TWI714661B

TWI714661B - 新穎念珠藻素化合物及接合物、其製備與其治療用途

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Publication number: TWI714661B
Application number: TW105135522A
Authority: TW
Inventors: 安東尼比蓋特; 哈維布夏德; 瑪莉普莉西拉布朗; 弗朗索瓦克雷; 紀東張
Original assignee: 法商賽諾菲公司
Priority date: 2015-11-05
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2021-01-01
Also published as: DK3371179T3; IL259067B; MX2018005379A; AR106604A1; HK1256754B; US20210163458A1; AU2016347724A1; PH12018500852B1; MA43160B1; CL2018001210A1; MY189448A; RS59498B1; JP6929292B2; ECSP18034035A; PH12018500852A1; WO2017076998A1; EA035625B1; MX374535B; HUE046033T2; US10941139B2

Abstract

本發明涉及式(I)的念珠藻素化合物：

本發明還涉及念珠藻素有效負載、念珠藻素接合物、含有它們的組合物以及它們的治療用途，特別是作為抗癌劑的治療用途。本發明還涉及製備這些接合物的方法。

Description

新穎念珠藻素化合物及接合物、其製備與其治療用途

本發明涉及新的念珠藻素(cryptophycin)化合物、新的念珠藻素有效負載(cryptophycin payloads)、新的念珠藻素接合物、含有它們的組合物以及它們的治療用途，特別是作為抗癌劑的治療用途。本發明還涉及製備這些接合物的方法。

念珠藻素類化合物作為次級代謝物屬於由念珠藻屬的藍細菌產生的縮酚酸肽大環類。該類分子的第一種代表性化合物即念珠藻素-1(C-1)在1990年從藍細菌念珠藻屬種(ATCC 53789)中分離(參見Eißler S.,et al.,Synthesis 2006,22,3747-3789)。以環氧化物官能團為特徵的念珠藻素C-1和C-52在20世紀90年代早期就被發現具有體外和體內抗腫瘤活性。C-8和C-55這些念珠藻素顯著更加活潑，但是並不能配製為穩定的溶液(Bionpally R.R.,et al.,Cancer Chemother Pharmacol 2003,52,25-33)。它們的更高的活性與它們推定的在細胞中產生相應環氧化物的能力相關。由於那時沒有方法精確地穩定念珠藻素，念珠藻素C-52(LY355703)進入了臨床研究，在具有30~40%穩定疾病的兩個II期肺癌實驗中產生了最低的抗腫瘤活性(30-40%的穩定疾病)，並且因此而中斷(Edelman M.J.,et al.,Lung Cancer 2003,39,197-99 和Sessa C.,et al.,Eur J Cancer 2002,38,2388-96)。

考慮到它們很高的潛能以及與美登醇(maytansinoids)和奧瑞他汀(auristatins)(這兩個細胞毒性分子在抗體藥物接合物(ADC)的臨床中是確認有效的)的共同的作用機制，該系列被認為對於ADC是有潛力的微管蛋白結合劑。因此，從大環的對位-苄基位置進行衍生開始開發了念珠藻素系列的接合物(Al-Awar R.S.,et al.,J Med Chem 2003,46,2985-3007)。

WO2011/001052記載了念珠藻素抗體藥物接合物，其中，細胞毒性部分使用多種連接基藉由對-苄基位置連接至抗體。他們可能是可剪切的、二硫化物或者蛋白酶-敏感的，或者非可剪切的。

對WO2011/001052中描述的念珠藻素抗體-藥物接合物的進一步優化得到了顯示有前景的抗腫瘤活性的潛在念珠藻素，但是卻發現其在小鼠的血漿中不穩定，同時在非齧齒類的血漿中是穩定的。因此，對於顯示改善穩定性的念珠藻素接合物存在需求。

本發明的目的為，提出一種新的念珠藻素大環化合物，其在共軛至抗體後，在小鼠血漿中是穩定的，並且提出一種新的包含該穩定大環化合物的念珠藻素接合物。

在該態樣中，本發明涉及式(I)的念珠藻素：

其中：￭R ₁代表(C₁-C₆)烷基；￭R ₂和R ₃彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；或者，R ₂和R ₃與它們所連接的碳原子一起形成(C₃-C₆)環烷基或(C₃-C₆)雜環烷基；￭R ₄和R ₅彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-NH(R₁₂)基團或(C₁-C₆)烷基-OH基團或(C₁-C₆)烷基-SH基團或(C₁-C₆)烷基-CO₂H基團；或者，R ₄和R ₅與它們所連接的碳原子一起形成(C₃-C₆)環烷基或(C₃-C₆)雜環烷基；￭R ₆代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；￭R ₇和R ₈彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-CO₂H基團或(C₁-C₆)烷基-N(C₁-C₆)烷基₂基團；或者，R ₇和R ₈與它們所連接的碳原子一起形成(C₃-C₆)環烷基或(C₃-C₆)雜環烷基；￭R ₉代表一個或多個彼此獨立地選自以下的苯基核的取代基：氫原子、-OH、(C₁-C₄)烷氧基、鹵素原子、-NH₂、-NH(C₁-C₆)烷基、-N(C₁-C₆)烷基₂、-NH(C₁-C₆)環烷基或(C₃-C₆)雜環烷基；￭R ₁₀代表至少一個選自氫原子和(C₁-C₄)烷基的苯基核的取代基；￭W代表

˙(C₁-C₆)烷基-NH(R₁₁)，更具體為(CH₂)_nNHR₁₁；˙(C₁-C₆)烷基-OH，更具體為(CH₂)_nOH； ˙(C₁-C₆)烷基-SH，更具體為(CH₂)_nSH；˙CO₂H或C(=O)NH₂；˙(C₁-C₆)烷基-CO₂H或(C₁-C₆)烷基-C(=O)NH₂；或˙(C₁-C₆)烷基-N₃。

W位於苯基核的鄰位(o)、間位(m)或對位(p)；￭R ₁₁和R ₁₂彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基，更具體為甲基；￭n代表1至6之間的整數。

本發明進一步涉及式(II)的念珠菌素有效負載：

其中：￭R ₁、R ₂、R ₃、R ₄、R ₅、R ₆、R ₇、R ₈、R ₉和R ₁₀如式(I)中所定義；￭Y代表(C₁-C₆)烷基-NR₁₁或(C₁-C₆)烷基-O或(C₁-C₆)烷基-S；或者，Y代表C(=O)O、C(=O)NH、(C₁-C₆)烷基-C(=O)O或(C₁-C₆)烷基-C(=O)NH；或者，Y代表(C₁-C₆)烷基-三唑-，如

； Y位於苯基核的鄰位(o)、間位(m)或對位(p)；￭R ₁₁代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；￭L代表連接基；￭RCG1代表存在於連接基端部的反應性化學基團，RCG1對抗體上存在的反應性化學基團呈反應性。

本發明還涉及式(III)的接合物：

其中：￭R ₁、R ₂、R ₃、R ₄、R ₅、R ₆、R ₇、R ₈、R ₉和R ₁₀如式(I)中所定義；￭Y和L如式(II)中所定義；￭G代表RCG1與RCG2之間的反應產物，其中RCG1為存在於連接基端部的反應性化學基團，RCG2為存在於抗體(Ab)上的正交反應性化學基團；￭Ab代表抗體。

各取代基R ₁至R ₁₁還可以採用空間構型中的一種(例如，R或S，或者，Z或E)，如實例中所描述的。

式(I)、(II)和(III)的化合物可以含有一個或多個不對稱碳原子。因此它們能夠以對映異構體、或非對映異構體的形式存在。這些對映異構體和非對映異構體及其混合物，包括外消旋混合物，形成本發明的一部分。

式(I)化合物，包括已經說明的那些，能夠以鹼或酸加成鹽、特別是醫藥上可接受之鹽的形式存在。

定義

在本發明的上下文中，一些術語具有以下定義：

˙烯基：從烯烴中移除一個氫原子得到的烴基。烯基可以是直鏈的或支鏈的。可以提及的實例包括乙烯基(-CH=CH₂，亦稱為乙烯基(vinyl))和丙烯基(-CH₂-CH=CH₂，亦稱為烯丙基)。

˙烷氧基：-O-烷基，其中烷基如下文所定義；

˙烷基：從烷烴除去氫原子得到的基於直鏈或支鏈飽和脂族烴的基團。可以提及的實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第三丁基、戊基、新戊基、2,2-二甲基丙基和己基；

˙亞烷基：經驗公式為-C_nH_2n-的飽和二價基團，從烷烴移除兩個氫原子得到的。亞烷基可以為直鏈的或支鏈的。可以提及的實例包括亞甲基(-CH₂-)、亞乙基(-CH₂CH₂-)、亞丙基(-CH₂CH₂CH₂-)、亞丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₂-) 和亞己基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-)，或以下支鏈基團

、

、

、

、

；較佳地，亞烷基具有式-(CH₂)_n-，n代表整數；在數值範圍內，包括上下限(例如，“n從1至6”或“在1和6之間類型的範圍包括限值1和6)；

˙抗體：對生物靶標具有親和性的抗體，更具體為單純系抗體。抗體的功能是將作為細胞毒性化合物的生物活性化合物導向生物靶標。抗體可以為單純系的、多純系的或多特異性的；其還可以為抗體片段；其還可以為鼠類抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。“抗體”可以為天然的或習知的抗體，其中兩個重鏈藉由二硫鍵彼此連接，且每個重鏈藉由二硫鍵連接至輕鏈(也成為“全長抗體”)。術語“習知(或全長)抗體”係指包含信號肽(或前肽，如果有的話)的抗體，以及在分泌時和蛋白水解各個鏈時得到的成熟形式。有兩種類型的輕鏈，λ(l)和κ(k)。有五種主鏈類型(或異型)確定抗體分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。各鏈還有不同的序列結構域。輕鏈包括兩個結構域或區域、可變域(VL)和恒定域(CL)。重鏈包括四個結構域，可變域(VH)和三個恒定域(CH1、CH2和CH3，集體稱為CH)。輕鏈的可變域(VL)以及重鏈的可變域(VH)均確定了對抗原的結合識別和特異性。輕鏈恒定域(CL)和重鏈恒定域(CH)賦予了重要的生物性質，如抗體鏈結合、分泌、跨胎盤移動、補足性結合、和結合至Fc受體(FcR)。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-末端部分，並且由一根輕鏈和一根重鏈的可變部分構成。抗體的特異性位於抗體結合位點和抗原決定簇之間的結構互補性。抗體結合位點由主要來自可高度變異或互補性確定區域(CDR)的殘基構成。偶爾地，來自非可高度變異或框架區域(FR)的殘基影響整個結構域結構並因此影響結構位元點。互補性確定區域或CDR係指一起定義天然免疫球蛋白結合位元點的天然Fv區域的結合親和性和特異性的胺基酸序列。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各自具有三個CDR，分別稱為CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。習知抗體抗原結合位點因此包括六個CDR，包含來自每個重鏈和輕鏈V區域的CDR組。

如本文所使用的，術語“抗體”表明習知的(全長)抗體及其片段，以及單結構域抗體及其片段、特別是單結構域抗體的可變重鏈。(習知)抗體的片段一般包括完整抗體的一部分，特別是完整抗體的抗原結合區域或可變區域，並保持習知抗體的生物功能。這種片段的實例包括Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2和雙抗體。

抗體的功能為將作為細胞毒性化合物的生物活性化合物導向生物靶標。

˙芳基：含有5至10個碳原子的環狀芳香族基團。芳基的實例包括苯基、甲苯基、二甲苯基、萘基；˙生物靶標：較佳位於癌細胞表面或與該腫瘤相關的基質細胞表面的抗原(或抗原族)；這些抗原可以是例如生長因數受體、癌基因產物、突變“腫瘤抑制劑”基因產物、血管發生相關分子或黏附分子；˙接合物：抗體-藥物接合物或ADC，即，經由連接基共價連接至少一個細胞毒性化合物分子的抗體；˙環烷基：包含3至6個銜接在環狀結構的碳原子的環狀烷基。可以提及的實例包括環丙基、環丁基、環戊基和環己基；˙DAR(藥劑-對-抗體的比例)：經由連接基連接至抗體的細胞毒性分子的平均數量；˙鹵素：四種元素氟、氯、溴和碘中的任意；˙雜芳基：含有2至10個碳原子和1至5個連接在環中並連接碳原子形成該環的雜原子如氮、氧或硫的芳基。雜芳基的實例包括吡啶基、嘧啶基、噻吩基、咪唑基、三唑基、吲哚基、咪唑-吡啶基、吡唑基；˙雜環烷基：含有2至8個碳原子和1至3個連接在環中並連接碳原子形成該環的雜原子如氮、氧或硫的環烷基。實例包括吖丙啶基、吡咯啶基、哌啶基、呱

基、嗎啉基、硫嗎啉基、四氫呋喃基、四氫硫代呋喃基、四氫吡喃基、氮雜環丁烷基、氧雜環丁烷基和吡喃基；˙連接基：能將細胞毒性化合物共價連接至抗體從而形成接合物的原子的基團或單鍵；˙片段：允許全部合成念珠藻素化合物的較簡單的分子；˙有效負載：共價連接連接基的細胞毒性化合物；˙反應性化學基團：能夠促進或經歷化學反應的原子的基團。

縮寫

ADC：抗體-藥物接合物；AcOH：乙酸；AIBN：偶氮雙異丁腈；ALK：(C₁-C₁₂)亞烷基基團，更具體地(C₁-C₆)亞烷基，更具體地為形式-(CH₂)_n-，n為1至12的整數、較佳1至6的整數；aq.：水溶液；Ar：氬；AUC：曲線下面積；BEMP：2-第三丁基亞胺基-2-二乙基胺基-1,3-二甲基全氫-1,3,2-二氮雜磷；BF₃：三氟化硼；Boc₂O：二碳酸二第三丁基酯；BuLi：丁基鋰；CAN：硝酸鈰銨；Cbz：羧基苄基；CHCl₃：氯仿；CH₃CN：乙腈；CH₃I：碘甲烷；CO₂：二氧化碳；CL：清除率；m-CPBA：間-氯過氧苯甲酸；CR：完全回應；crypto表示式

的單元，crypto特別地表示稍後描述的D₁-D₁₉念珠藻素化合物中的一個或實例中的念珠藻素化合物；D1係指DAR為1的ADC，D2係指DAR為2的ADC，等；d：天；DAR：藥物對抗體比例；DBU：8-二氮雜二環[5.4.0]十一碳-7-烯；DCC：N,N’-二環己基碳二亞胺；DCE：二氯乙烷；DCM：二氯甲烷；DDQ：2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌；DIC：N,N'-二異丙基碳二亞胺；DIAD：二異丙基偶氮二羧酸酯；DIEA：N,N-二異丙基乙基胺；DMA：二甲基乙醯胺；DMAP：4-(二甲基胺基)吡啶；DME：二甲氧基乙烷；DMEM：Dulbecco的改良Eagle培養基；DMEM/F12：Dulbecco的改良Eagle培養基營養混合物F-12；DMF：二甲基甲醯胺；DMSO：二甲基亞碸；DPBS：Dulbecco’s磷酸鹽緩衝鹽水；DPPA：疊氮磷酸二苯基酯(PhO)₂P(=O)N₃；DSC：N,N'-碳酸二琥珀醯亞胺基酯；EDA：乙二胺；EDC：1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺；EDTA：乙二胺四乙酸；EEDQ：N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉；ELSD：蒸發光散射檢測器；eq.：當量；ES：電噴霧；EtOAc：乙酸乙酯；Et₂O：二乙醚；EtOH：乙醇；Ex.：實例；FCS：胎牛血清；Fmoc：9-芴基甲氧基羰基；FmocOSu：N-(9-芴基甲氧基羰基氧基)琥珀醯亞胺；GI：電子誘導基團；Grubbs I：亞苄基-雙(三環己基膦)二氯釕；Grubbs II：(1,3-雙(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷基)二氯(苯基亞甲基)(三環己基膦)釕；h：小時；H₂O：水；Hal：鹵素；HATU：1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑並[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸酯；HCl：鹽酸；HEPES：4-(2-羥基乙基)-1-呱

乙磺酸；HIC：疏水相互作用層析；HOAt：1-羥基-7-氮雜苯並三唑；HOBt：1-羥基-苯並三唑；HPLC：高效液相層析；HRMS：高分辨質譜；IC₅₀：中位抑制濃度；i.e.：id est表示即；IEC：離子交換層析；iPrOH：2-丙醇；iPr₂O：二異丙基醚；i.v.：靜脈內；K₂CO₃：碳酸鉀；LDA：二異丙基胺基鋰；LiOH：氫氧化鋰；marg.：最低限度地；MeOH：甲醇；MeTHF：2-甲基-四氫呋喃；MgSO₄：硫酸鎂；min：分鐘；MNBA：2-甲基-6-硝基苯甲酸酐；MTBE：甲基第三丁基醚；MTD：最大耐受劑量；NaH：氫化鈉；NaHSO₄：硫酸氫鈉；Na₂S₂O₃：硫代硫酸鈉；NaCl：氯化鈉；NaHCO₃：碳酸氫鈉；NaHSO₃：亞硫酸氫鈉；NaHSO₄：硫酸氫鈉；NaOH：氫氧化鈉；NH₄Cl：氯化銨；NHS： N-羥基琥珀醯亞胺；NMP：1-甲基-2-吡咯啶酮；NMR：核磁共振；P₂-Et：1-乙基-2,2,4,4,4-五(二甲基胺基)-2λ5,4λ5-連二(磷氮基化合物)；PBS：磷酸鹽緩衝的鹽水；PEG：聚乙二醇；PK：藥代動力學；PMB：對甲氧基苄基；PNGase F：肽-N-糖苷酶F；PPh₃：三苯基膦；ppm：份每百萬；PR：部分回應；QS：quantum satis，表示所需的量；Q-Tof：四極杆飛行時間；quant.：定量收率；RCG：反應性化學基團；RT：室溫；sat.：飽和；s.c.：皮下；SCID：重度聯合免疫缺陷症；SEC：空間排阻層析；TBAF：四丁基氟化銨；tBuOK：第三丁醇鉀；TCEP：三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽；TEA：三乙胺；TEMPO：(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基；TFA：三氟乙酸；TFS：無腫瘤存活；THF：四氫呋喃；THP：四氫吡喃；TLC：薄層層析；t_1/2：半衰期；t_R：滯留時間；p-TsOH：對甲苯磺酸；UPLC：超高效液相層析；UV：紫外線；V_ss：穩態分佈的明顯體積。

圖1：實例3的高分辨質譜

圖2：實例7的高分辨質譜

圖3：實例10的高分辨質譜

圖4：實例14的高分辨質譜

圖5：實例20的高分辨質譜

圖6：實例23的高分辨質譜

圖7：實例3針對在SCID小鼠中的MDA-MB-231異種移植物的體內功效

圖8：實例7針對在SCID小鼠中的MDA-MB-231異種移植物的體內功效

圖9：實例10針對在SCID小鼠中的MDA-MB-231異種移植物的體內功效

圖10：實例14針對在SCID小鼠中的MDA-MB-231異種移植物的體內功效

圖11：實例20針對在SCID小鼠中的MDA-MB-231異種移植物的體內功效

圖12：實例23針對在SCID小鼠中的MDA-MB-231異種移植物的體內功效

圖13：在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後的ADC1體內藥代動力學曲線

圖14：在非齧齒類物種中單次靜脈注射投予後的ADC1體內藥代動力學曲線

圖15：在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後的實例3的體內藥代動力學曲線

圖16：在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後的實例7的體內藥代動力學曲線

圖17：在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後96h的去糖基化ADC1的HRMS光譜

圖18：在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後96h的ADC2輕鏈的HRMS光譜

圖19：在非齧齒類物種中單次靜脈注射投予後6天的去糖基化ADC1的HRMS光譜

圖20：在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後96h的實例3的HRMS光譜

圖21：在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後96h的實例7的HRMS光譜

圖22：在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後96h的實例10的HRMS光譜

圖23：在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後96h的實例14的HRMS光譜

圖24：在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後96h的實例20的HRMS光譜

圖25：在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後96h的實例23的HRMS光譜

本發明涉及式(I)的念珠藻素：

其中：￭R₁代表(C₁-C₆)烷基；￭R₂和R₃彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；或者，R ₂和R ₃與它們所連接的碳原子一起形成(C₃-C₆)環烷基或(C₃-C₆)雜環烷基；￭R ₄和R ₅彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-NH(R₁₂)基團或(C₁-C₆)烷基-OH基團或(C₁-C₆)烷基-SH基團或(C₁-C₆)烷基-CO₂H基團；或者，R ₄和R ₅與它們所連接的碳原子一起形成(C₃-C₆)環烷基或(C₃-C₆)雜環烷基；￭R₆代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；￭R ₇和R ₈彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-CO₂H基團或(C₁-C₆)烷基-N(C₁-C₆)烷基₂基團；或者，R ₇和R ₈與它們所連接的碳原子一起形成(C₃-C₆)環烷基或(C₃-C₆)雜環烷基；￭R₉代表彼此獨立地選自以下的苯基核的一個或多個取代基：氫原子、-OH、(C₁-C₄)烷氧基、鹵素原子、-NH₂、-NH(C₁-C₆)烷基或-N(C₁-C₆)烷基₂或-NH(C₁-C₆)環烷基或(C₃-C₆)雜環烷基；￭R₁₀代表選自氫原子和(C₁-C₄)烷基的苯基核的至少一個取代基；￭W代表

˙(C₁-C₆)烷基-NH(R₁₁)，更具體為(CH₂)_nNHR₁₁； ˙(C₁-C₆)烷基-OH，更具體為(CH₂)_nOH；˙(C₁-C₆)烷基-SH，更具體為(CH₂)_nSH；˙CO₂H或C(=O)NH₂；˙(C₁-C₆)烷基-CO₂H或(C₁-C₆)烷基-C(=O)NH₂；或˙(C₁-C₆)烷基-N₃。

念珠菌素化合物可以為以下D₁-D₁₉中的一個：

其中：￭W和R₁₂如式(I)中所定義；或者，念珠菌素化合物可以為在一個實例中描述的等同單位(equivalent unit)。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第一組化合物包括其中R₁代表(C₁-C₆)烷基、特別是甲基的化合物。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第二組化合物包括其中R₂和R₃各自代表氫原子的化合物。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第三組化合物包括其中R ₂和R ₃中的一個代表(C₁-C₆)烷基、特別是甲基且另一個代表氫原子的化合物。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第四組化合物包括其中R ₂和R ₃與它們所連接的碳原子一起形成(C₃-C₆)環烷基、特別是環丙基的化合物。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第五組化合物包括其中R ₄和R ₅各自代表(C₁-C₆)烷基、特別是甲基的化合物。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第六組化合物包括其中R₆代表氫原子的化合物。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第七組化合物包括其中R ₇和R ₈彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基的化合物。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第八組化合物包括其中R₉代表選自甲氧基和氯原子的兩個取代基的化合物。更具體地，苯基核在苯基核的3位和4位上包括兩個取代基。較佳地，其為3-Cl和4-甲氧基。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第九組化合物包括其中R₁₀代表氫原子的化合物。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第十組化合物包括其中W位於苯基核對位的化合物。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第十一組化合物包括其中W選自(C₁-C₆)烷基-NHR₁₁、特別是(C₁-C₃)烷基-NHR₁₁、特別是CH₂-NH₂基團，(C₁-C₆)烷基-OH、特別是(C₁-C₃)烷基-OH、特別是CH₂-OH基團，(C₁-C₆)烷基-SH、特別是(C₁-C₃)烷基-SH和(C₁-C₆)烷基-CO₂H、特別是(C₁-C₃)烷基-CO₂H的化合物。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第十二組化合物包括其中R₁代表(C₁-C₆)烷基、特別是甲基，R ₂和R ₃各自代表氫原子，R₆代表氫原子，R₉代表選自甲氧基和氯原子的兩個取代基，更具體地，苯基核在苯基核的3位和4位包括兩個取代基，較佳其為3-Cl和4-甲氧基且R₁₀代表氫原子的化合物。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第十三組化合物包括其中R₁代表(C₁-C₆)烷基、特別是甲基，R ₂和R ₃中的一個代表(C₁-C₆)烷基、特別是甲基且另一個代表氫原子，R₆代表氫原子，R₉代表選自甲氧基和氯原子的兩個取代基，更具體地，苯基核在苯基核的3位和4位包括兩個取代基，較佳其為3-Cl和4-甲氧基且R₁₀代表氫原子的化合物。

備選地，W選自(CH₂)_nNHR₁₁、(CH₂)_nSH或(CH₂)_nOH，其中n代表1至6之間的整數。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第十四組化合物包括以下結構(β-環氧化物構型)的化合物：

所有這些子集，不論單獨還是組合，均是本發明的一部分。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，可以特別提及以下化合物：

本發明進一步涉及式(II)的念珠菌素有效負載：

其中：￭R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀如式(I)中所定義；￭Y代表(C₁-C₆)烷基-NR₁₁或(C₁-C₆)烷基-O或(C₁-C₆)烷基-S；或者，Y代表C(=O)O、C(=O)NH、(C₁-C₆)烷基-C(=O)O或(C₁-C₆)烷基-C(=O)NH；或者，Y代表(C₁-C₆)烷基-三唑-，如

； Y位於苯基核的鄰位(o)、間位(m)或對位(p)；￭R₁₁代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；￭L代表連接基；￭RCG1代表存在於連接基端部的反應性化學基團，RCG1對抗體上存在的反應性化學基團呈反應性。

在作為本發明標的的式(II)化合物中，第一組化合物包括其中R₁代表(C₁-C₆)烷基、特別是甲基的化合物。

在作為本發明標的的式(II)化合物中，第二組化合物包括其中R₂和R₃各自代表氫原子的化合物。

在作為本發明標的的式(II)化合物中，第三組化合物包括其中R ₂和R ₃中的一個代表(C₁-C₆)烷基、特別是甲基且另一個代表氫原子的化合物。

在作為本發明標的的式(II)化合物中，第四組化合物包括其中R ₂和R ₃與它們所連接的碳原子一起形成(C₃-C₆)環烷基、特別是環丙基的化合物。

在作為本發明標的的式(II)化合物中，第五組化合物包括其中R ₄和R ₅各自代表(C₁-C₆)烷基、特別是甲基的化合物。

在作為本發明標的的式(II)化合物中，第六組化合物包括其中R₆代表氫原子的化合物。

在作為本發明標的的式(II)化合物中，第七組化合物包括其中R ₇和R ₈彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基的化合物。

在作為本發明標的的式(II)化合物中，第八組化合物包括其中R₉代表選自甲氧基和氯原子的兩個取代基的化合物。更具體地，苯基核在苯基核的3位和4位上包括兩個取代基。較佳地，其為3-Cl和4-甲氧基。

在作為本發明標的的式(II)化合物中，第九組化合物包括其中R₁₀代表氫原子的化合物。

在作為本發明標的的式(II)化合物中，第十組化合物包括其中Y位於苯基核對位的化合物。

在作為本發明標的的式(II)化合物中，第十一組化合物包括其中Y代表(C₁-C₆)烷基-NR₁₁、特別是(C₁-C₃)烷基-NR₁₁、更特別是CH₂-NH的化合物。

在作為本發明標的的式(II)化合物中，第十四組化合物包括以下結構(β-環氧化物構型)的化合物：

所有這些子集，不論單獨還是組合，均是本發明的一部分。

在作為本發明標的的式(II)化合物中，可以特別提及以下化合物：

本發明還涉及式(III)的接合物：

在作為本發明標的的式(III)化合物中，第一組化合物包括其中R₁代表(C₁-C₆)烷基、特別是甲基的化合物。

在作為本發明標的的式(III)化合物中，第二組化合物包括其中R₂和R₃各自代表氫原子的化合物。

在作為本發明標的的式(III)化合物中，第三組化合物包括其中R ₂和R ₃中的一個代表(C₁-C₆)烷基、特別是甲基且另一個代表氫原子的化合物。

在作為本發明標的的式(III)化合物中，第四組化合物包括其中R ₂和R ₃與它們所連接的碳原子一起形成(C₃-C₆)環烷基、特別是環丙基的化合物。

向來

在作為本發明標的的式(III)化合物中，第五組化合物包括其中R ₄和R ₅各自代表(C₁-C₆)烷基、特別是甲基的化合物。

在作為本發明標的的式(III)化合物中，第六組化合物包括其中R₆代表氫原子的化合物。

在作為本發明標的的式(III)化合物中，第七組化合物包括其中R ₇和R ₈彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基的化合物。

在作為本發明標的的式(III)化合物中，第八組化合物包括其中R₉代表選自甲氧基和氯原子的兩個取代基的化合物。更具體地，苯基核在苯基核的3位和4位上包括兩個取代基。較佳地，其為3-Cl和4-甲氧基。

在作為本發明標的的式(III)化合物中，第九組化合物包括其中R₁₀代表氫原子的化合物。

在作為本發明標的的式(III)化合物中，第十一組化合物包括其中Y代表(C₁-C₆)烷基-NR₁₁、特別是(C₁-C₃)烷基-NR₁₁、更特別是CH₂-NH的化合物。

在作為本發明標的的式(I)化合物中，第十二組化合物包括以下結構(β-環氧化物構型)的化合物：

所有這些子集，不論單獨還是組合，均是本發明的一部分。

在作為本發明標的的式(III)化合物中，可以特別提及以下化合物：

式(II)的念珠藻素有效負載與抗體之間為了得到式(III)的接合物的連接藉由在有效負載上存在的對在抗體上存在的反應性基團RCG2具有反應性的反應性化學基團RCG1來製備。RCG1與RCG2之間的反應確保了式(II)化合物藉由形成共價鍵連接至抗體。在式(III)的接合物中，RCG1和RCG2的部分能夠保持形成連接基和抗體之間的連接。

可以提及的RCG1的實例包括：(i)-C(=O)-Z_aR_a反應性基團，其中Z_a代表單鍵、O或NH，更具體為O，且R_a代表氫原子或(C₁-C₆)烷基、(C₃-C₇)環烷基、烯基芳基、雜芳基或(C₃-C₇) 雜環烷基。芳基可以被選自鹵素特別是F、烷基、烷氧基、硝基和氰基的1至5個基團取代； (ii)以下反應性基團中的一個：馬來醯亞胺基

基團：鹵代乙醯胺基

基團，其中R₁₃代表氫原子或(C₁-C₆)烷基、更具體為Me； -Cl；-N₃；-OH；-SH；-NH₂；-C≡CH或活化的C≡C，如環辛炔如

；O-烷基羥基胺或Pictet-Spengler反應基質，如在 Agarwal P.,et al.,Bioconjugate Chem 2013,24,846-851中描述的

更具體地，-Z_aR_a可以代表-OH、-OCH₃、-OCH₂CH=CH₂、

(O-NHS)或

，其中陽離子代表例如鈉、鉀或銫

或

，其中GI代表至少一個電誘導性基團如-NO₂ 或-Hal，特別是-F。他們可以是例如以下基團：

或

。另一類型的-C(=O)Z_aR_a基團如下：

。更具體地，RCG1可以選自實例中描述的那些中的一個。

可以提到的RCG2的實例包括(Garnett M.C.,et al.,Advanced Drug Delivery Reviews 2001,53,171-216)：(i)賴胺酸中由賴胺酸殘基的側鏈所帶有的存在於抗體表面的ε-胺基；(ii)抗體重鏈和輕鏈的N-末端胺基酸的α-胺基；(iii)鉸鏈區的糖基；(iv)半胱胺酸中藉由還原鏈內二硫鍵而形成的巰基或者工程化半胱胺酸的巰基；(v)一些穀胺醯胺殘基的側鏈所帶有的存在於抗體表面的醯胺基團；(vi)使用產生甲醯基甘胺酸的酶引入的醛基。

進來，可以考慮其他共軛方法，例如藉由突變引入半胱胺酸(Junutula J.R.,et al.,Nature Biotechnology 2008,26,925-932)、引入允許其他化學類型的非天然胺基酸(Axup J.Y.,et al.,PNAS 2012,109,40,16101-16106)或在抗體聚糖上的共軛(Zhou Q.,et al.,Bioconjugate Chem.2014,25,510-520)。另一個位置特異性修飾抗體的方法為基於使用例如細菌轉穀胺醯胺酶(Jeger S.,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,9995-9997：Strop P.,et al.,Chem.Biol.2013,20,161-167)或產生甲醯基甘胺酸的酶(Hudak J.E.,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,4161-4165)進行酶標記。關於位點特異性共軛策略的綜述，參見Agarwal P.and Bertozzi C.R.,Bioconjugate Chem 2015,26,176-192。這些共軛技術還可以應用於本發明中描述的念珠藻素有效負載。

還可以化學修飾抗體從而引入新的反應性基團RCG2。因此，本領域技術人員熟知如何借助引入例如活化的二硫化物、巰基、馬來醯亞胺基鹵代乙醯胺基的修飾劑來修飾抗體(參見例如WO2005/077090，第14頁和WO2011/001052)。修飾可以實現改善共軛反應以及使用範圍更廣的基團RCG1。

更具體地，在RCG1為上述類型(ii)的情況下，可以使用精確的修飾劑來化學修飾抗體或者引入一種或多種非天然胺基酸從而引入精確的官能團RCG2。例如：- 當RCG1代表N-羥基琥珀醯亞胺基酯時，RCG2代表-NH2基團；- 當RCG1代表馬來醯亞胺基或鹵代乙醯胺基官能團或-Cl時，RCG2可以為-SH；- 當RCG1代表-N₃時，RCG2可以為-C≡CH或活化的C≡C如環辛炔基團；- 當RCG1代表-OH或-NH₂時，RCG2可以為羧酸或醯胺官能團；- 當RCG1代表-SH時，RCG2可以為馬來醯亞胺基或鹵代乙醯胺基官能團；- 當RCG1代表-C≡CH官能團或活化的C≡C時，RCG2可以為-N₃；- 當RCG1代表-O-烷基羥基胺官能團或Pictet-Spengler反應基質時，RCG2可以為醛或酮官能團。

可以提及的G的實例包括：

本發明涉及式(II)念珠藻素有效負載和涉及式(III)的接合物：

其中，連接基L為式(IV)：

其中：￭L1代表￭若Y=(C₁-C₆)烷基-N(R₁₁)，則為單鍵或NR₁₆(雜)芳基-CR₁₅R₁₄-O-C(=O)基團；￭若Y=(C₁-C₆)烷基-O-或(C₁-C₆)烷基-S，則為NR₁₈-(C₂-C₆)烷基-NR₁₇-C(=O)基團或NR₁₆(雜)芳基-CR₁₅R₁₄-O-C(=O)NR₁₈-(C₂-C₆)烷基-NR₁₇-C(=O)基團；￭若Y=C(=O)O、C(=O)NH、(C₁-C₆)烷基-C(=O)O或(C₁-C₆)烷基-C(=O)NH，則為NR₁₆(雜)芳基-CR₁₅R₁₄基團；￭R₁₁、R₁₄、R₁₅、R₁₆、R₁₇和R₁₈彼此獨立地代表H或(C₁-C₆)烷基；￭(AA)_w代表經由肽鍵連接的w胺基酸AA的序列；￭w代表1至12的整數，較佳1至6的整數，更特別為2或3；￭L2代表單鍵或(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-(OCH₂CH₂)_i基團或(C₁-C₆)烷基-(OCH₂CH₂)_i-O(C₁-C₆)烷基或(CH₂CH₂O)_i(C₁-C₆)烷基或CH(SO₃H)-(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-CH(SO₃H)基團或(C₁-C₆)烷基-環己基基團或NR₁₉-(C₁-C₆)烷基或NR₂₀-(CH₂CH₂O)_i(C₁-C₆)烷基或NR₂₁-芳基基團或NR₂₁-雜芳基基團或(C₁-C₆)烷基-NR₂₂C(=O)-(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-NR₂₂C(=O)-(C₁-C₆)烷基-(OCH₂CH₂)_i基團。更具體地，L2代表(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基團或CH(SO3H)-(C1-C6)烷基；￭R₁₉、R₂₀、R₂₁和R₂₂彼此獨立地代表H或(C₁-C₆)烷基；￭i代表1至50之間的整數，較佳1至10之間的整數(i可以採納1和50之間的任何數值)。

AA表示構型為D或L的天然或非天然胺基酸，更具體地選自：丙胺酸(Ala)、β-丙胺酸、γ-胺基丁酸、2-胺基-2-環己基乙酸、2-胺基-2-苯基乙酸、精胺酸(Arg)、天冬醯胺(Asn)、天冬胺酸(Asp)、瓜胺酸(Cit)、半胱胺酸(Cys)、α,α-二甲基-γ-胺基丁酸、β,β-二甲基-γ-胺基丁酸、穀胺醯胺(Gln)、谷胺酸(Glu)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、異亮胺酸(Ile)、亮胺酸(Leu)、賴胺酸(Lys)、ε-乙醯基-賴胺酸(AcLys)、甲硫胺酸(Met)、鳥胺酸(Orn)、苯丙胺酸(Phe)、脯胺酸(Pro)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、纈胺酸(Val)。更具體地，AA選自丙胺酸(Ala)、瓜胺酸(Cit)、穀胺醯胺(Gln)、甘胺酸(Gly)、ε-乙醯基-賴胺酸(AcLys)、纈胺酸(Val)。

序列(AA)_w具有式：

，其中R₂₃代表上述的胺基酸中的一種的側鏈。序列的實例如下：Gly-Gly、Phe-Lys、Val-Lys、Val-AcLys、Val-Cit、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Ala、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Phe、Gly-Gly-Gly、Gly-Ala-Phe、Gly-Val-Cit、Gly-Phe-Leu-Cit、Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu。

對於Y=(C₁-C₆)烷基-N(R₁₁)，更具體地CH₂NH，RCG1-L可以為以下中(IV1-17)的一個：

其中：￭(AA)_w代表經由肽鍵連接在一起的w胺基酸AA的序列，如上所述；￭w代表1至12、較佳1至6之間的範圍的整數，且更具體地2或3；￭i代表1至50之間、較佳1至10之間的整數(i可以採納1至50之間的所有數值)；￭M₁、M₂、M₃和M₄彼此獨立地選自CR₂₄和N；￭R₁₉、R₂₀、R₂₁、H₂₂和R₂₄彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基，更具體為氫原子或甲基。

對於Y=(C₁-C₆)烷基-O或(C₁-C₆)烷基-S，更具體地CH₂O或CH₂S，RCG1-L可以為以下(IV18-34)中的一個：

其中：￭(AA)_w代表經由肽鍵連接在一起的w胺基酸AA的序列，如上所述；￭w代表1至12、較佳1至6之間的範圍的整數，且更具體地2或3；￭i代表1至50之間、較佳1至10之間的整數(i可以採納1至50之間的所有數值)；￭M₁、M₂、M₃和M₄彼此獨立地選自CR₂₄和N；￭R₁₇,R₁₈,R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₂和R₂₄彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基，更具體為氫原子或甲基。

對於Y=(C₁-C₆)烷基-N(R₁₁)，更具體地CH₂NH，RCG1-L還可以為以下(IV35-51)中的一個：

其中：￭(AA)_w代表經由肽鍵連接在一起的w胺基酸AA的序列，如上所述；￭w代表1至12、較佳1至6之間的範圍的整數，且更具體地2或3；￭i代表1至50之間、較佳1至10之間的整數(i可以採納1至50之間的所有數值)；￭J₁、J₂、J₃和J₄彼此獨立地選自CR₂₄和N；￭M₁、M₂、M₃和M₄彼此獨立地選自CR₂₄和N；￭R₁₄、R₁₅、R₁₆、R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₂和R₂₄彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基，更具體為氫原子或甲基。

對於Y=(C₁-C₆)烷基-O或(C₁-C₆)烷基-S，更具體地CH₂O或CH₂S，RCG1-L還可以為以下(IV52-68)中的一個：

其中：￭(AA)_w代表經由肽鍵連接在一起的w胺基酸AA的序列，如上所述；￭w代表1至12、較佳1至6之間的範圍的整數，且更具體地2或3；￭i代表1至50之間、較佳1至10之間的整數(i可以採納1至50之間的所有數值)；￭J₁、J₂、J₃和J₄彼此獨立地選自CR₂₄和N；￭M₁、M₂、M₃和M₄彼此獨立地選自CR₂₄和N；￭R₁₄、R₁₅、R₁₆、R₁₇、R₁₈、R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₂和R₂₄彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基，更具體為氫原子或甲基。

對於Y=C(=O)O、C(=O)NH、(C₁-C₆)烷基-C(=O)O或(C₁-C₆)烷基-C(=O)NH，更具體地C(=O)O或CH₂-C(=O)O，RCG1-L可以為以下(IV69-85)中的一個：

對於Y=C(=O)或(C₁-C₆)烷基-C(=O)，本發明還涉及式(II)的念珠藻素有效負載和涉及式(III)的接合物；

其中，連接基L為式(V)：

其中：￭(AA)’_w代表經由肽鍵連接在一起的w胺基酸AA的序列；￭w代表1至12、較佳1至6之間的範圍的整數，且更具體地2或3；￭R₂₅代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；￭L3代表(C₁-C₆)烷基或(CH₂CH₂O)_i-(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-(OCH₂CH₂)_i基團或CH(SO₃H)-(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-(OCH₂CH₂)_i-O(C₁-C₆)烷基或NR₁₉-(C₁-C₆)烷基或NR₂₀-(CH₂CH₂O)_iCH₂CH₂基團或(C₁-C₆)烷基-環己基-C(=O)NR₁₉-(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-環己基-C(=O)NR₂₀-(CH₂CH₂O)_i-CH₂CH₂基團或NR₂₁-芳基-C(=O)NR₁₉-(C₁-C₆)烷基或NR₂₁-雜芳基-C(=O)NR₁₉-(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-NR₂₂C(=O)(CH₂CH₂O)_i-(C₁-C₆)烷基；￭R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₂和R₂₅代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；￭RCG1代表對抗體上存在的反應性化學基團呈反應性的反應性化學基團，如上文所定義；￭R ₁、R ₂、R ₃、R ₄、R ₅、R ₆、R ₇、R ₈、R ₉和R ₁₀如本文所定義。

AA表示構型為D或L的天然或非天然胺基酸，更具體地選自：丙胺酸(Ala)、β-丙胺酸、γ-胺基丁酸、2-胺基-2-環己基乙酸、2-胺基-2-苯基乙酸、精胺酸(Arg)、天冬醯胺(Asn)、天冬胺酸(Asp)、瓜胺酸(Cit)、半胱胺酸(Cys)、α,α-二甲基-γ-胺基丁酸、β,β-二甲基-γ-胺基丁酸、穀胺醯胺(Gln)、谷胺酸(Glu)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、異亮胺酸(Ile)、亮胺酸(Leu)、賴胺酸(Lys)、ε-乙醯基-賴胺酸(AcLys)、甲硫胺酸(Met)、鳥胺酸(Orn)、苯丙胺酸(Phe)、脯胺酸(Pro)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、纈胺酸(Val)。更具體地，AA選自丙胺酸(Ala)、瓜胺酸(Cit)、穀胺醯胺(Gln)、甘胺酸(Gly)、ε-乙醯基-賴胺酸(AcLys)、纈胺酸(Val)

序列(AA)’_w具有式：

，其中R₂₆代表如上所述的胺基酸的一種的側鏈。序列的實例如下：Gly-Gly、Lys-Phe、Lys-Val、AcLys-Val、Cit-Val、Lys-Phe-Phe、Lys-Phe-DPhe、Lys-Phe-Gly、Lys-Ala、Ala-Val、Cit-Phe、Cit-Leu、Cit-Ile、Cit-Trp、Ala-Phe、Phe-Ala、Gly-Gly-Gly、Phe-Ala-Gly、Cit-Val-Gly、Cit-Leu-Phe-Gly、Gly-Leu-Phe-Gly、Leu-Ala-Leu-Ala.

對於Y=C(=O)或(C₁-C₆)烷基-C(=O)，更具體地C(=O)或CH₂-C(=O)，RCG1-L可以為以下(V86-101)中的一個：

其中：￭(AA)’_w代表經肽鍵連接在一起的w胺基酸AA的序列，如上所述；￭w代表1至12、較佳1至6之間的範圍的整數，且更具體地2或3；￭i代表1至50之間、較佳1至10之間的整數(i可以採納1至50之間的所有數值)；￭M₁、M₂、M₃和M₄彼此獨立地選自CR₂₄和N；￭R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₂、R₂₄和R₂₅彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基，更具體為氫原子或甲基。

連接基L還可以選自所說明的化合物。

根據本發明，通式(I)、(II)和(III)的化合物可以藉由以下方法製備。

念珠藻素化合物的製備方法

在W=CH₂N₃或CH₂NH₂的情況下，製備式(I)化合物的一般途徑A

片段A、B、C和D允許借助下面詳細的步驟製備念珠藻素化合物P₁至P₃：步驟(i)：片段AD1和BC之間在偶聯劑如HOAt和HATU的存在下的肽偶聯；步驟(ii)：在酸性條件下使用例如TFA進行脫保護並在偶聯劑如HOAt和HATU的存在下大環化；步驟(iii)：使用例如m-CPBA將烯烴氧化形成環氧化物；步驟(v)：使用例如TCEP還原疊氮基。

片段A和B根據下文描述的合成製備。作為甲基酯保護的片段C對於以下市售可得R₄=H,R₅=Me(R),R₂=R₃=H(CAS號[92535-26-7])；R₄=H,R₅=Me(S),R₂=R₃=H(CAS號[118138-56-0])；R₄=R₅=Me,R₂=R₃=H(CAS號[25307-82-8])；R₂=H,R₃=Me(R),R₄=H,R₅=Me(R)(CAS號[86544-92-5])；R₂=H,R₃=Me(S),R₄=H,R₅=Me(R)(CAS號[86544-93-6])；R₂=H,R₃=Me(R),R₄=R₅=Me(CAS號[1315052-25-5])；R₂=H,R₃=Me(S),R₄=R₅=Me(CAS號[1315050-96-4])；R₂=H,R₃=iPr(R),R₄=R₅=Me(CAS號[1314999-06-8])；R₂=H,R₃=iPr(S),R₄=R₅=Me(CAS號[1315054-33-1])；R₂=R₃=R₄=R₅=Me(CAS號[90886-53-6])；R ₄和R ₅與它們所連接的碳原子一起形成環丙基(CAS號[914226-26-9])。它們還可以如實例中描述的進行製備。非市售可得的片段C如實例中描述的製備。所有的片段D均市售可得：L-Fmoc-Ala-OH(CAS號[35661-39-3])；L-Fmoc-Val-OH(CAS號[68858-20-8])；L-Fmoc-第三-Leu-OH(CAS號[132684-60-7])；L-Fmoc-Leu-OH(CAS號[35661-60-0])；L-Fmoc-NMe-Leu-OH(CAS號[103478-62-2])；L-Fmoc-3-二甲基胺基-Ala-OH(CAS號[587880-86-2])；L-Fmoc-(O烯丙基)Asp-OH(CAS號[146982-24-3])；L-Fmoc-4-甲基-Leu-OH(CAS號[139551-74-9])。構造塊AD1和BC根據下面描述的合成製備。

在W=CH₂OH或CH₂N₃或CH₂NH₂的情況下，製備式(I)化合物的一般途徑B

片段A、B、C和D允許借助下面詳述的步驟製備念珠藻素化合物P₂至P₄：

步驟(i)：片段AD1和BC之間在偶聯劑如HOAt和HATU的存在下肽偶聯；

步驟(ii)：在酸性條件下使用例如TFA進行脫保護，在偶聯劑如HOAt和HATU的存在下大環化，並在pH 6-7使用例如在水和AcOEt的混合物中的NaOH乙酸酯水解；

步驟(iii)：使用例如氯三異丙基矽烷在鹼如咪唑的存在下苄醇保護為甲矽烷基醚；使用例如m-CPBA將烯烴氧化形成環氧化物；使用例如TBAF溶液脫保護甲矽烷基醚。

步驟(iv)：在DPPA和鹼如DBU的存在下疊氮化；

步驟(v)：使用例如TCEP還原疊氮基。

片段A和B根據下文描述的合成製備。片段C要麼如前文中報導的市售可得或如實例中描述的進行製備。所有的片段D如前文中報導的市售可得。構造塊AD2和BC根據下面描述的合成製備。

在W=CH₂OH或CH₂N₃或CH₂NH₂的情況下，製備式(I)化合物的一般途徑C

Sakurai醇和片段B、C和D允許借助下面詳述的步驟製備念珠藻素化合物P₂至P₄：步驟(i)：片段AD3和可選的BC之間在偶聯劑如HOAt和HATU的存在下的肽偶聯；步驟(ii)：在催化劑如Grubbs I催化劑的存在下藉由環閉合置換進行大環化；步驟(iii)：p-甲氧基苄基醚在酸性條件如10% TFA中脫保護；步驟(iv)：使用氧化劑如TEMPO在次氯酸鈉存在下將醇氧化；步驟(v)：藉由不對稱Corey-Chaykovsky反應使用適當取代的異硫代桉樹腦(isothiocineole)衍生的對掌性鋶在鹼如磷腈鹼P₂-Et的存在下引入環氧化物；步驟(vi)：使用例如TCEP還原疊氮基。

Sakurai醇和片段B根據下文描述的合成製備。片段C要麼如前文中報導的市售可得或如實例中描述的進行製備。所有的片段D如前文中報導的市售可得。構造塊AD3和可選的BC根據下面描述的合成製備。

在W=CH₂SH的情況下，製備式(I)化合物

P₄允許借助下面詳述的步驟製備其他念珠藻素化合物P₅和P₆：步驟(i)：使用甲磺醯氯在鹼如DIEA的存在下引入氯基團；步驟(ii)：使用從TBAF和六甲基二矽硫烷原位製備的四丁基銨三甲基甲矽烷基硫醇酯進行官能化，根據Hu J.,et al.,J.Org.Chem.1999,64,4959-496：在該反應的過程中，通常形成在流程3中描述的中間體二聚物；步驟(iii)：使用膦如TCEP還原二聚體。

流程1、2、3和4描述了n=1的情況，但是也可適用於製備n>1的情況從P₂、P₃或P₄開始的式(I)化合物，借助於下文詳述的步驟並描述於WO2011/001052的流程2中：

步驟(i)：在酸性介質中打開環氧化物的環，從而得到二醇官能團；例如，可以使用濃高氯酸；步驟(ii)：使用例如高碘酸鈉氧化解離該二醇；步驟(iii)：Wittig反應，使用合適的鹵化鏻例如溴化鏻和強鹼如BuLi；步驟(iv)：將烯烴氧化形成環氧化物，使用例如m-CPBA；步驟(v)：甲矽烷基醚的脫保護，使用例如TBAF溶液。

在W=CO₂H的情況下，製備式(I)化合物

P₄允許借助下面詳述的步驟製備其他念珠藻素化合物P₇和P₈：步驟(i)：使用戴斯-馬丁試劑氧化；步驟(ii)：在2-甲基-2-丁烯的存在下的Pinnick類型的氧化(Pinnick H.W.,Tetrahedron 1981,37,2091-2096)。

流程6描述了n=0的情形，但是也可適用於製備以下情況下的式(I)化合物：W=(CH₂)_nCO₂H，起始於承載(CH2)_n+1OH基團的P₄的類似物。流程1、2、3、4、5和6針對對位的連接基給出，但是可以一致地適用於鄰位或間位位置。類似地，它們針對念珠藻素化合物給出，但是也可以適用於製備其他式(I)化合物，特別是D₁-D₁₉。

念珠藻素有效負載的製備方法

式(II)化合物可以根據流程7製備，起始於式(I)的念珠藻素化合物和連接基前體(LP)：

W代表˙(C₁-C₆)烷基-NH(R₁₁)，更具體為(CH₂)_nNHR₁₁；˙(C₁-C₆)烷基-OH，更具體為(CH₂)_nOH；˙(C₁-C₆)烷基-SH，更具體為(CH₂)_nSH；˙CO₂H；˙(C₁-C₆)烷基-CO₂H，更具體為(CH₂)_nCO₂H；或˙(C₁-C₆)烷基-N₃。

其中R₁₁代表氫原子或(C₁-C₆)烷基，更具體為甲基。

連接基前體LP具有在基團W和存在於LP上的化學官能團之鹼的反應後將連接基L的前體引入念珠藻素化合物的功能。

在流程7中，一些步驟和/或反應對於從念珠藻素化合物(I)製備念珠藻素有效負載(II)是必要的。例如，在Z_aR_a=-O-NHS的情況下，連接基L(其中Z_aR_a=-O-烯丙基)可以使用相應的連接基前體、接著將酯官能團脫保護並引入-O-NHS來引入。脫保護可以藉由以鈀催化劑處理來進行，例如在清除劑胺例如嗎啉的存在下的Pd(PPh₃)₄；活化可以使用DSC在鹼如DIEA的存在下進行，或者使用NHS在偶聯劑如DCC的存在下進行。基團Z_aR_a轉化至另一基團Z_aR_a(例如-O-烯丙基→-O-NHS)可以適用於得到其他基團Z_aR_a，特別是上述描述的那些。

流程7’類似地說明瞭製備包含分別承載以下基團的連接基的念珠藻素化合物：馬來醯亞胺基、鹵代乙醯胺基、胺基或疊氮基(L*代表連接基的片段使得L=-L*-馬來醯亞胺基或L=-L*-鹵代乙醯胺基或L=-L*-NH₂-或L= -L*-N₃)。

這些化合物藉由包括含胺基的連接基L’的念珠菌素化合物與修飾劑之間的反應分別引入馬來醯亞胺基、鹵代乙醯胺基、胺基或疊氮基來得到。

式(II)化合物可以備選地根據流程8起始於相同的式(I)的念珠藻素化合物和另一連接基前體(LP’)來製備：

在流程8中，一些步驟和/或反應對於起始於念珠菌素化合物(I)實現念珠菌素有效負載(II)是必要的。例如，在Z_aR_a=-O-NHS的情況下，受保護的連接基前體L’可以引入，接著脫保護並偶聯至連接基前體L”從而引入羧酸官能團，其可直接活化為Z_aR_a=-O-NHS，或者首先脫保護並接著活化(L’和L”代表連接基的片段，使得L=L’-L”)。脫保護可以以鹼如哌啶進行處理；偶聯至連接基L”可以藉由環狀酸酐如戊二酸酐的打開來處理；活化可以使用DSC在鹼如DIEA的存在下進行或者在偶聯劑如DCC的存在下以使用NHS進行。

基團W和LP上存在的化學官能團之間的反應的實例為攜帶羧酸官能團的連接基前體LP和W=(CH₂)_nNH₂之間或者攜帶胺官能團的連接基前體LP和W=CO₂H或(CH₂)_nCO₂H之間的醯胺化：反應可以在偶聯劑如EDCI或HOBt的存在下進行。也可根據下文的流程(R₁₇=H或(C₁-C₆)烷基)，使帶有胺官能團連接基前體LP與從W=(CH₂)_nOH和對硝基苯基氯甲酸酯(活化碳酸酯形式的醇)得到的W’=(CH₂)_nO-C(=O)-O-(4-硝基苯基)反應：-NHR₁₇+crypto-(CH₂)_nO-C(=O)-O-(4-硝基苯基)→crypto-(CH₂)_nO-C(=O)-NR₁₇-

相同類型的反應還能在帶有活化為碳酸酯的醇官能團的連接基前體LP和W=(CH₂)_nNH₂之間進行。反應的另一實例為帶有醇官能團的連接基和W=CO₂H或(CH₂)_nCO₂H之間的酯化反應：該反應可以在偶聯劑如MNBA的存在下進行。反應的另一實例為帶有炔官能團的連接基前體和W=(CH₂)N₃之間的銅催化的疊氮化物-炔環加成：該反應可以在硫酸銅和抗壞血酸鈉的存在下進行。

在W=(CH₂)_nNH₂和L=(IV1)，其中n=1,R₁₅=H且ALK=(CH₂)₃的情況下，基於流程7，製備式(II)化合物

步驟(i)：在偶聯劑如EDC和HOBt以及鹼如DIEA的存在下進行肽偶聯；步驟(ii)：在催化劑如四-(三苯基膦)鈀的存在下對烯丙基酯脫保護；步驟(iii)：羧酸活化為NHS酯，藉由在鹼如DIEA的存在下的DSC處理。

在W=(CH₂)_nNH₂和L=(IV1)，其中n=1,R₁₁=H且ALK=(CH₂)₃的情況下，基於流程8，製備式(II)化合物

步驟(i)：在偶聯劑如EDC和HOBt以及鹼如DIEA的存在下的肽偶聯；步驟(ii)：在鹼如哌啶的存在下對Fmoc胺進行脫保護；步驟(iii)：偶聯至戊二酸酐；步驟(iv)：羧酸活化為NHS酯，藉由在鹼如DIEA的存在下的DSC處理。

流程9和10描述了以下情況：L(IV1)，其中n=1，R₁₁=H和ALK=(CH₂)₃，但是它們也可適用於其他連接基L，其中RCG1=C(=O)ONHS，即L(IV1)，其中n≠1和/或R₁₁≠H和/或ALK≠(CH₂)₃的情況以及L(IV2)和L(IV3)的情況。它們針對對位的連接基給出，但是可以一致地適用於鄰位或間位位置。類似地，它們針對念珠藻素化合物給出，但是也可適用於製備其他式(I)化合物，特別是D₁-D₁₉。

在W=(CH₂)_nNH₂，其中n=1,R₁₁=和RCG1=馬來醯亞胺基、鹵代乙醯胺基、NH₂、N₃或環辛炔劑即連接基L(IV4)至L(IV17)的情況下，製備式(II)化合物

步驟(i)：在偶聯劑如EDC和HOBt以及鹼如DIEA的存在下的肽偶聯；步驟(ii)：在鹼如哌啶的存在下對Fmoc胺進行脫保護。

流程11描述了如下情形：L(IV4)，其中n=1，R₁₁=H和ALK=(CH₂)₅，L(IV8)，其中n=1和R₁₁=H，L(IV12)，其中n=1，R₁₁=H和ALK=(CH₂)₄，L(IV14)，其中n=1，R₁₁=H和ALK=(CH₂)₃和L(IV16)，其中n=1，R₁₁=H，ALK=(CH₂)₃和ALK’=(CH₂)₂，但是其也適用於其他連接基L(IV4)至L(IV17)，其中RCG1=馬來醯亞胺基、碘代乙醯胺基、NH₂、N₃或環辛炔。對於碘代乙醯胺基反應性基團進行了描述，但是對於溴乙醯胺基反應性基團一致地適用。其針對對位的連接基給出，但是可以一致地適用於鄰位或間位位置。類似地，其針對念珠藻素化合物給出，但是還可以適用於製備其他式(I)化合物，特別是D₁-D₁₉。

在W=(CH₂)_nX，其中X=O或S和L=(IV18)，其中n=1，R₁₇和R₁₈=H且ALK=(CH₂)₃情況下，基於流程7，製備式(II)化合物

步驟(i)：將苄醇或苄硫醇活化為對-硝基苯基-(硫代)碳酸酯，藉由利用對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下的處理；步驟(ii)：藉由與胺在鹼如DIEA的存在下反應形成(硫代)胺基甲酸酯；步驟(iii)：在催化劑如四(三苯基膦)鈀的存在下對烯丙基酯脫保護；步驟(iv)：藉由在鹼如DIEA的存在下的DSC處理將羧酸活化為NHS酯。

在W=(CH₂)_nX，其中X=O或S和L=(IV18)，其中n=1,R₁₇和R₁₈=H和ALK=(CH₂)₃的情況下，基於流程8，製備式(II)化合物

步驟(i)：藉由與胺在鹼如DIEA的存在下反應形成(硫代)胺基甲酸酯；步驟(ii)：在鹼如哌啶的存在下對Fmoc胺進行脫保護；步驟(iii)：偶聯至戊二酸酐；步驟(iv)：藉由在鹼如DIEA的存在下的DSC處理將羧酸活化為NHS 酯。

流程12和13描述了以下情況：L(IV18)，其中n=1，R₁₇和R₁₈=H和ALK=(CH₂)₃，但是它們也可適用於其他連接基L，其中RCG1=C(=O)ONHS，即L(IV18)，其中n≠1和/或R₁₇，R₁₈≠H和/或ALK≠(CH₂)₃的情況以及L(IV19)和L(IV20)的情況。它們針對對位的連接基給出，但是也可一致地適用於鄰位或間位。類似地，它們針對念珠藻素化合物給出，但是也可適用於製備其他式(I)化合物，特別是D₁-D₁₉。

在W=(CH₂)_nX，其中X=O或S且RCG1=馬來醯亞胺基、鹵代乙醯胺基、NH₂、N₃或環辛炔，即連接基L(IV21)至(IV34)的情況下，製備式(II)化合物

流程14

步驟(i)：(硫代)胺基甲酸酯的形成，反應在鹼如DIEA的存在下進行；步驟(ii)：在鹼如哌啶的存在下對Fmoc胺進行脫保護。

流程14描述了以下情形：L(IV21)，其中n=1、R₁₇和R₁₈=H和ALK=(CH₂)₅的情形，L(IV25)，其中n=1和R₁₇及R₁₈=H的情形，L(IV29)，其中n=1，R₁₇和R₁₈=H和ALK=(CH₂)₄的情形，L(IV31)，其中n=1，R₁₇和R₁₈=H和ALK=(CH₂)₃的情形，以及L(IV33)，其中n=1、R₁₇、R₁₈和R₂₂=H，ALK=(CH₂)₃和ALK’=(CH₂)₂的情形，但是其也適用於其他連接基L(IV21至34)，其中RCG1=馬來醯亞胺基、碘代乙醯胺基、NH₂,、N₃或環辛炔。對於碘代乙醯胺基反應性基團進行了描述，但是一致地適用於溴乙醯胺基反應性基團。其針對對位的連接基給出，但是一致地適用於鄰位或間位。類似地，其針對念珠藻素化合物給出，但是也可適用於製備其他式(I)化合物，特別是D₁-D₁₉。

在W=(CH₂)_nNH₂和L=(IV35)，其中n=1，R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H，J₁=J₂=J₃=J₄=CH和ALK=(CH₂)₃的情況下，基於流程7，製備式(II)化合物

步驟(i)：胺基甲酸酯的形成，反應在鹼如DIEA的存在下進行；步驟(ii)；在催化劑如四-(三苯基膦)鈀的存在下對烯丙基酯脫保護；步驟(iii)：藉由在鹼如DIEA的存在下的DSC處理將羧酸活化為NHS酯。

在W=(CH₂)_nNH₂和L=(IV35)，其中n=1，R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H，J₁=J₂=J₃=J₄=CH和ALK=(CH₂)₃的情況下，基於流程8，製備式(II)化合物

步驟(i)：胺基甲酸酯的形成，反應在鹼如DIEA的存在下在合適的對硝基苯基碳酸酯試劑的存在下進行；步驟(ii)：在鹼如哌啶的存在下對Fmoc胺進行脫保護；步驟(iii)：偶聯至戊二酸酐；步驟(iv)：藉由在鹼如DIEA的存在下的DSC處理將羧酸活化為NHS酯。

流程15和16描述了以下情況：L(IV35)，其中n=1，R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H，J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對-苄醇和ALK=(CH₂)₃，但是它們也可適用於其他連接基L，其中RCG1=C(=O)ONHS，即L(IV35)，其中n≠1和/或R₁₁，R₁₄，R₁₅， R₁₆≠H和/或J₁，J₂，J₃，J₄≠CH和/或鄰-苄醇和/或ALK≠(CH₂)的情形，以及L(IV36)和L(IV37)的情形。它們針對對位的連接基給出，但是一致地適用於鄰位或間位。類似地，它們針對念珠藻素化合物給出，但是也可適用於製備其他式(I)化合物，特別是D₁-D₁₉。

在W=(CH₂)_nNH₂，其中n=1，R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H，J₁=J₂=J₃=J₄=CH和RCG1=馬來醯亞胺基、鹵代乙醯胺基、NH₂、N₃或環辛炔即連接基L(IV38)至L(IV151)的情況下，製備式(II)化合物

步驟(i)：胺基甲酸酯的形成，反應在鹼如DIEA的存在下在合適的對硝基苯基碳酸酯試劑的存在下進行；步驟(ii)：在鹼如哌啶的存在下對Fmoc胺進行脫保護。

流程17描述了以下情形：L(IV38)，其中n=1，R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H，J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對苄醇和ALK=(CH₂)₅，L(IV42)，其中n=1,R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H和J₁=J₂=J₃=J₄=CH和對-苄醇，L(W46)，其中n=1,R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對苄醇和ALK=(CH₂)₄,L(IV48)，其中n=1,R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對苄醇和ALK=(CH₂)₃，以及L(IV50)，其中n=1,R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₂₂=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對-苄醇，ALK=(CH₂)₃和ALK’=(CH₂)₂，但是其也適用於其他連接基L(IV38)至L(IV51)，其中RCG1=馬來醯亞胺基、碘代乙醯胺基、NH₂、N₃或環辛炔。其針對對苄醇給出，但是也可適用於鄰-苄醇。其針對碘代乙醯胺基反應性基團描述，但是可以一致地適用於溴乙醯胺基反應性基團。其針對對位連接基給出，但是一致地適用於鄰位或間位。類似地，其針對念珠藻素化合物給出，但是也可適用於製備其他式(I)化合物，特別是D₁-D₁₉.

在W=(CH₂)_nX，其中X=O或S和L=(IV52)，其中n=1,R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH和ALK=(CH₂)₃的情況下，基於流程7，製備式(II)化合物

步驟(i)：藉由與胺在鹼如DIEA的存在下反應形成(硫代)胺基甲酸酯；步驟(ii)：在催化劑如四(三苯基膦)鈀的存在下對烯丙基酯脫保護；步驟(iii)：藉由在鹼如DIEA的存在下的DSC處理將羧酸活化為NHS酯。

在W=(CH₂)_nX，其中X=O或S和L=(IV52)，其中n=1，R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=H，J₁=J₂=J₃=J₄=CH和ALK=(CH₂)₃的情況下，基於流程8，製備式(II)化合物

步驟(i)：藉由與胺在鹼如DIEA的存在下反應形成(硫代)胺基甲酸酯；步驟(ii)：在鹼如哌啶的存在下對Fmoc胺進行脫保護；步驟(iii)：偶聯至戊二酸酐；步驟(iv)：藉由在鹼如DIEA的存在下的DSC處理將羧酸活化為NHS酯。

流程18和19描述了以下情況：L(IV52)，其中n=1,R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對苄醇和ALK=(CH₂)₃，但是它們也可適用於其他連接基L，其中RCG1=C(=O)ONHS，即L(IV52)，其中n≠1和/或R₁₄,R₁₅,R₁₆,R₁₇,R₁₈≠H和/或J₁,J₂,J₃,J₄≠CH和/或鄰-苄醇和/或ALK≠(CH₂)₃的情形以及L(IV53)和L(IV54)的情形。它們針對對位的連接基給出，但是一致地適用於鄰位或間位。類似地，它們針對念珠藻素化合物給出，但是也可適用於製備其他式(I)化合物，特別是D₁-D₁₉。

在W=(CH₂)_nX，其中X=O或S和RCG1=馬來醯亞胺基、鹵代乙醯胺基、NH₂、N₃或環辛炔即連接基L(IV55)至(IV68)的情況下，製備式(II)化合物

步驟(i)：藉由與胺在鹼如DIEA的存在下反應形成(硫代)胺基甲酸酯；步驟(ii)：在鹼如哌啶的存在下對Fmoc胺進行脫保護。

流程20描述了L(IV55)，其中n=1,R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對-苄醇，ALK=(CH₂)₂和ALK’=(CH₂)₅的情況，L(IV59)，其中n=1,R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對苄醇和ALK=(CH₂)₂的情況，L(IV63)，其中n=1,R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對-苄醇，ALK=(CH₂)₂和ALK’=(CH₂)₄的情況，L(IV65)，其中n=1,R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對-苄醇，ALK=(CH₂)₂和ALK’=(CH₂)₃的情況，以及L(IV67)，其中n=1,R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=R₂₂=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對-苄醇，ALK=(CH₂)₂,ALK’=(CH₂)₅和ALK”=(CH₂)₂的情況，但是其也適用於其他連接基L(IV55至68)，其中RCG1=馬來醯亞胺基，碘代乙醯胺基，NH₂,N₃或環辛炔。其針對碘代乙醯胺基反應性基團進行描述，但是可一致地適用於溴乙醯胺基反應性基團。其針對對位連接基給出，但是一致地適用於鄰位或間位。類似地，其針對念珠藻素化合物給出，但是也可適用於製備其他式(I)化合物，特別是D₁-D₁₉.

在W=C(=O)O和L=(IV69)，其中R₁₄=R₁₅=R₁₆=H，J₁=J₂=J₃=J₄=CH和ALK=(CH₂)₃的情況下，基於流程7，製備式(II)化合物

步驟(i)：在偶聯劑如MNBA和鹼如DMAP和DIEA的存在下酯化；步驟(ii)：在催化劑如四-(三苯基膦)鈀的存在下對烯丙基酯脫保護；步驟(iii)：藉由在鹼如DIEA的存在下的DSC處理將羧酸活化為NHS酯。

在W=C(=O)O和L=(IV69)，其中R₁₄=R₁₅=R₁₆=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH和ALK=(CH₂)₃的情況下，基於流程8，製備式(II)化合物

步驟(i)：在偶聯劑如MNBA和鹼如DMAP和DIEA的存在下酯化；步驟(ii)：在鹼如哌啶的存在下對Fmoc胺進行脫保護；步驟(iii)：偶聯至戊二酸酐；步驟(iv)：藉由在鹼如DIEA的存在下的DSC處理將羧酸活化為NHS酯。

流程21和22描述了以下情況：L(IV69)，其中R₁₄=R₁₅=R₁₆=H，J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對苄醇和ALK=(CH₂)₃，但是它們也可適用於其他連接基L，其中RCG1=C(=O)ONHS，即L(IV69)，其中R₁₄,R₁₅,R₁₆≠H和/或J₁,J₂,J₃,J₄≠CH和/或鄰-苄醇和/或ALK≠(CH₂)₃的情況以及L(IV70)和L(IV71)的情況。它們針對對位的連接基給出，但是一致地適用於鄰位或間位。類似地，它們針對念珠藻素化合物給出，但是也可適用於製備其他式(I)化合物，特別是D₁-D₁₉。

在W=C(=O)O，其中R₁₄=R₁₅=R₁₆=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH和RCG1=馬來醯亞胺基，鹵代乙醯胺基，NH₂,N₃或環辛炔即連接基L(IV72)至L(IV85)的情況下，製備式(II)化合物

步驟(i)：在偶聯劑如MNBA和鹼如DMAP和DIEA的存在下酯化；步驟(ii)：在鹼如哌啶的存在下對Fmoc胺進行脫保護。

流程23描述了以下情形：L(IV72)，其中n=1,R₁₄=R₁₅=R₁₆=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對苄醇和ALK=(CH₂)₅，L(IV76)，其中n=1,R₁₄=R₁₅=R₁₆=H和J₁=J₂=J₃=J₄=CH和對-苄醇，L(IV80)，其中n=1,R₁₄=R₁₅=R₁₆=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對苄醇和ALK=(CH₂)₄,L(IV82)，其中n=1,R₁₄=R₁₅=R₁₆=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對苄醇和ALK=(CH₂)₃以及L(IV84)，其中n=1,R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₂₂=H,J₁=J₂=J₃=J₄=CH，對-苄醇，ALK=(CH₂)₃和ALK’=(CH₂)₂，但是其也適用於其他連接基L(IV72)至L(IV85)，其中RCG1=馬來醯亞胺基，碘代乙醯胺基，NH₂,N₃或環辛炔。其針對對苄醇給出，但是也可適用於鄰-苄醇。其針對碘代乙醯胺基反應性基團進行描述，但是可一致地適用於溴乙醯胺基反應性基團。其針對對位連接基給出，但是一致地適用於鄰位或間位。類似地，其針對念珠藻素化合物給出，但是也可適用於製備其他式(I)化合物，特別是D₁-D₁₉。

在W=C(=O)O和L=(V86)，其中R₂₅=H和ALK=(CH₂)₇的情況下，製備式(II)化合物

步驟(i)：藉由在鹼如DIEA的存在下的DSC處理將羧酸活化為NHS酯；步驟(ii)：肽偶聯在鹼如DIEA的存在下；步驟(iii)：藉由在鹼如DIEA的存在下的DSC處理將羧酸活化為NHS酯。

流程24描述了L(V86)，其中R₂₅=H和ALK=(CH₂)₇的情況，但是它們也可適用於其他連接基L，其中RCG1=C(=O)ONHS，即L(V86)，其中R₂₅≠H和/或ALK≠(CH₂)₇的情形以及L(V87)和L(V88)的情形。它們針對對位的連接基給出，但是一致地適用於鄰位或間位。類似地，它們針對念珠藻素化合物給出，但是也可適用於製備其他式(I)化合物，特別是D₁-D₁₉。

在W=C(=O)O，其中R₃₀=H和RCG1=馬來醯亞胺基、鹵代乙醯胺基、NH₂、N₃或環辛炔即連接基L(V89)至L(V101)的情況下，製備式(II)化合物

步驟(i)：在鹼如DIEA的存在下肽偶聯；步驟(ii)：藉由利用還原劑如TCEP處理還原疊氮基。

流程25描述以下情況：L(V89)，其中R₂₅=H和ALK=(CH₂)₅,L(V93)，其中R₂₅=H和ALK=(CH₂)₃，L(V96)，其中R₂₅=H和ALK=(CH₂)₄，L(V98)，其中R₂₅=H和ALK=(CH₂)₃，以及L(V100)，其中R₂₂=R₂₅=H，ALK=(CH₂)₃和ALK’=(CH₂)₂，但是其也適用於其他連接基L(V89)至L(V101)，其中RCG1=馬來醯亞胺基、碘代乙醯胺基、NH₂、N₃或環辛炔。其針對碘代乙醯胺基反應性基團進行描述，但是可一致地適用於溴乙醯胺基反應性基團。其針對對位連接基給出，但是一致地適用於鄰位或間位。類似地，其針對念珠藻素化合物給出，但是也可適用於製備其他式(I)化合物，特別是D₁-D₁₉。

念珠藻素接合物的製備方法

式(III)化合物可以根據流程26從式(II)的念珠藻素有效負載和抗體(Ab)開始製備：

其中：￭Y代表(C₁-C₆)烷基-NR₁₁或(C₁-C₆)烷基-O或(C₁-C₆)烷基-S；或者，Y代表C(=O)O或O(C₁-C₆)烷基-C(=O)O；或者，Y代表(C₁-C₆)烷基-三唑-，如

； Y位於苯基核的鄰位(o)、間位(m)或對位(p)；￭R₁₁代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；￭L代表定位在苯基核的鄰位(o)、間位(m)或對位(p)的連接基，如上文所定義的；￭RCG1代表對抗體上存在的反應性化學基團呈反應性的反應性化學基團，如上所定義；￭Ab代表抗體。

用於合成式(I)的念珠藻素化合物的構造塊的製備方法

片段A的一般合成

可以借助下面詳述的步驟起始於合適的羥基酯以12步來製備片段A：

步驟(i)：使用活化為三氯乙醯亞胺酯的p-甲氧基苄基醇在催化量的酸如p-TsOH的存在下將醇保護為p-甲氧基苄基醚；

步驟(ii)：使用還原劑如硼氫化鋰將酯還原；

步驟(iii)：使用氧化劑如TEMPO在次氯酸鈉的存在下將醇氧化；

步驟(iv)：使用烯丙基三丁基錫在四氯化錫的存在下進行非對映立體選擇的烯丙基化；

步驟(v)：使用丙烯酸第三丁基酯在催化劑如Grubbs II催化劑的存在下進行交叉複分解；

步驟(vi)：使用CAN和接著以乙二硫醇處理在催化量的酸如p-TsOH的存在下對p-甲氧基苄基醚進行脫保護；

步驟(vii)：使用氯三乙基矽烷在鹼如咪唑的存在下將醇保護為甲矽烷基醚；

步驟(viii)：使用DMSO和草醯氯在鹼如DIEA的存在下進行Swern氧化；

步驟(ix)：使用合適的鹵化鏻例如溴化鏻和強鹼如BuLi進行Wittig反應；

步驟(x)：使用例如TBAF溶液將甲矽烷基醚脫保護。

步驟(xi)：使用氧化劑如氧化錳將苄醇進行氧化；

步驟(xii)：使用AIBN在苯硫醇的存在下對雙鍵進行異構化。

羥基酯對於R₁=Me(CAS號[72657-23-9])、Et(CAS號[72604-81-0])和iPr(CAS號[72604-82-1])市售可得。鹵化鏻的製備描述於WO2011/001052中。

片段B的一般合成

可以借助下面詳述的步驟從合適的胺基酸以2步來製備片段B：步驟(i)：藉由以Boc₂O在鹼如TEA的存在下的處理來保護胺；步驟(ii)：使用鹼例如LiOH來進行甲基酯的皂化。

保護為甲基酯的胺基酸對於以下市售可得：R₉=3-Cl,4-OMe(CAS號[704870-54-2])；3-Cl,4-OEt(CAS號[1256963-00-9])；3-Cl,4-OPr(CAS號[1259709-59-9])；3-Cl,4-OMe,5-F(CAS號[1213670-98-4])；3-Cl,4-OMe,5-Cl(CAS號[1259701-42-2])；3-Cl,4-OMe,5-OMe(CAS號[1212820-34-2])；3-Cl,4-OH,5-OMe(CAS號[1213426-93-7])；3-Cl,4-NH₂(CAS號[1213672-64-0])；2-Cl,3-Cl,4-NH₂(CAS號[1213607-49-8])；3-Cl,4-NH₂,5-F(CAS號[1213400-66-8])；3-Cl,4-NH₂,5-Cl(CAS號[1213480-30-8]).

構造塊AD1的一般合成

片段A和D允許借助下面詳述的步驟製備構造塊AD1：步驟(i)：片段D與片段A在偶聯劑如MNBA和鹼如DMAP和DIEA的存在下的酯化；步驟(ii)：使用還原劑如三甲氧基硼氫化鈉將醛還原成醇；步驟(iii)：藉由以甲磺醯氯處理在鹼如TEA的存在下將醇活化為甲磺酸酯；藉由以疊氮化鈉處理以疊氮基取代甲磺酸酯基；步驟(iv)：藉由以鹼如哌啶處理對胺進行脫保護。

構造塊AD2的一般合成

片段A和D允許借助下面詳述的步驟製備構造塊AD2：步驟(i)：片段D與片段A在偶聯劑如MNBA和鹼如DMAP和DIEA的存在下的酯化；步驟(ii)：使用還原劑如三甲氧基硼氫化鈉將醛還原成醇；步驟(iii)：藉由以鹼如哌啶處理對胺進行脫保護。

構造塊AD3的一般合成

步驟(i)：片段D與Sakurai醇在偶聯劑如MNBA和鹼如DMAP和DIEA的存在下的酯化；步驟(ii)：藉由以鹼如哌啶處理對胺進行脫保護。

構造塊BC的一般合成

片段B和C允許借助下面詳述的步驟製備構造塊BC：步驟(i)：片段B與片段C在偶聯劑如HOBt和EDC的存在下和鹼如DIEA的肽偶聯；步驟(ii)：使用鹼例如LiOH的甲基酯的皂化。

可選的構造塊BC的一般合成

片段B和C允許借助下面詳述的步驟製備可選的BC：步驟(i)：片段B與片段C在偶聯劑如HOBt和EDC和鹼如DIEA的存在下的肽偶聯；步驟(ii)：在酸性條件下使用例如TFA對Boc基團進行脫保護；步驟(iii)：藉由以丙烯醯氯處理在鹼如DIEA的存在下形成丙烯醯胺；步驟(iv)：使用鹼如tBuOK對甲基酯進行皂化。

製備連接基前體LP

LP可以為以下之一：LP₁至LP₁₀₁，使用L胺基酸描述，但是也可適用於D胺基酸。它們針對w=2給出，但是類似地藉由如所要求的重複多次肽偶聯步驟而適用於w>2。

LP₁根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由以在偶聯劑如EDC的存在下的NHS處理來進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在室溫在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護為烯丙基酯的二酸對於n=2(琥珀酸單烯丙基酯)市售可得，或者可以藉由甲基或第三丁基單酯的酯交換來製備，其對於n=2至6市售可得。

LP₂根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由以在偶聯劑如支撐DCC的存在下的NHS處理來進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如 DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護為烯丙基酯的PEG二酸可以根據以下流程製備：當ALK=CH₂CH₂時

當ALK≠CH₂CH₂時

步驟(i)：PEG鏈的延長；反應在無水極性非質子溶劑如THF或DMF中藉由以藉由催化量鈉的作用產生的醇鹽處理不飽和的經保護的酸來進行；步驟(ii)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。在後一種情況中，可以形成存在於結構上醇官能的三氟乙酸鹽。該三氟乙酸鹽在以下步驟(iii)中解離；步驟(iii)：將羧酸保護為甲基酯；反應在極性非質子溶劑如MeOH中藉由以三甲基甲矽烷基二偶氮甲烷處理來進行；步驟(iv)：甲基酯的皂化；反應在極性溶劑的混合物如THF/H₂O混合物中在LiOH的存在下進行；步驟(v)：將羧酸保護為烯丙基酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中在烯丙醇、偶聯劑如EDC和鹼如DMAP的存在下進行；步驟(vi)：PEG鏈的延長；反應在無水極性非質子溶劑如THF或DMF中藉由以單保護為THP醚的PEG二醇的醇鹽處理鹵化的酯進行。這種類型的單保護的PEG二醇的製備詳細地描述於文獻中：參見例如，Richard A.,et al.,Chem.Eur.J.2005,11,7315-7321或Sakellariou E.G.,et al.,Tetrahedron 2003,59,9083-9090。

起始的PEG二醇類對於i=3至12市售可得。

LP₃根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性溶劑如混合物DMF/H₂O中藉由N,N'-二琥珀醯亞胺基碳酸酯在鹼如DIEA的存在下的處理來進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在室溫在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護為烯丙基酯的磺基二酸可以根據以下流程製備：

備選地，當ALK=CH₂CH₂時

步驟(i)：將羧酸保護為烯丙基酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中在烯丙醇、偶聯劑如EDC和鹼如DMAP的存在下進行；

步驟(ii)：羧酸的α-磺化；反應於75℃在極性非質子溶劑如DCE中藉由以氯磺酸在鹼如DIEA的存在下的處理來進行。

步驟(iii)：形成羧酸部分；反應藉由以氫氧化鈉處理進行；

步驟(iv)：由硫代乙醯基取代溴基(bromide)；反應於-20℃在極性非質子溶劑如THF中使用硫乙酸在鹼如DIEA的存在下進行；

步驟(v)：形成磺酸部分；反應在室溫藉由以過氧化氫和乙酸處理來進行。

氰基羧酸對於n=1至12市售可得。

LP₄根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由以在偶聯劑如EDC的存在下的NHS處理來進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；馬來醯亞胺基羧酸對於n=1至12市售可得。

LP₅根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中進行在鹼如碳酸氫鈉的存在下；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由以在偶聯劑如支撐DCC的存在下的NHS處理來進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；馬來醯亞胺酸對於ALK=ALK’=CH₂CH₂和i=1至7市售可得，並且可以根據以下流程製備：當ALK=ALK’=CH₂CH₂且i>7時

當ALK≠CH₂CH₂且ALK’=CH₂CH₂時

當ALK=CH₂CH₂且ALK’≠CH₂CH₂時

當ALK且ALK’≠CH₂CH₂時

步驟(i)：PEG鏈的延長；反應在無水極性非質子溶劑如THF或DMF中藉由以催化量鈉的作用產生的醇鹽處理不飽和的受保護的酸來進行；步驟(ii)：在馬來醯亞胺上進行Mitsunobu反應；反應在極性非質子溶劑如THF中藉由在PPh₃和DIAD的存在下以PEG羥酸處理馬來醯亞胺來進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護；步驟(iv)：PEG鏈的延長；反應在無水極性非質子溶劑如THF或DMF中藉由以單保護為THP醚的PEG二醇的醇鹽處理鹵化的酯來進行。這種類型的單保護的PEG二醇的製備詳細描述於文獻中：參見，例如，Richard A.,et al.,Chem.Eur.J.2005,11,7315-7321或Sakellariou E.G.,et al., Tetrahedron 2003,59,9083-9090；步驟(v)：選擇性脫保護THP醚；反應在極性質子溶劑如MeOH中使用催化量的乙醯氯進行；步驟(vi)：將醇活化為甲磺酸酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由以甲磺醯氯在鹼如TEA的存在下的處理來進行；步驟(vii)：親核取代；反應在極性非質子溶劑如DMF中在鹼如氫化鈉的存在下進行；步驟(viii)：將醇保護為苄基醚；反應在極性非質子溶劑如THF中藉由以苄基溴在鹼如氫化鈉的存在下的處理來進行；步驟(ix)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)進行醇的脫保護；步驟(x)：藉由氫解在催化劑如鈀/碳的存在下對醇進行脫保護。

起始的PEG二醇類對於i=3至12市售可得。起始的ALK二醇類對於n=1至12市售可得。

LP₆根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性溶劑如混合物DMF/H₂O中藉由N,N'-二琥珀醯亞胺基碳酸酯在鹼如DIEA的存在下的處理來進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；馬來醯亞胺基環己烷羧酸對於ALK=CH₂市售可得，並且可以另外根據以下流程製備：當n=2至4時

當n>4時

步驟(i)：氫化；反應於60℃在乙酸在催化劑如氧化鉑的存在下在氫氣壓力如60psi下進行；步驟(ii)：胺的保護；反應在極性質子溶劑如二

烷/H₂O混合物中藉由在鹼如NaOH的存在下以氯甲酸苄基酯的處理來進行；步驟(iii)：對羧酸進行保護；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由在偶聯劑如EDC和鹼如DMAP的存在下以第三丁醇的處理來進行；步驟(iv)：胺的脫保護；反應藉由氫解在極性質子溶劑如MeOH中在催化劑如鈀的存在下進行；步驟(v)：引入馬來醯亞胺基部分；反應在極性非質子溶劑如DMF中藉由在NHS和偶聯劑如EDC的存在下以馬來酸酐的處理來進行；步驟(vi)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護；步驟(vii)：鈀催化的偶聯；反應在極性非質子溶劑如THF中藉由在氯化鋰、鋅和三甲基氯矽烷和催化劑如四(三苯基膦)鈀的存在下以溴-ALK-氰基衍生物的處理來進行。

合適的溴-ALK-氰基衍生物對於n=1至12市售可得。

LP₇根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸的α-磺化；反應於75℃在極性非質子溶劑如DCE中藉由在鹼如DIEA的存在下以氯磺酸的處理來進行；步驟(iv)：羧酸活化為NHS酯；反應在室溫在極性溶劑如混合物DMF/H₂O中藉由在鹼如DIEA的存在下以N,N'-二琥珀醯亞胺基碳酸酯的處理來進行；步驟(v)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在室溫在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；馬來醯亞胺酸對於n=1至12市售可得。

LP₈根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得。

LP₉根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：偶聯和將羧酸活化為NHS酯；N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯與胺基羧酸的偶聯於室溫在極性非質子溶劑如DCM/DMF混合物並隨後添加N,N’-二琥珀醯亞胺基碳酸酯和鹼如DIEA中進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得，胺基羧酸對於n=1至12以及N-甲基化的胺基羧酸對於n=1至7也是市售可得。

LP₁₀根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：偶聯和將羧酸活化為NHS酯；N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯與胺基羧酸的偶聯在極性非質子溶劑如DCM/DMF混合物並隨後添加N,N’-二琥珀醯亞胺基碳酸酯和鹼如DIEA中進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；在ALK=CH₂CH₂和R₂₀=H的情況下，胺基PEG羧酸對於i=1至6市售可得，並且可以另外從丙烯酸第三丁基酯和對應的胺基-PEG-醇製備；在ALK≠CH₂CH₂的情況下，它們可以根據以下的流程製備：在ALK=CH₂CH₂和R₂₀≠H的情況下

在ALK≠CH₂CH₂的情況下

在R₂₀=H的情況下

在R₂₀≠H的情況下

步驟(i)：胺的保護；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由在鹼如TEA的存在下以二碳酸二第三丁基酯處理胺來進行；步驟(ii)：對羧酸進行保護；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由在偶聯劑如EDC和鹼如DMAP的存在下以第三丁醇處理來進行；步驟(iii)：氮原子的烷基化；反應在無水極性非質子溶劑如THF中藉由在帶有離去基團如鹵化物的試劑的存在下以鹼如氫化鈉的處理來進行；步驟(iv)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護；步驟(v)：PEG鏈的延長；反應在無水極性非質子溶劑如THF或DMF中藉由以經由氫化鈉或萘基鉀(potassium naphthalenide)的作用產生的二苯甲酮-亞胺-PEG-醇的醇鹽處理鹵化的酯來進行，如WO2007/127440中描述的；步驟(vi)：酯的皂化；反應藉由使酯與LiOH在H₂O的存在下反應來進行。

胺基-PEG-醇類對於例如i=3、4、7、8市售可得，或者可以從PEG二醇類根據US7230101中描述的方法製備，其對於i=3至12市售可得。二苯甲酮對胺官能團進行保護可以在路易士酸如BF₃乙醚合物的存在下藉由共沸脫水來進行。

LP₁₁根據以下流程製備：

步驟(i)：在Fmoc-L-胺基酸-NHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺Fmoc的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：偶聯和將羧酸活化為NHS酯；N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯與胺基羧酸的偶聯於室溫在極性非質子溶劑如DCM/DMF混合物並接著添加N,N’-二琥珀醯亞胺基碳酸酯和鹼如DIEA中進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在室溫在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；胺基-(雜)芳基-羧酸市售可得，例如4-胺基-2-苯甲酸、6-胺基-3-吡啶羧酸、5-胺基-2-吡

羧酸、2-胺基-5-嘧啶羧酸或6-胺基-1,2,4,5-四

羧酸。

LP₁₂根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由在偶聯劑如EDC的存在下的以NHS處理來進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；胺基羧酸對於n=1至11市售可得。

LP₁₃根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由在偶聯劑如支撐DCC的存在下以NHS的處理來進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；在ALK=CH₂CH₂的情況中，Fmoc-保護的胺基PEG羧酸對於i=1至6市售可得並且另外可以從丙烯酸第三丁基酯和相應的胺基-PEG-醇製備；在ALK≠CH₂CH₂的情況下，它們可以根據對於連接基前體LP₁₀描述的流程來製備。以Fmoc基團保護胺官能團了可以藉由在鹼如DIEA的存在下以FmocOSu(CAS號[82911-69-1])處理來實現。

LP₁₄根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：引入疊氮基；反應在極性溶劑如丙酮/H₂O化合物中藉由以疊氮化鈉處理來進行；步驟(iv)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由在偶聯劑如EDC的存在下以NHS的處理來進行；步驟(v)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；溴羧酸對於n=1至11市售可得。

LP₁₅根據以下流程製備：

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；疊氮基PEG酸可以根據以下的流程製備：當ALK=CH₂CH₂時

當ALK≠CH₂CH₂時

步驟(i)：PEG鏈的延長；反應在無水極性非質子溶劑如THF或DMF中藉由以催化量鈉的作用產生的醇鹽處理不飽和的受保護的酸來進行；步驟(ii)：醇功能的活化；反應在極性溶劑如DCM中使用甲磺醯氯在鹼如TEA的存在下進行；步驟(iii)：以疊氮基取代甲磺酸酯；反應在極性溶劑如丙酮/H₂O混合物中藉由以疊氮化鈉處理進行；步驟(iv)：使用鹽酸溶液(如在二

烷中的溶液)脫保護；步驟(v)：PEG鏈的延長；反應如下進行：在無水極性非質子溶劑如THF或DMF中藉由以單保護為THP醚的PEG二醇的醇鹽處理鹵化的酯、例如以氫化鈉處理產生的醇鹽。這種類型的單保護的PEG二醇的製備詳細描述於文獻中：參見，例如Richard A.et al.Chem.Eur.J.2005,11,7315-7321或Sakellariou E.G.,et al.Tetrahedron 2003,59,9083-9090；步驟(vi)：甲基酯的皂化；反應在室溫在極性溶劑的混合物如THF/H₂O混合物中在LiOH的存在下進行。

起始的PEG二醇類對於i=3至12市售可得；溴甲基酯對於n=1至12市售可得。

LP₁₆根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：環辛炔偶聯；反應在極性溶劑如DCM中進行；步驟(iv)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由在偶聯劑如EDC的存在下以NHS的處理來進行；步驟(v)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；環辛炔對於n’=1,2,3和5市售可得；單活化為NHS酯的二酸對於n=1至3以及對於n=4至10市售可得，它們可以藉由在偶聯劑如DCC和鹼如DMAP的存在下以NHS活化市售可得的二酸來製備。

LP₁₇根據以下流程製備：

步驟(i)：Fmoc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：環辛炔偶聯；反應在極性溶劑如DCM中進行；步驟(iv)：使用鹽酸溶液(如在二

烷中的溶液)脫保護；步驟(v)：將環辛炔-PEG羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由在偶聯劑如EDC的存在下以NHS的處理來進行；步驟(vi)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM中進行。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；環辛炔對於n’=1、2、3和5市售可得；單活化為NHS酯的PEG二酸根據以下流程製備：當ALK=CH₂CH₂

當ALK≠CH₂CH₂

步驟(i)：PEG鏈的延長；反應在無水極性非質子溶劑如THF或DMF中藉由以通過催化量的鈉的作用產生的醇鹽處理不飽和的受保護的酸來進行；步驟(ii)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護；步驟(iii)：將一個酸單活化為NHS酯；反應在極性溶劑如THF中使用NHS在偶聯劑如DCC和鹼如DMAP的存在下進行；步驟(iv)：PEG鏈的延長；反應在無水極性非質子溶劑如THF或DMF中藉由以單保護為THP醚的PEG二醇的醇鹽處理鹵化的酯進行。這種類型的單保護的PEG二醇的製備詳細描述於文獻中：參見，例如，Richard A.,et al.,Chem.Eur.J.2005,11,7315-7321 or Sakellariou E.G.,et al.,Tetrahedron 2003,59,9083-9090；步驟(v)：將羧酸保護為甲基酯；反應在極性非質子溶劑如MeOH中藉由以三甲基甲矽烷基二疊氮甲烷處理進行；步驟(vi)：甲基酯的皂化；反應在極性溶劑的混合物如THF/H₂O混合物中在LiOH的存在下進行；步驟(vii)：將酸活化為NHS酯；反應在極性溶劑如THF中使用NHS在偶聯劑如DCC和鹼如DMAP的存在下進行。

起始的PEG二醇類對於i=3至12市售可得。

LP₁₈根據以下流程製備：

步驟(i)：肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下或在極性溶劑如DCM中在偶聯劑如丙基膦酸酐和鹼如TEA的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由在偶聯劑如EDC的存在下以NHS的處理來進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行；步驟(v)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得。單保護為烯丙基酯的二酸對於n=2(琥珀酸單烯丙基酯)市售可得，或者可以藉由甲基或第三丁基單酯的酯交換夾製備，其對於n’=2至6市售可得。

LP₁₉根據以下流程製備：

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；單保護為烯丙基酯的PEG二酸根據對於連接基前體LP₂描述的流程製備。

LP₂₀根據以下流程製備：

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；單保護為烯丙基酯的磺基二酸根據對連接基前體LP₃描述的流程製備。

LP₂₁根據以下流程製備：

步驟(i)：肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下或在極性溶劑如DCM中在偶聯劑如丙基膦酸酐和鹼如TEA的存在下進行。

步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由在偶聯劑如EDC的存在下以NHS的處理來進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行；步驟(v)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護.Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；馬來醯亞胺基羧酸對於n=1至12市售可得。

LP₂₂根據以下流程製備：

步驟(i)：肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下或在極性溶劑如DCM中在偶聯劑如丙基膦酸酐和鹼如TEA的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由在偶聯劑如支撐DCC的存在下以NHS的處理來進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行；步驟(v)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護.Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；馬來醯亞胺基PEG酸對於ALK=ALK’=CH₂CH₂和i=1至7市售可得，並且另外根據對於連接基前體LP₅描述的流程製備。

LP₂₃根據以下流程製備：

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；馬來醯亞胺基環己烷羧酸對於ALK=CH₂市售可得並且可以另外根據對於連接基前體LP₆描述的流程製備。

LP₂₄根據以下流程製備：

步驟(i)：肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下或在極性溶劑如DCM中在偶聯劑如丙基膦酸酐和鹼如TEA的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸的α-磺化；反應於75℃在極性非質子溶劑如DCE中藉由在鹼如DIEA的存在下以氯磺酸的處理來進行；步驟(iv)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由在偶聯劑如EDC的存在下以NHS的處理來進行；步驟(v)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行；步驟(vi)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；馬來醯亞胺基酸對於n=1至12市售可得。

LP₂₅根據以下流程製備：

步驟(i)：肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下或在極性溶劑如DCM中在偶聯劑如丙基膦酸酐和鹼如TEA的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行；步驟(iv)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得。

LP₂₆根據以下流程製備：

步驟(i)：肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下或在極性溶劑如DCM中在偶聯劑如丙基膦酸酐和鹼如TEA的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：偶聯和將羧酸活化為NHS酯；N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯與胺基羧酸的偶聯在極性非質子溶劑如DCM/DMF混合物並接著添加N,N’-二琥珀醯亞胺基碳酸酯和鹼如DIEA中進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行；步驟(v)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；胺基羧酸對於n=1至12市售可得，N-甲基化的胺基羧酸對於n=1至7市售可得。

LP₂₇根據以下流程製備：

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；在ALK=CH₂CH₂和R₂₀=H的情況下，胺基PEG羧酸對於i=1至6市售可得，並且另外可以從丙烯酸第三丁基酯和相應的胺基-PEG-醇製備；在ALK≠CH₂CH₂的情況下，它們可以根據對連接基前體LP₁₀描述的流程製備。

LP₂₈根據以下流程製備：

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；胺基-(雜)芳基-羧酸對於以下市售可得，例如4-胺基-2-苯甲酸，6-胺基-3-吡啶羧酸，5-胺基-2-吡

羧酸，2-胺基-5-嘧啶羧酸或6-胺基-1,2,4,5-四

羧酸。

LP₂₉根據以下流程製備：

步驟(i)：肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下或在極性溶劑如DCM中在偶聯劑如丙基膦酸酐和鹼如TEA的存在下進行；步驟(ii)：胺的脫保護；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在鹼如哌啶的存在下進行；步驟(iii)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由在偶聯劑如EDC的存在下以NHS的處理來進行；步驟(iv)：在二肽和NHS酯之間的肽偶聯反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行；步驟(v)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；胺基羧酸對於n=1至12市售可得。

LP₃₀根據以下流程製備：

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；Fmoc-保護的胺基PEG羧酸對於i=1至6市售可得，並且另外可以由丙烯酸第三丁基酯和對應的胺基-PEG-醇製備；在ALK≠CH₂CH₂的情況下，它們可以根據對於連接基前體LP₁₀ 的流程製備。以Fmoc基團保護胺官能團可以藉由在鹼如DIEA的存在下以FmocOSu(CAS號[82911-69-1])處理來實現。

LP₃₁根據以下流程製備：

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；疊氮基羧酸可以根據對於連接基前體LP₁₄描述的流程製備。

LP₃₂根據以下流程製備：

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；疊氮基PEG羧酸可以根據對於連接基前體LP₁₅描述的流程製備。

LP₃₃根據以下流程製備：

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；環辛炔連接基活化為NHS酯可以根據對於連接基前體LP₁₆描述的流程製備。

LP₃₄根據以下流程製備：

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

Fmoc-L-胺基酸的NHS酯市售可得；單保護的二胺對於n=2至4以及R₁₇和R₁₈彼此獨立地=H或Me市售可得；活化為NHS酯的環辛炔連接基可以根據對於連接基前體LP₁₇的描述製備。

LP₃₅根據以下流程製備：

步驟(i)：在連接基前體LP₁和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物可以市售獲得，例如4-(羥基甲基)-苯胺(CAS號[623-04-1])、4-(1-羥基乙基)-苯胺(外消旋(CAS號[14572-89-5])或對映異構體純的(R)(CAS號[210754-25-9])或(S)(CAS號[500229-84-5]))、4-胺基-α,α-二甲基-苯-甲醇(CAS號[23243-04-1])、4-胺基-α-甲氧基-α-甲基-苯甲醇(CAS號[1379318-81-6])、4-胺基-α-甲基-α-三氟甲基-苯甲醇(CAS號[851652-56-7])、2-胺基-苯甲醇(CAS號[5344-90-1])、2-胺基-α-甲基-苯甲醇(外消旋(CAS號[10517-50-7])或對映異構體純的(R)(CAS號[3205-21-8])或(S)(CAS號[3205-21-8]))、6-胺基-3-吡啶甲醇(CAS號[113293-71-3])、6-胺基-α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS號[1335054-83-5])、6-胺基-α-乙基-3-吡啶甲醇(CAS號[1355225-85-2])、6-胺基-α,α-二甲基-3-吡啶甲醇(CAS號[843646-03-8])、5-胺基-3-吡啶甲醇(CAS號[873651-92-4])、2-胺基-3-吡啶甲醇(CAS號[23612-57-9])、2-胺基-α-甲基-3-吡啶甲醇(外消旋(CAS號[869567-91-9])或對映異構體純的(R)(CAS號[936718-01-3])或(S)(CAS號[936718-00-2]))、2-胺基-α-乙基-3-吡啶甲醇(CAS號[914223-90-8])、2-胺基-α,α-二甲基-3-吡啶甲醇(CAS號[213666-96-7])、3-胺基-4-吡啶甲醇(CAS號[152398-05-5])、3-胺基-α-甲基-4-吡啶甲醇(CAS號[1242470-88-7])、3-胺基-α,α-甲基-4-吡啶甲醇(CAS號[13357-81-8])、4-胺基-3-吡啶甲醇(CAS號[138116-34-4])、4-胺基-α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS號[741223-49-4])、4-胺基-α,α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS號[1339013-26-1])、3-胺基-2-吡啶甲醇(CAS號[52378-63-9])、3-胺基-α-甲基-2-吡啶甲醇(CAS號[954240-54-1])、3-胺基-α,α-甲基-2-吡啶甲醇(CAS號[899438-57-4])。

LP₃₆根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₂和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₃₇根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₃和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₃₈根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₄和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₃₉根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₅和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₄₀根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₆和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₄₁根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₇和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₄₂根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₈和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₄₃根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₉和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₄₄根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₁₀和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₄₅根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₁₁和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₄₆根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₁₂和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₄₇根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₁₃和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₄₈根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₁₄和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₄₉根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₁₅和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

LP₅₀根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₁₆和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₅₁根據以下流程製備：

步驟(i)：在連接基前體LP₁₇和苯胺衍生物之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM/MeOH混合物中在偶聯劑如EEDQ的存在下進行；步驟(ii)：藉由以對-硝基苯基-氯甲酸酯在鹼如DIEA的存在下處理將苄醇活化為對硝基-苯基碳酸酯。

許多苯胺衍生物市售可得，例如對於LP₃₅列出的那些。

LP₅₂根據以下流程製備：

步驟(i)：在連接基前體LP₃₅和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₅₃根據以下流程製備：

LP₅₄根據以下流程製備：

步驟(i)：在連接基前體LP₃₆和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

步驟(i)：在連接基前體LP₃₇和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

步驟(i)：在連接基前體LP₃₈和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₅₅根據以下流程製備：

LP₅₆根據以下流程製備：

步驟(i)：在連接基前體LP₃₉和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₅₇根據以下流程製備：

步驟(i)：在連接基前體LP₄₀和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₅₈根據以下流程製備：

步驟(i)：在連接基前體LP₄₁和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₅₉根據以下流程製備：

步驟(i)：在連接基前體LP₄₂和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₆₀根據以下流程製備：

步驟(i)：在連接基前體LP₄₃和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₆₁根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₄₄和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₆₂根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₄₅和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₆₃根據以下流程製備：

步驟(i)：連接基前體LP₄₆和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₆₄根據以下流程製備：

步驟(i)：在連接基前體LP₄₇和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₆₅根據以下流程製備：

步驟(i)：在連接基前體LP₄₈和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₆₆根據以下流程製備：

步驟(i)：在連接基前體LP₄₉和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₆₇根據以下流程製備：

步驟(i)：在連接基前體LP₅₀和單保護的二胺之間形成胺基甲酸酯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₆₈根據以下流程製備：

步驟(i)：胺基甲酸酯的形成；反應在極性溶劑如CH₃CN中在鹼如DIEA的存在下進行；使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護。

LP₆₉根據針對連接基前體LP₃₅描述的第一步驟製備。

LP₇₀根據針對連接基前體LP₃₆描述的第一步驟製備。

LP₇₁根據針對連接基前體LP₃₇描述的第一步驟製備。

LP₇₂根據針對連接基前體LP₃₈描述的第一步驟製備。

LP₇₃根據針對連接基前體LP₃₉描述的第一步驟製備。

LP₇₄根據針對連接基前體LP₄₀描述的第一步驟製備。

LP₇₅根據針對連接基前體LP₄₁描述的第一步驟製備。

LP₇₆根據針對連接基前體LP₄₂描述的第一步驟製備。

LP₇₇根據針對連接基前體LP₄₃描述的第一步驟製備。

LP₇₈根據針對連接基前體LP₄₄描述的第一步驟製備。

LP₇₉根據針對連接基前體LP₄₅描述的第一步驟製備。

LP₈₀根據針對連接基前體LP₄₆描述的第一步驟製備。

LP₈₁根據針對連接基前體LP₄₇描述的第一步驟製備。

LP₈₂根據針對連接基前體LP₄₈描述的第一步驟製備。

LP₈₃根據針對連接基前體LP₄₉描述的第一步驟製備。

LP₈₄根據針對連接基前體 LP₅₀描述的第一步驟製備。

LP₈₅根據針對連接基前體LP₅₁描述的第一步驟製備。

LP₈₆根據以下流程製備：

步驟(i)：藉由酯化將酸偶聯在Wang樹脂(Wang resin)上；反應在極性溶劑如DCM中在偶聯劑如DIC和鹼如DMAP的存在下進行；步驟(ii)：Fmoc基團的脫保護；反應在極性溶劑如DMF中藉由以鹼例如哌啶處理進行；步驟(iii)：肽偶聯；反應在極性溶劑如DMF中在偶聯劑如HOBt和HATU和鹼如DIEA的存在下進行；步驟(iv)：解離樹脂；反應在極性溶劑如DCM/H₂O混合物中在酸如TFA的存在下進行。

Fmoc保護的烷基-胺基酸對於n=1至9市售可得；Fmoc L-胺基酸市售可得。

LP₈₇根據以下流程製備：

步驟(i)：藉由酯化將酸偶聯在Wang樹脂(Wang resin)上；反應在極性溶劑如DCM中進行在偶聯劑如DIC和鹼如DMAP的存在下進行；步驟(ii)：Fmoc基團的脫保護；反應在極性溶劑如DMF中藉由以鹼例如哌啶處理進行；步驟(iii)：肽偶聯；反應在極性溶劑如DMF中在偶聯劑如HOBt和HATU和鹼如DIEA的存在下進行；步驟(iv)：解離樹脂；反應在極性溶劑如DCM/H₂O混合物中在酸如TFA的存在下進行。

Fmoc-保護的胺基PEG羧酸對於i=1至6市售可得，並且另外可以從丙烯酸第三丁基酯和對應的胺基-PEG-醇製備；在ALK≠CH₂CH₂的情況下，它們可以根據對於連接基前體LP₁₀描述的流程製備。Fmoc基團保護胺官能團可以藉由以FmocOSu(CAS號[82911-69-1])在鹼如DIEA的存在下的處理來實現；Fmoc L-胺基酸市售可得。

LP₈₈根據以下流程製備：

步驟(i)：在Boc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：與磺基胺基酸肽偶聯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在偶聯劑如DCC和HOBt和鹼如DIEA的存在下進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

L-胺基酸市售可得；Boc-保護的L-胺基酸的NHS酯市售可得；磺基胺基酸對於n=1和2市售可得或者可以另外根據以下流程製備：

步驟(i)：藉由硫代乙醯基取代溴化物；反應在極性非質子溶劑如THF中使用硫代乙酸在鹼如DIEA的存在下進行；步驟(ii)：形成磺酸部分；反應藉由以過氧化氫和乙酸處理進行；步驟(iii)：藉由疊氮基取代溴化物；反應在極性溶劑如DMA中藉由以疊氮化鈉處理來進行；步驟(iv)：甲基酯脫保護；反應在酸性條件如HCl和AcOH的混合物中進行；步驟(v)：還原疊氮基；反應藉由在極性溶劑如H₂O中在催化劑如鈀/碳的存在下藉由氫解進行來進行。

二溴衍生物對於n=3,4和9市售可得。

LP₈₉根據以下流程製備：

步驟(i)：在Boc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：與馬來醯亞胺基胺肽偶聯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在偶聯劑如DCC和HOBt和鹼如DIEA的存在下進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

L-胺基酸市售可得；Boc-保護的L-胺基酸的NHS酯市售可得；馬來醯亞胺基胺對於n=2至6市售可得。

LP₉₀根據以下流程製備：

步驟(i)：在Boc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：與馬來醯亞胺基PEG胺的肽偶聯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在偶聯劑如DCC和HOBt和鹼如DIEA的存在下進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

L-胺基酸市售可得；Boc-保護的L-胺基酸的NHS酯市售可得；馬來醯亞胺基PEG胺對於ALK=ALK’=CH₂CH₂和i=0和1市售可得，或者可以另外根據以下流程製備：當ALK=ALK’=CH₂CH₂和i>1時

當ALK≠CH₂CH₂和ALK’=CH₂CH₂時

當ALK=CH₂CH₂和ALK’≠CH₂CH₂時

當ALK和ALK’≠CH₂CH₂時

步驟(i)：在馬來醯亞胺上的Mitsunobu反應；反應在極性非質子溶劑如THF中藉由以PEG羥基酸處理馬來醯亞胺(malemide)在PPh₃和DIAD的存在下進行；

步驟(ii)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護；

步驟(iii)：將醇活化為甲苯磺酸酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由以甲苯磺醯氯在鹼如TEA的存在下的處理來進行；

步驟(iv)：取代甲苯磺醯基；反應在極性非質子溶劑如THF中在鹼如氫化鈉的存在下進行。

步驟(v)：苄基的脫保護；反應在極性溶劑如MeOH中在催化量的催化劑如鈀/碳的存在下藉由氫解進行；

步驟(vi)：將醇活化為甲磺酸酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由以甲磺醯氯在鹼如TEA的存在下的處理來進行；

步驟(vii)：親核性取代；反應在極性非質子溶劑如DMF中在鹼如氫化鈉的存在下進行；

起始的Boc-保護的PEG胺基醇對於i=2至4市售可得，或者對於i=5至8能夠藉由Boc₂O處理市售可得的PEG胺基醇而製備；起始的ALK胺基醇對於n=1和3至10市售可得；起始的以苄基單保護的PEG二醇類對於i=1至9市售可得；起始的ALK二醇類對於n=1至12市售可得。

LP₉₁根據以下流程製備：

步驟(i)：在Boc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：與馬來醯亞胺基胺的肽偶聯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在偶聯劑如DCC和HOBt和鹼如DIEA的存在下進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

L-胺基酸市售可得；Boc-保護的L-胺基酸的NHS酯市售可得；馬來醯亞胺基胺可以根據以下流程製備：

步驟(i)：羧酸活化為NHS酯；反應在極性溶劑如混合物DMF/H₂O中藉由N,N'-二琥珀醯亞胺基碳酸酯在鹼如DIEA的存在下的處理來進行；步驟(ii)：肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

馬來醯亞胺基環己烷羧酸對於ALK=CH₂市售可得，或者可以根據對於LP₆描述的流程製備；以Boc單保護的二胺對於n=1至10市售可得。

LP₉₂根據以下流程製備：

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

L-胺基酸市售可得；Boc-保護的L-胺基酸的NHS酯市售可得；馬來醯亞胺基PEG胺可以根據以下流程製備：

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

馬來醯亞胺基環己烷羧酸對於ALK=CH₂市售可得，或者可以另外根據對於LP₆描述的流程製備；以Boc基團單保護的PEG二胺對於i=1至9市售可得。

LP₉₃根據以下流程製備：

步驟(i)：在Boc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：與鹵代乙醯胺基PEG胺的肽偶聯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在偶聯劑如DCC和HOBt和鹼如DIEA的存在下進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

L-胺基酸市售可得；Boc-保護的L-胺基酸的NHS酯市售可得；鹵代乙醯胺基胺對於n=2至4和8市售可得，或者可以根據以下流程製備：

步驟(ii)：肽偶聯；反應在極性非質子溶劑如DCM/CH₃CN混合物中進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；以Boc基團單保護的二胺對於n=1至10市售可得。

LP₉₄根據以下流程製備：

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

L-胺基酸市售可得；Boc-保護的L-胺基酸的NHS酯市售可得；鹵代乙醯胺基胺對於n=2至4和8市售可得，或者可得根據以下流程製備：

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

N-琥珀醯亞胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；以Boc基團單保護的PEG 二胺對於i=1至9市售可得。

LP₉₅根據以下流程製備：

步驟(i)：在Boc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：與鹵代乙醯胺基胺的肽偶聯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在偶聯劑如DCC和HOBt和鹼如DIEA的存在下進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

L-胺基酸市售可得；Boc-保護的L-胺基酸的NHS酯市售可得；鹵代乙醯胺基胺可以根據以下流程製備：

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

鹵代乙醯胺的NHS酯可以如對於連接基前體LP₁₁所描述的來製備；以Boc基團單保護的二胺對於n=1至10市售可得。

LP₉₆和LP₉₈根據以下流程製備：

步驟(i)：在Boc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：與疊氮基胺的肽偶聯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在偶聯劑如DCC和HOBt和鹼如DIEA的存在下進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

L-胺基酸市售可得；Boc-保護的L-胺基酸的NHS酯市售可得；疊氮基胺對於n=2至8和10市售可得。

LP₉₇和LP₉₉根據以下流程製備：

步驟(i)：在Boc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：與疊氮基PEG胺的肽偶聯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在偶聯劑如DCC和HOBt和鹼如DIEA的存在下進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

L-胺基酸市售可得；Boc-保護的L-胺基酸的NHS酯市售可得；對於ALK=CH₂CH₂，疊氮基PEG胺對於i=1至8和10市售可得，對於ALK≠CH₂CH₂，疊氮基PEG胺可以根據以下流程製備：

步驟(i)：將醇活化為甲磺酸酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由以甲磺醯氯在鹼如TEA的存在下的處理來進行；步驟(ii)：藉由疊氮基基團取代甲磺酸酯；反應在極性溶劑如丙酮/H₂O混合物中藉由以疊氮化鈉處理來進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

起始的PEG胺基醇可根據對於連接基前體LP₉₀所描述的來製備。

LP₁₀₀根據以下流程製備：

步驟(i)：在Boc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：與環辛炔胺的肽偶聯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在偶聯劑如DCC和HOBt和鹼如DIEA的存在下進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

環辛炔胺對於n=1,2,3和5市售可得。

LP₁₀₁根據以下流程製備：

步驟(i)：在Boc-L-胺基酸-ONHS和L-胺基酸之間的肽偶聯；反應在極性溶劑如DME/THF/H₂O混合物中在鹼如碳酸氫鈉的存在下進行；步驟(ii)：與環辛炔PEG胺的肽偶聯；反應在極性溶劑如CH₃CN中在偶聯劑如DCC和HOBt和鹼如DIEA的存在下進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如在二

烷中的溶液)對Boc基團進行脫保護。

環辛炔PEG胺可以根據以下流程製備：

步驟(i)：將醇活化為甲磺酸酯；反應在極性非質子溶劑如DCM中藉由以甲磺醯氯在鹼如TEA的存在下的處理來進行；步驟(ii)：親核性取代；反應在極性非質子溶劑如DMF中在鹼如氫化鈉的存在下進行；步驟(iii)：使用鹽酸的溶液(例如二

烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液進行脫保護；步驟(iv)：以Boc基團保護胺；反應在極性溶劑如DCM中藉由以Boc₂O在鹼如TEA的存在下的處理來進行；步驟(v)：肽偶聯；反應在極性溶劑如DCM中在偶聯劑如HOBt和EDC的存在下進行。

起始的ALK胺基醇對於n=1至10市售可得；環辛炔對於n=1,2,3和5市售可得。

¹ 實例是針對特定的念珠藻素化合物給出的，但是也可適用於任何式(I)的念珠藻素化合物，特別是D₁-D₁₉。

² 在表I中，其中的L在對位給出，但是也可以以類似方式得到L在鄰位元元或間位的化合物。

(表中or表示：或)

製備式(III)接合物的方法

本發明的接合物可以藉由由以下步驟構成的方法得到：(i)使視情況經緩衝的抗體的水溶液與式(II)念珠藻素有效負載的溶液接觸且使它們發生反應，其中抗體視情況首先藉由修飾劑修飾，式(II)化合物的化學基團RCG1針對在抗體上存在的化學基團RCG2、特別是針對在抗體上存在的胺基基團具有反應性，該化學基團RCG2在適當時已經藉由修飾劑引入，從而使得式(II)化合物藉由形成共價鍵連接至抗體；(ii)然後視情況使步驟(i)中形成的接合物與念珠藻素有效負載和/或未反應的抗體和/或所形成的任何聚集物分離。

根據一個變形以及更具體地，在步驟(ii)中僅使得自步驟(i)的接合物與未反應的念珠藻素有效負載和所形成的任何聚集物分離，而任何未反應的抗體被留在溶液中。

進行接觸的作用是使化學基團RCG1與化學基團RCG2反應以確保藉由形成共價鍵將念珠藻素有效負載與抗體連接；較佳地￭當RCG1代表-C(=O)-Z_aR_a時，反應較佳發生在抗體中的胺基官能團尤其是抗體中由賴胺酸(Lys)殘基的側鏈所帶有的ε-胺基和由抗體重鏈和輕鏈的N-末端胺基酸的α-胺基上。在此情況中得到下式的接合物：mAb-[NH-C(=O)-L*-Crypto]_d，其中L*=包含RCG1=-C(=O)-Z_aR_a的連接基L的片段，並且使得L=-L*C(=O)-Z_aR_a，並且d表示藥物對抗體的比例或DAR；￭當RCG1代表-Cl或馬來醯亞胺基或鹵代乙醯胺基時，抗體可以包含巰基化學基團；￭當RCG1代表疊氮基時，抗體可以包括-C≡CH部分或者活化的三鍵如環辛炔；￭當RCG1代表-NH₂時，反應使用酶催化劑發生在抗體的醯胺官能團上，特別是抗體的穀胺醯胺(Gln)殘基的側鏈帶有的醯胺基團上。在這種情況下得到下式的接合物：mAb-[C(=O)-NH-L*-Crypto]_d，其中L*=包含RCG1=-NH₂的連接基L的片段並且使得L=-L*NH₂，且d表示藥物對抗體的比例或DAR；￭當RCG1代表-C≡CH或活化的C≡C如環辛炔部分，抗體可以包含疊氮基。

術語“聚集物”係指可在兩個或更多個抗體之間形成的締合物，該抗體可能已藉由共軛來改性。聚集物在很多種參數的影響下是易於形成的，該參數為諸如抗體在溶液中的高濃度、溶液的pH、高的剪切力、接枝藥物的數目和它們的疏水性及溫度(參見J.Membrane Sci.2008,318,311-316中引用的參考文獻)，然而由於這些參數中的一些而引起的影響尚未被明確地闡明。在蛋白質或抗體的情況下，可參見AAPS Journal,“Protein Aggregation and Bioprocessing”2006,8(3),E572-E579。聚集物的含量可藉由已知的技術諸如SEC來確定(相關事項參見Analytical Biochemistry 1993,212(2),469-480)。

抗體的水溶液可例如用緩衝液諸如磷酸鉀或HEPES或或緩衝液的混合物諸如下述緩衝液A進行緩衝。緩衝液取決於抗體的性質。將念珠藻素有效負載溶於極性有機溶劑例如DMSO或DMA中。

反應在通常為20至40℃的溫度進行。反應時間可以在1至24小時變化，抗體與念珠藻素有效負載之間的反應可藉由帶有折射和/或紫外檢測器和/或HRMS的SEC來監測以確定反應的進度。若取代程度是不充分的，則反應可進行較長時間和/或可加入念珠藻素化合物。可以參考實例章節中較詳細的特定條件。具體的實施流程參見實例3、7、10、14、20和23。

本領域技術人員知曉用於在步驟(ii)中進行分離的各種層析技術：接合物可例如藉由以下方法來純化：空間排阻層析(SEC)、吸附層析(例如離子交換層析(IEC))、疏水性相互作用層析(HIC)、親和層析、在混合性載體諸如陶瓷性羥基磷灰石上進行的層析或HPLC。也可藉由透析或滲濾來進行純化。

在步驟(i)或(ii)後，可對接合物的溶液進行超濾和/或滲濾步驟(iii)。在這些步驟後，由此得到呈水溶液形式的接合物。

抗體

抗體可以為選自以下的單純系抗體：鼠類抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。

在一個實施流程中，抗體為單純系抗體，即特異性結合至一個單獨的靶標的抗體。或者，其可以為多特異性抗體。

在一個實施流程中，抗體為IgG抗體，例如IgG₁抗體、IgG₂抗體、IgG₃抗體或IgG₄抗體。

根據本發明的抗體特異性結合至靶標，由此將作為細胞毒性化合物的生物活性化合物導向生物靶標。如本文所使用的，“特異性結合”或“特異性結合至”或“結合至”等，表示抗體或其抗原結合片段與在生理條件下相對穩定的抗原形成絡合物。特異性結合可以由至少約1x10^-8M或更小的平衡解離常數(K_D)來表徵(例如，更小的K_D表示更緊的結合)。確定兩個分子是否特異性結合的方法在本領域中是熟知的，例如平衡透析、表面等離子體共振，等。如本文所描述的，抗體已經使用表面等離子體共振例如BIACORE^TM藉由它們特異性結合至靶標和/或靶標抗原進行表徵。

靶標一般地對應於在細胞表面表達的蛋白質，例如在腫瘤細胞表面表達的蛋白質。

在一個實施流程中，靶標為EphA2受體。EphA2受體為Ephrin受體，並且也稱為“EPH受體A2”或"上皮細胞受體蛋白-酪胺酸激酶"(參見例如，OMIM Entry *176946，可從omim.org/entry/176946萬維網網頁獲得，版本更新於2016年7月21日)。特異性結合至EphA2受體的抗體可以例如對應於在WO2008/010101或WO2011/039724中描述的一種抗體。

在另一實施流程中，靶標為CD19。CD19為造血系統的B淋巴細胞和小結樹突細胞特異性表達的細胞表面分子，並且也稱為“B-淋巴細胞抗原CD19”(參加例如OMIM Entry *107265，可從omim.org/entry/107265萬維網網頁獲得，版本最後更新於2015年5月11日)。特異性結合至CD19的抗體可以例如對應於Coltuximab，即Coltuximab Ravtansin的抗體部分。

抗體可以視情況地以修飾劑修飾，從而促進與前文描述的念珠藻素有效負載的連接。抗體尤其可以是單純系、多純系或多特異性的。其也可以是抗體片段。其也可以是鼠類抗體、人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在本發明實例中使用的抗體為hu2H11_R3574，針對EphA2受體的拮抗劑抗體。hu2H11_R3574的序列描述於WO2011/039724中(重鏈的SEQ ID NO：18和輕鏈的SEQ ID NO：16)。

接合物

接合物通常包含與抗體共價連接的約1至10個念珠藻素化合物(其為接枝程度或“藥物：抗體比例”或“DAR”)。該數目隨抗體的性質和念珠藻素化合物的性質及共軛方法中使用的操作條件(例如念珠藻素化合物相對於抗體的當量數、反應時間、溶劑的性質和任何共溶劑的性質)而變化。使抗體與念珠藻素化合物接觸，這得到包含以下物質的混合物：藉由不同的DAR而彼此各自區分的幾種接合物；視情況的未反應的抗體；和視情況的聚集物。因此，針對最終溶液而確定的DAR相應於平均DAR。DAR可以從接合物的SEC-HRMS光譜解卷積進行計算。DAR(HRMS)較佳大於0.5，更具體為1至10，且甚至更具體為2至7。

接合物可用作抗癌劑。由於抗體的存在，接合物對腫瘤細胞而非健康細胞具有高度的選擇性。這可在與其類似的環境中或直接在其中引導念珠藻素化合物(相關事項參見以下對單純系抗體接合物在治療癌症中的用途進行描述的公開出版物：“Antibody-drug conjugates for cancer therapy”Carter P.J.,et al.,Cancer J.2008,14,154-169；“Targeted cancer therapy：conferring specificity to cytotoxic drugs”Chari R.,Acc.Chem.Res.2008,41,98-107)。其可治療實體癌症或液體癌症。接合物可單獨使用或與至少一種其它抗癌劑聯用。

將接合物配製成經緩衝的水溶液形式，其濃度通常為1至10mg/ml。該溶液可按灌注形式本身來注射或可被重新稀釋以形成灌注溶液。

實例

下文的實例描述了根據本發明的一些化合物的製備。這些實例是非限制性的，並且僅用來說明本發明。

所使用的分析方法 高壓液相層析-質譜(LCMS) 方法A1

在Waters UPLC-SQD體系上得到光譜，以陽離子和/陰離子電噴霧模式(ES+/-)，使用ELSD和UV(210-400nm)探測。層析條件如下：柱：ACQUITY BEH C18-1.7μm-2.1 x 50mm；溶劑：A：H₂O(0.1%甲酸)，B：CH₃CN(0.1%甲酸)；柱溫度：50℃；流速：0.8mL/min；梯度(2.5min)：歷時1.8min從5至100%的B；2.4min：100%的B；2.45min：歷時0.05min從100至5%的B。

方法A2

在Waters XeVo-QTof體系上得到光譜，以陽離子電噴霧模式(ES+)，使用ELSD和UV(210-400nm)探測。層析條件如下：柱：ACQUITY BEH C18-1.7μm-2.1 x 100mm；溶劑：A：H₂O(0.1%甲酸)，B：CH₃CN(0.1%甲酸)；柱溫度：70℃；流速：0.55mL/min；梯度 (11min)：歷時8.3min從5至97%的B；8.6min：97%的B；9min：歷時0.7min從97至5%的B和2min期間5%的B。

方法A3

在Waters XeVo-QTof體系上得到光譜，以陽離子電噴霧模式(ES+)。層析條件如下：柱：ACQUITY BEH C18-1.7μm-2.1 x 100mm；溶劑：A：H₂O(0.1%甲酸)，B：CH₃CN(0.1%甲酸)；柱溫度：45℃；流速：0.6mL/min；梯度(5.3min)：0.3min期間5%的B；歷時3.7min從5至100%的B；4.6min：100%的B；5.3min 5%的B。

方法A4

在Waters UPLC-SQD體系上得到光譜，以陽離子和/陰離子電噴霧模式(ES+/-)，使用ELSD和UV(210-400nm)探測。層析條件如下：柱：ACQUITY BEH C18-1.7μm-2.1 x 50mm；溶劑：A：H₂O(0.1%甲酸)，B：CH₃CN(0.1%甲酸)；柱溫度：45℃；流速：0.8mL/min；梯度(10min)：歷時8.6min從5至100%的B；9.6min：100%的B；9.8min：5%的B。

方法A5

在Waters UPLC-SQD體系上得到光譜，以陽離子和/陰離子電噴霧模式(ES+/-)，使用ELSD和UV(210-400nm)探測。層析條件如下：柱：ACQUITY CSH C18-1.7μm-2.1 x 50mm；溶劑：A：H₂O(0.1%甲酸)，B：CH₃CN(0.1%甲酸)；柱溫度：40℃；流速：0.85mL/min；梯度(2.5min)：歷時1.8min從5至100%的B；2.4min：100%的B；2.45min：歷時0.05min從100至5%的B。

¹H核磁共振(NMR)

用Bruker Avance波譜儀(型號為DRX-300、DRX-400或DRX-500)得到¹H NMR譜。化學位移(δ)以ppm給出。

空間排阻層析-高解析度質譜(SEC-HRMS)

層析分析在Agilent HP1100設備和Waters BEH SEC 2001.7μm(2.1 x 150mm)柱上於30℃進行，以流速0.5mL/min和等度溶離(A)25mM甲酸銨+1%甲酸/(B)CH₃CN+0.1%甲酸70/30實施15分鐘。質譜在Waters QTOF-II機器上以陽離子模式的電噴霧離子化(ES+)進行。質譜以Waters MaxEnt1軟體進行解卷積。

分析性空間排阻層析(SEC)

在配有光電二極體矩陣檢測器和Tosoh Bioscience TSKgel G3000 SWXL 5μm(7.8×300mm)柱的Waters Alliance HPLC系統或Hitachi Lachrom系統上進行分析，流速為0.5mL/min且以含有0.2M的KCl、0.052M的KH₂PO₄、0.107M的K₂HPO₄和20體積%的異丙醇的pH 7緩衝液等度溶離30分鐘。

緩衝液

●緩衝液A(pH 6.5)：NaCl(50mM)，磷酸鉀(50mM),EDTA(2mM)

●緩衝液B(pH 6.5)：NaCl(140mM)，磷酸鉀和磷酸鈉(9.6mM)

●PBS(pH 7.4)：KH₂PO₄(1.06mM),NaCl(155.17mM),Na₂HPO₄-7H₂O(2.97mM)

●DPBS：KCl(2.67mM),KH₂PO₄(1.47mM),NaCl(136.9mM),Na₂HPO₄(8.10mM)，以HCl 5N(每1000mL的緩衝液1mL)調節至pH 6.5

用來製備抗體-藥物接合物(ADC)的一般方法

抗體在緩衝水溶液中的溶液包含緩衝液A和1N HEPES的96：4混合物，對其以過量的念珠藻素有效負載在DMA中的大致10mM的溶液進行處理，使得最終的抗體濃度為3mg/mL且DMA在緩衝水溶液中的百分比為20%。攪拌2小時後，混合物藉由SEC-HRMS分析以確定在單體抗體的種群上的DAR。如果DAR不充足，混合物以進一步過量(1至5當量)的念珠藻素在DMA中的溶液於室溫在攪拌下再處理2小時。混合物藉由凝膠過濾Superdex 200 pg基質(HiLoad 16/60或26/60脫鹽柱，GEHealthcare)(在含10至20%的NMP的緩衝水溶液pH 6.5(緩衝液B或DPBS)中預平衡)純化。含有單體共軛的抗體的各級分經收集並在Amicon Ultra-15(10k或50k Ultracel membrane,Millipore)濃縮至濃度為2至5mg/mL。然後在適當的緩衝液中進行緩衝液交換或稀釋以配製最終緩衝液中的接合物。在緩衝液交換的情況下，藉由凝膠過濾使用Sephadex^TM G25基質(NAP-5、NAP-10、NAP-25/PD-10或Hiprep 26/10脫鹽柱，GEHealthcare)(以最終緩衝水溶液預平衡，其組成和pH適合每種接合物)來實現。接合物最終藉由Steriflip®過濾裝置(0.22μm Durapore® PVDF膜，Millipore)過濾。最終的接合物藉由UV光譜測定法或SEC-HPLC分析來測量接合物濃度，藉由SEC-HPLC來確定單體純度並藉由SEC-HRMS來確定來自接合物的質譜的解卷積的DAR。

片段A的合成：(2E,5S,6R,7E)-8-(4-甲醯基苯基)-5-羥基-6-甲基辛-2,7-二烯酸第三丁基酯

化合物1：(2E,5S,6R)-5-羥基-7-((4-甲氧基苄基)氧基)-6-甲基庚-2-烯酸第三丁基酯

在氬氣下，向(2R,3S)-1-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]-2-甲基-5-己烯-3-醇或Sakurai醇(CAS號[203z926-55-0],100g,399.5mmol)在DCM(350mL)中的溶液添加丙烯酸第三丁基酯(354.7mL,2.435mol)和Grubbs催化劑(4.849g,2.435mol)。於室溫攪拌17h後，反應混合物在230g的二氧化矽上過濾並以庚烷/AcOEt(50/50,6 x 300mL)的混合物溶離。濃縮後，剩餘物藉由快速層析在1.2kg的矽膠(梯度溶離庚烷/EtOAc)上純化得到140.8g的棕色油狀物。油狀物溶解在無水DCM(550mL)中，添加10g的quadraPure^TM TU樹脂以除去過量的催化劑。混合物於35℃攪拌3h。過濾樹脂並以DCM洗滌，濾液經濃縮並真空乾燥得到135.75g的化合物1，為棕色油狀物(97%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.85(d,J=7.0Hz,3 H)；1.42(s,9 H)；1.72(m,1 H)；2.18(m,1 H)；2.30(m,1 H)；3.24(dd,J=7.0和9.3Hz,1 H)；3.46(dd,J=7.7和9.3Hz,1 H)；3.49(m,1 H)；3.73(s,3 H)；4.35(s,2 H)；4.65(d,J=5.8Hz,1 H)；5.76(td,J=1.5和15.6Hz,1 H)；6.83(td,J=7.4和15.6Hz,1 H)；6.90(d,J=8.8Hz,2 H)；7.23(d,J=8.8Hz,2 H).

化合物2：(2E,5S,6R)-5,7-二羥基-6-甲基庚-2-烯酸第三丁基酯

向化合物1在CH₃CN(910mL)中的溶液添加H₂O(90mL)，並且混合物於12℃冷卻，然後在25min內添加CAN(196.7g,358.9mmol)在H₂O(300mL)中的溶液。在室溫持續攪拌1h。添加額外的溶解在CH₃CN(70mL)和H₂O(30mL)的混合物中的CAN(18.83g,34.36mmol)並於室溫攪拌1h以完成反應。混合物以NaCl淬滅直到水層飽和，然後添加MTBE(400mL)。傾析後，水層以MTBE萃取(2 x 80mL)。合併的有機層以5% NaHCO₃/H₂O(3 x 200mL)、飽和鹽水(2 x 130mL)的3：1混合物洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮。水層以2N HCl酸化直到pH 4，然後以NaCl飽和並以MTBE(2 x 150mL)萃取。該第二有機層以5% NaHCO₃(60mL)、飽和鹽水(60mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，濃縮並與第一有機層合併得到棕色橙色油狀物。

混合物溶解於MeTHF(300mL)中，然後添加1,2-乙二硫醇(22mL,0.260mol)和p-TsOH(1.651g,8.590mmol)。於60℃攪拌5h後，將MTBE(200mL)添加至反應混合物中並且其以5% NaHCO₃(2 x 120mL)、飽和鹽水(120mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在520g的矽膠(梯度溶離DCM/MTBE)純化得到29.48g的化合物2，為黃色油狀物(75%)。

化合物3：(2E,5S,6R)-6-甲基-5,7-雙((三乙基甲矽烷基)氧基)庚-2-烯酸第三丁基酯

在氬氣下，向化合物2(39.38g,0.171mol)在無水DCM(500mL)中的溶液添加咪唑(51.540g,0.749mol)。黃色混合物於0℃冷卻，然後添加三乙基氯矽烷(63.99mL,0.374mol)並允許溶液升溫至室溫過夜。反應混合物以飽和NH₄Cl(400mL)、MTBE(300mL)和冰淬滅。pH以2M NaHSO₄調節為4，劇烈攪拌後分離各層。水層以MTBE萃取(200mL)。合併的有機層以半飽和NH₄Cl(2 x 250mL)、磷酸鹽緩衝液pH 7(150mL)、飽和鹽水(150mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在490g的矽膠(梯度溶離庚烷/Et₂O)上純化得到74.52g的化合物3，為淡黃色油狀物(95%)。

化合物4：(2E,5S,6S)-6-甲基-7-側氧基-5-((三乙基甲矽烷基)氧基)庚-2-烯酸第三丁基酯

在氬氣下，於-75℃在1h內向DMSO(102.400mL,1.427mol)在DCM(300mL)中的溶液滴加草醯氯(63mL,0.719mol)並持續攪拌15min，然後於-75℃添加化合物3在DCM(150mL)中的溶液，同時保持溫度低於-70℃。反應混合物升溫至-40℃並且持續攪拌2h。反應混合物再次於-75℃冷卻，然後在75min內添加DIEA(425mL,2.432mol)，同時保持溫度低於-65℃。反應混合物升溫至室溫，並且然後以MTBE(500mL)、冰、飽和NH₄Cl(200mL)淬滅，並以2M NaHSO₄達到pH 4。劇烈攪拌後分離各層。水層以MTBE(200mL)萃取。合併的有機層以NH₄Cl(3 x 300mL)、磷酸鹽緩衝液pH 7(300mL)、飽和鹽水(300mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在1.25kg的矽膠(梯度溶離庚烷/Et₂O)上純化得到51.74g的化合物4，為橙色油狀物(93%)。

化合物5：(2E,5S,6R,7E)-5-羥基-8-(4-(羥基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸第三丁基酯

在氬氣下，向溴化鏻(在WO2011/001052中描述的合成，147g,0.237mol)在無水THF(1.5L)中的混懸液於-50℃添加n-BuLi在己烷(90mL,0.225mol)中的2.5M溶液。允許溫度升溫至-40℃並且持續攪拌15min。加熱至室溫後，紅色混合物攪拌1h。反應介質於-70℃冷卻，然後添加化合物4(51.63g,126.6mmol)在THF(200mL)中的溶液，同時保持溫度低於-65℃。當添加完成後，允許反應混合物升溫至室溫，並且持續攪拌過夜。反應混合物經過濾以除去不溶物，不溶物以MTBE(500mL)洗滌。濾液於42℃經部分濃縮(1/3)，然後以冰、NH₄Cl(500mL)、MTBE(500mL)淬滅並以2M NaHSO₄達到pH 4。分離各層，並且水層以MTBE(200mL)萃取。合併的有機層以半飽和NH₄Cl(250mL)、磷酸鹽緩衝液pH 7(250mL)、飽和鹽水(250mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並半真空濃縮直到250mbar。懸浮液以50：50庚烷/MTBE(600mL)(以冰浴冷卻)稀釋，過濾並以50：50庚烷/MTBE洗滌。濾液經真空濃縮得到100.05g，為棕色油狀物。

粗化合物溶解於無水THF(320mL)，然後添加TBAF三水合物(90g,282.40mmol)並且反應混合物攪拌3h。真空濃縮後，粗產物以10：1 MTBE/THF(770mL)稀釋，以半飽和NH₄Cl(3 x 200mL)、1M NaHSO₄(200mL)、磷酸鹽緩衝液pH 7(200mL)、飽和鹽水(200mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮。水層以MTBE萃取。傾析後，有機層以磷酸鹽緩衝液pH 7(30mL)、飽和鹽水(30mL)洗滌，經MgSO₄乾燥並過濾。濃縮後，合併的有機層藉由矽膠層析在1.25kg的矽膠(梯度溶離庚烷/Et₂O)上純化得到36.91g的化合物5，為棕紅的油狀物(88%)。

片段A：(2E,5S,6R,7E)-8-(4-甲醯基苯基)-5-羥基-6-甲基辛-2,7-二烯酸第三丁基酯

在氬氣下，於10℃向化合物5(30.3g,91.7mmol)在無水DCM(600mL)中的溶液添加氧化錳(175g,3.013mol)並且反應混合物於35℃攪拌4h。氧化劑經矽藻土塞過濾並以溫的丙酮洗滌。濾液經濃縮得到30.43g的紅橙色油狀物。

在氬氣下，油狀物以苯(800mL)稀釋並在AIBN(880mg,4.58mmol)和苯硫酚(2.81mL,27.51mmol)的存在下回流1h。添加額外的AIBN(530mg,0.03當量)和苯硫酚(1.03mL,10.087mmol)並再持續回流1h.添加額外的AIBN(530mg,0.03當量)和苯硫酚(1.03mL,10.087mmol)並持續回流3h。添加額外的AIBN(353mg,1.834mmol)和苯硫酚(468μL,4.58mmol)並且持續回流1h。轉化率E/Z為92/8，添加352.6mg的AIBN並持續回流1h。反應混合物冷卻至室溫並真空濃縮得到28.03g的片段A，為橙色油狀物 (92%)，其中E/Z比率大於98/2。

片段B的合成：(R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氧-4-甲氧基-苯基)丙酸

向(R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酸甲基酯(CAS號[162465-44-3],30g,87.26mmol)在THF(225mL)中的溶液添加H₂O(30mL)和LiOH一水合物(4.4g,104.85mmol)。反應介質於室溫攪拌2h。此後，反應介質以H₂O(200mL)稀釋，然後以5N HCl(20mL)酸化在pH 2並以EtOAc(2 x 250mL)萃取。合併的有機相以H₂O(500mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮，以Et₂O稀釋並真空濃縮得到26.9g的片段B，為白色固體(94%)。

RMN ¹H(300MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：1.21至1.37(m,9 H)；2.74(dd,J=11.0和14.3Hz,1 H)；2.96(dd,J=5.0和14.3Hz,1 H)；3.81(s,3 H)；4.04(m,1 H)；6.99至7.09(m,2 H)；7.18(dd,J=2.3和8.7Hz,1 H)；7.29(d,J=2.3Hz,1 H)；12.60(寬峰m,1 H)。

片段C1的合成：3-胺基-2,2-二甲基丙酸甲基酯鹽酸鹽

化合物6：3-((第三-丁氧基羰基)胺基)-2,2-二甲基丙酸甲基酯

在氬氣下，向3-([(第三-丁氧基)羰基]胺基)-2,2-二甲基丙酸(CAS號[180181-02-6],250mg,1.09mmol)在DCM(6mL)和MeOH(2mL)中的溶液於0℃滴加(三甲基甲矽烷基)重氮甲烷(819.86μL,1.64mmol)直到恒定為黃色。然後添加AcOH直到完全脫色。反應混合物經真空濃縮，然後以H₂O稀釋並以DCM萃取兩次。合併的有機相以飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到260mg的化合物6，為無色油狀物(定量)。

片段C1：3-胺基-2,2-二甲基丙酸甲基酯鹽酸鹽

向化合物6(260mg,1.12mmol)在1,4-二

烷(10mL)中的溶液添加在1,4-二

烷中的4N HCl(2.81mL,11.24mmol)。反應混合物於室溫攪拌過夜，然後真空濃縮得到200mg的片段C1(定量)。

片段C2的合成：3-胺基-2,2-二甲基丁酸甲基酯鹽酸鹽

化合物7：3-((第三-丁氧基羰基)胺基)丁酸

向DL-3-胺基丁酸(CAS號[541-48-02],18.72g,176.09mmol)在H₂O(96mL)中的溶液添加在H₂O(76mL)中的二碳酸二第三丁基酯(39.62g,176.09mmol)和NaOH(8.03g,200.74mmol)，然後添加第三丁基醇(132mL)。反應混合物於室溫攪拌過夜。此後，反應介質經真空濃縮，然後以EtOAc(200mL)稀釋並以稀HCl在pH 3酸化。靜置後，水相以EtOAc(200mL)萃取。合併的有機相經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到34.5g的化合物7，為無色油狀物(82%)。

RMN ¹H(300MHz,δ in ppm,CDCl₃-d1)：1.25(d,J=7.0Hz,3 H)；1.45(s,9 H)；2.55(m,2 H)；4.04(m,1 H)；4.93(寬峰m,1 H)；8,41(寬峰m,1 H).

化合物8：3-((第三-丁氧基羰基)胺基)丁酸甲基酯

在氬氣下，化合物7(10g,49.20mmol)在甲苯(350mL)和MeOH(100mL)中的溶液於+5℃攪拌。在+5℃和+10℃之間，滴加(三甲基甲矽烷基)重氮甲烷(73.81mL,147.61mmol)。反應混合物攪拌3h，然後真空蒸發得到10.8g的化合物8，為淡黃色油狀物(定量)。

RMN ¹H(300MHz,δ in ppm,CDCl₃-d1)：1.20(d,J=7.0Hz,3 H)；1.45(s,9 H)；2.50(m,2 H)；3.69(s,3 H)；4.03(m,1 H)；4.90(寬峰m,1 H).

化合物9：3-((第三-丁氧基羰基)胺基)-2-甲基丁酸甲基酯

在氬氣下，於-70℃向LDA(2M在THF中，25.32mL,50.63mmol)在THF(48mL)中的溶液滴加化合物8(5g,23.01mmol)在THF(62mL)中的溶液。反應混合物於-75℃攪拌，然後於-70℃滴加碘甲烷(5.79mL,92.05mmol)1h。反應混合物於-75℃攪拌3h，然後於室溫攪拌過夜。此後，添加20% NH₄Cl水溶液(100mL)和Et₂O(125mL)。靜置後，有機相以飽和NaHCO₃(80mL)洗滌，然後以飽和NaCl(80mL)洗滌。合併的水相以Et₂O(125mL)萃取。合併的有機相經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到5.49g的粗制油狀物。以真空乾燥後，戊烷結晶(15mL)得到2.65g的化合物9。該戊烷溶液經真空濃縮並藉由快速層析在100g的矽膠(梯度溶離庚烷/Et₂O)上純化得到1.98g的化合物9。兩個批次經收集(87%)並以其本身用於後續步驟。

化合物10：3-((第三-丁氧基羰基)胺基)-2-,2-二甲基丁酸甲基酯

在氬氣下，THF(46mL)於-72℃冷卻，然後添加LDA(2M在THF中，22mL,44.0mmol)並於-72℃(+/-2℃)滴加化合物9(4.60g,19.89mmol)在THF(64mL)中的溶液。反應混合物於-75℃攪拌1h15，然後於-72℃(+/-2℃)滴加碘甲烷(5mL,79.55mmol)。反應介質於-75℃攪拌3h，然後於室溫攪拌過夜。此後，添加20% NH₄Cl水溶液(50mL)和Et₂O(80mL)。靜置後，有機相以飽和NaHCO₃(50mL)和飽和鹽水(50mL)洗滌。合併的水相經Et₂O(80mL)萃取。合併的有機相經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到6.5g的粗制油狀物，其藉由快速層析在200g的矽膠(梯度溶離庚烷/iPr₂O)上純化得到1.9g的化合物10，為無色油狀物(39%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.92(d,J=7.1Hz,3 H)；1.02 (s,3H)；1.04(s,3 H)；1.48(s,9 H)；3.58(s,3 H)；3.88(m,1 H)；6.62(寬峰d,J=10.5Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=146,m/z=246[M+H]⁺；t_R=1.2min.

片段C2：3-胺基-2,2-二甲基丁酸甲基酯鹽酸鹽

在圓底燒瓶中，在磁力攪拌下，引入化合物10(0.3g,1.22mmol)，接著引入在1,4-二

烷(5mL)中的1,4-二

烷(5mL)和4N HCl。反應混合物於室溫攪拌過夜，然後真空濃縮。所得粗固體沉澱在iPr₂O(15mL)中，過濾並乾燥得到210mg的片段C2，為白色固體(95%)。

LCMS(A1)：ES m/z=146[M+H]⁺；t_R=0.8min.

片段C3的合成：2-(1-胺基環丙基)-2,2-二甲基丙酸乙基酯

在氬氣下，向2-氰基-2-甲基丙酸乙基酯(CAS號[1572-98-1],2g,13.88mmol)在Et₂O(48mL)中的溶液添加異丙醇鈦(IV)(4.63g,15.97mmol)。反應混合物於室溫攪拌10min，然後於-5℃冷卻。於-5℃-0℃在25min中內滴加乙基溴化鎂3M在Et₂O(9.72mL,29.16mmol)中的溶液，然後不使用冷卻浴攪拌反應混合物40min。此時，TLC顯示然後反應完成。反應介質於0℃冷卻並於0℃滴加三氟化硼二乙基乙醚合物(3M在Et₂O中，3.6mL,29.16mmol)。反應混合物不使用冷卻浴攪拌30min。此後，於0℃添加1N HCl直到pH 1-2(8mL)，然後添加2N NaOH直到pH 8(28mL)，反應混合物以EtOAc萃取(3 x 150mL)。合併的有機相經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到2.4g的粗制黃色油狀物，其藉由快速層析在70g的矽膠上(梯度溶離DCM/MeOH)純化得到915mg的片段C3，為淡黃色油狀物(39%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,CDC;₃-d1)：0.52(m,2 H)；0.70(m,2 H)；1.11(s,6 H)；1.27(t,J=7.2Hz,3 H)；1.64(寬峰s,2 H)；4.18(q,J=7.2Hz, 2 H).

片段C4的合成：3-胺基-2-(羥基甲基)-2-甲基丙酸甲基酯鹽酸鹽

化合物11：3-((第三-丁氧基羰基)胺基)-2-甲基丙酸

向DL-3-胺基異丁酸(CAS號[10569-72-9],5g,47.52mmol)在2N NaOH(24.7mL)中的溶液滴加Boc₂O(11.73g,53.22mmol)在THF(75mL)中的溶液，同時以冷水浴保持反應介質的溫度低於30℃。反應介質於室溫攪拌18h，然後真空濃縮，在H₂O(75mL)中稀釋並且以MTBE(3 x 150mL)洗滌。水相藉由添加100g/L(150mL的檸檬酸酸化至pH 3，並以EtOAc(3 x 150mL)萃取。合併的有機相以H₂O洗滌(3 x 45mL)，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到9.4g的化合物11，為無色油狀物(97%).

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：1.01(d,J=7.1Hz,3H)；1.38(s,9H)；2.48(m,1H)；2.91(dt,J=6.1,6.5和13.5Hz,1H)；3.15(ddd,J=6.1,7.4和13.5Hz,1H)；6.80(t,J=6.1Hz,1H)；12.15(寬峰s,1H).

化合物12：3-((第三-丁氧基羰基)胺基)-2-甲基丙酸甲基酯

向化合物11(9.4g,46.25mmol)在丙酮(300mL)中的溶液添加K₂CO₃(16.14g,115.63mmol)和CH₃I(13.26g,92.5mmol)。反應介質，黃色的懸浮液，於室溫攪拌20h，然後經Clarcel過濾。由此得到的濾餅以丙酮洗滌，濾液經真空濃縮，以DCM(100mL)稀釋，經Clarcel過濾，由此得到的濾餅以DCM洗滌且濾液經真空濃縮得到9.4g的化合物12，為黃色液體(93%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：1.01(d,J=7.1Hz,3H)；1.37(s,9H)；2.54(m,1H)；2.91(dt,J=6.2和13.5Hz,1H)；3.15(ddd,J=6.2,6.9和13.5Hz,1H)；3.59(s,3H)；6.90(t,J=6.2Hz,1H).

化合物13：3-((第三-丁氧基羰基)胺基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2-甲基丙酸甲基酯

向DIEA(3.2mL,22.45mmol)在THF(10mL)中的冷卻在-75℃的溶液滴加1.6M n-BuLi在THF(14mL,22.4mmol)中的溶液。反應介質於-75℃攪拌20min；然後於-75℃滴加化合物12(2g,9.21mmol)在THF(16mL)中的溶液，並且反應混合物於-75℃攪拌10min。1-((氯甲氧基)甲基)-4-甲氧基苯(1.72g,9.21mmol)在THF(16mL)中的溶液然後快速添加至反應混合物並且於-25℃持續攪拌4h。反應介質以DCM(100mL)稀釋，然後添加100g/L的檸檬酸溶液(50mL)同時保持溫度低於5℃。反應介質於室溫RT攪拌15min。有機相以100g/L的檸檬酸溶液(2 x 50mL)、H₂O(3 x 50mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到4.08g的黃橙色油狀物，其藉由快速層析在150g的矽膠(梯度溶離庚烷/EtOAc)上純化，得到2.05g的化合物13，為無色油狀物(60%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：1.03(s,3H)；1.37(s,9H)；3.14(d,J=6.8Hz,2H)；3.31(d,J=9.1Hz,1H)；3.48(d,J=9.1Hz,1H)；3.58(s,3H)；3.73(s,3H)；4.38(s,2H)；6.76(t,J=7.1Hz,1H)；6.90(d,J=8.9Hz,2H)；7.20(m,2H).

片段C4：3-胺基-2-(羥基甲基)-2-甲基丙酸甲基酯鹽酸鹽

化合物13(1.5g,4.08mmol)以在二

烷(24mL)中的4M HCl溶液於室溫處理1h。反應介質然後真空濃縮並在甲苯的存在下共蒸發得到794mg的片段C4，為粘稠油狀物(定量)。

合成AD1：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-胺基-4-甲基戊醯基)氧基)-8-(4-(疊氮基 甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸第三丁基酯

化合物14：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-甲基戊醯基)氧基)-8-(4-甲醯基苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸第三丁基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，在磁力攪拌下，引入Fmoc-Leu-OH(4.9g,13.86mmol)，接著引入在DCM(100mL)和DIEA(6.6mL,38.13mmol)中的片段A(3.5g,10.59mmol)。然後添加MNBA(5g,14.52mmol)和DMAP(620mg,5.07mmol)，並且反應混合物於室溫攪拌過夜。此後，反應介質以H₂O(100mL)和飽和鹽水(100mL)洗滌。有機相經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到9.1g的粗的橙色油狀物，其藉由快速層析在400g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上純化得到5g的化合物14，為淡黃色油狀物(71%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.77(d,J=6.8Hz,6 H)；1.05(d,J=7.0Hz,3 H)；1.33至1.64(m,4 H)；1.38(s,9 H)；2.39至2.63(部分遮蔽的m,2 H)；4.01(m,1 H)；4.13至4.31(m,3 H)；4.95(m,1 H)；5.81(d,J=15.9Hz,1 H)；6.37(dd,J=8.8和16.2Hz,1 H)；6.52(d,J=16.2Hz,1 H)；6.70(td,J=7.3和15.9Hz,1 H)；7.29(t,J=7.9Hz,2 H)；7.40(t,J=7.9Hz,2 H)；7.56(d,J=8.4Hz,2 H)；7.67(dd,J=7.9Hz,2 H)；7.74至7.82(m,3 H)； 7.87(d,J=7.9Hz,2 H)；9.93(s,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=666[M+H]⁺,m/z=689[M+Na]⁺；t_R=1.92min.

化合物15：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-甲基戊醯基)氧基)-8-(4-(羥基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸第三丁基酯

在氬氣下，向化合物14(5g,7.51mmol)在MeTHF(60mL)中的溶液分份添加三甲氧基硼氫化鈉(1.2g,8.91mmol)。反應介質於室溫攪拌5h。此後，添加飽和NH₄Cl(100mL)和丙酮(20mL)。反應介質於室溫攪拌1h。靜置後，有機相以H₂O洗滌，然後以飽和鹽水(50mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到5.3g的粗黃色油狀物，其藉由快速層析在300g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上純化得到3.15g的化合物15，為白色半固體(63%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.80(m,6 H)；1.02(d,J=7.0Hz,3 H)；1.35至1.66(m,4 H)；1.38(s,9 H)；2.35至2.56(部分遮蔽的m,2 H)；4.02(m,1 H)；4.15至4.32(m,3 H)；4.43(d,J=5.5Hz,2 H)；4.92(m,1 H)；5.12(t,J=5.5Hz,1 H)；5.80(d,J=15.9Hz,1 H)；6.10(dd,J=8.8 et 16.2Hz,1 H)；6.39(d,J=16.2Hz,1 H)；6.69(m,1 H)；7.20(d,J=8.4Hz,2 H)；7.28至7.33(m,4 H)；7.41(t,J=7.9Hz,2 H)；7.69(t,J=7.9Hz,2 H)；7.80(d,J=8.2Hz,1 H)；7.88(d,J=7.9Hz,2 H).LCMS(A1)：ES m/z=668[M+H]⁺；m/z=690[M+Na]⁺；m/z=712[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.84min.

化合物16：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-甲基戊醯基)氧基)-8-(4-(疊氮基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸第三丁基酯

在氬氣下，化合物15(3.15g,4.72mmol)和DCM(50mL)引入圓底燒瓶中。於0℃，添加TEA(987μL,7.08mmol)，接著添加甲磺醯氯(438μL,5.66mmol)，反應介質於0℃攪拌1h並於室溫攪拌13h。此後，添加DCM(50mL)和水(50mL)。靜置後，有機相以飽和鹽水(3 x 25mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥並真空濃縮。在氬氣下，由此得到的粗產物溶解於DMF(50mL)中並添加疊氮化鈉(644mg,9.91mmol)。反應介質於室溫攪拌過夜。此後，DMF經真空濃縮並添加AcOEt。所得混合物以0.1N HCl(25mL)、飽和NaHCO₃(25mL)和飽和鹽水(25mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到3.3g的粗產物，其藉由快速層析在200g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上純化得到1.8g的化合物16，為無色膠狀物(55%)和740mg的化合物AD1(33%)。

LCMS(A2)：ES m/z=715[M+Na]⁺；t^R=8.95min.

化合物AD1：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-胺基-4-甲基戊醯基)氧基)-8-(4-(疊氮基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸第三丁基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，在磁力攪拌下，引入化合物16(1.8g,2.6mmol)和DCM(50mL)，接著引入哌啶(1.6mL,16.2mmol)。反應介質於室溫攪拌過夜。此後，其以1N HCl洗滌，然後以飽和NaHCO₃、飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到2g的粗產物，其藉由快速層析在130g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上純化得到1.48g的化合物AD1，為淡黃色油狀物(定量)。

LCMS(A3)：ES m/z=471[M+H]⁺；t_R=2.65min.

合成AD2：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-胺基-4,4-二甲基戊醯基)氧基)-8-(4-(羥基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸第三丁基酯鹽酸鹽

化合物17：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4,4-二甲基戊醯基)氧基)-8-(4-甲醯基苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸第三丁基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向化合物A(1.633g,4.94mmol)在DCM(60mL)中的溶液添加L-Fmoc-第三-Leu-OH(1.82g,4.94mmol)、DIEA(2.57mL,14.83mmol)、MNBA(1.70g,4.94mmol)和DMAP(241.51mg,1.98mmol)。於室溫攪拌2h，反應介質以H₂O(50mL)稀釋並以DCM萃取兩次。合併的有機相以檸檬酸(2 x 50mL)、飽和NaHCO₃(50mL)和飽和鹽水(50mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到3.24g的粗化合物17，其直接用於後續還原中(96%)。

化合物18：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4,4-二甲基戊醯基)氧基)-8-(4-(羥基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸第三丁基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向化合物17(3.24g,4.77mmol)在MeTHF(60mL)中的溶液中於0℃添加三甲氧基硼氫化鈉(670.56mg,5.24mmol)。於室溫攪拌1h後，添加額外的三甲氧基硼氫化鈉(304mg,2.38mmol)並攪拌2h。然後反應介質於0℃冷卻，以丙酮(18mL)和飽和NH₄Cl(36mL)稀釋並以AcOEt萃取。合併的有機相以飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在100g的矽膠(梯度庚烷/AcOEt)上純化得到2.61g的化合物18，為無色無定形固體(80%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.80(s,9 H)；1.02(d,J=7.0Hz,3 H)；1.35至1.60(m,4 H)；1.38(s,9 H)；2.37至2.58(部分遮蔽的m,2 H)；4.04(m,1 H)；4.16至4.33(m,3 H)；4.45(d,J=5.7Hz,2 H)；4.91(m,1 H)；5.12(t,J=5.7Hz,1 H)；5.80(d,J=16.0Hz,1 H)；6.10(dd,J=8.8和16.2Hz,1 H)；6.39(d,J=16.2Hz,1 H)；6.69(m,1 H)；7.21(d,J=8.4Hz,2 H)；7.25至7.33(m,4 H)；7.40(t,J=7.9Hz,2 H)；7.68(t,J=7.9Hz,2 H)；7.78(d,J=8.3Hz,1 H)；7.88(d,J=7.9Hz,2 H).LCMS(A1)：ES m/z=608；m/z =682[M+H]⁺；m/z=726[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.85min.

化合物AD2：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-胺基-4,4-二甲基戊醯基)氧基)-8-(4-(羥基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸第三丁基酯鹽酸鹽

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向化合物18(2.61g,3.83mmol)在DCM(40mL)中的溶液添加哌啶(7.60mL,76.56mmol)並且反應介質於室溫攪拌1h。然後其經濃縮並以AcOEt萃取。合併的有機層以1N HCl,H₂O和飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮。殘餘物以iPr₂O(50mL)稀釋並於室溫攪拌40h。粗產物經過濾，以iPr₂O洗滌並於40°真空乾燥3h得到1.706g的化合物AD2，為無色無定形固體(90%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.88(s,9 H)；1.10(d,J=7.0Hz,3 H)；1.39至1.49(m,1 H)；1.42(s,9 H)；1.75(dd,J=6.1和15.1Hz,1 H)；2.47至2.64(部分遮蔽的m,2 H)；3.92(t,J=5.5Hz,1 H)；4.47(d,J=5.7Hz,2 H)；5.02(m,1 H)；5.15(t,J=5.7Hz,1 H)；5.90(d,J=15.9Hz,1 H)；6.15(dd,J=8.3和16.1Hz,1 H)；6.44(d,J=16.1Hz,1 H)；6.77(td,J=7.3和15.9Hz,1 H)；7.26(d,J=8.4Hz,2 H)；7.34(d,J=8.4Hz,2 H)；8.10(寬峰m,3 H).LCMS(A1)：ES m/z=460[M+H]⁺；t_R=0.95min.

合成AD3：(S)-2-胺基-4,4-二甲基戊酸(2R,3S)-1-((4-甲氧基苄基)氧基)-2-甲基己-5-烯-3-基酯

化合物19：(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4,4-二甲基戊酸(2R,3S)-1-((4-甲氧基苄基)氧基)-2-甲基己-5-烯-3-基酯

向Sakurai醇(1.02g,4.08mmol)和(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4,4-二甲基戊酸(1.5g,4.08mmol)在THF(15mL)中的溶液添加2,4,6-三氯苄醯氯(1.02g,4.08mmol)，滴加TEA(1.14mL,8.16mmol)和DMAP(126.0mg,1.02mmol)。反應介質於室溫攪拌5h，然後使用冰浴冷卻，然後添加1N HCl(60mL)同時保持溫度低於10℃。所得介質於室溫攪拌15min，並以EtOAc(3 x 50mL)萃取。合併的有機相以飽和NaHCO₃(15mL)，飽和鹽水(3 x 15mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由三次連續的快速層析在矽膠柱(150g，梯度溶離庚烷/EtOAc；150g和20g，梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到1.78g的化合物19，為無色油狀物(72%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.85(d,J=7.1Hz,3H)；0.89(s,9H)；1.51(dd,J=2.8和14.3Hz,1H)；1.61(dd,J=9.0和14.3Hz,1H)；1.95(m,1H)；2.21(m,1H)；2.31(m,1H)；3.20(dd,J=6.5和9.6Hz,1H)；3.35(m,1H)；3.73(s,3H)；4.04(m,1H)；4.18至4.34(m,5H)；4.83(m,1H)；5.00(dq,J=2.1和10.3Hz,1H)；5.05(dq,J=2.1和7.3Hz,1H)；5.70(m,1H)；6.87(d,J=8.7Hz,2H)；7.17(d,J=8.7Hz,2H)；7.30(m,2H)；7.41(t,J=7.8Hz,2H)；7.70(d,J=7.8Hz,2H)；7.75(d,J=8.3Hz,1H)；7.90(d,J=7.8Hz,2H).LCMS(A5)：ES m/z=600[M+H]⁺；m/z=617[M+H+NH₃]⁺；m/z=644[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.86min.

化合物AD3：(S)-2-胺基-4,4-二甲基戊酸(2R,3S)-1-((4-甲氧基苄基)氧基)-2-甲基己-5-烯-3-基酯

向化合物19(1.78g,2.98mmol)在DCM(63mL)中的溶液滴加哌啶(1.77mL,17.9mmol)。反應介質於室溫攪拌4h，以DCM(150mL)稀釋，以1N HCl(2 x 20mL)，飽和NaHCO₃(20mL)，飽和鹽水(3 x 20mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在50g的矽膠(梯度溶離庚烷/EtOAc)上純化得到644mg的化合物AD3，為無色油狀物(57%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.88(s,9H)；0.89(d,J=7.1Hz, 3H)；1.21(dd,J=6.9和13.9Hz,1H)；1.56(dd,J=5.0和13.9Hz,1H)；1.66(寬峰s,2H)；2.00(m,1H)；2.24(m,1H)；2.33(m,1H)；3.26(m,2H)；3.38(dd,J=5.5和9.4Hz,1H)；3.74(s,3H)；4.36(s,2H)；4.84(m,1H)；5.00至5.10(m,2H)；5.72(m,1H)；6.89(d,J=8.8Hz,2H)；7.22(d,J=8.8Hz,2H).LCMS(A5)：ES m/z=378[M+H]⁺；t_R=0.88min.

合成BC1：3-((R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)-2,2-二甲基丙酸

化合物20：3-((R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)-2,2-二甲基丙酸甲基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，引入片段C1(981.45mg,4.00mmol)和DCM(50mL)，接著引入DIEA(1.84mL,10.92mmol)，片段B(1.2g,3.64mmol),HOBt(563.40mg,4.00mmol)和EDC(1.45mL,8.01mmol)。反應介質於室溫攪拌過夜。此後，反應介質以H₂O(30mL)稀釋並且以DCM萃取兩次。合併的有機相以飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到2.5g的粗制油狀物，其藉由快速層析在110g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上純化得到1.06g的化合物20，為白色蛋白霜狀物(meringue)(66%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：1.06(s,3 H)；1.07(s,3 H)；1.30(s,9 H)；2.65(dd,J=11.6和13.9Hz,1 H)；2.82(dd,J=4.0和13.9Hz,1 H)；3.18(dd,J=6.1和13.4Hz,1 H)；3.29(部分遮蔽的m,1 H)；3.60(s,3 H)；3.81(s,3 H)；4.11(m,1 H)；6.90(d,J=8.7Hz,1 H)；7.04(d,J=8.6Hz, 1 H)；7.19(dd,J=2.3和8.6Hz,1 H)；7.33(寬峰s,1 H)；7.75(large t,J=6.1Hz,1 H).

化合物BC1：3-((R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)-2,2-二甲基丙酸

在氬氣下，在圓底燒瓶中，引入化合物20(1.06g,2.39mmol)和THF(25mL)，接著引入LiOH(70.18mg,2.87mmol)和H₂O(1mL)。反應介質攪拌數小時，然後添加70mg的LiOH並於室溫攪拌過夜。此後，添加Amberlit樹脂直到pH 4，過濾然後以THF洗滌並真空濃縮得到1g的化合物BC1，為白色固體(97%)。

合成BC2：3-((R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)-2,2-二甲基丁酸

化合物21：3-((R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)-2,2-二甲基丁酸甲基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，引入片段B(1.02g,2.78mmol)和DCM(25mL)，接著引入EDC(592mg,3.03mmol)和HOBt(478mg,3.03mmol)。反應介質攪拌15min，然後添加片段C2(0.5g,2.75mmol)和DIEA(1.7mL,9.73mmol)。反應介質於室溫攪拌過夜。此後，反應介質經真空濃縮，然後以AcOEt稀釋。有機層以飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到1.45g的粗制油狀物，其藉由矽膠層析在100g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上純化得到845mg的化合物21，為白色泡沫(67%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：非對映異構體混合物50：50；0.87(d,J=6.8Hz,1.5 H)；0.97(d,J=6.8Hz,1.5 H)；1.01(s,1.5 H)；1.03(s,1.5 H)；1.07(s,3 H)；1.31(s,9 H)；2.58至2.87(m,2 H)；3.59(s,1.5 H)；3,60(s,1.5 H)；3.81(s,3 H)；3.99至4.20(m,2 H)；6.90(d,J=9.0Hz,0.5 H)；6.97(d,J=9.0Hz,0.5 H)；7.05(寬峰d,J=8.6Hz,1 H)；7.19(分裂dd,J=2.4和8.6Hz,1 H)；7.32(d,J=2.4Hz,0.5 H)；7.34(d,J=2.4Hz,0.5 H)；7.54(d,J=10.1Hz,0.5 H)；7.62(d,J=10.1Hz,0.5 H).LCMS(A3)：非對映異構體混合物50：50；ES m/z=457[M+H]⁺；m/z=479[M+Na]⁺；t_R=3.19-3.2min.

化合物21立體異構體1和2：3-((R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)-2,2-二甲基丁酸甲基酯立體異構體1和2

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向片段B(1.17g,3.55mmol)在DCM(30mL)中的溶液添加EDC(741.75mg,3.87mmol),HOBt(592.57mg,3.87mmol)。於室溫攪拌15min後，添加片段C2(639mg,3.52mmol)和DIEA(2.17mL,12.31mmol)。反應介質攪拌4h，然後濃縮並以AcOEt(100mL)稀釋。有機層以H₂O(2 x 10mL)和飽和鹽水(2 x 10mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮。粗產物藉由快速層析在50g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上純化得到1.306g的非對映異構體的混合物(81%)，其藉由兩次連續快速層析分離，第一次100g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上得到376mg的化合物21立體異構體1(23%)，第二次在70g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上得到181mg的化合物21立體異構體1(11%),279mg的化合物21立體異構體2(17%)和476mg的非對映異構體的混合物。

化合物21立體異構體1

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.85(d,J=6.8Hz,3 H)；1.07(s,6 H)；1.31(s,9 H)；2.57(m,1H)；2.80(dd,J=5.2和13.8Hz,1 H)；3.60(s,3 H)；3.81(s,3 H)；4.05(m,1 H)；4.16(m,1 H)；6.99(d,J=8.7Hz,1 H)；7.05(d,J=8.6Hz,1 H)；7.20(dd,J=2.0和8.6Hz,1 H)；7.34(d,J=2.0Hz,1 H)；7.57(d,J=10.1Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=381；m/z=401；m/z=455[M-H]^-；m/z=457[M+H]⁺；t_R=1.29min.

化合物21立體異構體2

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.95(d,J=6.8Hz,3 H)；1.00(s,3 H)；1.03(s,3 H)；1.31(s,9 H)；2.55(m,1H)；2.80(dd,J=5.0和14.3Hz,1 H)；3.59(s,3 H)；3,81(s,3 H)；4.09至4.22(m,2 H)；6.92(d,J=8,8Hz,1 H)；7.05(d,J=8.6Hz,1 H)；7.20(dd,J=2.0和8.6Hz,1 H)；7.34(d,J=2.0Hz,1 H)；7.64(d,J=10.1Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=381；m/z=401；m/z=455[M-H]^-；m/z=457[M+H]⁺；t_R=1.29min.

化合物BC2：3-((R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)-2,2-二甲基丁酸

化合物21(0.845g,1.85mmol)和MeOH(20mL)引入在圓底燒瓶中，接著引入1.8mL的10M NaOH。溶液經攪拌並於50℃加熱過夜。反應介質真空蒸發，然後以H₂O(20mL)稀釋並以5N HCl中和。溶液AcOEt萃取兩次。合併的有機層以飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到800mg的化合物BC2，為白色泡沫狀物(97%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：非對映異構體混合物50：50；0.91(d,J=6.8Hz,1.5 H)；0.97(d,J=6.8Hz,1.5 H)；1.00(s,3 H)；1.03(s,1,5 H)；1.07(s,1.5 H)；1.31(s,9 H)；2.57(m,1 H)；2.83(m,1 H)；3.81(s,3 H)；4.01至4.16(m,2 H)；6.90(d,J=9.0Hz,0.5 H)；6.95(d,J=9.0Hz,0.5 H)；7.03(d,J=8.6Hz,1 H)；7.20(寬峰，J=8.6Hz,1 H)；7.31(寬峰s,1 H)；7.49 (d,J=10.1Hz,0.5 H)；7.54(d,J=10.1Hz,0.5 H)；11.94(寬峰m,1 H).LCMS(A1)：非對映異構體混合物50：50；ES m/z=387；m/z=443[M+H]⁺；t_R=1.20-1.21min.

化合物BC2立體異構體1：3-((R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙醯胺基)-2,2-二甲基丁酸立體異構體1

化合物21立體異構體1(0.325g,1.85mmol)和MeOH(8mL)引入在圓底燒瓶中，接著引入0.692mL的10M NaOH。黃色溶液於50℃攪拌並加熱過夜。反應介質真空蒸發然後H₂O(20mL)稀釋並且以AcOEt(3 x 5mL)萃取。水層以5N HCl酸化並以AcOEt(3 x 30mL)萃取。合併的有機相以飽和鹽水洗滌(5mL)，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到303mg的化合物BC2立體異構體1，為白色泡沫(96%)，其直接用於後續反應。

化合物BC2立體異構體2：3-((R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙醯胺基)-2.2-二甲基丁酸立體異構體2

化合物21立體異構體2(1.094g,2.39mmol)THF(5mL)和H₂O(5mL)引入在圓底燒瓶中，接著引入LiOH(301mg,7.18mmol)。溶液於室溫攪拌44h。反應不完全，添加LiOH(301mg)。混合物攪拌48h，然後添加在THF(10mL)和H₂O(5mL)中的301mg的LiOH，並且反應介質於60℃攪拌40h。反應介質真空蒸發。添加1M檸檬酸直到pH 2，並且混合物以AcOEt萃取(2 x 20mL)。合併的有機層以H₂O洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到1.096g的化合物BC2立體異構體2，為白色無定形固體(定量)，其直接用於後續反應。

BC3的合成：乙基2-((R)-1-(2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)環丙基)-2-甲基丙酸

化合物22：2-((R)-1-(2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)環丙基)-2-甲基丙酸乙基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，引入片段C3(1.2g,7.01mmol)和THF(16.5mL)，接著引入片段B(2,54g,7.71mmol),HOBt(1.77g,8.76mmol),EDC(1.23g,8.06mmol)和DIEA(1.35mL,7.71mmol)。反應介質於室溫攪拌2h。此後，反應介質以H₂O(25mL)稀釋並以AcOEt(250mL)萃取。有機層以H₂O(2 x 25mL)，飽和鹽水(2 x 25mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並藉由快速層析純化，第一次在200g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上得到2.16g的化合物22，為無色泡沫(64%)，和343mg的含有期望化合物的混合物，其進一步在30g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上純化得到160mg的化合物22，為無色泡沫(4.7%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.62(m,1 H)；0.74至0.99(m,3 H)；1.03(s,3 H)；1.10(s,3 H)；1.24(t,J=7.2Hz,3 H)；1.42(s,9 H)；2.90(m,2 H)；3.88(s,3 H)；4.08(m,1 H)；4.10(q,J=7.2Hz,2 H)；4.96(m,1 H)；6.33(寬峰s,1 H)；6.85(d,J=8.5Hz,1 H)；7.03(dd,J=2.4和8.5Hz,1 H)；7.17(d,J=2.4Hz,1 H).

化合物BC3：2-((R)-1-(2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)環丙基)-2-甲基丙酸

化合物22(2.09g,4.33mmol),THF(10mL)和H₂O(8mL)引入在圓底燒瓶中，接著引入LiOH(726.33mg,17.31mmol)。溶液經攪拌並於65℃加熱。 16h後，反應未完全，添加726.33mg的在10mL H₂O中的LiOH。混合物於65℃攪拌48h。冷卻後，反應介質以H₂O(20mL)稀釋，然後以AcOEt(3 x 40mL)萃取。有機層以H₂O(2 x 10mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到1.29g的混合物酯/酸。水層以5N HCl酸化直到pH 3，然後以AcOEt(3 x 50mL)萃取。有機層以H₂O(2 x 10mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到787mg的化合物BC3，為米色泡沫(40%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.50至0.90(m,4 H)；1.03(s,6 H)；1.30(s,9 H)；2.60(dd,J=10.5和14.1Hz,1 H)；2.78(dd,J=5.0和14.1Hz,1 H)；3.81(s,3 H)；3.97(m,1 H)；6.80(d,J=8.7Hz,1 H)；7.03(d,J=8.5Hz,1 H)；7.18(dd,J=2.0和8.5Hz,1 H)；7.31(d,J=2.0Hz,1 H)；7.86(s,1 H)；12.11(寬峰m,1 H).

合成BC4：(S)-3-((R)-2-丙烯醯胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙醯胺基)-2,2-二甲基丁酸

化合物23：(S)-3-((R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)-2,2-二甲基丁酸甲基酯

向片段B(2g,6.06mmol)在DCM(60mL)中的溶液添加EDC(1.13mL,7.06mmol)和HOBt(948mg,6.67mmol)。反應介質於室溫攪拌15min，然後添加(S)-3-胺基-2,2-二甲基丁酸甲基酯(881mg,6.06mmol)和DIEA(1.53mL,9.10mmol)。反應介質於室溫攪拌4h，真空濃縮並以EtOAc(100mL)和H₂O(20mL)稀釋。水相以EtOAc(20mL)萃取；合併的有機相以飽和鹽水洗滌(2 x 20mL)，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析純化在150g的矽膠(梯度溶離庚烷/EtOAc)上得到2.21g的化合物23，為無色漆狀物(79%).

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.88(d,J=7.0Hz,3H)；1.08(s,6H)；1.32(s,9H)；2.67(dd,J=9.9和13.6Hz,1H)；2.82(dd,J=5.2和13.6Hz,1H)；3.62(s,3H)；3.83(s,3H)；4.06(m,1H)；4.77(m,1H)6.97(d,J=8.6Hz,1H)；7.05(d,J=8.6Hz,1H)；7.20(dd,J=2.4和8.6Hz,1H)；7.33(d,J=2.4Hz,1H)；7.55(d,J=9.8Hz,1H).

化合物24：(S)-3-((R)-2-胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙醯胺基)-2,2-二甲基丁酸甲基酯2,2,2-三氟乙酸鹽

向化合物23(2.2g,4.81mmol)在DCM(25mL)中溶液添加TFA(3.6mL,48.1mmol)。反應介質於室溫攪拌過夜，真空濃縮並在甲苯存在下共蒸發得到2.0g的化合物24，為非對映異構體混合物(88%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.80(d,J=6.9Hz,3H)；1.04(s,3H)；1.10(s,3H)；2.95(d,J=7.0Hz,2H)；3.62(s,3H)；3.84(s,3H)；4.00(m,1H)；4.15(m,1H)；7.10至7.30(m,3H)；8.00(d,J=9,5Hz,1H)；8.22(寬峰s,3H).

化合物25：(S)-3-((R)-2-丙烯醯胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙醯胺基)-2,2-二甲基丁酸甲基酯

向化合物24(2.0g,4.25mmol)在DCM(20mL)中的溶液添加丙烯醯氯 (536μL,6.37mmol)和DIEA(2.5mL,12.74mmol)。反應介質於室溫攪拌2h，然後以H₂O(20mL)稀釋。有機相以DCM萃取(2 x 20mL)，合併的有機相以飽和鹽水洗滌(2 x 20mL)，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在100g的矽膠(梯度溶離庚烷/EtOAc)上純化得到850mg的化合物25，為85：15非對映異構體混合物(68%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.85(d,J=6.9Hz,3H)；1.03(s,3H)；1.04(s,3H)；2.72(dd,J=9.7和13.9Hz,1H)；2.86(dd,J=5.8和13.9Hz,1H)；3.58(s,3H)；3.80(s,3H)；4.15(m,1H)；4.56(m,1H)；5.56(dd,J=2.3和10.2Hz,1H)；6.03(dd,J=2.3和17.2Hz,1H)；6.28(dd,J=10.2和17.2Hz,1H)；7.02(d,J=8.5Hz,1H)；7.17(dd,J=2.2和8.5Hz,1H)；7.31(d,J=2.2Hz,1H)；7.72(d,J=9.8Hz,1H)；8.36(d,J=8.6Hz,1H).

化合物BC4：(S)-3-((R)-2-丙烯醯胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙醯胺基)-2,2-二甲基丁酸

於0℃向tBuOK(1.11g,9.86mmol)在THF(4mL)中的冷卻的溶液添加H₂O(47μL)和化合物25(450mg,1.10mmol)。反應介質於室溫攪拌3h，然後以1N HCl(5mL)酸化。水相以DCM萃取(2 x 20mL)；合併的有機相以H₂O(30mL)、飽和鹽水(20mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮。兩個非對映異構體藉由超臨界液相層析在Chiralpak AS 10μm柱(在85/15 CO₂/[MeOH+0.1% TEA]等度溶離)上分離得到385mg的化合物BC4，為無定形固體(89%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.88(d,J=6.9Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.00(s,3H)；2.71(dd,J=9.4和13.7Hz,1H)；2.88(dd,J=5.3和13.7Hz,1H)；3.80(s,3H)；4.10(m,1H)；4.54(m,1H)；5.55(dd,J=2.3和10.2Hz,1H)；6.01(dd,J=2.3和17.1Hz,1H)；6.28(dd,J=10.2和17.1Hz,1H)；7.02(d,J=8.7Hz,1H)；7.17(dd,J=2.4和8.7Hz,1H)；7.32(d,J=2.4Hz,1H)；7.80 (d,J=9.8Hz,1H)；8.39(d,J=8.8Hz,1H)；12.00(寬峰s,1H).LCMS(A5)：ES m/z=395[M-H]^-；m/z=397[M+H]⁺；t_R=0.92min,

合成BC5：(S)-3-((R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)-2,2-二甲基丁酸

化合物BC5從(3S)-3-胺基-2,2-二甲基丁酸甲基酯(MFCD09256689)開始並根據在流程32中描繪的構造塊BC和對於化合物BC1和BC2描述的一般合成製備。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.89(d,J=7.0Hz,3H)；1.02(s,3H)；1.04(s,3H)；1.30(s,9H)；2.68(dd,J=13.6和10.2Hz,1H)；2.82(dd,J=5.2和13.6Hz,1H)；3.80(s,3H)；4.05(m,1H)；4.12(m,1H)；7.00(d,J=8.7Hz,1H)；7.05(d,J=8.7Hz,1H)；7.20(dd,J=2.2和8.7Hz,1H)；7.32(d,J=2.2Hz,1H)；7.52(d,J=9.9Hz,1H)；12.35(寬峰s,1H).LCMS(A1)：ES m/z=441[M-H]^-；m/z=443[M+H]⁺；m/z=883[2M-H]^-；t_R=1.16min.

合成BC6：3-((R)-2-丙烯醯胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙醯胺基)-2-(羥基甲基)-2-甲基丙酸

化合物26：3-((R)-2-((第三-丁氧基羰基)胺基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)-2-(羥基甲基)-2-甲基丙酸甲基酯

向片段C4(1.059g,5.77mmol)在THF(60mL)中的溶液添加DIEA(2.06mL,11.76mmol)、片段B(1.90g,5.77mmol)、HOBt(935mg,6.92mmol)和EDC(1.23mL,6.92mmol)。反應介質於室溫攪拌48h，真空濃縮並藉由快速層析在200g的矽膠(等度溶離庚烷/EtOAc)上純化得到1.05g的化合物26，為無色油狀物(39%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.98(s,3H)；1.30(s,9H)；2.63(m,1H)；2.83(m,1H)；3.18至3.48(m,4H)；3.60(s,3H)；3.80(s,3H)；4.10(m,1H)；4.81(m,1H)；6.98(d,J=8.9Hz,1H)；7.04(d,J=8.7Hz,1H)；7.20(dd,J=2.1和8.7Hz,1H)；7.35(d,J=2.1Hz,1H)；7.83(m,1H).LCMS(A5)：ES m/z=457[M-H]^-；m/z=459[M+H]⁺；m/z=503[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.1min.

化合物27：3-((R)-2-胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙醯胺基)-2-(羥基甲基)-2- 甲基丙酸甲基酯鹽酸鹽

化合物26(1.05g,2.29mmol)以在二

烷(16mL,64mmol)中的HCl 4M於室溫處理1h。反應介質經真空濃縮並在甲苯的存在下共蒸發兩次。粗產物與iPr₂O(10mL)一起研磨，過濾並以iPr₂O(5mL)洗滌兩次。然後將濾餅溶解在DCM中，過濾並真空濃縮得到809mg的化合物27，為白色泡沫(90%)，其不經純化而使用。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.92(s,1.5H)；0.97(s,1.5H)；2.88(m,1H)；3.00(m,1H)；3.19至3.47(m,4H)；3.60(s,3H)；3.85(s,3H)；4.05(m,1H)；4.89(m,1H)；7.11(split d,J=8.6Hz,1H)；7.19(split dd,J=2.0和8.6Hz,1H)；7.38(split d,J=2.0Hz,1H)；8.15(寬峰s,3H)；8.39(m,1H).

化合物28：3-((R)-2-胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙醯胺基)-2-甲基-2-(((三乙基甲矽烷基)氧基)甲基)丙酸甲基酯

向化合物27(809mg,2.05mmol)在DCM(4mL)(以冰浴冷卻)中的溶液添加TEA(1.43mL,10.23mmol)和氯三乙基矽烷(1.37mL,8.19mmol)同時保持溫度低於4℃。於4℃繼續攪拌10min，然後反應介質於室溫攪拌20h。將飽和鹽水(20mL)和DCM添加至介質，其攪拌10min。有機相以飽和鹽水(3 x 10mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在70g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到706mg的化合物28，為淡黃色油狀物(73%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.52(q,J=8.0Hz,6H)；0.89(t,J=8.0Hz,9H)；0.98(s,3H)；1.70(寬峰s,2H)；2.54(m,1H)；2.82(m,1H)；3.18至3.45(m,3H)；3.58(m,2H)；3.60(s,3H)；3.80(s,3H)；7.03(d,J=8.7Hz,1H)；7.14(dd,J=2.3和8.7Hz,1H)；7.28(split d,J=2.3Hz,1H)；7.78(m,1H).LCMS(A5)：ES m/z=471[M-H]^-；m/z=473[M+H]⁺；m/z=517[M-H+HCO₂H]^-；t_R=0.97min.

化合物29：3-((R)-2-丙烯醯胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙醯胺基)-2-甲基-2-(((三乙基甲矽烷基)氧基)甲基)丙酸甲基酯

向化合物28(704mg,1.49mmol)在DCM(19mL)(以冰/丙酮浴冷卻)中的溶液添加DIEA(780μL,4.46mmol)並滴加丙烯醯氯(181μL,2.23mmol)。反應介質於0-5℃攪拌1h，然後添加EtOAc(38mL)並且介質以1N HCl(5mL)、飽和NaHCO₃(5mL)、飽和鹽水(3 x 15mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在30g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到742mg的化合物29，為無色油狀物(94%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.52(split q,J=8.0Hz,6H)；0.89(split t,J=8.0Hz,9H)；0.99(s,1.5H)；1.01(s,1.5H)；2.69(m,1H)；2.87(m,1H)；3.20(m,1H)；3.28(m,1H)；3.50(dd,J=3.1和9.9Hz,1H)；3.58(s,3H)；3.68(d,J=9.9Hz,1H)；3.80(s,3H)；4.59(m,1H)；5.55(d,J=10.3Hz,1H)；6.00(d,J=17.3Hz,1H)；6.25(split dd,J=10.3和17.3Hz,1H)；7.02(d,J=8.5Hz,1H)；7.18(split dd,J=2.0和8.5Hz,1H)；7.31(split d,J=2.0Hz,1H)；7.96(m,1H)；8.39(d,J=8.9Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=525[M-H]^-；m/z=527[M+H]⁺；m/z=571[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.54min.

化合物BC6：3-((R)-2-丙烯醯胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙醯胺基)-2-(羥基甲基)-2-甲基丙酸

向tBuOK(1.42g,12.65mmol)在THF(7mL)(以冰/丙酮浴冷卻)的懸浮液中添加H₂O(50μL)，攪拌介質10min，然後添加化合物29(741mg,1.41mmol)在THF(7mL)中的溶液。於0℃持續攪拌10min然後在室溫攪拌1h。反應介質以冰浴冷卻，然後添加1N HCl(16.9mL)。攪拌15min後，反應介質以DCM萃取(3 x 25mL)。合併的有機相以飽和鹽水(2 x 15mL)、H₂O(15mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到656mg的化合物BC6，為黃色泡沫(定量)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.91(s,3H)；2.69(m,1H)；2.90(dd,J=4.8和13.6Hz,1H)；3.18至3.42(m,4H)；3.80(s,3H)；4.59(m,1H)；4.73(寬峰，1H)；5.55(d,J=2.3和10.3Hz,1H)；6.00(dd,J=2.3和17.2Hz,1H)；6.24(dd,J=10.3和17.2Hz,1H)；7.03(d,J=8.7Hz,1H)；7.19(dd,J=2.0和8.7Hz,1H)；7.35(d,J=2.0Hz,1H)；8.00(m,1H)；8.39(d,J=8.8Hz,1H)；12.30(寬峰s,1H).LCMS(A5)：ES m/z=397[M-H]^-；m/z=399[M+H]⁺；t_R=0.77min.

合成實例1至3：氮雜-C52的苄胺、戊二醯基-Val-Ala-氮雜-C52苄胺的NHS酯和對應的ADC

化合物30：(6R,13S)-(1E,3R,4S,6E)-1-(4-(疊氮基甲基)苯基)-8-(第三-丁氧基)-3-甲基-8-側氧基辛-1,6-二烯-4-基6-(3-氯-4-甲氧基苄基)-13-異丁基-2,2,10,10-四甲基-4,7,11-三側氧基-3-氧雜-5,8,12-三氮雜十四烷-14-酸酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，引入在DMF(25mL)中的化合物BC1(899.55mg,2.10mmol)、HATU(861mg,2.20mmol)和HOAt(302mg,2.20mmol)。混合物於室溫攪拌30分鐘。此後，添加化合物AD1(940mg,2mmol)和DIEA(1.05mL,5.99mmol)。反應介質於室溫攪拌4h。此後，反應介質以H₂O(50mL)稀釋並以AcOEt(2 x 40mL)萃取。有機層以飽和鹽水洗滌(25mL)，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並藉由快速層析在80g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上純化得到1.011g的化合物30，為黃色半固體(57%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.76(d,J=6.7Hz,3 H)；0.78(d,J=6.7Hz,3 H)；1.03(d,J=7.0Hz,3 H)；1.07(s,6 H)；1.39(s,9 H)；1.37至1.63(m,3 H)；1.41(s,9 H)；2.36至2.60(部分遮蔽的m,3 H)；2.64(dd,J=9.5和14.1Hz,1 H)；2.86(dd,J=5.6和14.1Hz,1 H)；3.18(dd,J=6.1和13.5Hz,1 H)；3.25(dd,J=6.9和13.5Hz,1 H)；3.79(s,3 H)；4.09(m,1 H)；4.26(m,1 H)；4.40(s,2 H)；4.92(m,1 H)；5.81(d,J=15.9Hz,1 H)；6.17(dd,J=8.4和16.1Hz,1 H)；6.44(d,J=15.9Hz,1 H)；6.70(m,1 H)；6.94(d,J=8.9Hz,1 H)；7.02(d,J=8.7Hz,1 H)；7.18(dd,J=2.3和8.9Hz,1 H)；7.31(m,3 H)；7.42(d,J=8.5Hz,2 H)；7.59(t,J=6.3Hz,1 H)；7.77(d,J=7.9Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=879[M-H]^-；m/z=881[M+H]⁺；m/z=925[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.89min.

化合物31：(3S,10R,16S,E)-16-((R,E)-4-(4-(疊氮基甲基)苯基)丁-3-烯-2-基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6-二甲基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮 化合物31分兩步製備。

步驟1：在圓底燒瓶中，引入在DCM(10mL)中的化合物30(1.011g,1.15mmol)。冷卻至0℃後，添加TFA(1.72mL,22.94mmol)和100μL的H₂O。反應介質於室溫攪拌72h。完成後，將甲苯添加至介質並且其經真空濃縮得到900mg的胺基/酸中間體(定量)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.76(d,J=6.7Hz,3 H)；0.78(d,J=6.7Hz,3 H)；1.03(d,J=7.0Hz,3 H)；1.07(s,3 H)；1.08(s,3 H)；1.38至1.62(m,3 H)；2.35至2.58(部分遮蔽的m,3 H)；2.79(dd,J=11.0和13.8Hz,1 H)；3.00(dd,J=4.1和13.8Hz,1 H)；3.16(dd,J=5.9和13.5Hz,1 H)；3.28至3.39(遮蔽的m,1 H)；3.81(s,3 H)；4.03(m,1 H)；4.26(m,1 H)；4.40(s,2 H)；4.92(m,1 H)；5.82(d,J=16.1Hz,1 H)；6.16(dd,J=8.8和16.4Hz,1 H)；6.42(d,J=16.4Hz,1 H)；6.73(m,1 H)；7.09(d,J=8.6Hz,1 H)；7.18(dd,J=2.0和8.6Hz,1 H)；7.32(d,J=8.6Hz,2 H)；7.37(d,J=2.0Hz,1 H)；7.41(d,J=8.6Hz,2 H)；7.84(d,J=7.9Hz,1 H)；8.01(大寬峰，3 H)；8.10(t,J=6.4Hz,1 H)；12.2(寬峰s,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=723[M-H]^-；m/z=725[M+H]⁺；t_R=1.09min.

步驟2：在圓底燒瓶中，向胺基/酸中間體(840mg,1.16mmol)在200mL的CH₃CN中的溶液添加DIEA(1.95mL,11.58mmol)、HOAt(159.23mg,1.16mmol)和HATU(499.40mg,1.27mmol)。反應介質於室溫攪拌3h。真空濃縮後，粗產物以AcOEt(200mL)稀釋，以0.5M檸檬酸(12mL)和1N HCl(6mL)中和。有機層經分離，以飽和NaHSO₃、飽和NaHCO₃、飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並藉由快速層析在40g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到558mg的化合物31，為白色固體(68%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.60(d,J=6.7Hz,3 H)；0.61(d,J=6.7Hz,3 H)；0.97(s,3 H)；1.07(s,3 H)；1.09(d,J=7.0Hz,3 H)；1.15(m,1 H)；1.33至1.48(m,2 H)；2.24(m,1 H)；2.53至2.70(m,2 H)；2.88(大 d,J=13.6Hz,1 H)；3.01(dd,J=3.5和14.5Hz,1 H)；3.23至3.32(掩蔽的m,1 H)；3.80(s,3 H)；4.18(m,1 H)；4.35(m,1 H)；4.40(s,2 H)；4.95(m,1 H)；5.86(dd,J=1.7和15.8Hz,1 H)；6.13(dd,J=8.8和16.1Hz,1 H)；6.40(m,1 H)；6.47(d,J=16.1Hz,1 H)；7.04(d,J=8.6Hz,1 H)；7.18(dd,J=2.0和8.6Hz,1 H)；7.29(d,J=2.0Hz,1 H)；7.32(d,J=8.6Hz,2 H)；7.41(寬峰d,J=8.6Hz,3 H)；7.89(d,J=8.9Hz,1 H)；8.1(d,J=8.2Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=705[M-H]^-；m/z=707[M+H]⁺；t_R=1.58min.

化合物32：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(疊氮基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6-二甲基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

在圓底燒瓶中，向化合物31(410mg,0.579mmol)在DCM(50mL)中的溶液於0℃添加m-CPBA(259mg,1.16mmol)。於室溫攪拌16h，在24h兩次添加m-CPBA(130mg)。一旦反應完成，粗混合物與飽和NaHCO₃(15mL)和飽和Na₂S2O₃(15mL)一起攪拌1h，然後以DCM萃取(3 x 15mL)。有機層以飽和鹽水洗滌(15mL)，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮得到440mg的α-和β-環氧化物的混合物，為黃色半固體。α-和β-環氧化物藉由對掌性液體層析分離，其在76 x 350mm柱(裝有1.1kg的10μm Chiralpak AD(直鏈澱粉三-3,5-二甲基苯基胺基甲酸酯，塗覆在矽膠支承體上，Chiral Technologies Europe))上使用80：20庚烷/EtOH的等度溶離進行。濃縮後，得到185mg的化合物32，為白色固體(44%)，和得到118mg的α-環氧化物，為白色固體(28%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.72(d,J=6.7Hz,3 H)；0.74(d,J=6.7Hz,3 H)；0.96(s,3 H)；1.04(d,J=7.0Hz,3 H)；1.08(s,3 H)；1.11(m,1 H)；1.40至1.55(m,2 H)；1.79(m,1 H)；2.26(m,1 H)；2.64(m,2 H)；2.85(寬峰d,J=13.2Hz,1 H)；3.00(m,2 H)；3.25(dd,J=10.2和13.2Hz,1 H)；3.80(s,3 H)；3.90(d,J=2.0Hz,1 H)；4.17(m,1 H)；4.35(m,1 H)；4.46(s,2 H)；5.12(m,1 H)；5.80(dd,J=1.7和16.0Hz,1 H)；6.39(ddd,J=3.8,11.6和16.0Hz,1 H)；7.04(d,J=8.6Hz,1 H)；7.18(dd,J=2.0和8.6Hz,1 H)；7.29(d,J=2.0Hz,1 H)；7.31至7.40(m,5 H)；7.94(d,J=9.1Hz,1 H)；8.40(d,J=8.1Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=723[M+H]⁺；t_R=1.48min.

實例1：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(胺基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6-二甲基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

在圓底燒瓶中，向化合物32(185mg,255.79μmol)在DCM(6mL),MeOH(6mL)和H₂O(0.8mL)中的溶液添加TCEP(81,47mg,281,37μmol)。溶液於室溫攪拌16h。一旦反應完成，粗混合物以飽和NaHCO₃(15mL)稀釋並以DCM萃取(2 x 30mL)。有機層以飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並藉由兩個連續快速層析在15g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到90mg的實例1，為白色固體(51%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.72(d,J=6.6Hz,3 H)；0.75(d,J=6.6Hz,3 H)；0.97(s,3 H)；1.03(d,J=7.1Hz,3 H)；1.07(s,3 H)；1.14(m,1 H)；1.42至1.57(m,2 H)；1.77(m,1 H)；1.92(寬峰m,2 H)；2.26(m,1 H)；2.64(m,2 H)；2.86(寬峰d,J=13.0Hz,1 H)；2.94(dd,J=2.0和8.0Hz,1 H)；3.00(dd,J=3.6和14.4Hz,1 H)；3.27(dd,J=10.2和13.0Hz,1 H)；3.70(s,2 H)；3.80(s,3 H)；3.84(d,J=2.0Hz,1 H)；4.18(m,1 H)；4.34(m,1 H)；5.11(m,1 H)；5.79(dd,J=1.7和15.6Hz,1 H)；6.38(ddd,J=4.1,11.6和15.6Hz,1 H)；7.05(d,J=8.6Hz,1 H)；7.16(dd,J=2.0和8.6Hz,1 H)；7.22(d,J=8.5Hz,2 H)；7.28(d,J=2.0Hz,1 H)；7.31(d,J=8.5Hz,2 H)；7.35(d,J=10.2Hz,1 H)；7.91(d,J=9.0Hz,1 H)；8.38(d,J=8.0Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=695[M-H]^-；m/z=697[M+H]⁺；t_R=0.83min.

化合物33：(S)-2-胺基-N-((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-3-甲基丁醯胺

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向實例1(90mg,129.01μmol)在DCM(20mL)中的溶液添加(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙酸或FmocValAla(CAS號[150114-97-9],79.47mg,193.61μmol)、EDC(34.27μL,193.61μmol)和HOBt(20.93mg,154.9μmol)。反應介質於室溫攪拌過夜。此後，哌啶(129μL,1.29mmol)添加並攪拌2h。除去溶劑並且粗剩餘物藉由快速層析在15g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到50mg的化合物33(45%)，為白色固體。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.75(m,9 H)；0.88(d,J=7.1Hz,3 H)；0.96(s,3 H)；1.03(d,J=7.1Hz,3 H)；1.08(s,3 H)；1.18(m,1 H)；1.23(d,J=7.0Hz,3 H)；1.42至1.57(m,2 H)；1.70(寬峰m,2 H)；1.79(m,1 H)；1.92(m,1 H)；2.26(m,1 H)；2.63(m,2 H)；2.86(寬峰d,J=13.0Hz,1 H)；2.99(m,3 H)；3.22至3.33(部分遮蔽的m,1 H)；3.80(s,3 H)；3.86(d,J=2.0Hz,1 H)；4.18(m,1 H)；4.28(d,J=6.3Hz,2 H)；4.33(m,2 H)；5.11(m,1 H)；5.79(dd,J=1.7和15.6Hz,1 H)；6.39(ddd,J=4.1,11.6和15.6Hz,1 H)；7.03(d,J=8.6Hz,1 H)；7.16(dd,J=2.0和8.6Hz,1 H)；7.24(s,4 H)；7.28(d,J=2.0Hz,1 H)；7.37(d,J=10.2Hz,1 H)；7.92(d,J=9.1Hz,1 H)；8.07(寬峰d,J=8.3Hz,1 H)；8.38(d,J=8.1Hz,1 H)；8.42(t,J=6.3Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=434[M+2H]²⁺；m/z=865[M-H]^-；m/z=867[M+H]⁺；m/z=911[M-H+HCO₂H]^-；t_R=0.88min.

化合物34：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向化合物33(54mg,57.64μmol)在DMF(5mL)中的溶液添加戊二酸酐(8mg,69.17μmol)。反應介質於室溫攪拌3.5h。此後，除去溶劑並且粗剩餘物藉由快速層析在1.8g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到51mg的化合物34，為白色固體(90%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.73(d,J=6.7Hz,3 H)；0.76(d,J=6.7Hz,3 H)；0.81(d,J=7.0Hz,3 H)；0.84(d,J=7.0Hz,3 H)；0.97(s,3 H)；1.03(d,J=7.2Hz,3 H)；1.05(s,3 H)；1.15(m,1 H)；1.22(d,J=7.2Hz,3 H)；1.43至1.52(m,2 H)；1.70(m,2 H)；1.77(m,1 H)；1.97(m,1 H)；2.17(m,2 H)；2.24(m,1 H)；2.55至2.68(m,2 H)；2.85(寬峰d,J=12.7Hz,1 H)；2.96(dd,J=1.8和7.7Hz,1 H)；2.99(dd,J=3.0和14.6Hz,1 H)；3.23至3.40(部分遮蔽的m,1 H)；3.80(s,3 H)；3.85(d,J=1.8Hz,1 H)；4.22至4.38(m,4 H)；5.11(m,1 H)；5.79(d,J=14.9Hz,1 H)；6.37(ddd,J=4.1,11.3和14.9Hz,1 H)；7.04(d,J=8.7Hz,1 H)；7.15(dd,J=2.0 et 8.7 Hz,1 H)；7.23(寬峰s,4 H)；7.28(d,J=2.0Hz,1 H)；7.37(寬峰d,J=10.7Hz,1 H)；7.87(d,J=8.7Hz,1 H)；7.93(d,J=9.2Hz,1 H)；8.06(m大，1 H)；8.37(寬峰m,1 H)；8.41(寬峰m,1 H)；12.03(寬峰m,1 H).LCMS(A1)；ES m/z=979[M-H]^-；m/z=981[M+H]⁺；t_R=1.17min.

實例2：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向化合物34(30mg,30.56μmol)在THF(5 mL)中的溶液添加DIEA(5.34μL,30.56μmol)和DSC(16.31mg,61.13μmol)。反應介質於室溫攪拌2h。此後，除去溶劑並且粗剩餘物藉由快速層析在1.3g的矽膠(梯度溶離DCM/iPrOH)上純化得到9mg的實例2，為白色固體。含有期望化合物和雜質的第二批次以MeTHF稀釋，以H₂O、飽和鹽水洗滌兩次，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮得到15mg的實例2，為白色固體(整體收率為73%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.73(d,J=6.7Hz,3 H)；0.77(d,J=6.7Hz,3 H)；0.82(d,J=7.0Hz,3 H)；0.84(d,J=7.0Hz,3 H)；0.96(s,3 H)；1.03(d,J=7.2Hz,3 H)；1.07(s,3 H)；1.15(m,1 H)；1.23(d,J=7.2Hz,3 H)；1.43至1.56(m,2 H)；1.78(m,1 H)；1.81(m,1 H)；1.97(m,1 H)；2.20至2.33(m,3 H)；2.58至2.69(m,4 H)；2.80(s,4 H)；2.85(寬峰d,J=12.7Hz,1 H)；2.98(dd,J=2.1和7.9Hz,1 H)；3.00(dd,J=3.2和14.7Hz,1 H)；3.22至3.34(部分遮蔽的m,1 H)；3.80(s,3 H)；3.85(d,J=2.1Hz,1 H)；4.15(m,2 H)；4.22至4.38(m,4 H)；5.11(m,1 H)；5.79(d,J=15.1Hz,1 H)；6.38(ddd,J=3.9,11.2和15.1Hz,1 H)；7.04(d,J=8.7Hz,1 H)；7.15(dd,J=2.2和8.7Hz,1 H)；7.22(寬峰s,4 H)；7.29(d,J=2.2Hz,1 H)；7.36(寬峰d,J=10.3Hz,1 H)；7.89(d,J=8.7Hz,1 H)；7.92(d,J=8.9Hz,1 H)；8.04(d,J=7.4Hz,1 H)；8.32(t,J=6.1Hz,1 H)；8.39(d,J=8.0Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=540；m/z=1076[M-H]^-；m/z=1078[M+H]⁺；m/z=1122[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.23min.

實例3：mAb-Ex2

先前描述的一般方法用來製備實例3。60mg的hu2H11_R35-74與161μL的實例2在DMA(1.733mg,4eq.)中的9.96mM溶液反應2h。此時，添加121μL的實例2(3當量)的溶液並且介質攪拌2h。此時，添加121μL的實例2(3當量)的溶液並攪拌2h。在Superdex 200 pg上在DPBS pH 6.5+ 20% NMP中純化後，在Amicon Ultra-15中濃縮，在PD-10上在緩衝液B pH 6.5+5% NMP中緩衝液交換並在Steriflip過濾，得到39.9mg的實例3，為無色澄清溶液，濃度為2.28mg/mL，DAR為4.6(HRMS)，單體純度為99%且整體收率為66%。

SEC-HRMS：圖1中完整ADC的光譜；m/z=150346(D1)；m/z=151307(D2)；m/z=152274(D3)；m/z=153240(D4)；m/z=154200(D5)；m/z=155165(D6)；m/z=156133(D7)；m/z=157095(D8)。

合成實例4至7：(S)-3-新戊基-氮雜-C52的苄胺，戊二醯基-Val-Ala-(S)-3-新戊基-氮雜-C52苄胺的NHS酯和對應的ADC

化合物35：6-(3-氯-4-甲氧基苄基)-2,2,10,10-四甲基-13-新戊基-4,7,11-三側氧基-3-氧雜-5,8,12-三氮雜十四烷-14-酸(6R,13S)-(1E,3R,4S,6E)-8-(第三-丁氧基)-1-(4-(羥基甲基)苯基)-3-甲基-8-側氧基辛-1,6-二烯-4-基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向片段BC1(1.32g,3.08mmol)在DCM(60mL)中的溶液添加DIEA(1.53mL,9.25mmol)、HOAt(503.75mg,3.70mmol)和HATU(1.41g,3.70mmol)。黃色懸浮液於室溫攪拌30min，然後添加片段AD2(1.7g,3.08mmol)。反應介質於室溫攪拌2h。此後，添加1.53mL 的DIEA並攪拌1h。混合物以1M檸檬酸(50mL)中和並以AcOEt(2 x 80mL)萃取。有機層以1M NaHSO₄、H₂O洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並藉由快速層析在100g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上純化得到1.475g的化合物35，為無色固體(57%)。

化合物36：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-(3-((R)-2-胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)-2,2-二甲基丙醯胺基)-4,4-二甲基戊醯基)氧基)-8-(4-(羥基甲基)-苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸

在圓底燒瓶中，向化合物35(1.475g,1.69mmol)在DCM(20mL)中的溶液添加TFA(8mL,52.27mmol)和H₂O(2mL)。反應介質於室溫攪拌5h。除去溶劑。剩餘物以H₂O(20mL)和AcOEt(20mL)稀釋並以2M NaOH(2mL)於室溫處理2h。有機層經分離且水層以AcOEt(2 x 10mL)萃取，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮得到1.24g的無色固體。固體溶解於AcOEt(10mL)和H₂O(10mL)中並以2M NaOH(400μL)於室溫處理2h。有機層經分離，水層以AcOEt(2 x 10mL)萃取，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並藉由快速層析在100g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上純化得到990mg的化合物36，為白色固體(82%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.80(s,9 H)；0.99(s,3 H)；1.02(d,J=7.0Hz,3 H)；1.05(s,3 H)；1.52(dd,J=2.0和14,8Hz,1 H)；1.69(dd,J=9.9和14.8Hz,1 H)；2.36至2.61(部分遮蔽的m,4 H)；2.84(dd,J=5.0和13.9Hz,1 H)；3.18(d,J=7.5Hz,2 H)；3.40(dd,J=5.1和8.1Hz,1 H)；3.80(s,3 H)；4.29(m,1 H)；4.45(s,2 H)；4.90(m,1 H)；5.12(寬峰m,1 H)；5.81(d,J=15.5Hz,1 H)；6.10(dd,J=8.4和15.9Hz,1 H)；6.40(d,J=15.9Hz,1 H)；6.70(td,J=7.5和15.5Hz,1 H)；7.01(d,J=8.7Hz,1 H)；7.11(dd,J=2.4和8.7Hz,1 H)；7.25(m,3 H)；7.32(d,J=8.2Hz,2 H)；7.72(t,J=6.5Hz,1 H)；7.79(d,J=7.8Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=712[M-H]^-；m/z= 714[M+H]⁺；t_R=0.94min.

化合物37：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((R,E)-4-(4-(羥基甲基)-苯基)丁-3-烯-2-基)-6,6-二甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

在氬氣下，在圓底燒瓶中，引入化合物36(990mg,1.39mmol)和CH₃CN(150mL)，以水浴在50℃加熱直到完全溶解並攪拌10min。此後，添加DIEA(687.20μL,4.16mmol),HOAt(207.51mg,1.52mmol)和HATU(579.7mg,1.52mmol)並於室溫攪拌30min。反應介質以1M檸檬酸(30mL)中和。除去溶劑且水層以AcOEt(2 x 40mL)萃取。有機層以1M NaHSO₄、H₂O洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮。粗的固體以H₂O(200mL)稀釋並攪拌1h。固體經過濾，然後以AcOEt稀釋，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮得到化合物37和HATU的混合物。固體以MeTHF(50mL)和H₂O(50mL)攪拌。有機層經分離，以H₂O(4 x 20mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並藉由快速層析在10g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上純化得到680mg的化合物37，為無色固體(70%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.68(s,9 H)；0.98(s,3 H)；1.03(s,3 H)；1.09(d,J=6.9Hz,3 H)；1.19(寬峰d,J=14.5Hz,1 H)；1.58(dd,J=10.3和14.5Hz,1 H)；2.23(m,1 H)；2.52至2.70(m,3 H)；2.86(寬峰d,J=12.7Hz,1 H)；3.00(dd,J=3.3和14.8Hz,1 H)；3.22至3.33(部分遮蔽的m,1 H)；3.80(s,3 H)；4.18(m,1 H)；4.42(m,1 H)；4.46(d,J=6.0Hz,2 H)；4.91(m,1 H)；5.13(t,J=6.0Hz,1 H)；5.85(寬峰d,J=15.0Hz,1 H)；6.05(dd,J=8.4和15.9Hz,1 H)；6.40(m,2 H)；7.03(d,J=8.7Hz,1 H)；7.18(dd,J=2.2和8.7Hz,1 H)；7.25(d,J=8.5Hz,2 H)；7.29(d,J=2.2Hz,1 H),7.31(d,J=8.5Hz,2 H)；7.42(d,J=10.6Hz,1 H)；7.94(d,J=9.1Hz,1 H)；8.41(d,J=8.2Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=694[M-H]^-；m/z=696[M+H]⁺；t_R= 1.36min.

化合物38：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-16-((R,E)-4-(4-(((三異丙基甲矽烷基)氧基)甲基)苯基)丁-3-烯-2-基)-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

在氬氣下，於0℃在圓底燒瓶中，向化合物37(680mg,0.976mmol)在CHCl₃(10mL)中的溶液添加1H-咪唑(305.84mg,4.49mmol)和氯三異丙基矽烷(480.13μl,2.25mmol)。反應介質於室溫攪拌5h，然後以飽和NH₄Cl和MTBE(30mL)稀釋。有機層以1M NaHSO₄、飽和NaHCO₃、飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮得到970mg的化合物38，為橙色無定型固體(定量)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.63(s,9 H)；0.87 à 1.17(m,31 H)；1.53(dd,J=10.9和14.3Hz,1 H)；2.22(m,1 H)；2.51至2.70(m,3 H)；2.86(寬峰d,J=13.0Hz,1 H)；3.00(dd,J=3.2和14.9Hz,1 H)；3.24至3.35(部分遮蔽的m,1 H)；3.80(s,3 H)；4.18(m,1 H)；4.41(m,1 H)；4.76(s,2 H)；4.91(m,1 H)；5.87(寬峰d,J=15.4Hz,1 H)；6.06(dd,J=8.9和15.9Hz,1 H)；6.40(m,2 H)；7.03(d,J=8.5Hz,1 H)；7.18(寬峰d,J=8.5Hz,1 H)；7.25(d,J=8.3Hz,2 H)；7.28(d,J=8.3Hz,2 H)；7.30(寬峰s,1 H)；7.42(d,J=10.5Hz,1 H)；7.93(d,J=9.2Hz,1 H)；8.42(d,J=8.1Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=850[M-H]^-；m/z=852[M+H]⁺；m/z=896[M-H+HCO₂H]^-；t_R=2.15min.

實例4：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(羥基-甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-6,6-二甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮實例4以2步製備。

步驟1：在氬氣下，在圓底燒瓶中，向化合物38(832mg,0.976mmol) 在DCM(10mL)中的溶液分三次添加m-CPBA(339.15mg,1.51mmol)。反應混合物於室溫攪拌50h，然後以DCM(10mL)稀釋並與飽和NaHCO₃(30mL)和Na₂S₂O₃(30mL)攪拌15min。有機層經分離以飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮得到1.1g的α-和β-環氧化物的混合物，為無色泡沫(定量)。

步驟2：α-和β-環氧化物的混合物在THF(30mL)中稀釋並添加1M TBAF(952.32μL)。攪拌2h後，添加952μL的TBAF。攪拌1h後，混合物以H₂O(50mL)稀釋並以AcOEt(3 x 50mL)萃取。有機層以飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮得到770mg的α-和β-環氧化物的混合物，為黃色固體(定量)。α-和β-環氧化物藉由對掌性液體層析分離，其在76 x 350mm柱(裝有1.1kg的10 μm Chiralpak AD(直鏈澱粉三-3,5-二甲基苯基胺基甲酸酯，塗覆在矽膠支承體上，Chiral Technologies Europe)上使用75：25庚烷/EtOH的等度溶離。濃縮後，得到190mg的實例4，為白色固體(31%)和得到125mg的α-環氧化物，為白色固體(20%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.81(s,9 H)；0.98(s,3 H)；1.03(d,J=7.0Hz,3 H)；1.05(s,3 H)；1.26(m,1 H)；1.71(dd,J=10.4和14.5Hz,1 H)；1.82(m,1 H)；2.26(m,1 H)；2.52(m,2 H)；2.84(d,J=12.8Hz,1 H)；2.92(dd,J=2.1和7.8Hz,1 H)；3.00(dd,J=3.1和14.5Hz,1 H)；3.24至3.36(部分遮蔽的m,1 H)；3.81(s,3 H)；3.90(d,J=2.1Hz,1 H)；4.17(ddd,J=3.4,8.0和11.7Hz,1 H)；4.42(m,1 H)；4.50(d,J=6.0Hz,2 H)；5,10(m,1 H)；5.20(t,J=6.0Hz,1 H)；5.79(dd,J=1.8和15.4Hz,1 H)；6.39(ddd,J=3.8,11.5和15.4Hz,1 H)；7.05(d,J=8.6Hz,1 H)；7.16(dd,J=2.1和8.6Hz,1 H)；7.26(d,J=8.3Hz,2 H)；7.29(d,J=2.1Hz,1 H)；7.32(d,J=8.3Hz,2 H)；7.41(d,J=10.3Hz,1 H)；8.02(d,J=9.2Hz,1 H)；8.38(d,J=8.2Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z=710[M-H]^-；m/z=712[M+H1⁺；t_R=1.28min.

化合物39：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(疊氮基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向實例4(100mg,140μmol)在THF(5mL)中的溶液添加DPPA(156.82μl,701.98μmol)和DBU(110.22μl,701.98μmol)。溶液於室溫攪拌6h，然後以H₂O稀釋並且以AcOEt(3 x 30mL)萃取。有機層經分離以飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並且在15g的矽膠(梯度溶離DCM/iPrOH)上純化得到100mg的化合物39，為白色固體(40%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.80(s,9 H)；0.97(s,3 H)；1.03(d,J=7.0Hz,3 H)；1.04(s,3 H)；1.28(d,J=14.5Hz,1 H)；1.69(dd,J=10.7和14.5Hz,1 H)；1.84(m,1 H)；2.28(m,1 H)；2.62(m,2 H)；2.84(d,J=12.8Hz,1 H)；2.93至3.03(m,2 H)；3.22至3.34(部分遮蔽的m,1 H)；3.80(s,3 H)；3.92(寬峰s,1 H)；4.17(m,1 H)；4.40至4.49(m,3 H)；5.10(m,1 H)；5.80(d,J=15.8Hz,1 H)；6.39(ddd,J=3.8,11.7和15.8Hz,1 H)；7.03(d,J=8.7Hz,1 H)；7.16(dd,J=2.2和8.7Hz,1 H)；7.28(d,J=2.1Hz,1 H)；7.32(d,J=8.3Hz,2 H)；7.39(d,J=8.3Hz,2 H)；7.41(m,1 H)；8.00(d,J=9.1Hz,1 H)；8.36(d,J=8.2Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z=735[M-H]^-；m/z=737[M+H]⁺；t_R=1.54min.

實例5：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-i-((2R,3R)-3-(4-(胺基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

在圓底燒瓶中，向化合物39(100mg,122.07μmol)在DCM(2.5mL)和MeOH(2.5mL)中的溶液滴加TCEP(38.88mg,134.28μmol)在H₂O(500μL)中的溶液。反應介質於室溫攪拌24h。反應混合物以H₂O和飽和NaHCO₃ 稀釋，以DCM萃取(3 x 10mL)。有機層經分離以飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮得到73mg的實例5，為白色固體(84%)，不經進一步純化用於後續步驟。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.82(s,9 H)；0.97(s,3 H)；1.03(d,J=7.0Hz,3 H)；1.04(s,3 H)；1.29(d,J=14.4Hz,1 H)；1.70(dd,J=10.2和14.4Hz,1 H)；1.80(m,1 H)；2.02(寬峰m,2 H)；2.25(m,1 H)；2.62(m,2 H)；2.83(d,J=13.0Hz,1 H)；2.93(dd,J=2.2和7.8Hz,1 H)；2.99(dd,J=3.4和14.5Hz,1 H)；3.23至3.35(部分遮蔽的m,1 H)；3.71(s,2 H)；3.80(s,3 H)；3.88(d,J=2.2Hz,1 H)；4.17(ddd,J=3.5,8.5和11.5Hz,1 H)；4.41(m,1 H)；5.09(m,1 H)；5.79(d,J=15.7Hz,1 H)；6.39(ddd,J=3.7,11.4和15.7Hz,1 H)；7.05(d,J=8.7Hz,1 H)；7.16(dd,J=2.3和8.7Hz,1 H)；7.22(d,J=8.4Hz,2 H)；7.28(d,J=2.3Hz,1 H)；7.34(d,J=8.4Hz,2 H)；7.40(d,J=10.3,1 H)；8.02(d,J=8.9Hz,1 H)；8.38(d,J=8.2Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z=709[M-H]^-；m/z=711[M+H]⁺；t_R=0.86min.

化合物40：(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，引入實例5(73mg,82.10μmol)和DMF(1mL)，接著引入FmocValAla(50.55mg,123.16μmo,)、HOBt(17.75mg,131.37μmol)、DCM(10mL)和EDC(14.53μl,82.10μmol)。溶液於室溫攪拌4h，然後以H₂O(10mL)稀釋並以DCM萃取(3 x 20mL)。有機層經分離以H₂O洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並在15g的矽膠(梯度溶離DCM/iPrOH)上純化得到90mg的化合物40，為無色固體(99%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.80(s,9 H)；0.84(d,J=7.1Hz,3 H)；0.86(d,J=7.1Hz,3 H)；0.93(s,3 H)；1.02(d,J=7.1Hz,3 H)；1.04(s,3 H)；1.24(d,J=7.3Hz,3 H)；1.29(d,J=14.5Hz,1 H)；1.70(dd,J=10.5和14.5Hz,1 H)；1.81(m,1 H)；1.99(m,1 H)；2.25(m,1 H)；2.60(m,2 H)；2.82(d,J=13.0Hz,1 H)；2.91(dd,J=1.9和7.6Hz,1 H)；2.99(dd,J=3.4和14.5Hz,1 H)；3.29(m,1 H)；3.80(s,3H)；3.88(d,J=1.9Hz,1 H)；3.90(m,1 H)；4.16(ddd,J=3.4,8.0和11.8Hz,1 H)；4.20至4.35(m,6 H)；4.41(m,1 H)；5.09(m,1 H)；5.79(d,J=15.7Hz,1 H)；6.39(ddd,J=3.7,11.6和15.7Hz,1 H)；7.05(d,J=8.6Hz,1 H)；7.15(dd,J=2.5和8.6Hz,1 H)；7.21(d,J=8.5Hz,2 H)；7.24(d,J=8.5Hz,2 H)；7.28(d,J=2.5Hz,1 H)；7.32(t,J=7.9Hz,2 H)；7.38至7.47(m,4 H)；7.73(t,J=7.9Hz,2 H)；7.89(d,J=7.9Hz,2 H)；8.03(d,J=9.1Hz,1 H)；8.05(d,J=7.9Hz,1 H)；8.39(m,2 H).LCMS(A1)：ES m/z=1103[M+H]⁺；m/z=1147[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.71min.

化合物41：(S)-2-胺基-N-((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-3-甲基丁醯胺

在氬氣下，在圓底燒瓶中，引入在DCM(5mL)中的化合物40(104mg,76.65μmol)，接著引入哌啶(138.87μl,1.40mmol)。溶液於室溫攪拌5h，然後濃縮並在10g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH/H₂O)上純化得到50mg的化合物41，為無色固體(60%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.76(d,J=7.0Hz,3 H)；0.81(s,9 H)；0.88(d,J=7.0Hz,3 H)；0.97(s,3 H)；1.02(d,J=7.1Hz,3 H)；1.04(s,3 H)；1.22(d,J=7.3Hz,3 H)；1.29(d,J=14.6Hz,1 H)；1.66(寬峰m,2 H)；1.70(dd,J=10.6和14.6Hz,1 H)；1.81(m,1 H)；1.92(m,1 H)；2.25(m,1 H)；2.60(m,2 H)；2.83(d,J=13.0Hz,1 H)；2.93(dd,J=1.9和7.4Hz,1 H)；2.99(m,2 H)；3.28(dd,J=10.4和13.0Hz,1 H)；3.80(s,3 H)；3.89(d,J=1.9Hz,1 H)；4.16(ddd,J=3.2和8.2 et 11.8Hz,1 H)；4.29(d,J=6.0Hz,2 H)；4.34(m,1 H)；4.41(m,1 H)；5.09(m,1 H)；5.79(dd,J=1.7和15.5Hz,1 H)；6.38(ddd,J=3.8,11.3和15.5Hz,1 H)；7.04(d,J=8.7Hz,1 H)；7.16(dd,J=2.2和8.7Hz,1 H)；7.25(m,4 H)；7.29(d,J=2.2Hz,1 H)；7.40(d,J=10.4Hz,1 H)；8.02(d,J=9.1Hz,1 H)；8.08(大d,J=7.7Hz,1 H)；8.39(d,J=8.2Hz,1 H)；8.45(t,J=6.0Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=441[M+2H]²⁺；m/z=879[M-H]^-；m/z=881[M+H]⁺；m/z=925[M-H+HCO₂H]^-；t_R=0.99min.

化合物42：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸

在氬氣下，在圓底燒瓶中，引入在DCM(10mL)中的化合物41(50mg,51.05μmol)，接著引入戊二酸酐(10.48mg,91.89μmol)。反應介質於室溫攪拌2h，濃縮並在10g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH/H₂O)上純化得到42mg的化合物42，為無色固體(82%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.80(s,9 H)；0.82(d,J=7.0Hz,3 H)；0.85(d,J=7.0Hz,3 H)；0.97(s,3 H)；1.02(d,J=7.0Hz,3 H)；1.04(s,3 H)；1.23(d,J=7.2Hz,3 H)；1.29(d,J=14.2Hz,1 H)；1.70(m,3 H)；1.81(m,1 H)；1.96(m,1 H)；2.18至2.25(m,5 H)；2.61(m,2 H)；2.83(d,J=13.0Hz,1 H)；2.93(dd,J=2.0和7.4Hz,1 H)；3.00(dd,J=3.1和14.5Hz,1 H)；3.29(dd,J=10.4和13.0Hz,1 H)；3.80(s,3 H)；3.89(d,J=2.0Hz,1 H)；4.16(m,2 H)；4,25至4.31(m,3 H)；4.42(m,1 H)；5.09(m,1 H)；5.79(dd, J=1.9和15.5Hz,1 H)；6.39(ddd,J=3.8,11.6 et 15.5Hz,1 H)；7.05(d,J=8.7Hz,1 H)；7.15(dd,J=2.1和8.7Hz,1 H)；7.23(m,4 H)；7.28(d,J=2.1Hz,1 H)；7.40(d,J=10.4Hz,1 H)；7.83(d,J=8.7Hz,1 H)；8.02(m,2 H)；8.35(t,J=6.1Hz,1 H)；8.39(d,J=8.0Hz,1 H)；12.04(寬峰m,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=498[M+2H]²⁺；m/z=993[M-H]^-；m/z=995[M+H]⁺；t_R=1.27min.

實例6：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，引入在DCM(5mL)中的化合物42(23mg,23.10μmol)，接著引入DSC(8.29mg,32.34μmol)和DIEA(5.63μL,32.34μmol)。反應介質於室溫攪拌2h。此後，添加2mg的DSC,1μL的DIEA和DCM(2mL)並於室溫攪拌1h。除去溶劑並且粗剩餘物藉由快速層析在10g的矽膠(梯度溶離DCM/iPrOH)上純化得到20mg的實例6，為無色固體(79%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.80(s,9 H)；0.82(d,J=7.0Hz,3 H)；0.85(d,J=7.0Hz,3 H)；0.97(s,3 H)；1.02(d,J=7.0Hz,3 H)；1.04(s,3 H)；1.23(d,J=7.2Hz,3 H)；1.30(d,J=14.2Hz,1 H)；1.70(dd,J=10.7和14.7Hz,1 H)；1.81(m,3 H)；1.97(m,1 H)；2.21至2.32(m,3 H)；2.61(m,2 H)；2.68(t,J=7.8Hz,2 H)；2.80(寬峰s,4 H)；2.83(d,J=13.0Hz,1 H)；2.94(dd,J=2.0 et 7.6Hz,1 H)；3.00(dd,J=3.4和14.9Hz,1 H)；3.28(dd,J=10.5和13.0Hz,1 H)；3.80(s,3 H)；3.88(d,J=2.0Hz,1 H)；4.16(m,2 H)；4.23至4.31(m,3 H)；4.42(m,1 H)；5.10(m,1 H)；5.79(dd,J=1.9 和15.3Hz,1 H)；6.39(ddd,J=3.8,11.4和15.3Hz,1 H)；7.05(d,J=8.8Hz,1 H)；7.16(dd,J=2.2和8.8Hz,1 H)；7.23(m,4 H)；7.28(d,J=2.2Hz,1 H)；7.40(d,J=10.5Hz,1 H)；7.89(d,J=8.7Hz,1 H)；8.02(d,J=9.1Hz,1 H)；8.06(d,J=7.5Hz,1 H)；8.34(t,J=6.1Hz,1 H)；8.39(d,J=8.1Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=546.5[M+2H]²⁺；m/z=1090[M-H]^-；m/z=1092[M+H]⁺；m/z=1136[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.34min.

實例7：mAb-Ex6

先前描述的一般方法用來製備實例7。60mg的hu2H11_R35-74與233μL的實例6在DMA(5當量)中的10.6mM溶液反應2h。在Superdex 200 pg上於DPBS pH 6.5+20% NMP中純化後，在Amicon Ultra-15上濃縮，在NAP-25上在緩衝液B pH 6.5+5% NMP中緩衝液交換並且在Steriflip過濾，得到39mg的實例7，為無色澄清溶液，濃度為1.98mg/mL，DAR為4.1(HRMS)，單體純度為100%和整體收率為66%。

SEC-HRMS：在圖2中完整ADC的光譜；m/z=149370(裸mAb)；m/z=150357(D1)；m/z=151330(D2)；m/z=152307(D3)；m/z=153285(D4)；m/z=154262(D5)；m/z=155238(D6)；m/z=156222(D7)。

合成實例8至10：7-Me-氮雜-C52的苄胺立體異構體1,戊二醯基-Val-Ala-7-Me-氮雜-C52苄胺立體異構體1的NHS酯和對應的ADC

化合物43：6-(3-氯-4-甲氧基苄基)-13-異丁基-2,2,9,10,10-五甲基-4,7,11-三側氧基-3-氧雜-5,8,12-三氮雜十四烷-14-酸(6R,13S)-(1E,3R,4S,6E)-1-(4-(疊氮基甲基)苯基)-8-(第三-丁氧基)-3-甲基-8-側氧基辛-1,6-二烯-4-基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，引入在DMF(5mL)中的片段BC2(1.10g,2.48mmol)，接著引入HATU(950mg,2.5mmol)和HOAt(340mg,2.5mmol)。混合物於室溫攪拌30min，然後添加片段AD1(1.24g,2.18mmol)和DIEA(1.2mL,6.87mmol)。黃色溶液於室溫攪拌16h，以H₂O淬滅並以AcOEt(3 x 30mL)萃取，有機層以H₂O、飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並在200g的矽膠(梯度溶離庚烷/AcOEt)上純化得到1.55g的化合物43，為白色蛋白霜(77%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：55/45非對映異構體混合物；0.82至0.89(m,6 H)；0.85(d,J=7.0Hz,1.65 H)；0.91(d,J=7.0Hz,1.35 H)；0.99至1.09(m,9 H)；1.30(s,9 H)；1.40(s,10 H)；1.50至1.70(m,2 H)；2.38至2.59(部分遮蔽的m,3 H)；2.68(m,1 H)；2.84(m,1 H)；3.79(s,1.35 H)；3.81(s,1.65 H)；4.00至4.18(m,2 H)；4.30(m,1 H)；4.40(寬峰s,2 H)；4.92(m,1 H)；5.81(d,J=15.7Hz,1 H)；6.18(dd,J=8.3和16.1Hz,1 H)；6.45(d,J=16.1Hz,1 H)；6.71(td,J=7.3和15.7Hz,1 H)；6.94(d,J=8.1Hz,0.45 H)；6.96(d,J=8.1Hz,0.55 H)；7.04(split d,J=8.7Hz,1 H)；7.19(寬峰d,J=8.7Hz,1 H)；7.30(d,J=7.8Hz,2 H)；7.32(寬峰s,1 H)；7.41(d,J=8.7Hz,2 H)；7.52(d,J=10.1Hz,0.45 H)；7.59(d,J=10.1Hz,0.55 H)；7.74(m,1 H).LCMS(A1)：55/45非對映異構體混合物；ES m/z=895[M+H]⁺；m/z=917[M+Na]⁺；t_R=6.94-6.98min.

化合物44 & 45：(3S,10R,16S,E)-16-((R,E)-4-(4-(疊氮基甲基)苯基)丁-3-烯-2-基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6,7-三甲基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮 化合物44 & 45分兩步得到。

步驟1：於0℃，在圓底燒瓶中，向化合物43(1.50g,1.67mmol)在11mL的DCM中的溶液添加TFA(2.6mL,34.65mmol)和100μL的H₂O。混合物於0℃攪拌15min並於室溫攪拌6.5h。反應介質然後真空蒸發並且在甲苯的存在下共蒸發，得到1.7g的脫保護的中間體，為橙色固體。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：55/45非對映異構體混合物；0.70至0.80(m,7.65 H)；0.90(s,1.35 H)；0.95(m,3 H)；1.01至1.09(m,6 H)；1.38至1.68(m,3 H)；2.40至2.60(部分遮蔽的m,3 H)；2.80至3.02(m,2 H)；3.81(s,1.35 H)；3.82(s,1.65 H)；3.96至4.08(m,1 H)；4.18(m,1 H)；4.28(m,1 H)；4.41(s,2 H)；4.91(m,1 H)；5.83(d,J=15.7Hz,0.45 H)；5.85(d,J=15.7Hz,0.55 H)；6.18(m,1 H)；6.43(d,J=16.1Hz,0.45 H)；6.46(d,J=16.1Hz,0.55 H)；6.74(m,1 H)；7.08至7.20(m,2 H)；7.30(掩蔽的m,0.45 H)；7.32(d,J=7.8Hz,2 H)；7.37(d,J=2.0Hz,0.55 H)；7.42(m,2 H)；7.76(d,J=8.00Hz,0.45 H)；7.79(d,J=8.00Hz,0.55 H)；7.86(d,J=10.1Hz,0.55 H)；8.00(d,J=10.1Hz,0.45 H)；8.11(寬峰m,3 H)；12.22(寬峰m,1 H).LCMS(A1)：55/45非對映異構體混合物；ES m/z=737[M-H]^-；m/z=739[M+H]⁺；t_R=1.07-1.09min.

步驟2：在圓底燒瓶中，向脫保護的中間體(1.43g,1.68mmol)在25mL的CH₃CN中添加DIEA(3mL,16.23mmol)、HOAt(250.91mg,1.84mmol)和HATU(700.91mg,1.84mmol)。混合物於室溫攪拌1h。然後除去溶劑，介質以AcOEt(200mL)稀釋，以0.5M檸檬酸和HCl中和。有機層經分離以飽和NaHSO₃、飽和NaHCO₃、飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並在100g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到640mg的化合物44 & 45，為黃色固體(53%)。

藉由對掌性液體層析分離C7處的非對映異構體，其在76.5 x 350mm柱(裝有1.1kg的10μm Whelk 01 SS(4-(3,5-二硝基苯甲醯胺基)四氫菲，Regis Technologies)上使用50：50庚烷/EtOH的等度梯度進行。濃縮後，得到210mg的化合物44(立體異構體1)，為白色固體(17%)並得到236mg的 化合物45(立體異構體2)，為白色固體(19%)。

化合物44(立體異構體1)：RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.60(d,J=6.7Hz,3 H)；0.62(d,J=6.7Hz,3 H)；0.98(s,3 H)；1.05(d,J=7.0Hz,3 H)；1.10(d,J=7.0Hz,3 H)；1.14(s,3 H)；1.18(m,1 H)；1.40至1.54(m,2 H)；2.24(m,1 H)；2.48至2.61(部分遮蔽的m,2 H)；2.65(dd,J=11.8和14.5Hz,1 H)；3.04(dd,J=3.2和14.5Hz,1 H)；3.55(m,1 H)；3.81(s,3 H)；4.19(m,2 H)；4.40(s,2 H)；4.96(m,1 H)；5.91(dd,J=1.4和15.5Hz,1 H)；6.13(dd,J=8.9和16.1Hz,1 H)；6.40(ddd,J=3.9,11.3和15.5Hz,1 H)；6.46(d,J=16.1Hz,1 H)；7.03(d,J=8.7Hz,1 H)；7.19(dd,J=2.1和8.7Hz,1 H)；7.30(d,J=2.1Hz,1 H)；7.32(d,J=8.4Hz,2 H)；7.41(d,J=8.4Hz,2 H)；7.87(d,J=8.9Hz,1 H)；8.36(d,J=9.9Hz,1 H)；8.40(d,J=8.0Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=719[M-H]^-；m/z=721[M+H]⁺；t_R=1.61min

化合物45(立體異構體2)：RMN ¹H(δ in ppm,DMSO-d6)：0.59(d,J=6.7Hz,3 H)；0.67(d,J=6.7Hz,3 H)；0.88(d,J=6.7Hz,3 H)；1.03(s,3 H)；1.10(d,J=7.0Hz,3 H)；1.19(s,3 H)；1.21(m,1 H)；1.49至1.60(m,2 H)；2.23(m,1 H)；2.46至2.61(部分遮蔽的m,2 H)；2.71(dd,J=11.3和14.5Hz,1 H)；2.98(dd,J=3.7和14.5Hz,1 H)；3.48(m,1 H)；3.80(s,3 H)；4.05(m,1 H)；4.11(ddd,J=3.7,7.6和11.3Hz,1 H)；4.40(s,2 H)；4.90(m,1 H)；5.93(d,J=15.7Hz,1 H)；6.14(dd,J=8.7和16.1Hz,1 H)；6.47(d,J=16.1Hz,1 H)；6.51(ddd,J=5.2,10.3和15.5Hz,1 H)；7.02(d,J=8.7Hz,1 H)；7.21(dd,J=2.4和8.7Hz,1 H)；7.31(d,J=8.4Hz,2 H)；7.37(d,J=2.4Hz,2 H)；7.41(d,J=8.4Hz,2 H)；7.87(d,J=6.9Hz,1 H)；7.89(d,J=9.0Hz,1 H)；8.51(d,J=7.6Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=719[M-H]^-；m/z=721[M+H]⁺；t_R=1.61min.

化合物46：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-(3-(4-(疊氮基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6,7-三甲基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

於0℃，在氬氣下，在圓底燒瓶中，向化合物44(154mg,213.51μmol)在DCM(10mL)中的溶液添加m-CPBA(80mg,324.51μmol)。反應介質於室溫攪拌5天。反應混合物以DCM(15mL)稀釋並與飽和NaHCO₃(6mL)和Na₂S₂O₃(6mL)攪拌15min。有機層經分離以飽和鹽水(2 x 3mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮得到150mg的化合物46，為白色固體(定量)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：60/40非對映異構體混合物；0.75(d,J=6.8Hz,1.8 H)；0.79(d,J=6.8Hz,3 H)；0.85(d,J=6.8Hz,1.2 H)；0.95至0.99(m,4.2 H)；1.02至1.09(m,4.8 H)；1.15(s,1.8 H)；1.18(s,1.2 H)；1.20(m,0.6 H)；1.38(m,0.4 H)；1.59至1.62(m,2 H)；1.80(m,0.6 H)；1.89(m,0.4 H)；2.25(m,0.6 H)；2.40至2.71(部分遮蔽的m,2.4 H)；2.96至3.08(m,2 H)；3.54(m,1 H)；3.80(s,3 H)；3.82(d,J=1.9Hz,0.4 H)；3.92(d,J=1.9Hz,0.6 H)；4.14至4.29(m,2 H)；4.40至4.50(m,2 H)；5.11(m,1 H)；5.85(dd,J=2.0和15.5Hz,0.6 H)；5.95(dd,J=2.0和15.5Hz,0.4 H)；6.38(m,1 H)；7.04(split d,J=8.8Hz,1 H)；7.16(dd,J=2.2和8.8Hz,0.6 H)；7.19(dd,J=2.2和8.8Hz,0.4 H)；7.28(d,J=2.2Hz,0.6 H)；7.30(d,J=2.2Hz,0.4 H)；7.30至7.40(m,4 H)；7.89(d,J=8.1Hz,0.6 H)；7.92(d,J=8.1Hz,0.4 H)；8.29(d,J=10.0Hz,0.6 H)H；8.32(d,J=8.1Hz,0.6 H)；8.35(d,J=10.0Hz,0.4 H)；8.40(d,J=8.1Hz,0.4 H).LCMS(A1)：ES m/z=735[M-H]^-；m/z=737[M+H]⁺；t_R=1.52min.

實例8：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-(3-(4-(胺基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6,7-三甲基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

於0℃，在圓底燒瓶中，向化合物46(60mg,81.38μmol)在DCM(3mL)和MeOH(3mL)中的溶液滴加TCEP(38.9mg,134.3μmol)在1mL的H₂O中的溶液。反應混合物於室溫攪拌35h，然後以DCM(15mL)和飽和NaHCO₃稀釋。攪拌10min後，有機層經分離以飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並在5g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到23mg的實例8，為白色固體(40%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：60/40非對映異構體混合物；0.77(d,J=7.0Hz,1.8 H)；0.81(split d,J=7.0Hz,3 H)；0.88(d,J=7.0Hz,1.4 H)；0.95(d,J=7.0Hz,1.2 H)；0.98(s,1.8 H)；1.00(s,1.2 H)；1.02至1.09(m,4.8 H)；1.17(s,1.8 H)；1.19(s,1.2 H)；1.22(m,0.6 H)；1.40(m,0.4 H)；1.51至1.64(m,2 H)；1.78(m,0.6 H)；1.89(m,0.4 H)；2.28(m,0.6 H)；2.40至2.71(部分遮蔽的m,2.4 H)；2.96(dd,J=2.2和7.5Hz,0.6 H)；2.99(dd,J=2.2和7.5Hz,0.4 H)；3.03(m,1 H)；3.55(m,1 H)；3.70(s,1.2 H)；3.72(s,1.8 H)；3.78(d,J=2.2Hz,0.4 H)；3.81(s,3 H)；3.88(d,J=2.2Hz,0.6 H)；4.12至4.30(m,2 H)；5.12(m,1 H)；5.84(dd,J=1.8和15.6Hz,0.6 H)；5.96(dd,J=1.8和15.6Hz,0.4 H)；6.39(m,1 H)；7.05(d,J=8.7Hz,1 H)；7.16至7.38(m,6 H)；7.90(d,J=8.1Hz,0.6 H)；7.93(d,J=8.1Hz,0.4 H)；8.28(d,J=10.0Hz,0.6 H)；8.32(d,J=8.1Hz,0.6 H)；8.37(d,J=10.0Hz,0.4 H)；8.41(d,J=8.1Hz,0.4 H).LCMS(A1)：ES m/z=709[M-H]^-；m/z=711[M+H]⁺；t_R=0.86min.

化合物47：(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-1-((4-(3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6,7-三甲基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，引入實例8(110mg,154.65μmol)和DMF(2 mL)，接著引入FmocValAla(90mg,219μmol),HOBt(30mg,222μmol),DCM(10mL)和EDC(35μl,197.52μmol)。溶液於室溫攪拌3h30，然後以H₂O(10mL)淬滅並以DCM(3 x 10mL)萃取。有機層經分離以飽和NaHCO₃、飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，在甲苯的存在下濃縮並在15g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到49mg的化合物47，為白色固體(46%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：60/40非對映異構體混合物；0.76(d,J=7.0Hz,1.8 H)；0.80(m,3 H)；0.82至0.89(m,6.4 H)；0.95(d,J=7.0Hz,1.2 H)；0.98(s,1.8 H)；1.00(s,1.2 H)；1.02至1.09(m,4.8 H)；1.17(s,1.8 H)；1.19(s,1.2 H)；1.20至1.32(m,3.6 H)；1.40(m,0.4 H)；1.51至1.63(m,2 H)；1.78(m,0.6 H)；1.85(m,0.4 H)；2.00(m,1 H)；2.27(m,0.6 H)；2.40至2.72(部分遮蔽的m,2.4 H)；2.96(m,1 H)；3.04(m,1 H)；3.55(m,1 H)；3.77(d,J=2.2Hz,0.4 H)；3.81(s,3 H)；3.88(d,J=2.2Hz,0.6 H)；3.90(m,1 H)；4.15至4.38(m,6 H)；5.12(m,1 H)；5.85(dd,J=1.8和15.6Hz,0.6 H)；5.95(dd,J=1.8和15.6Hz,0.4 H)；6.39(m,1 H)；7.05(split d,J=8.7Hz,1 H)；7.15至7.48(m,19 H)；7.73(t,J=8.1Hz,2 H)；7.90(d,J=8.1Hz,2.6 H)；7.92(d,J=8.1Hz,0.4 H)；8.05(d,J=8.1Hz,1 H)；8.25至8.45(m,3 H).LCMS(A1)：ES m/z=552[M+2H]²⁺；m/z=1103[M+H]⁺；m/z=1147[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.55-1.57min.

化合物48：(2S)-2-胺基-N-((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6,7-三甲基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-3-甲基丁醯胺

在圓底燒瓶中，哌啶(60μL,600.6μmol)添加至化合物47(50mg,45.30μmol)在DCM(5mL)中的溶液。所得混合物於室溫攪拌24h，真空濃縮並在5g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到70mg的α-和β-環氧化物。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：60/40非對映異構體混合物；0.75(d,J=7.0Hz,1.8 H)；0.80(m,3 H)；0.82至0.92(m,6.4 H)；0.96(d,J=7.0Hz,1.2 H)；0.98(s,1.8 H)；1.00(s,1.2 H)；1.02至1.09(m,4.8 H)；1.15(s,1.8 H)；1.19(s,1.2 H)；1.20至1.42(m,4 H)；1.50至1.70(掩蔽的m,2 H)；1.78(m,0.6 H)；1.85(m,0.4 H)；2.00(m,1 H)；2.25(m,0.6 H)；2.40至2.72(部分遮蔽的m,2.4 H)；2.92至3.08(m,3 H)；3.54(m,1 H)；3.79(d,J=2.1Hz,0.4 H)；3.81(s,3 H)；3.88(d,J=2.1Hz,0.6 H)；4.13至4.41(m,6 H)；5.12(m,1 H)；5.85(d,J=15.4Hz,0.6 H)；5.93(d,J=15.4Hz,0.4 H);6.38(m,1 H)；7.05(d,J=8.7Hz,1 H)；7.15至7.32(m,6 H)；7.90(d,J=8.3Hz,0.6 H)；7.93(d,J=8.3Hz,0.4 H)；8.10至8.55(m,7 H).LCMS(A1)：ES m/z=441[M+2H]²⁺；m/z=879[M-H]^-；m/z=881[M+H]⁺；m/z=925[M-H+HCO₂H]^-；t_R=0.92min.

α-和β-環氧化物藉由對掌性液體層析分離，其在76 x 350mm柱(裝有1.1kg的10μm Chiralpak AD(直鏈澱粉三-3,5-二甲基苯基胺基甲酸酯，塗覆在矽膠支承體上，Chiral Technologies Europe))上使用70：30庚烷/EtOH的等度溶離進行。濃縮後，得到28mg的化合物48，為白色固體(70%)並得到19mg的α-環氧化物，為白色固體。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.75(d,J=7.0Hz,6 H)；0.80(d,J=7.0Hz,3 H)；0.88(d,J=7.0Hz,3 H)；0.98(s,3 H)；1.03(d,J=7.0Hz,6 H)；1.17(s,3 H)；1.23(d,J=7.0Hz,3 H)；1.35(m,1 H)；1.50至1.68(m,2 H)；1.78(m,1 H)；1.91(m,1 H)；2.26(m,1 H)；2.58至2.70(m,2 H)；2.96(dd,J=1.9和7.7Hz,1 H)；2.99(d,J=4.8Hz,1 H)；3.02(dd,J=3.3和14.8Hz,1 H)；3.53(m,1 H)；3.80(s,3 H)；3.89(d,J=1.9Hz,1 H)；4.10至4.23(m,3 H)；4.28(d,J=6.1Hz,2 H)；4.35(m,1 H)；5.11(m,1 H)；5.83(dd, J=1.9和15.2Hz,1 H)；6.37(ddd,J=4.0,11.2和15.2Hz,1 H)；7.03(d,J=8.8Hz,1 H)；7.18(dd,J=2.4和8.8Hz,1 H)；7.26(s,4 H)；7.29(d,J=2.4Hz,1 H)；7.90(d,J=8.2Hz,1 H)；8.08(寬峰d,J=7.7Hz,1 H)；8.29(d,J=10.1Hz,1 H)；8.33(d,J=8.2Hz,1 H)；8.46(t,J=6.7Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=441[M+2H]²⁺；m/z=879[M-H]^-；m/z=881[M+H]⁺；m/z=925[M-H+HCO₂H]^-；t_R=0.92min.

化合物49：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6,7-三甲基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸

在氬氣下，在圓底燒瓶中，將戊二酸酐(3.78mg,32.44μmol)DCM(4mL)中的溶液添加至化合物48(26mg,29.5μmol)在DCM(9mL)中的溶液。所得混合物於室溫攪拌2h，真空濃縮並在2.5g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH/H₂O)上純化得到18mg的化合物49，為白色固體(61%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.78(d,J=7.0Hz,3 H)；0.80(d,J=7.0Hz,3 H)；0.82(d,J=7.0Hz,3 H)；0.84(d,J=7.0Hz,3 H)；0.97(s,3 H)；1.03(d,J=7.0Hz,6 H)；1.15(s,3 H)；1.23(寬峰d,J=7.0Hz,4 H)；1.49至1.61(m,2 H)；1.70(m,2 H)；1.78(m,1 H)；1.97(m,1 H)；2.20(m,4 H)；2.25(m,1 H)；2.62(m,2 H)；2.95(m,1 H)；3.02(m,1 H)；3.53(m,1 H)；3.80(s,3 H)；3.88(s,1 H)；4.10至4.22(m,3 H)；4.24至4.31(m,3 H)；5.11(m,1 H)；5.83(d,J=15.7Hz,1 H)；6.36(m,1 H)；7.03(d,J=8.7Hz,1 H)；7.19(寬峰d,J=8.7Hz,1 H)；7.23(m,4 H)；7.29(寬峰s,1 H)；7.87(d,J=8.9Hz,1 H)；7.90(d,J=8.1Hz,1 H)；8.06(d large,J=7.3Hz,1 H)；8.29(d,J=10.1Hz,1 H)；8.37(m,2 H)；12.0(寬峰m,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=993[M-H]^-；m/z=995[M+H]⁺；t_R=1.21min.

實例9：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6,7-三甲基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向化合物49(15mg,15.07μmol)在DCM(5mL)中的溶液添加DSC(5.63mg,21.09μmol)和DIEA(3.56μL,21.09μmol)。所得混合物於室溫攪拌1h，真空濃縮並在2.5g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到7.7mg的實例9，為白色固體(47%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.78(d,J=6.7Hz,3 H)；0.80(d,J=6.7Hz,3 H)；0.82(d,J=7.0Hz,3 H)；0.85(d,J=7.0Hz,3 H)；0.99(s,3 H)；1.04(d,J=7.2Hz,6 H)；1.18(s,3 H)；1.26(m,4 H)；1.57(m,2 H)；1.79(m,1 H)；1.83(m,2 H)；1.99(m,1 H)；2.22至2.33(m,3 H)；2.60 à 2.71(m,4 H)；2.82(s,4 H)；2.97(dd,J=2.1和7.7Hz,1 H)；3.04(dd,J=3.4和14.7Hz,1 H)；3.55(m,1 H)；3.81(s,3 H)；3.89(d,J=2.1Hz,1 H)；4.19(m,3 H)；4.26至4.34(m,3 H)；5.12(m,1 H)；5.86(dd,J=2.0和15.7Hz,1 H)；6.38(ddd,J=3.8,11.2和15.7Hz,1 H)；7.05(d,J=8.7Hz,1 H)；7.19(dd,J=2.2和8.7Hz,1 H)；7.26(m,4 H)；7.29(d,J=2.2Hz,1 H)；7.91(m,2 H)；8.09(m,1 H)；8.29(d,J=9.9Hz,1 H)；8.35(m,2 H).LCMS(A1)：ES m/z=1092[M+H]⁺；m/z=1136[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.26min.

實例10：mAb-Ex9

先前描述的一般方法用來製備實例10。60mg的hu2H11_R35-74與198μL的實例9在DMA(5eq.)中的10.78mM溶液反應2h。此時，添加120μL的實例9(3當量)的溶液並且介質攪拌2h。在Superdex 200pg上於DPBS pH 6.5+20% NMP中純化後，在Amicon Ultra-15上濃縮，在PD-10上於緩衝液B pH 6.5+5% NMP中緩衝液交換並且在Steriflip上過濾，得到46mg的實例10，為無色澄清溶液，濃度為2.23mg/mL，DAR為4.7(HRMS)，單體純度為99.2%且整體收率為78%。

SEC-HRMS：圖3中完整ADC的光譜；m/z=150345(D1)；m/z=151319(D2)；m/z=152297(D3)；m/z=153274(D4)；m/z=154251(D5)；m/z=155222(D6)；m/z=156202(D7)；m/z=157183(D8)。

合成實例11至14：3-(S)-新戊基-7-Me-氮雜-C52的苄胺立體異構體1，戊二醯基-Val-Ala-3-(S)-新戊基-7-Me-氮雜-C52苄胺立體異構體1的NHS酯和對應的ADC

化合物50：(6R,13S)-(1E,3R,4S,6E)-8-(第三-丁氧基)-1-(4-(羥基甲基)苯基)-3- 甲基-8-側氧基辛-1,6-二烯-4-基6-(3-氯-4-甲氧基苄基)-2,2,9,10,10-五甲基-13-新戊基-4,7,11-三側氧基-3-氧雜-5,8,12-三氮雜十四烷-14-酸酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向片段BC2(742mg,1.68mmol)在DMF(20mL)中的溶液添加HATU(716mg,1.83mmol)和HOAt(251mg,1.83mmol)。混合物於室溫攪拌30min。然後添加在DMF(10mL)中的片段AD1(730mg,1.59mmol)和DIEA(981μL,5.56mmol)。反應介質於室溫攪拌24h。此後，反應介質以冰稀釋(200g)，以AcOEt(4 x 200mL)萃取。有機層以H₂O(80mL)、飽和鹽水(2 x 80mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並藉由兩個連續的快速層析純化，第一個在300g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上且第二個在70g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上得到428mg的化合物50，為無色泡沫(30%)。

化合物51：(2E,5S,6R,7E)-5-(((2S)-2-(3-((R)-2-胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙醯胺基)-2,2-二甲基丁醯胺基)-4,4-二甲基戊醯基)氧基)-8-(4-(羥基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸

在圓底燒瓶中，引入化合物50(428mg,483.87μmol)和DCM(27mL)。溶液於0℃冷卻然後添加TFA(8mL,106.62mmol)。混合物於室溫攪拌1.5h。除去溶劑並在加壓下於甲苯(3 x 100mL)共蒸發。粗制油狀物以1：1AcOEt/H₂O(75mL)稀釋並以2M NaOH(250μL)中和直至pH 6-7。混合物於室溫攪拌6h。分離各層，水層以AcOEt(3 x 50mL)萃取。有機層以飽和鹽水洗滌(2 x 15mL)，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮得到374mg的化合物51，為無色泡沫(定量)。

化合物52：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((R,E)-4-(4-(羥基甲基)-苯基)丁-3-烯-2-基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向化合物51(352mg,483.31μmol)在CH₃CN (60mL)中的溶液添加HATU(208mg,531.64mmol)、HOAt(73.09mg,531.64μmol)和DIEA(244.52μL，1.45mmol)。反應介質於室溫攪拌45min。此後，反應介質以0.5N檸檬酸中和至pH 4，部分真空濃縮並以AcOEt(150mI)萃取。有機層以飽和NaHCO₃(10mL)、飽和鹽水(3 x 10mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並藉由快速層析在15g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到188mg的化合物52，為無色泡沫(54%)。

化合物53：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-16-((R,E)-4-(4-(((三異丙基甲矽烷基)氧基)甲基)苯基)丁-3-烯-2-基)-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

於0℃，在氬氣下，在圓底燒瓶中，向化合物52(188mg,264.68μmol)在DCM(7mL)中的溶液添加1H-咪唑(83.72mg,1.2mmol)和1M氯三異丙基矽烷(134.15μl)。反應介質於室溫攪拌5h，然後以飽和NH₄Cl淬滅並攪拌15min。分離各層，水層以DCM(3 x 25mL)萃取。有機層以1M NaHSO₄(10mL)、飽和NaHCO₃(10mL)、飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並藉由快速層析在10g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到137mg的化合物53，為無色泡沫(59%)。

實例11：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(羥基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮 實例11分兩步製備。

步驟1：於0℃，在氬氣下，在圓底燒瓶中，向化合物53(137mg,158.08μmol)在DCM(5.5mL)中的溶液添加m-CPBA(50.66mg,205.51μmol)在DCM(2mL)中的溶液並且反應介質攪拌2h。然後在攪拌2h後兩次添加39mg的m-CPBA。攪拌16h後，混合物以飽和NaHCO₃(30mL)和Na₂S₂O₃(30mL)淬滅，攪拌15min並用DCM(40mL)稀釋。分離各層。水層以DCM(2 x 20mL)萃取。有機層以飽和鹽水洗滌(2 x 8mL)，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮得到160mg的α-和β-環氧化物，為無色固體(定量)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：60/40非對映異構體混合物；0.80至0.91(m,12 H)；0.97至1.09(m,24 H)；1.12至1.21(m,6 H)；1.32(d,J=14.7Hz,0.6 H)；1.40(d,J=14.7Hz,0.4 H)；1.70至1.87(m,1 H)；1.90(dd,J=10.1和14.7Hz,0.4 H)；1.97(dd,J=10.1和14.7Hz,0.6 H)；2.28(m,0.6 H)；2.40(m,0.4 H)；2.55至2.79(m,2 H)；2.90至3.00(m,2 H)；3.44(m,1 H)；3.79(d,J=2.1Hz,0.4 H)；3.80(s,3 H)；3.90(d,J=2.1Hz,0.6 H)；4.03至4.22(m,2 H)；4.78(s,0.8 H)；4.80(s,1.2 H)；5.03(m,1 H)；5.90(dd,J=1.5和15.5Hz,0.6 H)；5.99(dd,J=1.5和15.5Hz,0.4 H)；6.40至6.55(m,1 H)；7.02至7.07(m,1 H)；7.13至7.38(m,6 H)；7.85至7.93(m,2 H)；8.40(d,J=7.3Hz,0.6 H)；8.51(d,J=7.3Hz,0.4 H).LCMS(A1)：ES m/z=880[M-H]^-；m/z=882[M+H]⁺；m/z=926[M-H+HCO₂H]^-；t_R=2.05-2.06min.

步驟2：於0℃在氬氣下，在圓底燒瓶中，向α-和β-環氧化物(177mg,200.53μmol)在THF(7.5mL)中的溶液滴加1M TBAF(221μL,221μmol)。於室溫攪拌2h後，添加50μL的TBAF並攪拌3.5h。反應介質以H₂O(9mL)稀釋，攪拌10min並以DCM萃取(3 x 25mL)。合併的有機層以飽和鹽水(3 x 8mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮得到210mg的α-和β-環氧化物，為無色固體(定量)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：60/40非對映異構體混合物；0.82至1.25(m,21 H)；1.32(d,J=14.5Hz,0.6 H)；1.42(d,J=14.5Hz,0.4 H)；1.80(m,1 H)；1.91(dd,J=10.0和14.5Hz,0.4 H)；1.98(dd,J=10.0和14.5Hz,0.6 H)；2.22至2.48(m,1 H)；2.55至2.78(m,2 H)；2.89至3.03(m,2 H)；3.44(m,1 H)；3.79(d,J=2.2Hz,0.4 H)；3.80(s,3 H)；3.90(d,J=2.2Hz,0.6 H)；4.04至4.22(m,2 H)；4.48(d,J=5.8Hz,0.8 H)；4.50(d,J=5.8Hz,1.2 H)；5.03(m,1 H)；5.16(t,J=5.8Hz,0.4 H)；5.19(t,J=5.8Hz,0.6 H)；5.89(dd,J=1.9和15.6Hz,0.6 H)；5.99(dd,J=1.9和15.6Hz,0.4 H)；6.40至6.52(m,1 H)；7.02(d,J=8.7Hz,0.6 H)；7.04(d,J=8.7Hz,0.4 H)；7.16至7.37(m,6 H)；7.83至7.94(m,2 H)；8.39(d,J=7.4Hz,0.6 H)；8.50(d,J=7.4Hz,0.4 H).LCMS(A1)：ES m/z=724[M-H]^-；m/z=726[M+H]⁺；t_R=1.29min.

α-和β-環氧化物藉由對掌性液體層析分離，其在76 x 350mm柱(裝有1.1kg的10μm Chiralpak AD(直鏈澱粉三-3,5-二甲基苯基胺基甲酸酯，塗覆在矽膠支承體上，Chiral Technologies Europe))上使用75：25庚烷/EtOH的等度溶離進行。濃縮後，得到66mg的實例11，為白色固體(45%)和得到45mg的α-環氧化物，為白色固體(31%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.82至0.89(m,12 H)；0.99(s,3 H)；1.03(d,J=6.9Hz,3 H)；1.19(s,3 H)；1.34(d,J=14.6Hz,1 H)；1.80(m,1 H)；1.98(dd,J=10.1和14.6Hz,1 H)；2.26(m,1 H)；2.61(m,1 H)；2.69(dd,J=11.1和14.6Hz,1 H)；2.91(dd,J=2.1和7.8Hz,1 H)；2.94(dd,J=3.7和14.6Hz,1 H)；3.42(m,1 H)；3.80(s,3 H)；3.91(d,J=2.1Hz,1 H)；4.03至4.14(m,2 H)；4.50(d,J=5.8Hz,2 H)；5.03(m,1 H)；5.19(t,J=5.8Hz,1 H)；5.89(dd,J=2.1和15.5Hz,1 H)；6.43(ddd,J=4.7,10.9和15.5Hz,1 H)；7.03(d,J=8.7Hz,1 H)；7.20(dd,J=2.3和8.7Hz,1 H)；7.23(d,J=8.4Hz,2 H)；7.30(d,J=2.3Hz,1 H)；7.33(d,J=8.4Hz,2 H)；7.86(d,J=8.4Hz,1 H)；7.92(d,J=7.1Hz,1 H)；8.39(d,J=9.1Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=724[M-H]^-；m/z=726[M+H]⁺；t_R=1.29min.

化合物54：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(疊氮基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向實例11(66mg,90.87μmol)在THF(5mL) 中的溶液於0℃添加DPPA(100.23μl,454.36μmol)和DBU(69.27μl,454.36μmol)。溶液於室溫攪拌5h，然後以H₂O稀釋並以AcOEt(2 x 15mL)萃取。有機層經分離以飽和鹽水(2 x 5mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並在15g的矽膠(梯度溶離DCM/iPrOH)上純化得到64mg的化合物54，為無色固體(94%)。

實例12：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(胺基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-稀-2,5,9,12-四酮

在圓底燒瓶中，向化合物54(64mg,85.18μmol)在DCM(3mL),MeOH(3mL)和H₂O(400μL)中的溶液添加TCEP(26.86mg,93.70μmol)。反應介質於室溫攪拌24h。反應混合物以DCM(15mL)和飽和NaHCO₃，稀釋，攪拌10min並以DCM萃取(3 x 15mL)。合併的有機層以飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，濃縮並藉由快速層析在4.5g的胺基-丙基修飾的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到42mg的實例12，為白色固體(68%)。

化合物55：((2S)-1-(((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，引入實例12(42mg,57.91μmol)和DMF(1mL)，接著引入FmocValAla(34.44mg,86.86μmol)、HOBt(13.20mg,93.81μmol)、DCM(10mL)和EDC(10.36μl,57.91μmol)。反應介質於室溫攪拌3h，並且然後以H₂O(15mL)稀釋，於室溫攪拌10min並以DCM萃取(3 x 20mL)。合併的有機層經MgSO₄乾燥，過濾並濃縮得到83mg的化合物55，為白色固體(定量)。

化合物56：(2S)-2-胺基-N-((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1S)-1- ((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-3-甲基丁醯胺

在圓底燒瓶中，將哌啶(57.8μL,579.10μmol)添加至化合物55(64.73mg,57.91μmol)在DCM(10mL)中的溶液中。攪拌5h後，添加57.8μL的哌啶並且介質於室溫攪拌過夜。反應介質經真空濃縮並在15g的矽膠(梯度DCM/MeOH/H₂O)上純化得到30mg的化合物56，為無色固體(58%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.86(d,J=7.0Hz,3 H)；0.82至0.90(m,15 H)；1.00(s,3 H)；1.03(d,J=7.0Hz,3 H)；1.19(s,3 H)；1.24(d,J=7.0Hz,3 H)；1.34(d,J=14.6Hz,1 H)；1.66(寬峰m,2 H)；1.80(m,1 H)；1.91(m,1 H)；1.98(dd,J=10.2和14.6Hz,1 H)；2.27(m,1 H)；2.60(m,1 H)；2.69(dd,J=11.1和14.6Hz,1 H)；2.91(dd,J=2.0和7.7Hz,1 H)；2.94(dd,J=3.7和14.6Hz,1 H)；2.99(d,J=4.9Hz,1 H)；3.43(m,1 H)；3.80(s,3 H)；3.91(d,J=2.0Hz,1 H)；4.03至4.12(m,2 H)；4.29(d,J=6.2Hz,2 H)；4.34(m,1 H)；5.03(m,1 H)；5.89(dd,J=1.8和15.6Hz,1 H)；6.43(ddd,J=4.8,10.9和15.6Hz,1 H)；7.02(d,J=8.6Hz,1 H)；7.20(dd,J=2.2和8.6Hz,1 H)；7.22(d,J=8.4Hz,2 H)；7.26(d,J=8.4Hz,2 H)；7.32(d,J=2.2Hz,1 H)；7.86(d,J=8.4Hz,1 H)；7.92(d,J=7.2Hz,1 H)；8.07(寬峰d,J=7.9Hz,1 H)；8.40(d,J=7.3Hz,1 H)；8.45(t,J=6.2Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=448[M+2H]²⁺；m/z=893[M-H]^-；m/z=895[M+H]⁺；m/z=939[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.29min.

化合物57：5-(((2S)-1-(((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸

在氬氣下，在圓底燒瓶中，將戊二酸酐(4.29mg,36.85μmol)在DCM(2mL)中的溶液添加至化合物56(30mg,33.5μmol)在DCM(6mL)中的溶液。反應介質於室溫攪拌2h，部分真空濃縮並在2.5g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH/H₂O)上純化得到34mg的化合物57，為無色漆狀物(定量)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.80至0.89(m,18 H)；0.99(s,3 H)；1.03(d,J=7.0Hz,3 H)；1.19(s,3 H)；1.24(d,J=7.0Hz,3 H)；1.34(d,J=14.6Hz,1 H)；1.70(m,2 H)；1.80(m,1 H)；1.97(m,2 H)；2.19(m,4 H)；2.26(m,1 H)；2.60(m,1 H)；2.70(dd,J=11.2和14.6Hz,1 H)；2.90(dd,J=2.2和7.8Hz,1 H)；2.95(dd,J=3.7和14.6Hz,1 H)；3.43(m,1 H)；3.80(s,3 H)；3.91(d,J=2.2Hz,1 H)；4.03至4.18(m,3 H)；4.22至4.33(m,3 H)；5.03(m,1 H)；5.90(d,J=15.5Hz,1 H)；6.43(ddd,J=4.9,11.0和15.5Hz,1 H)；7.02(d,J=8.6Hz,1 H)；7.19至7.28(m,5 H)；7.32(d,J=2.2Hz,1 H)；7.85(寬峰d,J=8.9Hz,2 H)；7.91(d,J=7.2Hz,1 H)；8.06(寬峰d,J=7.5Hz,1 H)；8.36(寬峰t,J=6.6Hz,1 H)；8.42(d,J=7.8Hz,1 H)；12.10(寬峰m,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=1007[M-H]^-；m/z=1009[M+H]⁺；t_R=1.21min.

實例13：5-(((2S)-1-(((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯

在氬氣下，在圓底燒瓶中，向化合物57(33mg,32.69μmol)在DCM(8mL)中的溶液添加DSC(11.72mg,45.76μmol)和DIEA(7.7μL,45.76μmol)。反應介質於室溫攪拌1h，真空濃縮並藉由兩個連續的快速層析在2.5g的矽膠(梯度溶離DCM/iPrOH)上純化得到17.9mg的實例13，為無色固體(49%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.80至0.90(m,18 H)；1.00(s,3 H)；1.04(d,J=7.0Hz,3 H)；1.19(s,3 H)；1.24(d,J=7.0Hz,3 H)；1.34(d,J=14.6Hz,1 H)；1.80(m,1 H)；1.83(m,2 H)；1.98(m,2 H)；2.26(m,1 H)；2.29(m,2 H)；2.60(m,1 H)；2.68(t,J=7.5Hz,2 H)；2.70(dd,J=11.2和14.6Hz,1 H)；2.80(s,4 H)；2.91(dd,J=2.2和7.6Hz,1 H)；2.95(dd,J=3.7和14.6Hz,1 H)；3.43(m,1 H)；3.80(s,3 H)；3.90(d,J=2.2Hz,1 H)；4.06至4.15(m,2 H)；4.18(dd,J=6.9和8.7Hz,1 H)；4.21至4.33(m,3 H)；5.03(m,1 H)；5.89(d,J=15.5Hz,1 H)；6.43(ddd,J=4.9,10.9和15.5Hz,1 H)；7.02(d,J=8.7Hz,1 H)；7.20(dd,J=2.3和8.7Hz,1 H)；7.23(d,J=8.4Hz,2 H)；7.25(d,J=8.4Hz,2 H)；7.31(d,J=2.3Hz,1 H)；7.84(d,J=8.6Hz,1 H)；7.89(m,2 H)；8.04(d,J=7.5Hz,1 H)；8.33(t,J=6.5Hz,1 H)；8.39(d,J=7.6Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=796；m/z=1104[M-H]^-；m/z=1106[M+H]⁺；m/z=1150[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.26min.

實例14：mAb-Ex13

先前描述的一般方法用來製備實例14。60mg的hu2H11_R35-74與200μL的實例13在DMA(5eq.)中的10.05mM溶液反應2h。此時，添加180μL的實例13(4.5當量)的溶液並且介質攪拌2h。在Superdex 200pg上在緩衝液B pH 6.5+10% NMP中純化後，在Amicon Ultra-15上濃縮，在PD-10上在緩衝液B pH 6.5+5% NMP中緩衝液交換並在Steriflip過濾，得到46mg的實例14，為無色澄清溶液濃度為2mg/mL，DAR為3.5(HRMS)，單體純度為99.7%且整體收率為77%。

SEC-HRMS：圖4中完整ADC的光譜；m/z=149336(裸mAb)；m/z=150328(D1)；m/z=151319(D2)；m/z=152311(D3)；m/z=153302(D4)；m/z=154295(D5)；m/z=155290(D6)；m/z=156282(D7)。

實例15：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((S)-1-(3-(4-(羥基-甲基) 苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-3,6,6-三甲基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

實例15根據在流程2中描繪的並對於實例4和11所描述的一般途徑B進行製備。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：65/35非對映異構體混合物；0.93至1.26(m,12 H)；1.75(m,0.65 H)；1.83(m,0.35 H)；2.22(m,0.65 H)；2.41(m,0.35 H)；2.55至2.70(m,2 H)；2.81(d,J=13.7Hz,0.65 H)；2.88(d,J=13.7Hz,0.35 H)；2.93(dd,J=2.1和8.2Hz,0.65 H)；3.00(m,1.35 H)；3.22至3.35(部分遮蔽的m,1 H)；3.77(d,J=2.1Hz,0.35 H)；3.81(s,3 H)；3.88(d,J=2.1Hz,0.65 H)；4.25至4.39(m,1.65 H)；4.34(m,0.35 H)；4.48(d,J=6.0Hz,0.7 H)；4.50(d,J=6.0Hz,1.3 H)；5.08(m,1 H)；5.17(t,J=6.0Hz,0.35 H)；5.20(t,J=6.0Hz,0.65 H)；5.78(dd,J=1.9和15.5Hz,0.65 H)；5.89(dd,J=1.9和15.5Hz,0.35 H)；6.40(m,1 H)；7.04(d,J=8.7Hz,1 H)；7.16(dd,J=2.2和8.7Hz,0.65 H)；7.19(dd,J=2.2和8.7Hz,0.35 H)；7.20至7.34(m,5 H)；7.58(寬峰d,J=10.2Hz,0.65 H)；7.64(寬峰d,J=10.2Hz,0.35 H)；8.00(d,J=8.4Hz,0.65 H)；8.07(d,J=8.4Hz,0.35 H)；8.35(d,J=8.3Hz,0.65 H)；8.44(d,J=8.3Hz,0.35 H).LCMS(A1)：ES m/z=654[M-H]^-；m/z=656[M+H]⁺；t_R=1.06min.

實例16：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((S)-1-(3-(4-(羥基-甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-6,6-二甲基-3-異丙基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

實例16根據在流程2中描繪的並對於實例4和11所描述的一般途徑B進行製備。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：60/40非對映異構體混合物；0.72(d,J=7.0Hz,1.8 H)；0.82(d,J=7.0Hz,1.2 H)；0.84(d,J=7.0Hz,1.8 H)；0.87(d,J=7.0Hz,1.2 H)；0.98(s,1.8 H)；0.99(d,J=7.0Hz,1.8 H)；1.01(s,1.2 H)；1.05(d,J=7.0Hz,1.2 H)；1.09(s,1.8 H)；1.11(s,1.2 H)；1.82(m,1 H)；1.91(m,0.6 H)；2.01(m,0.4 H)；2.30(m,1 H)；2.52至2.72(m,2 H)；2.88至3.04(m,3 H)；3.25至3.35(掩蔽的m,1 H)；3.79(d,J=2.2Hz,0.4 H)；3.80(s,3 H)；3.88(d,J=2.2Hz,0.6 H)；4.09至4.21(m,2 H)；4.48(d,J=5.8Hz,0.8 H)；4.50(d,J=5.8Hz,1.2 H)；5.14至5.29(m,2 H)；5.79(dd,J=1.7和15.4Hz,0.6 H)；5.90(dd,J=1.7和15.4Hz,0.4 H)；6.40至6.52(m,1 H)；7.05(d,J=8.7Hz,1 H)；7.10(dd,J=2.0和10.2Hz,1 H)；7.17(m,1 H)；7.21至7.35(m,5 H)；7.70(d,J=9.3Hz,0.6 H)；7.80(d,J=9.3Hz,0.4 H)；8.39(d,J=8.0Hz,0.6 H)；8.44(d,J=8.0Hz,0.4 H).LCMS(A1)：ES m/z=682[M-H]^-；m/z=684[M+H]⁺；t_R=1.16min.

實例17：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((S)-1-(3-(4-(羥基-甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-3-第三丁基-6,6-二甲基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

實例17根據在流程2中描繪的並對於實例4和11所描述的一般途徑B進行製備。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：50/50非對映異構體混合物；0.90(s,4.5 H)；0.91(s,4.5 H)；1.00(d,J=7.0Hz,1.5 H)；1.03(s,1.5 H)；1.05(s,1.5 H)；1.06(d,J=7.0Hz,1.5 H)；1.10(s,1.5 H)；1.12(s,1.5 H)；1.85(m,1H)；2.32(m,1H)；2.55至2.72(m,2 H)；2.90至3.03(m,3 H)；3.25至3.35(掩蔽的m,1 H)；3.81(s,3 H)；3.90(d,J=2.2Hz,1 H)；4.15(m,1 H)；4.36(d,J=10.0Hz,0.5 H)；4.43(d,J=10.0Hz,0.5 H)；4.49(d,J=5.9Hz,1 H)；4.51(d,J=5.9Hz,1 H)；5.15(t,J=5.9Hz,0,5 H)；5.18(t,J=5.9Hz,0.5 H)；5.29(m,1 H)；5.79(dd,J=2.0和15.4Hz,0.5 H)；5.90(d,J=15.4Hz,0.5 H)；6.39(m,1 H)；6.91(dd,J=2.5和10.4Hz,0.5 H)；6.98(dd,J=2.5和10.4Hz,0.5 H)；7.05(split d,J=8.7Hz,1 H)；7.15(split dd,J=2.4和8.7Hz,1 H)；7.20至7.39(m,6 H)；8.32(d,J=7.9Hz,0.5 H)；8.40(d,J=7.9Hz,0.5 H).LCMS(A4)：ES m/z=696[M-H]^-；m/z=698[M+H]⁺；t_R=4.13-4.16min.

實例18：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(胺基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6,7-三甲基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

實例18根據在流程1中描繪的並對於實例8描述的一般途徑A製備。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.78(d,J=7.0Hz,3 H)；0.84(d,J=7.0Hz,3 H)；0.87(d,J=7.0Hz,3 H)；1.00(s,3 H)；1.03(d,J=7.0Hz,3 H)；1.19(s,3 H)；1.30(m,1 H)；1.50至1.90(m,5 H)；2.28(m,1 H)；2.55至2.76(m,2 H)；2.90至3.00(m,2 H)；3.48(m,1 H)；3.70(s,2 H)；3.80(s,3 H)；3.89(s,1 H)；4.02至4.15(m,2 H)；5.06(m,1 H)；5.88(d,J=15.5Hz,1 H)；6.47(m,1 H)；7.03(d,J=8.7Hz,1 H)；7.20(m,3 H)；7.31(m,3 H)；7.80(d,J=8.7Hz,1 H)；7.89(d,J=7.3Hz,1 H)；8.41(d,J=8.2Hz,1 H).

實例19：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-異丁基-6,6,7-三甲基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯

實例19如在流程3中描繪的以及對於實例2,6,9和13所描述的製備。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.79(d,J=7.0Hz,3 H)；0.81至0.89(m,18 H)；1.01(s,3 H)；1.03(d,J=7.0Hz,3 H)；1.20(s,3 H)；1.24(d,J=7.0Hz,3 H)；1.31(m,1 H)；1.60至1.74(m,2 H)；1.78至1.86(m,3 H)；1.96(m,1 H)；2.21至2.31(m,3 H)；2.55至2.72(m,4 H)；2.80(s,4 H)；2.96(m,2 H)；3.47(m,1 H)；3.80(s,3 H)；3.89(d,J=2.2Hz,1 H)；4.03至4.14(m,2 H)；4.17(dd,J=6.8和8.6Hz,1 H)；4.21至4.33(m,3 H)；5.06(m,1 H)； 5.89(d,J=15.5Hz,1 H)；6.47(ddd,J=5.2,10.5和15.5Hz,1 H)；7.02(d,J=8.7Hz,1 H)；7.20(dd,J=2.3和8.7Hz,1 H)；7.23(m,4 H)；7.32(d,J=2.3Hz,1 H)；7.80(d,J=8.3Hz,1 H)；7.89(m,2 H)；8.04(d,J=7.6Hz,1 H)；8.32(t,J=6.3Hz,1 H)；8.42(d,J=7.6Hz,1 H).LCMS(A1)：ES m/z=1092[M+H]⁺；m/z=1136[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.23min.

實例20：mAb-Ex19

實例20以類似於實例3,7,10和14的方式製備。得到45mg的實例20，為無色澄清溶液，濃度為2.55mg/mL，DAR為4.4(HRMS)，單體純度為99.1%和整體收率為78%。

SEC-HRMS：圖5中完整ADC的光譜；m/z=150368(D1)；m/z=151350(D2)；m/z=152327(D3)；m/z=153304(D4)；m/z=154281(D5)；m/z=155255(D6)；m/z=156237(D7)；m/z=157217(D8)。

實例21：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-(3-(4-(胺基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-7-環丙基-3-異丁基-6,6-二甲基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環-十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

實例21根據在流程1中描繪的和對實例1和8描述的一般途徑A來製備。

實例22：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-7-環丙基-3-異丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯

實例22如在流程3描述的和對實例2,6,9和13所描述的製備。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.34(m,1 H)；0.66(m,1 H)；0.74(d,J=7.0Hz,3 H)；0.76(d,J=7.0Hz,3 H)；0.78(s,3 H)；0.80(m,1 H)；0.82(d,J=7.0Hz,3 H)；0.85(d,J=7.0Hz,3 H)；1.04(d,J=7.0Hz,3 H)；1.08(s,3 H)；1.11(m,1 H)；1.20(m,1 H)；1.23(d,J=7.0Hz,3 H)；1.43至1.54(m,2 H)；1.78(m,1 H)；1.82(m,2H)；1.98(m,1 H)；2.22(m,1 H)；2.28(m,2H)；2.65(m,3 H)；2.79(m,1 H)；2.81(s,4 H)；2.97(dd,J=2.2和7.9Hz,1 H)；3.80(s,3 H)；3.89(d,J=2.2Hz,1 H)；4.02(m,1 H)；4.17(dd,J=6.7和8.7Hz,1 H)；4.27(d,J=6.3Hz,2H)；4.30(m,1 H)；4.37(m,1 H)；5.10(m,1 H)；5.79(dd,J=1.8和15.5Hz,1 H)；6.39(ddd,J=4.0,11.6和15.5Hz,1 H)；7.02(d,J=8.7Hz,1 H)；7.11(dd,J=2.3和8.7Hz,1 H)；7.20(d,J=2.3Hz,1 H)；7.22(m,4 H)；7.46(s,1 H)；7.77(d,J=9.0Hz,1 H)；7.89(d,J=8.6Hz,1 H)；8.05(d,J=7.5Hz,1 H)；8.29(d,J=7.6Hz,1 H)；8.32(t,J=6.3Hz,1 H).

實例23：mAb-Ex22

實例23以類似於實例3、7、10和14的方式製備。得到45mg的實例23，為無色澄清溶液，濃度為2.14mg/mL，DAR為3.6(HRMS)，單體純度為100%且整體收率為75%。

SEC-HRMS：圖6中的完整ADC的光譜；m/z=150341(D1)；m/z=151329(D2)；m/z=152317(D3)；m/z=153308(D4)；m/z=154296(D5)；m/z=155287(D6)；m/z=156279(D7)；m/z=157267(D8)。

實例24：(3S,7S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(疊氮基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)-乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

實例24根據在流程3中描繪的和對實例32描述的一般途徑C製備。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.83(s,9H)；0.88(d,J=6.8Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.03(d,J=7,1Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.33(d,J=14.5Hz,1H)；1.84(m,1H)；1.97(dd,J=9.8和14.5Hz,1H)；2.27(dd,J=11.1和14.5Hz,1H)；2.61(m,1H)；2.69(dd,J=11.1和14.2Hz,1H)；2.92(dd,J=2.1和7.7Hz,1H)；2.96(dd,J=3.6和14.2Hz,1H)；3.43(m,1H)；3.80(s,3H)；3.96(d,J=2.1Hz,1H)；4.08(ddd,J=3.6,7.1和11.1Hz,1H)；4.12(m,1H)； 4.46(s,2H)；5.05(ddd,J=1.3,3.9和11.3Hz,1H)；5.90(dd,J=1.3和15.3Hz,1H)；6.45(ddd,J=4.7,10.7和15.3Hz,1H)；7.02(d,J=8.7Hz,1H)；7.20(dd,J=2.4和8.7Hz,1H)；7.32(m,3 H)；7.40(d,J=8.4Hz,2H)；7.88(d,J=8.4Hz,1H)；7.92(d,J=7.1Hz,1H)；8.40(d,J=7.4Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=749[M-H]^-；m/z=751[M+H]⁺；m/z=795[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.52min.

實例25：(3S,7S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(胺基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-稀-2,5,9,12-四酮

實例25如對於實例1,5,8和11中所描述的製備。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.86(s,9H)；0.88(d,J=6.9Hz,3H)；0.98(s,3H)；1.02(d,J=7.1Hz,3H)；1.18(s,3H)；1.34(d,J=14.5Hz,1H)；1.80(m,1H)；1.98(dd,J=9.8和14.5Hz,1H)；2.27(dd,J=11.1和14.5Hz,1H)；2.40(寬峰m,2H)；2.62(m,1H)；2.68(dd,J=11.1和14.2Hz,1H)；2.90(dd,J=2.1和7.7Hz,1H)；2.96(dd,J=3.6和14.2Hz,1H)；3.43(m,1H)；3.76(s,2H)；3.80(s,3H)；3.91(d,J=2.1Hz,1H)；4.02至4.15(m,2H)；5.04(ddd,J=1.3,3.9和11.3Hz,1H)；5.88(dd,J=1.3和15.4Hz,1H)；6.45(ddd,J=4.7,10.7和15.3Hz,1H)；7.03(d,J=8.5Hz,1H)；7.20(dd,J=2.2和8.5Hz,1H)；7.23(d,J=8.3Hz,2H)；7.32(d,J=2.2Hz,2H)；7.36(d,J=8.3Hz,2H)；7.86(d,J=8.3Hz,1H)；7.93(d,J=6.9Hz,1H)；8.40(d,J=7.1Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=723[M-H]^-；m/z=725[M+H]⁺；m/z=769 [M-H+HCO₂H]^-；t_R=0.87min.

合成實例26至28：3-(S)-新戊基-7-(S)-Me-氮雜-C52苄醇、戊二醯基-Val-Ala-EDA-3-(S)-新戊基-7-(S)-Me-氮雜-C52苄醇的NHS酯和對應的ADC

化合物58：(2R,3S)-1-((4-甲氧基苄基)氧基)-2-甲基己-5-烯-3-基(S)-2-((8)-3-((R)-2-丙烯醯胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙醯胺基)-2,2-二甲基丁醯胺基)-4,4-二甲基戊酸酯

向化合物BC4(365mg,919.7μmol)在DMF(12mL)中的溶液添加HATU(402mg,1.06mmol)和HOAt(144mg,1.06mmol)，反應介質於室溫攪拌30min，然後添加化合物AD3(365mg,965.7μmol)在DMF(5mL)和DIEA(562μL,3.22mmol)中的溶液。反應介質於室溫攪拌4h，然後以H₂O(50mL)稀釋並以EtOAc(3 x 50mL)萃取。合併的有機相以H₂O(15mL)、飽和鹽水(3 x 15mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由兩個連續快速層析在30g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH和庚烷/EtOAc)上純化得到564mg的化合物58，為無色泡沫(81%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.83(d,J=6.9Hz,3H)；0.85(s,9H)；0.87(d,J=6.9Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.03(s,3H)；1.55(dd,J=2.4和14.5Hz,1H)；1.78(dd,J=9.5和14.5Hz,1H)；1.96(m,1H)；2.20(m,1H)；2.30(m,1H)；2.72(dd,J=9.6和13.9Hz,1H)；2.87(dd,J=5.3和13.9Hz,1H)；3.20(dd,J=6.5和9.5Hz,1H)；3.37(dd,J=5.4和9.5Hz,1H)；3.76(s,3H)；3.80(s,3H)；4.19(m,1H)；4.28(m,1H)；4.34(s,2H)；4.55(m,1H)；4.82(m,1H)；5.00(d,J=10.2Hz,1H)；5.07(d,J=17.4Hz,1H)；5.55(dd,J=2.3和10.2Hz,1H)；5.71(m,1H)；6.01(dd,J=2.3和17.1Hz,1H)；6.28(dd,J=10.2和17.1Hz,1H)；6.90(d,J=8.7Hz,2H)；7.02(d,J=8.6Hz,1H)；7.17(dd,J=2.3和8.6Hz,1H)；7.22(d,J=8.7Hz,2H)；7.32(d,J=2.3Hz,1H)；7.65(d,J=9.5Hz,1H)；7.70(d,J=7.9Hz,1H)；8.35(d,J=8.4Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=754[M-H]^-；m/z=756[M+H]⁺；m/z=800[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.62min.

化合物59：(3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((R)-1-((4-甲氧基-苄基)氧基)丙-2-基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

向化合物58(560mg,740.4μmol)在DCM(56mL)中的溶液在Ar下添加Grubbs I催化劑(31.0mg,37.02μmol)。反應介質於室溫攪拌1h 30，然後添加31.0mg的催化劑。室溫持續攪拌1h 30，然後添加31.0mg的催化劑。室溫持續攪拌1h 30，然後添加31.0mg的催化劑，反應介質於室溫攪拌1h 30，真空濃縮並藉由快速層析在25g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到330mg的化合物59(61%)，並且220mg藉由快速層析在15g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上進一步純化得到204mg的化合物59(37%)，為與三環己基氧化膦的混合物。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.85(s,9H)；0.88(d,J=6.9Hz,3H)；0.91(d,J=7.1Hz,3H)；1.04(s,3H)；1.20(s,3H)；1.29(d,J=14.5Hz,1H)；1.95(dd,J=9.8和14.5Hz,1H)；1.99(m,1H)；2.26(m,1H)；2.43(m,1H)；2.72(dd,J=10.1和14.3Hz,1H)；2.97(dd,J=3.6和14.3Hz,1H)；3.27(dd,J=6.1和9.3Hz,1H)；3.40(dd,J=5.8和9.3Hz,1H)；3.46(m,1H)；3.72(s,3H)；3.80(s,3H)；4.10(m,1H)；4.13(m,1H)；4.38(s,2H)；4.97(m,1H)；5.93(d,J=15.4Hz,1H)；6.43(ddd,J=4.8,10.7和15.4Hz,1H)；6.90(d,J=8.7Hz,2H)；7.02(d,J=8.6Hz,1H)；7,17(d,J=8.6Hz,3H)；7.36(d,J=2.3Hz,1H)；7.88(m,2H)；8.48(d,J=7.5Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=726[M-H]^-；m/z=728[M+H]⁺；m/z=772[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.54min.

化合物60：(3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((R)-1-羥基丙-2-基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

化合物59(532mg,730.4μmol)以TFA(3.93mL)在DCM(36mL)中的溶液於室溫處理30min。在磁力攪拌下，將反應介質傾倒至9%NaHCO₃水溶液(130mL)。持續攪拌30min然後水相以以DCM萃取(2 x 70mL)。合併的有機相以H₂O(3 x 20mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在30g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到299mg的化合物60，為白色泡沫(67%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.88(d,J=6.9Hz,3H)；0.89(s,9H)；0.90(d,J=7.0Hz,3H)1.03(s,3H)；1.20(s,3H)；1.36(dd,J=1.8和14.5Hz,1H)；1.80(m,1H)；1.96(dd,J=9.6和14.5Hz,1H)；2.25(m,1H)；2.43(m,1H)；2.72(dd,J=11.1和14.3Hz,1H)；2.97(dd,J=3.8和14.3Hz,1H)；3.25(m,1H)；3.45(m,2H)；3.80(s,3H)；4.10(m,1H)；4.16(m,1H)； 4.57(t,J=5.3Hz,1H)；4.98(m,1H)；5.93(dd,J=1.3和15.3Hz,1H)；6.45(ddd,J=4.9,10.7和15.3Hz,1H)；7.02(d,J=8.6Hz,1H)；7.22(dd,J=2.3和8.6Hz,1H)；7.36(d,J=2.3Hz,1H)；7.89(m,2H)；8.48(d,J=7.3Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=606[M-H]^-；m/z=608[M+H]⁺；t_R=1.2min.

化合物61：(S)-2-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)丙醛

向化合物60(297mg,488.4μmol)在DCM(6mL)(以冰/丙酮浴冷卻)中的溶液於0℃添加KBr(58.11mg,488.4μmol)在H₂O(1.18mL)中的溶液和TEMPO(1.57mg,9.8μmol)，並滴加1.56M次氯酸鈉的水溶液pH 9.5(467.6μL,732.52μmol)。於0℃持續攪拌15min，然後於0℃添加飽和Na₂S₂O₃(3.56mL)，除去冰浴並且反應介質攪拌10min。其然後以DCM萃取(3 x 25mL)，合併的有機相以H₂O(2 x 10mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在15g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到139mg的化合物61，為白色漆狀物(47%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.85(s,9H)；0.90(d,J=7.0Hz,3H)；1.03(s,3H)；1.04(d,J=6.9Hz,3H)；1.20(s,3H)；1.26(d,J=15.3Hz,1H)；1.95(m,1H)；2.44(m,1H)；2.57(m,1H)；2.72(dd,J=11.2和14.4Hz,1H)；2.80(m,1H)；2.98(dd,J=3.1和14.4Hz,1H)；3.80(s,3H)；4.10(m,3H)；5.22(m,1H)；5.98(d,J=15.3Hz,1H)；6.47(ddd,J=4.9,10.8和15.3Hz,1H)；7.04(d,J=8.7Hz,1H)；7.22(dd,J=2.3和8.7Hz,1H)；7.37(s,1H)；7.90(m,1H)；7.92(d,J=8.2Hz,1H)；8.53(d,J=7.6Hz,1H)；9.68(s,1H).LCMS(A5)：ES m/z=604[M-H]^-；m/z=606[M+H]⁺；m/z=650[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.28min.

化合物62：(4-(((三異丙基甲矽烷基)氧基)甲基)苯基)甲醇

向1,4-苯二甲醇(2g,14.33mmol)在THF(100mL)中的溶液添加咪唑 (1.13g,16.48mmol)。反應介質於室溫攪拌15min，然後添加三異丙基甲矽烷氯(3.14mL,14.33mmol)並於室溫繼續攪拌過夜。將Et₂O(50mL)添加至反應混合物並有機相以飽和鹽水(100mL)洗滌兩次，經MgSO₄過濾，真空濃縮，溶解在DCM中，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在200g的矽膠(等度溶離8：2庚烷/EtOAc)上純化得到1.9g的化合物62，為無色油狀物(45%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：1.04(d,J=6,7Hz,18H)；1.15(m,3H)；4.48(d,J=5.7Hz,2H)；4.78(s,2H)；5.13(t,J=5.7Hz,1H)；7.29(s,4H).

化合物63：((4-(溴甲基)苄基)氧基)三異丙基矽烷

向N-溴代琥珀醯亞胺(1.29g,7.16mmol)在DCM(65mL)(冷卻在0℃)中的懸浮液滴加二甲基硫醚(953μL,12.9mmol)。於0℃持續攪拌10mim然後反應介質於-20℃冷卻並於-20℃攪拌10min。然後滴加化合物62(1.9g,6.45mmol)在DCM(30mL)(冷卻在-20℃)中的溶液。於-20℃持續攪拌15min，然後於0℃攪拌15min並於室溫攪拌過夜。反應介質以飽和鹽水(100mL)洗滌兩次，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由兩個連續的快速層析在40g的矽膠(梯度溶離庚烷/EtOAc)上純化。合併各含有期望化合物的各級分，真空濃縮並溶解在庚烷(8mL)中。過濾懸浮液，濾液經真空濃縮，溶解在Et₂O(5mL)(冷卻在-20℃)中，過濾，真空濃縮得到1.18g的化合物63，為淡黃色油狀物(51%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：1.04(d,J=6,8Hz,18H)；1.15(m,3H)；4.70(s,2H)；4.81(s,2H)；7.29(d,J=8.4Hz,2H)；7.41(d,J=8.4Hz,2H).LCMS(A5)：ES m/z=104；m/z=356[M]⁺；t_R=1.99min.

化合物64：(1R,4S,5R,6S)-4,7,7-三甲基-6-(4-(((三異丙基甲矽烷基)氧基)甲基)苄基)-6-硫雜雙環[3.2.1]辛烷-6-三氟甲磺酸酯

向(1R,4R,5R)-4,7,7-三甲基-6-硫雜雙環[3.2.1]辛烷(CAS號[5718-75-2],562.3mg,3.3mmol)中添加化合物63(1.18g,3.3mmol)在DCM(3.4mL)中的溶液。然後滴加三氟甲磺酸鋰(2.63g,16.51mmol)在H₂O(3mL)中的溶液並且反應介質於室溫攪拌過夜。然後將H₂O(15mL)和DCM(15mL)添加至反應介質並於室溫持續攪拌10min。水相以DCM萃取(3 x 20mL)，合併的有機相以飽和鹽水洗滌(3 x 8mL)，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮。淡黃色油狀物在iPr₂O(5mL)研磨，由此得到的固體經過濾，以iPr₂O(2 x 5mL)洗滌並真空乾燥得到1.125g的化合物64，為白色固體(57%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：1.04(m,21H)；1.15(m,3H)；1.45(m,1H)；1.60(m,2H)；1.68(s,3H)；1.71(m,1H)；1.74(s,3H)；1,98(m,1H)；2.40(d,J=14.6Hz,1H)；2.45(m,1H)；2.58(寬峰d,J=14.6Hz,1H)；3.85(m,1H)；4.56(d,J=12.6Hz,1H)；4.83(s,2H)；4.90(d,J=12.6Hz,1H)；7.44(d,J=8.4Hz,2H)；7.57(d,J=8.4Hz,2H).

化合物65：(3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(((三異丙基甲矽烷基)氧基)甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

向化合物61(138mg,227.7μmol)和64(149.5mg,250.4μmol)在DCM(4mL)(冷卻在-70℃)中的溶液滴加BEMP(CAS號[98015-45-3],90.2μL,296.0μmol)。反應混合物於-70℃攪拌2h，將飽和鹽水(7mL)添加至反應混合物，除去浴並持續劇烈攪拌直到室溫。水相以DCM萃取(3 x 20mL)，合併的有機相經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在10g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到163mg的化合物65，為無色油狀物(30%)和60mg的化合物61(43%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.84(s,9H)；0.88(d,J=6.9Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J=7.1Hz,3H)；1.05(d,J=7.3Hz,18H)；1.15(m, 3H)；1.19(s,3H)；1.32(d,J=14.8Hz,1H)；1.82(m,1H)；1.97(dd,J=9.9和14.8Hz,1H)；2.28(dt,J=11.1和14.9Hz,1H)；2.61(m,1H)；2.69(dd,J=11.2和14.3Hz,1H)；2.91(dd,J=2.2和7.6Hz,1H)；2.95(dd,J=3.8和14.3Hz,1H)；3.43(m,1H)；3.80(s,3H)；3.91(d,J=2.2Hz,1H)；4.08(ddd,J=3.8,7.4和11.2Hz,1H)；4.12(m,1H)；4.81(s,2H)；5.04(ddd,J=1.5,4.5和11.1Hz,1H)；5.89(dd,J=1.5和15.2Hz,1H)；6.44(ddd,J=4.5,10.6和15.2(d,J=2.3Hz,1H)；7.36(d,J=8.4Hz,2H)；7.88(d,J=8.4Hz,1H)；7.91(d,J=7.1Hz,1H)；8.39(d,J=7.4Hz,1H).LCMS(A4)：ES m/z=120；m/z=882[M+H]⁺；t_R=7.65min.

實例26：(3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(羥基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

向化合物65在冷卻在0℃的THF中的溶液添加TBAF。反應介質於0℃攪拌1h 30，然後添加H₂O(5mL)並繼續攪拌20min。反應介質以DCM萃取(3 x 20mL)，合併的有機相以飽和鹽水(3 x 5mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在15g的矽膠(梯度溶離EtOAc/MeOH/H₂O)上純化得到69mg的實例26，為白色漆狀物(91%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.85(s,9H)；0.89(d,J=6.9Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J=7.1Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.35(d,J=14.8Hz,1H)；1.80(m,1H)；1.99(dd,J=9.9和14.8Hz,1H)；2.27(dt,J=11.1和14.9Hz,1H)；2.61(m,1H)；2.69(dd,J=11.2和14.3Hz,1H)；2.90(dd,J=2.2和7.6Hz,1H)；2.95(dd,J=3.8和14.3Hz,1H)；3.43(m,1H)；3.80(s,3H)；3.91(d,J=2.2Hz,1H)；4.06至4.15(m,2H)；4.50(d,J=5.9Hz,2H)；5.03(dd,J=1.5,3.7和11.5Hz,1H)；5.20(t,J=5.9Hz,1H)；5.89(dd,J=1.5和15.3Hz,1H)；6.43(ddd,J=4.6,10.7和15.3Hz,1H)；7.02(d,J=8.6Hz,1H)；7.20(dd, J=2.2和8.6Hz,1H)；7.23(d,J=8.3Hz,2H)；7.32(m,3H)；7.87(d,J=8.3Hz,1H)；7.92(d,J=7.0Hz,1H)；8.40(d,J=7.4Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=724[M-H]^-；m/z=726[M+H]⁺；m/z=770[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.29min.

化合物66：4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯

向實例26(68mg,93.6μmol)在DCM(5mL)中的溶液添加雙(4-硝基苯基)碳酸酯(118.7mg,374.5μmol)並滴加DIEA(49μL,281.0μmol)。反應介質於室溫攪拌6天，然後添加飽和鹽水，並且其以DCM萃取(3 x 10mL)。合併的有機相經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在5g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到79mg的化合物66，為白色漆狀物(94%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.85(s,9H)；0.89(d,J=6.9Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.05(d,J=7.1Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.34(d,J=14.6Hz,1H)；1.83(m,1H)；1.97(dd,J=9.9和14.6Hz,1H)；2.28(dt,J=11.1和14.9Hz,1H)；2.61(m,1H)；2.69(dd,J=11.2和14.3Hz,1H)；2.93(m,2H)；3.42(m,1H)；3.79(s,3H)；3.99(d,J=2.2Hz,1H)；4.09(m,2H)；5.05(dd,J=1.3,4.0和11.1Hz,1H)；5.31(s,2H)；5.89(dd,J=1.3和15.3Hz,1H)；6.47(ddd,J=4.8,10.8和15.3Hz,1H)；7.01(d,J=8.6Hz,1H)；7.21(dd,J=2.2和8.6Hz,1H)；7.31(d,J=2.2Hz,1H)；7.36(d,J=8.5Hz,2H)；7.50(d,J=8.5Hz,2H)；7.59(d,J=9.3Hz,2H)；7.87(d,J=8.3Hz,1H)；7.92(d,J=7.0Hz,1H)；8.32(d,J=9.3Hz,2H)；8.39(d,J=7.4Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=889[M-H]^-；m/z=891[M+H]⁺；m/z=935[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.55min.

化合物67：((S)-1-(((S)-1-((2-NBoc-胺基乙基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯鹽酸鹽

向Fmoc-Val-Ala-OH(3.5g,8.53mmol)在DCM(100mL)中的懸浮液添加TEA(3.6mL,25.58mL)(導致原料的完全溶解)、N-Boc-EDA(1.62mL,10.23mmol)和丙基膦酸酐(6.51g,10.23mmol)50%在DCM中的溶液。反應介質於室溫攪拌3h，然後添加1N NaOH(50mL)，並且過濾懸浮液，以H₂O和DCM洗滌。濾液的有機相以H₂O洗滌。濾餅和有機相合併，部分真空濃縮，過濾，以DCM洗滌並乾燥得到3.952g的化合物67，為白色粉末(84%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.84(d,J=7.0Hz,3H)；0.86(d,J=7.0Hz,3H)；1.19(d,J=7.1Hz,3H)；1.37(s,9H)；1.99(m,1H)；2.92至3.14(m,4H)；3.88(dd,J=6.9和9.1Hz,1H)；4.19至4.35(m,4H)；6.71(m,1H)；7.32(m,2H)；7.38(m,1H)；7.42(m,2H)；7.73(m,2H)；7.84(t,J=6.8Hz,1H)；7.89(d,J=7.8Hz,2H)；7.92(d,J=7.8Hz,1H).

化合物68：((S)-1-(((S)-1-((2-胺基乙基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯鹽酸鹽

向化合物67(100mg,159.5μmol)在二

烷(3mL)中的懸浮液添加在二

烷(905μL,3.62mmol)中的HCl 4N。反應介質於室溫攪拌20h，然後真空濃縮。粗產物重懸於iPr₂O(3mL)，浸沒在超音波浴中並過濾。由此得到的濾餅以iPr₂O(2 x 3mL)洗滌並真空乾燥得到78mg的化合物68，為白色固體(88%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.85(d,J=6.9Hz,3H)；0.87(d,J=6.9Hz,3H)；1.23(d,J=7.1Hz,3H)；1.99(m,1H)；2,83(m,2H)；3.29(m,2H)；3.89(dd,J=6.9和8.9Hz,1H)；4.19至4.38(m,4H)；7.33(m,2H)；7.42(m,3H)；7.75(m,2H)；7.88(寬峰s,3H)；7.90(d,J=7.6Hz,2H)；8.08(d,J=7.3Hz,1H)；8.14(d,J=5.9Hz,1H).

化合物69：(2-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)乙基)胺基甲酸 4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基酯

向化合物66(78mg,87.5μmol)和68(51.4mg,105.0μmol)在DCM中的懸浮液添加DIEA(44.0μL,262.5μmol)。反應介質於室溫攪拌過夜，然後添加化合物68(24mg,49μoml)和DIEA(15μL)並於室溫繼續攪拌1天。添加哌啶(87.0μL,875.0μmol)並於室溫持續攪拌過夜。反應介質經真空濃縮並藉由兩個連續的快速層析在5g的矽膠(梯度溶離EtOAc/MeOH/H2O)上純化得到57mg的化合物69，為白色漆狀物(66%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.75(d,J=7.0Hz,3H)；0.85(s,9H)；0.86(d,J=7.0Hz,3H)；0.87(d,J=6.7Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J=7.0Hz,3H)；1.18(m,6H)；1.33(d,J=14.5Hz,1H)；1.75(寬峰s,2H)；1.81(m,1H)；1.92(m,1H)；1.98(dd,J=10.0和14.5Hz,1H)；2.28(m,1H)；2.61(m,1H)；2.69(dd，J=11.3和14.7Hz,1H)；2.90(dd,J=2.0和7.5Hz,1H)；2.96(m,1H)；2.98(d,J=4.7Hz,1H)；3.05(m,2H)；3.12(m,2H)；3.43(m,1H)；3.81(s,3H)；3.93(d,J=2.0Hz,1H)；4.09(m,2H)；4.26(m,1H)；5.01(s,2H)；5.04(m,1H)；5.89(dd,J=1.5和15.2Hz,1H)；6.45(ddd,J=4.5,10.4和15.2Hz,1H)；7.02(d,J=8.8Hz,1H)；7.20(dd,J=2.4和8.8Hz,1H)；7.26(t,J=6.0Hz,1H)；7.29(d,J=8.4Hz,2H)；7.32(d,J=2.5Hz,1H)；7.37(d,J=8.4Hz,2H)；7.88(d,J=8.4Hz,1H)；7.93(d,J=7.1Hz,1H)；8.00(t,J=6.0Hz,1H)；8.03(d,J=8.1Hz,1H)；8.41(d,J=7.2Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=492[M+2H]²⁺；m/z=980[M-H]^-；m/z=982[M+H]⁺；m/z=1026[M-H+HCO₂H]^-；t_R=0.91min.

化合物70：(9S,12S)-1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苯基)-12-異丙基-9-甲基-3,8,11,14-四側氧基-2-氧雜-4,7,10,13-四氮雜十八烷-18-酸

向化合物69(56.0mg,56.8μL)在DCM(8mL)中的溶液添加戊二酸酐(7.27mg,62.5μmol)在DCM(4mL)中的溶液。反應介質於室溫攪拌2h，真空濃縮並藉由快速層析在5g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH/H₂O)上純化得到35.5mg的化合物70，為白色漆狀物(56%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.81(d,J=7.0Hz,3H)；0.83(d,J=7.0Hz,3H)；0.85(s,9H)；0.87(d,J=6.5Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J=7.1Hz,3H)；1.19(m,6H)；1.32(d,J=14.3Hz,1H)；1.70(m,2H)；1.81(m,1H)；1.92(m,1H)；1.98(m,2H)；2.15(m,2H)；2.19(t,J=7.5Hz,2H)；2.27(m,1H)；2.61(m,1H)；2.69(dd,J=11.1和14.1Hz,1H)；2.91(d,J=7.6Hz,1H)；2.95(m,1H)；3.04(m,2H)；3.10(m,2H)；3.41(m,1H)；3.80(s,3H)；3.93(s,1H)；4.03至4.16(m,3H)；4.19(m,1H)；5.01(s,2H)；5.04(m,1H)；5.89(d,J=15.6Hz,1H)；6.43(ddd,J=5.3,11.0和15.6Hz,1H)；7.02(d,J=8.7Hz,1H)；7.20(dd,J=2.3和8.7Hz,1H)；7.28(d,J=8.4Hz,2H)；7.30(m,1H)；7,32(d,J=2.3Hz,1H)；7.36(d,J=8.4Hz,2H)；7.88(m,2H)；7.93(d,J=7.4Hz,1H)；7.98(寬峰s,1H)；8.06(寬峰s,1H)；8.42(d,J=7.4Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=549[M+2H]²⁺；m/z=1094[M-H]^-；m/z=1096[M+H]⁺；t_R=1.21min.

實例27：(9S,12S)-1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環-十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苯基)-12-異丙基-9-甲基-3,8,11,14-四側氧基-2-氧雜-4,7,10,13-四氮雜十八烷-18-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯

向化合物70(14.6mg,13.3μmol)在DCM(5mL)中的溶液在Ar下添加DSC(4.3mg,16.0μmol)和DIEA(2.8μL,16.0μmol)。反應介質於室溫攪拌3 h，然後添加DSC(1.5mg,5.6μmol)和DIEA(1μL,5.7μmol)並於室溫繼續攪拌1h。反應介質經真空濃縮並藉由快速層析在16.4g的二醇修飾的矽膠(梯度溶離DCM/iPrOH)上純化得到11.4mg的實例27，為白色漆狀物(72%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.81(d,J=7.0Hz,3H)；0.83(d,J=7.0Hz,3H)；0.85(s,9H)；0.88(d,J=6.5Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J=7.1Hz,3H)；1.19(m,6H)；1.34(d,J=14.4Hz,1H)；1.83(m,3H)；1.98(m,2H)；2.26(m,1H)；2.29(m,2H)；2.60(m,1H)；2.68(t,J=7.6Hz,2H)；2.70(dd,J=11.2和14.3Hz,1H)；2.80(s,4H)；2.91(dd,J=2.3和7.6Hz,1H)；2.95(dd,J=3.7和14.3Hz,1H)；2.99至3.20(m,4H)；3.43(m,1H)；3.80(s,3H)；3.93(d,J=2.2Hz,1H)；4.05至4.25(m,4H)；5.01(m,2H)；5.03(m,1H)；5.89(dd,J=1.6和15.4Hz,1H)；6.44(ddd,J=4.6,10.9和15.4Hz,1H)；7.02(d,J=8.5Hz,1H)；7.20(m,2H)；7.28(d,J=8.5Hz,2H)；7.31(d,J=2.3Hz,1H)；7.37(d,J=8.5Hz,2H)；7.86(m,3H)；7.91(d,J=7.1Hz,1H)；7.95(d,J=7.6Hz,1H)；8.39(d,J=7.3Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=311；m/z=1191[M-H]^-；m/z=1193[M+H]⁺；m/z=1237[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.26min.

實例28：mAb-Ex27

實例28以類似於實例3,7,10和14的方式製備。得到1.56mg的實例28，為無色清澈溶液，濃度為0.78mg/mL，DAR為4(HRMS)，單聚體純度為100%，整體收率為13%。

SEC-HRMS：m/z=149405(裸mAb)；m/z=150486(D1)；m/z=151568(D2)；m/z=152645(D3)；m/z=153725(D4)；m/z=154802(D5)；m/z=155882(D6)；m/z=156961(D7)；m/z=158039(D8)。

合成實例29：馬來醯亞胺基-mc-vc-PABA-3-(S)-新戊基-7-(S)-Me-氮雜-C52苄胺

化合物71：(4-硝基苯基)碳酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基酯

化合物72如Verma V.A.,et al.,in Bioorg Med Chem Lett 2015,25,864-868描述的製備。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.83(d,J=7.0Hz,3H)；0.87(d,J=7.0Hz,3H)；1.18(m,2H)；1.31至1.75(m,8H)；1.96(m,1H)；2.10(m,1H)；2.18(m,1H)；2.96(m,1H)；3.01(m,1H)；3.37(t,J=7.2Hz,2H)；4.19(dd,J=7.0和8.6Hz,1H)；4.38(m,1H)；5.24(s,2H)；5.42(s,2H)；5.98(t,J=6.0Hz,1H)；7.00(s,2H)；7.40(d,J=8.7Hz,2H)；7.57(d,J=9.2Hz,2H)；7.66(d,J=8.7Hz,2H)；7.81(d,J=8.6Hz,1H)；8.12(d,J=7.9Hz,1H)；8.31(d,J=9.2Hz,2H)；10.08(s,1H).LCMS(A5)：ES m/z=738[M+H]⁺；m/z=782[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.1min.

實例29：(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)胺基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基-丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基酯

向化合物71(16.0mg,21.7μmol)中添加實例25(14.3mg,19.7μmol)在DCM(2.5mL)和DIEA(3.4μL,19.7μmol)中的溶液。反應介質於室溫攪拌過夜，然後添加DMF(1mL)並於室溫繼續攪拌1天。H₂O(8mL)添加至反應介質，繼續攪拌15min，然後水相以DCM萃取(3 x 10mL)。合併的有機相經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮，與甲苯共蒸發兩次並藉由快速層析在5g矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到15.8mg的實例29，為白色固體(60%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.81(d,J=7.0Hz,3H)；0.85(d,J=7.0Hz,3H)；0.86(s,9H)；0.89(d,J=6.8Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J=7.0Hz,3H)；1.18(s,3H)；1.19(m,2H)；1.31至1.75(m,9H)；1.80(m,1H)；1,96(m,2H)2.10(m,1H)；2.18(m,1H)；2,27(m,1H)；2.61(m,1H)；2,69(dd,J=10.8和14.3Hz,1H)；2,90(dd,J=2.1和7.6Hz,1H)；2.96(m,2H)；3.01(m,1H)；3.37(t,J=7.2Hz,2H)；3.42(m,1H)；3.80(s,3H)；3.90(d,J=2.1Hz,1H)；4.08(m,1H)；4.11(m,1H)；4.20(m,3H)；4.39(m,1H)；4.97(s,2H)；5.04(m,1H)；5.40(s,2H)；5.89(dd,J=1.7和15.5Hz,1H)；5.97(t,J=6.2Hz,1H)；6.45(ddd,J=4.8,10.7和15.5Hz,1H)；6.99(s,2H)；7.01(d,J=8.7Hz,1H)；7.20(dd,J=2.2和8.7Hz,1H)；7.21至7.30(m,6H)；7.31(d,J=2.2Hz,1H)；7.59(d,J=8.7Hz,2H)；7.78(m,2H)；7.85(d,J=8.5Hz,1H)；7.90(d,J=6.9Hz,1H)；8.07(d,J=7.8Hz,1H)；8.39(d,J=7.3Hz,1H)；9.97(s,1H).LCMS(A5)：ES m/z=662[M+2H]²⁺；m/z=1322[M-H]^-；m/z=1324[M+H]⁺；m/z=1368[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.3min.

合成實例30和31：非解離的三唑-3-(S)-新戊基-7-(S)-Me-氮雜-C52的NHS酯和對應的ADC

化合物72：3-(丙-2-炔-1-基氧基)丙酸第三丁基酯

向炔丙基醇(1.362mL,23.4mmol)在THF(23mL)中的溶液添加鈉(20.08mg,0.874mmol)，反應介質於60℃加熱直至鈉完全溶解，然後於室溫冷卻，然後添加丙烯酸第三丁基酯(2.286mL,15.6mmol)。反應介質於室溫攪拌過夜，然後添加H₂O(25mL)並且水相以EtOAc(3 x 25mL)萃取。合併的有機相經Na₂SO₄乾燥，過濾並真空濃縮得到2g的化合物72，為無色油狀物(70%)。

化合物73：3-(丙-2-炔-1-基氧基)丙酸

向化合物72(2.0g,10.86mmol)在DCM(50mL)中的溶液添加TFA(8.065mL,108.6mmol)。反應介質於室溫攪拌過夜，真空濃縮，與甲苯共蒸發並藉由快速層析在80g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到1.1g的化合物73，為油狀物(80%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：2.46(t,J=6.4Hz,2H)；3.43(t,J=2.4Hz,1H)；3.63(t,J=6.4Hz,2H)；4.11(d,J=2.4Hz,2H)；12.20(寬峰，1H).

化合物74：3-((1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)丙酸

向實例24(50mg,66.6μmol)在THF(0.5mL)中的溶液添加化合物73(17.05mg,113.1μmol)、0.1M硫酸銅(II)水溶液(266μL,26.6μmol)和0.2M抗壞血酸鈉水溶液(266μL,53.2μmol)。反應介質於室溫攪拌1天，然後添加H2O(1mL)並且水相以EtOAc(3x1mL)萃取。合併的有機相以飽和鹽水洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由過濾在Sephadex LH20(溶離DCM)上純化得到40mg的油狀物，其藉由快速層析在5g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上進一步純化得到20mg的化合物74(35%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.82(s,9H)；0.88(d,J=6.7Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J=7.1Hz,3H)；1.18(s,3H)；1.31(d,J=14.6Hz,1H)；1.80(m,1H)；1.97(dd,J=10.0和14.6Hz,1H)；2.25(m,1H)；2.42(t, J=6.6Hz,2H)；2.60(m,1H)；2,70(dd,J=10.9和14.4Hz,1H)；2.90(dd,J=2.2和7.6Hz,1H)；2.95(dd,J=3.6和14.4Hz,1H)；3.44(m,1H)；3.62(t,J=6.62H)；3.80(s,3H)；3.94(d,J=2.2Hz,1H)；4.08(m,2H)；4.49(s,2H)；5.03(m,1H)；5.59(s,2H)；5.89(dd,J=1.7和15.3Hz,1H)；6.43(ddd,J=4.8,10.8和15.3Hz,1H)；7.02(d,J=8.7Hz,1H)；7.20(dd,J=2.4和8.7Hz,1H)；7.29(d,J=8.4Hz,2H)；7.32(d,J=2.4Hz,1H)；7.35(d,J=8.4Hz,2H)；7.85(d,J=8.4Hz,1H)；7.90(d,J=7.0Hz,1H)；8.13(s,1H)；8.46(m,1H)；12.20(寬峰，1H).LCMS(A5)：ES m/z=440[M+2H]²⁺；m/z=877[M-H]^-；m/z=879[M+H]⁺；t_R=1.24min.

實例30：3-((1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜-環十六-13-烯-16-基)乙基)氧雜環丙烷-2-基)苄基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯

向化合物74(20mg,22.7μmol)在DCM(5mL)中的溶液添加DIEA(5.0μL,28.5μmol)和DSC(6.34mg,23.8μmol)。反應介質於室溫攪拌3h，然後添加DSC(3mg,11.3μmol)和DIEA(5μL,28.5μmol)並於室溫繼續攪拌2h。反應介質，然後真空濃縮並藉由兩個連續的快速層析在1.5g的二醇修飾的矽膠(梯度溶離DCM/iPrOH)上純化得到11.5mg的實例30(50%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.83(s,9H)；0.87(d,J=6.6Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.03(d,J=7.1Hz,3H)；1.04(d,J=6.6Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.32(d,J=14.5Hz,1H)；1.81(m,1H)；1.96(dd,J=10.2和14.5Hz,1H)；2.25(m,1H)；2.60(m,1H)；2.70(dd,J=11.2和14.5Hz,1H)；2.80(s,4H)；2.90(dd,J=2.0和7.4Hz,1H)；2.94(t,J=6.1Hz,2H)；2.97(dd,J=3.6和14.1Hz,1H)；3.42(m,1H)；3.74(t,J=6.1Hz,2H)；3.80(s,3H)；3.92(d,J=2.0Hz,1H)；4.09(m,2H)；4.55(s,2H)；5.03(m,1H)；5.59(s,2H)；5.89(dd, J=1.6和15.2Hz,1H)；6.44(ddd,J=4.7,10.6和15.2Hz,1H)；7.02(d,J=8.6Hz,1H)；7.20(dd,J=2.4和8.6Hz,1H)；7.29(d,J=8.3Hz,2H)；7.32(m,3H)；7.86(d,J=8.4Hz,1H)；7.90(d,J=6.9Hz,1H)；8.14(s,1H)；8.39(d,J=7.5Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=120；m/z=974[M-H]^-；m/z=976[M+H]⁺；m/z=1020[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.29min.

實例31：mAb-實例30

實例31以類似於實例3,7,10和14的方式製備。得到5.4mg的實例31，為無色澄清溶液，濃度為1.8mg/mL，DAR為4(HRMS)，單體純度為98.1%且整體收率為45%。

SEC-HRMS：m/z=149399(裸mAb)；m/z=150245(D1)；m/z=151101(D2)；m/z=151965(D3)；m/z=152831(D4)；m/z=153679(D5)；m/z=154546(D6)；m/z=155408(D7)；m/z=156273(D8)；m/z=157284(D9)。

合成實例32：3-(S)-新戊基-6-Me-6-CH ₂ OH-氮雜-C52苄胺

化合物75：(2S)-2-((4-((R)-2-丙烯醯胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙醯胺基)-3-(羥基甲基)-3-甲基-2-側氧基丁基)胺基)-4,4-二甲基戊酸(2R,3S)-1-((4-甲氧基苄基)氧基)-2-甲基己-5-烯-3-基酯

向化合物BC6(385.6mg,773.5μmol)在DMF(12mL)中的溶液添加HATU(348.7mg,889.5μmol)和HOAt(122.3mg,889.5μmol)。反應介質於室溫攪拌30min，然後添加化合物AD3(292mg,773.5μmol)在DMF(5mL)和DIEA(475.2μL,2.71mmol)中的溶液並於室溫繼續攪拌4h。添加H₂O(50mL)並且水相以EtOAc(3 x 50mL)萃取。合併的有機相以H₂O(15mL)、飽和鹽水(3 x 15mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在30g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到383mg的化合物75，為黃色油狀物(65%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：55/45非對映異構體混合物；0.85至0.88(m,12H)；0.91(s,1.65H)；0.92(s,1.35H)；1.56(m,1H)；1.60(m,1H)；1.98(m,1H)；2.21(m,1H)；2.30(m,1H)；2.71(m,1H)；2.92(m,1H)；3.19至3.45(m,6H)；3.73(s,3H)；3.80(s,3H)；4.29(m,1H)；4.33(m,2H)；4.58(m,1H)；4.82(m,1H)；4.95至5.09(m,3H)；5.55(dd,J=2.2和10.2Hz,1H)；5.71(m,1H)；6.01(dd,J=2.2和17.2Hz,1H)；6.23(dd,J=10.2和17.2Hz,1H)；6.89(m,2H)；7.01(d,J=8.6Hz,1H)；7.17(dd,J=2.2和8.6Hz,1H)；7.21(m,2H)；7.34(d,J=2.2Hz,1H)；7.82(d,J=8.0Hz,0.45H)；7.84(d,J=8.0Hz,0.55H)；7.98(t,J=6.5Hz,0.45H)；8.00(t,J=6.5Hz,0.55H)；8.39(d,J=8.6Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=756[M-H]^-；m/z=758[M+H]⁺；m/z=802[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.54-1.56min.

化合物76：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6-(羥基甲基)-16-((R)-1-((4-甲氧基苄基)氧基)丙-2-基)-6-甲基-3-新戊基-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

向化合物75(380mg,501.1μmol)在DCM(38mL)中的溶液在Ar下添加Grubbs I催化劑(20.97mg,25.05μmol)。反應介質在Ar下於室溫攪拌4h，然後添加Grubbs I催化劑(20.97mg,25.05μmol)。室溫持續攪拌3h，然後添加Grubbs I催化劑(20.97mg,25.05μmol)並於室溫持續攪拌。在反應24h後，添加Grubbs I催化劑(20.97mg,25.05μmol)並繼續攪拌4h。反應介質經真空濃縮並藉由快速層析在20g的矽膠(等度溶離庚烷/EtOAc)上純化得到170mg的化合物76立體異構體1(56%)和138mg的化合物76立體異構體2(37%)。

化合物76立體異構體1

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.83(s,9H)；0.91(d,J=7.1Hz,3H)；1.02(s,3H)；1.30(dd,J=2.4和14.6Hz,1H)；1.53(dd,J=9.9和14.6Hz,1H)；1.99(m,1H)；2.28(m,1H)；2.45(m,1H)；2.67(m,1H)；2.91(dd,J=3.0和13.7Hz,1H)；2.97(dd,J=4.0和14.5Hz,1H)；3.17至3.49(m,5H)；3.72(s,3H)；3.80(s,3H)；4.18(m,1H)；4.37(m,2H)；4.50(td,J=2.4和9.6Hz,1H)；5.00(m,3H)；5.82(dd,J=1.9和15.4Hz,1H)；6.39(ddd,J=4.2,11.6和15.4Hz,1H)；6.90(d,J=8.7Hz,2H)；7.04(d,J=8.6Hz,1H)；7.12(m,1H)；7.15(dd,J=2.3和8.6Hz,1H)；7.21(d,J=8.7Hz,2H)；7.28(d,J=2.3Hz,1H)；8.09(d,J=9.6Hz,1H)；8.38(d,J=8.0Hz,1H).LCMS(A4)：ES m/z=728[M-H]^-；m/z=730[M+H]⁺；m/z=774；t_R=5.15min.

化合物76立體異構體2

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.83(s,9H)；0.88(s,3H)；0.91(d,J=7.1Hz,3H)；1.28(dd,J=2.4和14.6Hz,1H)；1.67(dd,J=9.9和14.6Hz,1H)；1.99(m,1H)；2.28(m,1H)；2.45(m,1H)；2.67(m,1H)；3.02(dd,J=3.3和14.2Hz,1H)；3.08(dd,J=1.9和13.5Hz,1H)；3.25至3.42(m,4H)；3.55(dd,J=5.1和11.0Hz,1H)；3.73(s,3H)；3.81(s,3H)；4.17(m,1H)；4.37(m,2H)；4.44(td,J=2.1和9.3Hz,1H)；4.80(t,J=5.1Hz,1H)；5.00(m,2H)；5.86(dd,J=1.6和15.1Hz,1H)；6.38(ddd,J=4.0,11.4和15.3Hz,1H)；6.90(d,J=8.8Hz,2H)；7.04(d,J=8.7Hz,1H)；7.19(dd,J=2.2和8.7Hz,1H)；7.22(d,J=8.8Hz,2H)；7.30(d,J=2.2Hz,1H)；7.42(d,J=10.4Hz,1H)；7.92(d,J=8.9Hz,1H)；8.45(d,J=8.0Hz,1H).LCMS(A4)：ES m/z=728[M-H]^-；m/z=730[M+H]⁺；m/z=774；t_R=4.79min.

化合物77：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((R)-1-((4-甲氧基-苄基)氧基)丙-2-基)-6-甲基-3-新戊基-6-(((三乙基甲矽烷基)氧基)甲基)-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

向化合物76立體異構體1(170mg,232.8μmol)在DCM(3mL)(以冰浴冷卻)中的溶液於4℃添加氯三乙基矽烷(159.3μL,931.1μmol)並滴加TEA(131.1μL,931.1μmol)。反應介質於4℃攪拌30min然後於室溫攪拌20h。反應介質以DCM(50mL)和鹽水(10mL)稀釋，並繼續攪拌10min。有機相以飽和鹽水(2 x 10mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮。化合物76(138mg,189.0μmol)的另一非對映異構體類似地保護，收集兩個批次，並藉由快速層析在20g的矽膠(等度溶離庚烷/EtOAc)上純化得到139mg的化合物77立體異構體1，為無色泡沫(39%)，和107mg的化合物77立體異構體2，為無色泡沫(30%)。

化合物77立體異構體1

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.62(q,J=8.1Hz,6H)；0.83(s,9H)；0.91(d,J=7.1Hz,3H)；0.96(t,J=8.1Hz,9H)；1.04(s,3H)；1.66(dd,J=3.4和14.4Hz,1H)；1.43(dd,J=9.3和14.4Hz,1H)；1.99(m,1H)；2.28(m,1H)；2.47(m,1H)；2.68(m,1H)；2.92(dd,J=3.0和13.5Hz,1H)；2.99(dd,J=4.0和14.8Hz,1H)；3.21至3.40(m,3H)；3.48(m,1H)；3.63(d,J=10.3Hz,1H)；3.73(s,3H)；3.81(s,3H)；4.17(m,1H)；4.36(m,2H)；4.51(td,J=2.9和9.4Hz,1H)；5.02(m,1H)；5.82(dd,J=1.8和15.4Hz,1H)；6.39(ddd,J=4.3,11.6和15.4Hz,1H)；6.89(d,J=8.7Hz,2H)；7.02(m,1H)；7.04(d,J=8.7Hz,1H)；7.15(dd,J=2.3和8.7Hz,1H)；7.21(d,J=8.7Hz,2H)；7.29(d,J=2.3Hz,1H)；7.96(d,J=9.4Hz,1H)；8.31(d,J=8.0Hz,1H).LCMS(A4)：ES m/z=842[M-H]^-；m/z=844[M+H]⁺；m/z=888[M-H+HCO₂H]^-；t_R=7.08min.

化合物77立體異構體2

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.52(q,J=8.1Hz,6H)0.84(s,9H)；0.88至0.93(m,15H)；1.29(dd,J=2.6和14.5Hz,1H)；1.68(dd,J=10.1 和14.5Hz,1H)；1.99(m,1H)；2.28(m,1H)；2.47(m,1H)；2.68(m,1H)；3.01(dd,J=3.4和14.5Hz,1H)；3.15(d,J=12.8Hz,1H)；3.33(m,1H)；3.48(d,J=10.4Hz,1H)；3.73(s,3H)；3.81(s,3H)；3.83(d,J=10.4Hz,1H)；4.17(m,1H)；4.36(m,2H)；4.45(td,J=2.4和9.2Hz,1H)；5.01(m,1H)；5.84(dd,J=1.8和15.3Hz,1H)；6.39(ddd,J=3.9,11.4和15.3Hz,1H)；6.90(d,J=8.8Hz,2H)；7.05(d,J=8.6Hz,1H)；7.19(dd,J=2.2和8.6Hz,1H)；7.22(d,J=8.8Hz,2H)；7.30(d,J=2.2Hz,1H)；7.47(d,J=10.4Hz,1H)；8.01(d,J=9.2Hz,1H)；8.41(d,J=8.0Hz,1H).LCMS(A4)：ES m/z=842[M-H]^-；m/z=844[M+H]⁺；m/z=888[M-H+HCO₂H]^-；t_R=6.88min.

化合物78：3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((R)-1-羥基丙-2-基)-6-甲基-3-新戊基-6-(((三乙基甲矽烷基)氧基)甲基)-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

向化合物77(245mg,290.1μmol)的兩個非對映異構體在DCM(10mL)和H₂O(2.5mL)(以冰/丙酮浴冷卻)中的溶液添加DDQ(339.4mg,1.45mmol)和2,6-二-第三丁基吡啶(171.7mg,870.3μmol)。反應介質於0℃攪拌2h，然後以NaHCO₃水溶液(10mL)和DCM(10mL)稀釋並繼續攪拌10min。水相以DCM萃取(3 x 20mL)，合併的有機相以飽和鹽水洗滌(3 x 5mL)，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在20g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到155mg的化合物78，為白色泡沫(74%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.49至0.65(m,6H)；0.80至1.07(m,24H)；1.35至1.71(m,2H)；1.83(m,1H)；2.28(m,1H)；2.47(m,1H；2.68(m,1H)；2.90至3.50(m,5.96H)；3.65(d,J=10.6Hz,0.52H)；3.80(s,3H)；3.82(d,J=10.6Hz,0.52H)；4.18(m,1H)；4.29至4.70(m,2H)；5.02(m,1H)；5.80至5.89(m,1H)；6.05(m,0.11H)；6.39(m,0.89H)；6.98至7.31(m,3.48H)；7.47(d,J=10.6Hz,0.52H)；7.87(d,J=9.4Hz,0.11H)；7.96(d,J=9,4Hz, 0.52H)；8.00(d,J=9.4Hz,0.37H)；8.31(d,J=8.0Hz,0.63H)；8.42(d,J=8.4Hz,0.37H).LCMS(A4)：ES m/z=722[M-H]^-；m/z=724[M+H]⁺；m/z=768[M-H+HCO₂H]^-；t_R=5.68-5.78min.

化合物79：2S)-2-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6-甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四側氧基-6-(((三乙基甲矽烷基)氧基)甲基)-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-16-基)丙醛

向化合物78(154mg,212.6μmol)在DCM(1.5mL)(以冰/丙酮浴冷卻)中的溶液於0℃添加KBr(25.6mg,212.6μmol)在H₂O(612μL)中的溶液、TEMPO以5mg/mL在DCM中的溶液(137μL,4.25μmol)，並滴加1.56M次氯酸鈉水溶液pH 9.5(204μL,318.9μmol)。於0℃持續攪拌15min，然後於0℃添加飽和Na₂S₂O₃(1.9mL)，除去冰浴並且反應介質攪拌10min。然後以DCM萃取(3 x 20mL)，合併的有機相以H₂O(2 x 10mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在15g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到36mg的化合物61(23%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：72/28非對映異構體混合物：0.49至0.65(m,6H)；0.80至1.08(m,24H)；1.32至1.69(m,2H)；2.40(m,1H)；2.68(m,2H)；2.79(m,1H)；2.89至3.70(m,5H)；3.80(s,3H)；4.10至4.53(m,2H)；5.02(m,0.28H)；5.28(m,0.72H)；5.78至5.91(m,1H)；6.07(m,0.28H)；6.40(m,0.72H)；7.00至7.51(m,4H)；7.90(d,J=9.4Hz,0.28H)；7.98(d,J=9.4Hz,0.72H)；8.34(m,1H)；9.59(d,J=2.5Hz,0.28H)；9.63(d,J=1.8Hz,0.72H).LCMS(A5)：m/z=722[M+H]⁺；t_R=1.71min.

化合物80：1-(疊氮基甲基)-4-(溴甲基)苯

向對二甲苯二溴化物(2.0g,7.2mmol)在DMF(20mL)中的溶液在20min內添加疊氮化鈉(584.9mg,8.64mmol)在DMF(20mL)中的溶液。反應介質於室溫攪拌20h，然後傾倒至冰(100g)上並且以EtOAc(3 x 50mL)萃取。合併的有機相以飽和鹽水(3 x 15mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮，與甲苯共蒸發並藉由快速層析在70g的矽膠(溶離Et₂O)上純化得到773mg的化合物80，為無色油狀物(47%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：4.45(s,2H)；4.71(s,2H)；7.35(d,J=8.5Hz,2H)；7.47(d,J=8.5Hz,2H).

化合物81：(1R,4S,5R,6S)-6-(4-(疊氮基甲基)苄基)-4,7,7-三甲基-6-硫雜雙環[3.2.1]辛烷-6-三氟甲磺酸酯

向(1R,4R,5R)-4,7,7-三甲基-6-硫雜雙環[3.2.1]辛烷(CAS號[5718-75-2],580.1mg,3.41mmol)添加化合物80(770mg,3.41mmol)在DCM(2.2mL)中的溶液。然後滴加三氟甲磺酸鋰(2.71g,17.03mmol)在H₂O 2mL中)的溶液並且反應介質於室溫攪拌2天。然後添加H₂O(15mL)和DCM(15mL)至反應介質並於室溫持續攪拌10min。水相以DCM萃取(3 x 15mL)，合併的有機相以飽和鹽水洗滌(3 x 8mL)，經MgSO₄乾燥，過濾並真空濃縮。淡黃色油狀物在iPr₂O(5mL)中研磨，由此得到的固體經過濾，以iPr₂O(2 x 5mL)洗滌並真空乾燥得到1.266g的化合物81，為白色固體(79%)。

RMN ¹H(400MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：1.08(d,J=7.2Hz,3H)；1.45(m,1H)；1.55至1.80(m,3H)；1.69(s,3H)；1.75(s,3H)；1.99(m,1H)；2.40(d,J=13.8Hz,1H)；2.45(m,1H)；2.59(dm,J=13.8Hz,1H)；3.88(t,J=4.6Hz,1H)；4.52(s,2H)；4.60(d,J=12.8Hz,1H)；4.90(d,J=12.8Hz,1H)；7.47(d,J=8.5Hz,2H)；7.61(d,J=8.5Hz,2H).

化合物82：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(疊氮基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6-甲基-3-新戊基-6-(((三乙基甲矽烷基)氧基)甲基)-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

向化合物79(35mg,48.5μmol)和81(24.8mg,53.3μmol)在DCM(1.5mL)(於-70℃冷卻)中的溶液滴加BEMP(CAS號[98015-45-3],18.6μL, 63.0μmol)。反應混合物於-70℃攪拌2小時30分鐘，將飽和鹽水(1.5mL)添加至反應混合物，除去浴並劇烈攪拌至RT。水相以DCM(3 x 10mL)萃取，合併的有機相經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在5g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH)上純化得到10.2mg的化合物82，為無色漆狀物(24%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.61(q,J=8.1Hz,6H)；0.80(s,9H)；0.98(t,J=8.1Hz,9H)；1.02(s,3H)；1.03(d,J=7.1Hz,3H)；1.34(dd,J=2.5和14.4Hz,1H)；1.44(dd,J=10.0和14.4Hz,1H)；1.85(m,1H)；2.27(m,1H)；2.62(m,2H)；2.88(dd,J=2.6和13.5Hz,1H)；2.97(dd,J=3.7和14.2Hz,1H)；3.00(dd,J=2.3和7.3Hz,1H)；3,35(m,1H)；3.48(dd,J=9.5和14.2Hz,1H)；3.61(d,J=10.3Hz,1H)；3.81(s,3H)；3.92(d,J=2.3Hz,1H)；4.15(m,1H)；4.46(s,2H)；4.48(td,J=2.5和9.7Hz,1H)；5.10(m,1H)；5.78(dd,J=2.2和15.3Hz,1H)；6.40(ddd,J=4.3,11.6和15.3Hz,1H)；7.04(m,2H)；7.14(dd,J=2.3和8.6Hz,1H)；7.28(d,J=2.3Hz,1H)；7.33(d,J=8.4Hz,2H)；7.39(d,J=8.4Hz,2H)；7.96(d,J=9.7Hz,1H)；8.28(d,J=8.0Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=120；m/z=865[M-H]^-；m/z=867[M+H]⁺；m/z=911[M-H+HCO₂H]^-；t_R=1.87min.

實例32：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(胺基甲基)苯基)氧雜環丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6-甲基-3-新戊基-6-(((三乙基甲矽烷基)氧基)甲基)-1-氧雜-4,8,11-三氮雜環十六-13-烯-2,5,9,12-四酮

向化合物82(9.4mg,10.84μmol)在DCM(1.3mL)和MeOH(0.7mL)中的溶液添加TCEP(3.45mg,11.9μmol)在H₂O(0.7mL)中的溶液。反應介質於室溫攪拌過夜，然後添加NaHCO₃水溶液(2.5mL)並持續攪拌10min。水相以DCM(3 x 10mL)萃取，合併的有機相經MgSO₄乾燥，過濾，真空濃縮並藉由快速層析在5g的矽膠(梯度溶離DCM/MeOH/H₂O)上純化得到 4.55mg的實例32，為白色漆狀物(57%)。

RMN ¹H(500MHz,δ in ppm,DMSO-d6)：0.82(s,9H)；1.01(s,3H)；1.03(d,J=7.1Hz,3H)；1.33(dd,J=2.3和14.5Hz,1H)；1.56(dd,J=10.1和14.5Hz,1H)；1.82(m,1H)；2.27(m,1H)；2.64(m,2H)；2.88(dd,J=2.6和13.5Hz,1H)；2.92(dd,J=2.2和7.3Hz,1H)；2.96(dd,J=4.0和11.2Hz,1H)；3,19(dd,J=4.3和10.9Hz,1H)；3.41(m,2H)；3.74(s,2H)；3.81(s,3H)；3.88(d,J=2.2Hz,1H)；4.18(m,1H)；4.47(td,J=2.1和9.4Hz,1H)；4.91(dd,J=4.2和6.2Hz,1H)；5.08(m,1H)；5.76(dd,J=2.3和15.5Hz,1H)；6.40(ddd,J=3.7,11.5和15.5Hz,1H)；7.05(d,J=8.8Hz,1H)；7.11(m,1H)；7.14(dd,J=2.4和8.8Hz,1H)；7.22(d,J=8.3Hz,2H)；7.25(d,J=2.4Hz,1H)；7.35(d,J=8.3Hz,2H)；8.08(d,J=9.4Hz,1H)；8.31(d,J=8.0Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z=725[M-H]^-；m/z=727[M+H]⁺；t_R=0.79min.

藥理學結果

本發明的化合物經歷藥理學測試用於確定它們的抗腫瘤作用。還評估了式(III)的ADC的血漿穩定性。

出於說明目的，還測試了下面描繪的兩個衍生自WO2011/001052的兩個接合物ADC1和ADC2。

評價式(I)的念珠藻素化合物對HCT116和MDA-MB-231細胞系的增殖的抑制

處於其指數生長期的HCT116和MDA-MB-231細胞用胰蛋白酶處理且重新混懸在其各自的培養基(對於MDA-MB-231細胞，DMEM/F12 Gibco #21331,10% FCS Gibco #10500-056,2nM穀胺醯胺Gibco #25030；對於HCT116細胞，DMEM Gibco #11960,10% FCS Gibco #10500-056,2mM穀胺醯胺Gibco #25030)。在Cytostar 96孔培養板(GE Healthcare Europe,#RPNQ0163)中將細胞混懸液以5000個細胞/孔的密度接種在含有血清的完全培養基中。孵育4小時後，將念珠藻素化合物的連續稀釋液以由10^-7M降至10^-12M的濃度加到各孔中(每種濃度一式三份)。將細胞在37℃在含有5%CO₂的氣氛下在念珠藻素化合物存在下培養3天。第4天將10μl ¹⁴C-胸苷溶液(0.1μCi/孔,Perkin Elmer#NEC56825000)加到各孔中。實驗開始後96小時使用Microbeta放射性計數器(Perkin Elmer)對¹⁴C-胸苷的引入進行測量。通過確定就用念珠藻素化合物處理的細胞而得到的減少計數和就對照孔中的細胞(僅用培養基處理)而得到的計數之間的比例將資料表示成存活百分比形式。

抑制活性通過抑制50%活性的濃度給出。

¹式(I)的念珠藻素作為純β環氧化物或作為α和β環氧化物的混合物測試，如標題“結構備註”的欄中所說明的。文獻已知β環氧化物的能力通常是α環氧化物的50-100倍(參見例如Al-Awar R.S.,et al.,JMed Chem 2003,46,2985-3007)。

發現，式(I)的念珠藻素化合物抑制HCT116和MDA-MB-231細胞系增殖的IC₅₀在50pM至2.815nM的範圍。

評價式(III)的ADC對MDA-MB-231細胞系的增殖的抑制

處於其指數生長期的MDA-MB-231細胞用胰蛋白酶處理且重新混懸在其各自的培養基(DMEM/F12 Gibco #21331,10% FCS Gibco #10500-056,2nM穀胺醯胺Gibco #25030)。在Cytostar 96孔培養板(GE Healthcare Europe,#RPNQ0163)中將細胞混懸液以5000個細胞/孔的密度接種在含有血清的完全培養基中。孵育4小時後，將念珠藻素化合物的連續稀釋液以由10^-7M降至10^-12M的濃度加到各孔中(每種濃度一式三份)。將細胞在37℃在含有5%CO₂的氣氛下在ADC存在下培養3天。第4天將10μl ¹⁴C-胸苷溶液(0.1μCi/孔，Perkin Elmer#NEC56825000)加到各孔中。實驗開始後96小時使用Microbeta放射性計數器(Perkin Elmer)對¹⁴C-胸苷的引入進行測量。通過確定就用ADC處理的細胞而得到的減少計數和就對照孔中的細胞(僅用培養基處理)而得到的計數之間的比例將資料表示成存活百分比形式。在一些實驗中，在實驗開始時將裸抗體以1μM的濃度添加至各孔中並如前所述測量增殖抑制。

發現，式(III)的ADC的念珠藻素，以及ADC1和ADC2，抑制MDA-MB-231細胞系的增殖IC₅₀在20pM至130pM的範圍，以及單獨的ADC對ADC+裸抗體的選擇性比例在185和500之間。

確定在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後式(III)的ADC的MTD

MTD確定為對於單獨小鼠在連續3天期間不會誘導15%體重損失或者在1天內不會誘導20%體重損失或致死的最大劑量。在三隻雌性SCID小鼠中單次靜脈注射(i.v.)推注後並且在28天的處理後期間進行評估。

式(III)的念珠藻素ADC顯示在SCID小鼠中的MTD在20mg/kg至

50mg/kg的範圍。

評價在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後式(III)的ADC針對MDA-MB-231的體內抗腫瘤活性

針對在雌性SCID小鼠中皮下種植的可測量乳房MDA-MB-231異種移植物在3個劑量水準上評價體內抗腫瘤活性。對照組保持未處理。接合物藉由單次靜脈推注投予，治療日在各圖上以箭頭(▼)指示。

為了評價接合物的抗腫瘤活性，動物每週稱重兩次並且藉由測徑器每週兩次檢測腫瘤。動物體重包括腫瘤重量。腫瘤體積使用公式體積(mm³)=[長度(mm)×寬度(mm)²]/2計算。主要療效終點為△T/△C、百分比中位元數消退、部分和完全消退(PR和CR)。各處理(T)和對照(C)的腫瘤體積變化對於各腫瘤藉由從指定觀察日的腫瘤體積減去首日(分期日)治療的腫瘤體積來計算。計算治療組的中位數△T，並計算對照組的中位數△C。然後，計算比例△T/△C，並表達為百分比△T/△C=(delta T/delta C)×100。

腫瘤消退的百分比定義為在指定觀察日(t)相比於首日的首先治療(t0)的腫瘤體積的治療組中的腫瘤體積的減少。在具體時間點以及對於各動物，計算%消退。然後計算各組的中位數%消退。%消退(在t日)=((體積_t0-體積_t)/體積_t0)×100。如果腫瘤體積減少至治療開始時的腫瘤體積的50%，消退定義為部分(PR)，當不能測量腫瘤體積(0 mm³)，消退定義為完全(CR)。無瘤生存(TFS)定義為在研究結束時(>最後治療後100天)具有未檢測到腫瘤的動物。

評價在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後實例3針對MDA-MB-231體內抗 腫瘤活性

評價在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後實例7針對MDA-MB-231體內抗腫瘤活性

評價在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後實例10針對MDA-MB-231體內抗腫瘤活性

評價在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後實例14針對MDA-MB-231體內抗腫瘤活性

評價在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後實例20針對MDA-MB-231體內抗腫瘤活性

評價在SCID小鼠中單次靜脈注射投予後實例23針對MDA-MB-231體內抗腫瘤活性

這些結果顯示，所有測試的本發明的實例，以及ADC2，在0.625mg/kg至5mg/kg的劑量範圍顯示抗腫瘤活性。

在SCID小鼠中單次靜脈注射投予(5mg/kg)後確定實例3和實例7的PK參數

在雌性SCID小鼠中在藉由單次靜脈推注投予接合物後評價ADC和全部抗體的體內藥物動力學。雌性SCID小鼠(5-6周齡，平均重量20-25g)安置在層流罩中消毒條件下的滅菌室中，並且隨意飼喂。靜脈推注以一次劑量水準(10mL/kg)投予ADC(非系列設計，n=3/取樣時間)。對於各動物並且在各選擇的時間點(即，0.083,0.25,24,72,96,168,240,336h)，經由心臟穿刺採集600μL的血並且血樣然後離心(在4℃和3500tr/min進行15min)。ADC和全部抗體在血漿樣品中的量化使用免疫測定進行。血漿濃度對時間的曲線和接合物和全部抗體在小鼠中的PK參數使用非房室分析(Phoenix,WinNonLin，版本6.3)進行表徵，並描繪在圖15和16中。濃度-時間曲線下的面積，AUC(μg.天/mL)藉由梯形法則計算。在t=0的濃度C₀(μg/mL)、獲得清除率CL(L/(天.kg)和終端消除半衰期(terminal elimination half-life)t_1/2(天)並計算自該曲線。

a：資訊資料僅為AUC _ext >>30%(即42%)；b：資訊資料僅為AUC _ext >>30%(即50%)。

在SCID小鼠中單次靜脈注射投予(5mg/kg)後評價式(III)念珠藻素ADC的血漿穩定性的HRMS

來自PK研究的血漿樣品還藉由LC-HRMS進行分析。層析分析在Waters Acquity I Class和Waters Mass Prep Micro Desalting 20μm(2.1 x 5mm)柱上進行，於80℃，梯度溶離為(A)水+0.1%甲酸/(B)CH₃CN+0.1%甲酸，如下所述。

質譜在Waters QTOF Synapt G2-S設備(具有電陽性模式的電噴霧離子化(ES+))上進行。質譜以Waters Biopharmalynx軟體解卷積。得到所有測試實例的HRMS光譜，並且描繪在圖20至25中。

這些結果顯示所有測試的本發明實例不會顯示參考ADC、ADC1和ADC2所觀察到的代謝。

因此，顯然的是，本發明的化合物具有抗癌活性並且本發明的接合物顯示出在小鼠血漿中的改善的穩定性。

因此，在其另一態樣中，本發明還涉及式(I)的念珠藻素化合物或式(III)的接合物作為抗癌劑的用途。

本發明，根據其另一態樣，還提供了包含式(III)接合物的藥劑。

這些藥劑在治療上使用，特別是用於治療癌症。

根據其另一態樣，本發明涉及包含根據本發明的式(III)接合物作為活性成份的醫藥組合物。這些醫藥組合物包含有效劑量的至少一種根據本發明的式(III)接合物以及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。

該賦形劑根據醫藥上可接受之形式和所需的投予方法選自常見的賦形劑，這對於本領域技術人員是已知的。

本發明，根據其另一態樣，還提供了治療上述病理的方法，其包含向患者投予有效劑量的根據本發明的式(III)接合物。

Claims

一種式(I)念珠藻素化合物，
其中■R₁代表(C₁-C₆)烷基；■R₂代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；■R₃代表氫原子；或者，R₂和R₃與它們所連接的碳原子一起形成(C₃-C₆)環烷基；■R₄代表(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-OH基團；■R₅代表(C₁-C₆)烷基；■R₆代表氫原子；■R₇彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；■R₈代表氫原子；■R₉代表二個彼此獨立地選自以下的苯基核的取代基：(C₁-C₄)烷氧基及鹵素原子；■R₁₀代表氫原子；■W代表●(C₁-C₆)烷基-NH(R₁₁)、●(C₁-C₆)烷基-OH、或●(C₁-C₆)烷基-N₃；且■R₁₁代表氫原子。
如請求項1的式(I)念珠藻素化合物，具有以下結構：
如請求項1或請求項2的式(I)念珠藻素化合物，其特徵在於R₁代表甲基。
如請求項1或請求項2的式(I)念珠藻素化合物，其特徵在於R₂和R₃各自代表氫原子。
如請求項1或請求項2的式(I)念珠藻素化合物，其特徵在於R₂和R₃中的一個代表甲基，另一個代表氫原子。
如請求項1或請求項2的式(I)念珠藻素化合物，其特徵在於R₂和R₃與它們所連接的碳原子一起形成環丙基。
如請求項1或請求項2的式(I)念珠藻素化合物，其特徵在於R₄和R₅各自代表甲基。
如請求項1或請求項2的式(I)念珠藻素化合物，其特徵在於R₆代表氫原子。
如請求項1或請求項2的式(I)念珠藻素化合物，其特徵在於R₇和R₈彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基。
如請求項1或請求項2的式(I)念珠藻素化合物，其特徵在於R₉代表兩個選自甲氧基和氯原子的取代基。
如請求項1或請求項2的式(I)念珠藻素化合物，其特徵在於：■R₁代表(C₁-C₆)烷基；■R₂和R₃各自代表氫原子；■R₆代表氫原子； ■R₉代表兩個選自甲氧基和氯原子的取代基；和■R₁₀代表氫原子。
如請求項1或請求項2的式(I)念珠藻素化合物，其特徵在於：■R₁代表(C₁-C₆)烷基；■R₂和R₃中的一個代表(C₁-C₆)烷基，且另一個代表氫原子；■R₆代表氫原子；■R₉代表兩個選自甲氧基和氯原子的取代基；和■R₁₀代表氫原子。
如請求項1或請求項2的式(I)念珠藻素化合物，其特徵在於W代表CH₂-NH₂或CH₂-OH基。
如請求項1的式(I)念珠藻素化合物，其選自以下：
一種式(II)念珠藻素有效負載，
其中 ■R₁代表(C₁-C₆)烷基；■R₂代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；■R₃代表氫原子；或者，R₂和R₃與它們所連接的碳原子一起形成(C₃-C₆)環烷基；■R₄代表(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-OH基團；■R₅代表(C₁-C₆)烷基；■R₆代表氫原子；■R₇彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；■R₈代表氫原子；■R₉代表二個彼此獨立地選自以下的苯基核的取代基：(C₁-C₄)烷氧基及鹵素原子；■R₁₀代表氫原子；■Y選自(C₁-C₆)烷基-NR₁₁、(C₁-C₆)烷基-O、C(=O)O、C(=O)NH、或(C₁-C₆)烷基-三唑基團；■R₁₁代表氫原子；■L代表連接基；且■RCG1代表存在於連接基端部的反應性化學基團，且其中L係下式(IV)：
其中：■L1代表■單鍵或如Y=(C₁-C₆)烷基-NR₁₁時，代表NR₁₆(雜)芳基-CR₁₅R₁₄-O-C(=O)基；■如Y=(C₁-C₆)烷基-O時，代表NR₁₈-(C₂-C₆)烷基-NR₁₇-C(=O)基；■R₁₁、R₁₄、R₁₅、R₁₆、R₁₇及R₁₈彼此獨立，代表氫原子或(C₁-C₆)烷基； ■(AA)_w代表經由肽鍵連接在一起之w個胺基酸AA的序列；■w代表範圍為1至12之整數；■L2代表(C₁-C₆)烷基；AA表示構型D或L之天然或非天然胺基酸，其選自：丙胺酸(Ala)、β-丙胺酸、γ-胺基丁酸、2-胺基-2-環己基乙酸、2-胺基-2-苯基乙酸、精胺酸(Arg)、天冬醯胺(Asn)、天冬胺酸(Asp)、瓜胺酸(Cit)、半胱胺酸(Cys)、α,α-二甲基-γ-胺基丁酸、β,β-二甲基-γ-胺基丁酸、穀胺醯胺(Gln)、谷胺酸(Glu)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、異亮胺酸(Ile)、亮胺酸(Leu)、賴胺酸(Lys)、ε-乙醯基-賴胺酸(AcLys)、甲硫胺酸(Met)、鳥胺酸(Orn)、苯丙胺酸(Phe)、脯胺酸(Pro)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、纈胺酸(Val)、代表丙胺酸(Ala)、瓜胺酸(Cit)、穀胺醯胺(Gln)、甘胺酸(Gly)、ε-乙醯基-賴胺酸(AcLys)、纈胺酸(Val)之序列AA；RCG1選自：- -C(=O)-Z_aR_a基，其中■Z_a選自單鍵、O或NH，且■R_a代表H或(C₁-C₆)烷基、(C₃-C₇)環烷基、(C₆-C₁₀)芳基、(C₅-C₁₀)雜芳基或(C₃-C₇)雜環烷基或琥珀醯亞胺基； - 下列反應基團之一：馬來醯亞胺基
基；鹵基乙醯胺基
，其中R₁₃代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；-Cl；-N₃；-OH；-SH； -NH₂； -C≡CH、
基或O-(C₁-C₆)烷基羥基胺基。
如請求項15的式(II)念珠藻素有效負載，具有以下結構：
如請求項15或請求項16的式(II)念珠藻素有效負載，其特徵在於Y代表(C₁-C₆)烷基-NR₁₁。
如請求項17的式(II)的念珠藻素有效負載，其特徵在於Y代表CH₂-NH。
如請求項15的式(II)念珠藻素有效負載，其選自以下：
一種式(III)接合物，
其中■R₁代表(C₁-C₆)烷基；■R₂代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；■R₃代表氫原子；或者，R₂和R₃與它們所連接的碳原子一起形成(C₃-C₆)環烷基；■R₄代表(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷基-OH基團；■R₅代表(C₁-C₆)烷基；■R₆代表氫原子；■R₇彼此獨立地代表氫原子或(C₁-C₆)烷基；■R₈代表氫原子；■R₉代表二個彼此獨立地選自以下的苯基核的取代基：(C₁-C₄)烷氧基及鹵素原子；■R₁₀代表氫原子；■Y和L如在請求項15中所定義的；■G代表RCG1和RCG2之間的反應產物，RCG1為存在於連接基端部的反應性基團，RCG2為在Ab上存在的正交反應性基團；■Ab代表抗體；■其中G選自：
如請求項20的式(III)接合物，具有以下結構：
如請求項20或請求項21的式(III)接合物，其特徵在於RCG2選自：■賴胺酸中由賴胺酸殘基的側鏈所帶有的存在於抗體表面的ε-胺基；■抗體重鏈和輕鏈的N-末端胺基酸的α-胺基；■鉸鏈區的糖基；■半胱胺酸中藉由還原鏈內二硫鍵而形成的巰基或者工程化半胱胺酸的巰基；■一些穀胺醯胺殘基的側鏈所帶有的存在於抗體表面的醯胺基團；■使用產生甲醯基甘胺酸的酶引入的醛基。
如請求項20或請求項21的式(III)接合物，其特徵在於：■當RCG1代表N-羥基琥珀醯亞胺基酯時，RCG2代表-NH₂基團；■當RCG1代表馬來醯亞胺基或鹵代乙醯胺基官能團或-C1時，RCG2代表-SH；■當RCG1代表-N₃基團時，RCG2代表-C≡CH或活化的C≡C；■當RCG1代表-OH或-NH₂時，RCG2代表羧酸或醯胺官能團；■當RCG1代表-SH時，RCG2代表馬來醯亞胺基或鹵代乙醯胺基官能團；■當RCG1代表-C≡CH官能團或活化的C≡C時，RCG2代表-N₃；■當RCG1代表O-烷基羥基胺官能團或Pictet-Spengler反應底物時，RCG2代表醛或酮官能團。
一種製備式(I)念珠藻素化合物的方法，包括以下步驟：
其中：- 步驟(i)為片段AD3和備選地BC之間在偶聯劑的存在下的肽的偶聯；- 步驟(ii)為在催化劑的存在下藉由閉環置換反應的大環化；- 步驟(iii)為p-甲氧基苄基醚在酸性條件下的脫保護；- 步驟(iv)為使用氧化劑氧化醇；- 步驟(v)為藉由使用適當取代的異硫代桉樹腦衍生的對掌性鋶在鹼的存在下的不對稱Corey-Chaykovsky反應引入環氧化物； - 步驟(vi)為疊氮基的還原。
一種製備式(III)接合物的方法，包括以下步驟：(i)將以下置於接觸並讓其反應：- 視情況借助修飾劑進行修飾的抗體的視情況緩衝的水溶液，和- 如請求項15或16之一定義的式(II)念珠藻素有效負載的溶液，式(II)念珠藻素有效負載的化學基團RCG1對於在抗體上存在的化學基團RCG2具有反應性、特別是對於在抗體上存在的胺基具有反應性，該化學基團RCG2在適當時已經藉由修飾劑引入，從而藉由形成共價鍵將式(II)念珠藻素有效負載連接至抗體；(ii)以及然後視情況地從式(II)的念珠藻素有效負載和/或未反應的抗體和/或可能已經形成的任何聚集體中分離在步驟(i)中形成的接合物。
一種藥物，其特徵在於其包含如請求項20或請求項21的式(III)接合物。
一種醫藥組合物，其特徵在於其包含如請求項20或請求項21的式(III)接合物、以及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
一種如請求項1或請求項2的式(I)念珠藻素化合物於製造抗癌劑的用途。
一種如請求項20或請求項21的式(III)接合物於製造抗癌劑的用途。
如請求項1或請求項2的式(I)的念珠藻素化合物，其用於治療癌症。
如請求項20或請求項21的式(III)接合物，其用於治療癌症。