物，亦可含有與前述標的外顯子之外顯子剪接增強子(ESE：Exonic Splicing Enhancer)的部分核苷酸序列互補的鹼基序列。

前述標的外顯子無特別限定，在某一實施態樣中，為人類基因之外顯子，進一步言之，為人類肌縮蛋白基因之外顯子。

更具體而言，為人類肌縮蛋白基因之第44號的外顯子。

因此，本發明在某種實施態樣中，提供可將人類肌縮蛋白基因之第44號之外顯子跳讀的反義寡聚物(以下，稱為「本發明之寡聚物」)。以下詳細說明本發明之反義寡聚物的構造。

[人類肌縮蛋白基因之第44號外顯子]

在本發明中，在「基因」中，除包含基因組基因以外，亦包含cDNA、mRNA前驅體及mRNA。較佳之基因為mRNA前驅體，亦即pre-mRNA。

在人類基因組中，人類肌縮蛋白基因存在於基因座Xp21.2。人類肌縮蛋白基因具有3.0Mbp之大小，就已知之人類基因而言，為最大的基因。但是，人類肌縮蛋白基因之編碼區域只不過14kb，該編碼區域係以79個外顯子分散於肌縮蛋白基因內(Roberts,RG.,et al.,Genomics,16：536-538(1993))。為人類肌縮蛋白基因之轉錄物的pre-mRNA，接受剪接，生成14kb之成熟mRNA。人類之野生型肌縮蛋白基因的鹼基序列為周知(GenBank Accession編號NM_004006)。

將人類之野生型肌縮蛋白基因之外顯子44的鹼基序列示於序列編號10。

在一實施態樣中，本發明之寡聚物，係以「藉由人類肌縮蛋白基因之外顯子44的跳讀，而將DMD型肌縮蛋白基因編碼之蛋白質改變成BMD型肌縮蛋白蛋白質」為目的而製作。因此，成為本發明寡聚物之外顯子跳讀對象的肌縮蛋白基因之外顯子44不僅為野生型，亦包含變異型。

變異型之人類肌縮蛋白基因的外顯子44，具體而言，為以下(I)或(II)記載之聚核苷酸。

(I)與「包含和序列編號10之鹼基序列互補之鹼基序列之聚核苷酸」在嚴苛條件下可雜交的聚核苷酸；(II)包含對比於序列編號10之鹼基序列，具有90%以上之相同性的鹼基序列之聚核苷酸

在本說明書中，「聚核苷酸」意指DNA或RNA。

在本說明書中，「在嚴苛條件下可雜交之聚核苷酸」意指例如將包含和序列編號10之鹼基序列互補之鹼基序列之聚核苷酸的全部或一部分作為探針，藉由使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或南方氏雜交法等所得到的聚核苷酸。就雜交之方法而言，可利用在例如"Sambrook & Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor,Laboratory Press 2001"及"Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons 1987-1997"等中所記載的方法。

在本說明書中，「互補之鹼基序列」不限定於與對象鹼基序列形成沃森‧克里克對(Watson Crick pair)的鹼基序列，亦包含形成搖擺鹼基對(Wobble base pair)之鹼基序列。其中，沃森．克里克對意指在腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-尿嘧啶及鳥嘌呤-胞嘧啶間形成氫鍵的鹼基對；搖擺鹼基對意指在鳥嘌呤-尿嘧啶、肌苷-尿嘧啶、肌苷-腺嘌呤及肌苷-胞嘧啶間形成氫鍵的鹼基對。又，「互補之鹼基序列」可不與對象鹼基序列具有100%的互補性，例如，對比於對象鹼基序列，亦可含有1至3個、1至2個或1個非互補性的鹼基。

在本說明書中，「嚴苛條件」意指低嚴苛條件、中嚴苛條件及高嚴苛條件之任一種。「低嚴苛條件」為例如，5×SSC、5×丹哈德氏(Denhardt’s)溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、32℃之條件。又，「中嚴苛條件」為例如5×SSC、5×丹哈德氏溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、42℃或5×SSC、1% SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5)、50%甲醯胺、42℃之條件。「高嚴苛條件」為例如5×SSC、5×丹哈德氏溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、50℃或0.2×SSC、0.1% SDS、65℃之條件。在此等條件中，越將溫度提高，越能期待有效率地得到具有相同性的聚核苷酸。但是，就影響雜交之嚴苛度的要素而言，有溫度、探針濃度、探針之長度、離子強度、時間、鹽濃度等複數種要素，若為本技術領域人士，可適宜選擇此等要素，實現同樣之嚴苛度。

再者，在雜交中使用市售之套組的情況，可使用例如Alkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare)。此種情況，可依照套組中所附加之規程，與標識之探針進行一夜培育後，將隔膜於55℃之條件下用含有0.1%(w/v)SDS之1次洗淨緩衝液洗淨後，檢測雜交之聚核苷酸。或者，在根據與序列編號10之鹼基序列互補之鹼基序列的全部或一部分製作探針並使用市售之試藥(例如，PCR Labeling Mix(Roche Diagnostics公司)等)將該探針以地高辛(DIG)標識之情況，可使用DIG核酸檢測套組(Roche Diagnostics公司)來檢測雜交。

就上述之可雜交聚核苷酸以外的聚核苷酸而言，可列舉藉由相同性檢索軟體BLAST，使用預設之參數計算時，與包含序列編號10之聚核苷酸之序列具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、或99.9%以上之相同性的聚核苷酸。

再者，鹼基序列之相同性，可使用根據Karlin氏及Altschul氏之演算法BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873,1993)來決定。已根據BLAST演算法開發出被稱為BLASTN及BLASTX的程式(Altschul SF,et al：J Mol Biol 215：403,1990)。在使用BLASTN解析鹼基序列之情況，參數為例如分數(score)=100、字長(wordlength)=12。在使用BLAST及Gapped BLAST程式之情況，係使用各程式之預設參數。

本發明之寡聚物，具體而言，係選自下列(a)及(b)所構成之群組中之2個單元寡聚物所連結而成之15至30個鹼基長的反義寡聚物：(a)包含與從序列編號1所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基之核苷酸序列互補的鹼基序列的單元寡聚物；及(b)包含與從序列編號2所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基之核苷酸序列互補的鹼基序列的單元寡聚物；例如，前述第1核苷酸序列可為從序列編號1所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基之核苷酸序列，及/或前述第2核苷酸序列可為從序列編號2所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基之核苷酸序列。

較佳者，本發明之寡聚物為選自以下(c)至(e)構成之群組中之2個單元寡聚物所連結而成的15至30個鹼基長的反義寡聚物。

(c)包含與從序列編號3所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基之核苷酸序列互補之序列的單元寡聚物；(d)包含與從序列編號4所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基之核苷酸序列互補之序列的單元寡聚物；及(e)包含與從序列編號5所示之核苷酸序列選出之連續 7至15個鹼基之核苷酸序列互補之序列的單元寡聚物。

其中，序列編號1及2所示之核苷酸序列，為在人類之野生型肌縮蛋白基因之外顯子44的核苷酸序列(序列編號10)中，分別包含從5’末端數起，-1至44號鹼基之序列及58至115號鹼基之序列。序列編號3所示之核苷酸序列，為在人類之野生型肌縮蛋白基因之外顯子44的核苷酸序列(序列編號10)中，包含從5’末端數起，18至34號鹼基之序列。同樣地，序列編號4及5所示之核苷酸序列，分別包含61至77號鹼基之序列及88至104號鹼基之序列。

上述(a)至(e)之各單元寡聚物(以下，有時簡單稱為「單元」)的大小為7至15個鹼基長，較佳為8至15個鹼基長、9至15個鹼基長、10至15個鹼基長、10至14個鹼基長、10至13個鹼基長、11至13個鹼基長。(a)至(e)之各單元的大小可相同，亦可相異。

從(a)及(b)所構成之群組中選出2個單元寡聚物時，該2個單元寡聚物可為相同單元寡聚物之組合，或為相異單元寡聚物之組合。亦即，2個單元寡聚物可為(a)與(a)之組合或(b)與(b)之組合，或者為(a)與(b)之組合。

又，從(c)至(e)所構成之群組中選出2個單元寡聚物時，2個單元寡聚物可為相同單元寡聚物之組合，或為相異單元寡聚物之組合，然而較佳為相異種類之單元各選1個。例如，在選擇(c)作為一單元之情況，以(d)或(e)作為另一單元為較佳。同樣地，在選擇單元(d)作為一單元之情況，以(c)或(e)作為另一單元為較佳，又，在一方選擇單元(e)作為一單元之情況，以(c)或(d)作為另一單元為較佳。

在選擇(a)及(b)單元的情況，所選擇之2個單元之任一個均可配置於5’末端側，然而若為選擇(a)及(b)之情況，以單元(a)係連結於3’末端側為較佳。

在從(c)至(e)選擇2個單元之情況，所選擇之2個單元均可配置於5’末端側，然而若在選擇(c)及(d)之情況，以單元(c)連結於3’末端側為較佳，若在選擇(d)及(e)之情況，以單元(d)連結於3’末端側為較佳，若在選擇(c)及(e)之情況，以單元(c)連結於3’末端側為較佳。

其中，「連結」意指將從(a)及(b)選擇之2個單元、或從(c)至(e)選擇之2個單元直接連結。亦即，意指在2個單元連結之情況，位於5‘末端側之單元的3’末端與位於3‘末端側之單元的5’末端形成磷酸鍵或以下之基。

「可進行人類肌縮蛋白基因之第44號之外顯子的跳讀」意指在相當於人類肌縮蛋白基因之轉錄物(例如pre-mRNA)之外顯子44的部位，藉由本發明寡聚物之結合，該轉錄物接受剪接時，例如在具有外顯子45刪除之DMD患者的情況，相當於外顯子43之3’末端的鹼基序列與相當於外顯子46之5’末端的鹼基序列連結，而在不引起密碼子之框架移位(frameshift)下形成成熟mRNA。

其中，前述「結合」，在本發明之寡聚物與人類肌縮蛋白基因之轉錄物混合的情況，意指在生理條件下兩者雜交，形成雙股。上述「生理條件下」意指調節成與身體內類似之pH、鹽組成、溫度的條件。可列舉例如25至40℃(較佳為37℃)，pH 5至8(較佳為pH 7.4)，氯化鈉濃度為150mM之條件。

人類肌縮蛋白基因之外顯子44的跳讀是否發生，可藉由將本發明之寡聚物導入肌縮蛋白表現細胞(例如，人類橫紋肌腫瘤細胞)內，從前述肌縮蛋白表現細胞之全部RNA中，將人類肌縮蛋白基因之mRNA之外顯子44的周邊區域進行RT-PCR增幅，並對該PCR增幅產物進行巢式PCR(nested PCR)或序列解析而確認。

跳讀效率可藉由從受檢細胞回收人類肌縮蛋白基因之 mRNA，測定該mRNA中，外顯子44跳讀之區帶的聚核苷酸量「A」，及外顯子44未跳讀之區帶的聚核苷酸量「B」，基於此等「A」及「B」之測定值，依據以下之式而計算。

跳讀效率(%)=A/(A+B)x 100

或者，關於跳讀效率之計算，亦可參照國際公開公報第2012/029986號。

較佳者，本發明之反義寡聚物係以10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上之效率，進行標的外顯子(例如，外顯子44)跳讀。

就本發明之反義寡聚物而言，可列舉如：具有15至30個鹼基之長度的寡核苷酸、N-嗎啉基寡聚物、或肽核酸(Peptide Nucleic Acid：PNA)寡聚物。較佳者，本發明之反義寡聚物為16至30個鹼基、17至30個鹼基、18至30個鹼基、19至30個鹼基、20至30個鹼基、20至29個鹼基、20至28個鹼基、20至27個鹼基、20至26個鹼基、21至26個鹼基或22至26個鹼基之長度，其中以N-嗎啉基寡聚物為較佳。

前述寡核苷酸(以下，稱為「本發明之寡核苷酸」)係以核苷酸為構成單元的本發明之寡聚物，該核苷酸只要為核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或修飾核苷酸之任一種即可。

修飾核苷酸意指構成核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸之核酸鹼基、糖部分、及磷酸鍵部分的全部或一部分經修飾者。

就核酸鹼基而言，可列舉如：腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或此等之修飾鹼基。就該修飾鹼基而言，可列舉如：假尿嘧啶、3-甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)、5-烷基尿嘧啶(例如，5-乙基尿嘧啶)、5-鹵素尿嘧啶(5-溴尿嘧啶)、6-氮雜嘧啶、6-烷基嘧啶(6-甲基尿嘧啶)、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5'-羧基甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、1-甲基腺嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2,2-二甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、2-硫胞嘧啶、嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、異鳥嘌呤、吲哚、咪唑、黃嘌呤等，然而不以此等為限。

就糖部分之修飾而言，可列舉如：核糖之2’位的修飾及糖之其他部分的修飾。就核糖之2’位的修飾而言，可列舉如：將核糖之2’位的-OH基置換成OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br、I的修飾。其中，R表示烷基或芳基。R’表示伸烷基。

就糖之其他部分的修飾而言，可列舉如：核糖或去氧核糖之4’位的O置換成S者、糖之2'位及4'位經架橋者，例如，LNA(鎖核酸(Locked Nucleic Acid))或ENA(2'-O,4'-C-伸乙基架橋-核酸(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids))等，然而不以此等為限。

就磷酸鍵部分之修飾而言，可列舉如：將磷酸二酯鍵置換成硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基膦酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵、硼烷化磷酸酯鍵(Enya et al：Bioorganic & Medicinal Chemistry，2008，18,9154-9160)的修飾(例如，參照專利再公表公報第2006/129594號及第2006/038608號)。

就烷基而言，以直鏈狀或分枝鏈狀之碳數1至6的烷基為較佳。具體而言，可列舉如：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、正戊基、異戊基、新戊基、三級戊基、正己基、異己基。該烷基可經取代，而該取代基可列舉如：鹵素、烷氧基、氰基、硝基，亦可經此等1至3個取代。

就環烷基而言，以碳數5至12之環烷基為較佳。具體而言，可列舉如：環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環癸基、環十二烷基。

就鹵素而言，可列舉：氟、氯、溴、碘。

就烷氧基而言，可列舉直鏈狀或分枝鏈狀之碳數1至6的烷氧基，例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、二級丁氧基、三級丁氧基、正戊基氧基、異戊基氧基、正己基氧基、異己基氧基等。尤其，以碳數1至3之烷氧基為特佳。

就芳基而言，以碳數6至10之芳基為較佳。具體而言，可列舉如：苯基、α-萘基、β-萘基。尤其以苯基為特佳。該芳基可經取代，就該取代基而言，可列舉如：烷基、鹵素、烷氧基、氰基、硝基，可經此等1至3個取代。

就伸烷基而言，以直鏈狀或分枝鏈狀之碳數1至6的伸烷基為較佳。具體而言，可列舉如：亞甲基、伸乙基、三亞甲基、四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、2-(乙基)三亞甲基、1-(甲基)四亞甲基。

就醯基而言，可列舉直鏈狀或分枝鏈狀之烷醯基、或芳醯基(aroyl)。就烷醯基而言，可列舉如：甲醯基、乙醯基、2-甲基乙醯基、2,2-二甲基乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、2,2-二甲基丙醯基、己醯基等。就芳醯基而言，可列舉如：苯甲醯基、甲苯醯基、萘醯基。該芳醯基在可取代之位置可經取代，亦可經烷基取代。

本發明之寡核苷酸，較佳為核糖之2’位的-OH基以甲氧基置換且磷酸鍵部分為硫代磷酸酯鍵之以下述通式所示之基為構成單元的本發明之寡聚物。

(式中，Base表示核酸鹼基)。

本發明之寡核苷酸，可使用各種自動合成裝置(例如，AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare))容易地合成，或者，亦可委託第三者機關(例如，Promega公司或Takara公司)等來製作。

前述N-嗎啉基寡聚物為以下述通式所表示之基作為構成單元的本發明寡聚物。

(式中，Base為與前述同義；W表示以下之任一式所示的基：

(式中，X表示-CH₂R¹、-O-CH₂R¹、-S-CH₂R¹、-NR²R³或F；R¹表示H、烷基；R²及R³為相同或相異，表示H、烷基、環烷基、或芳基；Y₁表示O、S、CH₂或NR¹；Y₂表示O、S或NR¹； Z表示O或S))。

N-嗎啉基寡聚物，較佳為以以下之式所示之基作為構成單元的寡聚物(二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物(以下，稱為「PMO」))。

(式中，Base、R²、R³與前述同義)。

N-嗎啉基寡聚物可依照例如，國際公開公報第1991/009033號、或國際公開公報第2009/064471號而製造。尤其，PMO可依照國際公開公報第2009/064471號記載之方法製造，或依照國際公開公報第2013/100190號記載之方法製造。

[PMO之製法]

就PMO之1個態樣而言，可列舉如：以下通式(I)所示之化合物(以下，稱為PMO(I))。

[式中，各Base、R²、R³，與前述同義；n為1至99範圍內之任何整數，較佳為18至28範圍內之任何整數]。

PMO(I)可依照周知之方法製造，然而亦可藉由例如實施下述步驟之操作而製造。

使用於下述步驟之化合物及試藥，只要為一般可使用於PMO之製造者即可，無特別限定。

又，下述所有步驟可藉由液相法或固相法(人工或使用市售之固相自動合成機)而實施。在以固相法製造PMO之情況，從操作程序之簡便化及合成之正確性的觀點而言，以使用自動合成機之方法為較佳。

(1)步驟A：

藉由使以下通式(II)所示之化合物(以下，稱為化合物(II))與酸作用，製造以下通式(III)所示之化合物(以下，稱為化合物(III))的步驟。

[式中，n、R²、R³與前述同義；各B^P各自獨立，表示可經保護之核酸鹼基；T表示三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、或二甲氧基三苯甲基；L表示氫、醯基、或以下通式(IV)所示之基(以下，稱為基(IV))。]

就B^P相關之「核酸鹼基」而言，可列舉與Base相同之「核酸鹼基」。但是，B^P相關之核酸鹼基的胺基或羥基可經保護。

就該胺基之保護基而言，只要可使用作為核酸之保護基者即可，無特別限制，具體而言，可列舉如：苯甲醯基、4-甲氧基苯甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、苯基乙醯基、苯氧基乙醯基、4-三級丁基苯氧基乙醯基、4-異丙基苯氧基乙醯基、(二甲基胺基)亞甲基。就羥基之保護基而言，可列舉如2-氰基乙基、4-硝基苯乙基、苯基磺醯基乙基、甲基磺醯基乙基、三甲基矽基乙基、在可取代之任何位置可經1至5個電子吸引性基取代的苯基、二苯基胺甲醯基、二甲基胺甲醯基、二乙基胺甲醯基、甲基苯基胺甲醯基、1-吡咯啶基胺甲醯基、N-嗎啉基胺甲醯基、4-(三級丁基羧基)苄基、4-[(二甲基胺基)羧基]苄基、4-(苯基羧基)苄基(例如，參照國際公開公報第2009/064471號公報)。

就「固相支持體」而言，只要可使用於核酸之固相反應的支持體即可，無特別限制，不過期望符合下列條件：(i)幾乎不溶於合成N-嗎啉基核酸衍生物中所使用的試藥 (例如，二氯甲烷、乙腈、四唑、N-甲基咪唑、吡啶、乙酸酐、二甲基吡啶、三氟乙酸)；(ii)對於合成N-嗎啉基核酸衍生物中所使用的試藥在化學上安定；(iii)可進行化學修飾；(iv)較佳可進行N-嗎啉基核酸衍生物之裝填、(v)具有能耐受處理中施予之高壓的充分強度、(vi)較佳以一定粒徑範圍分布。具體而言，可列舉膨潤性聚苯乙烯(例如，胺基甲基聚苯乙烯樹脂經1%二苄基苯交聯者(200至400網孔(mesh))(2.4至3.0mmol/g)(東京化成公司製)、胺甲基化聚苯乙烯樹脂．HCl[1%二苄基苯，100至200網孔](肽研究所公司製))、非膨潤性聚苯乙烯(例如，Primer Support(GE Healthcare公司製))、PEG鏈結合型聚苯乙烯(例如，NH₂-PEG 樹脂(渡邊化學公司製)、TentaGel resin)、定孔玻璃(controlled pore glass；CPG)(例如，CPG公司製)、草醯基化-定孔玻璃(例如，參照Alul氏等，Nucleic Acids Research,Vol.19,1527(1991))、TentaGel支持體-胺基聚乙二醇衍生物化支持體(例如，參照Wright氏等，Tetrahedron Letters,Vol.34,3373(1993))、Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯之共聚物。

就「連接基」而言，可使用通常用於將核酸或N-嗎啉基核酸衍生物連結之周知連接基，惟可列舉如：3-胺基丙基、琥珀醯基、2,2’-二乙醇磺醯基、長鏈烷基胺基(LCAA)。

本步驟可藉由使化合物(II)與酸作用而實施。

就可使用於本步驟之「酸」而言，可列舉如：三氟乙酸、二氯乙酸或三氯乙酸。就酸之使用量而言，例如，相對於化合物(II)1莫耳，以在0.1莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內為宜，以在1莫耳當量至100莫耳當量之範圍內為較佳。

又，可與前述酸一起使用有機胺。就有機胺而言，無特別限定，可列舉如三乙基胺。有機胺之使用量，例如，相對於酸1莫耳，以在0.01莫耳當量至10莫耳當量之範圍內為宜，以在0.1莫耳當量至2莫耳當量之範圍內為較佳。

在本步驟中使用酸與有機胺之鹽或混合物的情況，可列舉如：三氟乙酸與三乙基胺之鹽或混合物，更具體而言，可列舉相對於2當量之三氟乙酸，以1當量之三乙基胺來混合者。

可使用於本步驟中之酸，可用適當溶劑稀釋成在0.1%至30%之範圍內的濃度而使用。就溶劑而言，只要不參與反應即可，無特別限定，可列舉如：二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或此等之混合物。

上述反應之反應溫度，以在例如10℃至50℃之範圍內為較佳，更佳為在20℃至40℃之範圍內，進一步更佳為在25℃至35℃之範圍內。

反應時間雖隨使用之酸的種類、反應溫度而異，然而通常以0.1分鐘至24小時之範圍內為宜。較佳在1分鐘至5小時之範圍內。

又，本步驟終了後，視需要可添加用於將系統中存在之酸中和的鹼。就「鹼」而言，無特別限定，可列舉如二異丙基胺。鹼亦可藉由適當溶劑稀釋成在0.1% (v/v)至30%(v/v)之範圍內的濃度而使用。

就本步驟中所用之溶劑而言，只要不參與反應即可，無特別限定，可列舉：二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或此等之混合物。反應溫度以例如，在10℃至50℃之範圍內為較佳，更佳為在20℃至40℃之範圍內，進一步更佳為在25℃至35℃之範圍內。

反應時間雖隨使用之鹼的種類、反應溫度而異，然而通常以在0.1分鐘至24小時之範圍內為宜，較佳為1分鐘至5小時之範圍內。

再者，在化合物(II)中，n=1，L為基(IV)之以下通式(IIa)所示之化合物(以下，稱為化合物(IIa))，可依照以下之方法製造。

[式中，B^P、T、連結基、固相支持體與前述同義]。

步驟1：

藉由使以下通式(V)所示之化合物與醯基化劑作用，製造以下通式(VI)所示之化合物(以下，稱為化合物(VI))的步驟。

[式中，B^P、T、連結基與前述同義；R⁴表示羥基、鹵素、或胺基]。

本步驟可用化合物(V)作為起始原料，藉由周知之連結基的導入反應而實施。

尤其，以下通式(VIa)所示之化合物，可藉由實施已知方法，即用化合物(V)及琥珀酸酐進行酯化反應而製造。

[式中，B^P、T與前述同義]。

步驟2：

藉由使化合物(VI)與縮合劑等作用，並與固相支持體反應而製造化合物(IIa)的步驟。

[式中，B^P、R⁴、T、連結基、固相支持體與前述同義]。

本步驟可藉由已知的方法，即使用化合物(VI)及固相支持體進行縮合反應而製造。

在化合物(II)中，n=2至99，L為基(IV)之以下通式(IIa2)所示之化合物，可藉由以化合物(IIa)作為起始原料，將本說明書記載之PMO製法中的步驟A及步驟B重覆實施期望之次數而製造。

[式中，B^P、R²、R³、T、連結基、固相支持體與前述同義；n’表示1至98]。

又，在化合物(II)中，n=1，L為氫之以下通式(IIb)所示之化合物，可藉由例如，國際公開公報第1991/009033號記載之方法而製造。

[式中，B^P、T與前述同義]。

在化合物(II)中，n=2至99，L為氫之以下通式(IIb2)所示之化合物，可藉由以化合物(IIb)作為起始原料，藉由將本說明書記載之PMO製法中的步驟A及步驟B重覆實施期望之次數而製造。

[式中，B^P、n’、R²、R³、T與前述同義]。

又，在化合物(II)中，n=1，L為醯基之以下通式(IIc)所示之化合物，可藉由實施已知方法，即對化合物(IIb)進行醯基化反應而製造。

[式中，B^P、T與前述同義；R⁵表示醯基]。

在化合物(II)中，n=2至99，L為醯基之以下通式(IIc2)所示之化合物，可藉由以化合物(IIc)作為起始原料，將本說明書記載之PMO製法中的步驟A及步驟B重覆實施期望之次數而製造。

[式中，B^P、n’、R²、R³、R⁵、T與前述同義]。

(2)步驟B：

藉由使化合物(III)於鹼存在下與N-嗎啉基單體化合物作用，製造以下通式(VII)所示之化合物(以下，稱為化合物(VII))的步驟。

[式中，各B^P、L、n、R²、R³、T與前述同義]。

本步驟可藉由使化合物(III)於鹼存在下與N-嗎啉基單體化合物作用而實施。

就N-嗎啉基單體化合物而言，可列舉如以下通式(VIII)所示之化合物。

[式中，B^P、R²、R³、T與前述同義]。

就本步驟中可使用之「鹼」而言，可列舉如：二異丙基胺、三乙基胺、或N-乙基嗎啉。就鹼之使用量而言，例如，相對於1莫耳之化合物(III)，以在1莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內為宜，以在10莫耳當量至100莫耳當量之範圍內為較佳。

可使用於本步驟中之N-嗎啉基單體化合物及鹼，亦可用適當溶劑稀釋成0.1%至30%之濃度而使用。就溶劑而言，只要不參與反應即可，無特別限定，然而可列舉如：N,N-二甲基咪唑啉酮、N-甲基哌啶酮、DMF、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃、或此等之混合物。

反應溫度以例如在0℃至100℃之範圍內為較佳，更佳為在10℃至50℃之範圍內。

反應時間雖隨使用之鹼的種類、反應溫度而異，然而通常以在1分鐘至48小時之範圍內為宜，以在30分鐘至24小時之範圍內為較佳。

再者，本步驟終了後，可視需要添加醯基化劑。就「醯基化劑」而言，可列舉如：乙酸酐、乙醯氯、苯氧基乙酸酐。醯基化劑亦可用適當溶劑稀釋成如0.1%至30%之範圍內的濃度而使用。就溶劑而言，只要不參與反應即可，無特別限定，可列舉如：二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或此等之混合物。

又，視需要可與醯基化劑一起使用，例如，吡啶、二甲基吡啶、三甲基吡啶、三乙基胺、二異丙基乙基胺、N-乙基嗎啉等鹼。就醯基化劑之使用量而言，以在0.1莫耳當量至10000莫耳當量之範圍內為較佳，以在1莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內為更佳。就鹼之使用量而言，例如，相對於1莫耳之醯基化劑，以在0.1莫耳當量至100莫耳當量之範圍內為宜，以在1莫耳當量至10莫耳當量之範圍內為較佳。

本反應之反應溫度可在10℃至50℃之範圍內，較佳在 10℃至50℃之範圍內，更佳在20℃至40℃之範圍內，進一步更佳在25℃至35℃之範圍內。反應時間雖隨例如，使用之醯基化劑的種類、反應溫度而異，然而通常以在0.1分鐘至24小時之範圍內為宜，以在1分鐘至5小時之範圍內為較佳。

(3)步驟C：

在步驟B中所製造之化合物(VII)中，使用脫保護劑將保護基脫離，製造通式(IX)所示之化合物的步驟。

[式中，Base、B^P、L、n、R²、R³、T與前述同義]。

本步驟可藉由使化合物(VII)與脫保護劑作用而實施。

就「脫保護劑」而言，可列舉如：濃氨水、甲基胺。可使用於本步驟中之「脫保護劑」，亦可用例如，水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃、DMF、N,N-二甲基咪唑啉酮、N-甲基哌啶酮或此等之混合溶劑稀釋而使用。其中，以乙醇為較佳。就脫保護劑之使用量而言，例如，相對於1莫耳之化合物(VII)，以在1莫耳當量至 100000莫耳當量之範圍內為宜，以在10莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內為較佳。

反應溫度以在例如15℃至75℃之範圍內為宜，以在40℃至70℃之範圍內為較佳，以在50℃至60℃之範圍內為更佳。脫保護反應時間雖隨化合物(VII)之種類、反應溫度等而異，然而以在10分鐘至30小時之範圍內為宜，以在30分鐘至24小時之範圍內為較佳，以在5小時至20小時之範圍內為更佳。

(4)步驟D：

藉由使步驟C中所製造之化合物(IX)與酸作用，製造PMO(I)之步驟。

[式中，Base、n、R²、R³、T與前述同義]。

本步驟可藉由於化合物(IX)中加酸而實施。

就可使用於本步驟中之「酸」而言，可列舉如：三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸、磷酸及鹽酸等。就酸之使用量而言，例如，以使溶液之pH在0.1至4.0之範圍內來使用為宜，更佳成為在1.0至3.0之範圍內來使用。就溶劑而言，只要未參與反應即可，無特別限定，可列舉如：乙腈、水、或此等之混合溶劑。

反應溫度以在10℃至50℃之範圍內為較佳，更佳為在20℃至40℃之範圍內，進一步更佳為在25℃至35℃之範圍內。脫保護反應時間雖隨化合物(IX)之種類、反應溫度等而異，然而以在0.1分鐘至5小時之範圍內為宜，以在1分鐘至1小時之範圍內為較佳，以在1分鐘至30分鐘之範圍內為更佳。

PMO(I)係可從本步驟中所得到之反應混合物，以通常之分離精製手段，例如萃取、濃縮、中和、過濾、離心、再結晶、C₈至C₁₈之逆相管柱層析、陽離子交換管柱層析、陰離子交換管柱層析、凝膠過濾管柱層析、高速液體層析、透析、超濾等手段單獨或組合使用而得到，亦可視期望將PMO(I)單離精製(例如，參照國際公開公報WO1991/09033)。

在使用逆相層析將PMO(I)精製之情況，就溶出溶劑而言，可使用例如20mM之三乙基胺/乙酸緩衝液與乙腈的混合溶液。

又，在使用離子交換層析精製PMO(I)之情況，可使用例如1M之食鹽水與10mM之氫氧化鈉水溶液的混合溶液。

前述肽核酸寡聚物，係以下述通式所示之基為構成單元的本發明寡聚物。

(式中，Base與前述同義)。

肽核酸可依照例如以下之文獻而製造。

1)P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt，Science, 254, 1497 (1991)

2)M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg，Jacs., 114, 1895 (1992)

3)K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt，J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)

4)L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm，O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)

5)T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

又，本發明之寡聚物，5’末端可為下述化學式(1)至(3)之任一基。較佳為(3)-OH。

以下，將上述(1)、(2)及(3)所示之基分別稱為「基(1)」、「基(2)」及「基(3)」。

2.醫藥組成物

本發明之寡聚物可使肌縮蛋白基因之外顯子44跳讀。因此，預測藉由將含有本發明之寡聚物的醫藥組成物投與至在肌縮蛋白基因具有成為外顯子44跳讀之對象之變異(以外顯子44跳讀之整碼(in-frame)化變異)的DMD患者，可緩和肌肉營養不良之症狀。又，鏈長度短之本發明寡聚物，製造步驟簡便，有進一步抑制製造成本之優點。

就其他實施態樣而言，提供以本發明之寡聚物、其醫藥上可容許之鹽或水合物作為有效成分的肌肉營養不良治療用醫藥組成物(以下，稱為「本發明之組成物」)。

就本發明之組成物所含之本發明寡聚物之醫藥上可容許之鹽的例子而言，可列舉如：如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽之鹼土金屬鹽；如鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等之金屬鹽；銨鹽；如三級辛基胺鹽、二苄基胺鹽、嗎啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷酯鹽、伸乙基二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N'-二苄基伸乙基二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙基胺鹽、哌嗪鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽之有機胺鹽；如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽之氫鹵酸鹽；如硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等之無機酸鹽；如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽之低級烷磺酸鹽；如苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽之芳基磺酸鹽；如乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等之有機酸鹽；如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽之胺基酸鹽等。此等鹽可藉由周知之方法製造。或者，本發明之組成物中所含之本發明寡聚物亦可為其水合物之形式。

本發明之組成物的投與形式，只要為醫藥上可容許之投與形式即可，無特別限制，可依照治療方法而選擇，然而從對肌肉組織之輸送容易性的觀點而言，以靜脈內投與、動脈內投與、肌肉內投與、皮下投與、經口投與、組織內投與、經皮投與等為較佳。又，就本發明之組成物所採取的劑型而言，無特別限制，不過可列舉如：各種注射劑、經口劑、點滴劑、吸入劑、軟膏劑、洗劑等。

在將本發明之寡聚物投與至肌肉營養不良患者之情況，本發明之組成物以含有促進該寡聚物輸送至肌肉組織之支持體為較佳。此種支持體只要醫藥上可容許者即可，無特別限制，就其例而言，可列舉陽離子性脂質體、陽離子性聚合物等陽離子性支持體、或利用病毒胞膜之支持體。就陽離子性脂質體而言，可列舉如：以2-O-(2-二乙基胺基乙基)胺甲醯基-1,3-O-二油醯基甘油及磷脂質作為必需構成成分而形成之脂質體(以下，稱為「脂質體A」)、Oligofectamine(註冊商標)(Invitrogen公司製)、Lipofectin(註冊商標)(Invitrogen公司製)、Lipofectamine(註冊商標)(Invitrogen公司製)、Lipofectamine 2000(註冊商標)(Invitrogen公司製)、DMRIE-C(註冊商標)(Invitrogen公司製)、GeneSilencer(註冊商標)(Gene Therapy Systems公司製)、TransMessenger(註冊商標)(QIAGEN公司製)、TransIT TKO(註冊商標)(Mirus公司製)、Nucleofector II(Lonza)。其中，以脂質體A為較佳。就陽離子性聚合物而言，可列舉如：JetSI(註冊商標)(Qbiogene公司製)、Jet-PEI(註冊商標)(聚伸乙基亞胺，Qbiogene公司製)。就利用病毒胞膜之支持體而言，可列舉如：GenomeOne(註冊商標)(HVJ-E脂質體，石原產業公司製)。或者，亦可使用專利2924179號記載之醫藥裝置、專利再公表公報第2006/129594號及專利再公表公報第2008/096690號記載之陽離子性支持體。

本發明之組成物中所含之本發明之寡聚物的濃度，雖隨支持體之種類等而異，然而以在0.1nM至100μM之範圍內為宜，以在1nM至10μM之範圍內為較佳，以在10nM至1μM之範圍內為更佳。又，本發明之組成物中所含之本發明之寡聚物及支持體的重量比(支持體/本發明之寡聚物)，雖隨該寡聚物之性質及該支持體之種類等而異，然而以在0.1至100之範圍內為宜，以在1至50之範圍內為較佳，以在10至20之範圍內為更佳。

在本發明之組成物中，除本發明之寡聚物及上述之支持體以外，可任意摻配醫藥上可容許之添加劑。就該添加劑而言，可列舉如：乳化補助劑(例如，碳數6至22之脂肪酸或其醫藥上可容許之鹽、白蛋白、葡聚醣)、安定化劑(例如，膽固醇、磷脂酸)、等張化劑(例如，氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖)、pH調整劑(例如，鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三乙醇胺)。可使用此等之一種或二種以上。本發明之組成物中該添加劑之含量，以90重量%以下為宜，以70重量%以下為較佳，以50重量%以下為更佳。

本發明之組成物，可藉由在支持體之分散液中添加本發明之寡聚物，並適當地攪拌而調製。又，添加劑可於本發明之寡聚物的添加前，或添加後，於適當步驟中添加。就添加本發明之寡聚物時所能使用之水性溶劑而言，只要醫藥上可容許者即可，無特別限制，可列舉如：注射用水、注射用蒸餾水、生理食鹽水等電解質液、葡萄糖液、麥芽糖液等糖液。又，該情況之pH及溫度等之條件，本技術領域人士可適宜選擇。

本發明之組成物可製成例如液劑或其凍結乾燥製劑。該凍結乾燥製劑可依照常法，將具有液劑形式的本發明組成物，藉由凍結乾燥處理而調製。例如，將具有液劑形式的本發明組成物進行適當滅菌後，將設定量分注於小瓶中，於約-40至-20℃之條件下進行約2小時之預備凍結，並於約0至10℃，減壓下進行一次乾燥，繼而於約15至25℃，減壓下二次乾燥，即可實施凍結乾燥。接著，一般將小瓶內部以氮氣置換，並封頂，即可得到本發明之組成物的凍結乾燥製劑。

本發明組成物的凍結乾燥製劑，一般可藉由添加任意之適當溶液(再溶解液)，再溶解而使用。就此種再溶解液而言，可列舉：注射用水、生理食鹽水、其他一般輸液。此種再溶解液之液量，雖隨用途等而異，無特別限制，不過以凍結乾燥前之液量之0.5至2倍量或500mL以下為宜。

就投與本發明之組成物時的用量而言，以考慮所含之本發明寡聚物的種類、劑型，年齡及體重等患者狀態，投與途徑，疾病之性質及程度而調製為較佳，不過對於成人，本發明寡聚物的量一般在每1日0.1mg至10g/人之範圍內，較佳在1mg至1g/人之範圍內。此數值有時亦隨標的疾病之種類、投與形式、標的分子而異。因此，視情況有時在此劑量以下即充分，又，相反地，有時必須大於上述用量。又，可進行1日1次至數次之投與或以1日至數日的間隔投與。

就本發明之組成物的其他態樣而言，可列舉含有可表現本發明寡核苷酸的載體及上述支持體的醫藥組成物。該表現載體亦可為能表現複數個本發明之寡核苷酸者。在該組成物中，與含有本發明寡聚物之本發明組成物同樣地，可添加醫藥上可容許之添加劑。該組成物中所含之表現載體的濃度，雖隨支持體之種類等而異，然而以在0.1nM至100μM之範圍內為宜，以在1nM至10μM之範圍內為較佳，以在10nM至1μM之範圍內為更佳。該組成物中所含之表現載體與支持體的重量比(支持體/表現載體)，雖隨表現載體之性質、支持體之種類等而異，然而以在0.1至100之範圍內為宜，以在1至50之範圍內為較佳，以在10至20之範圍內為更佳。又，該組成物中所含之支持體的含量，與含有本發明寡聚物的本發明組成物的情況相同，關於其調製方法等，亦與本發明組成物的情況相同。

以下，揭示實施例及試驗例，以更詳細說明本發明，不過本發明並不限定於實施例中所示的範圍。

[實施例] [參考例1]

承載於胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(4-苄醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸

步驟1：4-{[(2S,6R)-6-(4-苄醯胺-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸之製造

在氬氛圍下，將3.44g之N-{1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苄醯胺及1.1g之4-二甲基胺基吡啶(4-DMAP)懸浮於50mL之二氯甲烷中，添加0.90g之琥珀酸酐，並於室溫攪拌3小時。在反應液中添加10mL之甲醇，並減壓濃縮。對於殘餘物，使用乙酸乙酯及0.5M之磷酸二氫鉀水溶液進行萃取操作。將所得到之有機層以0.5M之磷酸二氫鉀水溶液、水、飽和食鹽水的順序洗淨。將所得到之有機層用硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，得到4.0g之目的物。

步驟2：承載於胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(4-苄醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸的製造

將4.0g之4-{[(2S,6R)-6-(4-苄醯胺-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸溶解於200mL之吡啶(脫水)，添加0.73g之4-DMAP、11.5g之1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽。繼而，添加25.0g之胺基聚苯乙烯樹脂Primer support 200 amino(GE HealthcareJapan公司製，17-5214-97)、8.5mL之三乙基胺，並於室溫振動4日。反應後，濾取樹脂。將所得到之樹脂依吡啶、甲醇、二氯甲烷之順序洗淨，並減壓乾燥。在所得到之樹脂中，添加200mL之四氫呋喃(脫水)、15mL之乙酸酐、15mL之2,6-二甲基吡啶，並於室溫振動2小時。濾取樹脂，依吡啶、甲醇、二氯甲烷之順序洗淨，減壓乾燥，得到26.7g之目的物。

該目的物之裝載(loading)量，係使用周知之方法，藉由測定於409nm之UV吸光度而決定每1g樹脂之三苯甲基的莫耳量。樹脂之裝載量為129.2μmol/g。

UV測定條件

機器：U-2910(日立製作所)

溶劑：甲磺酸

波長：409nm

ε值：45000

[參考例2]

承載於胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸

依照與參考例1同樣之方法製造標題化合物。但是，在本步驟中，使用1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮代替參考例1之步驟1所用的N-{1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苄醯胺。

該目的物之裝載量，係使用周知之方法，藉由測定於409nm之UV吸光度而決定每1g樹脂之三苯甲基的莫耳量。樹脂之裝載量為164.0μmol/g。

[參考例3]

承載於胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(6-苄醯胺嘌呤-9-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸

依照與參考例1同樣之方法製造標題化合物。但是，在本步驟中，使用N-{9-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]嘌呤-6-基}苄醯胺代替參考例1之步驟1中所用的N-{1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苄醯胺。

該目的物之裝載量，係使用周知之方法，藉由測定於409nm之UV吸光度而決定每1g樹脂之三苯甲基的莫耳量。樹脂之裝載量為185.7μmol/g。

[參考例4]

承載於胺基聚苯乙烯樹脂之4-{{(2S,6R)-6-{6-(2-氰基乙氧基)-2-[(2-苯氧基乙醯基)胺基]嘌呤-9-基}-4-三苯甲基嗎啉-2-基}甲氧基}-4-側氧基丁酸

依照與參考例1同樣之方法，製造標題化合物。但是，在本步驟中，使用N-{6-(2-氰基乙氧基)-9-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]嘌呤-2-基}-2-苯氧基乙醯胺代替參考例1之步驟1中所用的N-{1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苄醯胺。

該目的物之裝載量，係使用周知之方法，藉由測定於409nm之UV吸光度而決定每1g樹脂之三苯甲基的莫耳量。樹脂之裝載量為164.8μmol/g。

依照以下之實施例1的記載，合成表1之PMO編號1至118所示的PMO。PMO編號119及120係從Jene Tools公司購入。將合成之PMO以注射用水(大塚製藥工場公司製)溶解。

[實施例1]

將對應於5’末端鹼基且承載於胺基聚苯乙烯樹脂的4-{[(2S,6R)-6-(4-苄醯胺-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例1)、或承載於胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸 (參考例2)、或承載於胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(6-苄醯胺嘌呤-9-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例3)、或承載於胺基聚苯乙烯樹脂之4-{{(2S,6R)-6-{6-(2-氰基乙氧基)-2-[(2-苯氧基乙醯基)胺基]嘌呤-9-基}-4-三苯甲基嗎啉-2-基}甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例4)0.2g，充填於附過濾器之管柱中，使用核酸合成機(AKTA Oligopilot 10 plus)開始下述合成循環。為了形成如表1記載之各化合物的鹼基序列，在各偶合循環中添加期望之N-嗎啉基單體化合物(參照下述表2)。

再者，就去封阻溶液(deblock solution)而言，使用含有3%(w/v)三氟乙酸之二氯甲烷溶液。就中和/ 洗淨溶液而言，使用以含有35%(v/v)之乙腈的二氯甲烷溶液溶解N,N-二異丙基乙基胺使其成為10%(v/v)並溶解四氫呋喃使其成為5%(v/v)者。就偶合溶液A而言，使用以四氫呋喃溶解N-嗎啉基單體化合物使其成為0.10M者。就偶合溶液B而言，使用以乙腈溶解N,N-二異丙基乙基胺使其成為20%(v/v)，且溶解四氫呋喃使其成為10%(v/v)者。就封端(capping)溶液而言，使用於乙腈中溶解有20%(v/v)之乙酸酐及30%(v/v)之2,6-二甲基吡啶者。

將上述所合成之承載於PMO的胺基聚苯乙烯樹脂從反應容器回收，於室溫減壓乾燥2小時以上。將經乾燥之承載於胺基聚苯乙烯樹脂的PMO加入反應容器中，添加5mL之28%氨水-乙醇(1/4)，並於55℃攪拌15小時。濾除胺基聚苯乙烯樹脂，並以1mL之水-乙醇(1/4)洗淨。將所得到之濾液減壓濃縮。將所得到之殘餘物溶解於20mM之乙酸-三乙基胺緩衝液(TEAA緩衝液)及乙腈之混合溶劑(4/1)10mL中，並以隔膜過濾器過濾。將所得到之濾液藉由逆相HPLC精製。所使用之條件如以下之表3所示。

分析各分液(fraction)，回收目的物，並減壓濃縮。在濃縮殘餘物中添加0.5mL之2M之磷酸水溶液，並攪拌15分鐘。再者，添加2mL之2M之氫氧化鈉水溶液，調成鹼性，並以隔膜過濾器(0.45μm)過濾。

將所得到之含有目的物的水溶液藉由陰離子交換樹脂管柱精製。所使用之條件如下述表4所示。

將各分液進行分析(HPLC)，得到為水溶液之目的物。在所得到之水溶液中，添加0.1M之磷酸緩衝液(pH 6.0)，進行中和。繼而，以下述表5所示之條件，藉由逆相HPLC脫鹽。

回收目的物，並減壓濃縮。將所得到之殘餘物溶於水中，並凍結乾燥，得到為白色綿狀固體之目的化合物。將ESI-TOF-MS之計算值、測定值示於下述表6中。

[試驗例1]

試管內檢定

使用Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L，藉由Nucleofector H(Lonza)將表1之反義寡聚物(0.1至30μM)導入3.5×10⁵個之RD細胞(人類橫紋肌腫瘤細胞株)中。程式係使用T-030。

導入後，將細胞在2mL之含10%牛胎兒血清(FCS)(Invitrogen公司製)之伊格氏最低基本培養基(Eagle's minimal essential medium(EMEM))(Sigma公司製，以下同)中，於37℃，5%CO₂條件下培養三晚。

將細胞用PBS(日水公司製，以下同)洗淨1次後，將含有1%之2-巰基乙醇(Nakalai Tesque公司製)的Buffer RLT(Qiagen公司製)添加於350μL細胞中，於室溫放置數分鐘，使細胞溶解，並回收於QIAshredder均質機(Qiagen公司製)中。以15,000rpm離心2分鐘，製作均質液。依照隨附於RNeasy Mini Kit(Qiagen公司製)之規程(protocol)，萃取全部RNA。所萃取之全部RNA的濃度係使用NanoDrop ND-1000(LMS公司製)來測定。

對於所萃取之全部RNA 400ng，使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(Qiagen公司製)，進行單一步驟RT-PCR(One-Step RT-PCR)。依照隨附於套組之規程調製反應液。熱循環儀(thermal cycler)係使用PTC-100(MJ Research公司製)或TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch(Takara Bio公司製)。所使用之RT-PCR的計劃(program)如以下所示。

50℃、30分鐘：逆轉錄反應

95℃、15分鐘：聚合酶活化、逆轉錄酵素不活化、cDNA熱變性

[94℃、30秒；60℃、30秒；72℃、1分鐘]x 35循環：PCR增幅

72℃、10分鐘：最終伸長反應

使用於RT-PCR之正向引子及反向引子的鹼基序列係如以下所示。

正向引子：5’-GCTCAGGTCGGATTGACATT-3’(序列編號125)

反向引子：5’-GGGCAACTCTTCCACCAGTA-3’(序列編號126)

將上述PCR之反應產物1μL，使用Bioanalyzer(Agilent公司製)解析。

測定外顯子44跳讀之區帶的聚核苷酸量「A」，及外顯子44未跳讀之區帶的聚核苷酸量「B」。基於此等「A」及「B」之測定值(單位：nmol/L)，依照以下之公式求取跳讀效率。

跳讀效率(%)=A/(A+B)x100

實驗結果

將結果示於第1至26圖。藉由本實驗，判定將從人類之野生型肌縮蛋白基因之外顯子44的核苷酸序列(序列編號10)之中，由5‘末端數起第-1至44號(序列編號1)、及第58至115號(序列編號2)中所選出之短單元寡聚物連結而得到的本發明寡聚物可有效地使外顯子44跳讀。

[試驗例2]

試管內檢定

以與試驗例1同樣之方法進行實驗。但是，使用Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L，藉由Nucleofector II(Lonza)，將PMO編號34、100、45、73、49、47之本發明寡聚物各以1、3、或10μM之濃度導入3.5×10⁵個之RD細胞(人類橫紋肌腫瘤細胞株)中，其中上述本發明寡聚物可單獨導入，或將構成各個之2條單元寡聚物分別單獨或混合地導入。程式係使用T-030。導入之序列的組合係如以下所示。

實驗結果

將結果示於第27至31圖。從本實驗判定以外顯子44內為標的之PMO編號110至115、PMO編號117及PMO編號118，各在單獨導入之情況，未使外顯子44跳讀。又，與以外顯子44內相異之部位為標的之2條反義核酸的混合物(PMO編號114與PMO編號115、PMO編號109與PMO編號114、PMO編號110與PMO編號111、PMO編號112與PMO編號113、PMO編號117與PMO編號118、及PMO編號119與PMO編號120)相比，將各個連結而成之PMO編號34、PMO編號100、PMO編號45、PMO編號73、PMO編號49、PMO編號47，即本發明之寡聚物，以高效率使外顯子44跳讀。

[試驗例3]

使用人類纖維母細胞之試管內檢定

使用GM05112細胞(來自外顯子45缺損型DMD患者之纖維母細胞，Coriell Institute for Medical Research)，檢討本發明之寡聚物的外顯子44跳讀活性。增殖培養基係使用含有10%FCS(Hyclone Laboratories)及1%青黴素/鏈黴素(P/S)(Sigma Aldrich公司)之經杜百可修飾之伊格培養基：養分混合物F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12；DMEM/F-12)(Life Technologies公司)，於5% CO₂存在下，在37℃培養。

細胞係於T225燒瓶中培養，相對於增殖培養基30mL，添加2.5mL之來自人類的myoD(序列編號127)表現逆轉錄病毒(ZsGreen1共表現)及終濃度為8μg/mL之Polybrene(Sigma Aldrich公司)。於32℃培養2日後，以新鮮之增殖培養基進行培養基交換，進一步於37℃培養3日。藉由BD FACSAria Cell Sorter(BD Bioscience公司)，以選擇ZsGreen1陽性細胞之方式，回收MyoD轉換纖維母細胞。將回收之細胞懸浮於分化培養基(含有2%馬血清(Life Technologies公司)、1%P/S及ITS液體培養基補充物(Sigma Aldrich公司)之DMEM/F-12)中，並以9.4×10⁴個細胞/孔播種於經膠原塗覆之24-孔培養盤中。每2至3日進行培養基交換，同時培養，誘導分化為肌小管細胞。

在播種於24-孔培養盤後之第7日，交換成分化培養基，在該分化培養基中，添加有PMO編號34、45、49及73並使終濃度成為10μM。培育2日後，交換成不含PMO之分化培養基，進一步培育5日。回收細胞，並使用RNeasyMini套組(Qiagen公司)萃取全部RNA。對於所萃取之全部RNA 50ng，使用QIAGEN OneStep RT-PCR套組進行RT-PCR。依照隨附之規程調製反應液。熱循環儀係使用iCycler(Bio-Rad Laboratories)。所用之RT-PCR的計劃係如以下所示。

50℃、30分鐘：逆轉錄反應

95℃、15分鐘：聚合酶活化、逆轉錄酵素不活化、cDNA熱變性

[94℃、1分鐘；60℃、1分鐘；72℃、1分鐘]x 35循環：PCR增幅

72℃、7分鐘：最終伸長反應

使用於RT-PCR之正向引子及反向引子的鹼基序列係如以下所示：

正向引子：5’-GCTCAGGTCGGATTGACATT-3’(序列編號125)；

反向引子：5’-GGGCAACTCTTCCACCAGTA-3’(序列編號126)。

使用Experion DNA 1K Analysis Kits(Bio-Rad Laboratories)，將1μL之PCR產物用Experion Electrophoresis Station(Bio-Rad Laboratories)解析。在Experion Software version 3.2(Bio-Rad Laboratories)上選擇DNA 1K assay，進行測定。藉由Experion Software，將317bp附近之區帶(A)及465bp附近之區帶(B)進行定量(單位：nmol/L)。使用Excel 2007 SP3(Microsoft)，藉由以下之公式求取跳讀效率(%)。

跳讀效率(%)=A/(A+B)x 100

實驗結果

將結果示於第32圖。藉由本實驗，判定本發明之寡聚物PMO編號34、45、49及73，在來自外顯子45缺損型DMD患者之細胞中，以高效率使外顯子44跳讀。

[產業上之可利用性]

從試驗例所示之實驗結果，顯示將短寡聚物連結而得的本發明之寡聚物，在RD細胞中引起外顯子44跳讀。因此，本發明之寡聚物在DMD之治療上非常有用。

<110> 日本新藥股份有限公司國立研究開發法人國立精神‧神經醫療研究中心

<120> 反義核酸

<130> G1076WO

<150> JP 2014-124157

<151> 2014-06-17

<160> 128

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 1

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 2

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 3

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 4

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 5

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 6

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

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<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成之核酸

<400> 8

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成之核酸

<400> 9

<210> 10

<211> 148

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成之核酸

<400> 11

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 12

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<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成之核酸

<400> 13

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 14

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 15

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 16

<210> 17

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 17

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 18

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 19

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 20

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 21

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 22

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 23

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

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<223> 合成之核酸

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 25

<210> 26

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<212> DNA

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<223> 合成之核酸

<400> 26

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成之核酸

<400> 27

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 28

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 29

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 30

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 31

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 32

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 33

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 34

<210> 35

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 35

<210> 36

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 36

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 37

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<220>

<223> 合成之核酸

<400> 38

<210> 39

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 39

<210> 40

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 40

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<212> DNA

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<223> 合成之核酸

<400> 41

<210> 42

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成之核酸

<400> 42

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<212> DNA

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<223> 合成之核酸

<400> 43

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 44

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<212> DNA

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<223> 合成之核酸

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<212> DNA

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<223> 合成之核酸

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<212> DNA

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<223> 合成之核酸

<400> 47

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

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<212> DNA

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<223> 合成之核酸

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<223> 合成之核酸

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<223> 合成之核酸

<400> 51

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

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<220>

<223> 合成之核酸

<400> 52

<210> 53

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 53

<210> 54

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<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成之核酸

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 55

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成之核酸

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<223> 合成之核酸

<400> 57

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<223> 合成之核酸

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<223> 合成之核酸

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<223> 合成之核酸

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<223> 合成之核酸

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<223> 合成之核酸

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<223> 合成之核酸

<400> 63

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<223> 合成之核酸

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<223> 合成之核酸

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<223> 合成之核酸

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<223> 合成之核酸

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<223> 合成之核酸

<400> 68

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<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成之核酸

<400> 69

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<211> 24

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<213> 人工

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<223> 合成之核酸

<400> 70

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<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成之核酸

<400> 71

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 72

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<212> DNA

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<223> 合成之核酸

<400> 73

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<212> DNA

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<223> 合成之核酸

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<212> DNA

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<223> 合成之核酸

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<212> DNA

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<223> 合成之核酸

<400> 76

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<212> DNA

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<223> 合成之核酸

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<212> DNA

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<223> 合成之核酸

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成之核酸

<400> 79

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 80

<210> 81

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成之核酸

<400> 81

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 82

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<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成之核酸

<400> 83

<210> 84

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 84

<210> 85

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 85

<210> 86

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 86

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 87

<210> 88

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 88

<210> 89

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 89

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 90

<210> 91

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 91

<210> 92

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 92

<210> 93

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 93

<210> 94

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 94

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 95

<210> 96

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 96

<210> 97

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 97

<210> 98

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 98

<210> 99

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 99

<210> 100

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 100

<210> 101

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 101

<210> 102

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 102

<210> 103

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 103

<210> 104

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 104

<210> 105

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 105

<210> 106

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 106

<210> 107

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 107

<210> 108

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 108

<210> 109

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 109

<210> 110

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 110

<210> 111

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 111

<210> 112

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 112

<210> 113

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 113

<210> 114

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 114

<210> 115

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 115

<210> 116

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 116

<210> 117

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 117

<210> 118

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 118

<210> 119

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 119

<210> 120

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 120

<210> 121

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 121

<210> 122

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 122

<210> 123

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 123

<210> 124

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 124

<210> 125

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 125

<210> 126

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成之核酸

<400> 126

<210> 127

<211> 963

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(963)

<400> 127

<210> 128

<211> 320

<212> PRT

<213> 智人

<400> 128

由於本案的圖為試驗數據，並非本案的代表圖。

故本案無指定代表圖。

Claims

一種誘導外顯子之跳讀之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物為由下列(a)及(b)連結而成之15至30個鹼基長的反義寡聚物，(a)第1單元寡聚物，含有與人類肌縮蛋白基因的外顯子44內之連續7至15個鹼基之第1核苷酸序列互補的鹼基序列；及(b)第2單元寡聚物，含有與前述外顯子內之連續7至15個鹼基之第2核苷酸序列互補的鹼基序列；其中，前述第1核苷酸序列係自序列編號1或序列編號2所示之核苷酸序列選擇之連續7至15個鹼基的核苷酸序列，前述第2核苷酸序列係自序列編號1或序列編號2所示之核苷酸序列選擇之連續7至15個鹼基的核苷酸序列；其中該第1核苷酸序列及第2核苷酸序列非為連續或互相重複者，反義寡聚物為寡核苷酸的情況，構成該寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分及/或磷酸鍵部分係經過修飾(惟，包含選自序列編號6至9、55及106所構成之群組中的任一鹼基序列之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物除外)。
如申請專利範圍第1項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該第1核苷酸序列係從序列編號1所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基的核苷酸序列。
如申請專利範圍第1項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該第2核苷酸序列係從序列編號2所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基的核苷酸序列。
如申請專利範圍第1項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物係由選自以下(c)至(e)所構成之群組中的2個單元寡聚物連結而成者：(c)包含與從序列編號3所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基的核苷酸序列互補之鹼基序列的單元寡聚物；(d)包含與從序列編號4所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基的核苷酸序列互補之鹼基序列的單元寡聚物；及(e)包含與從序列編號5所示之核苷酸序列選出之連續7至15個鹼基的核苷酸序列互補之鹼基序列的單元寡聚物。
如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物係寡核苷酸。
如申請專利範圍第5項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中構成該寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分係2’位之-OH基以選自OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及I所構成之群組中之任一基置換的核糖，上述R表示烷基或芳基，上述R’表示伸烷基。
如申請專利範圍第5項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中構成該寡核苷酸之至少1個核苷酸的磷酸鍵部分係選自硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基膦酸酯鍵、胺基磷酸酯(phosphodiamidate)鍵、及硼烷化磷酸酯(boranophosphate)鍵所構成之群組中之任一者。
如申請專利範圍第1項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物係N-嗎啉基寡聚物(morpholino oligomer)。
如申請專利範圍第8項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物係二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物。
如申請專利範圍第8或9項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物，其中該反義寡聚物之5’末端係下述化學式(1)至(3)中之任一基：
一種肌肉營養不良治療用醫藥組成物，其係以如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物作為有效成分。
如申請專利範圍第11項所述之醫藥組成物，其進一步含有醫藥上可容許之支持體。
一種如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許之鹽或水合物、或如申請專利範圍第11或12項所述之該醫藥組成物的用途，其係用於治療患者肌肉營養不良之醫藥的製造。
如申請專利範圍第13項所述之用途，其中該肌肉營養不良患者係在肌縮蛋白基因具有變異的患者，而該變異為外顯子44跳讀之對象。
如申請專利範圍第13或14項所述之用途，其中該患者為人類。
一種製造如申請專利範圍第1項所述之反義寡聚物的方法，其包含藉由將下列(a)與(b)連結而製作15至30鹼基長之反義寡聚物的步驟，(a)第1單元寡聚物，含有與人類肌縮蛋白基因的外顯子44內之連續7至15個鹼基之第1核苷酸序列互補之鹼基序列；(b)第2單元寡聚物，含有與前述外顯子內之連續7至15個鹼基之第2核苷酸序列互補之鹼基序列；其中，該第1核苷酸序列及第2核苷酸序列非為連續或互相重複者；前述第1核苷酸序列係自序列編號1或序列編號2所示之核苷酸序列選擇之連續7至15個鹼基的核苷酸序列，前述第2核苷酸序列係自序列編號1或序列編號2所示之核苷酸序列選擇之連續7至15個鹼基的核苷酸序列；反義寡聚物為寡核苷酸的情況，構成該寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分及/或磷酸鍵部分係經過修飾。
如申請專利範圍第16項所述之方法，其進一步包含：測定該步驟中所得到之反義寡聚物之跳讀效率的步驟；及選擇具有超過基準值之跳讀效率之反義寡聚物的步驟。
一種反義寡聚物之篩選方法，其包含：(a)選擇下列(i)及(ii)的步驟：(i)第1單元寡聚物，含有與人類肌縮蛋白基因的外顯子44內之連續7至15個鹼基之第1核苷酸序列互補之鹼基序列；(ii)第2單元寡聚物，含有與該外顯子內之連續7至15個鹼基之第2核苷酸序列互補之鹼基序列(其中，該第1核苷酸序列及第2核苷酸序列非為連續或互相重複者)；前述第1核苷酸序列係自序列編號1或序列編號2所示之核苷酸序列選擇之連續7至15個鹼基的核苷酸序列，前述第2核苷酸序列係自序列編號1或序列編號2所示之核苷酸序列選擇之連續7至15個鹼基的核苷酸序列；反義寡聚物為寡核苷酸的情況，構成該寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分及/或磷酸鍵部分係經過修飾；(b)藉由將該第1及第2單寡聚物連結而製作15至30鹼基長之反義寡聚物的步驟；(c)測定該步驟(b)中所得到之反義寡聚物之跳讀效率的步驟；及(d)選擇具有超過基準值之跳讀效率之反義寡聚物的步驟。