HK1204273B

HK1204273B - 细胞毒性肽及其抗体-药物缀合物

Info

Publication number: HK1204273B
Application number: HK15104828.3A
Authority: HK
Inventors: M‧D‧乔罗斯基; A‧马代尔纳; C‧J‧奥唐奈; C‧苏布拉曼亚姆; B‧C‧韦特利诺; R‧G‧杜申; P‧施特罗普; E‧I‧格拉西亚尼
Original assignee: 辉瑞公司
Priority date: 2011-11-17
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2018-05-04

Description

细胞毒性肽及其抗体-药物缀合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年11月17日提交的美国临时申请61/561,255与2012年7月27日提交的美国临时申请61/676,423的优先权，此二案整体援引加入本文。

发明领域

本发明涉及用作抗体-药物缀合物(ADC)中的有效负载的新的肽系化合物与用于ADC方面的有效负载-连接基化合物。本发明还涉及包含前述有效负载、有效负载-连接基和ADC的组合物以及利用这些有效负载、有效负载-连接基和ADC治疗病理状况(包括癌症)的方法。

背景技术

药物与抗体直接缀合或通过连接基缀合涉及下列多种因素的考虑：包括用于药物缀合的化学基团的特性与位置、药物释放机制、提供药物释放的结构单元及所释放的游离药物的结构修饰。此外，若药物在抗体内化作用之后被释放，则药物释放的机制必须与缀合物的细胞内运输一致。

当尝试过通过抗体递送多种不同的药物种类时，只有几类药物被证明有效作为抗体-药物缀合物同时具有合适的毒性谱。其中一种此类药物是奥里斯他汀(auristatin)(天然产物多拉司他汀10的衍生物)。代表性奥里斯他汀包括(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸(dolaisoleuine)-海兔脑氨酸(dolaproine)-去甲麻黄碱)与(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸-海兔脑氨酸-苯丙氨酸)。然而，对于具有改善的性质的其他奥里斯他汀仍有所需求。

发明概述

本发明涉及下式表示的细胞毒性五肽或其药学上可接受的盐或溶剂合物以及其抗体-药物缀合物：

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基，或R¹是连接基或连接基-抗体，例如

Y是-C₂-C₂₀亚烷基-、-C₂-C₂₀杂亚烷基(heteroalkylene)-、-C₃-C₈碳环基-、-亚芳基-、-C₃-C₈杂环基-、-C₁-C₁₀亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈碳环基)-、-(C₃-C₈碳环基)-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈杂环基)-或-(C₃-C₈杂环基)-C₁-C₁₀亚烷基-；

Z是

G是卤素、-OH、-SH或-S-C₁-C₆烷基；

L是抗体；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B如下列中的任一定义：

(i)R^3A是氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基、芳烷基或卤素；和

R^3B是C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基、芳烷基或卤素；或

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R^4A与R^4B如下列中的任一定义：

(i)R^4A是氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基或芳烷基；和

R^4B是氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基或芳烷基；或

(ii)R^4A与R^4B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

C₁-C₁₀杂环基、C₃-C₈碳环基和C₆-C₁₄芳基，其任选地被1、2、3、4或5个独立地选自下列的基团取代：-C₁-C₈烷基、-C₁-C₈烷基-N(R')₂、-C₁-C₈烷基-C(O)R'、-C₁-C₈烷基-C(O)OR'、-O-(C₁-C₈烷基)、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)N(R')₂、-NHC(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)R'、-OH、卤素、-N₃、-N(R')₂、-CN、-NHC(＝NH)NH₂、-NHCONH₂、-S(＝O)₂R'和-SR'，其中每该R'独立地选自：氢、C₁-C₈烷基和未取代芳基，或两个R'可与它们所连接的氮起形成C₁-C₁₀杂环基；

或R⁵是

其任选地被1、2、3、4或5个独立地选自下列的基团取代：C₁-C₈烷基、-C₁-C₈烷基-N(R')₂、-C₁-C₈烷基-C(O)R'、-C₁-C₈烷基-C(O)OR'、-O-(C₁-C₈烷基)、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)N(R')₂、-NHC(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)R'、-OH、卤素、-N₃、-N(R')₂、-CN、-NHC(＝NH)NH₂、-NHCONH₂、-S(＝O)₂R'、-SR'和亚芳基-R'，其中每个R'独立地选自：氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈杂环基、C₁-C₁₀亚烷基-C₃-C₈杂环基和芳基，或两个R'可与它们所连接的氮一起形成C₁-C₁₀杂环基；

R⁶是氢、-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基、-C₂-C₈炔基或-C₁-C₈卤代烷基；

R¹²是氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀杂环基或C₆-C₁₄芳基；

R¹³是C₁-C₁₀杂环基；和

R⁷是F、Cl、I、Br、NO₂、CN与CF₃；

h是1、2、3、4或5；和

X是O或S；

条件是：在R^3A是氢时，X是S。

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B如下列中的任一定义：

R^3B是C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基、芳烷基、卤素或氢；或

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R^4A与R^4B如下列中的任一定义：

(ii)R^4A与R^4B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

其任选地被1、2、3、4或5个独立地选自下列的基团取代：C₁-C₈烷基、-O-(C₁-C₈烷基)、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH₂、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')₂、-NHC(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)R'、-OH、卤素、-N₃、-NH₂、-NH(R')、-N(R')₂、-CN、-NHC(＝NH)NH₂、-NHCONH₂、-S(＝O)₂R'和-SR'，其中每个R'独立地选自下列：氢、C₁-C₈烷基与未取代芳基；

R¹¹是氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基，或R¹¹是连接基或连接基-抗体，例如

Y是C₂-C₂₀亚烷基或C₂-C₂₀杂亚烷基、C₃-C₈碳环基-、-亚芳基-、-C₃-C₈杂环基-、-C₁-C₁₀亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈碳环基)-、-(C₃-C₈碳环基)-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈杂环基)-或-(C₃-C₈杂环基)-C₁-C₁₀亚烷基-；

Z是

G是卤素、-OH、-SH或-S-C₁-C₆烷基；

L是抗体；

R⁷是F、Cl、I、Br、NO₂、CN与CF₃；

h是1、2、3、4或5；和

X是O或S。

本发明另一方面涉及药物组合物，其包含有效量的任一前述化合物和/或任一前述抗体-药物缀合物与药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明另一方面涉及通过向有此需要的患者给药有效量的任一前述化合物和/或任一前述抗体-药物缀合物来使用有效量的所述化合物和/或缀合物治疗癌症的方法。

本发明另一方面涉及治疗癌症的方法，其中所述癌症包括肿瘤、转移、或以不受控制的细胞生长为特征的其它疾病或病症，其中所述癌症选自：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、胃癌和睪丸癌。

附图简述

图1表示绘制为肿瘤体积对时间的图的四种缀合物(各以1mg/kg剂量给药，Q4dx4)的抗肿瘤活性。

图2表示绘制为经药物治疗的肿瘤体积/经媒介物治疗的肿瘤体积对时间的图的六种缀合物(各以1mg/kg剂量给药，Q4dx4)的抗肿瘤活性。

图3表示在1mg/kg剂量下测试H(C)-#D54与H(C)-vcMMAE的结果。

图4A、4B与4C表示[A]在MDA-MB-361-DYT2小鼠异种移植物体内筛选模型中测试H(C)-#D54与H(K)-MCC-DM1的结果；[B]在MDA-MB-361-DYT2小鼠异种移植物体内筛选模型中测试H(C)-vcMMAE与H(C)-mcMMAF的结果；和[C]对全部四种缀合物的计算T/C的比较。用q4dx4治疗小鼠，在第1日开始。

图5A、5B、5C、5D、5E与5F表示在N87小鼠异种移植物体内筛选模型中测试[A]H(C)-#D54、[B]H(C)-vcMMAE、[C]H(C)-mcMMAF与[D]H(K)-MCC-DM1的剂量反应结果；[E]对H(C)-#D54与H(C)-vcMMAE作比较；与[F]对全部四种缀合物的T/C作比较。q4dx4治疗小鼠，在第1日开始。

图6表示在N87小鼠异种移植物体内模型中测试H(C)-#A115(1mpk、3mpk与10mpk)的剂量反应结果。q4dx4治疗小鼠，在第1日开始。

图7显示在具有PC3MM2细胞(一种表达IL-13Rα2受体的人前列腺癌细胞系)的体内异种移植模型中测试的与vc-0101或与mc-3377缀合的人源化抗体hu08的对比数据。

图8A-E显示[A]在HCC2429肺异种移植物中以5mg/kg剂量给药的大鼠-人嵌合抗Notch ADC的效力；[B和C]在MDA-MB-468乳腺异种移植物中以5mg/kg剂量给药的大鼠-人嵌合抗Notch ADC的效力；[D与E]在N87胃异种移植物中以5mg/kg剂量给药的大鼠-人嵌合抗Notch ADC的效力。发明详述

本发明涉及细胞毒性五肽、包含所述细胞毒性五肽的抗体-药物缀合物以及用其治疗癌症及其它病理状况的方法。本发明还涉及用此类化合物和/或缀合物在体外、原位和体内检测、诊断或治疗哺乳动物细胞或相关病理状况的方法。

定义及缩写

除非另外说明，否则本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。当本文中使用商品名时，除非另外由上下文指出，否则该商品名包含产品制剂、非专利药和该商品名产品的一种或多种活性药物成分。

本文中的术语“抗体”(或“Ab”)按最广义使用，并特别涵盖全单克隆抗体、多克隆抗体、单一特异性抗体、多特异性抗体(例如双重特异性抗体)以及表现出期望的生物活性的抗体片段。全抗体主要有两个区：可变区与恒定区。可变区与靶抗原结合并相互作用。可变区包含互补决定区(CDR)，其识别并结合到特定抗原上的特异性结合位点。恒定区可被免疫系统识别并相互作用(请参见，例如Janeway等人,2001,Immuno.Biology,5th Ed.,Garland Publishing,New York)。抗体可以是任一类型或种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD与IgA)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以源自任一合适的物种。在一些实施方案中，抗体源自人类或鼠类。抗体可以是(例如)人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

术语“特异性结合”与“特异结合”指与预定的抗原结合的抗体。代表性地，抗体用至少约1x10⁷M^-1的亲和力结合，并用至少为其与除预定的抗原或密切相关的抗原以外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力的2倍的亲和力与预定的抗原结合。

本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本同源的抗体的种群得到的抗体，即除了可能少量存在的可能的自然突变体以外包含种群的各抗体是相同的。单克隆抗体高度特异地针对单抗原位点。修饰词“单克隆”指出从基本同源的抗体种群得到的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定的方法制备抗体。

术语“单克隆抗体”特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部份与源自特定物种或属于特定的抗体种类或亚类的相应的抗体序列相同或同源，而链的剩余部分与源自另外的物种或属于另外的抗体种类或亚类的相应的抗体序列及此类抗体的片段相同或同源，只要其表现出期望的生物活性。

本文中所用的“H(C)-”指曲妥珠单抗(trastuzumab)(商品名其是通过其胱氨酸之一与本发明的化合物结合的干扰HER2/neu受体的单克隆抗体。本文中所用的“H(K)-”指曲妥珠单抗，其是通过其赖氨酸之一与本发明的化合物结合的干扰HER2/neu受体的单克隆抗体。

“全抗体”是包含抗原结合可变区及轻链恒定区(C_L)与重链恒定区C_H1、C_H2、C_H3与C_H4(视抗体种类而定)的抗体。恒定区可以是自然序列恒定区(例如人自然序列恒定区)或其氨基酸序列变异体。

全抗体可能具有一或多种“效应子功能”，其指可归因于抗体的Fc区(例如自然序列Fc区或氨基酸序列变异体Fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括补体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用。

“抗体片段”包含全抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、线性抗体、单链抗体分子、scFv、scFv-Fc、由抗体片段形成的多特异性抗体片段、由Fab expressionlibrary制得的片段、或与靶抗原(例如癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)免疫特异性结合的上述中的任一者的表位结合片段。

在抗体的上下文，中术语“可变的”指抗体的可变区的某些部份，其在序列上大为不同，并用于各种特定抗体对其特定抗原的结合与特异性。此可变性集中于轻链可变区与重链可变区中的三个被称为“超变区”的片段。可变区的较高度保守的部分被称为框架区(FR)。自然重链与轻链的可变区各包含四个被三个超变区连结的框架区。

本文中所用的术语“超变区”指负责与抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如在轻链可变区中的第24到34位残基(L1)、第50到56位残基(L2)与第89到97位残基(L3)，以及在重链可变区中的第31到35位残基(H1)、第50到65位残基(H2)与第95到102位残基(L3)；Kabat等人(Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“超变循环(hypervariableloop)”的那些残基(例如在轻链可变区中的第26到32位残基(L1)、第50到52位残基(L2)与第91到96位残基(L3)，与在重链可变区中的第26到32位残基(H1)、第53到55位残基(142)与第96到101位残基(H3)；Chothia and Lesk,1987,J。Mol。Biol。196:901-917)。FR残基是除本文所定义的超变区残基以外的那些可变区残基。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V.sub.H区与V.sub.L区，其中这些区存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽还包含在V.sub.H区与V.sub.L区之间的多肽连接基，其使得scFv能够形成用于抗原结合的期望的结构。对于scFv的综述，请参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。

术语“双特异抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，上述片段包含在同一多肽链中与轻链可变区(V_L)连结的重链可变区(V_H)。通过使用过短而不能使在同一链上的两个区之间配对的连接基迫使所述区与另一链的互补区配对并产生两个抗原结合位点。双特异抗体更完整的说明请参见(例如)EP0404097；WO93/11161；与Hollinger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448。

非人(例如啮齿类动物)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列。就绝大部分而言，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的超变区的残基被替换为具有期望的特异性、亲和力与能力的源自非人物种例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(供体抗体)的超变区的残基。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被替换为相应的非人残基。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或在供体抗体中没被发现的残基。进行这些修饰以进一步纯化抗体效能。一般说来，人源化抗体会包含至少一个，通常两个可变区的基本全部，其中超变循环的全部或基本全部对应于非人免疫球蛋白超变循环的那些，且FR的全部或基本全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地也会包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人类免疫球蛋白的Fc。进一步的细节请参见Jones等人,1986,Nature321:522-525；Riechmann等人,1988,Nature332:323-329；与Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。

本文中所用的“分离的”表示从(a)天然来源(例如植物或动物细胞或细胞培养物)或(b)合成的有机化学反应混合物的其它成分中分离的。本文中所用的“纯化的”表示在分离时，分离物含有以所述分离物的重量计至少95％，另一方面至少98％的化合物(例如缀合物)。

“分离的”抗体是已被识别并从其天然环境的成分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并可包括酶类、激素及其它蛋白质类或非蛋白质类溶质。在优选实施方案中，抗体会(1)被纯化到多于95重量％的抗体(由Lowry法测得)，最优选多于99重量％的抗体，(2)被纯化到足够得到至少15个N端或内部氨基酸序列的残基的程度(利用旋杯式顺序分析仪)，或(3)在使用考马斯蓝或优选银染料的还原或非还原条件下被SDS-PAGE纯化到均质。由于抗体的自然环境中的至少一个成分不会存在，分离抗体包括在重组细胞内的原位抗体。然而，通常经至少一个纯化步骤会制得分离抗体。

“诱导凋亡”的抗体是诱导通过下列方法测定的程序性细胞死亡的抗体：钙磷脂结合蛋白V的结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网扩张、细胞断裂和/或膜囊(被称为凋亡小体)形成。细胞是肿瘤细胞，例如乳腺细胞、卵巢细胞、胃细胞、子宫内膜细胞、唾液腺细胞、肺细胞、肾细胞、结肠细胞、甲状腺细胞、胰脏细胞或膀胱细胞。可用多种方法评估凋亡相关的细胞事件。例如，可通过膜联蛋白结合测得磷脂酰丝氨酸(PS)易位；可通过DNA laddering评估DNA断裂；和可由亚二倍体细胞的任何增加评估伴随DNA断裂的核染色质凝聚。

术语“治疗有效量”指有效治疗哺乳动物的疾病或病症的药物的量。在癌症的情况下，治疗有效量的药物可能减使癌细胞数目；减小肿瘤尺寸；抑制(即减慢到某种程度，优选使之停止)癌细胞浸润外周器官；抑制(即减慢到某种程度，优选使之停止)肿瘤转移；抑制(到某种程度)肿瘤生长；和/或缓解(到某种程度)与癌症有关的一或多种症状。在药物可能抑制现存癌细胞的生长和/或杀死现存癌细胞的程度上，所述药物可能是细胞生长抑制和/或细胞毒性的。对癌症治疗而言，可通过(例如)评估疾病进展时间(TTP)和/或测定反应速率(RR)来测得效力。

术语“大量(substantial amount)”指种群、混合物或样品中的大多数(即多于50％)。

术语“细胞内代谢产物”指在抗体-药物缀合物(ADC)上的细胞内的代谢过程或反应产生的化合物。代谢过程或反应可能是酶过程，例如ADC的肽连接基的蛋白水解。细胞内代谢产物包括(但不限于)在进入、扩散、摄取或运输到细胞后已发生细胞内裂解的抗体与游离药物。

术语“细胞内裂解”指在ADC上的细胞内的代谢过程或反应等，由此破坏共价连接(例如在药物部分与抗体之间的连接基)而产生游离药物或从细胞内抗体解离的缀合物的其它代谢产物。因此ADC的被裂解部分是细胞内代谢产物。

术语“生物利用率”指给药至患者的给定量的药物的全身利用率(即血液/血浆水平)。生物利用率是指示从给药的剂型达到全身循环的药物的时间(速率)与总量(程度)二者的测量值的绝对术语。

术语“细胞毒性”指ADC的杀细胞、细胞生长抑制或抗增殖作用或所述ADC的细胞内代谢产物。细胞毒性可被表示为IC₅₀值，其是每单位体积的半数细胞存活浓度(摩尔或质量)。

“病症”是会得益于药物或抗体-药物缀合物的治疗的任何病况。其包括慢性和急性的病症或疾病，包括使哺乳动物易患前述病症的那些病理状况。本文中待治疗病症的非限制性实例包括：良性及恶性癌症；白血病及淋巴恶性肿瘤、神经元病症、神经胶质病症、星形细胞病症、下丘脑病症与其它腺体的病症、巨噬细胞病症、上皮病症、间质病症与囊胚腔病症；以及炎性病症、血管发生病症和免疫性病症。

术语“癌症”与“癌症的”指或说明通常以不受控制的细胞生长为特征的哺乳动物的生理病况或病症。“肿瘤”包含一或多种癌细胞。

“患者”的实例包括(但不限于)：人、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴、猪、山羊、乳牛、马、犬、猫、鸟与家禽。在示例性实施方案中，患者是人。

术语“治疗”指(除非另外由上下文来指出)防止复发的治疗性治疗与预防性措施，其中目的是抑制或减慢(减轻)不期望的生理变化或病症，例如癌症的产生或蔓延。为了本发明的目的，有利的或期望的临床结果包括(但不限于)：症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或减轻、以及可检测或不可检测的缓解(不管是部份的或全部的)。与在未接受治疗下预期的存活相比，“治疗”也可以表示延长存活。需要治疗的对象包括已经有病况或病症的那些以及易于有病况或病症的那些。

在癌症情况下，术语“治疗”包括下列中的任一者或全部：抑制肿瘤细胞、癌细胞生长、或抑制肿瘤生长；抑制肿瘤细胞或癌细胞复制、减轻总体肿瘤负荷或减少癌细胞数目、以及改善与疾病有关的一或多种症状。

在自身免疫性疾病的情况下，术语“治疗”包括下列中的任一者或全部：抑制与自身免疫性疾病状态有关的细胞(包括但不限于产生自身免疫抗体的细胞)复制、减轻自身免疫抗体负荷和改善自身免疫性疾病的一或多种症状。

在传染性疾病的情况下，术语“治疗”包括下列中的任一者或全部：抑制引起传染性疾病的病原的生长、增殖或复制以及改善传染性疾病的一或多种症状。

术语“药品说明书”用于指通常在治疗产品的商品包装中包含的说明，其含有关于适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或对于此类治疗产品用途的警告的信息。

本文中所用的术语“细胞”、“细胞系”与“细胞培养物”可交替使用，且所有此类名称包括子代。“转化体”与“转化细胞”包括主要的受试细胞与源自其的培养物或后代(与转化数无关)。同样应理解，由于故意的突变或非故意的突变，所有后代的DNA含量不可能正好相同。这包括具有与如对初代转化细胞进行筛选的相同的功能或生物活性的突变体后代。在意图不同名称的情形中，可从上下文中清楚看出。

除非另外指定，本身或作为另一术语的一部份的术语“烷基”指具有指定数目的碳原子的直链或支链的饱和烃(例如“C₁-C₈”烷基指具有1至8个碳原子的烷基)。在未指定碳原子数的时候，烷基具有1至8个碳原子。代表性直链C₁-C₈烷基包括(但不限于)：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基与正辛基；而支链C₁-C₈烷基包括(但不限于)：-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基与-2-甲基丁基；不饱和C₂-C₈烷基包括(但不限于)：乙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基与3-甲基-1-丁炔基。

除非另外指定，本身或作为另一术语的一部份的术语“亚烷基”指具有指定数目的碳原子(通常1至18个碳原子)并具有从母体烷的同一碳原子或两个不同的碳原子除去两个氢原子得到的两个单价基团中心的饱和支链或直链或环状的烃。代表性亚烷基包括(但不限于)：亚甲基(-CH₂-)、1,2-亚乙基(-CH₂CH₂-)、1,3-亚丙基(-CH₂CH₂CH₂-)、1,4-亚丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₂-)等。“C₁-C₁₀”直链亚烷基是式-(CH₂)_1-10-所示的直链饱和烃基团。C₁-C₁₀亚烷基的实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基与亚癸基。

除非另外指定，术语“杂烷基”本身或与另一术语合并表示(除非另外指定)完全饱和的或含有1至3个不饱和度的稳定的直链或支链的烃或其组合，其由指定数目的碳原子与1至3个选自O、N、Si与S的杂原子组成，且其中氮原子与硫原子可任选地被氧化且氮杂原子可任选地被季铵化。杂原子O、N与S可被置于杂烷基的任一内部位置。杂原子Si可被置于杂烷基的任一位置，包括烷基被连接到分子的剩余部分的位置。多达两个杂原子可以是相邻的。

除非另外指定，本身或作为另一取代基的一部份的术语“杂亚烷基”表示源自杂烷基(如前详述)的二价基团。对杂亚烷基而言，杂原子也可以占据链的任一端或二端。

除非另外指定，本身或作为另一术语的一部份的术语“芳基”表示从母体芳环系统的单个碳原子除去一个氢原子而得到的具有6至20个(优选6至14个)碳原子的取代或未取代的单价碳环芳族烃基团。代表性芳基包括(但不限于)源自苯、取代苯、萘、蒽、联苯等的基团。取代碳环芳族基团(例如芳基)可被一或多个(优选1至5个)下列基团取代：C₁-C₈烷基、-O-(C₁-C₈烷基)、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH₂、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')₂、-NHC(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)R'、-OH、卤素、-N₃、-NH₂、-NH(R')、-N(R')₂与-CN；其中每个R'独立地选自-H、C₁-C₈烷基和未取代芳基。在一些实施方案中，取代碳环芳族基团可另外包含下列中的一或多者：-NHC(＝NH)NH₂、-NHCONH₂、-S(＝O)₂R'和-SR'。“亚芳基”是相应的二价基团。

“取代烷基”表示其中一或多个氢原子各自独立地被取代基替换的烷基。代表性取代基包括(但不限于)：-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR₂、-NR₃、＝NR、-CX₃、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO₂、＝N₂、-N₃、-NRC(＝O)R、-C(＝O)NR₂、-SO₃ ^-、-SO₃H、-S(＝O)₂R、-OS(＝O)₂OR、-S(＝O)₂NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)₂、-P(＝O)(OR)₂、-PO₃ ^2-、PO₃H₂、-AsO₂H₂、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO₂R、-CO₂ ^-、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR₂、-C(＝S)NR₂或-C(＝NR)NR₂，其中每个X独立地是卤素(-F、-Cl、-Br或-I)；且每个R独立地是-H、C₁-C₂₀烷基、C₁-C₂₀杂烷基、C₆-C₂₀芳基、C₁-C₁₀杂环基、保护基或前药部分。前述芳基、亚烷基与杂亚烷基也可被类似地取代。

除非另外指定，本身或作为另一术语的一部份的“芳烷基”表示被如前所定义的芳基取代的如前所定义的烷基。

除非另外指定，本身或作为另一术语的一部份的“C₁-C₁₀杂环基”指一价取代或未取代芳族或非芳族的单环、二环或三环系统，其具有1至10个(优选3至8个)碳原子(也被称为环成员)与1至4个独立地选自N、O、P或S的杂原子环成员，并通过从母体环系统的环原子除去一个氢原子而得到。杂环基中的一或多个N、C或S原子可被氧化。包含杂原子的环可以是芳环或非芳环。除非另外指明，杂环基在产生稳定结构的任一杂原子或碳原子上与其侧基连接。C₁-C₁₀杂环基的代表性实例包括(但不限于)：四氢呋喃基、氧杂环丁烷基、吡喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、吲哚基、苯并吡唑基、吡咯基、噻吩基(噻吩)、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、包括例如1,2,3,4-四氢喹啉基在内的喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异噁唑基、四唑基、环氧基、氧杂环丁烷基和BODIPY(取代或未取代的)。C₁-C₁₀杂环基可被多达七个基团取代，所述基团包括(但不限于)：C₁-C₈烷基、C₁-C₈杂烷基、-OR'、芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH₂、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')₂、-NHC(O)R'、-S(＝O)₂R'、-S(O)R'、卤素、-N₃、-NH₂、-NH(R')、-N(R')₂和-CN；其中每个R'独立地选自-H、C₁-C₈烷基、C₁-C₈杂烷基和芳基。在一些实施方案中，取代杂环基也可包括下列基团中的一或多者：-NHC(＝NH)NH₂、-NHCONH₂、-S(＝O)₂R'和-SR'。“杂环基”“C₁-C₁₀杂环基”是相应的二价基团。

除非另外指定，本身或作为另一术语的一部份的“杂芳烷基”表示被如前所定义的芳族杂环基取代的如前所定义的烷基。杂芳亚烷基(heteroaralklo)是相应的二价基团。

除非另外指定，本身或作为另一术语的一部份的“C₃-C₈碳环基”是通过从母体环系统的环原子除去一个氢原子而得到的3-、4-、5-、6-、7-、或8-元单价的取代或未取代的饱和或不饱和非芳族单环或二环碳环。代表性C₃-C₈碳环基包括(但不限于)：环丙基、环丁基、环戊基、环戊二烯基、环己基、环己烯基、1,3-环己二烯基、1,4-环己二烯基、环庚基、1,3-环庚二烯基、1,3,5-环庚三烯基、环辛基、环辛二烯基、双环(1.1.1.)戊烷和双环(2.2.2.)辛烷。C₃-C₈碳环基可以是未取代的或被多达七个基团取代，所述基团包括(但不限于)：C₁-C₈烷基、C₁-C₈杂烷基、-OR'、芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH₂、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')₂、-NHC(O)R'、-S(＝O)₂R'、-S(＝O)R'、-OH、-卤素、-N₃、-NH₂、-NH(R')、-N(R')₂和-CN；其中每个R'独立地选自-H、C₁-C₈烷基、C₁-C₈杂烷基和芳基。“C₃-C₈亚碳环基(C₃-C₈carbocyclo)”是相应的二价基团。

术语“手性的”指具有镜像配偶体(mirror image partner)的不可重迭性质的分子，而术语“非手性的”指对它们的镜像配偶体可重迭的分子。

术语“立体异构体”指具有相同的化学组成但原子或基团在空间中的排列不同的化合物。

“非对映异构体”指具有二或更多个手性中心且其分子不为彼此的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、波谱特性与反应性。非对映异构体混合物可在高分辨分析操作(例如电泳与色谱法)下分离。

本发明中所用的立体化学定义与规则一般遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms,McGraw-Hill Book Company,New York(1984)；与Elieland Wilen,Stereochemistry of Organic Compounds,John Wiley&Sons,Inc.,New York(1994)。许多有机化合物以旋光性形式存在，即其具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述旋光性化合物的情形下，前缀D与L或R与S用来表示在其手性中心附近的分子的绝对构型。前缀d与l或(+)与(-)用来表明化合物旋转平面偏振光的符号，其中前缀(-)或l表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。对给定的化学结构而言，这些立体异构体是相同的，除了其是彼此的镜像以外。特定的立体异构体也可被称为对映异构体，此类异构体的混合物通常被称为对映异构体混合物。50:50的对映异构体混合物被称为外消旋混合物或外消旋体，其可出现在化学反应或方法中没有立体选择性或立体特异性的情形。术语“外消旋混合物”与“外消旋体”指二种对映异构体的等摩尔混合物，所以没有旋光性的。

氨基酸“衍生物”包括通过母体氨基酸的共价连接(例如通过烷基化、糖基化、乙酰化、磷酰化等)取代或修饰的氨基酸。“衍生物”的定义还包括(例如)具有取代连接基以及本领域已知的其它修饰的氨基酸的一或多种类似物。

“天然氨基酸”指精氨酸、谷氨酸(glutamine)、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸(glutamic acid)、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、缬氨酸，除非另外由上下文来指出。

“保护基”指在连结到分子内的反应性基团时掩蔽、减少或阻止反应性的部分。保护基实例可参见下列：T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in OrganicSynthesis,3rd edition,John Wiley&Sons,New York,1999与Harrison and Harrison等人,Compendium of Synthetic Organic Methods,Vols.1-8(John Wiley and Sons,1971-1996)，其整体援引加入本文。代表性羟基保护基包括酰基、苄基醚与三苯甲基醚、四氢吡喃基醚、三烷基甲硅烷基醚与烯丙基醚。代表性氨基保护基包括甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苄基、苄氧羰基(CBz)、叔丁氧羰基(Boc)、三甲基甲硅烷基(TMS)、2-三甲基甲硅烷基-乙磺酰基(SES)、三苯甲基与取代三苯甲基、烯丙氧羰基、9-芴基甲氧羰基(FMOC)、硝基-藜芦基氧羰基(NVOC)等。

“羟基保护基”的实例包括(但不限于)：甲氧基甲醚、2-甲氧基乙氧基甲醚、四氢吡喃醚、苄基醚、对甲氧基苄基醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、三异丙基甲硅烷基醚、叔丁基二甲基甲硅烷基醚、三苯基甲基甲硅烷基醚、乙酸酯、取代乙酸酯、新戊酸酯、苯甲酸酯、甲磺酸酯与对甲苯磺酸酯。

“离去基”指可被另一官能团取代的官能团。此类离去基是本领域公知的且实例包括(但不限于)：卤素(例如氯、溴、碘)、甲磺酰基(mesyl)、对甲苯磺酰基(tosyl)、三氟甲磺酰基(triflate)与三氟甲磺酸酯。

本文中所用的短语“药学上可接受的盐”指化合物的药学上可接受的有机盐或无机盐。化合物通常含有至少一个氨基，因此可以此氨基形成酸加成盐。示例性的盐包括(但不限于)：硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、丁二酸盐、顺丁烯二酸盐、苹果酸盐、龙胆酸盐、反丁烯二酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基-双(2-羟基-3-萘甲酸)盐)。药学上可接受的盐可包含另一分子，例如乙酸根离子、丁二酸根离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是使母体化合物上的电荷稳定的任一有机部分或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可能具有多于一个带电原子。在多个带电原子是药学上可接受的盐的一部份的情况下可具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一或多个带电原子和/或一或多个抗衡离子。

“药学上可接受的溶剂合物”或“溶剂合物”指一或多个溶剂分子与本发明的化合物或缀合物的结合。形成药学上可接受的溶剂合物的溶剂实例包括(但不限于)：水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸与乙醇胺。

术语“负载”或“药物负载”或“有效负载”表示或指在ADC分子内每个抗体的平均有效负载数(在本文中“有效负载”可与“药物”互换使用)。药物负载可为1-20/抗体。这有时被称为DAR或药物/抗体比。本文中所述的ADS的组合物通常具有1-20的DAR，在某些实施方案中具有1-8、2-8、2-6、2-5和2-4的DAR。代表性DAR值是2、4、6和8。平均药物数/抗体或DAR值可通过常规方式例如UV/可见光光谱法、质谱法、酶标记免疫分析(ELISA)与HPLC进行表征。也可测得定量DAR值。在有些情况下具有特定DAR值的同源ADS的分离、纯化与表征可通过例如反相HPLC或电泳的方式达成。DAR可能受限于抗体上的连结位点数目。例如，在连结位点是半胱氨酸硫醇的情形下，抗体可能只有一或几个半胱氨酸硫醇基或可能只有一或几个具有充分反应性的硫醇基(通过此硫醇基可连结连接单元)。在一些实施方案中，半胱氨酸硫醇是形成链间二硫键的半胱氨酸残基的硫醇基。在一些实施方案中，半胱氨酸硫醇是不形成链间二硫键的半胱氨酸残基的硫醇基。通常，在缀合反应期间比理论最大值少的药物部分与抗体缀合。抗体可能含有(例如)许多不与连接基或连接基中间体反应的赖氨酸残基。只有具有最大反应性的赖氨酸基团可能与反应性连接基试剂反应。

一般抗体即使含有可能通过连接基与药物连结的游离的反应性半胱氨酸基团，但也不会很多。在抗体中大多数的半胱氨酸硫醇残基以二硫键形式存在且必须被还原剂(例如二硫苏糖醇(DTT))还原。可使抗体经受变性条件以展现反应性亲核基(例如赖氨酸或半胱氨酸)。ADC的负载(药物/抗体比)可以下列几种不同的方式控制：(i)限制相对抗体来说摩尔过量的药物-连接基，(ii)限制缀合反应时间或温度，与(iii)部分限制或限制半胱氨酸硫醇变性的还原条件。在多于一个亲核基与药物-连接基反应的情形下，所得产物是具有一或多的药物部分/抗体分布的ADC混合物。通过(例如)对抗体特异并对药物特异的双重ELISA抗体分析可从混合物计算出平均药物数/抗体。通过质谱法可识别混合物中的单个ADC并通过HPLC(例如疏水相互作用色谱法)分离。

后文是在本申请中不可能另外定义或说明的缩写与定义的列表：DMSO(指二甲亚砜)、HRMS(指高分辨率质谱法)、DAD(指二极管阵列检测)、TFA(指2,2,2-三氟乙酸或三氟乙酸)、TFF(指切线流过滤)、EtOH(指乙醇)、MW(指分子量)、HPLC(指高效液相色谱法)、prepHPLC(指制备级高效液相色谱法)、etc.(指等等)、trityl(指1,1',1''-乙烷-1,1,1-三基三苯基)、THF(指四氢呋喃)、NHS(指1-羟基-2,5-吡咯烷二酮)、Cbz(指羧基苄基)、eq.(指当量)、n-BuLi(指正丁基锂)、OAc(指乙酸根/酯)、MeOH(指甲醇)、i-Pr(指异丙基或丙-2-基)、NMM(指4-甲基吗啉)，且“-”(在表中指在当时得不到数据)。

化合物及其抗体-药物缀合物

本发明一方面涉及式I所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

(i)R^3A是氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基、卤素或芳烷基；和

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R^4A与R^4B是下列中的任一者：

(ii)R^4A与R^4B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

C₁-C₁₀杂环基、C₃-C₈碳环基和C₆-C₁₄芳基，其任选地被1、2、3、4或5个独立地选自下列的基团取代：-C₁-C₈烷基、-C₁-C₈烷基-N(R')₂、-C₁-C₈烷基-C(O)R'、-C₁-C₈烷基-C(O)OR'、-O-(C₁-C₈烷基)、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)N(R')₂、-NHC(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)R'、-OH、卤素、-N₃、-N(R')₂、-CN、-NHC(＝NH)NH₂、-NHCONH₂、-S(＝O)₂R'和-SR'，其中每个R'独立地选自：氢、C₁-C₈烷基和未取代芳基，或两个R'可与它们所连接的氮一起形成C₁-C₁₀杂环基；

或R⁵是

R⁶是氢、-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基、-C₂-C₈炔基、-C₂-C₈炔基或-C₁-C₈卤代烷基；

R¹²是氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀杂环基或C₆-C₁₄芳基；

R¹³是C₁-C₁₀杂环基；和

X是O或S；

条件是：当R^3A是氢时，X是S。

本发明另一方面涉及式IIa的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是

Y是-C₂-C₂₀亚烷基-、-C₂-C₂₀杂亚烷基-、-C₃-C₈碳环基-、-亚芳基-、-C₃-C₈杂环基-、-C₁-C₁₀亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈碳环基)-、-(C₃-C₈碳环基)-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈杂环基)-或-(C₃-C₈杂环基)-C₁-C₁₀亚烷基-；

Z是

或-NH₂；

G是卤素、-OH、-SH或-S-C₁-C₆烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

R^3B是C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基或芳烷基或卤素；或

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R^4A与R^4B是下列中的任一者：

(ii)R^4A与R^4B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

或R⁵是

R¹²是氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀杂环基或C₆-C₁₄芳基；

R¹³是C₁-C₁₀杂环基；和

R⁷每次出现时独立地选自：F、Cl、I、Br、NO₂、CN与CF₃；

R¹⁰是氢、-C₁-C₁₀烷基、-C₃-C₈碳环基、-芳基、-C₁-C₁₀杂烷基、-C₃-C₈杂环基、-C₁-C₁₀亚烷基-芳基、-亚芳基-C₁-C₁₀烷基、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈碳环基)、-(C₃-C₈碳环基)-C₁-C₁₀烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈杂环基)和-(C₃-C₈杂环基)-C₁-C₁₀烷基，其中在含有芳基的R₁₀上的芳基任选地被[R₇]_h取代；

h是1、2、3、4或5；和

X是O或S；

条件是：当R^3A是氢时，X是S。

本发明另一方面涉及式IIIa的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

R^3B是C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基、卤素或芳烷基；或

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R^4A与R^4B是下列中的任一者：

(ii)R^4A与R^4B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

其任选地被1、2、3、4或5个独立地选自下列的基团取代：C₁-C₈烷基、-O-(C₁-C₈烷基)、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH₂、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')₂、-NHC(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)R'、-OH、卤素、-N₃、-NH₂、-NH(R')、-N(R')₂、-CN、-NHC(＝NH)NH₂、-NHCONH₂、-S(＝O)₂R'与-SR'，其中每个R'独立地选自：氢、C₁-C₈烷基和未取代芳基；

R¹¹是

Y是-C₂-C₂₀亚烷基-、-C₂-C₂₀杂亚烷基-、C₃-C₈碳环基-、-亚芳基-、-C₃-C₈杂环基-、-C₁-C₁₀亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈碳环基)-、-(C₃-C₈碳环基)-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈杂环基)-或-(C₃-C₈杂环基)-C₁-C₁₀亚烷基-；

Z是

R⁷每次出现时独立地选自下列：F、Cl、I、Br、NO₂、CN和CF₃；

R¹⁰是氢、-C₁-C₁₀烷基、-C₃-C₈碳环基、芳基、-C₁-C₁₀杂烷基、-C₃-C₈杂环基、-C₁-C₁₀亚烷基-芳基、-亚芳基-C₁-C₁₀烷基、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈碳环基)、-(C₃-C₈碳环基)-C₁-C₁₀烷基、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈杂环基)和-(C₃-C₈杂环基)-C₁-C₁₀烷基，其中在含有芳基的R₁₀上的芳基任选地被[R₇]_h取代；

h是1、2、3、4或5；和

X是O或S。

R⁶是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；和

h是1、2、3、4或5。

本发明另一方面涉及式IIb的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是

Z是

L是抗体；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R^4A与R^4B是下列中的任一者：

(ii)R^4A与R^4B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

C₁-C₁₀杂环基、C₃-C₈碳环基和C₆-C₁₄芳基，其任选地被1、2、3、4或5个独立地选自下列的基团取代：-C₁-C₈烷基、-C₁-C₈烷基-N(R')₂、-C₁-C₈烷基-C(O)R'，-C₁-C₈烷基-C(O)OR'、-O-(C₁-C₈烷基)、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)N(R')₂、-NHC(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)R'、-OH、卤素、-N₃、-N(R')₂、-CN、-NHC(＝NH)NH₂、-NHCONH₂、-S(＝O)₂R'和-SR'，其中每个R'独立地选自：氢、C₁-C₈烷基和未取代芳基，或两个R'可与它们所连接的氮一起形成C₁-C₁₀杂环基；

或R⁵是

R¹²是氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀杂环基或C₆-C₁₄芳基；

R¹³是C₁-C₁₀杂环基；和

X是O或S；

条件是：当R^3A是氢时，X是S。

本发明另一方面涉及式IIIb的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R^4A与R^4B是下列中的任一者：

(ii)R^4A与R^4B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

其任选地被1、2、3、4或5个独立地选自下列的基团取代：C₁-C₈烷基、-O-(C₁-C₈烷基)、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH₂、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')₂、-NHC(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)R'、-OH、卤素、-N₃、-NH₂、-NH(R')、-N(R')₂、-CN、-NHC(＝NH)NH₂、-NHCONH₂、-S(＝O)₂R'和-SR'，其中每个R'独立地选自：氢、C₁-C₈烷基和未取代芳基；

R¹¹是

Z是

L是抗体；

X是O或S。

本发明另一方面涉及式IIc的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中，每次出现时，独立地，

R^1'是

Z'是

L是抗体；

D是-C(R^4A')(R^4B')-或不存在；

R^2'是氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基，或如果存在，则R^2'不存在；

R^3A'与R^3B'是下列中的任一者：

(i)R^3A'是氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基、芳烷基或卤素；和

R^3B'是C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基、卤素或芳烷基，或R^3B'是C₂-C₄亚烷基并形成如所示的5至7元环；或

(ii)R^3A'与R^3B'合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R^4A'与R^4B'是下列中的任一者：

(i)R^4A'是氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基或芳烷基；和

R^4B'是氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基或芳烷基；或

(ii)R^4A'与R^4B'合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

C₁-C₁₀杂环基、C₃-C₈碳环基和C₆-C₁₄芳基，其任选地被1、2、3、4或5个独立地选自下列的基团取代：-C₁-C₈烷基、-C₁-C₈烷基-N(R')₂、-C₁-C₈烷基-C(O)R'、-C₁-C₈烷基-C(O)OR'、-O-(C₁-C₈烷基)、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)N(R')₂、-NHC(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)R'、-OH、卤素、-N₃、-N(R')₂、-CN、-NHC(＝NH)NH₂、-NHCONH₂、-S(＝O)₂R'与-SR'，其中每个R'独立地选自：氢、C₁-C₈烷基和未取代芳基，或两个R'可与它们所连接的氮一起形成C₁-C₁₀杂环基；

或R⁵是

R¹²是氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀杂环基或C₆-C₁₄芳基；

R¹³是C₁-C₁₀杂环基；和

X是O或S；

条件是：当R^3A是氢时，X是S。

本发明另一方面涉及式IIIc的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R^4A与R^4B是下列中的任一者：

(ii)R^4A与R^4B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

R^11'是

Z'是

L是抗体；

X是O或S。

本发明另一方面涉及式IId的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中，每次出现时，独立地，

L是抗体；

[连接基]是二价连接基；

D是-C(R^4A')(R^4B')-或不存在；

R^3A'与R^3B'是下列中的任一者：

(ii)R^3A'与R^3B'合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R^4A'与R^4B'是下列中的任一者：

(ii)R^4A'与R^4B'合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

或R⁵是

R¹²是氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀杂环基或C₆-C₁₄芳基；

R¹³是C₁-C₁₀杂环基；和

X是O或S；

条件是：当R^3A是氢时，X是S。

本发明另一方面涉及式IIId的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R^4A与R^4B是下列中的任一者：

(ii)R^4A与R^4B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

[连接基]是二价连接基；

L是抗体；

X是O或S。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中所述化合物由下式表示：

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中W是

在本发明的某些实施方案中，W是

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R¹是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R¹是氢。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R¹是C₁-C₈烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R¹是甲基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R²是氢。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R²是C₁-C₈烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R²是甲基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R¹是氢且R²是甲基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R¹是甲基且R²是甲基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A是氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基或芳烷基；和R^3B是C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基、卤素或芳烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A是氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基或芳烷基；和R^3B是C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基、芳烷基或卤素。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A是卤素。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A是氢。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A是C₁-C₈烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A是甲基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3B是C₁-C₈烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3B是甲基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3B是异丙基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3B是C₃-C₈碳环基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3B是环己基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A是C₁-C₈烷基且R^3B是C₁-C₈烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A是甲基且R^3B是甲基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A是氢且R^3B是C₁-C₈烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A是氢且R^3B是异丙基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A与R^3B合起来是-CH₂CH₂-。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A与R^3B合起来是-CH₂CH₂CH₂-。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A与R^3B合起来是-CH₂CH₂CH₂CH₂-。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A与R^3B合起来是C₁-C₈杂亚烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^3A与R^3B合起来是-CH₂OCH₂-。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A是氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基或芳烷基；和R^4B是C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基或芳烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A是氢。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A是C₁-C₈烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A是甲基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4B是氢。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4B是C₁-C₈烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4B是甲基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A是C₁-C₈烷基且R^4B是C₁-C₈烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A是甲基且R^4B是甲基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A是氢且R^4B是氢。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A是氢且R^4B是C₁-C₈烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A与R^4B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A与R^4B合起来是C₂-C₈亚烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A与R^4B合起来是-CH₂CH₂-。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A与R^4B合起来是-CH₂CH₂CH₂-。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A与R^4B合起来是-CH₂CH₂CH₂CH₂-。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A与R^4B合起来是C₁-C₈杂亚烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R^4A与R^4B合起来是-CH₂OCH₂-。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R⁵是

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R⁶是氢。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R⁶是C₁-C₈烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R⁶是甲基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中X是O。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中X是S。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物和伴随的定义，其中所述化合物系选自：

N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基(thioxopropyl)]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N²-[(1-氨基环戊基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N-甲基-L-缬氨酰基-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-[(2-苯乙基)氨基]-3-硫代丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N²-[(1-氨基环戊基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N²-[(1-氨基环丙基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

1-氨基-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]环己烷甲酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1-苯基环丙基)甲基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N²-[(3-氨基氧杂环丁烷-3-基)羰基]-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N²-(3-氨基-2,2-二甲基丙酰基)-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N²-(3-氨基-2,2-二甲基丙酰基)-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[1-(双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基(羧基)甲基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-氨基-2,2-二甲基丙酰基)-L-缬氨酰基](甲基)氨基}-3-甲氧基-5-甲基庚酰基]吡咯烷-2-基}-3-甲氧基-2-甲基丙酰基]-L-苯丙氨酸甲酯；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-(甲氨基)-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-2-氨基-1-苄基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-氧代-2-(丙氨基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-(二乙氨基)-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-(叔丁氨基)-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

3-甲基-D-异缬氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

3-甲基-L-异缬氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

L-异缬氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

D-异缬氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N～2～-[2,2-二甲基-3-(甲氨基)丙酰基]-N-{(1S,2R)-2-甲氧基-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[2,2-二甲基-3-(甲氨基)丙酰基]-L-缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯；

N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(N-{[(2S)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯；

N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(N-{[(2R)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯；

N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(N-{[(2S)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸；

N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(N-{[(2R)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸；

N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯；

(2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]-2-甲基哌啶-2-甲酰胺；

(2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]-2-甲基哌啶-2-甲酰胺；

2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N～2～-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N～2～-{[(3S)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

(2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]-2-甲基哌啶-2-甲酰胺；

(2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]-2-甲基哌啶-2-甲酰胺；

N-2-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N-2-{[(3S)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-氨基苯基)-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-(1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-氨基苯基)-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸；

N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3S)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2R,4S)-4-羧基-1-苯基戊-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-(双环[1.1.1]戊-1-基氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(1R)-2-甲氧基-2-氧代-1-(1-苯基环丙基)乙基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(1S)-2-甲氧基-2-氧代-1-(1-苯基环丙基)乙基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(1R)-1-[(7R)-双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]-2-甲氧基-2-氧代乙基}氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(1S)-1-[(7S)-双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]-2-甲氧基-2-氧代乙基}氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(1S)-1-[(7R)-双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]-2-甲氧基-2-氧代乙基}氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,N,2-三甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,N,2-三甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(R)-羧(1-苯基环丙基)甲基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

二氟{2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(3R,4R,7S)-7-苄基-15-{2-[(3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基-κN)亚甲基]-2H-吡咯-5-基-κN}-4-甲基-5,8,13-三氧代-2-氧杂-6,9,12-三氮杂十五烷-3-基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰氨基}硼；

2-甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[(3-氨基氧杂环丁烷-3-基)羰基]-L-缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯；

2-甲基丙氨酰基-N-{(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S,12S)-7-苄基-14-[3-氯-4-(丙-2-基氧基)苯基]-4-甲基-12-[4-(8-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)苄基]-5,8,14-三氧代-2,9-二氧杂-6,13-二氮杂十四烷-3-基}吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-{[4-(5-氟-1,3-苯并噻唑-2-基)-2-甲苯基]氨基}-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2S)-1-氧代-3-苯基-1-(丙-2-烯-1-基氧基)丙-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-({(2S)-1-氧代-3-苯基-1-[(1H-1,2,3-三唑-4-基甲基)氨基]丙-2-基}氨基)丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2S)-1-氧代-3-苯基-1-(丙-2-炔-1-基氨基)丙-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H-咪唑-4-基)-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-羟基苯基)-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1R)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2S)-1-氧代-3-苯基-1-(哌嗪-1-基)丙-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；

1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；和

2-甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R¹是

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中Y是C₂-C₂₀亚烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中Y是-(CH₂)_p-且p是1至10。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中p是1。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中p是2。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中p是3。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中p是4。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中p是5。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中p是6。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中p是7。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中p是8。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中p是9。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中p是10。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中Y是C₂-C₂₀杂亚烷基。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中Y是-(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂-且q是1至10。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中q是1。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中q是2。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中q是3。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中q是4。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中q是5。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中q是6。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中q是7。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中q是8。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中q是9。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中q是10。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中Z是

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R⁷是F或Cl且h是4或5。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R⁷是F且h是3、4或5。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中R⁷是F且h是5。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中Z是-NH₂。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中G是Cl。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中G是Br。在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中G是I。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中所述化合物选自表18B的化合物。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中所述化合物选自：

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中Z是-NHL。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中L是H(C)-。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述化合物与伴随的定义，其中L是选自下列的抗体：用于治疗卵巢癌的鼠抗体，例如奥戈伏单抗(oregovomab)用于治疗结肠直肠癌的鼠IgG_2a抗体，例如依决洛单抗(edrecolomab)用于治疗表皮生长因子阳性癌(例如头颈癌)的抗EGFR IgG嵌合抗体，例如西妥昔单抗(cetuximab)用于治疗肉瘤的人源化抗体，例如玻连蛋白受体(α_vβ₃)的人源化单克隆抗体(如)；用于治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的人源化IgG₁抗体，例如阿仑珠单抗(alemtuzumab)用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的人源化抗HLA-DR抗体SMART ID10；用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的放射性标记鼠抗HLA-Dr10抗体131I Lym-1用于治疗霍奇金氏病或非霍奇金氏淋巴瘤的人源化抗CD2mAb，例如用于治疗结肠直肠癌的人源化抗CEA抗体拉贝珠单抗(labetuzumab)用于治疗脑癌、结肠癌、肾癌或肺癌的人源化抗VEGF-A mAb贝伐单抗(bevacizumab)用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的抗CD20单克隆抗体替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)用于治疗慢性淋巴细胞性白血病的人抗CD20单克隆抗体奥法木单抗(ofatumumab)用于治疗结肠癌的人抗EGFR单克隆抗体帕尼单抗(panitumumab)用于治疗慢性淋巴细胞性白血病与非霍奇金氏淋巴瘤的抗CD20嵌合单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab)用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的抗CD20单克隆抗体托西莫单抗(tositumomab)用于治疗乳腺癌与胃癌的抗HER2受体单克隆抗体曲妥珠单抗用于治疗黑色素瘤的抗CTLA4人单克隆抗体伊匹单抗(ipilimumab)吉妥珠单抗(gemtuzumab)和因妥珠单抗欧格霉素(inotuzumab ozogamicin)。

在另一具体实施方案中，L包括选自抗I-13抗体的抗体，其包括用于治疗癌症的抗I-13抗体，例如抗IL-13Rα2抗体。

在另一具体实施方案中，L包括选自抗Notch抗体的抗体，其包括用于治疗癌症的抗Notch抗体。

在某些实施方案中，所述抗体L通过硫键或通过硫-硫键结合到所述连接基。

本发明另一方面涉及包含任一前述化合物的一种抗体-药物缀合物。

本发明另一方面涉及包含一抗体与任一前述化合物的抗体-药物缀合物。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述抗体-药物缀合物与伴随的定义，其中所述化合物与所述抗体共价结合。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述抗体-药物缀合物与伴随的定义，其中所述前述抗体-药物缀合物中的所述化合物选自表18B的化合物，

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述抗体-药物缀合物与伴随的定义，其中所述抗体-药物缀合物包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种本发明的化合物。

在某些实施方案中，本发明涉及任一前述抗体-药物缀合物与伴随的定义，其中所述抗体-药物缀合物包含3或4种本发明的化合物。

抗体单元(Ab)

如前面指出的，本文中的术语“抗体”(或“Ab”)被最广义地使用并特别涵盖全单克隆抗体、多克隆抗体、单一特异性抗体、多特异性抗体(例如双重特异性抗体)、与呈现期望的生物活性的抗体片段。此外，当本文中说明的本发明的某些方面涉及抗体-药物缀合物的时候，缀合物的抗体部分可被和与给定的靶细胞群有关的受体、抗原或其它接受部分特异性结合或反应性结合或复合的任何物质替代。例如，除含有抗体外，本发明的缀合物还可含有与意图在治疗上或在其它方面被生物改造的细胞群的受体、抗原或其它接受部分结合、复合或反应的靶分子。前述分子实例包括小分子量蛋白质、多肽或肽、凝集素、糖蛋白、非肽、维生素、养分运输分子(例如但不限于转铁蛋白)或其它的细胞结合分子或物质。在某些方面，抗体或其它的前述靶分子起作用以输送药物到与抗体或其它的靶分子相互作用的特定靶细胞群。

可能存在于抗体单元上的杂原子包括硫(在一实施方案中，其源自抗体的巯基)、氧(在一实施方案中，其源自抗体的羰基、羧基或羟基)与氮(在一实施方案中，其源自抗体的伯氨基或仲氨基)。这些杂原子可存在于抗体的自然态(例如天然抗体)的抗体上或可通过化学变性被引入抗体中。

在一实施方案中，抗体单元具有巯基且该抗体单元通过巯基的硫原子结合。

在另一实施方案中，抗体具有赖氨酸残基，其可与活性酯(例如但不限于N-羟基丁二酰亚胺活性酯、五氟苯酯与对硝基苯酯)反应从而形成由抗体单元的氮原子与羰基组成的酰胺键。

在另一方面，抗体单元具有一或多个赖氨酸残基，其可被化学变性以引入一或多个巯基。可用于将赖氨酸变性的试剂包括(但不限于)S-乙酰基硫代乙酸N-丁二酰亚胺酯(SATA)与2-亚氨基硫杂环戊环盐酸盐(Traut试剂)。

在另一实施方案中，抗体单元可具有一或多个碳水化合物基团，其可被化学变性以具有一或多个巯基。

在另一实施方案中，抗体单元可具有一或多个碳水化合物基团，其可被氧化以提供醛基(请参见，例如Laguzza,等人,1989,J.Med.Chem.32(3):548-55)。相应的醛可形成具有反应位点的键，例如肼与羟胺。用于将连接或结合药物的蛋白质改造的其它方案的说明请参见Coligan等人,Current Protocols in Protein Science,vol.2,John Wiley&Sons(2002)，其援引加入本文。

当缀合物包含非免疫反应性蛋白质、多肽或肽单元而非抗体时，有用的非免疫反应性蛋白质、多肽或肽单元包括(但不限于)：转铁蛋白、表皮生长因子(“EGF”)、铃蟾素、胃泌激素、促胃泌激素释放肽、血小板衍生生长因子、IL-2、IL-6、转变生长因子(“TOP”，例如TGF-α与TGF-β)、牛痘生长因子(“VGF”)、胰岛素与似胰岛素生长因子I与II、生长激素抑制素、凝集素、与源自低密度脂蛋白的脱辅基蛋白。

有用的多克隆抗体是源自免疫动物血清的抗体分子的异源种群。有用的单克隆抗体是特定抗原决定子的抗体的同源种群，抗原决定子例如癌细胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白质、肽、碳水化合物、化学药品、核酸或其片段。用本领域已知的任何通过在培养基中的传代细胞系产生抗体分子的技术可制得所关注抗原的单克隆抗体(mAb)。

有用的单克隆抗体包括(但不限于)人单克隆抗体、人源化单克隆抗体、抗体片段或嵌合单克隆抗体。人单克隆抗体可由下列本领域已知的许多技术中的任一者制得：例如Teng等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:7308-7312；Kozbor等人,1983,ImmunologyToday4:72-79；与Olsson等人,1982,Meth.Enzymol.92:3-16。

所述抗体也可以是双重特异性抗体。用于制备双重特异性抗体的方法是本领域已知的并在后文被详述。

所述抗体可以是与靶细胞(例如癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)免疫特异性结合的抗体或与肿瘤细胞或基质结合的其它抗体的具有功能活性的片段、衍生物或类似物。在这方面，“具有功能活性的”表示所述片段、衍生物或类似物能够引出抗抗独特型抗体，其识别抗体(其中片段、衍生物或类似物源自所述抗体)识别的抗原。特别地，在一示例性的实施方案中，删除框架区与CDR序列(特异地识别抗原的CDR序列的C端)可强化免疫球蛋白分子的独特性的抗原性。可在抗原结合检测中使用含有CDR序列的合成肽以测定结合抗原的CDR序列，其利用本领域已知的任何结合检测法(例如BIAcore检测)以定位CDR序列，请参见，例如Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,Md.；Kabat E等人,1980,J.Immunology125(3):961-969。

其它有用的抗体包括抗体的片段，例如(但不限于)F(ab')₂片段、Fab片段、Fvs、单链抗体、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、scFv、scFv-FV、或具有与抗体相同的特异性的其它分子。

此外，重组抗体，例如用标准重组DNA技术可制得的包含人部份与非人部份的嵌合人源化单克隆抗体是有用的抗体。嵌合抗体是其中不同部份源自不同动物种类的分子，例如具有源自鼠单克隆抗体的可变区与人免疫球蛋白恒定区。请参见，例如U.S.Pat.No.4,816,567与U.S.Pat.No.4,816,397，整体援引加入本文。人源化抗体是源自非人物种的抗体分子，其具有一或多个源自非人物种的互补决定区(CDR)与一个源自人免疫球蛋白分子的框架区。请参见，例如U.S.Pat.No.5,585,089，其整体援引加入本文。此类嵌合人源化单克隆抗体可由本领域公知的重组DNA技术制得，例如利用下列记载的方法：InternationalPublication No.WO87/02671；European Patent Publication No.0184187；EuropeanPatent Publication No.0171496；European Patent Publication No.0173494；International Publication No.WO86/01533；U.S.Pat.No.4,816,567；European PatentPublication No.012023；Berter等人,1988,Science240:1041-1043；Liu等人,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439-3443；Liu等人,1987,J.Immunol.139:3521-3526；Sun等人,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:214-218；Nishimura等人,1987,Cancer.Res.47:999-1005；Wood等人,1985,Nature314:446-449；Shaw等人,1988,J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559；Morrison,1985,Science229:1202-1207；Oi等人,1986,BioTechniques4:214；U.S.Pat.No.5,225,539；Jones等人,1986,Nature321:552-525；Verhoeyan等人,1988,Science239:1534；与Beidler等人,1988,J.Immunol.141:4053-4060；每一者整体援引加入本文。

纯人抗体特别令人满意并可用不能表达内源免疫球蛋白重链与轻链基因但能表达人重链与轻链基因的转基因小鼠制得。以一般方式使转基因小鼠对所选定抗原(例如本发明的多肽的全部或一部份)免疫。用常规的杂交瘤技术可得到靶向抗原的单克隆抗体。转基因小鼠所含的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，然后发生类型转换与体细胞突变。因此，用此类技术可以制得治疗上有用的IgG、IgA、IgM与IgE抗体。有关制备人抗体的技术的概述，请参见Lonberg and Huszar,1995,Int.Rev.Immunol.13:65-93。有关制备人抗体与人单克隆抗体的技术与制备此类抗体的方案的详述请参见(例如)U.S.Pat.Nos.5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；其各自整体援引加入本文。其它的人抗体可从例如Abgenix,Inc.(现在Amgen,Freemont,Calif.)与Medarex(Princeton,N.J.)购得。

用被称为“定向选择”(guided selection)的技术可以产生识别所选定抗原决定部位的纯人抗体。在这一方法中，将所选定非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)用于定向识别同一抗原决定部位的纯人抗体的选择。请参见，例如Jespers等人,1994,Biotechnology12:899-903。用本领域已知的各种技术(包括噬菌体呈现文库)也可制备人抗体(请参见，例如Hoogenboom and Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381；Marks等人,1991,J.Mol.Biol.222:581；Quan and Carter,2002,The rise of monoclonal antibodies as therapeutics,InAnti-IgE and Allergic Disease,Jardieu and Fick,eds.,Marcel Dekker,New York,N.Y.,Chapter20,pp.427-469)。

在其它实施方案中，所述抗体是抗体的融合蛋白或其有生物活性的片段，例如其中抗体通过共价键(例如肽键)在非源自一种抗体的另一种蛋白质(或其部分，优选蛋白质的至少10、20或50个氨基酸部分)的氨基酸序列的C端或N端被融合。优选，抗体或其片段在恒定区的N端与其它蛋白质共价结合。

抗体包括被任何类型的分子共价结合变性的类似物与衍生物，只要前述共价结合使抗体得以保持其抗原结合免疫特异性。例如，但不限于，抗体的衍生物与类似物包括已经被下列方法进一步变性的衍生物与类似物：例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、已知保护/封闭(blocking)基衍生化、蛋白水解、与细胞抗体单元或其它蛋白质的键合等。由已知技术可进行许多化学变性中的任一者，其包括(但不限于)特异化学裂解、乙酰化、甲酰化、在衣霉素作用下的代谢合成等。另外，类似物或衍生物可含有一或多种非天然氨基酸。

在与Fc受体相互作用的氨基酸残基中，抗体可具有修饰(例如取代、缺失或附加)。特别地，在被认为涉及抗Fc区与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基中的抗体可具有修饰(请参见，例如International Publication No.WO97/34631，其整体援引加入本文)。

对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体可商购获得或由本领域技术人员已知的任何方法(例如化学合成或重组表达技术)制得。编码对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可(例如)由GenBank数据库或类似的数据库、文献公告或由常规的克隆与定序得到。

在一具体实施方案中，可利用已知抗体来治疗癌症。对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体可商购获得或由本领域技术人员已知的任何方法(例如重组表达技术)制得。编码对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可(例如)由GenBank数据库或类似的数据库、文献公告或由例行的克隆与定序得到。可用于治疗癌症的抗体实例包括(但不限于)：用于治疗卵巢癌的鼠抗体用于治疗结肠直肠癌的鼠IgG_2a抗体(Glaxo Wellcome,NC)；用于治疗表皮生长因子阳性癌(例如头颈癌)的抗EGFR IgG嵌合抗体西妥昔单抗(Cetuximab)(Imclone Systems Inc.,NY)；用于治疗肉瘤的人源化抗体(MedImmune Inc.,MD)；用于治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的人源化IgG₁抗体CAMPATH(Leukosite,MA)；用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的人源化抗HLA-DR抗体SMART ID10(Protein Design Labs,Inc.,CA)；用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的放射性标记鼠抗HLA-Dr10抗体(Techniclone,Inc.,CA)；用于治疗霍奇金氏病或非霍奇金氏淋巴瘤的人源化抗CD2mAb(BioTransplant,CA)；用于治疗结肠直肠癌的人源化抗CEA抗体(Immunomedics,NJ)；用于治疗脑癌、结肠癌、肾癌或肺癌的人源化抗VEGF-A mAb(Genentech/Roche,CA)；用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的抗CD20单克隆抗体(Spectrum Pharmaceuticals,NV)；用于治疗慢性淋巴细胞性白血病的人抗CD20单克隆抗体(GSK,UK)；用于治疗结肠癌的人抗EGFR单克隆抗体(Amgen,CA)；用于治疗慢性淋巴细胞性白血病与非霍奇金氏淋巴瘤的抗CD20嵌合单克隆抗体(Genentech/BioGen,CA)；用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的抗CD20单克隆抗体(GSK,UK)；用于治疗乳腺癌与胃癌的抗HER2受体单克隆抗体(Genentech,CA)；用于治疗黑色素瘤的抗CTLA4人单克隆抗体(BMS,NJ)；用于治疗急性骨髓性白血病的与卡里奇霉素(calicheamicin)缀合的抗CD33人源化单克隆抗体(Wyeth/Pfizer,NY)；与用于治疗急性淋巴细胞性白血病与非霍奇金氏淋巴瘤的与卡里奇霉素(calicheamicin)缀合的抗CD22人源化单克隆抗体inotuzumab ozogamicin(Wyeth/Pfizer,NY)。

在另一具体实施方案中，可利用抗IL13抗体，包括用于治疗癌症的抗IL13抗体。

在另一具体实施方案中，可利用抗Notch抗体，包括用于治疗癌症的抗Notch抗体。

研究者试图识别跨膜或在一或多个特定类型的癌细胞表面上被特异性表达(与在一或多种正常的非癌细胞上相比)的其它与肿瘤有关的多肽，企图发现用于癌症诊断与治疗的有效细胞靶。通常，与在非癌细胞表面上相比，此类与肿瘤有关的多肽在癌细胞表面上被更大量表达。此类与肿瘤有关的细胞表面抗原多肽的识别已经导致通过基于抗体的特异性治疗针对癌细胞的靶向消灭的能力。

化合物及其抗体-药物缀合物的合成

用下列示例中概述的合成操作可制得本发明的化合物与缀合物。

如后文中更详细地说明，用具有与本发明的化合物结合的反应位点的连接单元部分可制得本发明的化合物与缀合物。

连接基

连接基(在本文中有时被称为“[连接基]”)是双官能化合物，其可用于连接药物与抗体以形成抗体-药物缀合物(ADC)。此类缀合物可用于(例如)针对肿瘤相关抗原的免疫缀合物的形成。此类缀合物使胞毒性药物得以选择性递送到肿瘤细胞。

在一实施方案中，所述连接基具有下式：

其中

Y是C₂-C₂₀亚烷基或C₂-C₂₀杂亚烷基；C₃-C₈碳环基-、-亚芳基-、-C₃-C₈杂环基-、-C₁-C₁₀亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈碳环基)-、-(C₃-C₈碳环基)-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈杂环基)-或-(C₃-C₈杂环基)-C₁-C₁₀亚烷基-；

Z是

R⁷每次出现时独立地选自下列：F、Cl、I、Br、NO₂、CN与CF₃；

R¹⁰是氢、-C₁-C₁₀烷基、-C₃-C₈碳环基、芳基、-C₁-C₁₀杂烷基、-C₃-C₈杂环基、-C₁-C₁₀亚烷基-芳基、-亚芳基-C₁-C₁₀烷基、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈碳环基)、-(C₃-C₈碳环基)-C₁-C₁₀烷基、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈杂环基)与-(C₃-C₈杂环基)-C₁-C₁₀烷基，其中在含有芳基的R₁₀上的芳基任选地被[R₇]_h取代；和

h是1、2、3、4或5。

在ADC中，连接基用于使有效负载连接到抗体上。

一方面，引入具有第二反应位点(例如与抗体单元(例如抗体)上的亲核基团反应的亲电基团)的连接单元的第二部分。有用的抗体的亲核基团包括(但不限于)巯基、羟基与氨基。抗体的亲核基团的杂原子与连接单元上的亲电基团反应并与连接单元形成共价键。有用的亲电基团包括(但不限于)顺丁烯二酰亚胺基团与卤化乙酰胺基团。亲电基团提供用于抗体结合的方便位点。

另一方面，连接单元具有反应位点，其具有与抗体上的亲电基团反应的亲核基团。有用的抗体的亲电基团包括(但不限于)醛与酮羰基。连接单元上的亲核基团的杂原子可与抗体上的亲电基团反应并与抗体形成共价键。有用的连接单元的亲核基团包括(但不限于)酰肼、肟、氨基、肼、氨硫脲、羧酸肼与芳酰肼。抗体的亲电基团提供用于与连接单元结合的方便位点。

氨基官能团也是连接单元的有用的反应位点，原因是其可以与羧酸或化合物的活性酯反应以形成酰胺键。通常，通过在二或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键可制得本发明的肽系化合物。例如根据肽化学领域中众所周知的液相合成法(请参见，例如Schroder and Lubke,''The Peptides'',volume1,pp76-136,1965,Academic Press)可制得此类肽键。

如后文更详细地说明，可使用具有一段与本发明的化合物结合的反应位点的连接基并引入另一段具有用于抗体的反应位点的连接单元制得缀合物。一方面，连接单元具有反应位点，其具有与抗体单元(例如抗体)上的亲核基团反应的亲电基团。亲电基团提供用于抗体结合的方便位点。有用的抗体的亲核基团包括(但不限于)巯基、羟基与氨基。抗体的亲核基团的杂原子与连接单元上的亲电基团反应并与连接单元形成共价键。有用的亲电基团包括(但不限于)顺丁烯二酰亚氨基团与卤化乙酰氨基团。

另一方面，连接单元具有反应位点，其具有与抗体单元上的亲电基团反应的亲核基团。抗体的亲电基团提供用于与连接单元结合的方便位点。有用的抗体的亲电基团包括(但不限于)醛与酮羰基。连接单元的亲核基团的杂原子可与抗体上的亲电基团反应并与抗体形成共价键。有用的连接单元的亲核基团包括(但不限于)酰肼、肟、氨基、肼、氨硫脲、甲酸肼与芳酰肼。

本文中所用的以前被称为“MalC-”的“mc-”指

本文中所用的以前被称为“MalCValCitPABC-”的“mcValCitPABC-”指

本文中所用的“MalPegXC2-”指

本文中所用的“AmPegXC2-”指

本文中所用的“mcValCitPABCAmPegXC2-”指

本文中所用的“MalPegXC2ValCitPABC-”指

本文中所用的“2BrAcPegXC2”指

本文中所用的“mv-”指

本文中所用的“mb-”指

本文中所用的“me-”指

本文中所用的“MalC6-”指

本文中所用的“PFPCOPegXC2ValCitPABC-”指

本文中所用的“PFPCOPegXC2AmPegYC2-”指

本文中所用的“PFPCOPegXC2AlaAlaAsnPABC-”指

本文中所用的“PFPCOPegXC2-”指

本文中所用的“PFPCOPegXC2AmPegYC2PABC-”指

本文中所用的“mcGly-”指

本文中所用的“AzCOC2Ph4AmCOPeg2C2-”指

本文中所用的“AzCOC2Ph4AmPeg1C1-”指

本文中所用的“AcLysValCitPABC-”指

用转谷氨酰胺酶的缀合

在某些实施方案中，在转谷氨酰胺酶的存在下，本发明的化合物可与用含有酰基供体谷氨酸的标记(例如含有Gln的肽标记或Q标记)基因工程改造的含有Fc或含有Fab的多肽共价交联，或可用多肽基因工程改造(例如通过多肽上的氨基酸缺失、插入、取代、突变或其任一组合)得到反应性(即在胺与转谷氨酰胺酶存在下形成作为酰基供体的共价键的能力)的内源性谷氨酸共价交联，条件是本发明的化合物含有胺供体试剂(例如含有或结合到反应性胺的小分子)从而形成稳定同源的与胺供体试剂结合的基因工程改造的含有Fc的多肽种群，胺供体试剂通过含有酰基供体谷氨酸的标记或暴露的/易受影响的/反应性的内源性谷氨酸与含有Fc或含有Fab的多肽位点特异性缀合。例如，本发明的化合物可按照在International Patent Application Serial No.PCT/IB2011/054899(整体援引加入本文)中说明的方式缀合。在某些实施方案中，在转谷氨酰胺酶的存在下为了促进本发明的化合物与以含有酰基供体谷氨酸的标记基因工程改造的含有Fc或含有Fab的多肽缀合，或为了促进本发明的化合物与由多肽基因工程改造得到反应性的内源性谷氨酸缀合，Z是NH₂。

与人轻链κ域恒定区的缀合

在某些实施方案中，本发明的化合物可与人轻链K域恒定区(CLκ)的K¹⁸⁸(按照Kabat的完整轻链编号)的侧链共价连接。例如，当只计数序列号(SEQ ID NO)：1、2、3与4的人κ域恒定区时，K188也可被称为CLκK80。

例如，本发明的化合物可按照在US Patent Application Serial Number13/180,204或WO2012/007896(整体援引加入本文)中说明的方式缀合。在某些实施方案中，为了促进与K188CLκ(CLκ-K80)缀合，Z是R⁷每次出现时独立地选自下列：F、Cl、I、Br、NO₂、CN与CF₃；和h是1、2、3、4或5。

在某些实施方案中，为了促进与K¹⁸⁸CLκ(CLκ-K80)缀合，Z是

本发明还提供含有抗体或其抗原结合部分的抗体-药物缀合物，其含有与本发明的毒素共价缀合的恒定κ域，其特征是：至少一种本发明的毒素与序列号1、序列号2、序列号3或序列号4的K80共价缀合(表1)。在某些方面，与K80共价缀合的本发明的毒素的数目可在这样的范围内，其下限选自：约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9与约2.0，且其上限选自：约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5。在某些方面，p是约2。

毒素与抗体的轻链恒定区的缀合特别需要尽量减少或防止任何对抗体的Fc部分与Fc受体(例如FcγR与FcRn)的结合或对抗体与其各自的靶的结合的干扰。反之，各毒素与抗体的Fc部分的缀合可使体内的抗体半衰期和/或其与免疫系统相互作用的能力(效应子功能)减少。抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)中的毒素的缀合带有使抗体与其同源物的结合减小的风险。

此外，与CLκ-K80的缀合是可信赖且坚固的，但与其它抗体表面赖氨酸(各自稍微不同的反应性和pI)的缀合可能导致缀合抗体的异源样品，结合抗体可以在不适当的或不规律的时间(例如在循环期间和在将效应子部分递送到抗体识别的靶之前)释放缀合的分子。

此外，本发明提供在45位的κ链V/A与在83位的κ链A/L的已知的多态性(提出3种已识别人恒定κ域多态性Km(1):V45/L83(序列号2)，Km(1,2):A45/L83(序列号3)与Km(3):A45/V83(序列号4))。可选择在序列号1中的45位与83位的残基的变异性以便只提供Km(1)、Km(1,2)与Km(3)多态性中的任一者、二者或三者全部。

表1

其中在45位的x是A或V，和在83位的x是L或V。

在某些实施方案中，本发明提供包含与抗体(或其抗原结合部分)共价缀合的本发明的化合物的组合物，其中在组合物中至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的本发明的化合物与抗体或其抗原结合部分在K¹⁸⁸CLκ缀合。

在某些实施方案中，本发明的化合物

可缀合到催化抗体(例如醛缩酶抗体)或其抗原结合部分的结合位点。醛缩酶抗体含有结合位点部分，其在不受阻碍(例如缀合)时催化在脂族酮供体与醛受体之间的醛醇加成反应。美国专利申请公开US2006/205670的内容援引加入本文，特别是第78至118页记载连接基与第[0153]至[0233]段记载抗体、有用的片段、变异体与其变型、h38C2、结合位点、互补决定区(CDR)与有关的抗体技术(表2与下列的示例性的化合物)：

术语“结合位点”包括CDR与参与抗原结合的邻近的框架残基。

表2

与含有丁二酰亚胺(包括开环形式)的连接基缀合

在某些实施方案中，本发明包括通过丁二酰亚胺系连接基或开环丁二酰亚胺系连接基缀合的本发明的化合物。丁二酰亚胺-半胱氨酸键的稳定性已经成为越来越受关注的领域。丁二酰亚胺可在体外与体内被转变成外源硫醇亲核体(可能通过产生顺丁烯二酰亚胺(随后被硫醇攻击)的逆Michael反应)。据信环的水解产生抗逆Michael反应的物质。这使得所得缀合物更稳定且可能更有效。可将条件优化以强制将缀合物上的丁二酰亚胺环开环。碱性条件导致环容易水解。例如，含有聚乙二醇(PEG)链的连接基可在37℃与pH9.2水解约12小时，而含有烷基链的连接基(例如“mc”)则可能需要较高的温度与较长的反应时间以促使开环完全。

顺丁烯二酰亚胺系缀合物的强制水解实例

为了评估这些缀合物的稳定性并将供体内评估的样品区分优先级次序，产生包括用过量的水性谷胱甘肽(GSH)或血浆处理与顺丁烯二酰亚胺连接的缀合物的测定。用前述方法在各种时间点分析等分的反应混合物以测定缀合物的负载。结果(表24)指出药物-抗体键以GSH依赖性方式缓慢裂解。如预期，裂解速率高度取决于丁二酰亚胺环的水解。重要地，这些结果似乎说明改善的PK暴露(如通过缀合物的曲线下面积(AUC)增加与缀合物/Ab暴露比增加所测量)。

用于评估ADC稳定性的方法

将ADC样品(30μg)/PBS与谷胱甘肽(GSH)溶液混合以得到0.5mMGSH与3mg/mL蛋白质浓度的最终浓度。同样用PBS将ADC样品(30μg)稀释成3mg/mL来制得对照样品(无GSH)。在37℃将谷胱甘肽处理的ADC样品与对照ADC样品温育并在第0、3与6日取样。用过量的TCEP还原等分，加入0.1％甲酸溶液(含10％乙腈)酸化并如下文所述通过LC/MS分析负载。

样品分析：用联合Waters Xevo G2Q-TOF质谱仪的Aglient1100毛细管HPLC进行分析。将分析物同0.1％甲酸装入Zorbax Poroshell300SB C8柱(0.5mm X75mm，保持于80℃，并用20-40％梯度的缓冲液B(80％乙腈、18％1-丙醇、2％水(含0.1％甲酸))以20μl/分流速洗脱5.5分。在毛细管电压设定于3.3kV的正灵敏度模式下进行质谱检测。用MassLynx中的MaxEnt1功能进行数据分析，强度用于以前述式为基础的负载计算。

组合物与给药方法

在其它实施方案中，本发明另一方面涉及药物组合物，其包含有效量的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体或赋形剂。在某些实施方案中，组合物适合于兽类或人类给药。

本发明的药物组合物可以是使得能够将组合物给药至患者的任意形式。例如，所述组合物可以是固体或液体形式。代表性的给药途径包括(但不限于)肠胃外给药、眼部给药与肿瘤内给药。肠胃外给药包括皮下注射、静脉注射、肌内注射、胸骨内注射或输注技术。一方面，所述组合物被肠胃外给药。在一具体实施方案中，所述组合物被静脉内给药。

药物组合物可被配制成使得本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物得以在将组合物给药至患者后是生物可利用的。所述组合物可采用一或多种剂量单位形式，例如片剂可以是单次剂量单位，且液体形式的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物的容器可以容纳多个剂量单位。

用于制备药物组合物的原料可以是在用量上无毒的。本领域技术人员清楚药物组合物中的有效成分的最佳剂量会取决于多种因素。有关的因素包括(但不限于)：动物种类(例如人类)、本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物的具体形式、给药方式与所使用的组合物。

药学上可接受的载体或赋形剂可以是固体或颗粒，使得组合物是(例如)片剂或散剂形式。所述载体可以是液体。此外，所述载体可以是颗粒。

所述组合物可以是液体形式，例如溶液剂、乳剂或混悬剂。用于注射给药的组合物也可包含一或多种表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂。

液体组合物(不管是溶液、悬浮液或其它形式)也可以包含下列中的一或多者：无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液(优选生理盐水)、林格溶液、等渗氯化钠、非挥发油(例如合成的甘油单酯或甘油二酯，其可以充当溶剂或悬浮介质)、聚乙二醇、甘油、环糊精、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或氨基酸；以及张力调节剂，例如氯化钠或葡萄糖。肠胃外组合物可以被下列包封：安瓿、用玻璃、塑料或其它原料制的一次性注射器或多剂量小瓶。生理盐水是示例性辅剂。可注射组合物优选是无菌的。

有效治疗特定病症或病况的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物的量会取决于病症或病况的特性并可以由标准临床技术测定。此外，可任选地利用体外检验或体内检验以帮助识别出最佳剂量范围。用于组合物的精确剂量也会取决于给药途径、疾病或病症的严重性并应根据医师的判断与每个患者的具体情况而定。

所述组合物包含有效量的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物从而得到合适的剂量。通常，所述量是至少约0.01％的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物(以组合物的重量为基准)。在一示例性的实施方案中，制备药物组合物使得肠胃外剂量单位含有约0.01wt％到约2wt％的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物。

对静脉内给药而言，所述组合物可以包含约0.01mg到约100mg的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物(以每kg的患者体重为基准)。一方面，所述组合物可以包含约1mg到约100mg的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物(以每kg的患者体重为基准)。另一方面，给药量是约0.1mg到约25mg/kg体重的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物。

一般而言，被给药至患者的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物的剂量通常是约0.01mg/kg到约20mg/kg患者体重。一方面，被给药至患者的剂量是约0.01mg/kg到约10mg/kg患者体重。另一方面，被给药至患者的剂量是约0.1mg/kg到约10mg/kg患者体重。另一方面，被给药至患者的剂量是约0.1mg/kg到约5mg/kg患者体重。另一方面，被给药的剂量是约0.1mg/kg到约3mg/kg患者体重。另一方面，被给药的剂量是约1mg/kg到约3mg/kg患者体重。

可通过任意方便的途径例如经输注或注射给药本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物。给药可以是全身给药或局部给药。已知多种递送系统例如包囊于脂质体、微粒、微胶囊、胶囊等中，并可用于给药本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物。在某些实施方案中，多于一种的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物被给药至患者。

在一具体实施方案中，需要将一或多种本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物局部给药至需要治疗的区域。这可通过下列方式实现(例如但不限于)：在外科手术期间局部输注；局部施用，例如在外科手术后与创伤敷料一起施用；注射；通过导管；或通过植入物，所述植入物是由多孔的、无孔的或凝胶状的原料制成，其包括膜例如硅橡胶膜或纤维。在一实施方案中，可通过直接注射于癌、肿瘤或肿瘤组织或肿瘤前组织部位(或前部位)来给药。在另一实施方案中，可通过直接注射于自身免疫性疾病的表现部位(或前部位)来给药。

在另一实施方案中，可以控释系统递送本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物，例如(但不限于)可使用泵或各种聚合物原料。在另一实施方案中，可以将控释系统放置于本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物的靶(例如肝脏)附近，因此只需要全身剂量的一小部份(请参见，例如Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。可使用在Langer的综述中所详述的其它控释系统(Science249:1527-1533(1990))。

术语“载体”指稀释剂、辅剂或赋形剂，其与化合物或其抗体-药物缀合物一起被给药。此类药用载体可以是液体，例如水与油(包括石油、动物油、植物油或合成油)。载体可以是盐溶液等。此外，可使用助剂、稳定剂与其它药剂。在一实施方案中，当被给药至患者时，化合物或缀合物与药学上可接受的载体是无菌的。当静脉内给药化合物或缀合物时，水是代表性载体。同样可将生理盐水与葡萄糖和甘油水溶液用作液体载体，特别是用于注射溶液的液体载体。本发明的组合物必要时同样可含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。

本发明的组合物可采用溶液剂、丸剂、散剂、缓释制剂形式或任何适合使用的其它形式。合适的药用载体的其它实例的说明请参见E.W.Martin的“Remington'sPharmaceutical Sciences”。

在一实施方案中，按照适合静脉内给药至动物(特别是人类)的药物组合物的常规操作配制本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物。通常，用于静脉内给药的载体或赋形剂是无菌等渗缓冲水溶液。在需要时，所述组合物也可包含增溶剂。用于静脉内给药的组合物可任选地含有局部麻醉剂(例如利多卡因)以减轻注射部位的疼痛。一般而言，将成分分别提供或以单位剂型混合，例如在指示活性剂的量的密封容器(例如安瓿或小药囊)中的冻干干粉或无水浓缩物的形式。在通过输注给药本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物的情况下，可(例如)用含有无菌医药级水或盐溶液的输液瓶配药。在通过注射给药本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物的情况下，可提供一安瓿的注射用无菌水或盐溶液以便在给药前事先将成分混合。

所述组合物可包含改变固体或液体剂量单位的物理形式的各种物质。例如，所述组合物可包含形成包围有效成分的外壳的物质。形成外壳的物质通常是惰性的并可选自(例如)糖、虫胶与其它肠溶衣剂。或者可以将有效成分装进胶囊中。

不管是固体或是液体形式，本发明的组合物可包含用于治疗癌症的药剂。

化合物及其抗体-药物缀合物的治疗用途

本发明另一方面涉及利用本发明的化合物与其抗体-药物缀合物治疗癌症的方法。

本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物可用于抑制肿瘤细胞或癌细胞增殖、引起肿瘤细胞或癌细胞凋亡、或治疗患者的癌症。因此本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物可用于治疗动物癌症的多种情况中。所述缀合物可用于递送本发明的化合物到肿瘤细胞或癌细胞。不希望受理论束缚，在一实施方案中，抗体-药物缀合物的抗体和与癌细胞或肿瘤细胞有关的抗原结合或有关连，并通过受体介导的细胞吞噬作用或其它内化机制将缀合物置于(内化于)肿瘤细胞或癌细胞内。抗原可与肿瘤细胞或癌细胞连接或可以是与肿瘤细胞或癌细胞有关的细胞外基质蛋白。在某些实施方案中，一旦进入细胞，则一或多种与肿瘤细胞或癌细胞有关的蛋白酶使一或多种特定肽序列酶解或水解，导致缀合物释放本发明的化合物。然后被释放的本发明的化合物在细胞内自由迁移并诱导胞毒性或细胞生长抑制活性。细胞内蛋白酶也可使抗体-药物缀合物裂解以释放本发明的化合物。在另一实施方案中，缀合物在肿瘤细胞或癌细胞外裂解释放本发明的化合物，然后所述化合物进入细胞。

在某些实施方案中，所述缀合物提供缀合特异性肿瘤或癌药物靶向，从而使本发明的化合物的一般毒性减少。

在另一实施方案中，抗体单元与肿瘤细胞或癌细胞结合。

在另一实施方案中，抗体单元与位于肿瘤细胞或癌细胞表面的肿瘤细胞或癌细胞抗原结合。

在另一实施方案中，抗体单元与肿瘤细胞或癌细胞抗原(与肿瘤细胞或癌细胞有关的细胞外基质蛋白)结合。

对特定肿瘤细胞或癌细胞的抗体单元的特异性对确定被最有效治疗的肿瘤或癌症可以说是重要的。

用本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物可以治疗的癌症的具体类型包括(但不限于)：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、胃癌与睪丸癌；与血癌，其包括(但不限于)白血病与淋巴瘤。

癌症的多模式治疗。通过给药本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物可以治疗或抑制癌症，其包括(但不限于)肿瘤、转移或以不受控制的细胞生长为特征的其它疾病或病症。

在其它实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其包括将有效量的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物与化学治疗剂给药至有此需要的患者。在一实施方案中，所述化学治疗剂是未曾发现其在癌症治疗中有困难的化学治疗剂。在另一实施方案中，所述化学治疗剂是已发现其在癌症治疗中有困难的化学治疗剂。可以将本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物给药至接受过外科手术来治疗癌症的患者。

在一些实施方案中，患者也接受另外的治疗，例如放射治疗。在一具体实施方案中，将本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物和化学治疗剂或和放射治疗同时给药。在另一具体实施方案中，在给药本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物之前或之后给药化学治疗剂或放射治疗。

可在一系列期间给药化学治疗剂。可给药任一化学治疗剂(例如护理标准化学治疗剂)或其组合。

此外，在已证明或可以证明化学治疗或放射治疗对待治疗的患者毒性太大(例如引起不能接受的或不能忍受的副作用)的情况下，用本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物治疗癌症的方法可作为化学治疗或放射治疗的替代。待治疗的患者可任选地被例如外科手术、放射治疗或化学治疗的任意癌症治疗法治疗，取决于发现何种治疗是可接受的或可忍受的。

同样可以体外或离体方式利用本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物，例如治疗某些癌症(包括但不限于白血病与淋巴瘤)，此类治疗涉及自体干细胞移植。这可能涉及多步过程，其中采集动物的自体造血干细胞并清除全部的癌细胞，然后通过给药高剂量的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物伴随或不伴随高剂量的放射治疗来消灭动物的残余骨髓细胞群，并将干细胞移植物输注回动物体内。然后提供支持疗法同时复原骨髓功能，从而患者恢复。

释放的物质

本发明其它实施方案包括在癌细胞或肿瘤细胞内部或附近的据信是由一或多种与癌细胞或肿瘤细胞相关的蛋白酶的酶解和/或水解所释放的化学物质。此类化合物包括本文中所述的物质并包括如下列结构所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是

Z''是

Z'''是

G是卤素、-OH、-SH或-S-C₁-C₆烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B如下列中的任一定义：

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R^4A与R^4B如下列中的任一定义：

(ii)R^4A与R^4B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

或R⁵是

R¹²是氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀杂环基或C₆-C₁₄芳基；

R¹³是C₁-C₁₀杂环基；和

R⁷每次出现时独立地选自：F、Cl、I、Br、NO₂、CN和CF₃；

h是1、2、3、4或5；和

X是O或S。

特别感兴趣的是式IV所示的化合物，其具有下列结构：

在下列实施例中进一步例示本发明，下列实施例不旨在限制本发明的范围。

实施例

实验一般是在惰性气氛(氮气或氩气)下进行，特别是在使用氧敏感性或水分敏感性试剂或中间体的情况下。商购溶剂与试剂一般不经进一步纯化而使用，其在合适的情况下包括无水溶剂(通常是Sure-Seal^TM产品，出自Aldrich Chemical Company,Milwaukee,Wisconsin)。通常在进行进一步反应或进行生物试验之前先将产品真空干燥。质谱数据是由液相色谱法-质谱法(LCMS)、大气压化学电离(APCI)或气相色谱法-质谱法(GCMS)仪器报告的。利用百万分之几(ppm,δ)表示核磁共振(NMR)数据的化学位移，其以所用的氘代溶剂的残留峰做为参照。

对引用其它实施例或方法中的操作的合成而言，反应方案(反应长度与温度)可能改变。一般来说，反应之后是薄层色谱法(TLC)或质谱法，并在合适情况下进行精制。纯化可能随实验的不同而改变：一般来说，选择用于洗脱液/梯度的溶剂和溶剂比，以提供合适的R_f或保留时间。

在Perkin-Elmer旋光计343(序号9506)上进行旋光度测定。

在Agilent6220TOF LC/MS上进行HRMS。

用ACD Labs软件产生化合物名称。

用于分析的HPLC与LC-MS条件

方案A：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x3.0mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/乙腈(v/v)；梯度：5％B经1.5分钟，5％至100％B经8.5分钟，然后100％B经1分钟；流速：0.75mL/分钟。温度：25℃；检测：DAD215nm，254nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；进样量：10μL；仪器：Agilent1200LCMS。

方案B：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x3.0mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/乙腈(v/v)；梯度：50％B经1.5分钟，50％至100％B经6.5分钟，然后100％B经3分钟；流速：0.75mL/分钟。温度：25℃；检测：DAD215nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；进样量：10μL；仪器：Agilent1200LCMS。

方案C：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x3.0mm，5μm；流动相A：0.02％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.02％三氟乙酸/甲醇(v/v)；梯度：50％至100％B经10分钟；流速：0.75mL/分钟。温度：未控制；检测：DAD215nm，254nm；进样量：10μL；仪器：Agilent1100HPLC。

方案D：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x3.0mm，5μm；流动相A：0.02％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.02％三氟乙酸/甲醇(v/v)；梯度：5％至100％B经8分钟；流速：0.75mL/分钟。温度：未控制；检测：DAD215nm，254nm；进样量：10μL；仪器：Agilent1100HPLC。

方案E：柱：Phenomenex Lux Amylose-2，250x4.6mm，5μm；流动相A：己烷；流动相B：变性乙醇；梯度：5％至100％B经10分钟；流速：1.5mL/分钟。温度：未控制；检测：DAD215nm，254nm；MS(+)范围150至1500道尔顿；进样量：10μL；仪器：Agilent1100LCMS。

方案F：柱：Waters Acquity UPLC BEH，C18，2.1x50mm，1.7μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/乙腈(v/v)；梯度：5％B经0.1分钟，5％至95％B经0.7分钟，95％B经0.1分钟；流速：1.25mL/分钟。温度：60℃；检测：200至450nm；MS(+)范围100至1200道尔顿；进样量：5μL；仪器：Waters Acquity。

方案G：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x3.0mm，5μm；流动相A：0.02％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.02％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：0％至100％B经8.5分钟；流速：1.5mL/分钟。温度：未控制；检测：DAD210nm；进样量：10μL；仪器：Agilent1100HPLC。

方案H：柱：Phenomenex Gemini-NX，C18，4.6x50mm，3μm，110流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/乙腈(v/v)；梯度：0％至100％B经4.10分钟，线性的，然后100％B经0.4分钟；流速：1.5mL/分钟。温度：60℃；检测：DAD200至450nm；MS(+)范围100至2000道尔顿；进样量：5μL；仪器：Agilent。

方案I：柱：Atlantis T3，75x3.0mm，3μm；流动相A：0.05％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：乙腈；梯度：5％至95％B经5.75分钟；流速：1.2mL/分钟。温度：45℃；检测：DAD215nm，230nm，254nm；MS(+)范围150至1200道尔顿；进样量：5μL；仪器：Agilent1100LCMS。

方案J：柱：Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl，150x3.0mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/乙腈(v/v)；梯度：5％B经1.5分钟，5％至100％B经8.5分钟，然后100％B经1分钟；流速：0.75mL/分钟。温度：25℃；检测：DAD215nm，254nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；进样量：10μL；仪器：Agilent1200LCMS。

方案K：柱：Symmetry-C18，50x2.1mm，3.5μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/甲醇(v/v)；梯度：10％至90％B经6.5分钟；流速：0.7mL/分钟。温度：室温；检测：DAD215nm；MS(+)范围100至1500道尔顿；进样量：3μL；仪器：Waters996PDA。

方案L：柱：XBridge C-18，150x4.6mm，3.5μm；流动相A：5mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；梯度：10％B经3分钟，然后10％至80％B经14分钟；流速：0.7mL/分钟。温度：室温；检测：DAD215nm；MS(+)范围100至1500道尔顿；进样量：3μL；仪器：Waters996PDA。

方案M：柱：Phenomenex Luna，150x3.0mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/甲醇(v/v)；梯度：50％B经1.5分钟，50％至80％B经8.5分钟，然后80％B经10分钟；流速：0.75mL/分钟。温度：45℃；检测：DAD215nm、254nm；MS(+)范围90至2000道尔顿；进样量：10μL；仪器：Agilent1200LCMS。

方案N：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x3.0mm，5μm；流动相A：0.02％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.02％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：0％至100％B经23.5分钟；流速：1.5mL/分钟。温度：未控制；检测：DAD210nm；进样量：10μL；仪器：Agilent1100HPLC。

方案O：柱：柱：Agilent Poroshell300SB-C8，75x2.1mm，2.6μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/乙腈(v/v)；梯度：20％至45％B经4分钟；流速：1.0mL/分钟。温度：60℃；检测：220nm；MS(+)范围400至2000道尔顿；进样量：10μL；仪器：Agilent1100LC、Waters MicromassZQ MS。用MaxEnt1进行重叠合法。

方案P：柱：柱：TSK-gel G3000SWxl，300x7.8mm，10μm；流动相：磷酸盐缓冲盐水(PBS,1X)，pH7.4，含2％乙腈；等度洗脱；流速：1mL/分钟。温度：室温；进样量：5μL；仪器：Agilent1100HPLC。

方案Q：柱：Waters Acquity UPLC HSS T3，C18，2.1x50mm，1.7μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/乙腈(v/v)；梯度：5％B经0.1分钟，5％至95％B经2.5分钟，95％B经0.35分钟；流速：1.25mL/分钟。温度：60℃；检测：200至450nm；MS(+)范围100至2000道尔顿；进样量：5μL；仪器：Waters Acquity。

方案Q1：柱：Waters Acquity UPLC HSS T3，C18，2.1x50mm，1.7μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/乙腈(v/v)；梯度：5％B经0.1分钟，5％至95％B经1.5分钟，95％B经0.35分钟；流速：1.25mL/分钟。温度：60℃；检测：200至450nm；MS(+)范围100至2000道尔顿；进样量：5μL；仪器：Waters Acquity。

方案Q2：柱：Xtimate C18，2.1x30mm，3μm；流动相A：0.1％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.1％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：10％至80％B经0.9分钟，80％B经0.6分钟，100％B经0.5分钟；流速：1.2mL/分钟。检测：DAD220nM；温度：25℃；进样量：1μL；仪器：Agilent。

方案Q3：柱：Xtimate C18，2.1x30mm，3μm；流动相A：0.1％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.1％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：0％至60％B经0.9分钟，60％B经0.6分钟，100％B经0.5分钟；流速：1.2mL/分钟。检测：DAD220nM；温度：25℃；进样量：1μL；仪器：Agilent。

方案R：柱：Phenomenex Luna，150x3.0mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/甲醇(v/v)；梯度：5％B经1.5分钟，5％至100％B经8.5分钟，然后100％B经1分钟；流速：0.75mL/分钟。温度：45℃；检测：DAD215nm，254nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；进样量：10μL；仪器：305RP Agilent1200LCMS。

方案S：柱：Phenomenex Luna，150x3.0mm，5μm；流动相A：0.1％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.1％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：5％B经1.5分钟，5％至95％B经8.5分钟，然后100％B经1分钟；流速：1.0mL/分钟。温度：未控制；检测：DAD210nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；进样量：10μL；仪器：305RP Agilent1100HPLC。

方案T：柱：Atlantis dC18，50x4.6mm，5μm；流动相A：0.05％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.05％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：5％至95％B经4.0分钟，然后保持于95％B经1分钟；流速：2mL/分钟。温度：室温；检测：DAD215nm；MS(+)范围160至1000道尔顿；进样量：3μL；仪器：Waters996PDA。

方案U：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x3.0mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/乙腈(v/v)；梯度：5％B经1.5分钟，5％至100％B经8.5分钟，然后100％B经1分钟；流速：0.75mL/分钟。温度：45℃；检测：DAD215nm，254nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；进样量：10μL；仪器：Agilent1200LCMS。

方案V：柱：HPLC-V Ultimate XB-C18，50x3.0mm，3μm；流动相A：0.225％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.225％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：30％至90％B经6分钟；流速：1.2mL/分钟。温度：40℃；检测：DAD220nm；进样量：1μL；仪器：SHIMADZU。

方案W：柱：HPLC-V Ultimate XB-C18，50x3.0mm，3μm；流动相A：0.1％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.1％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：10％至80％B经6分钟；流速：1.2mL/分钟。温度：40℃；检测：DAD220nm；进样量：3μL；仪器：SHIMADZU。

方案X：柱：YMC-pack ODS-A，150x4.6mm，5μm；流动相A：0.1％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.1％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：10％至80％B经6分钟；流速：1.2mL/分钟。检测：DAD220nm；温度：40℃；进样量：3μL；仪器：SHIMADZU。

方案Y：柱：YMC-pack ODS-A，150x4.6mm，5μm；流动相A：0.1％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.1％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：0％至95％B经10分钟，然后95％B经5分钟；流速：1.5mL/分钟；检测：DAD220nm；仪器：Agilent1100。

方案Z：柱：Xtimate C18，2.1x30μm，3μm；流动相A：0.1％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.1％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：0％至60％B经2分钟；流速：1.2mL/分钟；温度：50℃；检测：220nm；MS(+)范围100至1000道尔顿；进样量：1μL；仪器：SHIMADZU。

方案AB：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x2.0mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/乙腈(v/v)；梯度：5％至100％B经10分钟，然后100％B经2分钟；流速：0.5mL/分钟。温度：25℃；检测：DAD210nm，254nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；进样量：5μL；仪器：Agilent1100LCMS。

方案BB：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x2.0mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/乙腈(v/v)；梯度：5％B经2.0分钟，5％至100％B经12分钟，100％B经2分钟，然后100％至5％B经1.5分钟；流速：0.75mL/分钟。温度：25℃；检测：DAD215nm，254nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；进样量：5μL；仪器：Agilent。

方案CB：柱：Waters XBridge C18，4.6x50mm，5μm；流动相A：0.03％氢氧化铵/水(v/v)；流动相B：0.03％氢氧化铵/乙腈(v/v)；梯度：5％至95％B经4.0分钟，然后95％B经1分钟；流速：2mL/分钟。温度：25℃；检测：DAD215nm；MS(+)范围160至1000道尔顿；进样量：4μL；仪器：Waters ZQ/Alliance2795HPLC。

方案DB：柱：Waters Atlantis dC18，4.6x50mm，5μm；流动相A：0.05％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.05％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：5.0％至95％B经4.0分钟，然后95％B经1分钟。流速：2mL/分钟。温度：25℃；检测：DAD215nm；MS(+)范围160至1000道尔顿；进样量：4μL；仪器：Waters ZQ/Alliance2795HPLC。

方案EB：柱：XBridge RP18，2.1x50mm，5μm；流动相A：0.02％氢氧化铵/水(v/v)；流动相B：0.02％氢氧化铵/乙腈(v/v)；梯度：10％至80％B经6分钟，然后80％B经2分钟；流速：1.2mL/分钟。检测：DAD220nm；温度：50℃。

方案FB：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x2.0mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/乙腈(v/v)；梯度：5％B经2.0分钟，5％至100％B经10分钟，然后100％B经2分钟；流速：0.50mL/分钟。温度：25℃；检测：DAD215nm，254nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；进样量：5μL；仪器：Agilent1200LCMS。

在某些情况下对LC-MS与HPLC分析条件做出一些小的改变，例如但不限于梯度或流速的改变，用符号*指示。

用于纯化的HPLC条件

方法A：柱：Phenomenex Lux Amylose-2，250x21.2mm，5μm；流动相A：庚烷；流动相B：变性乙醇；梯度：5％至100％B经6分钟；流速：27mL/分钟；检测：DAD210至360nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；仪器：Waters FractionLynx。

方法B：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x21.2mm，5μm；流动相A：0.02％乙酸/水；流动相B：0.02％乙酸/乙腈；梯度：5％B经1.5分钟，5％至45％B经8.5分钟；流速：27mL/分钟；检测：DAD215nm，254nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；仪器：Waters FractionLynx。

方法C：柱：Phenomenex Luna C18，100x30mm，10μm；流动相A：0.02％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.02％三氟乙酸/甲醇(v/v)；梯度：10％至90％B经20分钟；流速：20mL/分钟。温度：未控制；检测：DAD210nm、254nm；进样量：可变；仪器：Gilson。

方法D：柱：Phenomenex Synergi Max-RP，150x21.2mm，4μm；流动相A：0.1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/乙腈；梯度：30％B经1.5分钟，30％至60％B经8.5分钟，60％至100％B经0.5分钟，然后100％B经2分钟；流速：27mL/分钟；检测：DAD210至360nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；仪器：Waters FractionLynx。

方法E1：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x21.2mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/乙腈；梯度：40％B经1.5分钟，40％至80％B经8.5分钟，80％至100％B经0.5分钟，然后100％B经2分钟；流速：27mL/分钟；检测：检测：DAD210至360nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；仪器：Waters FractionLynx LCMS。

方法E2：柱：Phenomenex Luna Phenyl-hexyl，150x21.2mm，5μm。该方案的其余部份与对方法E1所述的相同。

方法F：柱：Phenomenex Synergi Max-RP，150x21.2mm，4μm；流动相A：0.1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/甲醇；梯度：44％B经1.5分钟，44％至77％B经8.5分钟，然后77％B经10分钟；流速：27mL/分钟；检测：DAD210至360nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；仪器：WatersFractionLynx LCMS。

方法G：柱：PrincetonSFC2-乙基吡啶，250x21.2mm，5μm；流动相A：庚烷；流动相B：变性乙醇；梯度：1％B经1.5分钟，1％至50％B经8.5分钟；流速：27mL/分钟；检测：DAD210至360nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；仪器：Waters FractionLynx LCMS。

方法H：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x21.2mm，5μm；流动相A：0.02％乙酸/水；流动相B：0.02％乙酸/乙腈；梯度：20％B经1.5分钟，20％至60％B经10.5分钟；流速：27mL/分钟；检测：DAD210至360nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；仪器：Waters FractionLynxLCMS。

方法I：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x21.2mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/甲醇；梯度：40％B经1.5分钟，40％至70％B经8.5分钟，然后70％B经10分钟；流速：27mL/分钟；检测：DAD210至360nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；仪器：WatersFractionLynx LCMS。

方法J：柱：Phenomenex Luna C18，100x30mm，5μm；流动相A：0.02％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.02％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：10％至90％B经20分钟；流速：20mL/分钟。温度：未控制；检测：DAD210nm，254nm；进样量：可变；仪器：Gilson。

方法K：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x21.2mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/乙腈；梯度：20％B经1.5分钟，20％至50％B经8.5分钟，50％至100％B经0.5分钟，然后100％B经2分钟；流速：27mL/分钟；检测：检测：DAD210至360nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；仪器：Waters Fraction Lynx LCMS。

方法L：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150x21.2mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/乙腈；梯度：30％B经1.5分钟，30％至50％B经8.5分钟，50％至100％B经0.5分钟，然后100％B经2分钟；流速：27mL/分钟；检测：检测：DAD210至360nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；仪器：Waters Fraction Lynx LCMS。

方法M：柱：Waters Sunfire，C18，19x100mm，5μm；流动相A：0.05％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.05％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：0至100％经8.5分钟。流速：25mL/分钟；检测：DAD215nm；MS(+)范围160至1000道尔顿；仪器：Waters FractionLynx。

方法N：柱：Waters Sunfire，C18，19x100mm，5μm；流动相A：0.05％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.05％甲酸/乙腈(v/v)；梯度：0至100％经8.5分钟。流速：25mL/分钟；检测：DAD215nm；MS(+)范围160至1000道尔顿；仪器：Waters FractionLynx。

方法O：柱：Phenomenex Luna C18，21.2x150mm，5μm；流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)；流动相B：0.1％甲酸/乙腈(v/v)；梯度(v/v)；梯度20％B经1.5分钟，20％至40％B经8.5分钟，40％至100％B经0.5分钟，然后保持100％B经1.5分钟。流速：27mL/分钟。检测：DAD210至360nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；仪器：Waters FractionLynx。

方法P：柱：Phenomenex Gemini C18，21.2x250mm，5μm；流动相A：0.225％氢氧化铵/水(pH10)(v/v)；流动相B：0.225％氢氧化铵/乙腈(v/v)；梯度：45％至85％B经10分钟；流速：35mL/分钟。检测：DAD220nm；MS(+)范围100至1200道尔顿；仪器：Shimadzu MSTrigger。

方法Q：柱：柱：Phenomenex Synergi C18，50x250mm，10μm；流动相A：0.1％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：乙腈；梯度：10％至40％B经25分钟。流速：100mL/分钟。检测：UV/Vis220nm；仪器：Shimadzu LC-8A。

方法R：柱：Phenomenex Luna C18(2)，250x21.2mm，5μm；流动相A：0.1％三氟乙酸/水(v/v)；流动相B：0.1％三氟乙酸/乙腈(v/v)；梯度：10％至100％经30分钟；流速：可变。温度：25℃；检测：DAD215nm、254nm；MS(+)范围150至2000道尔顿；进样量：1.8mL；仪器：Agilent1100Prep HPLC。

在某些情况下对纯化条件做出一些小的改变，例如但不限于梯度或流速的改变，用符号*指示。

通用操作

通用操作A：用二乙胺或哌啶除去Fmoc。将等体积的二乙胺或哌啶加入含有Fmoc的化合物的二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺(也被称为DMF)溶液中。通过LC-MS(或HPLC或TLC)监测反应进程。真空除去溶剂，在有些情况下使残留物与庚烷共沸一至四次。通常用二氯甲烷与少量的甲醇稀释残留物，然后在硅胶上浓缩并通过硅胶色谱法纯化，用甲醇/二氯甲烷(或其它合适的溶剂混合物)洗脱以得到期望物质(或直接使用粗制物)。

通用操作B：用三氟乙酸除去Boc或使叔丁酯裂解。在0℃(或室温)下将三氟乙酸加入含有Boc的化合物或含有叔丁酯的化合物的二氯甲烷溶液中以得到1：4的三氟乙酸：二氯甲烷比。通过LC-MS(或HPLC或TLC)监测反应进程。真空除去溶剂。使残留物与庚烷共沸三次以得到期望物质。

通用操作C：用盐酸的二噁烷溶液除去Boc或使叔丁酯(也被称为t-Bu酯)裂解。将4M盐酸的二噁烷溶液加入含有Boc的化合物或含有叔丁酯的化合物的二噁烷溶液(或在有些情况下没有溶液，或使用其它有关溶剂)中。通过LC-MS(或HPLC或TLC)监测反应进程。真空浓缩反应混合物并在有些情况下与庚烷共沸一至四次。

通用操作D：与O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)偶联。先将HATU(1.0-2.0当量)然后将三乙胺(2.0-4.0当量)或二异丙基乙胺(2.0-4.0当量，也被称为Hunig碱)加入搅拌的胺(1.0当量)与酸(1.0-2.0当量)在二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(也被称为DMF)或二者的混合物的溶液中。通过LC-MS(或HPLC或TLC)监测反应进程，通常该反应在三小时内完成。真空除去溶剂。通过硅胶或反相色谱法纯化残留物或在有些情况下与庚烷共沸三次，用少量的乙酸乙酯稀释，然后在硅胶或C18结合硅胶上浓缩，并通过硅胶或反相色谱法纯化。

通用操作E：与N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N⁵-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(MalcValCitPABC-PNP)偶联。将吡啶(0.0-4.0当量)、二异丙基乙胺(0.0-4.0当量)、2,6-二甲基吡啶(0.0-4.0当量，也被称为2,6-二甲基吡啶)和1-羟基苯并三唑水合物(0.01-1.1当量，也被称为HOBT)或3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-酚(0.01-1.1当量，也被称为HOAT)加入有效负载胺(1当量)与N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N⁵-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(MalcValCitPABC-PNP,Eur.Pat.Appl.(1994),EP624377,1.0-2.0当量)在N,N-二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺(也被称为DMA)中的混合物中。在40-50℃下搅拌1-48小时，然后真空浓缩反应混合物并与庚烷共沸三次。按照指定的方法通过反相色谱法纯化粗制物质以得到期望物质。

通用操作F：通过内部二硫键(disulfide)将商购抗体与连接基-有效负载缀合。使商购的抗体(Genentech Inc)透析进入Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Lonza)中。加入x当量的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP,5mM在蒸馏水中的溶液)使经透析的抗体还原，并用DPBS、5mM2,2',2'',2'''-(乙烷-1,2-二基二次氮基)四乙酸(EDTA)(pH7.0-7.4，缓冲液A)稀释成15mg/mL最终抗体浓度。在37℃下将反应混合物温育1-2小时，然后冷却到室温。加入y当量的连接基-有效负载(5-10mM在二甲基乙酰胺(DMA)中的溶液)以进行缀合。加入DMA以使在最终反应混合物中的总有机溶剂成分达到10-20％(v/v)，并加入缓冲液A以达到10mg/mL最终抗体浓度。在室温下将反应混合物温育1-2小时。然后按制备商的说明用GE Healthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱将反应混合物的缓冲液更换成DPBS(pH7.4)。使用具有GE Superdex柱及以PBS(pH7.4)洗脱液的GE AKTAExplorer系统，通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化粗制物质。

通用操作G：在离心超滤装置例如Amicon Ultra50k Ultracel过滤器(part#UFC805096,GE)的上部中进行缀合反应。在含有50mM EDTA的PBS中制备132mM的L-半胱氨酸储备原液。将此溶液(50μL)加入各突变抗体(5mg)与950μL含有50mM EDTA的PBS混合物中。该反应混合物的最终半胱氨酸浓度是6.6mM。使该反应混合物处于室温(约23℃)1.5小时，然后将反应管离心使该物质浓缩成约100μL。用含有50mM EDTA的PBS将该混合物稀释成1mL。重复此工序四次以便除去所有的半胱氨酸还原剂。用含有50mM EDTA的PBS将所得物质稀释成1mL，用16μL的5mM顺丁烯二酰亚胺连接基-有效负载(来自表18A，在二甲基乙酰胺(DMA)中，约5当量)溶液处理。使反应混合物处于室温(约23℃)1.5小时，然后将反应管离心使该物质浓缩成约100μL。用PBS将该混合物稀释成1mL。重复此工序二次以便除去过量的顺丁烯二酰亚胺反应物。一般使用具有GESuperdex200柱和PBS(pH7.4)洗脱液的GE AKTAExplorer系统，通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化该抗体缀合物。用多种方法(包括在别处说明的质谱法(MS)、反相HPLC和疏水作用色谱法(HIC))测定在意图缀合位点上的药物负载。通常在还原条件下通过LC-MS得到报告值(请参见表19A与19B)。

通用操作H：将20mM TCEP溶液(一般50-100摩尔当量)加入到该抗体(通常为5mg)中使得在含有50mM EDTA的PBS中的最终抗体浓度是5mg/mL。使反应混合物处于37℃经1.5小时，然后用50kD MW截止旋转浓缩装置(3x3mL清洗，每一循环10x浓缩)将抗体的缓冲液更换成含有50mM EDTA的PBS。在具体情况下也可用另外的方法例如TFF或透析。使所得抗体悬浮于1mL含有50mM EDTA的PBS中，用新制的50mMDHA(脱氢抗坏血酸盐)的1:1PBS/EtOH溶液(最终DHA浓度通常是1mM)处理，使其处于4℃整夜。用50kD MW截止旋转浓缩装置(3x3mL清洗，每一循环10x浓缩)将该抗体/DHA混合物的缓冲液更换成含有50mMEDTA的PBS。使所得抗体悬浮于1mL含有50mM EDTA的PBS中，用10mM顺丁烯二酰亚胺连接基-有效负载/DMA(通常为5-10当量)处理。使其静置1.5小时，然后将该物质的缓冲液如前所述地更换成1mL的PBS(3x3mL清洗，每一循环10x浓缩)。视需要如前所述地通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行纯化以除去任何聚集物质。

通用操作I：用前述方法(通用操作F)进行该连接基-有效负载的最初缀合。用超滤装置(50kd MW截止)将所得抗体-药物缀合物的缓冲液更换成50mM硼酸盐缓冲液(pH9.2)。将所得溶液加热到37℃持续24小时(对于顺丁烯二酰亚胺-Peg连接基)或加热到45℃持续48小时(对于顺丁烯二酰亚胺-己酰基连接基)。冷该所得溶液，将缓冲液更换成PBS，通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化(如前所述)以便除去任何聚集物质。该物质的LCMS分析表明丁二酰亚胺环已经完全打开(90％或更多)。请注意在甲酯存在于有效负载中的实施例中，该酯在所述条件下被水解成羧酸。

通用操作J：按照前面在WO2012007896A1中概述的操作，使五氟苯酯与所示的抗体缀合。

通用操作K：通过在WO2012059882A2中所述的酶介导的接合(ligation)来完成氨基-烷基连接基的缀合。

通用操作L：在DMF、二氯甲烷溶液中或在有些情况下在二者的溶液(或一或多种溶剂的溶液)中，在Hunig碱(1.0-5.0当量)的存在下，用HATU(1.0-2.0当量)使N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(以与#136相同的方式制得)与有关的氨基酸或胺部分偶联。通过LC-MS(或TLC或HPLC)监测反应。真空浓缩反应混合物，通常通过硅胶色谱法或制备级HPLC纯化。然后按照通用操作A中所述进行Fmoc脱保护，然后真空浓缩，并通过硅胶色谱法或制备级HPLC纯化。

通用操作M：在DMF、二氯甲烷溶液中或在有些情况下在二者的溶液(或一或多种溶剂的溶液)中，在Hunig碱(1.0-5.0当量)的存在下，用HATU(1.0-2.0当量，或其它合适的偶联剂)使#151与有关的胺偶联。通过LC-MS(或TLC或HPLC)监测反应。真空浓缩反应混合物。然后按照通用操作B中所述进行Boc脱保护，真空浓缩，并通过硅胶色谱法或制备级HPLC纯化。

通用操作N：在DMF、二氯甲烷溶液中或在有些情况下在二者的溶液(或一或多种溶剂的溶液)中，在Hunig碱(1.0-5.0当量，或其它合适的碱)的存在下，用HATU(1.0-2.0当量，或其它合适的偶联剂)使1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16,19,22-七氧杂-4-氮杂二十五烷-25-酸(或其它合适的Fmoc-AmPegXC2-COOH)与有关的细胞毒性五肽(或在N端以外的反应部分上含有保护基的细胞毒性五肽)偶联。通过LC-MS(或TLC或HPLC)监测反应。真空浓缩反应混合物。按照通用操作A进行Fmoc脱保护。在有些情况下通过通用操作B(或在基于保护基的文献中已知的其它有关操作)进行第二次脱保护以便除去在细胞毒性五肽上的反应部分上的保护基。真空浓缩反应混合物，并通过硅胶色谱法或制备级HPLC纯化。

通用操作O：使合适的Fmoc-AmPegXC2-COOH与有关的细胞毒性五肽(或在N端以外的反应部分上含有保护基的细胞毒性五肽)偶联，并按照通用操作N进行Fmoc脱保护。真空浓缩反应混合物，然后通过硅胶色谱法或制备级HPLC纯化(或直接使用该粗制物)。然后按照通用操作E安装合适的PABC序列(例如mcValCitPABC或其衍生物)。在有些情况下如果保护基存在于分子的细胞毒性五肽部分，则用通用操作A或通用操作B(或在基于保护基的文献中已知的其它有关操作)进行脱保护。真空浓缩反应混合物，并通过硅胶色谱法或制备级HPLC纯化。

通用操作P：按照步骤E，以MalPeg3C2ValCitPABC-PNP(以与mcValCitPABC-PNP相似的方式制得)替换mcValCitPABC-PNP。

通用操作Q：使合适的Fmoc-AmPegXC2-COOH与有关的细胞毒性五肽(或在N端以外的反应部分上含有保护基的细胞毒性五肽)偶联，并按照通用操作N中所述的进行Fmoc脱保护。真空浓缩反应混合物，然后通过硅胶色谱法或制备级HPLC纯化(或直接使用该粗制物)。在0℃(或在有些情况下稍微高一点的温度)先将溴乙酸(1.0-2.0当量)然后将Hunig碱(1.0-5.0当量)与HATU(1.0-2.0当量)加入搅拌的残留物的DMF溶液中。将反应混合物加热到室温，并在室温搅拌，同时通过LC-MS(或TLC或HPLC)监测。真空浓缩反应混合物，并通过制备级HPLC纯化。

通用操作R：按照步骤E，以N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(以与mcValCitPABC-PNP相似的方式制得)替代mcValCitPABC-PNP。然后按照通用操作B进行Fmoc脱保护，然后通过制备级HPLC纯化。

通用操作S：先将有关的细胞毒性五肽(1.0当量)然后将甲酸加入搅拌的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己醛(1.0-3.0当量)的甲醇溶液中。在室温下将反应混合物搅拌1-40分钟，然后加入(氰基-κC)(三氢化)硼酸钠(1-)(3.0-6.0当量，也被称为氰基硼氢化钠)。通过LC-MS(或TLC或HPLC)监测反应。在有些情况下再加入另外的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己醛(1.0-3.0当量)。真空浓缩反应混合物，然后通过制备级HPLC纯化。

通用操作T：按照文献Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters.2012,vol.22,#13,4249-4253中所述制得4-[3-氧代-3-(2-氧代氮杂环丁烷-1-基)丙基]苯铵，然后用HATU/二氯甲烷使其与3,3'-[乙烷-1,2-二基二(氧基)]二丙酸双(五氟苯基)酯偶联，然后与期望的细胞毒性五肽偶联。然后通过制备级HPLC纯化物质。

通用操作U：按照通用操作E使Fmoc-ValCitPABC-PNP与期望的细胞毒性五肽偶联，然后按照通用操作A除去Fmoc。然后使残留物与[2-氧代-2-({4-[3-氧代-3-(2-氧代氮杂环丁烷-1-基)丙基]苯基}氨基)乙氧基]乙酸(按照通用操作D使4-[3-氧代-3-(2-氧代氮杂环丁烷-1-基)丙基]苯铵与1,4-二噁烷-2,6-二酮偶联制得)偶联。然后通过制备级HPLC纯化物质。

通用操作V：按照通用操作D使3,3'-[乙烷-1,2-二基二(氧基)]二丙酸双(五氟苯基)酯或4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酸双(五氟苯基)酯与期望的细胞毒性五肽偶联(或在有些情况下与在N端以外的反应部分上含有保护基的期望的细胞毒性五肽偶联)。如果存在保护基，则用文献中所述的有关步骤除去该保护基。然后通过制备级HPLC纯化物质。

通用操作W：按照通用操作E使1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十三烷-13-酸4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯酯与期望的细胞毒性五肽偶联。按照通用操作A除去Fmoc。按照通用操作D使残留物与3,3'-[乙烷-1,2-二基二(氧基)]二丙酸双(五氟苯基)酯偶联。然后通过制备级HPLC纯化物质。

通用操作X1：按照通用操作E使N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N～1～-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～4～-三苄基-L-天冬酰胺与期望的细胞毒性五肽偶联。按照通用操作A除去Fmoc，并按照通用操作B除去三苄基保护基。按照通用操作D使残留物与3,3'-[乙烷-1,2-二基二(氧基)]二丙酸双(五氟苯基)酯偶联。通过制备级HPLC纯化物质。

通用操作X2：按照通用操作E使N-{3-[2-(3-乙氧基-3-氧代丙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺与期望的细胞毒性五肽偶联。在THF与水中用氢氧化锂除去乙酯。然后用N,N'-二环己基碳二亚胺/THF使残留物与1-羟基吡咯烷-2,5-二酮偶联形成NHS酯。通过制备级HPLC纯化物质。

通用操作X3：按照通用操作D在DMSO与乙腈中使N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-D-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(2-羧基丙-2-基)氨甲酰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺与#50偶联。按照通用操作A除去Fmoc，然后用Hunig碱/乙腈使残留物与3,3'-[乙烷-1,2-二基二(氧基)]二丙酸双(五氟苯基)酯偶联。通过制备级HPLC纯化物质。

通用操作X4：按照通用操作D在乙腈中使N-[1-(9H-芴-9-基)-3,5,12-三氧代-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-基]-2-甲基丙氨酸与#250偶联。按照通用操作A除去Fmoc，然后用Hunig碱/乙腈使残留物与3,3'-[乙烷-1,2-二基二(氧基)]二丙酸双(五氟苯基)酯偶联。通过制备级HPLC纯化物质。

通用操作X5：按照通用操作D使L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟基甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺与N～2～-乙酰基-N～6～-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸偶联。用Hunig碱/DMF使所得残留物与双(4-硝基苯基)碳酸酯偶联，然后按照通用操作E与期望的细胞毒性五肽偶联。然后按照通用操作B在乙腈中进行Boc脱保护。通过制备级HPLC纯化残留物。

在有些情况下对反应条件做出小的改变，例如但不限于试剂与反应物加入的顺序和/或试剂或反应物的量，用符号*指示。此外，这些通用操作仅为示例性且非限制性的。

除了前面被提出的通用操作外，有关的多拉司他汀与奥里斯他汀参考文献包括下列：Petit等人，J.Am.Chem.Soc.1989,111,5463；Petit等人Anti-Cancer DrugDesign1998,13,243与其中被引用的参考文献；Petit等人J.Nat.Prod.2011,74,962；WO96/33212；WO95/09864；EP0695758；WO07/8848；WO01/18032；WO09/48967；WO09/48967；WO09/117531；WO08/8603；US7,750,116；US5,985,837与US2005/9751；整体援引加入本文。

MS分析与样品制备

将约20μL样品(约1mg/mL的ADC/PBS)与20μL的20mM二硫苏糖醇(DTT)结合来制备供LC-MS分析的样品。使混合物处于室温5分钟，然后按照方案O分析样品。

进行下列计算以便确立缀合物的总负载(DAR)：

负载＝2*[LC1/(LC1+LC0)]+2*[HC1/(HC0+HC1+HC2+HC3)]+4*

[HC2/(HC0+HC1+HC2+HC3)]+6*[HC3/(HC0+HC1+HC2+HC3)]

其中所指示的变量是以下的相对丰度：LC0＝未负载的轻链，LC1＝单一负载的轻链，HC0＝未负载的重链，HC1＝单一负载的重链，HC2＝双重负载的重链，和HC3＝三重负载的重链。

所用的LC-MS条件是：除非另外指定，对于保留时间少于1分钟的用方案F，而其余的实验用方案H。

制备N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R,3S,4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#8)

步骤1.合成[(2S,3S)-1-羟基-3-甲基戊-2-基]甲基氨甲酸苄酯(#1)。将硼烷-四氢呋喃复合物(1M在四氢呋喃中的溶液,375mL,375mmol,2当量)经1小时缓慢加入N-[(苄氧基)羰基]-N-甲基-L-异亮氨酸(52.37g,187.5mmol,1当量)的四氢呋喃(524mL,0.35M)溶液中，在室温使反应混合物搅拌18小时。将反应混合物冷却到0℃，经30分钟加入水(30mL)。用1M碳酸钠水溶液(100mL)与叔丁基甲醚(250mL)稀释反应混合物。用叔丁基甲醚(100mL)反萃取水层。用1M碳酸钠水溶液(100mL)清洗合并的有机层，用盐水(200mL)清洗，在硫酸镁上干燥，过滤，真空浓缩，得到浅黄色油#1(48.44g,97％收率)，其不经进一步纯化即用于下一步。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物:δ7.26-7.41(m,5H),[5.06(AB四重峰,J_AB＝12.9Hz,Δν_AB＝22.8Hz)与5.06(AB四重峰,J_AB＝9.0Hz,Δν_AB＝9.0Hz),共2H],[4.65(t,J＝5.3Hz)与4.59(t,J＝5.4Hz),共1H],3.67-3.80(m,1H),3.51-3.60(m,1H),3.41-3.51(m,1H),2.75与2.71(2s,共3H),1.49-1.64(br m,1H),1.24-1.37(br m,1H),0.90-1.02(br m,1H),0.74-0.87(m,6H)。

步骤2.合成甲基[(2S,3S)-3-甲基-1-氧代戊-2-基]氨甲酸苄酯(#2)。将三乙胺(8.70mL,64.0mmol,2.05当量)加入#1(8.27g,31.2mmol,1当量)的二甲亚砜(41.35mL,0.75M)溶液中，将混合物冷却到0℃。然后分批加入三氧化硫吡啶复合物(10.18g,63.96mmol,2.05当量)同时保持内部温度低于8℃。使反应到达室温并搅拌18小时。将反应混合物倒入水(100mL)与叔丁基甲醚(100mL)中。用叔丁基甲醚(50mL)反萃取水层，用盐水(100mL)清洗合并的有机层，在硫酸镁上干燥，过滤，真空浓缩，通过硅胶色谱法(梯度：10％到60％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为无色油的#2(7.14g,87％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物,特征信号:δ9.61(s,1H),7.26-7.42(m,5H),5.01-5.13(m,2H),4.04-4.12(m,1H),2.86与2.82(2s,共3H),1.94-2.11(br m,1H),1.26-1.42(br m,1H)。

步骤3.合成(3R,4S,5S)-4-{[(苄氧基)羰基](甲基)氨基}-3-羟基-5-甲基庚酸叔丁酯(#3)。在-78℃下将正丁基锂(2.5M在四氢呋喃中的溶液,35.9mL,89.8mmol,1.4当量)加入到二异丙胺(13.8mL,96.3mmol,1.5当量)的四氢呋喃(50mL,1.3M)溶液中制得二异丙胺锂。1小时后，逐滴加入乙酸叔丁酯(15.7mL,116mmol,1.8当量)，将反应混合物搅拌1.5小时同时缓慢加热到-20℃。将反应混合物冷却到-78℃，加入醛#2(16.9g,64.2mmol,1当量)的四氢呋喃(10mL)溶液。将反应混合物搅拌1.5小时然后加入水(100mL)来猝灭。用乙醚(2x100mL)萃取，在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩，通过硅胶色谱法(梯度：0％到20％丙酮/庚烷)纯化，得到作为无色油的#3(8.4g,34％)。LC-MS:m/z402.4[M+Na⁺],保留时间＝3.91分；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物:δ7.27-7.39(m,5H),5.01-5.12(m,2H),[4.93(d,J＝7.2Hz)与4.98(br d,J＝7.2Hz),共1H],4.03-4.15(br m,1H),3.68-3.85(br m,1H),2.65与2.72(2br s,共3H),2.28-2.37(m,1H),2.09-2.17(m,1H),1.74-1.90(br m,1H),1.41-1.51(m,1H),1.39(s,9H),0.92-1.01(m,1H),0.77-0.92(m,6H)。

步骤4.合成(3R,4S,5S)-4-{[(苄氧基)羰基](甲基)氨基}-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯(#@2)。先将分子筛(40.7g)与质子海绵(1,8-双(二甲氨基)萘)(13.4g,59.2mmol,2.7当量)然后将三甲基氧鎓四氟硼酸盐(9.10g,61.6mmol,2.8当量)加入#3(8.4g,22mmol,1当量)的1,2-二氯乙烷(25mL,0.88M)溶液中。搅拌整夜，用硅藻土过滤反应混合物。真空浓缩滤液，通过硅胶色谱法(梯度：0％到40％的1：1的丙酮：乙酸乙酯/庚烷)纯化残留物，得到作为无色油的#@2(8.7g,68％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物:δ7.28-7.40(m,5H),5.01-5.13(m,2H),3.89-4.08(br m,1H),3.70-3.82(m,1H),3.18与3.26(2s,共3H),2.66与2.71(2brs,共3H),2.44-2.53(m,1H,推测；部份被溶剂峰遮蔽),2.17-2.24(m,1H),1.71-1.86(br m,1H),1.39与1.39(2s,共9H),1.31-1.40(m,1H),0.94-1.08(m,1H),0.76-0.91(m,6H)。

步骤5.合成(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲氨基)庚酸叔丁酯盐酸盐(#4)。将10％钯碳(50％湿的)(0.1wt％；1.34g,3.40mmol)加入#@2(13.37g,33.98mmol,1当量)在甲醇(134mL,0.1M)与浓盐酸(3.1mL,37.4mmol,1.1当量)的溶液中。在45psi下将混合物氢化3小时，然后氮气冲洗，通过硅藻土过滤，真空浓缩，得到作为白色固体的#4(9.20g,92％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.65(br s,1H),8.97(br s,1H),3.98-4.04(m,1H),3.40(s,3H),3.06-3.13(br m,1H),2.82(br dd,J＝6,5Hz,3H),2.74-2.80(m,1H),2.68(dd,ABX图形的一半,J＝16.3,4.2Hz,1H),2.00-2.10(br m,1H),1.73-1.84(m,1H),1.46(s,9H),1.38-1.45(m,1H),1.13(d,J＝7.0Hz,3H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H)。

步骤6.合成(3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯(#5)。先将N-甲基吗啉(6.52mL,59.1mmol,1.5当量)然后将#4(11.80g,39.9mmol,1当量)加入N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酸(18.53g,54.60mmol,1.3当量)与2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)(9.58g,54.6mmol,1.3当量)在2-甲基四氢呋喃(118.00mL,0.34M)的混合物中。3小时后，用水(50mL)使反应猝灭，搅拌15分钟。将水层分离并用2-甲基四氢呋喃(50mL)反萃取。用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)清洗合并的有机层，在硫酸镁上干燥，过滤，真空浓缩，得到无色油，通过硅胶色谱法(梯度：5％到40％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为无色泡沫的#5(26.2g,91％)。LC-MS(方案I)m/z581.3[M+H⁺]604.3[M+Na⁺],保留时间＝4.993分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),可能是一种旋转异构体混合物,主要特征信号:δ7.88(d,J＝7.4Hz,2H),7.71(d,J＝7.4Hz,2H),7.62(d,J＝8.6Hz,1H),7.41(dd,J＝7.4,7.4Hz,2H),7.27-7.34(m,2H),4.13-4.32(m,4H),3.70-3.82(br m,1H),3.24(s,3H),2.92(br s,3H),2.54(dd,J＝15.7,2.4Hz,1H),2.17(dd,J＝15.4,9.4Hz,1H),1.95-2.07(m,1H),1.70-1.83(br m,1H),1.40(s,9H),0.83-0.94(m,9H),0.69(t,J＝7.2Hz,3H)。

步骤7A.合成(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(L-缬氨酰基)氨基]庚酸叔丁酯(#6)。将二乙胺(22mL)经30分钟加入#5(26g,42mmol,1当量)的四氢呋喃(260mL,0.16M)溶液中。将反应混合物搅拌约6小时，然后通过硅藻土过滤悬浮液，用四氢呋喃(25mL)清洗。真空浓缩滤液，得到浅黄色油，用2-甲基四氢呋喃(50mL)使油溶解，浓缩以保证完全除去二乙胺。粗制油#6(>15.25g)不经进一步纯化即用于下一步。

步骤7B.合成(3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸(#@5)。按照通用操作B，由#5(1.62g,2.79mmol,1当量)、二氯甲烷(10mL,0.3M)与三氟乙酸(3mL)合成作为固体的#@5(1.42g,97％)，其不经进一步纯化就被使用。LC-MS m/z525.3[M+H⁺]547.3[M+Na⁺]保留时间＝0.95分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),特征信号:δ7.89(d,J＝7.6Hz,2H),7.71(d,J＝7.4Hz,2H),7.59(d,J＝8.8Hz,1H),7.41(dd,J＝7.6,7.4Hz,2H),7.28-7.34(m,2H),4.14-4.32(m,4H),3.24(s,3H),2.92(br s,3H),2.51-2.57(m,1H,推测；部份被溶剂峰遮蔽),2.20(dd,J＝15.9,9.5Hz,1H),1.95-2.06(m,1H),1.70-1.83(br m,1H),1.22-1.36(br m,1H),0.84-0.93(m,9H),0.70(t,J＝7.3Hz,3H)。

步骤8.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-叔丁氧基-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#7)。将2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)(9.71g,55.3mmol,1.3当量)加入N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酸(19.54g,55.29mmol,1.3当量)与#6(15.25g,42.54mmol,1当量)在2-甲基四氢呋喃(152mL,0.28M)的混合物中。10分钟后，缓慢加入N-甲基吗啉(6.6mL,60mmol,1.4当量)同时保持内部温度低于25℃。搅拌反应混合物4小时，然后加入水(50mL)使反应猝灭。搅拌15分钟，将水层分离并用2-甲基四氢呋喃(50mL)反萃取。用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)清洗合并的有机层，然后在硫酸镁上干燥，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：5％到35％乙酸乙酯/庚烷)纯化所得黄色泡沫，得到#7(32g,97％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物,特征信号:δ7.89(d,J＝7.4Hz,2H),7.62(d,J＝7.4Hz,2H),7.41(br dd,J＝7.4,7.4Hz,2H),7.29-7.34(m,2H),4.52-4.69(br m,1H),3.70-3.82(br m,1H),3.22与3.25(2br s,共3H),2.94与2.96(2br s,共3H),2.78与2.81(2br s,共3H),2.11-2.23(m,1H),1.90-2.10(m,2H),1.68-1.83(br m,1H),1.40(s,9H),1.21-1.33(br m,1H)。

步骤9.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R,3S,4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#8)。将三氟乙酸(17.4mL,231mmol,5当量)经10分钟逐滴加入#7(32g,46mmol,1当量)/二氯甲烷(160mL,0.29M)中。6小时后，加入相同量的三氟乙酸，继续反应18小时。用甲苯(320mL)稀释反应混合物，真空浓缩，得到作为带桃红色油的#8(35.8g,97％)，其不经进一步纯化即用于下一步。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物,特征信号:δ7.90(d,J＝7.0Hz,2H),7.62(d,J＝7.4Hz,2H),7.41(br dd,J＝7.4,7.0Hz,2H),7.29-7.35(m,2H),4.54-4.68(brm,1H),[4.09(d,J＝11Hz)与4.22(d,J＝10.9Hz),共1H],3.74-3.84(br m,1H),3.22与3.24(2br s,共3H),2.94与2.96(2br s,共3H),2.78与2.80(2br s,共3H),2.13-2.24(m,1H),1.89-2.10(br m,2H),1.70-1.81(br m,1H)。

制备(2R,3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酸(#11；“Boc-Dap-酸”)

步骤1.合成(2S)-2-[(1R,2S)-1-羟基-2-甲基丁-3-烯-1-基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(#9)。先将(2Z)-2-丁烯-1-基三氟硼酸钾(9.76g,60.2mmol,1.2当量)然后将四正丁基溴化铵(3.24g,5.02mmol,0.1当量)与水(60mL)加入到(2S)-2-甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(10g,50mmol,1当量)的二氯甲烷(120mL,0.42M)溶液中。13小时后，用二氯甲烷(150mL)与水(150mL)稀释反应混合物。将水层分离并用二氯甲烷(100mL)反萃取。用氯化钠水溶液(5wt％,200mL)清洗合并的有机层，用水(200mL)清洗，真空浓缩，得到作为橙色油的#9(～13g)，其不经进一步纯化就被使用。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.61-5.86(br m,1H),4.97-5.09(m,2H),3.80-3.98(br m,2H),3.45-3.67(br m,1H),3.21-3.29(m,1H),2.14-2.26(m,1H),1.80-2.04(m,3H),1.65-1.76(m,1H),1.47(s,9H),1.12(d,J＝6.6Hz,3H)。

步骤2.合成(2S)-2-[(1R,2S)-1-甲氧基-2-甲基丁-3-烯-1-基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(#10)。将氢化钠(60％在矿物油中,3.38g,84.4mmol,1.1当量)与己烷(40mL)混合，将混合物快速机械搅拌5分钟。使固体沉降并除去己烷。重复此操作二次以除去矿物油。加入N,N-二甲基甲酰胺(59mL,1.3M)，将混合物冷却到0℃；然后逐滴加入甲基碘(5mL,81mmol,1.05当量)，然后经5分钟逐滴加入#9(19.6g,76.8mmol,1当量)的N,N-二甲基甲酰胺(59mL)溶液同时保持温度在0℃到5℃范围内。在0℃搅拌反应混合物2小时。用饱和氯化铵水溶液(150mL)使反应猝灭，倒入氯化钠水溶液(5wt％,300mL)中，用乙酸乙酯(3x50mL)萃取混合物。用10％氯化钠水溶液(2x300mL)清洗合并的有机层，用水(200mL)清洗，真空浓缩。通过乙酸乙酯(150mL)浓缩所得水润湿的油，由硅胶色谱法(梯度：2％到10％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为无色油的#10(15.0g,73％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃),推测是一种旋转异构体混合物:δ5.60-5.83(m,1H),4.91-5.06(m,2H),3.81-3.95(br m,1H),3.43(s,3H),3.36-3.61(m,2H),3.19-3.31(m,1H),2.09-2.21(m,1H),1.86-2.02(br m,2H),1.62-1.85(br m,2H),1.47与1.49(2s,共9H),1.09(d,J＝6.6Hz,3H)。

步骤3.合成(2R,3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酸(#11)。先加入水(30.00mL)然后加入N-甲基吗啉-N-氧化物(25.97g,192.1mmol,2.07当量)与四氧化锇(235.93mg,928.04μmol,0.01当量)到#10(25.0g,92.8mmol,1当量)/叔丁醇(100mL,0.93M)中。12小时后，真空浓缩混合物，用水(20mL)共沸除去残留的叔丁醇。残留物用乙酸乙酯(500mL)和水(500mL)与盐水(150mL)萃取使之分离。用乙酸乙酯(250mL)萃取水层。用10wt％氯化钠水溶液(200mL)清洗合并的有机层，用水(150mL)清洗，真空浓缩，得到水润湿的浅棕色油(由100mL乙酸乙酯再次浓缩以除去任何残留的水)。此粗制的二醇(34.76g)不经进一步纯化就被使用。

将高锰酸钠(2.03g,5.73mmol,0.05当量)加入粗制的二醇(34.76g,≤92.8mmol,1当量)在乙腈(347mL,0.1M)和水(174mL)混合物中。冷却混合物到0℃，经30分钟分批加入高碘酸钠(51.46g,240.6mmol,2.1当量)同时保持内部温度低于5℃。在0℃搅拌反应混合物4小时，然后倒入五水硫代硫酸钠(65.40g,263.5mmol,2.3当量)的水(100mL)溶液中。通过硅藻土过滤混合物，真空浓缩滤液。将残留物用乙酸乙酯(200mL)和水(200mL)萃取使之分离。用乙酸乙酯(250mL)反萃取水层，用10％柠檬酸水溶液清洗合并的有机层。因期望产物很难溶于水，将全部水层合并，用硅藻土(100g)处理，真空浓缩，得到灰白色糊料。加入乙酸乙酯(150mL)，浓缩混合物以除去任何残留的水；再一次重复此操作。用乙酸乙酯(150mL)处理糊料，在50℃下放置于真空中10分钟，过滤(重复二次)。将这些滤液与先前来自柠檬酸清洗的有机层复合，浓缩，用乙酸乙酯(200mL)稀释，通过硅藻土过滤以除去固体。最后浓缩滤液，得到作为带黄色/棕色泡沫的#11(22.9g,两个步骤共69％)。LCMS(方案I):m/z310.1[M+Na⁺],232.1[(M-2-甲基丙-1-烯)+H⁺],188.1[(M-Boc)+H⁺],保留时间＝3.268分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),特征信号:δ3.61-3.85(br m,2H),3.20-3.45(br m,4H),3.03-3.17(brm,1H),1.59-1.93(br m,4H),1.40(br s,9H),1.02-1.18(br m,3H)。

制备(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸盐(#19)和(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙烷硫代酰胺三氟乙酸盐(#18)

步骤1.合成Nα-(叔丁氧羰基)-L-苯丙氨酰胺(#12)。将N-甲基吗啉(13.6mL,124mmol,1.09当量)与氯甲酸乙酯(11.8mL,124mmol,1.09当量)加入被冷却到-10℃的Boc-Phe-OH(30.1g,113mmol,1当量)的四氢呋喃(378mL,0.3M)溶液中。20分钟后，加入30％氢氧化铵水溶液(45mL,350mmol,3.1当量)。在室温搅拌混合物18小时，然后真空浓缩。用乙酸乙酯稀释残留物，依序用1N硫酸氢钾水溶液、水与盐水清洗。然后在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩。用乙酸乙酯(约400mL)溶解白色固体同时加热并搅拌；然后使溶液冷却到室温，然后加入己烷(～1000mL)。几分钟后，反应混合物开始沉淀出一种白色固体。过滤收集固体，用庚烷(2x～150mL)清洗，在真空中干燥18小时，得到作为固体的#12(24.50g,82％)。LC-MS:m/z263.2[M-H⁺],309.2[M+HCO₂ ^-],保留时间＝1.85分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物,主要的旋转异构体:δ7.35(br s,1H),7.22-7.30(m,5H),7.00(br s,1H),6.78(d,J＝8.6Hz,1H),4.09(ddd,J＝10,9,4.5Hz,1H),2.95(dd,J＝13.8,4.4Hz,1H),2.72(dd,J＝13.7,10.1Hz,1H),1.30(s,9H)。

步骤2.合成[(2S)-1-氨基-3-苯基-1-硫代丙基-2-基]氨甲酸叔丁酯(#13)。将2,4-双(4-甲氧基苯基)-1,3,2,4-二硫杂二磷杂环丁烷-2,4-二硫酮(Lawesson试剂)(12.70g,31.40mmol,0.59当量)加入#12(14.060g,53.192mmol,1当量)的四氢呋喃(180mL,0.296M)溶液中，使反应混合物回流90分钟。使反应混合物冷却到室温，加入饱和碳酸氢钠水溶液使反应猝灭。用乙酸乙酯萃取混合物二次，在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩。用乙酸乙酯溶解残留物，在真空中在硅胶上浓缩，通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色固体的#13(11.50g,77％)。LC-MS:m/z279.4[M-H⁺],225.2[(M-2-甲基丙-1-烯)+H⁺],181.2[(M-Boc)+H⁺]；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物,主要的旋转异构体:δ9.60(br s,1H),9.19(br s,1H),7.23-7.32(m,5H),6.82(d,J＝8.8Hz,1H),4.44(ddd,J＝9.4,9.1,4.4Hz,1H),3.00(dd,J＝13.7,4.5Hz,1H),2.79(dd,J＝13.6,9.9Hz,1H),1.29(s,9H)。

步骤3.合成[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨甲酸叔丁酯(#14)。将溴乙醛缩二乙醇(8.76mL,58.2mmol,2.89当量)与4M盐酸/二噁烷(2滴)加入#13(5.65g,20.2mmol,1当量)在丙酮(101mL,0.2M)的混合物中。用氮气使混合物除气三次，然后加热到回流。2小时后，冷却反应混合物到室温，真空浓缩。用乙酸乙酯溶解残留物，用饱和碳酸氢钠水溶液清洗并用盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩。用乙酸乙酯稀释所得粗制的橙色油，然后在真空中在硅胶上浓缩，通过硅胶色谱法(梯度：0％到35％乙酸乙酯/庚烷)纯化，然后通过反相色谱法纯化(方法A)，得到#14(625mg,10％)；HPLC(方案E):m/z304.5[M+H⁺],248.9[(M-2-甲基丙-1-烯)+H⁺],保留时间＝7.416分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物,主要的旋转异构体:δ7.75(d,J＝3.3Hz,1H),7.75(br d,J＝8.6Hz,1H),7.61(br d,J＝3.1Hz,1H),7.25-7.30(m,5H),4.99(ddd,J＝10.5,8.9,4.5Hz,1H),3.29-3.36(m,1H,推测；部份被水信号遮蔽),2.98(dd,J＝13.8,10.6Hz,1H),1.31(s,9H)。

步骤4.合成(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙胺盐酸盐(#15)。按照通用操作C，由#14(1.010g,3.318mmol,1当量)、二噁烷(10mL,0.33M)与4M盐酸的二噁烷溶液(20mL,80mmol,20当量)合成#15(775mg,97％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.95-9.07(br m,3H),7.86(d,J＝3.2Hz,1H),7.73(d,J＝3.2Hz,1H),7.18-7.28(m,3H),7.10-7.15(m,2H),4.98-5.07(m,1H),3.49(dd,J＝13.3,4.9Hz,1H),3.18(dd,J＝13.4,10.2Hz,1H)。

步骤5.合成(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(#16)。在0℃下先加入氰基磷酸二乙酯(diethylphosphoryl cyanide，DEPC)(93％纯度,212μL,1.30mmol,1.34当量)然后加入三乙胺(367μL,2.63mmol,2.7当量)到#11(280mg,0.974mmol,1当量)与#15(460mg,1.44mmol,1.48当量)的N,N-二甲基甲酰胺(3mL,0.32M)溶液中。在0℃经过2小时后，使反应混合物加热到室温达18小时。然后用乙酸乙酯：甲苯(2:1,30mL)稀释反应混合物，依序用1M硫酸氢钠水溶液(35mL)与50％饱和碳酸氢钠水溶液(4x25mL)清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩，通过硅胶色谱法(12％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为浅琥珀色油的#16(374mg,81％)。LC-MS:m/z474.4[M+H⁺],374.4[(M-2-甲基丙-1-烯)+H⁺]保留时间＝3.63分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),特征信号:δ8.66(d,J＝8.5Hz,1H),7.78(d,J＝3.3Hz,1H),7.64(d,J＝3.3Hz,1H),7.21-7.31(m,4H),7.14-7.20(m,1H),5.40(ddd,J＝11.4,8.5,4.0Hz,1H),3.23(br s,3H),2.18(dq,J＝9.7,6.7Hz,1H),1.06(d,J＝6.6Hz,3H)。

步骤6A.合成(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(#17)。使#16(350mg,0.739mmol,1当量)与2,4-双(4-甲氧基苯基)-1,3,2,4-二硫杂二磷杂环丁烷-2,4-二硫酮(Lawesson试剂)(324mg,0.776mmol,1.05当量)在甲苯(6mL,0.1M)中的混合物加热到100℃。10分钟后，冷却混合物到室温。过滤除去不溶物，真空浓缩滤液。通过硅胶色谱法(梯度：12％到80％乙酸乙酯/庚烷)纯化残留物，然后通过反相色谱法纯化(方法E2)，得到#17(120mg,33％)；HPLC(方案J):m/z490.2[M+H⁺],保留时间＝10.069分钟；[α]²⁰ _D–110(c0.24,MeOH)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD),特征信号:δ7.78(d,J＝3.3Hz,1H),7.51(d,J＝3.3Hz,1H),7.32-7.37(m,2H),7.24-7.30(m,2H),7.17-7.23(m,1H),6.52-6.61(br m,1H),3.62(br dd,J＝15,4Hz,1H),3.37(s,3H),2.98-3.09(br m,1H),2.53-2.64(br m,1H),1.60-1.78(m,2H),1.49(s,9H),1.27(d,J＝6.5Hz,3H)。

步骤6B.合成(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙烷硫代酰胺三氟乙酸盐(#18)。按照通用操作B，由#17(198mg,0.404mmol,1当量)、二氯甲烷(6mL,0.07M)与三氟乙酸(2mL)合成#18(185mg,91％)，其不经进一步纯化就被使用。LC-MS:m/z390.1[M+H⁺],保留时间＝0.57分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.91(d,J＝8.2Hz,1H),9.07-9.20(br m,1H),7.86-8.00(br m,1H),7.83(d,J＝3.2Hz,1H),7.69(d,J＝3.3Hz,1H),7.27-7.36(m,4H),7.21-7.26(m,1H),6.33(ddd,J＝11.3,8.3,4.4Hz,1H),3.76-3.82(m,1H),3.56(dd,J＝14.6,4.3Hz,1H),3.45(s,3H),3.28(dd,J＝14.6,11.3Hz,1H),3.02-3.12(br m,1H),2.89-3.00(br m,1H),2.72-2.89(m,2H),1.69-1.83(br m,1H),1.43-1.58(m,2H),1.20-1.33(m,1H),1.22(d,J＝6.6Hz,3H)。

步骤7.合成(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸盐(#19)。按照通用操作B，由#16(607mg,1.28mmol,1当量)、二氯甲烷(10mL,0.13M)与三氟乙酸(2mL)合成#19(640mg,定量)，其不经进一步纯化即用于下一步。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.96-9.07(br m,1H),8.89(d,J＝8.8Hz,1H),7.87-8.00(br m,1H),7.80(d,J＝3.2Hz,1H),7.66(d,J＝3.3Hz,1H),7.28-7.34(m,4H),7.20-7.27(m,1H),5.43(ddd,J＝11.3,8.6,4.2Hz,1H),3.42-3.50(m,2H),3.36(s,3H),3.04-3.14(br m,1H),2.99(dd,J＝14.2,11.5Hz,1H),2.92-3.02(m,1H),2.78-2.88(br m,1H),2.34-2.42(m,1H),1.73-1.84(br m,1H),1.55-1.68(m,1H),1.38-1.53(m,2H),1.15(d,J＝6.9Hz,3H)。

制备(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-(2-苯乙基)-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙烷硫代酰胺盐酸盐(#23)和(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-(2-苯乙基)-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺盐酸盐(#24)

步骤1A.合成(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(#20)。将二异丙基乙胺(26.9mL,153mmol,2当量)、2-苯乙胺(11.6mL,91.9mmol,1.2当量)与HATU(39.0g,99.5mmol,1.3当量)加入#11(22g,77mmol,1当量)在二氯甲烷(383mL,0.2M)和N,N-二甲基甲酰胺(30mL)的混合物中。搅拌反应混合物18小时，然后真空浓缩。将残留物置于乙酸乙酯(700mL)中，依序用1M盐酸(2x200mL)与盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩。将粗制品置于二氯甲烷中并过滤。通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化滤液，得到作为灰白色固体的#20(24g,80％)。LC-MS:m/z392.2[M+2H⁺],291.1[(M-Boc)+H⁺],保留时间＝0.88分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物:δ7.80-7.89(br m,1H),7.23-7.29(m,2H),7.15-7.23(m,3H),3.72-3.82与3.55-3.62(2br m,共1H),3.45-3.55(br m,1H),3.31-3.44(br m,2H),3.29(s,3H),3.12-3.25(br m,1H),2.98-3.12(br m,1H),2.71(t,J＝7.1Hz,2H),2.09-2.19(m,1H),1.71-1.83(br m,2H),1.60-1.70(br m,1H),1.49-1.60(br m,1H),1.41(s,9H),1.03(d,J＝6.8Hz,3H)。

步骤1B.合成二吡啶鎓-1-基五硫二膦酸盐(#21)。在80℃下将五硫化二磷(4.45g,2.19mL,20mmol,1当量)加入吡啶(56mL,0.36M)中，在回流(115℃)下加热混合物1小时。冷却混合物到室温，通过过滤收集产物得到作为黄色固体的#21(4.57g,60％)；mp:165-167℃(分解)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.78-8.84(m,4H),8.22-8.30(m,2H),7.76-7.83(m,4H)。

步骤2A.合成(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-[(2-苯乙基)氨基]-3-硫代丙基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(#22)。在100℃下用微波照射#20(1.200g,3.073mmol,1当量)与#21(1.40g,3.69mmol,1.2当量)在乙腈(15mL,0.20M)中的混合物30分钟。然后冷却反应混合物到室温，用乙酸乙酯(150mL)稀释，依序用0.5M盐酸(100mL)与盐水(2x50mL)清洗。在硫酸镁上干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：20％到80％乙酸乙酯/庚烷)纯化残留物，得到作为白色蜡状固体的#22(670mg,54％)；mp:107-109℃；LC-MS:m/z407.4[M+H⁺],351.3[(M-2-甲基丙-1-烯)+H⁺],307.3[(M-Boc)+H⁺],保留时间＝0.99分钟；¹H NMR(400MHz,CD₃CN),推测是一种旋转异构体混合物:δ8.28(br s,1H),7.19-7.33(m,5H),3.81-4.05(br m,2H),3.60-3.81(br m,2H),3.38-3.51(br m,1H),3.36(s,3H),3.02-3.17(br m,1H),2.89-3.02(m,2H),2.50-2.62(br m,1H),1.71-1.85(br m,2H),1.53-1.66(brm,2H),1.45(br s,9H),1.23(d,J＝6.7Hz,3H)。

步骤3.合成(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-(2-苯乙基)-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙烷硫代酰胺盐酸盐(#23)。按照通用操作C，由#22(325mg,0.799mmol,1当量)、二噁烷(5mL,0.2M)与4M盐酸的二噁烷溶液(4mL,16mmol,20当量)合成作为白色泡沫的#23(274mg,定量)；LC-MS:308.2[M+H⁺],保留时间＝0.55分钟。

步骤2B.合成(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-(2-苯乙基)-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺盐酸盐(#24)。将4M盐酸的二噁烷溶液(20mL,80mmol,4.4当量)加入#20(7.00g,17.9mmol,1当量)在二噁烷(50mL,0.36M)和甲醇(2mL)中的混合物中。搅拌18小时后，浓缩混合物，得到作为胶的#24(5.86g,定量)，其不经进一步纯化就被使用；LC-MS:292.2[M+H⁺],保留时间＝0.47分钟。

制备N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#26)

步骤1.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#25)

按照通用操作D，由#8(480mg,0.753mmol,1当量)、二氯甲烷(10mL,0.07M)、N,N-二甲基甲酰胺(2mL)、胺#18(401mg,0.941mmol,1.25当量)、HATU(372mg,0.979mmol,1.3当量)与三乙胺(367μL,2.64mmol,3.5当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到30％丙酮/庚烷)纯化，得到作为固体的#25(711mg,75％)。LC-MS:m/z1009.7[M+H⁺],保留时间＝1.15分钟；HPLC(方案B):m/z505.3[M+2H⁺]/2,保留时间＝10.138分钟；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.54(br d,J＝8Hz)与10.81(brd,J＝8Hz),共1H],7.89(br d,J＝7Hz,2H),[7.80(d,J＝3.3Hz)与7.83(d,J＝3.2Hz),共1H],[7.64(d,J＝3.2Hz)与7.69(d,J＝3.2Hz),共1H],7.62(br d,J＝7Hz,2H),7.37-7.44(m,2H),7.28-7.35(m,4H),7.20-7.27(m,2H),7.12-7.18(m,1H),6.27-6.35与6.40-6.48(2m,共1H),[1.14(d,J＝6.4Hz)与1.17(d,J＝6.3Hz),共3H]。

步骤2.合成N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#26)。按照通用操作A，由#25(701mg,0.694mmol)在二氯甲烷(10mL,0.07M)与二乙胺(10mL)中合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到玻璃状固体。加入乙醚与庚烷，真空浓缩混合物，得到作为白色固体的#26(501mg,92％)。HPLC(方案A):m/z787.4[M+H⁺],保留时间＝7.229分钟,(纯度>97％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.54(br d,J＝8Hz)与10.81(br d,J＝8.Hz),共1H],[7.99(br d,J＝9Hz)与8.00(br d,J＝9Hz),共1H],[7.80(d,J＝3.3Hz)与7.83(d,J＝3.3Hz),共1H],[7.65(d,J＝3.2Hz)与7.69(d,J＝3.3Hz),共1H],7.29-7.34(m,2H),7.19-7.28(m,2H),7.13-7.19(m,1H),[6.31(ddd,J＝11,8,4.5Hz)与6.45(ddd,J＝11.5,8,4.5Hz),共1H],[4.57(dd,J＝8.9,8.7Hz)与4.63(dd,J＝8.7,8.7Hz),共1H],3.16,3.21,3.24与3.25(4s,共6H),2.96与3.03(2br s,共3H),[1.14(d,J＝6.6Hz)与1.17(d,J＝6.4Hz),共3H]。

制备N²-[(1-氨基环戊基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#30)

步骤1.合成(3R,4S,5S)-4-[{N-[(1-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}环戊基)羰基]-L-缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯(#27)。将1-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}环戊烷羧酸(309mg,0.879mmol,1.1当量)、二异丙基乙胺(281μL,1.60mmol,2当量)与HATU(376mg,0.960mmol,1.2当量)加入#6(287mg,0.801mmol,1当量)/二氯甲烷(4mL,0.2M)中。将混合物搅拌18小时，用乙酸乙酯(15mL)稀释。用1M盐酸(2x5mL)清洗并用盐水(5mL)清洗反应混合物。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到60％乙酸乙酯/庚烷)纯化物质，得到作为白色泡沫的#27(502mg,91％)。LC-MS:m/z692.3[M+H⁺],714.3[M+Na⁺],636.3[(M-2-甲基丙-1-烯)+H⁺],保留时间＝1.13分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),特征信号:δ7.89(br d,J＝7.4Hz,2H),7.67-7.75(m,2H),7.60(br s,1H),7.38-7.44(m,2H),7.30-7.36(m,2H),7.21(br d,J＝8.8Hz,1H),4.44-4.59(m,2H),4.17-4.27(m,3H),3.68-3.78(br m,1H),3.21(s,3H),2.88(br s,3H),2.09-2.20(m,2H),1.39(s,9H)。

步骤2.合成(3R,4S,5S)-4-[{N-[(1-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}环戊基)羰基]-L-缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸(#28)。将三氟乙酸(3mL)加入#27(500mg,0.723mmol)的二氯甲烷(7mL,0.1M)溶液中。反应混合物最初变成橙色，然后随时间推移变成黑色。搅拌18小时后，真空除去溶剂，得到作为深棕色玻璃的#28(460mg,定量)，其不经进一步纯化就被使用。LC-MS:m/z636.3[M+H⁺]。

步骤3.合成N²-[(1-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}环戊基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#29)。按照通用操作D，由#28(50mg,0.079mmol,1当量)、二氯甲烷(3mL,0.03M)、N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)、胺#18(44mg,0.087mmol,1.1当量)、三乙胺(33.0μL,0.237mmol,3当量)与HATU(36mg,0.95mmol,1.2当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到30％丙酮/庚烷)纯化，得到作为固体的#29(59mg,67％)。LC-MS:m/z1007.5[M+H⁺],保留时间＝1.11分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.54(br d,J＝8Hz)与10.80(brd,J＝8Hz),共1H],7.89(br d,J＝7Hz,2H),[7.80(d,J＝3.3Hz)与7.82(d,J＝3.1Hz),共1H],7.68-7.75(m,2H),[7.64(d,J＝3.2Hz)与7.68(d,J＝3.2Hz),共1H],7.38-7.44(m,2H),7.27-7.36(m,4H),7.12-7.25(m,4H),[6.30(ddd,J＝11,8,4.5Hz)与6.39-6.48(m),共1H],[4.50(br dd,J＝8,8Hz)与4.54-4.59(m),共1H],4.17-4.29(m,3H),2.89与2.96(2br s,共3H),[1.13(d,J＝6.5Hz)与1.16(d,J＝6.4Hz),共3H]。

步骤4.合成N²-[(1-氨基环戊基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#30)。按照通用操作A，由#29(54mg,0.054mmol)在二氯甲烷(6mL,0.9mM)与二乙胺(4mL)中合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到作为固体的实施例#30(26mg,61％)。HPLC(方案A):保留时间＝7.233分钟,m/z785.4[M+H⁺],(纯度>72％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是一种旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.54(br d,J＝8Hz)与10.82(br d,J＝8Hz),共1H],8.19-8.27(m,1H),[7.80(d,J＝3.2Hz)与7.83(d,J＝3.2Hz),共1H],[7.65(d,J＝3.3Hz)与7.69(d,J＝3.3Hz),共1H],7.28-7.33(m,2H),7.20-7.27(m,2H),7.14-7.19(m,1H),[6.31(ddd,J＝11,8,4.5Hz)与6.44(ddd,J＝11,8,4Hz),共1H],[4.53(dd,J＝9,8Hz)与4.60(dd,J＝9,7.5Hz),共1H],3.24与3.25(2s,共3H),3.17与3.21(2s,共3H),2.93与3.00(2br s,共3H),[1.14(d,J＝6.5Hz)与1.17(d,J＝6.5Hz),共3H]。

制备2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#34)

步骤1.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-叔丁氧基-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#31)。将N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酸(1.99g,6.12mmol,1当量)、二异丙基乙胺(2.67mL,15.3mmol,2.5当量)与HATU(2.79g,7.35mmol,1.2当量)加入#6(70％纯度,3.13g,6.1mmol,1当量)的二氯甲烷(40mL,0.15M)溶液中。将反应混合物搅拌18小时，用乙酸乙酯稀释，用1M盐酸清洗并用盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，在真空中在硅胶上浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到45％乙酸乙酯/庚烷)纯化物质，得到固体#31(3.65g,90％)。LC-MS:m/z665.5[M+H⁺],688.5[M+Na⁺],610.5[(M-2-甲基丙-1-烯)+H⁺]；HPLC(方案C):保留时间＝9.455(纯度>94％)；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),特征信号:δ7.89(d,J＝7.4Hz,2H),7.67-7.74(m,2H),7.39-7.48(m,3H),7.31-7.36(m,2H),7.29(br d,J＝8.8Hz,1H),4.47-4.60(br m,1H),4.47(dd,J＝8.6,8.0Hz,1H),4.18-4.28(m,3H),3.69-3.79(br m,1H),3.21(s,3H),2.88(br s,3H),2.15(dd,J＝15.5,9.3Hz,1H),1.91-2.01(m,1H),1.67-1.81(br m,1H),1.39(s,9H),1.36(br s,3H),1.30(s,3H),0.75(d,J＝6.6Hz,3H),0.66-0.73(br m,3H)。

步骤2.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(2R,3S,4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#32)。按照通用操作B，由#31(500mg,0.751mmol)在二氯甲烷(7mL,0.1M)与三氟乙酸(3mL)中合成作为玻璃的#32(458mg,定量)，其不经进一步纯化即用于下一步。LC-MS:m/z611.4[M+2H⁺],632.2[M+Na⁺],保留时间＝0.94分钟。

步骤3.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#33)。按照通用操作D，由#32(53.0mg,≤0.083mmol,1当量)、二氯甲烷(4mL,0.02M)、N,N-二甲基甲酰胺(1mL)、胺#18(43.8mg,0.0870mmol,1当量)、三乙胺(36μL,0.26mmol,3当量)与HATU(39.5mg,0.104mmol,1.2当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到30％丙酮/庚烷)纯化，得到#33(60mg,二步共69％)。LC-MS:m/z981.4[M+H⁺],保留时间＝1.090分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),其被推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.54(br d,J＝8Hz)与10.80(brd,J＝8Hz),共1H],7.86-7.91(m,2H),[7.80(d,J＝3.3Hz)与7.82(d,J＝3.3Hz),共1H],7.68-7.74(m,2H),[7.64(d,J＝3.2Hz)与7.68(d,J＝3.3Hz),共1H],7.38-7.44(m,2H),7.20-7.36(m,6H),7.12-7.17(m,1H),6.27-6.34与6.40-6.47(2m,共1H),3.22与3.24(2s,共3H),3.14与3.18(2s,共3H),2.90与2.97(2br s,共3H),1.37(brs,3H),1.31(2br s,共3H),[1.13(d,J＝6.6Hz)与1.16(d,J＝6.5Hz),共3H]。

步骤4.合成2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#34)。按照通用操作A，由#33(55mg,0.055mmol,1当量)在二氯甲烷(6mL,0.009M)与二乙胺(4mL)中合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到5％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到作为固体的#34(25mg,60％)。HPLC(方案A):m/z759.4[M+H⁺],保留时间＝7.088分钟,(纯度>75％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.54(br d,J＝8Hz)与10.81(br d,J＝8Hz),共1H],8.01-8.08(m,1H),[7.80(d,J＝3.1Hz)与7.83(d,J＝3.3Hz),共1H],[7.65(d,J＝3.2Hz)与7.69(d,J＝3.2Hz),共1H],7.29-7.33(m,2H),7.20-7.27(m,2H),7.13-7.19(m,1H),6.27-6.35与6.40-6.48(2m,共1H),[4.49(dd,J＝9,8Hz)与4.56(dd,J＝9,8Hz),共1H],3.24与3.25(2s,共3H),3.17与3.21(2s,共3H),2.92与2.99(2br s,共3H),1.20与1.21(2s,共3H),1.12与1.13(2s,共3H),0.75-0.81(m,3H)。

制备N-甲基-L-缬氨酰基-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-[(2-苯乙基)氨基]-3-硫代丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#36)

步骤1.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-[(2-苯乙基)氨基]-3-硫代丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#35)。将#8(564mg,0.885mmol,0.9当量)、二异丙基乙胺(383mg,2.95mmol,3当量)与HATU(472mg,1.18mmol,1.2当量)加入#23(337mg,0.983mmol,1当量)在二氯甲烷(8mL,0.1M)与N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中的混合物中。2小时后，用二氯甲烷稀释混合物，依序用0.1M盐酸与盐水清洗，在硫酸镁上干燥，过滤，真空浓缩。通过反相色谱法纯化残留物(方法G)，得到#35(600mg,66％)；LC-MS:m/z926.6[M+H⁺],保留时间＝1.16分钟；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[9.94(br t,J＝5Hz)与10.16-10.23(br m),共1H],7.90(d,J＝7.2Hz,2H),[7.71(br d,J＝7Hz)与8.06(br d,J＝8Hz),共1H],7.60-7.65(m,2H),7.41(brdd,J＝7,7Hz,2H),7.15-7.36(m,7H),3.29(s,3H),1.16-1.22(m,3H)。

步骤2.合成N-甲基-L-缬氨酰基-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-[(2-苯乙基)氨基]-3-硫代丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#36)。按照通用操作A，由#35(465mg,0.502mmol,1当量)在二氯甲烷(5mL,0.1M)与二乙胺(5mL)中合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到作为固体的#36(310mg,88％)。LC-MS:m/z704.6[M+H⁺],保留时间＝0.74分钟；HRMS:m/z计算值C₃₈H₆₆N₅O₅S:704.4779,实测值:704.477[M+H⁺]；¹H NMR(400MHz,CD₃OD),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ7.23-7.30(m,4H),7.15-7.22(m,1H),[4.68(d,J＝8.6Hz)与4.74(d,J＝8.0Hz),共1H],3.39与3.40(2s,共3H),3.12与3.22(2br s,共3H),[2.82(d,J＝6.0Hz)与2.84(d,J＝6.0Hz),共1H],2.29与2.30(2s,共3H),[1.27(d,J＝6.8Hz)与1.29(d,J＝6.6Hz),共3H],[0.84(t,J＝7.4Hz)与0.87(t,J＝7.4Hz),共3H]。

制备N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#41)和N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#42)

步骤1.合成N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯(#37)。将二异丙基乙胺(3.30mL,18.8mmol,2当量)、L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(2.03g,9.40mmol,1.2当量)与HATU(4.79g,12.2mmol,1.3当量)加入#11(2.7g,9.4mmol,1当量)在二氯甲烷(30mL,0.3M)与N,N-二甲基甲酰胺(3mL)的混合物中。将反应混合物搅拌18小时，然后真空浓缩。将残留物置于乙酸乙酯(100mL)中，依序用1M盐酸(2x50mL)与盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，在真空中蒸发。将粗制物置于二氯甲烷中并过滤。通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化滤液，得到作为灰白色固体的#37(2.76g,65％)。LC-MS:m/z449.3[M+H⁺],349.2[(M-Boc)+H⁺]保留时间＝0.88分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ8.28(d,J＝8.2Hz,1H),7.14-7.29(m,5H),4.50(ddd,J＝10.9,8.1,4.4Hz,1H),3.64(s,3H),3.23(s,3H),2.15-2.24(m,1H),1.56-1.76(m,2H),1.31-1.55(m,11H),1.02(d,J＝6.6Hz,3H)。

步骤2.合成N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙烷亚硫酰基}-L-苯丙氨酸甲酯(#38)。在100℃下微波照射#37(1.52g,3.39mmol,1当量)、#21(1.68g,4.41mmol,1.3当量)在乙腈(12mL,0.28M)中的混合物1小时。用水与乙酸乙酯萃取使混合物分离。用乙酸乙酯反萃取水层。用10％柠檬酸与用盐水清洗合并的有机层，在硫酸钠上干燥，过滤，真空浓缩。用少量乙酸乙酯溶解粗制物，在真空中在硅胶上浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到30％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到#38(680mg,43％)；LC-MS:m/z465.2[M+H⁺],487.3[M+Na⁺],365.2[(M-Boc)+H⁺],保留时间＝0.97分钟；HPLC(方案B):465.2[M+H⁺],487.2[M+Na⁺],365.2[(M-Boc)+H⁺],保留时间＝7.444分钟(纯度>98％)；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ10.23(br d,J＝7.5Hz,1H),7.17-7.28(m,5H),5.24(ddd,J＝11,7.5,4.5Hz,1H),3.66(s,3H),3.28(s,3H),3.21(dd,J＝14.3,4.4Hz,1H),3.07(dd,J＝14.2,11.2Hz,1H),2.65-2.74(m,1H),1.54-1.71(m,2H),1.37(s,9H),1.17(d,J＝6.4Hz,3H)。

步骤3.合成N-{(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙烷亚硫酰基}-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(#39)。按照通用操作C，在0℃由#38(660mg,1.42mmol,1当量)、二噁烷(10mL,0.14M)与4M盐酸的二噁烷溶液(20mL,80mmol,60当量)合成作为灰白色固体的#39(590mg)，其不经进一步纯化即用于下一步。LC-MS:m/z365.2[M+H⁺],保留时间＝0.58分钟；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.67(d,J＝7.7Hz,1H),9.42-9.54(br m,1H),8.21-8.33(br m,1H),7.20-7.35(m,5H),5.25(ddd,J＝11.1,7.6,4.4Hz,1H),3.76(dd,J＝8.9,3.0Hz,1H),3.68(s,3H),3.39(s,3H),3.24(dd,J＝14.2,4.5Hz,1H),3.13(dd,J＝14.3,11.0Hz,1H),2.93-3.09(m,3H),2.85-2.93(m,1H),1.72-1.84(m,1H),1.36-1.60(m,3H),1.22(d,J＝6.6Hz,3H)。

步骤4.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#40)。按照通用操作D，由#8(247mg,0.387mmol,1当量)、#39(186mg,≤0.450mmol,1.2当量)、二氯甲烷(10mL,0.04M)、N,N-二甲基甲酰胺(2mL)、HATU(176mg,0.464mmol,1.2当量)与三乙胺(189μL,1.35mmol,3.5当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到25％丙酮/庚烷)纯化，得到作为灰白色固体的#40(410mg,二步共90％)。LC-MS:m/z984.7[M+H⁺],1006.7[M+Na⁺],保留时间＝1.15分钟；HPLC(方案C):保留时间＝9.683分钟(纯度>99％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.19(br d,J＝7Hz)与10.49(br d,J＝8Hz),共1H],7.90(d,J＝7.5Hz,2H),7.60-7.65(m,2H),7.38-7.45(m,2H),7.29-7.35(m,2H),7.14-7.28(m,5H),[5.20(ddd,J＝11,7,4Hz)与5.35-5.43(m),共1H],3.65与3.69(2s,共3H),[1.15(d,J＝6.5Hz)与1.18(d,J＝6.4Hz),共3H]。

步骤5A.合成N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#41)。将氢氧化锂(24.4mg,1.02mmol,2.5当量)的水(5mL)溶液加入#40(401mg,0.407mmol,1当量)的四氢呋喃(10mL,0.03M)溶液中。4小时后，真空浓缩反应混合物，然后和庚烷共沸三次。用二甲亚砜(7mL)溶解粗制物，通过反相色谱法纯化(方法C，1mL的7次注入)。将合适的流份浓缩(Genevac)，然后用少量甲醇/二氯甲烷稀释。真空浓缩混合物成玻璃状固体。然后加入乙醚，然后加入庚烷，真空浓缩混合物，得到作为白色固体的#41(180mg,59％)。LC-MS:m/z748.6[M+H⁺],保留时间＝0.68分钟；HPLC(方案A):748.4[M+H⁺],保留时间＝6.922分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ12.9与13.1(2v br s,共1H),[10.12(br d,J＝8Hz)与10.45(br d,J＝8Hz),共1H],8.75-8.90(m,2H),8.62-8.73(br m,1H),7.13-7.29(m,5H),[5.20(ddd,J＝11,7.5,4Hz)与5.40(ddd,J＝11.5,8,4Hz),共1H],4.55-4.73(m,2H),3.23与3.25(2s,共3H),3.16与3.18(2s,共3H),2.97与3.01(2br s,共3H),1.13-1.20(m,3H),0.73-0.81(m,3H)。

步骤5B.合成N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#42)。按照通用操作A，由#40(561mg,0.570mmol,1当量)、二氯甲烷(10mL,0.057M)与二乙胺(10mL)合成，通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到作为白色固体的#42(348mg,80％)。LC-MS:m/z762.7[M+H⁺],保留时间＝0.74分钟；HPLC(方案A):762.4[M+H⁺],保留时间＝7.315分钟(纯度>95％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.20(brd,J＝7.5Hz)与10.50(br d,J＝8Hz),共1H],7.95-8.03(m,1H),7.15-7.29(m,5H),[5.20(ddd,J＝11,7.5,5Hz)与5.39(ddd,J＝11,7.5,4Hz,共1H),[4.57(dd,J＝8.8,8.7Hz)与4.61(dd,J＝8.7,8.6Hz),共1H],3.65与3.69(2s,共3H),3.24与3.25(2s,共3H),3.16与3.17(2s,共3H),2.96与2.99(2br s,共3H),2.69-2.79(m,1H),2.62-2.68(m,1H),2.14与2.15(2br s,共3H),[1.15(d,J＝6.6Hz)与1.18(d,J＝6.5Hz),共3H],[0.75(t,J＝7.4Hz)与0.76(t,J＝7.3Hz),共3H]。

制备2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺盐酸盐(#44)和2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺盐酸盐(#45)

步骤1.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#43)。将#39(484mg,≤0.769mmol,0.9当量)、HATU(353mg,0.881mmol,1当量)与二异丙基乙胺(463μL,2.64mmol,3当量)加入#32(321mg,0.881mmol,1当量)的二氯甲烷(5mL,0.1M)与N,N-二甲基甲酰胺(1mL)溶液中。搅拌18小时，然后用二氯甲烷稀释混合物，用水与盐水清洗，在硫酸镁上干燥，过滤，在真空中在硅胶上浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到30％丙酮/庚烷)纯化残留物，得到作为白色固体的#43(574mg,二步共68％)。LC-MS:m/z956.6[M+H⁺],保留时间＝4.49分钟；¹HNMR(400MHz,CD₃OD),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ7.80(d,J＝7.5Hz,2H),7.64-7.72(m,2H),7.16-7.35(m,7H),[5.43(dd,J＝11,4.5Hz)与5.58(dd,J＝11.5,4Hz),共1H],3.72与3.75(2s,共3H),3.34与3.35(2s,共3H),3.26与3.29(2s,共3H),3.05与3.11(2br s,共3H),1.39与1.40(2s,共3H),[1.24(d,J＝6.7Hz)与1.29(d,J＝6.4Hz),共3H]。

步骤2A.合成2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺盐酸盐(#44)。将氢氧化锂(10mg,0.417mmol,3当量)的水(3mL)溶液加入#43(100mg,0.105mmol,1当量)的四氢呋喃(5mL,0.02M)溶液中。3小时后，真空浓缩反应混合物，通过反相色谱法纯化(方法C)，得到三氟乙酸盐，用甲醇溶解，用4M盐酸的二噁烷溶液处理，真空浓缩，得到作为白色固体的#44(56mg,71％)。LC-MS:m/z720.6[M+H⁺],保留时间＝0.67分钟；HPLC(方案D):保留时间＝8.851分钟；¹H NMR(400MHz,CD₃OD),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ7.17-7.31(m,5H),3.34与3.35(2s,共3H),3.10与3.16(2br s,共3H),1.62与1.64(2s,共3H),1.53与1.55(2s,共3H),[1.26(d,J＝6.5Hz)与1.30(d,J＝6.5Hz),共3H],0.84-0.91(m,3H)。

步骤2B.合成2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺盐酸盐(#45)。按照通用操作A，由#43(176mg,0.184mmol,1当量)、二氯甲烷(4mL,0.05M)与二乙胺(4mL)合成粗制的期望物质，通过反相色谱法纯化(方法C)。用甲醇溶解所得三氟乙酸盐，用4M盐酸的二噁烷溶液处理，真空浓缩，得到作为白色固体的#45(100mg,70％)。LC-MS:m/z734.6[M+H⁺],保留时间＝0.72分钟；¹H NMR(400MHz,CD₃OD),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ7.18-7.31(m,5H),5.41-5.47与5.55-5.62(2m,共1H),3.73与3.76(2s,共3H),3.35与3.36(2s,共3H),3.10与3.15(2br s,共3H),1.62与1.64(2s,共3H),1.53与1.55(2s,共3H),[1.25(d,J＝6.6Hz)与1.29(d,J＝6.5Hz),共3H],0.84-0.91(m,3H)。

制备N²-[(1-氨基环戊基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#47)

步骤1.合成N²-[(1-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}环戊基)-羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#46)。将#28(600mg,0.944mmol,0.9当量)、二异丙基乙胺(498μL,2.83mmol,3当量)与HATU(444mg,1.13mmol,1.2当量)加入#19(353mg,0.944mmol,1当量)的二氯甲烷(10mL,0.094M)溶液中。搅拌2日后，真空浓缩混合物，用乙酸乙酯(60mL)稀释残留物，用1M盐酸与盐水清洗，在硫酸钠上干燥，过滤，真空浓缩。用二氯甲烷稀释残留物并过滤。在减压下在硅胶上浓缩滤液，通过硅胶色谱法(梯度：40％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色固体的#46(644mg,69％)。LC-MS:m/z991.8[M+H⁺],保留时间＝1.07分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ7.89(br d,J＝7.4Hz,2H),[7.77(d,J＝3.3Hz)与7.79(d,J＝3.3Hz),共1H],7.66-7.76(m,2H),[7.62(d,J＝3.3Hz)与7.65(d,J＝3.3Hz),共1H],7.37-7.44(m,2H),7.11-7.36(m,7H),[5.38(ddd,J＝11,8,4Hz)与5.48-5.57(m),共1H],3.13,3.17,3.18与3.24(4s,共6H),2.90与3.00(2br s,共3H),[1.05(d,J＝6.6Hz)与1.09(d,J＝6.8Hz),共3H]。

步骤2.合成N²-[(1-氨基环戊基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#47)。将二乙胺(4mL)加入#46(500mg,0.504mmol,1当量)在四氢呋喃(8mL,0.06M)中的混合物中。搅拌18小时后，真空浓缩反应混合物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化残留物，得到作为白色固体的#47(374mg,96％)。LC-MS:m/z769.6[M+H⁺],保留时间＝0.70分钟；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[8.64(br d,J＝8.4Hz)与8.87(br d,J＝8.6Hz),共1H],[8.22(br d,J＝9.4Hz)与8.26(br d,J＝9.4Hz),共1H],[7.77(d,J＝3.3Hz)与7.80(d,J＝3.3Hz),共1H],[7.63(d,J＝3.1Hz)与7.66(d,J＝3.3Hz),共1H],7.13-7.31(m,5H),[5.39(ddd,J＝11.1,8.5,4.2Hz)与5.54(ddd,J＝11.7,8.8,4.1Hz),共1H],[4.53(dd,J＝9.2,7.6Hz)与4.64(dd,J＝9.2,6.6Hz),共1H],3.16,3.20,3.21与3.25(4s,共6H),2.93与3.03(2br s,共3H),[1.05(d,J＝6.8Hz)与1.10(d,J＝6.6Hz),共3H],0.73-0.80(m,3H)。

制备N²-[(1-氨基环丙基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#51)和1-氨基-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]环己基甲酰胺(#52)

步骤1.合成(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸盐和(3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸(#48)。在0℃下将三氟乙酸(6mL)加入#16(1.0g,2.11mmol,1当量)与#5(1.22g,2.11mmol,1当量)的二氯甲烷(20mL,0.1M)溶液中。3小时后，真空浓缩混合物，得到混合物#48(1.8g)，其不经进一步纯化即用于下一步；LC-MS(方案K):m/z374.2[M+H⁺],保留时间＝2.093分钟,525.2[M+H⁺],保留时间＝4.875分钟。

步骤2.合成N²-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#49)。在0℃下将三乙胺(1.47mL,10.6mmol,5当量)加入#48(1.8g,≤2.1mmol,1当量)与氰基磷酸二乙酯(DEPC)(0.51g,3.2mmol,1.5当量)的1,2-二甲氧基乙烷(30mL,0.07M)溶液中。在室温搅拌2小时后，真空浓缩混合物，通过硅胶色谱法(10％到50％乙酸乙酯/石油醚)纯化残留物，得到#49(0.8g,45％)。R_f0.6(10％甲醇/二氯甲烷)；LC-MS(方案K):m/z881.3[M+H⁺],903.3[M+Na⁺],保留时间＝4.837分钟。

步骤3.合成N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#50)。按照通用操作A，由#49(0.70g,0.79mmol,1当量)、二氯甲烷(15mL,0.05M)与二乙胺(10mL)合成，通过硅胶色谱法(梯度：0％到5％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到#50(160mg,30％)。R_f0.4(10％甲醇/二氯甲烷)；LC-MS(方案K):m/z658.3[M+H⁺],680.3[M+Na⁺],保留时间＝2.760分钟。

步骤4A.合成N²-[(1-氨基环丙基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#51)。在0℃下将1-氨基环丙烷羧酸(18mg,0.18mmol,1.2当量)加入#50(100mg,0.15mmol,1当量)、溴代三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(Brop,70mg,0.18mmol,1.2当量)与二异丙基乙胺(0.08mL,0.45mmol,3当量)的二氯甲烷(15mL,0.01M)溶液中。2小时后，用水使混合物猝灭，用乙酸乙酯萃取二次。在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到5％甲醇/二氯甲烷)纯化残留物，得到#51(45mg,34％)。R_f0.5(10％甲醇/二氯甲烷)。LC-MS(方案L):m/z741.44[M+H⁺]；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[8.64(brd,J＝8Hz)与8.88(br d,J＝8Hz),共1H],[8.16(br d,J＝9Hz)与8.22(br d,J＝10Hz),共1H],[7.77(d,J＝3.5Hz)与7.79(d,J＝3.5Hz),共1H],[7.63(d,J＝3.5Hz)与7.65(d,J＝3Hz),共1H],7.10-7.32(m,5H),5.33-5.60(m,1H),3.16,3.20,3.21与3.26(4s,共6H),2.93与3.02(2br s,共3H),[1.05(d,J＝6.3Hz)与1.10(d,J＝6.3Hz),共3H]。

步骤4B.合成1-氨基-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]环己基甲酰胺(#52)。在0℃下将1-氨基环己烷羧酸(31mg,0.21mmol,1.2当量)加入#50(120mg,0.18mmol,1当量)、Brop(84mg,0.21mmol,1.2当量)与二异丙基乙胺(0.1mL,0.54mmol,3当量)的二氯甲烷(15mL,0.009M)溶液中。2小时后，用水使混合物猝灭，用乙酸乙酯萃取二次。在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到5％甲醇/二氯甲烷)纯化残留物，得到#52(50mg,35％)。R_f0.6(10％甲醇/二氯甲烷)。LC-MS(方案K):m/z783.79[M+H⁺]；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[8.64(br d,J＝8Hz)与8.87(br d,J＝9Hz),共1H],8.18-8.28(m,1H),[7.77(d,J＝3.5Hz)与7.80(d,J＝3.3Hz),共1H],[7.63(d,J＝3.3Hz)与7.66(d,J＝3.3Hz),共1H],7.12-7.31(m,5H),5.35-5.43与5.49-5.57(2m,共1H),[4.51(dd,J＝9,8Hz),与4.61(dd,J＝9,7Hz),共1H],3.16,3.19,3.21与3.25(4s,共6H),2.93与3.02(2br s,共3H),[1.05(d,J＝6.8Hz)与1.10(d,J＝6.8Hz),共3H]。

制备2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#54)

步骤1.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#53)。按照通用操作D，由#32(2.05g,2.83mmol,1当量)、二氯甲烷(20mL,0.1M)、N,N-二甲基甲酰胺(3mL)、胺#19(2.5g,3.4mmol,1.2当量)、HATU(1.29g,3.38mmol,1.2当量)与三乙胺(1.57mL,11.3mmol,4当量)合成粗制的期望物质，由硅胶色谱法(梯度：0％到55％丙酮/庚烷)纯化，得到固体#53(2.42g,74％)。LC-MS:m/z965.7[M+H⁺],987.6[M+Na⁺],保留时间＝1.04分钟；HPLC(方案A):m/z965.4[M+H⁺],保留时间＝11.344分钟(纯度>97％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ7.86-7.91(m,2H),[7.77(d,J＝3.3Hz)与7.79(d,J＝3.2Hz),共1H],7.67-7.74(m,2H),[7.63(d,J＝3.2Hz)与7.65(d,J＝3.2Hz),共1H],7.38-7.44(m,2H),7.30-7.36(m,2H),7.11-7.30(m,5H),[5.39(ddd,J＝11.4,8.4,4.1Hz)与5.52(ddd,J＝11.7,8.8,4.2Hz),共1H],[4.49(dd,J＝8.6,7.6Hz)与4.59(dd,J＝8.6,6.8Hz),共1H],3.13,3.17,3.18与3.24(4s,共6H),2.90与3.00(2br s,共3H),1.31与1.36(2br s,共6H),[1.05(d,J＝6.7Hz)与1.09(d,J＝6.7Hz),共3H]。

步骤2.合成2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#54)。按照通用操作A，由#53(701mg,0.726mmol)在二氯甲烷(10mL,0.07M)中合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化。用乙醚与庚烷稀释残留物，真空浓缩，得到作为白色固体的#54(406mg,75％)。LC-MS:m/z743.6[M+H⁺],保留时间＝0.70分钟；HPLC(方案A):m/z743.4[M+H⁺],保留时间＝6.903分钟,(纯度>97％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[8.64(br d,J＝8.5Hz)与8.86(br d,J＝8.7Hz),共1H],[8.04(br d,J＝9.3Hz)与8.08(br d,J＝9.3Hz),共1H],[7.77(d,J＝3.3Hz)与7.80(d,J＝3.2Hz),共1H],[7.63(d,J＝3.3Hz)与7.66(d,J＝3.2Hz),共1H],7.13-7.31(m,5H),[5.39(ddd,J＝11,8.5,4Hz)与5.53(ddd,J＝12,9,4Hz),共1H],[4.49(dd,J＝9,8Hz)与4.60(dd,J＝9,7Hz),共1H],3.16,3.20,3.21与3.25(4s,共6H),2.93与3.02(2br s,共3H),1.21(s,3H),1.13与1.13(2s,共3H),[1.05(d,J＝6.7Hz)与1.10(d,J＝6.7Hz),共3H],0.73-0.80(m,3H)。

制备2-甲基丙氨酰基-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺乙酸盐(#56)

步骤1.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#55)。将#32(156mg,0.256mmol,0.9当量)、二异丙基乙胺(135μL,0.768mmol,3当量)与HATU(120mg,0.307mmol,1.2当量)加入#24(104mg,0.256mmol,1当量)的二氯甲烷(10mL,0.094M)溶液中。搅拌18小时后，真空浓缩混合物，用乙酸乙酯(10mL)稀释残留物，用1M盐酸(2x5mL)与用盐水清洗，在硫酸钠上干燥，过滤，真空浓缩。用二氯甲烷稀释残留物并过滤。在减压下在硅胶上浓缩滤液，通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色固体的#55(44mg,19％)。LC-MS:m/z884.5[M+2H⁺],保留时间＝1.04分钟。

步骤2.合成2-甲基丙氨酰基-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺乙酸盐(#56)。将二乙胺(0.5mL)加入#55(44mg,0.050mmol,1当量)在四氢呋喃(1mL,0.05M)中的混合物中。搅拌18小时后，真空浓缩反应混合物，通过反相色谱法纯化残留物(方法B)，得到作为固体的#56(16.2mg,49％)。LC-MS:m/z660.8[M+H⁺],保留时间＝2.23分钟；HPLC(方案A):m/z660.5[M+H⁺],682.4[M+Na⁺],保留时间＝6.865分钟。

制备2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1-苯基环丙基)甲基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#60)

步骤1.合成1-(1-苯基环丙基)甲胺#@1。在0℃下将氢化铝锂(23g,0.35mol,1.03当量)加入1-苯基环丙腈(50g,0.34mol,1当量)的四氢呋喃(500mL,0.7M)溶液中。在0℃下搅拌反应混合物1小时，然后在回流下搅拌1小时。然后冷却反应混合物，用水(23mL)与15％氢氧化钠水溶液(69mL)猝灭。过滤混合物，真空浓缩，得到#@1(36g,72％)。LC-MS:m/z148.1[M+H⁺],保留时间＝0.86分钟；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.2-7.4(m,5H),2.78(s,2H),1.19(br s,2H),0.72-0.84(m,4H)。

步骤2.合成(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1-苯基环丙基)甲基]氨基}丙基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(#57)。按照通用操作D，由在二氯甲烷(20mL,0.3M)和N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中的#11(2.15g,7.48mmol,1.1当量)、1-(1-苯基环丙基)甲胺#@1(1.001g,6.799mmol,1当量)、HATU(3.10g,8.16mmol,1.2当量)与三乙胺(2.84mL,20.4mmol,3当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为固体的#57(1.93g,68％)。HPLC(方案A在45℃):m/z417.3[M+H⁺],保留时间＝10.575分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物:δ7.75-7.81(m,1H),7.20-7.27(m,4H),7.12-7.19(m,1H),3.33-3.62与3.71-3.80(br多重峰,共4H),3.28(s,3H),2.97-3.17(br m,2H),2.14-2.24(m,1H),1.67-1.80(br m,2H),1.45-1.65(m,2H),1.41(s,9H),1.00(d,J＝6.6Hz,3H),0.67-0.93(m,4H)。

步骤3.合成(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(1-苯基环丙基)甲基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺盐酸盐(#58)。按照通用操作C，由#57(566mg,1.36mmol,1当量)在二噁烷(4mL,0.3M)与4M盐酸的二噁烷溶液(4mL,16mmol,11.7当量)中合成#58(466mg,97％)；LC-MS:m/z318.2[M+H⁺],339.2[M+Na⁺],保留时间＝0.56分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.53(br s,1H),8.48(br s,1H),8.11(br dd,J＝5.7,5.6Hz,1H),7.23-7.30(m,4H),7.14-7.21(m,1H),3.58(dd,J＝7.5,3.9Hz,1H),3.50(dd,J＝13.7,6.3Hz,1H),3.34(s,3H),3.21-3.29(br m,1H),3.18(dd,J＝13.8,5.0Hz,1H),3.04-3.13(brm,2H),2.42-2.50(m,1H),1.56-1.89(m,4H),1.04(d,J＝6.9Hz,3H),0.71-0.91(m,4H)。

步骤4.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1-苯基环丙基)甲基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#59)。按照通用操作D，由#32(550mg,0.902mmol,1当量)、#58(350mg,0.992mmol,1.1当量)、二氯甲烷(10mL,0.08M)、N,N-二甲基甲酰胺(2mL)、HATU(446mg,1.17mmol,1.3当量)与三乙胺(0.503mL,3.61mmol,4当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到30％丙酮/庚烷)纯化，得到作为灰白色固体的#59(618mg,69％)。LC-MS:m/z908.7[M+H⁺],930.7[M+Na⁺],保留时间＝1.07分钟；HPLC(方案B在45℃):m/z908.5[M+H⁺],保留时间＝8.721分钟(纯度>97％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.38-7.44(m,2H),7.30-7.36(m,2H),[4.49(dd,J＝8.5,7.8Hz)与4.59(dd,J＝8.7,6.9Hz),共1H],4.18-4.26(m,3H),3.93-4.01(br m,1H),3.23与3.26(2s,共3H),3.16与3.16(2s,共3H),2.91与3.05(2br s,共3H),1.36与1.37(2br s,共3H),1.30与1.32(2br s,共3H),[1.00(d,J＝6.7Hz)与1.02(d,J＝6.6Hz),共3H],0.67-0.78(m,7H)。

步骤5.合成2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1-苯基环丙基)甲基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#60)。按照通用操作A，由#59(605mg,0.666mmol,1当量)、二氯甲烷(10mL,0.067M)与二乙胺(10mL)合成#60(379mg,83％)；HPLC(方案A在45℃)m/z685.5[M+H⁺],保留时间＝7.072分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[8.03(br d,J＝9.6Hz)与8.07(br d,J＝9.4Hz),共1H],[7.74(br dd,J＝7,4Hz)与7.99(br dd,J＝5.9,5.7Hz),共1H],7.20-7.27(m,4H),7.11-7.17(m,1H),[4.49(dd,J＝9,7Hz)与4.58(dd,J＝9,7.5Hz),共1H],3.96-4.04(br m,1H),3.24与3.27(2s,共3H),3.18与3.19(2s,共3H),2.93与3.07(2br s,共3H),1.20与1.21(2s,共3H),1.12与1.14(2s,共3H),[1.00(d,J＝6.7Hz)与1.03(d,J＝6.7Hz),共3H]。

制备2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#66)

步骤1.合成环庚-2,4,6-三烯-1-基乙腈(#61)。在-78℃下将二异丙胺锂(1.8M在庚烷/乙苯/四氢呋喃中的溶液,31.2mL,56.2mmol,1当量)加入无水乙腈(3.12mL,56.2mmol,1当量)的四氢呋喃(281mL,0.2M)溶液中。在-78℃下经过20分钟后，加入四氟硼酸鎓(10g,56mmol,1当量)。10分钟后，真空浓缩反应混合物，用乙酸乙酯稀释残留物，用水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到棕色油，通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为黄色油的#61(1.88g,25％)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.69-6.71(m,2H),6.27-6.32(m,2H),5.28-5.33(m,2H),2.61(d,J＝7.2Hz,2H),2.26-2.34(m,1H)。

步骤2.合成2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙胺(#62)。在0℃下将#61(2.25g,17.2mmol,1当量)的乙醚(15mL)溶液经15分钟逐滴缓慢加入氢化铝锂(911mg,24.0mmol,1.4当量)的无水乙醚(75mL,0.23M)悬浮液中。加热反应到室温。5小时后，冷却反应到0℃，加入水(1mL)来猝灭，然后通过小硅藻土垫过滤并用甲醇清洗。在硫酸钠上干燥滤液，过滤，真空浓缩，得到作为金黄色油的#62(1.683g,73％)。LC-MS:m/z136.1[M+H⁺],保留时间＝0.23分钟；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.64-6.67(m,2H),6.16-6.21(m,2H),5.16-5.21(m,2H),2.84-2.89(m,2H),1.86-1.92(m,2H),1.62-1.70(m,1H)。

步骤3.合成(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(#63)。将HATU(5.36g,13.7mmol,1.1当量)加入#11(3.57g,12.4mmol,1当量)在二氯甲烷(100mL,0.1M)与N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中的溶液中。20分钟后，依序加入三乙胺(5.20mL,37.3mmol,3当量)与#62(1.68g,12.4mmol,1当量)，搅拌混合物18小时。真空浓缩反应混合物，将残留物置于乙酸乙酯中并用水(50mL)清洗。用乙酸乙酯反萃取水层3次，干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩，得到棕色油，通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为黏性油的#63(2.95g,59％收率)。LC-MS:m/z405.4[M+H⁺],427.4[M+Na⁺],保留时间＝0.75分钟；¹H NMR(400MHz,CDCl₃),推测是旋转异构体混合物:δ6.63-6.68(m,2H),6.16-6.23(m,2H),5.19(br dd,J＝9.0,5.8Hz,2H),3.51-3.63与3.71-3.90(2br多重峰,共3H),3.42(s,3H),3.18-3.29与3.34-3.47(2br多重峰,共3H),2.27-2.45(br m,1H),1.6-2.00(m,7H),1.47与1.50(2br s,共9H),1.16-1.29(br m,3H)。

步骤4.合成(2R,3R)-N-[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺盐酸盐(#64)

用4M盐酸的二噁烷溶液(10mL,40mmol,40当量)处理中间体#63(400mg,0.989mmol,1当量)。1小时后，真空浓缩反应混合物，将残留物置于二氯甲烷中并用1M氢氧化钠溶液清洗。用二氯甲烷反萃取水层，在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩，得到作为棕色油的#64(301mg,定量)，静置后缓慢开始固化。LC-MS:m/z305.3[M+H⁺],保留时间＝0.54分钟；HPLC(方案G):保留时间＝4.848分钟；¹H NMR(400MHz,CDCl₃),特征信号:δ6.64-6.67(m,2H),6.16-6.22(m,2H),6.08-6.14(br m,1H),5.16-5.22(m,2H),3.44(s,3H),3.31(dd,J＝6.3,4.5Hz,1H),2.98-3.04(m,1H),2.94(ddd,J＝10.5,7.2,5.6Hz,1H),2.81(ddd,J＝10.5,7.7,6.7Hz,1H),2.57(qd,J＝7.1,4.5Hz,1H),1.90-1.97(m,2H),1.49-1.55(m,1H),1.18(d,J＝7.1Hz,3H)。

步骤5.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#65)。按照通用操作D，由在二氯甲烷(9.37mL,0.1M)中的#32(678mg,0.937mmol,1当量)、胺#64(300mg,0.985mmol,1.1当量)、HATU(427mg,1.12mmol,1.2当量)与二异丙基乙胺(494μL,2.81mmol,3当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到50％丙酮/庚烷)纯化，得到作为固体的#65(546mg,65％)。LC-MS:m/z896.7[M+H⁺],918.7[M+Na⁺],保留时间＝1.06分钟。

步骤6.合成2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#66)。将三乙胺(10mL)加入#65(540mg,0.603mmol,1当量)的二氯甲烷(10mL,0.06M)溶液中，搅拌反应混合物2小时。真空浓缩混合物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化残留物，得到作为无色固体的#66(347mg,85％)。HPLC(方案A在45℃):m/z674.5[M+H⁺],保留时间＝7.015分钟。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[8.03(br d,J＝9Hz)与8.05(brd,J＝9Hz),共1H],[7.77(br dd,J＝5.5,5.5Hz)与7.98(br dd,J＝5.5,5.5Hz),共1H],6.54-6.65(m,2H),6.10-6.19(m,2H),5.11-5.19(m,2H),[4.48(dd,J＝9,8Hz)与4.54(dd,J＝9,7.5Hz),共1H],3.94-4.04(br m,1H),3.26与3.29(2s,共3H),3.17与3.19(2s,共3H),2.93与3.06(2br s,共3H),1.20与1.21(2s,共3H),1.12与1.13(2s,共3H),[1.04(d,J＝6.8Hz)与1.07(d,J＝6.7Hz),共3H]。

制备2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#69)和2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#70)

步骤1.合成N-{(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(#67)。按照通用操作C，由#37(2.39g,5.33mmol,1当量)、二噁烷(10mL,0.53M)与4M盐酸的二噁烷溶液(10mL,40mmol,7.5当量)合成作为白色固体的#67(2.21g)，其不经进一步纯化即用于下一步。LC-MS:m/z349.2[M+H⁺],保留时间＝0.53分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.45-9.58(br m,1H),8.63(d,J＝8.1Hz,1H),8.51-8.62(br m,1H),7.25-7.33(m,4H),7.18-7.25(m,1H),4.50(ddd,J＝10.8,8.1,4.5Hz,1H),3.65(s,3H),3.54(dd,J＝6.8,4.5Hz,1H),3.20(s,3H),3.11(dd,J＝13.8,4.5Hz,1H),2.99-3.14(br m,3H),2.89(dd,J＝13.8,10.9Hz,1H),2.44-2.50(m,1H,推测；部份被溶剂峰遮蔽),1.77-1.89(m,1H),1.60-1.73(m,2H),1.46-1.57(m,1H),1.05(d,J＝6.8Hz,3H)。

步骤2.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#68)。按照通用操作D，由二氯甲烷(10mL,0.04M)中的#32(353mg,0.488mmol,1当量)、胺#67(271mg,≤0.588mmol,1.3当量)、HATU(223mg,0.586mmol,1.2当量)与二异丙基乙胺(238μL,1.71mmol,3.5当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到40％丙酮/庚烷)纯化，得到作为固体的#68(404mg,二步共88％)。LC-MS:m/z940.7[M+H⁺],962.7[M+Na⁺],保留时间＝1.04分钟；HPLC(方案C):保留时间＝9.022分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[8.25(br d,J＝8Hz)与8.48(br d,J＝8Hz),共1H],7.89(d,J＝7.4Hz,2H),7.67-7.75(m,2H),7.38-7.44(m,2H),7.31-7.36(m,2H),7.14-7.24(m,5H),4.43-4.69(m,3H),4.17-4.26(m,3H),3.91-3.99(br m,1H),3.63与3.65(2s,共3H),3.19与3.24(2s,共3H),3.14与3.15(2s,共3H),2.90与2.99(2br s,共3H),1.36与1.37(2brs,共3H),1.30与1.32(2s,共3H),[1.02(d,J＝6.8Hz)与1.06(d,J＝6.6Hz),共3H]。

步骤3A.合成2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#69)。将氢氧化锂(9.10mg,0.378mmol,2.5当量)的水(3mL)溶液加入#68(143mg,0.152mmol,1当量)的四氢呋喃(5mL,0.02M)溶液中。5小时后，真空浓缩反应混合物，与庚烷共沸三次，用二甲亚砜(2.2mL)溶解，通过反相色谱法纯化(方法C)，得到#69(56mg,52％)。HPLC(方案A在45℃):704.4[M+H⁺],保留时间＝6.623分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ8.08-8.22与8.37-8.49(2m,共5H),7.12-7.28(m,5H),3.18,3.20与3.24(3s,共6H),2.95与3.04(2br s,共3H),1.52与1.53(2s,共3H),1.39与1.41(2s,共3H),[1.02(d,J＝6.8Hz)与1.05(d,J＝6.6Hz),共3H],0.74-0.81(m,3H)。

步骤3B.合成2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#70)。按照通用操作A，由#68(240mg,0.255mmol,1当量)、二氯甲烷(10mL,0.026M)与二乙胺(10mL)合成，通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到作为白色固体/玻璃混合物的#70(120mg,65％)。HPLC(方案A在45℃):m/z762.7[M+H⁺],740.4[M+Na⁺],保留时间＝6.903分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),其被推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[8.26(d,J＝8.1Hz)与8.49(d,J＝8.3Hz),共1H],[8.03(d,J＝9.5Hz)与8.07(d,J＝9.5Hz),共1H],7.14-7.27(m,5H),3.63与3.67(2s,共3H),3.16,3.18,3.20与3.25(4s,共6H),2.92与3.01(2br s,共3H),1.20与1.22(2s,共3H),1.12与1.13(2s,共3H),[1.02(d,J＝6.8Hz)与1.06(d,J＝6.7Hz),共3H],0.74-0.80(m,3H)。

制备N²-[(3-氨基氧杂环丁烷-3-基)羰基]-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺乙酸盐(#75)

步骤1.合成3-[(叔丁氧羰基)氨基]氧杂环丁烷-3-羧酸(#71)。先加入氢氧化钠(1.55g,38.7mmol,4.5当量)的水(15mL)溶液然后加入二碳酸二叔丁酯(2.09g,9.29mmol,1.1当量)到1-氨基氧杂环丁烷-3-羧酸(1.00g,8.54mmol,1当量)/二噁烷(15mL,0.5M)中。得到白色固体。搅拌反应混合物18小时，然后真空浓缩。将残留物置于乙酸乙酯中，用1M盐酸与用盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到作为白色固体的#71(633mg,38％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物:δ12.93(br s,1H),7.59与7.93(2br s,共1H),4.71-4.78(m,2H),4.47(d,J＝6.4Hz,2H),1.30与1.38(2s,共9H)。

步骤2.合成N²-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#72)。将二异丙基乙胺(9.52mL,54.2mmol,3当量)与HATU(8.49g,21.7mmol,1.2当量)加入#@5(9.47g,18.0mmol,1当量)、#24(5.90g,18.0mmol,1当量)与二氯甲烷(250mL,0.072M)的混合物中。搅拌反应混合物18小时，然后真空浓缩。将残留物置于乙酸乙酯(300mL)中，用1M盐酸(2x100mL)与用盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩。将残留物置于二氯甲烷(250mL)中并过滤。在真空中在硅胶上浓缩滤液，通过硅胶色谱法(梯度：0％到50％丙酮/庚烷)纯化，得到作为浅黄色固体的#72(11.61g,81％)。LC-MS:m/z797.6[M+H⁺],819.6[M+Na⁺],保留时间＝1.06分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ3.26与3.28(2s,共3H),3.18与3.20(2s,共3H),2.95与3.10(2br s,共3H),1.01-1.09(m,3H),0.67-0.78(m,3H)。

步骤3.合成N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#73)。将二乙胺(10mL)加入#72(5.16g,6.47mmol,1当量)/四氢呋喃(10mL,0.65M)中。2小时后，真空浓缩反应混合物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化残留物，得到#73(2414mg,65％)。LC-MS:m/z576.5[M+H⁺],保留时间＝0.64分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ7.80-7.88与7.99-8.10(2m,共1H),7.14-7.31(m,5H),3.17与3.18(2s,共3H),2.87与3.03(2br s,共3H),1.02-1.08(m,3H)。

步骤4.合成N²-({3-[(叔丁氧羰基)氨基]氧杂环丁烷-3-基}羰基)-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#74)。先加入#71(45.2mg,0.208mmol,1.2当量)然后加入二异丙基乙胺(92μL,0.521mmol,3当量)与HATU(102mg,0.260mmol,1.5当量)到#73(100mg,0.174mmol,1当量)与二氯甲烷(4mL,0.04)和N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)的混合物中。16小时后，真空浓缩反应混合物，将残留物置于乙酸乙酯(6mL)中，用1M盐酸(2x2mL)与用盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过反相色谱法纯化粗制物(方法C)，得到#74(140mg)，其不经进一步纯化即用于下一步。LC-MS:m/z774.7[M+H⁺],796.6[M+Na⁺],保留时间＝0.91分钟。

步骤5.合成N²-[(3-氨基氧杂环丁烷-3-基)羰基]-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺乙酸盐(#75)。将三氟乙酸(1mL)加入#74(140mg,≤0.181mmol,1当量)/二氯甲烷(3mL,0.06M)中。1小时后，真空浓缩反应混合物，将残留物置于乙酸乙酯(6mL)中，用饱和碳酸氢钠水溶液(2mL)与用盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过反相色谱法纯化一半的粗制物(方法B)，得到#75(16mg,二步共26％)。LC-MS:m/z674.6[M+H⁺],保留时间＝0.68分钟；HPLC(方案A在45℃):m/z674.5[M+H⁺],保留时间＝7.128分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ7.80-7.87与8.02-8.07(2m,共2H),7.23-7.30(m,2H),7.14-7.22(m,3H),4.28-4.33(m,2H),3.96-4.04(br m,1H),3.17与3.19(2s,共3H),2.96与3.10(2br s,共3H),[1.04(d,J＝7.0Hz)与1.07(d,J＝6.6Hz),共3H]。

制备N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#79)和N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#80)

步骤1.合成N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙烷亚硫酰基}-L-苯丙氨酸甲酯(#76)。按照通用操作D，由#@5(260mg,0.648mmol,1当量)、#39(340mg,≤0.629mmol,1当量)、二氯甲烷(10mL,0.065M)、HATU(296mg,0.778mmol,1.2当量)与二异丙基乙胺(339μL,1.94mmol,3当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到40％丙酮/庚烷)纯化，得到作为固体的#76(466mg,二步共83％)。LC-MS:m/z871.5[M+H⁺],893.5[M+Na⁺],保留时间＝1.10分钟；HPLC(方案C):保留时间＝9.249分钟(纯度>99％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.19(brd,J＝7.4Hz)与10.49(brd,J＝7.8Hz),共1H],7.89(br d,J＝7.4Hz,2H),7.68-7.75(m,2H),7.54-7.60(m,1H),7.41(br dd,J＝7.4,7.4Hz,2H),7.28-7.36(m,2H),7.15-7.28(m,5H),[5.20(ddd,J＝10.9,7.3,4.4Hz)与5.34-5.43(m),共1H],3.65与3.69(2s,共3H),3.24与3.25(2s,共3H),3.17(br s,3H),2.93与2.98(2br s,共3H),[1.15(d,J＝6.6Hz)与1.18(d,J＝6.6Hz),共3H]。

步骤2.合成N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙烷亚硫酰基}-L-苯丙氨酸甲酯(#77)。按照通用操作A，由#76(460mg,0.528mmol,1当量)、四氢呋喃(8mL,0.07M)与二乙胺(8mL)合成#77(399mg)，其不经进一步纯化即用于下一步。LC-MS m/z649.5[M+H⁺],保留时间＝0.73分钟；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征产物信号:δ[10.20(d,J＝7.4Hz)与10.49(d,J＝7.4Hz),共1H],7.15-7.28(m,5H),[5.20(ddd,J＝10.9,7.2,4.5Hz)与5.34-5.42(m),共1H],3.65与3.68(2s,共3H),3.24与3.25(2s,共3H),3.15与3.15(2s,共3H),2.83与2.88(2br s,共3H),[1.15(d,J＝6.6Hz)与1.18(d,J＝6.6Hz),共3H]。

步骤3.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#78)。按照通用操作D，由#77(399mg,≤0.52mmol,1当量)、N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酸(213mg,0.628mmol,1.2当量)、二氯甲烷(5mL,0.1M)、HATU(239mg,0.628mmol,1.2当量)与二异丙基乙胺(282μL,1.62mmol,3.1当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到50％丙酮/庚烷)纯化，得到#78(231mg,二步共46％)。LC-MS:m/z970.7[M+H⁺],992.6[M+Na⁺],保留时间＝1.11分钟；HPLC(方案C):保留时间＝9.260分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.19(d,J＝7.4Hz)与10.47(d,J＝7.8Hz),共1H],7.89(d,J＝7.4Hz,2H),7.61-7.67(m,2H),7.41(br dd,J＝7.4,7.4Hz,2H),7.14-7.36(m,8H),[5.20(ddd,J＝11,7,5Hz)与5.38(ddd,J＝11,8,4Hz),共1H],[4.41(dd,J＝8.6,8.4Hz)与4.46(dd,J＝8.2,8.2Hz),共1H],3.65与3.68(2s,共3H),3.23与3.24(2s,共3H),3.13(br s,3H),2.88与2.93(2br s,共3H),2.84与2.85(2s,共3H),1.31与1.32(2s,共3H),[1.15(d,J＝6.6Hz)与1.18(d,J＝6.4Hz),共3H]。

步骤4A.合成N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#79)。按照通用操作A，由#78(223mg,0.230mmol,1当量)、二氯甲烷(6mL,0.04M)与二乙胺(6mL)合成，通过硅胶色谱法(梯度：0％到5％甲醇/庚烷，然后0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到作为白色固体的#79(146mg,85％)。HPLC(方案A在45℃):749.4[M+H⁺],保留时间＝7.315分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.20(d,J＝7.6Hz)与10.50(d,J＝8.0Hz),共1H],7.79-7.88(m,1H),7.15-7.29(m,5H),[5.20(ddd,J＝11,7,4Hz)与5.38(ddd,J＝11,8,4Hz),共1H],[4.50(dd,J＝8.8,8.6Hz)与4.56(dd,J＝9,8Hz),共1H],3.65与3.69(2s,共3H),3.24与3.25(2s,共3H),3.16(br s,3H),2.93与2.97(2br s,共3H),2.10与2.11(2s,共3H)。

步骤4B.合成N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#80)。将氢氧化锂(12.6mg,0.525mmol,3当量)的水(1.5mL)溶液加入#78(170mg,0.175mmol,1当量)的四氢呋喃(3mL,0.04M)溶液中。搅拌整夜，真空除去溶剂。将残留物与庚烷共沸三次。然后用二甲亚砜(2.2mL)稀释残留物，通过反相色谱法纯化(方法C)，得到作为固体的#80(74mg,58％)。LC-MS:m/z734.6[M+H⁺],保留时间＝0.69分钟；HPLC(方案A在45℃):734.4[M+H⁺],保留时间＝6.903分钟(纯度>96％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ12.9与13.1(2v br s,共1H),[10.12(d,J＝7.4Hz)与10.46(d,J＝7.8Hz),共1H],8.77-8.89(br m,2H),[8.47(d,J＝8.6Hz)与8.51(d,J＝8.6Hz),共1H],7.21-7.29(m,4H),7.14-7.21(m,1H),[5.16-5.23(m)与5.38(ddd,J＝11.3,8.2,3.9Hz),共1H],[4.51(dd,J＝9.0,9.0Hz)与4.57(dd,J＝9.4,8.6Hz),共1H],3.24与3.24(2s,共3H),3.18与3.19(2s,共3H),2.96与3.00(2br s,共3H),1.51与1.53(2s,共3H),1.40与1.42(2s,共3H),1.14-1.19(m,3H),0.74-0.81(m,3H)。

制备N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#84)

步骤1.合成N²-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#81)。按照通用操作D，由#@5(620mg,1.18mmol,1当量)、二氯甲烷(10mL,0.1M)、胺#18(604mg,1.42mmol,1.2当量)、二异丙基乙胺(618μL,3.54mmol,3当量)与HATU(539mg,1.42mmol,1.2当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到30％丙酮/庚烷)纯化，得到#81(737mg,58％)。HPLC(方案C):保留时间＝9.235分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.54(br d,J＝8Hz)与10.81(br d,J＝8Hz),共1H],7.89(d,J＝7.6Hz,2H),[7.80(d,J＝3.3Hz)与7.83(d,J＝3.1Hz),共1H],7.70-7.75(m,2H),[7.64(d,J＝3.1Hz)与7.68(d,J＝3.3Hz),共1H],7.55-7.60(m,1H),7.38-7.44(m,2H),7.13-7.35(m,7H),[6.31(ddd,J＝11,8,4.5Hz)与6.40-6.48(m),共1H],3.23与3.24(2s,共3H),3.17与3.22(2s,共3H),2.94与3.01(2br s,共3H),[1.14(d,J＝6.4Hz)与1.17(d,J＝6.2Hz),共3H]。

步骤2.合成N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#82)。按照通用操作A，由二氯甲烷(7mL,0.1M)中的#81(733mg,0.818mmol,1当量)与二乙胺(7mL)合成#82(670mg)，其不经进一步纯化即用于下一步。LC-MS:m/z674.5[M+H⁺],保留时间＝1.29分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),其被推测是旋转异构体混合物,特征产物信号:δ[10.55(br d,J＝8Hz)与10.84(br d,J＝8Hz),共1H],[7.64(d,J＝3.1Hz)与7.69(d,J＝3.3Hz),共1H],7.13-7.33(m,5H),6.27-6.35与6.38-6.47(2m,共1H),3.23与3.25(2s,共3H),3.15与3.19(2s,共3H),2.84与2.91(2br s,共3H)。

步骤3.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#83)。按照通用操作D，由#82(670mg,≤0.818mmol,1当量)、二氯甲烷(5mL,0.16M)、N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酸(304mg,0.896mmol,1.1当量)、HATU(372mg,0.978mmol,1.2当量)与二异丙基乙胺(440μL,2.53mmol,3.1当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到30％丙酮/庚烷)纯化，得到#83(556mg,二步共69％)。LC-MS:m/z994.7[M+H⁺],保留时间＝0.69分钟；HPLC(方案C):保留时间＝9.333分钟(纯度>98％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.53(br d,J＝8Hz)与10.80(br d,J＝8Hz),共1H],7.86-7.91(m,2H),[7.80(d,J＝3.3Hz)与7.82(d,J＝3.2Hz),共1H],[7.64(d,J＝3.2Hz)与7.68(d,J＝3.2Hz),共1H],7.62-7.66(m,2H),7.38-7.44(m,2H),7.28-7.36(m,5H),7.19-7.26(m,2H),7.12-7.17(m,1H),[6.31(ddd,J＝11,8,4.5Hz)与6.44(ddd,J＝11,8.5,4.5Hz),共1H],[4.42(dd,J＝9,8Hz)与4.48(dd,J＝8,8Hz),共1H],3.22与3.24(2s,共3H),3.13与3.17(2s,共3H),2.89与2.97(2br s,共3H),2.84与2.85(2s,共3H),[1.13(d,J＝6.4Hz)与1.16(d,J＝6.4Hz),共3H]。

步骤4.合成N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#84)。按照通用操作A，由二氯甲烷(10mL,0.05M)中的#83(552mg,0.555mmol,1当量)与二乙胺(10mL)合成粗制的期望物质，用甲醇稀释，在真空中在硅胶上浓缩，通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到作为白色固体的#84(406mg,95％)。LC-MS:m/z772.8[M+H⁺],保留时间＝1.35分钟；HPLC(方案A):774.4[M+H⁺],保留时间＝7.390分钟；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[10.54(br d,J＝8Hz)与10.81(br d,J＝8Hz),共1H],7.78-7.84(m,2H),[7.65(d,J＝3.1Hz)与7.69(d,J＝3.3Hz),共1H],7.29-7.34(m,2H),7.20-7.28(m,2H),7.14-7.19(m,1H),6.27-6.35与6.40-6.48(2m,共1H),[4.51(dd,J＝9,8Hz)与4.57(dd,J＝9,8Hz),共1H],3.24与3.25(2s,共3H),3.16与3.21(2s,共3H),2.94与3.00(2br s,共3H),2.09与2.10(2s,共3H),1.08与1.09(2s,共3H),0.73-0.80(m,3H)。

N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#88)

步骤1.合成N²-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#85)。先加入二异丙基乙胺(5.51mL,31.3mmol,3当量)然后加入HATU(4.91g,12.5mmol,1.2当量)到#@5(5.48g,10.4mmol,1当量)与#19(3.90g,10.4mmol,1当量)在二氯甲烷(50mL,0.2M)中的混合物中。搅拌整夜后，真空浓缩反应混合物。将残留物置于乙酸乙酯(100mL)中，用1M盐酸(2x30mL)与盐水(30mL)清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩。将残留物置于二氯甲烷中并过滤，通过硅胶色谱法(梯度：0％到50％丙酮/庚烷)纯化滤液，得到作为固体的#85(7.20g,78％)。LC-MS:m/z880.6[M+H⁺],保留时间＝1.07分钟。

步骤2.合成N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#86)。按照通用操作A，由四氢呋喃(10mL,0.56M)中的#85(5.00g,5.68mmol,1当量)与二乙胺(3mL)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到作为固体的#86(2.952g,79％)。LC-MS:m/z658.5[M+H⁺],680.5[M+Na⁺]保留时间＝0.66分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),其被推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[8.64(br d,J＝8.4Hz)与8.90(br d,J＝8.8Hz),共1H],[7.77(d,J＝3.3Hz)与7.80(d,J＝3.3Hz),共1H],[7.63(d,J＝3.3Hz)与7.66(d,J＝3.3Hz),共1H],7.12-7.31(m,5H),[5.39(ddd,J＝11.2,8.4,4.2Hz)与5.54(ddd,J＝11.9,8.9,4.0Hz),共1H],3.15,3.19,3.20与3.26(4s,共6H),2.86与2.98(2br s,共3H),[1.06(d,J＝6.6Hz)与1.11(d,J＝6.6Hz),共3H]。

步骤3.合成N-(叔丁氧羰基)-N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#87)。先加入N-(叔丁氧羰基)-N,2-二甲基丙氨酸(29.1mg,0.134mmol,1.1当量)然后加入二异丙基乙胺(64μL,0.365mmol,3当量)与HATU(71.7mg,0.183mmol,1.5当量)到#86(80.3mg,0.122mmol,1当量)在二氯甲烷(4mL,0.03M)中的混合物中。搅拌整夜后，真空浓缩反应混合物。将残留物置于乙酸乙酯(6mL)中，用1M盐酸(2x2mL)与盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机溶剂，过滤，真空浓缩。将残留物置于二氯甲烷中并过滤，在真空中在硅胶上浓缩滤液，通过硅胶色谱法(梯度：0％到50％丙酮/庚烷)纯化，得到作为白色固体的#87(58mg,50％)。LC-MS:m/z857.7[M+H⁺],879.7[M+Na⁺],保留时间＝0.99分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[8.64(br d,J＝8Hz)与8.87(br d,J＝9Hz),共1H],[7.77(d,J＝3.3Hz)与7.80(d,J＝3.3Hz),共1H],[7.63(d,J＝3.2Hz)与7.66(d,J＝3.2Hz),共1H],7.13-7.31(m,5H),[6.95(br d,J＝8Hz)与7.06(br d,J＝8Hz),共1H],5.35-5.42与5.51-5.58(2m,共1H),3.15,3.19,3.20与3.26(4s,共6H),2.94与3.03(2br s,共3H),2.83与2.84(2s,共3H),[1.05(d,J＝6.7Hz)与1.11(d,J＝6.7Hz),共3H]。

步骤4.合成N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#88)。将三氟乙酸(2mL)加入#87(58mg,0.068mmol,1当量)在二氯甲烷(8mL)中的混合物中。搅拌整夜后，真空浓缩反应混合物。将残留物置于乙酸乙酯(10mL)中，用饱和碳酸氢钠水溶液清洗，在硫酸钠上干燥，过滤，真空浓缩，得到#88(52mg,定量)。LC-MS757.6[M+H⁺],保留时间＝0.69分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[8.64(br d,J＝8.6Hz)与8.87(br d,J＝8.6Hz),共1H],7.80-7.85(m,1H),[7.77(d,J＝3.3Hz)与7.80(d,J＝3.1Hz),共1H],[7.63(d,J＝3.1Hz)与7.66(d,J＝3.3Hz),共1H],7.20-7.31(m,4H),7.13-7.19(m,1H),[5.39(ddd,J＝11,8.5,4Hz)与5.49-5.56(m),共1H],[4.51(dd,J＝9,8Hz)与4.61(dd,J＝9,8Hz),共1H],3.16,3.20,3.21与3.25(4s,共6H),2.94与3.03(2br s,共3H),2.10与2.10(2s,共3H),1.16(br s,3H),1.04-1.12(m,6H),0.72-0.80(m,3H)。

制备N²-(3-氨基-2,2-二甲基丙酰基)-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#95)

步骤1.合成3-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-2,2-二甲基丙酸(#93)。先加入二异丙基乙胺(859μL,4.88mmol,3当量)然后加入(9H-芴-9-基甲氧基)羰基氯(473mg,1.79mmol,1.1当量)到3-氨基-2,2-二甲基丙酸盐酸盐(250mg,1.63mmol,1当量)/二氯甲烷(4mL,0.4M)中。搅拌反应混合物18小时，然后真空浓缩。将残留物置于乙酸乙酯(3mL)中，用1M盐酸(2x1mL)与用盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为油的#93(250mg,45％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.22(s,1H),7.89(d,J＝7.4Hz,2H),7.72(d,J＝7.4Hz,2H),7.38-7.44(m,2H),7.27-7.35(m,3H),4.18-4.30(m,3H),3.16(d,J＝6.2Hz,2H),1.05(s,6H)。

步骤2.合成N²-(3-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-2,2-二甲基丙酰基)-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#94)。先加入#93(51.6mg,0.152mmol,1当量)然后加入二异丙基乙胺(80.0μL,0.457mmol,3当量)与HATU(89.8mg,0.229mmol,1.5当量)到#86(100mg,0.152mmol,1当量)在二氯甲烷(4mL,0.038M)与N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的混合物中。搅拌反应混合物18小时，然后真空浓缩。将残留物置于乙酸乙酯(6mL)中，用1M盐酸(2x2mL)与用盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩。将残留物置于二氯甲烷(250mL)中并过滤，在真空中使滤液在硅胶上浓缩，通过硅胶色谱法(梯度：0％到50％丙酮/庚烷)纯化，得到作为白色固体的#94(90mg,60％)。LC-MS:m/z979.8[M+H⁺],1002.7[M+Na⁺],保留时间＝1.15分钟；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征产物信号:δ[8.64(br d,J＝8.6Hz)与8.86(br d,J＝8.6Hz),共1H],7.86-7.91(m,2H),[7.77(d,J＝3.3Hz)与7.79(d,J＝3.3Hz),共1H],7.67-7.73(m,2H),[7.63(d,J＝3.3Hz)与7.65(d,J＝3.3Hz),共1H],6.87-6.95(m,1H),[5.39(ddd,J＝11,8,4Hz)与5.52(ddd,J＝11.5,9,4Hz),共1H],[4.44(dd,J＝8.4,8.4Hz)与4.55(dd,J＝8.4,8.4Hz),共1H],3.16,3.20,3.21与3.25(4s,共6H),2.96与3.06(2br s,共3H),0.69-0.77(m,3H)。

步骤3.合成N²-(3-氨基-2,2-二甲基丙酰基)-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#95)。将二乙胺(10mL)加入#94(86mg,0.088mmol,1当量)/四氢呋喃(2mL,0.04M)中。搅拌整夜后，真空浓缩反应混合物，通过反相色谱法纯化残留物(方法C)，得到#95(55mg,72％)。LC-MS:m/z757.5[M+H⁺],保留时间＝0.74分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[8.66(br d,J＝8Hz)与8.92(br d,J＝9Hz),共1H],[7.91(br d,J＝8Hz)与7.97(br d,J＝9Hz),共1H],[7.78(d,J＝3.3Hz)与7.81(d,J＝3.1Hz),共1H],7.65-7.74(br m,3H),[7.63(d,J＝3.3Hz)与7.67(d,J＝3.3Hz),共1H],7.12-7.31(m,5H),[5.35-5.42(m)与5.45-5.52(m),共1H],[4.44(dd,J＝9,9Hz)与4.55(dd,J＝9,9Hz),共1H],3.17,3.20,3.22与3.25(4s,共6H),2.96与3.05(2br s,共3H),1.25与1.25(2s,共3H),1.14与1.15(2s,共3H),[1.06(d,J＝6.6Hz)与1.10(d,J＝6.4Hz),共3H],0.72-0.80(m,3H)。

制备N²-(3-氨基-2,2-二甲基丙酰基)-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#97)

步骤1.合成N²-(3-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-2,2-二甲基丙酰基)-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#96)。先加入#93(59.1mg,0.174mmol,1当量)然后加入二异丙基乙胺(92μL,0.52mmol,3当量)与HATU(102mg,0.260mmol,1.5当量)到#73(100mg,0.174mmol,1当量)在二氯甲烷(4mL,0.04M)和N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的混合物中。搅拌反应混合物18小时，然后真空浓缩。将残留物置于乙酸乙酯(6mL)中，用1M盐酸(2x2mL)与用盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到50％丙酮/庚烷)纯化，得到作为白色固体的#96(102mg,65％)。LC-MS:m/z896.7[M+H⁺],918.8[M+Na⁺],保留时间＝1.14分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征产物信号:δ7.88(d,J＝7.4Hz,2H),[7.83(br dd,J＝6,5Hz)与8.03(br dd,J＝6,5Hz),共1H],7.67-7.73(m,2H),7.36-7.48(m,3H),7.22-7.35(m,4H),7.13-7.21(m,3H),6.86-6.96(m,1H),[4.44(dd,J＝8.6,8.6Hz)与4.50(dd,J＝8.6,8.6Hz),共1H],3.18,3.19,3.26与3.29(4s,共6H),2.96与3.11(2br s,共3H),0.70-0.77(m,3H)。

步骤2.合成N²-(3-氨基-2,2-二甲基丙酰基)-N-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#97)。将二乙胺(0.5mL)加入#96(98mg,0.11mmol,1当量)/四氢呋喃(2mL,0.04M)中。搅拌整夜后，真空浓缩反应混合物，通过反相色谱法纯化残留物(方法C)，得到#97(58mg,68％)。LC-MS:m/z674.4[M+H⁺],696.4[M+Na⁺],保留时间＝0.74分钟；HPLC(方案A):674.5[M+H⁺],保留时间＝7.072分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[7.92(br d,J＝8Hz)与7.97(brd,J＝8Hz),共1H],[7.86(br dd,J＝6,5Hz)与8.07(brdd,J＝6,5Hz),共1H],7.64-7.74(brm,3H),7.15-7.29(m,5H),[4.44(dd,J＝9,9Hz)与4.50(dd,J＝9,9Hz),共1H],3.26与3.29(2s,共3H),3.18与3.20(2s,共3H),2.96与3.10(2br s,共3H),1.24与1.25(2s,共3H),1.14与1.16(2s,共3H),1.02-1.07(m,3H),0.73-0.80(m,3H)。

制备2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#98)

先加入HATU(0.108mg,0.284mmol,1.1当量)然后加入二异丙基乙胺(139μL,0.800mmol,3.1当量)到1-(叔丁氧羰基)-2-甲基-L-脯氨酸(65.1mg,0.284mmol,1.1当量)和#86(170mg,0.258mmol,1当量)在二氯甲烷(5mL,0.03M)中的混合物中。搅拌整夜后，冷却反应混合物到0℃，加入二氯甲烷(3mL)，然后缓慢加入三氟乙酸(2mL)。在0℃下搅拌反应混合物5分钟，加热到室温，然后在室温搅拌30分钟，真空浓缩。使残留物和庚烷共沸二次，用少量二氯甲烷与甲醇稀释，在真空中在硅胶上浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化残留物，然后通过反相色谱法纯化(方法C)，得到作为白色固体的#98(128mg,56％)。LC-MS:m/z769.4[M+H⁺],保留时间＝1.28分钟；HPLC(方案A在45℃)m/z769.4[M+H⁺],保留时间＝7.146分钟(纯度>98％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ9.03-9.15(br m,1H),8.77-8.86(br m,1H),8.69-8.76(m,1H),[8.66(d,J＝8.2Hz)与8.92(d,J＝8.6Hz),共1H],[7.78(d,J＝3.1Hz)与7.80(d,J＝3.5Hz),共1H],[7.63(d,J＝3.1Hz)与7.67(d,J＝3.1Hz),共1H],7.12-7.31(m,5H),[5.38(ddd,J＝11,8,4Hz)与5.47(ddd,J＝11,9,4Hz),共1H],[4.46(dd,J＝9.4,9.0Hz)与4.55(dd,J＝9.0,8.6Hz),共1H],3.17,3.20,3.22与3.25(4s,共6H),2.98与3.04(2br s,共3H),[1.06(d,J＝7.0Hz)与1.09(d,J＝6.6Hz),共3H],0.73-0.80(m,3H)。

制备氨基(双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)乙酸甲酯盐酸盐(#102)

步骤1.合成(乙酰基氨基)(双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)氰基乙酸乙酯(#99)。使钠(464mg,20.2mmol,1.2当量)与无水乙醇(40mL,0.42M)反应，将2-(乙酰基氨基)-2-氰基乙酸乙酯(3.44g,20.2mmol,1.2当量)加入所得混合物中。在60℃下经过20分钟后，加入7-溴双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯(3.092g,16.89mmol,1当量)，在回流下加热反应混合物整夜，然后过滤，真空浓缩。用水稀释残留物，用乙酸乙酯萃取。用盐水清洗有机层，在硫酸钠上干燥，过滤，真空浓缩，得到深色油，通过硅胶色谱法(梯度：0％到50％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为黄色胶体的#99(4.38g)。LC-MS:m/z273.2[M+H⁺],保留时间＝2.36分钟。

步骤2.合成(乙酰基氨基)(双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)乙酸(#100)。将1N氢氧化钠水溶液(38mL,38mmol,2.4当量)加入#99(4.38mg,<16.1mmol,1当量)在甲醇(30mL,0.53M)中的混合物中。在回流下加热反应混合物整夜，然后真空浓缩，用水(40mL)稀释，用1N盐酸(40mL)酸化。用二氯甲烷(3x30mL)萃取水层。在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法(溶剂A：二氯甲烷；溶剂B：含有0.02％三氟乙酸的20％甲醇/二氯甲烷；梯度：0％到40％B)纯化所得油，然后通过超临界流体色谱法(柱：ChiralpakAD-H,250x21mm；洗脱液：85:15二氧化碳/甲醇；流速：65g/分钟；检测：210nm；仪器：Bergerminigram preparativeSFC system)纯化。分离第两个洗脱峰得到作为单一异构体的#100(600mg,二步共17％)(保留时间：3.37分钟，纯度>99％)。LC-MS:m/z220.3[M+H⁺],保留时间＝2.10分钟；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.14-7.24(m,2H),7.03-7.09(m,2H),4.59(d,J＝8.6Hz,1H),3.87(ddd,J＝8.5,5.3,2.4Hz,1H),3.35(dd,J＝14.5,5.4Hz,1H,推测；部份被溶剂峰遮蔽),3.10(dd,J＝14.4,2.4Hz,1H),2.00(s,3H)。旋光度:[α]_D ²⁵+70.9°(c0.67,甲醇)。

步骤3.合成氨基(双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)乙酸盐酸盐(#101)。在回流下加热#100(200mg,0.912mmol,1当量)与6N盐酸(12.3mL,73.8mmol,81当量)的混合物整夜。真空浓缩反应混合物，得到作为米黄色固体的单一异构体#101(195mg)，其不经进一步纯化即用于下一步。

步骤4.合成氨基(双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)乙酸甲酯盐酸盐(#102)。将亚硫酰氯(0.666mL,9.13mmol,10当量)加入#101(195mg,<0.913mmol,1当量)在甲醇(20mL,0.04M)中的混合物中。在回流下经过2小时后，真空浓缩反应混合物，得到作为浅色固体的单一异构体#102(175mg,二步共84％)。LC-MS:m/z192.3[M+H⁺],保留时间＝0.80分钟；GC-MS:m/z192[M+H⁺],保留时间＝3.206分钟；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.24-7.33(m,2H),7.11-7.18(m,2H),4.40(d,J＝6.9Hz,1H),3.99-4.05(m,1H),3.78(s,3H),3.46(dd,J＝14.8,5.4Hz,1H),3.23(dd,J＝14.8,2.5Hz,1H)。

制备(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酸盐酸盐(#103)

将4N盐酸的二噁烷溶液(37mL,100mmol,7当量)加入#11(4.09g,14.2mmol,1当量)在环戊基甲醚(10mL,0.14M)中的混合物中。3小时后，真空浓缩反应混合物，与庚烷共沸三次，得到作为胶的#103(1000mg,31％)，其不经进一步纯化即用于下一步。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.92-10.06(br s,1H),8.66-8.80(br s,1H),3.89(dd,J＝5.2,4.9Hz,1H),3.43-3.53(m,1H),3.39(s,3H),3.06-3.17(m,2H),2.66(qd,J＝7.1,4.6Hz,1H),1.71-2.03(m,4H),1.11(d,J＝7.1Hz,3H)。

制备2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[1-(双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#107)和2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基(羧基)甲基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#108)

步骤1.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代-1-(五氟苯氧基)庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#104)。将三氟乙酸五氟苯酯(2.25mL,13.1mmol,2当量)逐滴加入#32(4.00g,6.56mmol,1当量)在二氯甲烷(20mL,0.33M)与吡啶(1.06mL,13.1mmol,2当量)中的混合物中。搅拌反应混合物1小时。

将三氟乙酸五氟苯酯(0.203mL,1.18mmol)逐滴加入含有#32(360mg,0.59mmol)在二氯甲烷(0.6mL,1M)与吡啶(0.095mL,1.2mmol,2当量)中的混合物的第两个烧瓶中。搅拌反应混合物15分钟。

将二种反应混合物复合，用1N盐酸清洗二次，在硫酸钠上干燥，过滤，真空浓缩。用乙酸乙酯溶解所得黄色油，事先吸附于硅胶上，通过硅胶色谱法(梯度：0％到40％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为含有一些杂质的白色泡沫的#104(4.6g,83％)。LC-MS:m/z798.3[M+Na⁺],保留时间＝1.23分钟。

步骤2.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#105)。先加入#103(483mg,2.16mmol,1当量)的二氯甲烷(2mL)溶液然后加入二异丙基乙胺(1.35mL,7.73mmol,3当量)到#104(2.00g,<2.58mmol,1当量)在二氯甲烷(6mL,0.4M)中的混合物中。搅拌反应混合物16小时，然后吸附于硅胶上，通过硅胶色谱法(梯度：0％到20％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到作为白色泡沫的#105(1.67g,83％)。分别收集含有带杂质的期望产物的流份(0.571g)。

以相似的方式用#104(2.60g,<3.35mmol,1当量)、#103(750mg,3.35mmol,1当量)、二氯甲烷(10mL,0.3M)与二异丙基乙胺(1.35mL,7.73mmol,2.3当量)重复前面的反应与纯化，得到作为棕褐色泡沫的#105(2.4g,92％)。将含有杂质产物的流份(1.7g)与前述杂质流份合并并按前述纯化，得到另外的#105(1.30g,二步的反应的定量的收率)。LC-MS:m/z779.3[M+H⁺],802.3[M+Na⁺],保留时间＝1.05分钟。

步骤3.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[1-(双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#106)。将HATU(136mg,0.347mmol,1.2当量)加入#105(225mg,0.289mmol,1当量)在二氯甲烷(15mL,0.02M)与N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中的混合物中。5分钟后，加入胺#102(72.4mg,0.318mmol,1当量)与二异丙胺(203μL,1.16mmol,3当量)的二氯甲烷(5mL)溶液。24小时后，用盐水清洗反应混合物，在硫酸钠上干燥，过滤，在真空中在硅胶上浓缩，通过硅胶色谱法(梯度：0％到50％丙酮/庚烷)纯化，得到作为透明油的单一异构体#106(210mg,76％)。LC-MS:m/z953.1[M+H⁺],保留时间＝3.99分钟；¹H NMR(400MHz,CDCl₃),推测是旋转异构体混合物,特征信号:7.76(d,J＝7.5Hz,2H),7.57-7.64(m,2H),7.40(dd,J＝7.5,7.4Hz,2H),7.28-7.34(m,2H),4.82-4.88(m,1H),3.95-4.01(m,1H),3.76与3.82(2s,共3H),3.30,3.31,3.34与3.35(4s,共6H),[1.20(d,J＝7.0Hz)与1.20(d,J＝7.0Hz),共3H]。

步骤4A.合成2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[1-(双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#107)。按照通用操作A，由二氯甲烷(10mL,0.003M)中的#106(25mg,0.026mmol,1当量)与二乙胺(4mL)合成粗制的期望物质，通过反相色谱法纯化(方法C)，得到作为固体的单一异构体#107(16mg,73％)。LC-MS:m/z730.8[M+H⁺],保留时间＝2.13分钟；HPLC(方案N):保留时间＝9.889分钟。

步骤4B.合成2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基(羧基)甲基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#108)。按照与前述由#40合成#41的步骤相似的步骤由#106(190mg,0.200mmol)合成单一异构体#108(94.5mg,57％)。LC-MS:m/z716.8[M+H⁺],保留时间＝2.06分钟；HPLC(方案N):保留时间＝9.137分钟。

制备2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#112)

步骤1.合成(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(#109)。将HATU(3270mg,8.35mmol,1.2当量)加入#11(2.00g,6.96mmol,1当量)在二氯甲烷(21mL,0.3M)与N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中。2分钟后，加入胺(1R,2S)-(+)-去甲麻黄碱(1.07mg,6.96mmol,1当量)与三乙胺(1.94mL,13.9mmol,2当量)。2小时后，用乙酸乙酯(100mL)稀释反应混合物，用1M盐酸与用盐水清洗，在硫酸钠上干燥，过滤，真空浓缩，通过硅胶色谱法(梯度：0％到60％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色固体的#109(2.18g,74％)。LC-MS:m/z321.3[(M-Boc)+H⁺],保留时间＝3.14分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ7.64(d,J＝8.6Hz,1H),7.24-7.33(m,4H),7.15-7.21(m,1H),5.35(br d,J＝5Hz,1H),4.45(brdd,J＝5,5Hz,1H),3.91-4.00(m,1H),3.30-3.39(m,1H),3.26(s,3H),2.94-3.07(m,1H),2.04-2.14(m,1H),1.46-1.78(m,4H),1.40(s,9H),0.97-1.04(m,6H)。

步骤2.合成(2R,3R)-N-[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸盐(#110)。按照通用操作C，在0℃下由#109(414mg,0.984mmol,1当量)、二噁烷(5mL,0.2M)与4M盐酸的二噁烷溶液(15mL,60mmol,60当量)合成粗制的期望化合物，通过反相色谱法纯化(方法C)，得到作为黏性液体的#110(120mg,34％)。LC-MS:m/z321.1[M+H⁺],保留时间＝0.55分钟；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),特征信号:δ7.90(d,J＝8.6Hz,1H),7.28-7.36(m,4H),7.20-7.27(m,1H),4.46(d,J＝6.2Hz,1H),3.48(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),3.38(s,3H),2.92-3.16(m,3H),2.24-2.35(m,1H),1.49-1.88(m,4H),1.09(d,J＝6.6Hz,3H),1.01(d,J＝6.6Hz,3H)。

步骤3.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#111)。按照通用操作D，由#32(140mg,0.230mmol,1当量)、#110(110mg,0.253mmol,1.1当量)、二氯甲烷(3mL,0.08M)、N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)、HATU(96.2mg,0.253mmol,1.1当量)与三乙胺(96μL,0.69mmol,3当量)合成粗制的期望产物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到40％丙酮/庚烷)纯化，得到#111(220mg,95％)。LC-MS:m/z912.4[M+H⁺],935.4[M+Na⁺],保留时间＝2.15分钟；HPLC(方案B):m/z912.5[M+H⁺],934.5[M+Na⁺],保留时间＝10.138分钟(纯度>94％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ7.89(d,J＝7.8Hz,2H),7.66-7.75(m,2H),7.41(dd,J＝7.4,7.4Hz,2H),7.12-7.20(m,1H),[5.33(d,J＝4.7Hz)与5.38(d,J＝4.7Hz),共1H],3.15,3.18,3.22与3.23(4s,共6H),1.30,1.33,1.36与1.39(4s,共6H),0.95-1.06(m,6H)。

步骤4.合成2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#112)。按照通用操作A，由二氯甲烷(5mL,0.05M)中的#111(210mg,0.230mmol)与二乙胺(5mL)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到油与固体混合物。加入乙醚与庚烷，真空浓缩混合物，得到作为白色固体的#112(81mg,51％)。LC-MS:m/z690.4[M+H⁺],保留时间＝1.10分钟；HPLC(方案A):m/z690.5[M+H⁺],712.4[M+Na⁺],保留时间＝7.229分钟(纯度>90％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),推测是旋转异构体混合物,特征信号:δ[7.62(br d,J＝8Hz),7.88(br d,J＝8Hz),8.07(br d,J＝9Hz)与8.11(br d,J＝9Hz),共2H],7.15-7.34(m,5H),[5.34(d,J＝4Hz)与5.41(d,J＝5Hz),共1H],3.18,3.21,3.23与3.25(4s,共6H),2.93与3.08(2br s,共3H),1.15,1.18,1.21与1.25(4s,共6H)。

制备N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-硫代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#115)。

步骤1.合成N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯(#113)。在氮气下先加入HATU(10.8g,27.6mM)然后加入Hunig碱(12.1mL,69.0mM)到搅拌的二聚体酸#5(12.1g,23.0mM)与#67(11.5g,23.0mM)在二氯甲烷(75mL)中的混合物中。在室温搅拌反应混合物15小时。浓缩反应混合物到较小的体积，将其置于乙酸乙酯中，用1N盐酸清洗二次。然后用盐水清洗有机层，在硫酸钠上干燥，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到70％丙酮/庚烷)纯化残留物，得到作为白色固体的#113(12.3g,62％)。LC-MS(方案Q):m/z855.3[M+H⁺],877.2[M+Na⁺],保留时间＝2.32分钟；HPLC(方案R):/z855.5[M+H⁺],保留时间＝9.596分钟(纯度>97％)。

步骤2.合成N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯(#114)。按照通用操作A，由#113(12g,14mmol,1当量)、二氯甲烷(60mL,0.24M)与二乙胺(40mL,390mM)合成，通过硅胶色谱法(梯度：0％到25％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到作为白色/浅黄色固体的#114(5.9g,67％)。LC-MS(方案Q):m/z633.0[M+H⁺],保留时间＝1.19分钟。HPLC(方案A):/z633.5[M+H⁺],保留时间＝7.142分钟(纯度>98％)。

步骤3.合成N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#115)。将Hunig碱(0.14mL,0.82mM)加入搅拌的N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酸(167mg,0.493mM)、#114(260mg,0.411mM)、HATU(188mg,0.493mM)在二氯甲烷(10mL)中的混合物中。在室温搅拌反应混合物1小时又20分钟。浓缩反应混合物。加入THF(9mL)，将氢氧化锂(49.2mg,2.06mM)的水(3mL)溶液加入搅拌的混合物中。在室温搅拌反应混合物4小时。浓缩反应混合物，通过中压反相C18色谱法(梯度：5％到45％水/乙腈，各相含有0.02％TFA)纯化，得到作为白色固体的#115(218mg,64％)。LC-MS(方案Q):m/z718.7[M+H⁺],740.6[M+Na⁺],保留时间＝1.21分钟。HPLC(方案A在45℃):m/z718.4[M+H⁺],保留时间＝6.903分钟。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.81-8.95(m),8.44-8.50(m),8.42(d),8.15(d),7.14-7.28(m),4.71-4.78(m),4.57-4.66(m),4.49-4.56(m),4.41-4.48(m),3.94-4.05(m),3.72-3.79(m),3.39-3.60(m),2.95-3.33(m),2.78-2.89(m),2.69(s),2.43-2.50(m),2.08-2.42(m),1.60-1.92(m),1.20-1.57(m),0.84-1.11(m),0.74-0.83(m)。

制备2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#117)和2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#118)。

步骤1.合成1-(叔丁氧羰基)-2-甲基-L-脯氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#116)。先加入HATU(735mg,1.93mmol,1.2当量)然后加入Hunig碱(1.12mL,6.45mmol,4.0当量)到搅拌的#114(1.02g,1.61mmol,1.0当量)和1-(叔丁氧羰基)-2-甲基-L-脯氨酸(443mg,1.93mmol,1.2当量)的二氯甲烷(12mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物2小时。浓缩反应混合物，用乙酸乙酯稀释，用0.5N盐酸与盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机物，浓缩成较小的体积，在硅胶上浓缩。进行硅胶色谱法(梯度：0％到45％丙酮/庚烷)，得到作为白色固体的#116(1.02g,74％)。LC-MS(方案Q):m/z844.3[M+H⁺],867.2[M+Na⁺],保留时间＝2.15分钟。

步骤2A.合成2-甲基-L-脯氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#117)。在0℃下将TFA(3mL,40mmol,70当量)加入搅拌的#116(450mg,0.533mmol,1.0当量)的二氯甲烷(7mL)溶液中。在0℃下搅拌反应混合物5分钟，加热到室温同时搅拌20分钟。浓缩反应混合物，用二氯甲烷与少量甲醇稀释，在硅胶上浓缩。进行硅胶色谱法(梯度：0％到20％甲醇/乙酸乙酯)，得到作为白色固体的#117(396mg,89％)。LC-MS(方案Q):m/z744.5[M+H⁺],767.2[M+Na⁺],保留时间＝1.40分钟；HPLC(方案A在45℃):m/z744.5[M+H⁺],保留时间＝7.149分钟(纯度>91％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.73-9.14(m),8.66(br d),8.50(d),8.22(d),7.12-7.25(m),4.67-4.74(m),4.41-4.63(m),3.93-4.00(m),3.73(dd),3.63(d),3.46-3.57(m),3.38-3.45(m),3.26-3.23(m),3.22-3.25(m),3.06-3.22(m),2.99-3.05(m),2.93-2.97(m),2.80-2.89(m),2.75-2.78(m),2.64-2.67(m),2.46-2.50(m),2.27-2.43(m),2.00-2.26(m),1.85-1.99(m),1.70-1.83(m),1.52-1.69(m),1.33-1.51(m),1.18-1.31(m),0.98-1.07(m),0.93-0.97(m),0.82-0.92(m),0.71-0.78(m)。

步骤2B.合成2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#118)。在氮气下将氢氧化锂(24.7mg,1.03mmol,2.0当量)的水(2mL)溶液加入搅拌的#116(435mg,0.515mmol)的THF(4mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物直到LC-MS指示甲酯皂化为止。真空浓缩反应混合物，放置于真空下。用二氯甲烷稀释反应混合物并放置于氮气下。将TFA(3mL,40.5mmol,80当量)加入搅拌的混合物中。在室温搅拌反应混合物30分钟。浓缩反应混合物。通过中压反相C18色谱法(梯度：5％到60％乙腈/水，各相含有0.02％TFA)纯化残留物，得到作为白色固体的#118(396mg,89％)。LC-MS(方案Q):m/z730.2[M+H⁺],保留时间＝1.18分钟；HPLC(方案A在45℃):m/z730.5[M+H⁺],保留时间＝7.088分钟(纯度>98％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ9.04-9.13(m),8.75-8.87(m),8.70(d),8.38(d),8.11(d),7.10-7.24(m),4.66-4.74(m),4.48-4.64(m),4.37-4.47(m),3.91-3.99(m),3.77(m),3.47-3.56(m),3.33-3.47(m),3.08-3.30(m),2.93-3.07(m),2.75-2.86(m),2.63-2.69(m),2.45-2.50(m),2.28-2.44(m),2.03-2.27(m),1.88-2.02(m),1.68-1.86(m),1.55-1.67(m),1.30-1.47(m),1.17-1.29(m),0.98-1.05(m),0.93-0.97(m),0.83-0.92(m),0.71-0.79(m)。

制备2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#123)。

步骤1.合成(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基}-3-甲氧基-2-甲基丙酸(#119)。在氮气下将4M盐酸/二噁烷(20mL,80mM,10当量)加入搅拌的#11(2.4g,8.4mmol,1.0当量)的二噁烷(10mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物3小时，真空浓缩并放置于高度真空下。用10％碳酸钠(30mL)溶解粗制物。将此溶液加入搅拌的1-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮(2.96g,8.77mmol,1.05当量)的DME(30mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物直到TLC(20％甲醇/40％乙酸乙酯/40％庚烷)指示Boc脱保护的原料用尽。真空浓缩反应混合物到较小的体积，用乙醚清洗二次，用浓盐酸酸化到pH2，用90％二氯甲烷10％甲醇溶液萃取三次。用饱和碳酸氢钠溶液与盐水清洗有机物，在硫酸钠上干燥，过滤，真空浓缩，得到作为棕色固体的#119(3.4g,定量)。LC-MS(方案Q):m/z410.0[M+H⁺],保留时间＝1.81分钟。

步骤2.合成N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]吡咯烷-2-基}-3-甲氧基-2-甲基丙酰基]-L-苯丙氨酸叔丁酯(#120)。先加入HATU(2.9g,7.9mmol,1.2当量)然后加入Hunig碱(5.6mL,32mmol,5.0当量)到搅拌的L-苯丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1.67g,6.5mmol,1.0当量)与#119(5.9g,6.5mmol,1.0当量)在二氯甲烷(50mL)与DMF(5mL)中的溶液中。在室温搅拌反应混合物45分钟。浓缩反应混合物，用乙酸乙酯稀释，用0.5N盐酸与盐水清洗，在硅胶上浓缩。进行硅胶色谱法(梯度：0％到25％丙酮/庚烷)，得到作为黄白色固体的#120(3.14g,79％)。LC-MS(方案Q):m/z613.1[M+H⁺]保留时间＝2.37分钟。

步骤3.合成N-{(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-L-苯丙氨酸叔丁酯(#121)。将二乙胺(10mL,95mM,20.5当量)加入搅拌的#120(2.87g,4.68mmol,1.00当量)的二氯甲烷(20mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物2小时。加入二乙胺(10mL,95mmol,20.5当量)，在室温搅拌反应混合物3小时。真空浓缩反应混合物并放置于高度真空下，得到作为黄白色油固体混合物的#121(1.8g,定量)。LC-MS(方案Q):m/z391.1[M+H⁺]保留时间＝1.05分钟。

步骤4.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#122)。先加入#32(0.62g,1.0mmol,1.0当量)然后加入HATU(0.42g,1.1mmol,1.1当量)与Hunig碱(0.72mL,4.1mmol,4.0当量)到搅拌的#121(0.55g,1.0mmol,1.0当量)在二氯甲烷(10mL)与DMF(1mL)中的溶液中。在室温搅拌反应混合物约21小时。浓缩反应混合物，用乙酸乙酯稀释，用0.5N盐酸与盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，浓缩到较小的体积，在硅胶上浓缩。进行硅胶色谱法(梯度：0％到40％丙酮/庚烷)，得到作为白色固体的#122(0.62g,62％)。LC-MS(方案Q):m/z982.3[M+H⁺]保留时间＝2.44分钟。

步骤5.合成2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#123)。将二乙胺(5mL,50mmol,80当量)加入搅拌的#122(600mg,0.611mmol,1.00当量)在二氯甲烷(15mL)中的混合物中。在室温搅拌反应混合物3小时。真空浓缩反应混合物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到40％甲醇/二氯甲烷)纯化混合物，得到作为固体的#123(0.46g,99％)。LC-MS(方案Q1):m/z760.3[M+H⁺]保留时间＝0.83分钟。¹H NMR(400MHz,CD₃OD),δ7.14-7.30(m),4.70-4.78(m),4.56-4.64(m),4.05-4.19(m),3.87(dd),3.79-3.84(m),3.72-3.77(m),3.62-3.70(m),3.46-3.56(m),3.37-3.45(m),3.33-3.36(m),3.16-3.24(m),3.09-3.11(m),2.98-3.05(m),2.95(d),2.91(d),2.87(d),2.83(d),2.73-2.79(m),2.40-2.51(m),2.29-2.39(m),2.16-2.28(m),2.04-2.15(m),2.01(s),1.73-1.96(m),1.50-1.68(m),1.47-1.49(m),1.46(s),1.43(s),1.38(s),1.35(d),1.23-1.32(m),1.17-1.22(m),1.15(d),1.04-1.11(m),0.94-1.03(m),0.82-0.91(m)。

制备N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-氨基-2,2-二甲基丙酰基)-L-缬氨酰基](甲基)氨基}-3-甲氧基-5-甲基庚酰基]吡咯烷-2-基}-3-甲氧基-2-甲基丙酰基]-L-苯丙氨酸甲酯(#126)。

步骤1.合成3-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-2,2-二甲基丙酸(#124)。将3-氨基-2,2-二甲基丙酸盐酸盐(1.0g,6.5mmol,1.0当量)的10％碳酸钠(10mL)溶液加入1-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮(2.3g,6.5mmol,1.0当量)的DME(10mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物整夜。浓缩反应混合物到较小的体积，用乙醚清洗二次。用浓盐酸酸化水层到pH<2，用10％甲醇90％二氯甲烷溶液萃取三次。将有机物合并，用1M盐酸与盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，真空浓缩，得到作为白色固体的#124(2.2g,98％)。LC-MS(方案Q1):m/z362.0[M+Na⁺]保留时间＝0.89分钟。

步骤2.合成N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-2,2-二甲基丙酰基)-L-缬氨酰基](甲基)氨基}-3-甲氧基-5-甲基庚酰基]吡咯烷-2-基}-3-甲氧基-2-甲基丙酰基]-L-苯丙氨酸甲酯(#125)。先加入#124(107mg,0.316mmol,1.00当量)然后加入Hunig碱(0.167mL,0.948mmol,3.00当量)与HATU(149mg,0.379mmol,1.20当量)到搅拌的#114(200mg,0.316mmol,1.00当量)的二氯甲烷(2mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物～12小时。浓缩反应混合物到较小的体积，将其置于乙酸乙酯(10mL)中，用1M盐酸(5mL)清洗二次并用盐水(5mL)清洗一次。在硫酸钠上干燥有机层并轻轻倒出。真空浓缩有机物，将粗制物置于二氯甲烷中。过滤出沉淀物。真空浓缩有机层，通过硅胶色谱法(梯度：0％到50％丙酮/庚烷)纯化残留物，得到作为白色固体的#125(235mg,78％)。LC-MS(方案Q):m/z954.2[M+H⁺]保留时间＝2.28分钟。

步骤3.合成N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-氨基-2,2-二甲基丙酰基)-L-缬氨酰基](甲基)氨基}-3-甲氧基-5-甲基庚酰基]吡咯烷-2-基}-3-甲氧基-2-甲基丙酰基]-L-苯丙氨酸甲酯(#126)。将二乙胺(1mL,10mM,40.6当量)加入搅拌的#125(235mg,0.246mmol,1.00当量)的THF(2mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物3小时。真空浓缩反应混合物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到30％甲醇/乙酸乙酯)纯化残留物，得到作为白色固体的#126(101mg,56％)。LC-MS(方案Q):m/z732.2[M+H⁺]保留时间＝1.32分钟。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.51(dd),8.28(d),7.15-7.29(m),5.77(s),4.55-4.77(m),4.44-4.54(m),3.94-4.10(m),3.73-3.79(m),3.66(d),3.49-3.60(m),3.40-3.48(m),3.10-3.36(m),3.00-3.09(m),2.83-2.98(m),2.57-2.77(m),2.19-2.46(m),1.87-2.14(m),1.61-1.86(m),1.36-1.55(m),1.23-1.36(m),1.12-1.22(m),0.97-1.11(m),0.82-0.96(m),0.73-0.81(m)。

制备N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#130)。

步骤1.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-叔丁氧基-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#127)。在氮气下先加入二氯甲烷(50mL)然后加入HATU(3.6g,9.4mmol,1.2当量)与Hunig碱(5.5mL,32mmol,4.0当量)到含有#6(4.7g,7.9mmol,1.0当量)与N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酸(3.2g,9.4mmol,1.2当量)及搅拌棒的圆底烧瓶中。在室温搅拌反应混合物～12小时。浓缩反应混合物到较小的体积，将其置于乙酸乙酯中，用1N盐酸与盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机物，过滤，在硅胶上浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到30％丙酮/庚烷)纯化残留物，得到作为白色固体的#127(4.2g,78％)。LC-MS(方案Q):m/z680.2[M+H⁺]保留时间＝2.52分钟。

步骤2.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(2R,3S,4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#128)。在氮气下将TFA(7mL,90mmol,10当量)加入搅拌的#127(4.2g,6.1mmol,1.0当量)的二氯甲烷(21mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物～4小时。真空浓缩反应混合物，和庚烷共沸一次，放置于高度真空下，得到作为浅黄白色固体的#128(3.8g,定量)。LC-MS(方案Q):m/z624.2[M+H⁺]保留时间＝2.01分钟。

步骤3.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#129)。先加入#121(2.4g,3.1mmol,1.0当量)然后加入HATU(1.29g,3.39mmol,1.1当量)然后加入Hunig碱(2.2mL,12.3mmol,4.0当量)到搅拌的#128(1.67g,3.1mmol,1.0当量)的二氯甲烷(20)与DMF(2mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物～2小时。浓缩反应混合物，用乙酸乙酯稀释，用0.5N盐酸与盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机物，在硅胶上浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到50％丙酮/庚烷)纯化残留物，得到作为白色固体的#129(1.9g,62％)。LC-MS(方案Q):m/z996.3[M+H⁺]保留时间＝2.53分钟。

步骤4.合成N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#130)。将二乙胺(4mL,40mmol,50当量)加入搅拌的#129(823mg,0.826mmol,1.00当量)的二氯甲烷(15mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物～14.5小时。真空浓缩反应混合物，与庚烷共沸一次。用二氯甲烷与少量甲醇稀释残留物，在硅胶上浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到20％甲醇/乙酸乙酯)纯化残留物，得到作为白色固体的#130(518mg,81％)。LC-MS(方案Q):m/z774.3[M+H⁺]保留时间＝1.48分钟。HPLC(方案A在25℃):m/z774.5[M+H⁺],保留时间＝7.733分钟(纯度>98％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.36(d).8.14(d),7.81(t),7.14-7.25(m),7.01-7.07(m),4.87-4.94(m),4.78-4.85(m,),4.67-4.76(m),4.46-4.65(m),4.29-4.40(m),3.93-4.03(m),3.70-3.81(m),3.49-3.60(m),3.38-3.47(m),3.29-3.36(m),3.15-3.28(m),2.98-3.13(m),2.94(br s),2.74-2.89(m),2.64-2.69(m),2.18-2.45(m),2.02-2.14(m),1.90-2.01(m),1.62-1.87(m),1.40-1.55(m),1.37(d),1.20-1.33(m),1.16(d),1.01-1.10(m),0.90-0.98(m),0.82-0.89(m),0.69-0.79(m)。

制备2-甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#131)。

步骤1.合成2-甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#131)。先加入HATU(118mg,0.311mmol,1.2当量)然后加入Hunig碱(0.180mL,1.04mmol,4当量)到搅拌的#114(164mg,0.259mmol,1.0当量)与1-(叔丁氧羰基)-2-甲基-D-脯氨酸(71.3mg,0.311mmol,1.2当量)的二氯甲烷(4mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物～30分钟。浓缩反应混合物。将反应混合物置于二氯甲烷(3.5mL)中并放置于氮气下。将TFA(1.5mL,20mmol,76当量)加入搅拌的溶液中。在室温搅拌反应混合物～1小时。浓缩反应混合物并放置于高度真空下。由方法J*纯化，得到作为白色固体的#131(119mg,54％)。HPLC(方案A在45℃):m/z744.5[M+H⁺],保留时间＝7.342分钟(纯度>98％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ9.08-9.18(m),8.79-8.89(m),8.76(t),8.54(d),8.29(d),7.14-7.31(m),4.70-4.79(m),4.57-4.66(m),4.45-4.55(m),3.96-4.04(m),3.74-3.80,3.66(d),3.48-3.61(m),3.40-3.48(m),3.09-3.34(m),3.00-3.09(m),2.95-3.00(m),2.83-2.93(m),2.36-2.53(m),2.21-2.35(m),2.10-2.19(m),1.99-2.10(m),1.61-1.09(m),1.36-1.53(m),1.21-1.35(m),1.02-1.10(m),0.94-1.0(m),0.86-0.93(m),0.73-0.82(m)。

制备2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#134)。

步骤1.合成N～2～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#132)。先加入二氯甲烷(10mL)然后加入Hunig碱(1.15mL,6.52mmol,3.0当量)、HATU(1.02g,2.61mmol,1.2当量)与#110(0.776g,2.17mmol,1.0当量)到含有#@5(1.14g,2.17mmol,1.0当量)的烧瓶中。在室温搅拌反应混合物30分钟，真空浓缩。将粗制物置于乙酸乙酯(50mL)中，用1M盐酸(25mL)清洗二次并用盐水(25mL)清洗一次。在硫酸钠上干燥有机物并轻轻倒出。真空浓缩有机物，置于二氯甲烷(30mL)中，过滤出所得沉淀物。真空浓缩有机物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到50％丙酮/庚烷)纯化残留物，得到作为固体的#132(1.33g,81％)。LC-MS(方案Q):m/z849.2[M+Na⁺]保留时间＝2.19分钟。

步骤2.合成N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#133)。将二乙胺(5mL,50mM,31.3当量)加入搅拌的#132(1.33g,1.60mmol,1.0当量)的THF(10mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物4小时。真空浓缩反应混合物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到30％甲醇/乙酸乙酯)纯化残留物，得到作为白色固体的#133(418mg,43％)。LC-MS(方案Q1):m/z605.2[M+H⁺]保留时间＝1.48分钟。

步骤3.合成2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#134)。在氮气下将HATU(151mg,0.398mmol,1.2当量)、#133(201mg,0.332mmol,1.0当量)与1-(叔丁氧羰基)-2-甲基-L-脯氨酸(91.3mg,0.398mM,1.2当量)加入含有搅拌棒的圆底烧瓶中混合。加入二氯甲烷(5mL)，然后加入Hunig碱(0.231mL,1.33mmol,4.0当量)。在室温搅拌反应混合物～15小时。真空浓缩反应混合物并放置于高度真空下。将二噁烷(4mL)加入残留物中，然后加入4M盐酸/二噁烷(4mL,20mmol,50当量)。在室温搅拌反应混合物1小时。真空浓缩反应混合物，通过中压反相C18色谱法(梯度：5％到90％乙腈/水，各相含有0.02％TFA)纯化残留物，得到作为白色固体的#134(237mg,86％)。LC-MS(方案Q):m/z716.3[M+H⁺],保留时间＝1.16分钟；HPLC(方案A在45℃):/z716.5[M+H⁺],保留时间＝6.930分钟(纯度>98％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),9.12-9.21(m),8.79-8.90(m),8.70-8.78(m),7.95(d),7.64(d),7.25-7.36(m),7.16-7.23(m),4.74-4.80(m),4.61-4.69(m),4.41-4.59(m),3.91-4.06(m),3.78(dd),3.54-3.64(m),3.45-3.51(m),3.17-3.36(m),3.02-3.15(m),3.00(br s),2.40-2.48(m),2.24-2.35(m),1.91-2.21(m),。1.68-1.90(m),1.61-1.68(m),1.48-1.59(m),1.22-1.35(m),0.97-1.09(m),0.84-0.97(m),0.74-0.83(m)。

制备N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-(甲氨基)-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#140)，N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-2-氨基-1-苄基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#141)，N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-氧代-2-(丙氨基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#142)，N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-(二乙氨基)-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#143)和N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-(叔丁氨基)-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#144)。

步骤1.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代-1-(五氟苯氧基)庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#135)。将3,3,3-三氟丙酸五氟苯酯(2.44mL,13.4mmol,2.0当量)加入#128(4.18g,6.70mmol,1.0当量)的二氯甲烷(50mL)溶液中，然后加入吡啶(1.61mL,20.1mmol,3.0当量)。在室温搅拌反应混合物～12小时。真空浓缩反应混合物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到70％丙酮/庚烷)纯化残留物，得到作为白色泡沫的#135(5.2g,98％)。LC-MS(方案Q1):m/z812.1[M+Na⁺]保留时间＝1.24分钟。

步骤2.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#136)。将#11(2.31g,8.05mmol,1.2当量)加入搅拌的4M盐酸的二噁烷溶液(10mL,25mmol,3.7当量)与二噁烷(10mL)的混合物中。在室温搅拌反应混合物6小时。真空浓缩反应混合物得到黄色胶体。将#135(5.3g,6.7mmol,1.0当量)的二氯甲烷(30mL)溶液加入前面的残留物中，然后加入Hunig碱(3.5mL,20mmol,3当量)。在室温搅拌反应混合物4小时。用二氯甲烷稀释反应混合物，依序用1％盐酸与盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，真空浓缩，通过硅胶色谱法(梯度：20％到50％乙酸乙酯/庚烷，然后93％乙酸乙酯6.6％甲醇与0.4％乙酸)纯化残留物，得到作为灰白色固体的#136(4.87g,92％)。LC-MS(方案Q1):m/z793.3[M+H⁺]保留时间＝1.07分钟。

步骤3.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(五氟苯氧基)丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#137)。将3,3,3-三氟丙酸五氟苯酯(1.3mL,7.1mmol,2.0当量)加入#136(2.8g,3.5mmol,1.0当量)的二氯甲烷(30mL)溶液中，然后加入吡啶(0.85mL,10.6mM)。在室温搅拌反应混合物2小时。真空浓缩反应混合物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到70％丙酮/庚烷)纯化残留物，得到作为白色粉末的#137(3.1g,92％)。LC-MS(方案Q1):m/z959.2[M+H⁺]保留时间＝1.28分钟。

步骤4.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#138)。先加入L-苯丙氨酸(84.9mg,0.514mmol,1.0当量)然后加入Hunig碱(0.27mL,1.54mmol,3.0当量)到搅拌的#137(493mg,0.514mmol,1.0当量)的DMF(4mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物～12小时。真空浓缩反应混合物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化残留物，得到作为白色泡沫的#138(200mg,41％)。LC-MS(方案Q1):m/z940.3[M+H⁺]保留时间＝1.08分钟。

步骤5.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2S)-1-氧代-1-(五氟苯氧基)-3-苯基丙-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#139)。先加入3,3,3-三氟丙酸五氟苯酯(126mg,0.426mM,2.0当量)然后加入吡啶(0.051mL,0.64mmol,3.0当量)到搅拌的#138(200mg,0.213mmol,1.0当量)的二氯甲烷(5mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物～12小时。真空浓缩反应混合物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化残留物，得到作为黄色油的#139(174mg,74％)。LC-MS(方案Q1):m/z1128[M+Na⁺]保留时间＝1.23分钟。

步骤6A.合成N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-(甲氨基)-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#140)。将甲胺(1M在THF中的溶液,0.18mL,0.18mmol,10当量)加入搅拌的#139(20mg,0.018mmol,1.0当量)的THF(1mL)溶液中，在室温搅拌混合物3小时。浓缩反应混合物，用DMSO稀释，按照方法J*纯化。收集流份，真空浓缩，得到作为白色固体的#140(4.0mg,30％)。LC-MS(方案Q1):m/z731.2[M+H⁺],保留时间＝0.70分钟。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄),7.30-7.41(m),4.71-4.78(m),4.58-4.69(m),4.04-4.15(m),3.86-3.98(m),3.73-3.78(m),3.61-3.70(m),3.50-3.58(m),3.32-3.47(m),3.23-3.26(m),3.17-3.22(m),3.07-3.15(m),2.95-2.98(m),2.76-2.91(m),2.68-2.75(m),2.63-2.66(m),2.43-2.51(m),2.22-2.28(m),1.99-2.11(m),1.74-1.96(m),1.21-1.31(m),1.17-1.20(m),0.92-1.10(m),0.79-0.89(m)。

步骤6B.合成N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-2-氨基-1-苄基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#141)。按照与#140相同的步骤，用#139(20mg,0.018mmol,1.0当量)与氨溶液(7M在甲醇中的溶液,0.026mL,0.18mmol,10当量)并按照方法J*纯化，得到作为白色固体的#141(3.0mg,20％)。LC-MS(方案Q):m/z717.2[M+H⁺],保留时间＝0.79分钟。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄),7.22-7.30(m),7.14-7.21(m),4.57-4.4.80(m),4.02-4.17(m),3.92-3.98(m),3.84-3.91(m),3.32-3.74(m),3.17-3.27(m),3.06-3.14(m),2.77-3.05(m),2.65(s),2.43-2.51(m),2.21-2.26(m),1.98-2.13(m),1.70-1.94(m),1.32-1.69(m),1.16-1.31(m),0.89-1.13(m),0.80-0.88(m)。

步骤6C.合成N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-氧代-2-(丙氨基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#142)。按照与#140相同的步骤，用#139(20mg,0.018mmol,1.0当量)与正丙胺(1M在THF中的溶液,0.18mL,0.18mmol,10当量)并按照方法J*纯化，得到作为白色固体的#142(3.0mg,20％)。LC-MS(方案Q):m/z759.2[M+H⁺],保留时间＝0.74分钟。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄),7.15-7.29(m),4.71-4.79(m),4.52-4.68(m),4.04-4.17(m),3.87-3.99(m),3.73-3.99(m),3.73-3.79(m),3.50-3.70(m),3.34-3.49(m),3.06-3.23(m),2.79-2.99(m),2.44-2.50(m),2.28-2.43(m),2.22-2.27(m),1.75-2.10(m),1.34-1.61(m),1.16-1.29(m),0.92-1.10(m),0.77-0.89(m)。

步骤6D.合成N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-(二乙氨基)-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#143)。按照与#140相同的步骤，用#139(20mg,0.018mmol,1.0当量)与二乙胺(1M在THF中的溶液,0.18mL,0.18mmol,10当量)并按照方法J*纯化，得到作为白色固体的#143(4.0mg,30％)。LC-MS(方案Q):m/z773.3[M+H⁺],保留时间＝0.77分钟。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄),7.16-7.33(m),5.10-5.17(m),4.96-5.07(m),4.68-4.75(m),4.60-4.65(m),3.61-4.23(m),3.35-3.67(m),3.16-3.26(m),2.99-3.15(m),2.78-2.94(m),2.30-2.52(m),2.19-2.28(m),1.73-2.13(m),1.83-1.45(m),1.19-1.31(m),0.92-1.18(m),0.80-0.89(m)。

步骤6E.合成N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-(叔丁氨基)-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#144)。按照与#140相同的步骤，用#139(20mg,0.018mmol,1.0当量)与叔丁胺(1M溶剂是THF的溶液,0.18mL,0.18mmol,10当量)并按照方法J*纯化，得到作为白色固体的#144(3.4mg,24％)。LC-MS(方案Q1):m/z773.3[M+H⁺],保留时间＝0.74分钟。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.21(d),8.03-7.98(m),7.92(d),7.81-7.62(m),7.46-7.16(m),4.83-4.69(m),4.68-4.56(m),4.21-4.07(m),3.92-3.86(m),3.83-3.80(m),3.74-3.65(m),3.60-3.48(m),3.47-3.36(m),3.28-3.13(m),3.11-3.01(m),2.96-2.82(m),2.69-2.62(m),2.54-2.43(m),2.38-2.12(m),2.00-1.76(m),1.69-1.161(m),1.60-1.53(m),1.52-0.98(m),0.94-0.86(m)。

制备N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#145)。

步骤1.合成N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1R,2S)-2-羟基-1-甲基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#145)。先加入(1S,2R)-2-氨基-1-苯基丙-1-醇(54.8mg,0.344mmol,1.1当量)然后加入Hunig碱(0.164mL,0.939mmol,3.0当量)到搅拌的#137(300mg,0.313mmol,1.0当量)的DMF(3mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物～12小时。加入20％哌啶的DMF溶液(1mL,2.2mmol,7.0当量)，在室温搅拌反应混合物2小时。按照方法J*纯化，然后经合适的试验管浓缩，得到作为白色粉末的#145(190mg,74％)。LC-MS(方案Q):m/z704.3[M+H⁺],保留时间＝0.67分钟。¹H NMR(400MHz,CD₃OD),δ7.97(d),7.73(d),7.37-7.41(m),7.27-7.36(m),7.19-7.25(m),4.70-4.75(m),4.58-4.63(m),4.49-4.54(m),4.14-4.30(m),4.04-4.11(m),3.87(dd),3.63-3.77(m),3.51-3.58(m),3.46-3.49(m),3.38-3.43(m),3.25-3.37(m),3.15-3.23(m),3.11-3.14(m),3.01-3.02(m),2.59-2.64(m),2.52-2.55(m),2.44-2.52(m),2.41-2.43(m),2.07-2.26(m),1.73-2.0(m),1.65-1.73(m),1.59-1.65(m),1.51-1.59(m),1.32-1.46(m),1.23-1.26(m),1.08-1.21(m),0.94-1.07(m),0.83-0.92(m)。

制备3-甲基-D-异缬氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#146)，3-甲基-L-异缬氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#147)，L-异缬氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#148)，和D-异缬氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#149)。

步骤1A.合成3-甲基-D-异缬氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#146)。将#114(225mg,0.356mmol,1.0当量)的二氯甲烷(2mL)溶液加入N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-3-甲基-D-异缬氨酸(126mg,0.356mmol,1.0当量)的二氯甲烷(4mL)溶液中。依序加入Hunig碱(0.188mL,1.07mmol,3.0当量)与HATU(167mg,0.427mmol,1.2当量)。在室温搅拌反应混合物12小时。真空浓缩反应混合物，然后置于乙酸乙酯中，用1M盐酸清洗二次并用盐水清洗一次。在硫酸钠上干燥有机层并轻轻倒出。在genevac中除去有机溶剂。依序加入THF(4mL)与二乙胺(2mL,19mmol,53.4当量)。搅拌反应混合物～12小时。用genevac浓缩反应混合物，然后进行硅胶色谱法(梯度：0％到30％甲醇/乙酸乙酯)，得到作为固体的#146(183mg,69％)。LC-MS(方案Q):m/z746.4[M+H⁺]保留时间＝1.37分钟。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.55(d),8.26-8.36(m),7.88-8.03(m),7.81(d),7.41-7.53(m),7.13-7.30(m),7.01(s),4.71-4.79(m),4.44-4.70(m),3.96-4.04(m),3.70-3.80(m),3.62-3.69(m),3.40-3.61(m),2.76-3.35(m),2.67-2.71(m),2.56-2.58(m),2.06-2.46(m),1.61-1.90(m),1.14-1.54(m),0.72-1.12(m)。

步骤1B.合成3-甲基-L-异缬氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#147)。将#114(224mg,0.354mmol,1.0当量)的二氯甲烷(2mL)溶液加入N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-3-甲基-L-异缬氨酸(125mg,0.354mmol,1.0当量)的二氯甲烷(4mL)溶液中。依序加入Hunig碱(0.187mL,1.06mmol,3.0当量)与HATU(167mg,0.425mmol,1.2当量)。在室温搅拌反应混合物12小时。真空浓缩反应混合物，然后置于乙酸乙酯中，用1M盐酸清洗二次并用盐水清洗一次。在硫酸钠上干燥有机层并轻轻倒出。在genevac中除去有机溶剂。依序加入THF(4mL)与二乙胺(2mL,19mmol,53.7当量)。搅拌反应混合物～12小时。在genevac中浓缩反应混合物，然后进行硅胶色谱法(梯度：0％到30％甲醇/乙酸乙酯)，得到作为固体的#147(216mg,82％)。LC-MS(方案Q):m/z746.6[M+H⁺]保留时间＝1.29分钟。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.56(m),8.31-8.39(m),8.50(d),8.30(br d),7.87-8.01(m),7.80(d),7.40-7.53(m),7.14-7.30(m),4.45-4.78(m),3.94-4.04(m),3.70-3.79(m),3.61-3.69(m),3.42-3.59(m),2.97-3.37(m),2.80-2.92(m),2.32-2.49(m),2.05-2.30(m),1.61-1.89(m),1.37-1.56(m),1.14-1.135(m),0.70-1.11(m)。

步骤1C.合成L-异缬氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#148)。将#114(447mg,0.707mmol,1.0当量)的二氯甲烷(2mL)溶液加入N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-异缬氨酸(240mg,0.707mmol,1.0当量)的二氯甲烷(4mL)溶液中。依序加入Hunig碱(0.373mL,2.12mmol,3.0当量)与HATU(332mg,0.425mmol,1.2当量)。在室温搅拌反应混合物12小时。真空浓缩反应混合物，然后置于乙酸乙酯中，用1M盐酸清洗二次并用盐水清洗一次。在硫酸钠上干燥有机层并轻轻倒出。在genevac中除去有机溶剂。依序加入THF(4mL)与二乙胺(2mL,19mmol,26.9当量)。搅拌反应混合物～12小时。在genevac中浓缩反应混合物，然后进行硅胶色谱法(梯度：0％到30％甲醇/乙酸乙酯)，得到作为固体的#148(182mg,35％)。LC-MS(方案Q1):m/z732.3[M+H⁺]保留时间＝0.71分钟。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.56(d),8.46-8.52(m),8.30(d),8.02-8.15(m),7.98(d),7.80(d),7.40-7.53(m),7.15-7.30(m),4.70-4.80(m),4.44-4.69(m),3.96-4.05(m),3.70-3.79(m),3.62-3.69(m),3.41-3.59(m),2.99-3.35(m),2.31-2.95(m),2.67-2.71(m),2.55-2.59(m),2.32-2.48(m),2.20-2.31(m),1.97-2.19(m),1.61-1.88(m),1.37-1.56(m),1.20-1.34(m),1.14-1.19(m),1.02-1.11(m),0.97-1.01(m),0.86-0.96(m),0.71-0.83(m)。

步骤1D.合成D-异缬氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-苄基-2-甲氧基-2-氧代乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#149)。将#114(447mg,0.707mmol,1.0当量)的二氯甲烷(2mL)溶液加入N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-D-异缬氨酸(240mg,0.707mmol,1.0当量)的二氯甲烷(4mL)溶液中。依序加入Hunig碱(0.373mL,2.12mmol,3当量)与HATU(332mg,0.425mmol,1.2当量)。在室温搅拌反应混合物12小时。真空浓缩反应混合物，然后置于乙酸乙酯中，用1M盐酸清洗二次并用盐水清洗一次。在硫酸钠上干燥有机层并轻轻倒出。在genevac中除去有机溶剂。依序加入THF(4mL)与二乙胺(2mL,19mmol,26.9当量)。搅拌反应混合物～12小时。在genevac中浓缩反应混合物，然后进行硅胶色谱法(梯度：0％到30％甲醇/乙酸乙酯)，得到作为固体的#149(154mg,30％)。LC-MS(方案Q):m/z732.0[M+H⁺]保留时间＝1.24分钟。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.55(d),8.38-8.46(m),8.29(d),8.03-8.14(m),7.97(d),7.81(d),7.40-7.53(m),7.14-7.28(m),7.02(s),4.71-4.79(m),4.43-4.69(m),3.96-4.05(m),3.71-3.80(m),3.62-3.70(m),3.49-3.60(m),3.40-3.48(m),3.15-3.34(m),3.10-3.14(m),3.01-3.09(m),2.94-3.00(m),2.83-2.93(m),2.65-2.71(m),2.55-2.59(m),2.32-2.48(m),2.04-2.31(m),1.61-1.89(m),1.37-1.52(m),1.21-1.35(m),1.15-1.20(m),1.02-1.10(m),0.75-1.01(m)。

制备1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#151)。

步骤1.合成1,2-二甲基-L-脯氨酸(#150)。将含有2-甲基-L-脯氨酸(1.0g,7.7mmol,1.0当量)、甲醇(40mL)、37wt％甲醛/水(2.1mL,77mmol,10当量)、10wt％钯碳(313mg,2.94mmol,0.38当量)的Parr烧瓶置于Parr振摇器上，在40psi氢气下摇动～12小时。除去氢，通过硅藻土垫过滤反应混合物，用50％甲醇50％二氯甲烷溶液清洗。真空浓缩残留物，得到作为略带黑色的白色固体的#150(1.1g,100％)。LC-MS(方案Q):m/z144.0[M+H⁺]保留时间＝0.17分钟。

步骤2.合成1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#151)。将Hunig碱(0.14mL,0.80mmol,4.1当量)加入搅拌的#114(125mg,0.198mmol,1.0当量)、#150(37mg,0.26mmol,1.3当量)与HATU(98mg,0.26mmol,1.3当量)与二氯甲烷(5mL)的混合物中。在室温搅拌反应混合物1小时。真空浓缩反应混合物。将THF(6mL)加入粗制物中。将氢氧化锂(14mg,0.59mmol,3.0当量)的水(2mL)溶液加入搅拌的混合物中。在室温搅拌反应混合物90分钟。真空浓缩反应混合物，通过中压反相C18色谱法(梯度：5％到40％乙腈/水，各相含有0.02％TFA)纯化残留物，得到作为白色固体的#151(147mg,69％)。LC-MS(方案Q):m/z744.3[M+H⁺],保留时间＝1.19分钟；HPLC(方案A在45℃):m/z744.4[M+H⁺],保留时间＝6.631分钟(纯度>98％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ9.57-9.71(m),8.75(d),8.42(d),8.15(d),7.14-7.29(m),4.70-4.79(m),4.40-4.68(m),3.95-4.03(m),3.73-3.80(m),3.37-3.61(m),2.97-3.31(m),2.79-2.88(m),2.66-2.76(m),2.54-2.58(m),2.31-2.43(m),1.94-2.29(m),1.57-1.91(m),1.21-1.52(m),0.85-1.10(m),0.74-0.82(m)。

制备1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#153)。

步骤1.合成1,2-二甲基-D-脯氨酸(#152)。将10wt％钯碳(108mg,0.304mmol,0.304当量)加入含有2-甲基-D-脯氨酸(432mg,3.34mmol,1.0当量)、37wt％甲醛/水(1.0mL,37mM,11当量)、甲醇(3.5mL)与水(1mL)的Parr烧瓶中。将Parr烧瓶置于Parr振摇器上，在30psi氢气下摇动～48小时。除去氢，通过硅藻土垫清洗反应混合物，用甲醇清洗。真空浓缩有机物，然后与甲苯共沸，得到作为固体的#152(517mg,100％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄):δ[3.61-3.56(m,1H),3.07-2.96(m,1H),2.68(br s,3H),2.34-2.22(m,1H),2.01-1.88(m,1H),1.87-1.73(m,1H),1.40(br s,3H)]。

步骤2.合成1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#153)。将Hunig碱(0.27mL,4.1mM,4.1当量)加入搅拌的#114(240mg,0.379mmol,1.0当量)、#152(71mg,0.49mmol,1.3当量)与HATU(188mg,0.49mmol,1.3当量)在二氯甲烷(10mL)中的混合物中。在室温搅拌反应混合物1小时。真空浓缩反应混合物。将THF(6mL)加入粗制物中。将氢氧化锂(36mg,1.5mmol,4当量)的水(2mL)溶液加入此搅拌的混合物中。在室温搅拌反应混合物1小时。真空浓缩反应混合物，通过中压反相C18色谱法(梯度：5％到40％乙腈/水，各相含有0.02％TFA)纯化残留物，得到作为白色固体的#153(220mg,78％)。LC-MS(方案Q):m/z744.8[M+H⁺],保留时间＝1.16分钟；HPLC(方案A在45℃):/z744.4[M+H⁺],保留时间＝6.713分钟(纯度>98％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ9.72-9.85(m),8.65(t),8.41(d),8.14(d),7.14-7.28(m),4.69-4.79(m),4.38-4.53(m),3.95-4.04(m),3.73-3.79(m),3.37-3.62(m),3.13-3.33(m),2.95-3.10(m),2.79-2.89(m),2.67-2.75(m),2.00-2.46(m),1.61-1.90(m),1.22-1.54(m),1.02-1.09(m),0.95-1.01(m),0.85-0.94(m),0.75-0.83(m)。

制备N～2～-[2,2-二甲基-3-(甲氨基)丙酰基]-N-{(1S,2R)-2-甲氧基-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#154)。

步骤1.合成N～2～-[2,2-二甲基-3-(甲氨基)丙酰基]-N-{(1S,2R)-2-甲氧基-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#154)。先加入2,2-二甲基-3-(甲氨基)丙酸(36mg,0.152mmol,1.0当量)然后加入Hunig碱(0.080mL,0.456mmol,3.0当量)与HATU(66mg,0.17mmol,1.1当量)到含有#50(100mg,0.152mmol,1.0当量)与二氯甲烷(1mL)的小药瓶中。在室温搅拌反应混合物1小时。真空浓缩反应混合物，然后置于乙酸乙酯中，用1M盐酸清洗二次并用盐水清洗一次。在硫酸钠上干燥有机层并轻轻倒出。真空浓缩反应混合物。依序加入二噁烷(1mL)与4M盐酸/二噁烷(1.0mL,4.0mmol,26当量)。在室温搅拌反应混合物～12小时。真空浓缩反应混合物。通过中压反相C18色谱法(梯度：10％到100％乙腈/水，各相含有0.02％TFA)纯化粗制物，得到作为固体的#154(55.8mg,41％)。LC-MS(方案Q):m/z771.8[M+H⁺]。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.70(d),8.45(d),7.90-8.15(m),7.82(d),7.75(d),7.55(dd),7.40(dd),6.90-7.10(m),5.10-5.30(m),4.45-4.55(b),4.30-4.45(m),4.20-4.30(m),3.75-3.90(m),3.50-3.60(m),3.15-3.40(m),3.05-3.15(m),2.85-3.05(m),2.60-2.85(m),2.25-2.40(m),1.80-2.25(m),1.70-1.80(m),1.20-1.60(m),0.80-1.10(m),0.05-0.80(m)。

制备N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[2,2-二甲基-3-(甲氨基)丙酰基]-L-缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯三氟乙酸盐(#155)。

步骤1.合成N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[2,2-二甲基-3-(甲氨基)丙酰基]-L-缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯三氟乙酸盐(#155)。先加入2,2-二甲基-3-(甲氨基)丙酸(36.1mg,0.152mmol,1.0当量)然后加入Hunig碱(0.080mL,0.456mmol,3.0当量)与HATU(66mg,0.17mmol,1.1当量)到含有#114(96.2mg,0.152mmol,1.0当量)与二氯甲烷(1mL)的小药瓶中。在室温搅拌反应混合物1小时。真空浓缩反应混合物，然后置于乙酸乙酯中，用1M盐酸清洗二次并用盐水清洗一次。在硫酸钠上干燥有机层并轻轻倒出。真空浓缩反应混合物。依序加入二噁烷(1mL)与4M盐酸/二噁烷(1.0mL,4.0mmol,26当量)。在室温搅拌反应混合物～12小时。真空浓缩反应混合物。通过中压反相C18色谱法(梯度：10％到100％乙腈/水，各相含有0.02％TFA)纯化粗制物，得到#155(22.2mg,17％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.55(d),8.22(d),8.15-8.35(m),7.90-8.05(m)7.10-7.25(m)4.70-4.80(m),4.55-4.65(m),4.45-4.52(m),3.93-4.00(m),3.72-3.78(m),3.60-3.70(m),3.50-3.60(m),3.40-3.50(m),2.80-3.30(m),2.45-2.60(m),2.00-2.45(m),1.60-1.80(m),1.35-1.50(m),1.10-1.35(m)。

制备N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(N-{[(2S)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯三氟乙酸盐(#158)和N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(N-{[(2R)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯三氟乙酸盐(#159)

步骤1.合成(2S)-1-(叔丁氧羰基)-2-甲基哌啶-2-羧酸(#156)和(2R)-1-(叔丁氧羰基)-2-甲基哌啶-2-羧酸(#157)。通过超临界流体色谱法(柱：Chiralcel OJ-H,250x21mm；洗脱液：90:10二氧化碳/乙醇；流速：65g/分钟)分离1-(叔丁氧羰基)-2-甲基哌啶-2-羧酸(500mg,2.06mmol,1当量)，得到相应的单一异构体。分离第一个洗脱峰(保留时间：1.57分钟)得到作为胶的#156(140mg,28％)(立体化学被任意指定为S单一异构体)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ3.83-3.90(m,1H),2.93-3.01(m,1H),1.87-1.97(m,1H),1.67-1.77(m,3H),1.48-1.66(m,2H),1.46(s,3H),1.44(s,9H)。旋光度:[α]_D25-21.7°(c0.40,三氯甲烷)。分离第两个洗脱峰(保留时间：2.22分钟)得到作为油的#157(255mg,51％)(立体化学被任意指定为R单一异构体)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ3.83-3.90(m,1H),2.93-3.01(m,1H),1.87-1.97(m,1H),1.67-1.77(m,3H),1.48-1.66(m,2H),1.46(s,3H),1.44(s,9H)。旋光度:[α]_D25+30.2°(三氯甲烷)。

步骤2A.合成N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(N-{[(2S)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯三氟乙酸盐(#158)。先加入N,N-二异丙基乙胺(0.018mL,0.102mmol,3当量)然后加入HATU(16.1mg,0.041mmol,1.2当量)到#156(8.3mg,0.034mmol,1当量)的二氯甲烷(0.3mL)与N,N-二甲基甲酰胺(0.05mL)溶液中。搅拌反应混合物15分钟，加入#114(23.4mg,0.037mmol,1.1当量)，在室温搅拌18小时。用二氯甲烷(2.5mL)稀释反应混合物，加入10％柠檬酸(1.5mL)。用相分离柱分离各层，用二氯甲烷(2x2.5mL)萃取水层，真空浓缩合并的有机层。用二氯甲烷(4mL)溶解残留物，加入三氟乙酸(0.5mL)。在室温搅拌反应混合物2小时，然后真空浓缩。通过反相色谱法纯化(方法M*)，得到#158(10.6mg,49％)。HPLC(方案T):m/z758.4[M+H⁺],保留时间＝2.53分钟(纯度>99％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.74-8.90(m),8.49-8.55(m),8.24(d),8.08-8.12(m),7.94-8.01(m),7.14-7.26(m),4.71-4.77(m),4.57-4.68(m),4.44-4.55(m),3.94-4.0(m),3.73-3.78(m),3.40-3.72(m),3.16-3.32(m),2.98-3.16(m),2.82-2.92(m),2.47-2.56(m),2.38-2.44(m),2.20-2.37(m),2.08-2.19(m)1.74-1.88(m),1.61-1.73(m),1.52-1.59(m),1.22-1.52(m),1.05(dd),0.94-1.00(m),0.85-0.93(m),0.74-0.79(m)。

步骤2B.合成N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(N-{[(2R)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯三氟乙酸盐(#159)。先加入N,N-二异丙基乙胺(0.017mL,0.096mmol,3当量)然后加入HATU(14.9mg,0.038mmol,1.2当量)到#157(7.8mg,0.032mmol,1当量)在二氯甲烷(0.3mL)与N,N-二甲基甲酰胺(0.05mL)中的溶液中。搅拌反应混合物15分钟，加入#114(22.1mg,0.035mmol,1.1当量)，在室温搅拌3小时，真空浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到80％丙酮/庚烷)纯化残留物，得到白色固体，用二噁烷(0.2mL)溶解，加入4N盐酸/二噁烷(0.2mL)。在室温搅拌反应混合物2小时，加入4N盐酸/二噁烷(0.1mL)。在室温搅拌反应混合物2小时，真空浓缩。通过反相色谱法纯化(方法M*)，得到#159(6.6mg,33％)。HPLC(方案T):m/z758.4[M+H⁺],保留时间＝2.46分钟(纯度＝89％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.86-8.95(m),8.75-8.84(m),8.48-8.54(m),8.33-8.45(m),8.22-8.27(m),8.17-8.19(m),7.99-8.12(m),7.83-7.91(m),7.13-7.29(m),7.04-7.08(m),4.69-4.76(m),4.55-4.66(m),4.45-4.53(m),3.96-4.01(m),3.41-3.78(m),3.28-3.33(m),3.24-3.27(m),3.16-3.23(m),3.11-3.15(m),3.02-3.10(m),2.93-3.02(m),2.91-2.93(m),2.84-2.91(m),2.76-2.82(m),2.69-2.71(m),2.60-2.63(m),2.53-2.55(m),2.47-2.53(m),2.40-2.46(m),2.30-2.38(m),2.20-2.30(m),2.06-2.17(m),1.75-1.87(m),1.52-1.74(m),1.35-1.51(m),1.14-1.34(m),1.01-1.08(m),0.92-1.0(m),0.85-0.94(m),0.74-0.82(m)。

制备N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(N-{[(2S)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸三氟乙酸盐(#162)和N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(N-{[(2R)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸三氟乙酸盐(#163)。

步骤1A.合成N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(2S)-1-(叔丁氧羰基)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基庚酰基}-L-苯丙氨酸甲酯(#160)。先加入二异丙基乙胺(0.228mL,1.31mmol,3当量)然后加入HATU(205mg,0.523mmol,1.2当量)到#156(106mg,0.436mmol,1当量)在二氯甲烷(3mL)与N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液中。搅拌反应混合物15分钟，加入#114(276mg,0.436mmol,1当量)，在室温搅拌2小时。用二氯甲烷(10mL)稀释反应混合物，用10％柠檬酸(3x5mL)清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩滤液。通过硅胶色谱法(梯度：0％到80％丙酮/庚烷)纯化残留物，得到#160(145mg,39％)。LC-MS(方案Q1):m/z858.8[M+H⁺],保留时间＝1.12分钟。

步骤1B.合成N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(2R)-1-(叔丁氧羰基)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯(#161)。先加入二异丙基乙胺(0.234mL,1.34mmol,3当量)然后加入HATU(205mg,0.538mmol,1.2当量)到#157(109mg,0.448mmol,1当量)在二氯甲烷(3mL)与N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液中。搅拌反应混合物15分钟，加入#114(284mg,0.448mmol,1当量)。在室温搅拌2小时，用二氯甲烷(10mL)稀释反应混合物，用10％柠檬酸(3x5mL)清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％丙酮/庚烷)纯化残留物，得到#161(185mg,48％)。LC-MS(方案Q):m/z858.3[M+H⁺],保留时间＝2.25分钟。

步骤2A.合成N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(N-{[(2S)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸三氟乙酸盐(#162)。将氢氧化锂(8mg,0.338mmol,2当量)的水(0.75mL)溶液加入#160(145mg,0.169mmol,1当量)的四氢呋喃(1.25mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物2小时，在真空中蒸发到干。用二氯甲烷(2.5mL)溶解残留物，加入三氟乙酸(1mL)。搅拌反应混合物30分钟，真空浓缩，通过中压反相C18色谱法(梯度：0％到100％乙腈/水，各相含有0.02％TFA)纯化，得到作为白色固体的标题化合物#162(145mg,定量)。HPLC(方案U):m/z744.5[M+H+],保留时间＝7.121分钟(纯度＝98％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)。δ8.76-8.96(m),8.52-8.58(m),8.38-8.43(m),8.11-8.16(m),7.27-7.30(m),7.12-7.27(m),7.01-7.05(m),4.71-4.79(m),4.48-4.67(m),4.39-4.47(m),3.79-4.22(m),3.71-3.78(m),3.38-3.57(m),3.22-3.30(m),3.14-3.23(m),3.07-3.13(m),2.96-3.06(m),2.76-2.87(m),2.66-2.68(m),2.47-2.57(m),2.42-2.44(m),2.06-2.40(m),1.73-1.89(m),1.51-1.72(m),1.36-1.49(m),1.20-1.35(m),1.00-1.09(m),0.95-0.99(m),0.83-0.94(m),0.73-0.80(m)。

步骤2B.合成N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(N-{[(2R)-2-甲基哌啶-2-基]羰基}-L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸三氟乙酸盐(#163)。用制备#162所述的操作把化合物#161(185mg,0.216mmol,1当量)转变成粗制的标题化合物#163。通过中压反相C18色谱法(梯度：0％到85％乙腈/水，各相含有0.02％TFA)纯化粗制物，得到作为白色固体的#163(127mg,68％)。HPLC(方案U):m/z744.5[M+H+],保留时间＝7.077分钟(纯度＝98％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)。δ8.79-8.99(m),8.36-8.49(m),8.12-8.17(m),7.31-7.34(m),7.11-7.27(m),7.05-7.09(m),4.71-4.77(m),4.54-4.68(m),4.40-4.53(m),3.88-4.39(m),3.71-3.77(m),3.39-3.58(m),3.22-3.32(m),3.10-3.22(m),3.04-3.09(m),2.92-3.03(m),2.77-2.88(m),2.68-2.71(m),2.47-2.57(m),2.43-2.45(m),2.30-2.42(m),2.03-2.29(m),1.74-1.88(m),1.52-1.73(m),1.37-1.51(m),1.17-1.37(m),1.00-1.07(m),0.95-0.99(m),0.84-0.93(m),0.73-0.81(m)。

制备N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯三氟乙酸盐(#172)和N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯三氟乙酸盐(#173)。

步骤1.合成(3R)-1-苄基-3-氟吡咯烷-3-羧酸甲酯(#164)和(3S)-1-苄基-3-氟吡咯烷-3-羧酸甲酯(#165)。通过超临界流体色谱法(柱：Chiralpak IC,250x21mm；洗脱液：95:5二氧化碳/丙醇；流速：65g/分钟)分离已知的1-苄基-3-氟吡咯烷-3-羧酸甲酯(3900mg,16.4mmol,1当量)，得到相应的单一异构体。分离第一个洗脱峰(保留时间：3.37分钟)得到单一异构体#164(1720mg,36％)(立体化学被任意指定为R单一异构体)。¹H NMR(400MHz,TMS-CDCl₃；δ7.17–7.30(m,5H),3.74(s,3H),3.65(d,J＝12.9Hz,1H),3.63(d,J＝12.9Hz,1H),2.86–3.03(m,3H),2.61(q,J＝8.0Hz,1H),2.34–2.46(m,1H),2.13-2.26(m,1H)。旋光度:[α]_D25+24.7°(三氯甲烷)。分离第两个洗脱峰(保留时间：3.91分钟)得到单一异构体#165(1600mg,33％)(立体化学被任意指定为S单一异构体)。1H NMR(400MHz,CDCl₃；(CH₃)₄Si),δ7.17–7.30(m,5H),3.74(s,3H),3.65(d,J＝12.9Hz,1H),3.63(d,J＝12.9Hz,1H),2.86–3.03(m,3H),2.61(q,J＝8.0Hz,1H),2.34–2.46(m,1H),2.13-2.26(m,1H)。旋光度:[α]_D25-23.3°(三氯甲烷)。

步骤2A.合成(3R)-3-氟吡咯烷-1,3-二羧酸1-叔丁酯3-甲酯(#166)。将10％钯碳(70mg)加入含有#164(355mg,1.50mmol,1当量)与碳酸二叔丁酯(400mg,1.8mmol,1.2当量)的甲醇(15.5mL)溶液中。在Parr振摇器中在45psi下使反应混合物氢化22小时，通过硅藻土过滤，真空浓缩滤液，通过硅胶色谱法(梯度：0％到30％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为透明油的#166(272mg,74％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃),δ3.87(s,3H),3.85-3.66(m,3H),3.56(m,1H),2.53-2.28(m,2H),1.51(s,9H)。

步骤2B.合成(3S)-3-氟吡咯烷-1,3-二羧酸1-叔丁酯3-甲酯(#167)。用前述制备#164的方法把化合物#165(362mg,1.53mmol,1当量)转变成#167(63％收率)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃),δ3.87(s,3H),3.85-3.66(m,3H),3.56(m,1H),2.53-2.28(m,2H),1.51(s,9H)。

步骤3A.合成(3R)-1-(叔丁氧羰基)-3-氟吡咯烷-3-羧酸(#168)。将氢氧化钠水溶液(2.5M,0.88mL)加入#166(272mg,1.10mmol,1当量)的甲醇(2.96mL)溶液中，在室温搅拌反应混合物3.5小时。用10％柠檬酸(5mL)使反应猝灭，加入乙酸乙酯(100mL)，将各层分离。用10％柠檬酸、水与盐水清洗有机层，在硫酸钠上干燥，过滤，真空浓缩，得到作为白色固体的#168(253mg,99％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃),δ3.96-3.69(m,3H),3.59(m,1H),2.59-2.33(m,2H),1.51(s,9H)。LC-MS(方案Q1):m/z232.1[M-H+],保留时间＝0.67分钟。手性HPLC保留时间:3.39分钟(纯度＝99％)。(柱:Chiralpak AD-H,4.6mm x25cm,流动相5-60％CO₂/甲醇,流速3.0mL/分钟)；旋光度:[α]_D254.8(c＝0.52,MeOH)。

步骤3B.合成(3S)-1-(叔丁氧羰基)-3-氟吡咯烷-3-羧酸(#169)。将氢氧化钠水溶液(2.5M,0.88mL)加入#167(238mg,0.963mmol,1当量)的甲醇(2.6mL)溶液中，在室温搅拌反应混合物3小时。用10％柠檬酸(5mL)使反应猝灭，加入乙酸乙酯(100mL)，将各层分离。用10％柠檬酸、水与盐水清洗有机层，在硫酸钠上干燥，过滤，真空浓缩，得到作为白色固体的#169(221mg,99％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃),δ3.96-3.69(m,3H),3.59(m,1H),2.59-2.33(m,2H),1.51(s,9H)。LC-MS(方案Q1):m/z232.1[M-H+],保留时间＝0.67分钟。手性HPLC保留时间:3.95分钟(纯度＝98％)(柱:ChiralpakAD-H,4.6mm x25cm,流动相5-60％CO₂/甲醇,流速3.0mL/分钟)；旋光度:[α]_D25-3.6(c＝0.55,MeOH)。

步骤4A.合成(3R)-1-(叔丁氧羰基)-3-氟吡咯烷-3-羧酸锂(#170)。将氢氧化锂(9.2mg,0.38mmol,1.8当量)的水(0.1mL)溶液加入#168(50mg,0.21mmol,1当量)的甲醇(0.2mL)溶液中。然后加入四氢呋喃(0.3mL)，在45℃下搅拌反应混合物18小时。真空浓缩反应混合物，将粗制物与甲苯(2mL)共沸三次，得到作为白色固体的#170(51mg,100％)，其不经进一步纯化即用于下一步。

步骤4B.合成(3S)-1-(叔丁氧羰基)-3-氟吡咯烷-3-羧酸锂(#171)。将氢氧化锂(13.8mg,0.572mmol,1.8当量)的水(0.4mL)溶液加入#169(75mg,0.32mmol,1当量)的甲醇(0.3mL)溶液中。然后加入四氢呋喃(0.45mL)，在45℃下搅拌反应混合物18小时。真空浓缩反应混合物，将粗制物和甲苯(4mL)共沸三次，得到作为白色固体的#171(77mg,100％)，其不经进一步纯化即用于下一步。

步骤5A.合成N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯三氟乙酸盐(#172)。先加入N,N-二异丙基乙胺(0.083mL,0.474mmol,3当量)然后加入HATU(60.7mg,0.158mmol,1.0当量)到#168(36.9mg,0.158mmol,1当量)与#114(100mg,0.158mmol,1.0当量)在N,N-二甲基甲酰胺(0.8mL)与二氯甲烷(3.6mL)中的悬浮液中，在室温搅拌反应混合物18小时。用乙酸乙酯稀释反应混合物，依序用水、10％柠檬酸(W/V)与盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，真空浓缩，得到粗制中间体(220mg,164％理论收率)。用二氯甲烷(1.5mL)溶解一部份此粗制中间体(50mg,23％)，加入三氟乙酸(0.4mL)。在室温搅拌混合物2小时，在真空中蒸发到干。通过反相色谱法纯化(方法M*)，得到#172(15.8mg,51％)。LC-MS(方案Q):m/z748.9[M+H⁺]保留时间＝1.29分钟。¹H NMR(DMSO-d₆),δ9.16-9.43(m),8.48-8.53(m),8.40-8.44(m),8.34-8.39(m),8.22-8.30(m),8.09-8.16(m),7.87-7.91(m),7.77-7.83(m),7.12-7.24(m),4.56-4.72(m),4.41-4.54(m),3.92-4.00(m),3.70-3.75(m),3.39-3.66(m),3.20-3.25(m),3.12-3.20(m),2.97-3.11(m),2.94(br s),2.75-2.89(m),2.63-2.69(m),2.47-2.54(m),2.29-2.45(m),2.15-2.27(m),2.02-2.15(m),1.57-1.87(m),1.33-1.51(m),1.19-1.30(m),1.02(dd),0.82-0.97(m),0.70-0.79(m)。

步骤5B.合成N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯三氟乙酸盐(#173)。先加入N,N-二异丙基乙胺(0.083mL,0.474mmol,3当量)然后加入HATU(60.7mg,0.158mmol,1当量)到#169(36.9mg,0.158mmol,1当量)与#114(100.0mg,0.158mmol,1当量)在N,N-二甲基甲酰胺(0.8mL)与二氯甲烷(3.6mL)中的悬浮液中。在室温搅拌反应混合物14小时，用乙酸乙酯稀释，依序用水、10％柠檬酸(W/V)与盐水清洗。在硫酸钠上干燥有机层，真空浓缩，得到粗制中间体(180mg,134％理论收率)。用二氯甲烷(1.5mL)溶解一部份此粗制中间体(50mg,27％)，加入三氟乙酸(0.4mL)，在室温搅拌混合物2小时，在真空中蒸发到干。通过反相色谱法纯化(方法M*)，得到#173(17.6mg,45％)。LC-MS(方案Q):m/z748.9[M+H+]保留时间＝1.29分钟。¹H NMR(DMSO-d₆)δ9.35-9.50(m),9.22-9.34(m),8.47-8.52(m),8.39-8.45(m),8.30-8.37(m),8.22-8.24(m),8.09-8.13(m),7.80-7.85(m),7.67-7.72(m),7.09-7.24(m),6.97-6.98(m),4.65-4.72(m),4.55-4.64(m),4.41-4.50(m),3.92-3.99(m),3.42-3.75(m),3.32-3.39(m),3.25-3.31(m),3.21-3.24(m),3.11-3.20(m),3.06-3.11(M),2.97-3.05(m),2.95(br s),2.83-2.88(m),2.76-2.82(m),2.65-2.70(m),2.44-2.54(m),2.15-2.42(m),2.02-2.14(m),1.57-1.84(m),1.33-1.48(m),1.19-1.30(m),1.02(dd),0.92-0.97(m),0.82-0.91(m),0.70-0.77(m)。

制备(2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]-2-甲基哌啶-2-甲酰胺盐酸盐(#178)与(2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]-2-甲基哌啶-2-甲酰胺盐酸盐(#180)。

步骤1.合成(3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-异缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸五氟苯酯(#174)。将三氟乙酸五氟苯酯(20.7g,74.1mmol,2当量)加入#@5(19.43g,37.03mmol,1当量)在二氯甲烷(100mL)与吡啶(5.86g,74.1mmol,2当量)中的溶液中，在室温搅拌反应混合物1小时。真空浓缩反应混合物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到52％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为黄色油的#174(23.58g,92％)。LC-MS(方案Q1):m/z691.2[M+H+],保留时间＝1.23分钟。

步骤2.合成N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N～2～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#175)。将N,N-二异丙基乙胺(400mg,3.07mmol,3当量)加入#174(706mg,1.02mmol,1当量)与#64(311mg,1.02mmol,1当量)的二氯甲烷(3mL)溶液中。在室温搅拌18小时，真空浓缩反应混合物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色固体的#175(560mg,68％)。LC-MS(方案Q1):m/z611.8[M+H+],保留时间＝1.15分钟。

步骤3.合成N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#176)。按照通用操作A，由二氯甲烷(9mL)中的#175(560mg,0.690mmol,1当量)与N,N-二乙胺(6.0mL)合成粗制的期望化合物，通过硅胶色谱法(梯度：0％到50％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到作为黄色油的#176(351mg,87％)。LC-MS(方案Q1):m/z589.5[M+H⁺],保留时间＝0.72分钟。

步骤4A.合成(2S)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨甲酰基}-2-甲基哌啶-1-羧酸叔丁酯(#177)。按照通用操作D，由#176(100mg,0.170mmol,1当量)、#156(53.8mg,0.221mmol,1.3当量)、二氯甲烷(4.5mL)、HATU(84.9mg,0.221mmol,1.3当量)与N,N-二异丙基乙胺(0.123mL,0.697mmol,4.1当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色固体的#177(145mg,假设定量的收率)。LC-MS(方案Q1):m/z814.7[M+H⁺],保留时间＝1.14分钟。

步骤4B.合成(2R)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨甲酰基}-2-甲基哌啶-1-羧酸叔丁酯(#179)。按照通用操作D，由#176(100mg,0.170mmol,1当量)、#157(53.8mg,0.221mmol,1.3当量)、二氯甲烷(4.5mL)、HATU(84.9mg,0.221mmol,1.3当量)与N,N-二异丙基乙胺(0.123mL,0.697mmol,4.1当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色固体的#179(155mg,假设定量的收率)。LC-MS(方案Q1):m/z814.7[M+H⁺],保留时间＝1.14分钟。

步骤5A.合成(2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]-2-甲基哌啶-2-甲酰胺盐酸盐(#178)。按照通用操作C，由#177(143mg,0.176mmol,1当量)与4M盐酸的二噁烷溶液(2.0mL)合成作为胶的期望物质(145mg)。将一部份此粗制残留物(25mg)与甲醇/乙腈混合物共沸，得到作为白色固体的#178(20mg,89％收率)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.96-9.07(m),8.79-8.96(m),8.58(d),8.02-8.08(m),7.77-7.83(m),7.25-7.31(m),7.19-7.24(m),6.56-6.67(m),6.12-6.21(m),5.13-5.22(m),4.72-4.81(m),4.63-4.70(m),4.50-4.59(m),4.07-4.16(m),3.98-4.05(m),3.80-3.86(m),3.55-3.76(m),3.46-3.54(m),3.38-3.44(m),3.26-3.35(m),3.18-3.24(m),3.05-3.18(m),2.98-3.04(m),2.40-2.55(m),2.27-2.35(m),2.08-2.27(m),1.74-1.98(m),1.50-1.74(m),1.20-1.46(m),0.73-1.16(m)。LC-MS(方案Q1):m/z714.6[M+H⁺],保留时间＝0.76分钟。HPLC(方案U):m/z714.5[M+H⁺]保留时间＝7.124分钟(纯度＝91％)。

步骤5B.合成(2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]-2-甲基哌啶-2-甲酰胺盐酸盐(#180)。按照通用操作C，由#179(162mg,0.199mmol,1当量)与4M盐酸的二噁烷溶液(2.0mL)合成作为胶的期望物质(155mg)。将一部份此胶(25mg)与1：1甲醇/乙腈混合物共沸，得到作为固体的#180(20mg,83％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ9.02-9.13(m),8.83-8.93(m),8.39-8.46(m),8.00-8.06(m),7.78(t),7.24-7.30(m),7.16-7.21(m),6.54-6.65(m),6.09-6.19(m),5.11-5.18(m),4.69-4.78(m),4.59-4.68(m),4.46-4.56(m),4.08-4.13(m),3.95-4.03(m),3.77-3.85(m),3.54-3.73(m),3.43-3.53(m),3.37-3.42(m),3.24-3.33(m),3.16-3.22(m),3.03-3.15(m),2.99-3.02(m),2.89-2.98(m),2.65-2.76(m),2.41-2.54(m),2.15-2.39(m),2.07-2.15(m),1.51-1.94(m),1.49(d),1.38(t),1.20-1.32(m),1.02-1.09(m),0.84-0.97(m),0.73-0.81(m)。LC-MS(方案Q1):m/z714.6[M+H⁺],保留时间＝0.76HPLC(方案U):m/z714.4[M+H⁺],保留时间＝7.409分钟(纯度＝90％)。

制备2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰氨甲酸盐(#182)，N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N～2～-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#184)和N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N～2～-{[(3S)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#186)。

步骤1A.合成1-(叔丁氧羰基)-2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#181)。按照通用操作D，由#176(100mg,0.170mmol,1当量)、(S)-1-(叔丁氧羰基)-2-甲基-L-脯氨酸(50.7mg,0.221mmol,1.3当量)、二氯甲烷(4.3mL)、HATU(84.9mg,0.221mmol,1.3当量)与N,N-二异丙基乙胺(0.123mL,0.697mmol,4.1当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0％到100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到#181(142mg,假设定量的收率)。LC-MS(方案Q1):m/z800.6[M+H⁺],保留时间＝1.11分钟。

步骤1B.合成(3R)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨甲酰基}-3-氟吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(#183)。先加入N,N-二异丙基乙胺(0.040mL,0.228mmol,3当量)然后加入HATU(29.2mg,0.076mmol,1当量)到#170(18.2mg,0.076mmol,1当量)在二氯甲烷(1.8mL)与N,N-二甲基甲酰胺(0.3mL)中的溶液中。在室温搅拌10分钟，加入#176(45mg,0.076mmol,1当量)。在室温搅拌反应混合物18小时，加入HATU(29mg,0.076mmol,1当量)。经过8小时后，真空浓缩反应混合物，得到#183(61.0mg,定量)，其不经进一步纯化即用于下一步。LC-MS(方案Q1):m/z826.6[M+Na⁺],保留时间＝1.05分钟。

步骤1C.合成(3S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨甲酰基}-3-氟环戊烷羧酸叔丁酯(#185)。先加入N,N-二异丙基乙胺(0.053mL,0.300mmol,3当量)然后加入HATU(38.4mg,0.100mmol,1当量)到#171(24mg,0.1mmol,1当量)在二氯甲烷(2.35mL)与N,N-二甲基甲酰胺(0.33mL)中的溶液中。在室温搅拌10分钟，加入#176(58.9mg,0.1mmol,1当量)。在室温搅拌反应混合物18小时，加入HATU(38.4mg,0.100mmol,1当量)与N,N-二甲基甲酰胺(0.2mL)，搅拌9小时。真空浓缩反应混合物，得到#185(80mg,定量)，其不经进一步纯化即用于下一步。LC-MS(方案Q1):m/z804.6[M+H⁺],保留时间＝1.05分钟。

步骤2A.合成2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰氨羧酸盐(#182)。按照通用操作C，由#181(136mg,0.170mmol,1当量)与4M盐酸的二噁烷溶液(2mL)合成作为胶的期望物质(142mg)。将一部份此粗制残留物(20mg,14％)与1：1甲醇/乙腈混合物共沸，然后通过反相色谱法纯化(方法O)，得到作为固体的#182(10mg,二步共57％)。HPLC(方案U):m/z700.4[M+H⁺],保留时间＝7.106分钟(纯度>90％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.25-8.39(m),8.20-8.25(m),7.96-7.99(m),7.74-7.77(m),6.55-6.63(m),6.10-6.18(m),5.11-5.18(m),4.66-4.72(m),4.51-4.61(m),4.46-4.50(m),3.96-4.01(m),3.37-3.86(m),3.20-3.36(m),3.11-3.19(m),3.03-3.11(m),2.98-3.03(m),2.90-2.96(m),2.77-2.79(m),2.65-2.73(m),2.57-2.63(m),2.47-2.56(m),2.36-2.46(m),2.26-2.32(m),2.14-2.25(m),2.03-2.10(m),1.92-2.03(m),1.72-1.92(m),1.64-1.72(m),1.60-1.64(m),1.50-1.59(m),1.39-1.48(m),1.23-1.32(m),1.18-1.22(m),1.12-1.14(m),1.01-1.09(m),0.83-1.00(m),0.74-0.83(m),0.70-0.74(m)。

步骤2B.合成N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N～2～-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#184)。按照通用操作C，由#183(61.1mg,0.076mmol,1当量)、二氯甲烷(0.3mL)与4M盐酸的二噁烷溶液(0.9mL)合成粗制的期望物质(140mg)。通过反相色谱法纯化一部份粗制物(98mg,69％)(方法M*)，得到#184(7.6mg,二步共20％)。HPLC(方案T):m/z704.5[M+H+],保留时间＝2.50分钟(纯度＝84％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.67-8.71(m),8.44-8.48(m),8.27-8.33(m),8.22-8.27(m),7.97-8.03(m),7.84-7.89(m),7.74-7.81(m),7.43-7.48(m),7.23-7.29(m),7.17-7.21(m),6.55-6.66(m),6.10-6.19(m),5.10-5.19(m),4.66-4.75(m),4.51-4.63(m),3.96-4.04(m),3.78-3.85(m),3.65-3.73(m),3.46-3.62(m),3.37-3.45(m),3.24-3.37(m),3.21-3.24(m),3.13-3.21(m),3.02-3.13(m),2.95-3.00(m),2.80-2.82(m),2.66-2.71(m),2.47-2.57(m),2.24-2.46(m),2.09-2.24(m),1.95-2.05(m),1.49-1.93(m),1.22-1.34(m),1.02-1.09(m),0.83-1.01(m),0.74-0.82(m)。

步骤2C.合成N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(环庚-2,4,6-三烯-1-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N～2～-{[(3S)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#186)。按照通用操作C，由#185(80.3mg,0.1mmol,1当量)、二氯甲烷(0.4mL)与4M盐酸的二噁烷溶液(1.2mL)合成粗制的期望物质，通过反相色谱法纯化一部份此期望物质(94mg,53％)(方法M*)，得到#186(11.8mg,二步共32％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.85-9.07(m),8.29-8.41(m),7.99-8.04(m),7.76-7.84(m),6.56-6.68(m),6.12-6.21(m),5.12-5.21(m),4.87-4.99(m),4.69-4.79(m),4.49-4.67(m),3.98-4.06(m),3.80-3.87(m),3.64-3.76(m),3.55-3.64(m),3.47-3.54(m),3.39-3.46(m),3.26-3.39(m),3.22-3.25(m),3.18-3.22(m),3.06-3.14(m),2.98-3.01(m),2.55-2.57(m),2.42-2.49(m),2.11-2.38(m),2.09(s),1.78-1.97(m),1.72-1.77(m),1.51-1.71(m),1.24-1.36(m),1.07(dd),0.83-1.03(m),0.75-0.82(m)。HPLC(方案T):m/z704.5[M+H⁺],保留时间＝2.48分钟(纯度＝100％)。

制备(2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]-2-甲基哌啶-2-甲酰胺甲酸盐(#188)，(2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]-2-甲基哌啶-2-甲酰胺甲酸盐(#190)，N～2～-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#192)和N～2～-{[(3S)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#194)。

步骤1A.合成(2S)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨甲酰基}-2-甲基哌啶-1-羧酸叔丁酯(#187)。按照通用操作D，由#86(280mg,0.4mmol,1当量)、#156(100mg,0.4mmol,1当量)、二氯甲烷(5mL)、HATU(182mg,0.48mmol,1.2当量)与N,N-二异丙基乙胺(100mg,0.8mmol,2当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0.01％到0.05％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到作为白色固体的#187(220mg,62％)。HPLC(方案V):m/z883.57[M+H⁺],保留时间＝3.23分钟(纯度＝95％)。

步骤1B.合成(2R)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨甲酰基}-2-甲基哌啶-1-羧酸叔丁酯(#189)。按照通用操作D，由#86(400mg,0.6mmol,1当量)、#157(146mg,0.6mmol,1当量)、二氯甲烷(10mL)、HATU(259mg,0.72mmol,1.2当量)与N,N-二异丙基乙胺(158mg,1.2mmol,2当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：0.01％到0.05％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到作为白色固体的#189(220mg,37％)。HPLC(方案W):m/z883.7[M+H⁺],保留时间＝4.12分钟(纯度＝95％)。

步骤1C.合成(3R)-3-氟-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨甲酰基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(#191)。按照通用操作D，由#86(300mg,0.45mmol,1当量)、#168(106mg,0.45mmol,1当量)、二氯甲烷(10mL)、HATU(194mg,0.54mmol,1.2当量)与二异丙基乙胺(117mg,0.9mmol,2当量)合成粗制的期望物质，通过反相色谱法纯化(方法P)，得到作为白色固体的#191(159mg,40％)。HPLC(方案X):m/z873.4[M+H⁺],保留时间＝3.32分钟(纯度＝99％)。

步骤1D.合成(3S)-3-氟-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨甲酰基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(#193)。按照通用操作D，由#86(300mg,0.45mmol,1当量)、#169(106mg,0.45mmol,1当量)、二氯甲烷(10mL)、HATU(194mg,0.54mmol,1.2当量)与二异丙基乙胺(117mg,0.9mmol,2当量)合成粗制的期望物质，通过反相色谱法纯化(方法P)，得到白色固体#193(149mg,37％)。HPLC(方案X):m/z873.4[M+H⁺],保留时间＝3.34分钟(纯度＝98％)。

步骤2A.合成(2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]-2-甲基哌啶-2-甲酰胺甲酸盐(#188)。按照通用操作C，由#187(20mg,0.023mmol,1当量)、二氯甲烷(0.1mL)、乙腈(0.1mL)与4M盐酸的二噁烷溶液(0.26mL)合成粗制的期望物质，通过反相色谱法纯化(方法N*)，得到#188(11.6mg,61％)；HPLC(方案T):m/z783.8[M+H⁺],保留时间＝2.53分钟(纯度＝96％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.82-8.87(m),8.60-8.63(m),8.26-8.29(m),7.84-7.90(m),7.75-7.81(m),7.60-7.67(m),7.21-7.31(m),7.14-7.19(m),5.49-5.55(m),5.37-5.42(m),4.69-4.75(m),4.59-4.65(m),4.50-4.56(m),3.95-4.01(m),3.77-3.82(m),3.54-3.61(m),3.47-3.53(m),3.24-3.45(m),3.14-3.23(m),3.03-3.08(m),2.96-3.03(m),2.78-2.80(m),2.64-2.73(m),2.60-2.62(m),2.47-2.56(m),2.31-2.45(m),2.13-2.28(m),2.00-2.07(m),1.92-1.99(m),1.71-1.86(m),1.58-1.70(m),1.50-1.56(m),1.38-1.49(m),1.15-1.36(m),1.08-1.14(m),1.03-1.07(m),0.90-1.02(m),0.83-0.90(m),0.73-0.80(m),0.70-0.73(m)。

步骤2B.合成(2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]-2-甲基哌啶-2-甲酰胺甲酸盐(#190)。按照通用操作C，由#189(20mg,0.022mmol,1当量)、二氯甲烷(0.1mL)、乙腈(0.1mL)与4M盐酸的二噁烷溶液(0.26mL)合成粗制的期望物质，通过反相色谱法纯化(方法N*)，得到#190(13.2mg,73％)；HPLC(方案T):m/z783.7[M+H⁺],保留时间＝2.5分钟(纯度＝100％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.83-8.86(m),8.60-8.62(m),8.24-8.27(m),7.83-7.89(m),7.78-7.80(m),7.75-7.77(m),7.64-7.66(m),7.60-7.63(m),7.20-7.31(m),7.13-7.19(m),5.49-5.55(m),5.36-5.42(m),4.65-4.74(m),4.60-4.65(m),4.50-4.56(m),3.95-4.01(m),3.76-3.81(m),3.53-3.62(m),3.47-3.52(m),3.22-3.45(m),3.14-3.21(m),2.97-3.05(m),2.93-2.96(m),2.79-2.86(m),2.76-2.78(m),2.65-2.68(m),2.48-2.56(m),2.37-2.43(m),2.29-2.35(m),2.17-2.27(m),2.04-2.11(m),1.93-2.00(m),1.70-1.85(m),1.53-1.69(m),1.36-1.48(m),1.28-1.36(m),1.13-1.26(m),1.08-1.12(m),0.98-1.07(m),0.91-0.97(m),0.84-0.91(m),0.73-0.78(m)。

步骤2C.合成N～2～-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#192)。按照通用操作C，由#191(10mg,0.011mmol,1当量)、二氯甲烷(0.1mL)、乙腈(0.1mL)与4M盐酸的二噁烷溶液(0.13mL)合成粗制的期望物质，通过反相色谱法纯化(方法M*)，得到#192(5.1mg,60％)；HPLC(方案T):m/z773.5[M+H⁺],保留时间＝2.43分钟(纯度＝100％).¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)9.32-9.44(m),9.17-9.21(m),8.91(d),8.63-8.69(m),8.38-8.43(m),8.22-8.27(m),7.80(dd),7.66(dd),7.14-7.33(m),5.49-5.57(m),5.37-5.45(m),4.10-4.78(m),3.97-4.06(m),3.77-3.83(m),3.33-3.65(m),3.15-3.29(m),2.95-3.09(m),2.82-2.83(m),2.67-2.71(m),2.55-2.57(m),2.32-2.54(m),2.10-2.31(m),2.09(s),1.72-1.90(m),1.57-1.72(m)。1.38-1.50(m),1.15-1.38(m),1.09(dd),0.85-1.0(m),0.75-0.83(m)。

步骤2D.合成N～2～-{[(3S)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#194)。按照通用操作C，由#193(10mg,0.011mmol,1当量)、二氯甲烷(0.1mL)、乙腈(0.1mL)与4M盐酸的二噁烷溶液(0.13mL)合成粗制的期望物质，通过反相色谱法纯化(方法M*)，得到#194(9mg,93％)；HPLC(方案T):m/z773.8[M+H⁺],保留时间＝2.42分钟(纯度＝100％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)9.39-9.52(m),9.21-9.35(m),8.90(d),8.63-8.69(m),8.42-8.48(m),8.29-8.34(m),7.80(dd),7.66(dd),7.22-7.33(m),7.13-7.21(m),5.47-5.57(m),5.36-5.44(m),4.43-4.93(m),3.97-4.05(m),3.64-3.83(m),3.32-3.61(m),3.15-3.29(m),3.06-3.09(m),2.95-3.05(m),2.89-2.95(m),2.82-2.84(m),2.67-2.72(m),2.54-2.56(m),2.48-2.53(m),2.28-2.48(m),2.11-2.28(m),2.09(s),1.57-1.72(m),1.38-1.47(m),1.15-1.37(m),1.09(dd),0.85-0.99(m),0.78(t)。

制备1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-氨基苯基)-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰氨甲酸盐(#200)和1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-氨基苯基)-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰氨甲酸盐(#201)。

步骤1.合成1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-叔丁氧基-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#195)。按照通用操作D，由#6(7.75g,21.6mmol,1当量)、#152(3.88g,21.6mmol,1当量)、二氯甲烷(100mL)、HATU(9.8g,25.9mmol,1.2当量)与二异丙基乙胺(11.1g,86.4mmol,4当量)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：20％到55％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到作为黄色油的#195(11.1g,定量收率)。

步骤2.合成1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-[(2R,3S,4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#196)。按照通用操作B，由#195(11.1g,21.6mmol,1当量)、二氯甲烷(100mL)与三氟乙酸(40mL)合成粗制的期望物质#196(10.1g,定量收率)，其不经进一步纯化即用于下一步。LC-MS(方案Z):m/z428.5[M+H⁺],保留时间＝0.9分钟。

步骤3.合成1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代-1-(五氟苯氧基)庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#197)。先逐滴加入吡啶(2.95g,37.6mmol,4当量)然后逐滴加入三氟乙酸五氟苯酯(3.9g,13.6mmol,1.4当量)的二氯甲烷(5mL)溶液到冷却(0℃)的#196(4.0g,9.4mmol,1当量)的二氯甲烷(40mL)溶液中。在室温搅拌混合物1小时，真空浓缩溶剂。通过硅胶色谱法(梯度：1％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化残留物，得到作为白色固体的化合物#197(4.5g,三个步骤共81.2％)。

步骤4.合成1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#198)。先逐滴加入二异丙基乙胺(3.4g,26.3mmol,3.5当量)然后逐滴加入#103(2.3g,7.6mmol,1.02当量)的二氯甲烷(15mL)溶液到冷却(0℃)的#197(4.0g,7.4mmol,1当量)的二氯甲烷(25mL)溶液中。然后在室温搅拌混合物16小时，真空除去溶剂。通过硅胶色谱法(梯度：1％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化残留物，然后通过反相色谱法进行第二次纯化(方法Q)，得到作为白色固体的#198(1.57g,57.5％)。HPLC(方案X):m/z597.49[M+H⁺]保留时间＝8.879分钟(纯度＝98％)。手性HPLC保留时间:3.328分钟(纯度＝98％)柱:柱:Chiralcel OJ-H,250x4.6mm,5μm；流动相:甲醇(0.05％二乙胺)/CO₂由5％到40％经15分钟；流速:2.35mL/分钟。

步骤5.合成1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(五氟苯氧基)丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#199)。先加入吡啶(75mg,0.94mmol,2.4当量)然后加入三氟乙酸五氟苯酯(268mg,0.94mmol,2.4当量)的二氯甲烷(1.5mL)溶液到#198(280mg,0.394mmol,1当量)的二氯甲烷(2mL)溶液中。在室温搅拌混合物2.5小时，真空浓缩溶剂。通过硅胶色谱法(梯度：1％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化残留物，得到作为白色固体的化合物#199(279mg,39％)。LC-MS(方案Q1):m/z763.5[M+H⁺],保留时间＝0.93分钟。

步骤6A.合成1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-(1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#200)。将N,N-二异丙基乙胺(30.2mg,2.31mmol,7当量)加入#199(25mg,0.033mmol,1当量)与#215(7.7mg,0.033mmol,1当量)与二氯甲烷(1.5mL)混合物中。搅拌反应混合物5分钟，加入N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)。搅拌2.5小时后，加入N,N-二异丙基乙胺(30.2mg,2.31mmol,7当量)。搅拌3.5小时后，加入N,N-二甲基甲酰胺(0.75mL)，搅拌混合物18小时。加入N,N-二异丙基乙胺(15.1mg,1.15mmol,3.6当量)与N,N-二甲基甲酰胺(0.25mL)，在室温搅拌反应混合物48小时。真空浓缩反应混合物，通过反相色谱法纯化粗制品(方法M*)，得到#200(12.9mg,48％)。HPLC(方案T):m/z HPLC(方案T):m/z407.7,双电荷[2+],保留时间＝1.69分钟(纯度＝100％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.72-9.82(m),8.61-8.67(m),8.42-8.48(m),8.19-8.24(m),7.25-7.27(m),7.12-7.14(m),6.94-7.01(m),6.88-6.94(m),6.78-6.84(m),6.67-6.74(m),6.57-6.64(m),4.69-4.77(m),4.60-4.68(m),4.53-4.60(m),4.46-4.53(m),4.37-4.45(m),3.97-4.05(m),3.76-3.81(m),3.62-3.67(m),3.53-3.62(m),3.44-3.52(m),3.32-3.38(m),3.27-3.32(m),3.22-3.27(m),3.15-3.22(m),3.06-3.14(m),2.97-3.01(m),2.92-2.96(m),2.74-2.83(m),2.61-2.74(m),2.57-2.61(m),2.48-2.56(m),2.37-2.46(m),2.25-2.36(m),2.00-2.20(m),1.67-1.91(m),1.47-1.60(m),1.37-1.47(m),1.24-1.35(m),1.03-1.10(m),0.95-1.00(m),0.88-0.94(m),0.76-0.83(m)。

步骤6B.合成1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-氨基苯基)-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#201)。将N,N-二异丙基乙胺(30.2mg,2.31mmol,7当量)加入#199(25mg,0.033mmol,1当量)与商购的4-氨基-L-苯丙氨酸甲酯(8.8mg,0.033mmol,1当量)在二氯甲烷(1.5mL)中的混合物中。搅拌反应混合物5分钟，加入N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)。4小时后，加入N,N-二异丙基乙胺(37.75mg,2.88mmol,8.25当量)，搅拌混合物50分钟。加入N,N-二甲基甲酰胺(0.75mL)，搅拌反应混合物66小时，真空浓缩，通过反相色谱法纯化粗制品(方法M*)，得到#201(14.3mg,56％)；HPLC(方案T):m/z387.2,双电荷[2+],保留时间＝1.50分钟(纯度＝100％).；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)9.68-9.84(m),8.57-8.66(m),8.46-8.51(m),8.23-8.29(m),7.18-7.28(m),7.11-7.16(m),7.03-7.08(m),6.97-7.02(m),4.67-4.75(m),4.58-4.66(m),4.34-4.57(m),3.95-4.03(m),3.85-3.90(m),3.73-3.81(m),3.66-3.72(m),3.57-3.66(m),3.50-3.57(m),3.42-3.49(m),3.32-3.38(m),3.14-3.30(m),2.95-3.11(m),2.84-2.94(m),2.78-2.81(m),2.63-2.74(m),2.46-2.57(m),2.34-2.45(m),2.19-2.34(m),1.97-2.19(m),1.67-1.90(m),1.45-1.62(m),1.34-1.41(m),1.21-1.34(m),1.01-1.10(m),0.82-0.99(m),0.72-0.81(m)。

制备1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-(1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺甲酸盐(#207)，1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-氨基苯基)-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺甲酸盐(#208)和1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#209)

步骤1.合成1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-叔丁氧基-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#202)。按照通用操作D，由#6(4.3g,12mmol,1当量)、#150(2.15g,12mmol,1eq.)、二氯甲烷(50mL)、HATU(5.46g,14mmol,1.2eq.)与二异丙基乙胺(8.17mL)合成粗制的期望物质，通过硅胶色谱法(梯度：20％到55％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到作为黄色油的#202(5.2g,89％)。

步骤2.合成1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(2R,3S,4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#203)。按照通用操作B，由#202(5.2g,10.77mmol,1当量)、二氯甲烷(45mL)与三氟乙酸(20mL)合成粗制的期望物质#203(7g,定量收率)，其不经进一步纯化即用于下一步。

步骤3.合成1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代-1-(五氟苯氧基)庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#204)。先逐滴加入吡啶(3.41g,43.08mmol,4当量)然后逐滴加入三氟乙酸五氟苯酯(6.03g,21.54mmol,2当量)的二氯甲烷(7mL)溶液到冷却(0℃)的#203(7.0g,10.77mmol,1当量)的二氯甲烷(15mL)溶液中。在室温搅拌混合物1小时，真空浓缩溶剂。通过硅胶色谱法(梯度：1％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化残留物，得到作为黄色固体的化合物#204(8g,二步共82％)。

步骤4.合成1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#205)。先逐滴加入二异丙基乙胺(5.6g,43.08mmol,4当量)然后逐滴加入#103(3.22g,10.77mmol,1当量)的二氯甲烷(15mL)溶液到冷却(0℃)的#204(8.0g,10.77mmol,1当量)的二氯甲烷(25mL)溶液中。在室温搅拌混合物16小时，在真空中除去溶剂。通过硅胶色谱法(梯度：1％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化残留物，得到作为黄色固体的#205(2.2g,33％)。HPLC(方案X):m/z597.42[M+H⁺],保留时间＝8.729分钟(纯度>97％),手性HPLC保留时间:2.87分钟(纯度＝89％)柱:Chiralcel OD-3,150x4.6mm,3μm；流动相:ethanol(0.05％二乙胺)/CO₂由5％到40％经12分钟；流速:2.5mL/分钟。

步骤5.合成1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(五氟苯氧基)丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#206)。先加入吡啶(75mg,0.94mmol,2当量)然后加入三氟乙酸五氟苯酯(268mg,0.94mmol,2当量)的二氯甲烷(1.5mL)溶液到#198(0.28g,0.47mmol,1当量)的二氯甲烷(2mL)溶液中。在室温搅拌混合物2.5小时，真空浓缩溶剂。通过硅胶色谱法(梯度：1％到10％甲醇/二氯甲烷)纯化残留物，得到作为白色固体的化合物#206(348mg,97％)。LC-MS(方案Q1):m/z763.5[M+H⁺],保留时间＝0.9分钟。

步骤6A.合成1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-(1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#207)。用前述制备#200的方法由#206(25mg,0.033mmol,1当量)与#215(7.7mg,0.033mmol,1当量)制得标题化合物。通过反相色谱法纯化粗制品(方法M*)，得到#207(11.7mg,44％)。HPLC(方案T):m/z407.6,双电荷[2+],保留时间＝1.59分钟(纯度＝100％)。¹H NMR(DMSO-d₆)9.57-9.69(m),8.68-8.76(m),8.42-8.47(m),8.23-8.29(m),8.18-8.23(m),7.24-7.27(m),6.95-7.01(m),6.89-6.94(m),6.80-6.86(m),6.70-6.78(m),6.60-6.67(m),4.69-4.77(m),4.60-4.68(m),4.46-4.60(m),4.34-4.46(m),3.95-4.03(m),3.87-3.91(m),3.79-3.85(m),3.74-3.79(m),3.60-3.66(m),3.49-3.60(m),3.41-3.49(m),3.12-3.35(m),3.04-3.12(m),2.89-3.04(m),2.68-2.83(m),2.61-2.67(m),2.45-2.55(m),2.34-2.44(m),2.08-2.33(m),2.05-2.08(m),1.92-2.05(m),1.75-1.91(m),1.65-1.75(m),1.59-1.64(m),1.34-1.58(m),1.20-1.31(m),1.01-1.09(m),0.94-0.99(m),0.84-0.93(m),0.80-0.83(m),0.72-0.80(m)。

步骤6B.合成1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-氨基苯基)-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#208)。将N,N-二异丙基乙胺(30.2mg,2.31mmol,7当量)加入#206(25.0mg,0.033mmol,1当量)与商购的4-氨基-L-苯丙氨酸甲酯(8.8mg,0.033mmol,1当量)在二氯甲烷(1.5mL)中的混合物中。搅拌反应混合物5分钟，加入N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)。2.5小时后，加入N,N-二异丙基乙胺(30.2mg,2.31mmol,7当量)。搅拌3.5小时后，加入N,N-二甲基甲酰胺(0.75mL)，搅拌反应混合物66小时，真空浓缩，通过反相色谱法纯化粗制品(方法M*)，得到#208(13mg,51％)；HPLC(方案T):m/z387.2,双电荷[2+],保留时间＝1.58分钟(纯度＝100％).；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)9.54-9.69(m),8.68-8.75(m),8.46-8.50(m),8.33-8.37(m),8.22-8.31(m),8.09-8.14(m),7.17-7.27(m),7.07-7.16(m),6.99-7.05(m),6.92-6.99(m),4.69-4.75(m),4.60-4.68(m),4.42-4.59(m),4.34-4.42(m),3.95-4.03(m),3.85-3.90(m),3.74-3.80(m),3.65-3.72(m),3.62-3.65(m),3.42-3.62(m),3.31-3.36(m),3.24-3.30(m),3.11-3.24(m),3.03-3.11(m),2.96-3.03(m),2.81-2.92(m),2.65-2.76(m),2.43-2.55(m),2.34-2.43(m),2.06-2.33(m),1.93-2.05(m),1.75-1.89(m),1.66-1.74(m),1.58-1.65(m),1.47-1.57(m),1.34-1.43(m),1.20-1.32(m),1.10-1.14(m),1.00-1.09(m),0.83-0.99(m),0.72-0.81(m)。

步骤6C.合成1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(#209)。用前述制备#200的方法由#206(25.0mg,0.033mmol,1当量)与L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(7.1mg,0.033mmol,1当量)制得标题化合物。通过反相色谱法纯化粗制品(方法M*)，得到#209(10.3mg,41％)。HPLC(方案T):m/z758.7[M+H⁺],保留时间＝1.787分钟(纯度＝100％).¹HNMR(DMSO-d₆)9.57-9.70(m),8.70-8.75(m),8.50-8.56(m),8.32-8.42(m),8.24-8.26(m),8.10-8.15(m),7.14-7.27(m),7.12-7.13(m),6.98-7.00(m),4.69-4.77(m),4.55-4.67(m),4.43-4.53(m),3.94-4.02(m),3.73-3.78(m),3.62-3.68(m),3.48-3.60(m),3.39-3.48(m),3.23-3.33(m),3.13-3.22(m),3.08-3.13(m),3.02-3.08(m),2.96-3.01(m),2.81-2.94(m),2.76-2.80(m),2.66-2.75(m),2.62-2.66(m),2.46-2.55(m),2.31-2.45(m),2.09-2.29(m),2.05-2.09(m),1.93-2.04(m),1.74-1.88(m),1.65-1.74(m),1.59-1.65(m),1.36-1.52(m),1.21-1.35(m),1.01-1.08(m),0.94-1.00(m),0.83-0.94(m),0.73-0.81(m)。

制备(2S)-2-氨基-3-(1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)丙酸甲酯

步骤1.合成6-(溴甲基)喹啉(#210)。在回流下搅拌6-甲基喹啉(5g,35mmol,1当量)、N-溴代丁二酰亚胺(8.1g,45.5mmol,1.3当量)与过氧化苯甲酰(840mg,3.5mmol,0.1当量)的四氯化碳(100mL)溶液3小时，然后冷却到室温。过滤反应混合物，真空浓缩滤液。用四氢呋喃(100mL)溶解残留物并过滤。滤液不经进一步纯化即用于下一步。

步骤2.合成6-{[(2S,5R)-3,6-二甲氧基-5-(丙-2-基)-2,5-二氢吡嗪-2-基]甲}喹啉(#211)。将正丁基锂(2.5M,64.4mL,161mmol,2.3当量)逐滴加入冷却(-70℃)的(2R)-3,6-二甲氧基-2-(丙-2-基)-2,5-二氢吡嗪(25.8g,140mmol,2当量)的四氢呋喃(200mL)溶液中，然后搅拌30分钟。在-65℃下逐滴加入#210(15.4g,70mmol,1当量)的四氢呋喃(150mL)溶液，然后本文中温度下搅拌溶液2小时。用饱和氯化铵水溶液(100mL)使反应猝灭，用乙酸乙酯(100mL)萃取。在硫酸钠上干燥有机相，真空浓缩。通过硅胶柱色谱法(梯度：10％到16％乙酸乙酯/石油醚)纯化残留物，得到作为黄色固体的#211(7.3g,二步共32％)。LC-MS(方案Z):m/z326.2[M+H⁺],保留时间＝0.88分钟。

步骤3.合成(2S)-2-氨基-3-(喹啉-6-基)丙酸甲酯(#212)。在0℃下将三氟乙酸(9mL)加入#211(7.3g,22.5mmol,1当量)在水(25mL)与乙腈(80mL)中的溶液中，在10℃下搅拌溶液整夜。在真空中除去有机层，用碳酸钠使剩余的水层碱化到pH9，其直接用于下一步。

步骤4.合成(2S)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(喹啉-6-基)丙酸甲酯(#213)。在0℃下将二碳酸二叔丁酯(17.5g,78.75mmol,3.5当量)加入#212(5.2g,22.5mmol,1当量)与三乙胺(9.1g,90mmol,4当量)在甲醇(30mL)与水(50mL)的混合溶剂的溶液中，在10℃下搅拌溶液整夜。过滤反应混合物，用甲醇(20mL x2)清洗滤饼。用乙酸乙酯(50mL x2)萃取滤液，真空浓缩有机相。通过硅胶柱色谱法(梯度：25％到50％乙酸乙酯/石油醚)纯化残留物，得到作为黄色油的#213(5.5g,二步共74％)。LC-MS(方案Z):m/z331.2[M+H⁺],保留时间＝0.76分钟。

步骤5.合成(2S)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)丙酸甲酯(#214)。在30psi氢气下在50℃下搅拌#213(1.5g,4.55mmol,1当量)与钯碳(150mg)的乙醇(20mL)悬浮液整夜。通过硅藻土垫过滤反应混合物，真空浓缩滤液。通过硅胶柱色谱法(梯度：40％乙酸乙酯/石油醚)纯化残留物，得到作为油的#214(1.2g,80％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ6.70(d,2H),6.40(m,1H),4.95(m,1H),4.49(m,1H),3.77(s,3H),3.28(m,2H),2.97(m,2H),2.71(m,2H),1.95(m,2H),1.26(s,9H),HPLC(方案Y):m/z357.0[M+Na⁺]保留时间＝5.304分钟(纯度>98％)。手性HPLC保留时间:4.64分钟(纯度＝98％)(柱:ChiralcelOJ-H,150x4.6mm,5μm；流动相:乙醇(0.05％二乙胺)/CO₂由5％到40％经15分钟；流速:2.5mL/分钟。

步骤6.合成(2S)-2-氨基-3-(1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)丙酸甲酯(#215)。在0℃下将三氟乙酸(2mL)逐滴加入#214(750mg,2.25mmol,1当量)的二氯甲烷(20mL)溶液中，在20℃下搅拌溶液整夜。真空浓缩反应混合物，用水(20mL)溶解残留物。用碳酸钠使溶液碱化，用乙酸乙酯/四氢呋喃萃取(30mL x3)。在硫酸钠上干燥有机相，真空浓缩，得到作为黄色油的#215(450mg,85％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ6.70(d,2H),6.40(m,1H),3.73(s,3H),3.67(m,1H),3.30(m,2H),2.96(m,1H),2.75(m,3H),1.96(m,2H),1.50(br,2H),1.26(br,1H).,HPLC(方案Y):m/z235.14[M+H⁺]保留时间＝4.35分钟(纯度>96％)。手性HPLC保留时间:5.71分钟(纯度＝98％)。(柱:ChiralcelOJ-H,150x4.6mm,5μm；流动相:乙醇(0.05％二乙胺)/CO₂由5％到40％经15分钟；流速:2.5mL/分钟。

制备N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸三氟乙酸盐(#217)和N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3S)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸三氟乙酸盐(#219)。

步骤1A.合成N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-1-(叔丁氧羰基)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯(#216)。先加入二异丙基乙胺(0.083mL,0.474mmol,3当量)然后加入HATU(60.7mg,0.158mmol,1当量)到#168(36.9mg,0.158mmol,1当量)与#114(100mg,0.158mmol,1当量)在二氯甲烷(3.6mL)与N,N-二甲基甲酰胺(0.8mL)中的溶液中。在室温搅拌反应混合物18小时，用乙酸乙酯(25mL)稀释，用水(1X)、10％柠檬酸(1X)与盐水(1X)清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩滤液，得到粗制的#216(220mg,164％理论收率)，其不经进一步纯化即用于下一步。HPLC(方案Q):m/z848.6[M+H⁺],保留时间＝2.10分钟。

步骤1B.合成N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3S)-1-(叔丁氧羰基)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸甲酯(#218)。先加入二异丙基乙胺(0.083mL,0.474mmol,3当量)然后加入HATU(60.7mg,0.158mmol,1当量)到#169(36.9mg,0.158mmol,1当量)与#114(100mg,0.158mmol,1当量)在二氯甲烷(3.6mL)与N,N-二甲基甲酰胺(0.8mL)中的溶液中。在室温搅拌反应混合物18小时，用乙酸乙酯(25mL)稀释，用水(1X)、10％柠檬酸(1X)与盐水(1X)清洗。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩滤液，得到粗制的#218(180mg,134％理论收率)，其不经进一步纯化即用于下一步。HPLC(方案Q):m/z848.6[M+H⁺],保留时间＝2.10分钟。

步骤2A.合成N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸三氟乙酸盐(#217)。将氢氧化锂(1M,0.5mL)加入粗制的#216(134mg)的四氢呋喃(4mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物18小时，真空浓缩。用二氯甲烷(2mL)溶解残留物，加入三氟乙酸(2mL)。搅拌反应混合物4小时，真空浓缩。通过反相色谱法纯化粗制物(方法M*)，得到作为胶的#217(60mg,二步共86％)。LC-MS(方案Q):m/z734.93[M+H⁺],保留时间＝1.19分钟。¹H NMR(DMSO-d₆)δ12.62-12.83(m),9.30-9.43(m),9.17-9.28(m),8.34-8.41(m),8.22-8.31(m),8.08-8.15(m),7.87-7.93(m),7.76-7.81(m),7.11-7.23(m),4.93-4.99(m),4.81-4.88(m),4.55-4.71(m),4.48-4.54(m),4.37-4.45(m),3.92-3.99(m),3.69-3.75(m),3.31-3.65(m),3.25-3.30(m),3.20-3.24(m),3.12-3.19(m),3.08-3.10(m),2.97-3.07(m),2.92-2.97(m),2.75-2.84(m),2.64-2.70(m),2.43-2.57(m),2.28-2.43(m),2.15-2.26(m),2.02-2.15(m),1.56-1.87(m),1.31-1.48(m),1.05-1.30(m),0.97-1.06(m),0.82-0.97(m),0.71-0.79(m)。

步骤2B.合成N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3S)-3-氟吡咯烷-3-基]羰基}-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸三氟乙酸盐(#219)。将氢氧化锂水溶液(1.0M,0.5mL)加入粗制的#218(100mg)的四氢呋喃(4mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物18小时，真空浓缩。用二氯甲烷(2mL)溶解粗制物，加入三氟乙酸(2mL)。搅拌反应混合物4小时，真空浓缩。通过反相色谱法纯化粗制物(方法M*)，得到作为胶的#219(60mg,二步共91％)。LC-MS(方案Q):m/z734.97[M+H⁺],保留时间＝1.14分钟。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ12.62-12.85(m),9.32-9.43(m),9.13-9.26(m),8.39-8.46(m),8.30-8.39(m),8.25-8.29(m),8.08-8.13(m),7.79-7.85(m),7.67-7.72(m),7.10-7.23(m),4.94-5.01(m),4.83-4.89(m),4.64-4.73(m),4.56-4.63(m),4.44-4.50(m),4.37-4.44(m),3.92-3.99(m),3.60-3.74(m),3.24-3.55(m),3.11-3.24(m),3.07-3.10(m),3.02-3.06(m),2.98-3.02(m),2.93-2.97(m),2.75-2.85(m),2.68-2.69(m),2.63-2.67(m),2.45-2.55(m),2.26-2.44(m),2.15-2.25(m),2.03-2.14(m),1.55-1.87(m),1.31-1.47(m),1.15-1.31(m),0.98-1.05(m),0.91-0.98(m),0.82-0.91(m),0.71-0.78(m)。

制备2-甲基丙氨酰基-N-{(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S)-7-苄基-4-甲基-18-[(4S,5R)-5-甲基-2-氧代咪唑烷-4-基]-5,8,13-三氧代-2-氧杂-6,9,12-三氮杂十八烷-3-基}吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#257)。

步骤1.合成[(2S)-1-({2-[(叔丁氧羰基)氨基]乙基}氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨甲酸9H-芴-9-基甲酯(#253)。按照通用操作D，在DMF(6mL)中用N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-苯丙氨酸(500mg,1.29mmol,1.0当量)、(2-氨基乙基)氨甲酸叔丁酯(207mg,1.29mmol,1.0当量)、HATU(620mg,1.55mmol,1.2当量)与Hunig碱(0.452mL,2.58mmol,2.0当量)，浓缩溶剂，用乙酸乙酯重结晶，得到作为白色固体的#253(620mg,91％)。LC-MS(方案Q1):m/z552.3[M+Na⁺],保留时间＝1.01分钟。

步骤2.合成N-α-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-[2-({6-[(4S,5R)-5-甲基-2-氧代咪唑烷-4-基]己酰基}氨基)乙基]-L-苯丙氨酰胺(#254)。按照通用操作C，用#251(88mg,0.17mmol,1.0当量)与4M盐酸(2.0mL,8.0mmol,48当量)除去Boc保护，然后真空浓缩。按照通用操作D，用粗制的残留物6-[(4S,5R)-5-甲基-2-氧代咪唑烷-4-基]己酸(35.6mg,0.166mmol,1.0当量)、HATU(73.2mg,0.18mmol,1.1当量)、Hunig碱(0.087mL,0.50mmol,3.0当量)与DMF(2mL)进行偶联反应，然后纯化(方法J)，得到作为白色固体的#254(35mg,34％)。LC-MS(方案Q1):m/z626.3[M+H⁺],保留时间＝0.86分钟。

步骤3.合成N-[2-({6-[(4S,5R)-5-甲基-2-氧代咪唑烷-4-基]己酰基}氨基)乙基]-L-苯丙氨酰胺(#255)。按照通用操作A，在DMF(0.5mL)中用#254(35mg,0.056mmol,1.0当量)、哌啶(0.10mL,1.0mmol,20当量)制备，通过硅胶色谱法(0％到30％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到#253(19mg,84％)。LC-MS(方案Q1):m/z404.2[M+H⁺],保留时间＝0.48分钟。

步骤4.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-{(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S)-7-苄基-4-甲基-18-[(4S,5R)-5-甲基-2-氧代咪唑烷-4-基]-5,8,13-三氧代-2-氧杂-6,9,12-三氮杂十八烷-3-基}吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#256)。按照通用操作D，在DMF(1.5mL)中用#105(36.6mg,0.047mmol,1.0当量)、#255(19mg,0.047mmol,1.0当量)、HATU(22.4mg,0.056mmol,1.2当量)、Hunig碱(0.025mL,0.141mmol)制备，然后纯化(方法J)，得到作为白色固体的#256(15mg,27％)。LC-MS(方案Q1):m/z1164.8[M+H⁺],保留时间＝0.99分钟。

步骤5.合成2-甲基丙氨酰基-N-{(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S)-7-苄基-4-甲基-18-[(4S,5R)-5-甲基-2-氧代咪唑烷-4-基]-5,8,13-三氧代-2-氧杂-6,9,12-三氮杂十八烷-3-基}吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(#257)。按照通用操作A，在DMF(0.7mL)中用#256(5mg,0.004mmol,1.0当量)、哌啶(0.02mL,0.2mmol,50当量)制备，然后纯化(方法J)，得到作为无色玻璃的#257(2mg,50％)。LC-MS(方案Q1):m/z1164.8[M+H⁺],保留时间＝0.99分钟。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.44-8.52(m),8.06-8.20(m),7.96-8.01(m),7.69-7.83(m),7.20-7.28(m),7.11-7.19(m),3.38-3.83(m),3.19-3.26(m),3.03-3.12(m),2.98(s),2.91(s),2.75(s),2.65-2.70(m),2.01-2.36(m),1.65-1.87(m),1.39-1.57(m),1.13-1.37(m),1.04-1.08(m),0.74-1.01(m)。

制备N-[5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(mv#115)。

步骤1.制备N-[5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(mv#115)。先加入HATU(23.2mg,0.061mM)然后加入Hunig碱(0.033mL,0.188mM)到搅拌的5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酸(12mg,0.061mM)在二氯甲烷(0.4mL)与DMF(0.1mL)中的溶液中。搅拌反应混合物5分钟，加入#115(39mg,0.047mM)在二氯甲烷(0.4mL)与DMF(0.1mL)中的溶液。在室温搅拌反应混合物3小时又15分钟，加入水和少量的TFA使反应猝灭。浓缩反应混合物。用DMSO溶解粗制物，通过反相色谱法纯化(方法J)。在Genevac中浓缩合适的流份。通过反相色谱法纯化粗制物(方法K)，在Genevac中浓缩合适的流份。把粗制物移到一个含有二氯甲烷与甲醇的小药瓶中，在Genevac中浓缩，得到油/固体混合物mv#115(1.4mg,3.3％)。HPLC(方案A在45℃:m/z897.5[M+H⁺],保留时间＝9.149分钟(纯度>97％)。

制备N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(mc#115)。

步骤1.合成6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯(#248)。先加入乙二酰氯(1.61mL,17.9mM)然后加入一滴DMF到搅拌的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(3.15g,14.9mM)的二氯甲烷(15mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物3小时。真空浓缩反应混合物。用1：1庚烷/二氯甲烷溶液溶解残留物，真空浓缩。重复此操作二次，得到作为固体的#248(3.43g,100％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ[7.02(s,2H),3.43(m,2H),2.53(m,1H),CH2.18(m,1H),1.54(m,4H),1.26(m,2H).]。

步骤2.合成N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-N,2-二甲基丙氨酸(#249)。先加入N,2-二甲基丙氨酸(306mg,2.61mM)然后加入三乙胺(1.09mL,7.84mM)到搅拌的#248(600mg,2.61mM)的二氯甲烷(10mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物3小时。加入二氯甲烷，用水清洗三次并用盐水清洗二次有机层。分离出有机层，在硫酸钠上干燥，真空浓缩。通过硅胶色谱法(0％到30％甲醇/二氯甲烷)纯化粗制的残留物(硅胶事先被三乙胺中和)，得到作为白色固体的#249(127mg,16％)。LC-MS(方案Q):m/z309.0[M-H-],保留时间＝0.96分钟。

步骤3.合成N-{(2R,3R)-3-甲氧基-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(L-缬氨酰基)氨基]庚酰基}吡咯烷-2-基]-2-甲基丙酰基}-L-苯丙氨酸(#250)。先加入氢氧化锂(228mg,5.16mM)然后加入水(3mL)到搅拌的#113(2.10g,2.46mM)的THF(10mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物2小时。加入1M盐酸使反应混合物酸化，真空浓缩。将所得白色固体置于乙腈(20mL)与水(5mL)中。除去水层，用水清洗一次有机层。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，真空浓缩。加入乙酸乙酯(20mL)，搅拌粗制的固体30分钟，过滤，得到作为白色固体的#250(1.42g,94％)LC-MS(方案Q):m/z619.5[M+H⁺],保留时间＝1.10分钟。HPLC(方案A在45℃)m/z619.4[M+H⁺],保留时间＝6.732分钟。

步骤4.合成N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(mc#115)。先加入HATU(482mg,1.23mM)然后加入三乙胺(0.52mL,1.23mM)到搅拌的#249(382mg,1.23mM)的二氯甲烷(5mL)溶液中。在室温搅拌反应混合物1小时，加入#250(762mg,1.23mM)。搅拌反应混合物3小时。真空浓缩反应混合物。反相纯化(方法L)，然后冻干，得到作为白色固体的mc#120(124mg,11％)。HPLC(方案A在45℃)；m/z911.5[M+H⁺],保留时间＝9.676分钟。

制备N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(mb#115)。

步骤1.合成N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(mb#115)。搅拌4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酸(1.2当量)、HATU(1.2当量)、Hunig碱(3当量)在DMF与二氯甲烷中的溶液30分钟。加入化合物#115(1当量)在二氯甲烷与DMF中的溶液。通过LC-MS监测反应。浓缩反应混合物，通过Isco中压反相色谱法(梯度：5％到100％水/乙腈)完成纯化。

制备N-[7-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)庚酰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(me#115)。

步骤1.合成N-[7-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)庚酰基]-N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(me#115)。搅拌7-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)庚酸(1.2当量)、HATU(1.2当量)、Hunig碱(3当量)在DMF与二氯甲烷中的溶液30分钟。加入化合物#115(1当量)在二氯甲烷与DMF中的溶液。通过LC-MS监测反应。浓缩反应混合物，通过Isco中压反相色谱法(梯度：5％到100％水/乙腈)完成纯化。

制备N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-(4-{(8S,11S,12R)-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-8-异丙基-4,5,5,10-四甲基-11-[(1S)-1-甲基丙基]-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基}苯基)-L-鸟氨酰胺(mcValCitPABC#115)。

步骤1.合成N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-(4-{(8S,11S,12R)-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-8-异丙基-4,5,5,10-四甲基-11-[(1S)-1-甲基丙基]-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基}苯基)-L-鸟氨酰胺(mcValCitPABC#115)。制备mcCValCitPABC(连接基#D,1当量)与#115(1当量)的DMF溶液。加入Hunig碱(4当量)、2,6-二甲基吡啶(4当量)与HOAT(0.2当量)。通过LC-MS监测反应。浓缩反应混合物，由Isco中压反相色谱法(梯度：5％到100％水/乙腈)完成纯化。

制备N-(21-氨基-4,7,10,13,16,19-六氧杂二十一烷-1-酰基)-N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(AmPeg6C2#115)。

步骤1.合成N-(21-氨基-4,7,10,13,16,19-六氧杂二十一烷-1-酰基)-N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺(AmPeg6C2#115)。搅拌1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16,19,22-七氧杂-4-氮杂二十五烷-25-酸(1当量)、HATU(1当量)与Hunig碱(3当量)溶液30分钟。加入化合物#115的DMF溶液。通过LC-MS监测反应。当偶联反应接近完成时加入哌啶(5当量)。由LC-MS监测Fmoc脱保护。浓缩反应混合物，通过Isco中压反相色谱法(梯度：5％到100％水/乙腈)完成纯化。

制备1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(2S)-3-[4-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基}氨基)苯基]-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基}氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(mcGly#201)。

步骤1.合成N-(叔丁氧羰基)-4-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基}氨基)-L-苯丙氨酸甲酯(#251)：在0℃下将N,N'-二环己基碳二亚胺(2.9g,15.3mmol,1当量)加入4-氨基-N-(叔丁氧羰基)-L-苯丙氨酸甲酯(4.1g,15.3mmol,1当量)的无水N,N-二甲基甲酰胺(70mL)溶液中。在0℃下搅拌混合物30分钟。在0℃下加入2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)乙酸(3g,10.2mmol,0.66当量)的无水N,N-二甲基甲酰胺(20mL)溶液。在室温搅拌混合物3日。过滤混合物。将滤液倒入冰水(200mL)中，用乙酸乙酯萃取(200mL x3)。用盐水(200mL)清洗萃取物，在硫酸钠上干燥，真空浓缩，得到作为浅黄色固体的#251(1.8g,32.3％收率)。HPLC(方案Q2)[M+Na⁺]567.3,保留时间＝1.02分钟。

步骤2.合成4-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基}氨基)-L-苯丙氨酸甲酯(#252)：在0℃下将TFA(4.8mL)加入#251(800mg,1.47mmol,1当量)的二氯甲烷(16mL)溶液中。在室温搅拌混合物2小时。真空浓缩混合物。用水溶解残留物并过滤。将滤液冻干，得到作为白色固体的#252(800mg,97.5％)。HPLC(方案Q3)[M+H⁺]445.4,保留时间＝0.90分钟。

步骤3.合成1,2-二甲基-D-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(2S)-3-[4-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基}氨基)苯基]-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基}氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(mcGly#201)。先加入HATU(64.2mg,0.13mmol,1当量)然后加入N,N-二异丙基乙胺(66mg,0.52mmol)到#198(94mg,0.13mmol,1当量)与#252(60.3mg,0.18mmol,1.4当量)的N,N-二甲基甲酰胺(2mL)溶液中。在室温搅拌溶液1小时。用柠檬酸水溶液中和反应混合物，浓缩，得到粗制品，通过硅胶色谱法(用1％到7％MeOH/DCM洗脱)纯化，由制备级TLC(甲醇:二氯甲烷＝1:10)纯化，得到作为白色固体的mcGly#201(25mg,16.2％)。ESI-MS:m/z1023.59[M+H⁺],HPLC(方案EB)保留时间＝4.0分钟(纯度＝96％)。¹H NMR(DMSO-d₆)δ9.88(d,1H),8.48(d,0.5H),8.24(d,0.5H),8.11(m,1H),7.82(m,1H),7.47(d,2H),7.15(m,2H),7.01(s,2H),4.67(m,3H),3.96(m,4H),3.65(m,4H),3.40(m,4H),3.27(m,7H),3.16(m,5H),2.24(m,8H),1.50(m,11H),1.19(m,21H)。

制备1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]氨基}-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(MalC6Am#151)。

步骤1.合成1,2-二甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]氨基}-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(MalC6Am#151)。按照通用操作D，用#151(20mg,0.023mmol,1.0当量)、1-(6-氨基己基)-1H-吡咯-2,5-二酮(7.0mg,0.030mmol,1.3当量)、HATU(11.4mg,0.030mmol,1.3当量)、Hunig碱(0.016mL,0.092mmol,1.3当量)、二氯甲烷(2mL)与DMF(0.2mL)制备，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％到80％乙腈/水，各相含有0.02％TFA)纯化，得到作为透明油/固体混合物的MalC6Am#151(18.4mg,86％)。LC-MS(方案Q):m/z922.3[M+H⁺],保留时间＝1.43分钟；HPLC(方案A在45℃):m/z922.4[M+H⁺],保留时间＝7.203分钟。

制备N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-(4-{(6S,9R,10R)-6-苄基-10-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(1,2-二甲基-L-脯氨酰基-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基}-9-甲基-3,8-二氧代-2,11-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-1-基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(mcValCitPABC#246)

步骤1.合成N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-(4-{(6S,9R,10R)-6-苄基-10-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(1,2-二甲基-L-脯氨酰基-L-缬氨酰基)(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-9-甲基-3,8-二氧代-2,11-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷-1-基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(mcValCitPABC#246)。按照通用操作E，在DMA(2.0mL)中用#246(29.2mg,0.035mmol,1.0当量)、mcValCitPABC-PNP(28.8mg,0.039mmol,1.1当量)、2,6-二甲基吡啶(0.016mL,0.14mmol,4.0当量)、Hunig碱(0.025mL,0.14mmol,4.0当量)、HOAT(4.8mg,0.035mmol,1.0当量)制备，然后通过中压反相C18色谱法(梯度：5％到50％乙腈/水，各相含有0.02％TFA)纯化，得到作为透明油/固体混合物的mcValCitPABC#246(21mg,45％)。LC-MS(方案Q):m/z1327.9[M+H⁺],保留时间＝1.36分钟。

体外与体内研究

请注意，对于下列研究，在不存在缀合细胞毒性药剂的情况下的在等同的抗体浓度下未显示显著的体外效力或体内效力。

体外细胞测定操作

在处理前24小时将靶表达BT474(乳腺癌)、N87(胃癌)、HCC1954(乳腺癌)、MDA-MB-361-DYT2(乳腺癌)或非表达(MDA-MB-468)细胞接种于96孔细胞培养盘。一式二份地用十个试验浓度的三倍连续稀释的抗体-药物缀合物或游离化合物(即没有抗体缀合到药物)处理细胞。在处理后96小时通过CellTiterAQ_ueousOne Solution Cell Proliferation MTSAssay(Promega,Madison WI)测定细胞活力。相对细胞活力被确定为未处理的对照组的百分比。用具有XLfit v4.2的四参数逻辑模型#203(IDBS,Guildford,Surry,UK)计算出IC₅₀值。结果请参见表20、21A与21B。

体内MDAMB-361DYT2肿瘤异种移植模型

用Her2+MDAMB-361DYT2细胞系进行抗体-药物缀合物的体内效力研究。对效力研究而言，将在50％基质胶中的1千万个肿瘤细胞植入6到8周龄照射裸小鼠皮下。当肿瘤尺寸达到250到350mm³范围时，通过尾静脉注射给药药物或媒介物。每四日四次(Q4dx4)地对小鼠注射1mg/kg剂量的抗体-药物缀合物。用卡尺在头50日每周测量肿瘤体积二次而后每周测量肿瘤体积一次并用下式计算：肿瘤体积＝(长度x宽度²)/2。由肿瘤体积除以经媒介物处理的肿瘤体积(T/C)，从而将经药物治疗的小鼠的肿瘤消退归一化，以将结果与其它研究进行对比。

在三个不同的MDA-MB-361-DYT2异种移植物研究中测试六种化合物以测定其抗肿瘤活性。其中四者的代表性研究结果说明在50日观测期间经媒介物处理的小鼠出现显著的肿瘤消退(图1)。由经药物治疗的肿瘤体积除以经媒介物处理的肿瘤体积(T/C)来将抗肿瘤活性归一化，从而将三个研究中的化合物的结果进行对比。六个T/C值的图(图2)说明六种化合物中的每一者在观测期间(对研究中的一者来说多达107日)导致完全的(或基本完全的)肿瘤消退。

在MDA-MB-361-DYT2异种移植物研究中的H(C)-#D54、H(C)-vcMMAE、H(C)-mcMMAF与H(K)-MCC-DM1的测试结果请参见图4。将处理组的肿瘤体积对对照组的肿瘤体积(T/C)作图以使缀合物之间进行对比(请参见图5C)。这些结果说明本文中模型中，H(C)-#D54显示与与H(C)-vcMMAE、H(C)-mcMMAF的缀合物相同的效力，并且优于与H(K)-MCC-DM1的缀合物。

体内N87肿瘤异种移植模型

用使用N87细胞系的靶表达异种移植模型进行抗体-药物缀合物的体内效力研究。对效力研究而言，将在50％基质胶中的750万个肿瘤细胞植入6到8周龄裸小鼠皮下直到肿瘤尺寸达到250到350mm³范围为止。通过尾静脉注射给药。视肿瘤对处理的反应而定，每四日处理四次地对小鼠注射1到10mg/kg的抗体-药物缀合物。每周监测所有小鼠的体重变化。用卡尺在头50日每周测量肿瘤体积二次而后每周测量肿瘤体积一次并用下式计算：肿瘤体积＝(长度x宽度²)/2。在肿瘤体积达到2500mm³以前人道处死小鼠。在处理一周后观测到肿瘤尺寸减小。在中止处理后持续监测小鼠的肿瘤再生。

在体内筛选模型中N87小鼠异种移植物中的H(C)-#D54、H(C)-vcMMAE、H(C)-mcMMAF与H(K)-MCC-DM1的测试结果请参见图3与5。这些结果说明本文中模型中H(C)-#D54优于/类似于H(C)-vcMMAE缀合物并且比H(C)-mcMMAF与H(K)-MCC-DM1缀合物更有效力。

药代动力学与毒理动力学

由单剂量小鼠药代动力学与大鼠毒理学研究测定小鼠药代动力学与大鼠毒理动力学(请参见表22与23)。由单剂量小鼠药代动力学与大鼠毒物学研究测定小鼠药代动力学与大鼠毒理动力学。由被给药3mg/kg单剂量的裸小鼠采集的样品测定小鼠药代动力学。采集样品长达336小时。由被单次给药3mg/kg、10mg/kg与30mg/kg剂量的H(C)-vc-MMAE或H(C)-#D54或被单次给药10mg/kg、30mg/kg与100mg/kg剂量的H(C)-mc-MMAD或H(C)-mc-MMAF的大鼠(Sprague-Dawley(Crl:CD(SD)))测定大鼠毒理动力学。采集样品长达336小时。用ELISA分析测量总抗体与ADC的循环浓度。对各种ADC计算出总抗体与ADC的曲线下面积(AUC)。同样计算出ADC对抗体AUC比。

H(C)-#D54总抗体与ADC的暴露大于在评估小鼠的3mg/kg剂量下及在评估大鼠的全部剂量下所观测到的H(C)-vc-MMAE的暴露。H(C)-#D54的ADC对Ab AUC比大于H(C)-vc-MMAE所观测到的ADC对Ab AUC比。这些结果发现H(C)-#D54具有更大的暴露并且ADC和/或连接基有效负载比H(C)-vc-MMAE的可能更稳定。

毒性

在观测2周的单剂量大鼠毒性研究中评估#D54和与非交叉反应性单克隆抗体(IgG1)缀合的比较连接基-有效负载(mcValCitPABC-MMAD及mcValCitPABC-MMAE)的靶无关的毒性。抗体-药物缀合物(ADC)的剂量是0、3、10及30mg/kg，n是每组5只雄鼠，在缀合物中连接基-有效负载是相似的(分别是3.8、3.2及4)。这些研究包括至少每日的临床观测、每周的体重、用显微镜检验9种或更多种组织与任何大体损伤的临床病理学(死亡)与验尸(第15到17日)。

观测在30mg/kg剂量下的全部缀合物与在10mg/kg剂量下的MMAD缀合物有相关的体重变化及发病征兆的死亡率。在存活组中没有临床观测或体重变化。

通过存活剂量组中的显微镜检验识别的缀合物的靶器官如下。在10mg/kg剂量下的缀合物在副睪内腔有碎片(5/5,最小到中等)，在心脏底部有炎症(1/5大鼠,最小)，并且在角膜的细胞有丝分裂增加(1/5大鼠,最小)。在3mg/kg剂量下缀合物没有组织学上的发现。对在3mg/kg剂量下的存活剂量组而言，MMAD缀合物在骨髓内与骨髓相关及在睪丸及副睪内有变化。对10mg/kg剂量而言，MMAE缀合物在骨髓、肾、肝及副睪内有变化。对3mg/kg剂量而言，MMAE缀合物在肾内有变化并且在肝内的细胞有丝分裂增加。因此在具有相似设计的研究及在存活组中，该缀合物在骨髓内没有用比较缀合物观察到的发现，并且在肝或肾内同样没有用比较缀合物中之一观察到的发现。

总之，所述缀合物与MMAE缀合物的最大耐受剂量(MTD)是10mg/kg，MMAD缀合物的最大耐受剂量是3mg/kg。所述缀合物的无明显副作用水平(NOAEL)是3mg/kg，而比较连接基-有效负载缀合物的NOAEL小于3mg/kg。此研究说明如何将#D54的毒理学性质与本领域中记载的某些化合物进行对比。

抗IL-13Rα2ADC体外与体内研究

抗IL-13Rα2抗体与ADC

人源化抗体hu08及IL-13Rα2受体特异性结合。hu08的氨基酸与核苷酸序列请参见表3。Kabat CDR被加下划线。

表3.人源化抗体hu08的氨基酸与核苷酸序列

人源化抗IL-13Rα2抗体hu08与本发明的多种连接基-有效负载组合缀合，如表4所示。按照本发明的方法制得抗体-药物缀合物。

表4.抗IL-13Rα2ADC

用抗IL-13Rα2ADC的体外胞毒性分析

用递增浓度的含有与本发明的各种连接基有效负载缀合的hu08抗体的抗IL-13Rα2ADC培养表达IL-13Rα2抗原的细胞系及负对照细胞系。4日后，评估各培养物的活力。通过逻辑非线性回归计算出IC₅₀值并表示成ngAb/mL。

数据说明与六种不同的奥里斯他汀有效负载缀合的抗IL-13Rα2抗体hu08v1.0/1.0对二种受试的IL-13Rα2正对照细胞系(PC3MM2)有效，其具有从1.1到4.9ng Ab/mL或从7.3到32.7pM的IC₅₀值(表5)。全部的ADC都没有对IL-13Rα2负对照细胞系H460的活性，并且非IL-13Rα2结合对照ADC(huIgG8.84-vc0101及huIgG8.84-mc3377)没有对任一受试细胞系的活性。

表5.人源化抗IL-13Rα2ADC的IC₅₀(ng Ab/mL)值

用抗IL13Rα2ADC的体内皮下异种移植模型

人源化抗体hu08与IL-13Rα2受体特异性结合。在体内异种移植模型中测试具有十一种不同的连接基-有效负载组合的hu08ADC。对雌性无胸腺(裸)小鼠皮下注射PC3MM2。对阶段性肿瘤(约0.1到0.3g)的小鼠(n＝8到10只小鼠/处理组)Q4dx4静脉内给药生理盐水(媒介物)、具有连接基-有效负载vc-0101、vc-6780、vc-3906、mc-8261、mc-0131、mc-6121、mc-3377、MalPeg-8261、MalPeg-0131、MalPeg-6121或MalPeg-3906的hu08v1.0/1.0ADC，和2或3mg Ab/kg剂量的与vc-0101或mc-3377缀合的一种非结合Ab(huIgG8.84)。根据Ab含量来给药ADC。每周至少测量一次肿瘤，按照下式计算肿瘤尺寸：mm³＝0.5x(肿瘤宽度²)x(肿瘤长度)。

表6中列出的体内效力结果显示受试的各种ADC的抗肿瘤活性范围。效力的相对顺序是hu08-vc-0101>hu08-vc-6780>hu08-mc-0131>hu08-mc-6121>hu08-mc-3906>hu08-MalPeg-0131>hu08-MalPeg-6121>hu08-MalPeg-3906>>hu08-mc-8261。在3mg/kg剂量下，hu08-vc-0101及hu08-mc-3377均证实抗肿瘤活性，而与vc-0101或mc-3377缀合的非结合Ab(huIgG8.84)没有抗肿瘤活性并与媒介物对照组相似。

表6.在PC3MM2异种移植物中的抗IL-13Rα2ADC效力

GT＝由于大的肿瘤尺寸而被终止的组

抗Notch ADC体外与体内研究

抗Notch抗体与ADC

人源化抗体hu28及hu75和大鼠-人嵌合抗体ch28及ch75与Notch受体特异性结合。hu28及hu75的氨基酸与核苷酸序列请参见表7。Kabat CDR被加下划线。

表7.人源化抗Notch抗体的氨基酸与核苷酸序列

与本发明的各种连接基-有效负载组合缀合的人源化抗Notch抗体hu28及hu75和大鼠-人嵌合抗Notch抗体ch28及ch75请参见表8。按照本发明的方法制得抗体-药物缀合物。

表8.抗Notch ADC

ADC连接基-有效负载#	相应的ADC命名法
		Notch-28-v1010-hG1-(C)_mcValCitPABC-#54	hu28-vc0101
Notch-28-v1010-hG1-(C)_mcValCitPABC-#112	hu28-vc6780
		Notch-75-v1913-hG1-(C)_mcValCitPABC-#54	hu75-vc0101
Notch-75-v1913-hG1-(C)_mcValCitPABC-#112	hu75-vc6780
		Notch-28-cG1-(C)_mcValCitPABC-#54	ch28-vc0101
Notch-28-cG1-(C)_mcValCitPABC-#112	ch28-vc6780
		Notch-28-cG1-(C)_mc-#54	ch28-mc0101
Notch-28-cG1-(C)_mc-0#118	ch28-mc0131
		Notch-28-cG1-(C)_mc-#115	ch28-mc3377
Notch-28-cG1-(C)_mc-#69	ch28-mc8261
		Notch-28-cG1-(C)_MalPeg6C2-0#118	ch28-MalPeg6C2-0131

Notch-28-cG1-(C)_MalPeg6C2-#69	ch28-MalPeg6C2-8261
		Notch-28-cG1-(C)_me-0#118	ch28-me0131
Notch-28-cG1-(C)_m(H2O)c-0#118	ch28-m(H2O)c-0131
		Notch-75-cG1-(C)_mcValCitPABC-#54	ch75-vc0101
Notch-75-cG1-(C)_mcValCitPABC-#112	ch75-vc6780
		Notch-75-cG1-(C)_mc-0#118	ch75-mc0131
Notch-75-cG1-(C)_mc-#115	ch75-mc3377
		Notch-75-cG1-(C)_MalPeg6C2-0#118	ch75-MalPegC2-0131
Notch-75-cG1-(C)_MalPeg6C2-#69	ch75-MalPeg6C2-8261
		Notch-75-cG1-(C)_me-0#118	ch75-me0131
Notch-75-cG1-(C)_m(H2O)c-0#118	ch75-m(H2O)c-0131
		huNeg8.8-(C)_mcValCitPABC-#54	huNeg8.8-vc0101
huNeg8.8-(C)_mcValCitPABC-#112	huNeg8.8-vc6780
		huNeg8.8-(C)_mc-0#118	huNeg8.8-mc0131
huNeg8.8-(C)_mc-#115	huNeg8.8-mc3377
		huNeg8.8-(C)_me-0#118	huNeg8.8-me0131
huNeg8.8-(C)_MalPeg6C2-#69	huNeg8.8-MalPeg6C2-8261
		ch2H6-(C)_mc-#69	ch2H6-mc8261

用抗Notch ADC的体外细胞毒性分析

用MTS细胞活力指示剂(Promega,Madison,WI)对下列评估抗Notch ADC的效果：1)内源表达Notch蛋白的细胞系：HCC2429(肺癌)、OVCAR3(卵巢癌)及MDA-MB-468(乳腺癌)，2)被基因工程改造以过度表达Notch蛋白的细胞系：MDA-MB-468/hNotch及U2OS/hNotch，及3)负对照细胞系(SW900)。用递增浓度的抗Notch ADC培养这些细胞系，所述抗Notch ADC含有与本发明的各种连接基-有效负载组合缀合的人源化抗Notch抗体hu28及hu75和大鼠-人嵌合抗Notch抗体ch28及ch75。就抗Notch-ADC的特异性对照而言，同样对相同的细胞系测试非靶向对照-ADC(huNeg8.8-ADC或ch2H6-ADC)。4日后，评估各种培养物的活力。通过逻辑非线性回归计算出IC₅₀并表示成ng Ab/mL。同样提供药物/抗体比(DAR)。

表9显示人源化抗Notch ADC处理的IC₅₀(ng Ab/mL)值。HCC2429和MDA-MB-468/hNotch细胞系有2个单个的重复序列。数据说明具有各种连接基-有效负载的人源化抗Notch ADC具有活性并诱导Notch表达与过度表达癌细胞系HCC2429、OVCAR3、MDA-MB-468、MDA-MB-468/hNotch、U2OS/hNotch中的细胞死亡，但在缺乏Notch表达的负对照细胞系SW900中没有活性。非靶向对照——ADC缺乏效力(LP)因此未产生如指出的IC₅₀值，或在最高测试剂量下具有最低限度的活性。具有等于或高于对照-ADC的IC₅₀值的IC₅₀值的抗NotchADC被认为缺乏体外效力并被称为LP。

表9.人源化抗Notch ADC的IC₅₀(ng Ab/mL)值

表10显示大鼠-人嵌合抗Notch ADC处理的IC₅₀(ng Ab/mL)值。对有2到4个单个的重复序列的试验计算平均IC₅₀值以及平均值的标准误差(S.E.M.)。数据说明具有各种连接基-有效负载的大鼠-人嵌合抗Notch ADC有活性并诱导Notch表达与过度表达癌细胞系HCC2429、OVCAR3、MDA-MB-468、MDA-MB-468/hNotch、U2OS/hNotch细胞死亡。非靶向对照——ADC缺乏效力(LP)并因此未产生如指出的IC₅₀值，或在最高测试剂量下有最低限度的活性。具有等于或高于对照-ADC的IC₅₀值的IC₅₀值的抗Notch ADC被认为缺乏体外效力并被称为LP。

表10.大鼠-人嵌合抗Notch ADC的IC₅₀(ng Ab/mL)值(nd＝未测定)

用抗Notch ADC的体内人肿瘤异种移植模型

人源化抗Notch抗体hu28及hu75和大鼠-人嵌合抗Notch抗体ch28及ch75与各种连接基-有效负载组合缀合，并在37622A1非小细胞肺癌(NSCLC)、HCC2429肺癌、MDA-MB-468乳腺癌与N87胃癌异种移植模型中测试。对于下文所述的各种模型，在第0日给予第一次剂量。每周至少测量一次肿瘤，按照下式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm³)＝0.5x(肿瘤宽度²)(肿瘤长度)。计算各处理组的平均肿瘤体积(±S.E.M.)，其包含最多10只鼠及最少6只鼠。

A.37622A1NSCLC异种移植物

在免疫缺陷小鼠中检验抗Notch ADC对由根据合适的同意的操作(Asterand)得到的新切除的37622A1NSCLC肿瘤片段建立的人肿瘤异种移植物的体内生长的作用。作为雌性裸(Nu/Nu)小鼠中的从动物到动物的片段，37622A1NSCLC患者源性异种移植物通过皮下进入体内。当肿瘤体积达到150到300mm³范围时，将其分阶段以确保各处理组的肿瘤尺寸一致。按照表11中提供的剂量，每4日4次对37622A1NSCLC模型Q4dx4静脉内给药PBS媒介物、人源化抗Notch ADC、对照huNeg-8.8ADC与顺铂。

顺铂是一种铂系抗癌药剂，其用于治疗癌症并被认为是一种护理标准疗法。顺铂与DNA交联从而诱导凋亡与细胞生长抑制。数据说明抗Notch ADC hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101及hu75-vc6780抑制37622A1NSCLC异种移植物的生长。再者，数据显示抗Notch ADC比对照huNeg8.8-ADC更能有效抑制肿瘤生长。此外，数据显示抗Notch ADC比顺铂更能有效抑制肿瘤生长，表明抗Notch ADC比铂系护理标准化疗药物效力更大。

表11.在37622A1NSCLC异种移植物中的抗Notch ADC的效力

B.HCC2429肺异种移植物

如前述用HCC2429肺癌细胞系进行相似的体内试验。将在50％基质胶(BDBiosciences)中的3.5x10⁶个HCC2429细胞植入雌性裸(Nu/Nu)小鼠皮下以产生异种移植物。当肿瘤体积达到200到400mm³范围时，将其分阶段以确保各处理组的肿瘤尺寸一致。按表12与13中提供的剂量对HCC2429肺模型Q4dx4静脉内给药PBS媒介物、人源化抗Notch ADC与及照huNeg-8.8ADC。数据说明抗Notch ADC hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101与hu75-vc6780以剂量依赖方式抑制HCC2429肺异种移植物的生长。再者，数据显示在1与3mg/kg剂量下(具有vc0101连接基-有效负载的抗Notch ADC)和在3与10mg/kg剂量下(具有vc6780连接基-有效负载的抗Notch ADC)，抗Notch ADC比对照huNeg8.8-ADC更能有效抑制肿瘤生长。此外，数据显示3mg/kg剂量的hu28-vc0101比10mg/kg剂量的hu28-vc6780更有效。

表12.在HCC2429肺异种移植物中的抗Notch-vc0101ADC的效力

表13.在HCC2429肺异种移植物中的抗Notch-vc6780ADC的效力

按照图8A中提供的5mg/kg剂量对HCC2429肺模型Q4dx4静脉内给药PBS媒介物、大鼠-人嵌合抗Notch ADC及对照huNeg-8.8ADC。数据说明具有不可裂解的(mc)与可裂解的(vc)连接基和各种有效负载组合的抗Notch ADC抑制HCC2429肺异种移植物的生长。再者，数据显示大鼠-人嵌合抗Notch ADC比对照huNeg8.8-ADC更能有效抑制肿瘤生长。此外，数据说明具有vc0101连接基-有效负载的大鼠-人嵌合抗Notch ADC比受试的其它抗NotchADC更有效。

C.MDA-MB-468乳房异种移植物

如前所述用MDA-MB-468乳腺癌细胞系进行相似的体内试验。MDA-MB-468细胞被归类为一种三阴性乳腺癌(TNBC)基底样亚型，原因是其缺乏雌激素受体、孕酮受体和人表皮生长因子受体2型(HER2)的表达(Lehmann,BD等人,J Clin Invest.2011；121(7):2750-2767)。用含有10x10⁶个MDA-MB-468细胞的50％基质胶(BD Biosciences)原位植入雌性SCID无毛远亲杂交(SHO)小鼠的乳房脂肪垫中以产生异种移植物。当肿瘤体积达到250到450mm³范围时，将其分阶段以确保各处理组的肿瘤尺寸一致。按照表14与15中提供的剂量对MDA-MB-468乳腺模型Q4dx4静脉内给药PBS媒介物、人源化抗Notch ADC及对照huNeg-8.8ADC。数据说明抗Notch ADC hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101与hu75-vc6780以剂量依赖方式抑制MDA-MB-468乳腺异种移植物的生长。再者，数据显示在1与3mg/kg剂量下(具有vc0101连接基-有效负载的ADC)和在1、3与10mg/kg剂量下(具有vc6780连接基-有效负载的ADC)，抗Notch ADC比对照huNeg8.8-ADC更能有效抑制肿瘤生长。此外，数据说明1mg/kg剂量的具有vc0101连接基-有效负载的抗Notch ADC比3mg/kg剂量的具有vc6780连接基-有效负载的抗Notch ADC更有效。

表14.在MDA-MB-468乳房异种移植物中的抗Notch-vc0101ADC的效力

表15.在MDA-MB-468乳房异种移植物中的抗Notch-vc6780ADC的效力

按照图8B和8C中提供的5mg/kg剂量同样对MDA-MB-468乳腺模型Q4dx4静脉内给药PBS媒介物、大鼠-人嵌合抗Notch ADC和对照huNeg-8.8ADC。数据说明具有不可裂解的(mc)与可裂解的(vc)连接基和各种有效负载组合的大鼠-人嵌合抗Notch ADC抑制MDA-MB-468乳腺异种移植物的生长。再者，数据显示大鼠-人嵌合抗Notch ADC比对照huNeg8.8-ADC更能有效抑制肿瘤生长。此外，数据说明具有vc0101连接基-有效负载的大鼠-人嵌合抗NotchADC比受试的其它大鼠-人嵌合抗Notch ADC更有效。

D.N87胃异种移植物

如前所述用N87胃癌细胞系进行相似的体内试验。将在50％基质胶(BDBiosciences)中的7.5x10⁶个N87细胞植入雌性裸(Nu/Nu)鼠皮下以产生异种移植物。当肿瘤体积达到250到450mm³范围时，将其分阶段以确保各个处理组的肿瘤尺寸一致。按照表16和17中提供的剂量对N87胃模型Q4dx4静脉内给药PBS媒介物、人源化抗Notch ADC、对照huNeg-8.8ADC和顺铂。数据说明抗Notch ADC hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101与hu75-vc6780以剂量依赖方式抑制N87胃异种移植物的生长。再者，数据显示在1、3、5mg/kg剂量下(具有vc0101连接基-有效负载的ADC)和在3与10mg/kg剂量下(具有vc6780连接基-有效负载的ADC)，抗Notch ADC比对照huNeg8.8-ADC更能有效抑制肿瘤生长。此外，数据说明具有vc0101连接基-有效负载的ADC一般比顺铂护理标准疗法和具有vc6780连接基-有效负载的ADC更有效。

表16.在N87胃异种移植物中的抗Notch-vc0101ADC的效力

表17.在N87胃异种移植物中的抗Notch-vc6780ADC的效力

按照图8D中提供的5mg/kg剂量同样对N87胃模型Q4dx4静脉内给药PBS媒介物、大鼠-人嵌合抗Notch ADC和对照huNeg-8.8ADC。数据说明具有不可裂解的(mc)与可裂解的(vc)连接基和各种有效负载组合的大鼠-人嵌合抗Notch ADC抑制N87胃异种移植物的生长。再者，数据显示大鼠-人嵌合抗Notch ADC比对照huNeg8.8-ADC更能有效抑制肿瘤生长。此外，数据说明具有vc0101连接基-有效负载的大鼠-人嵌合抗Notch ADC比受试的其它抗Notch ADC更有效。

按找图8E中提供的5mg/kg剂量同样对N87胃模型Q4dx4静脉内给药PBS媒介物与大鼠-人嵌合抗Notch ADC ch28-mc0131、ch75-mc0131、ch28-m(H2O)c-0131与ch75-m(H2O)c-0131。数据说明具有mc0131与m(H2O)c-0131连接基-有效负载的大鼠-人嵌合抗Notch ADC抑制N87胃异种移植物的生长。再者，数据说明具有m(H2O)c-0131连接基-有效负载的大鼠-人嵌合抗Notch ADC比具有mc0131连接基-有效负载的大鼠-人嵌合抗Notch ADC更有效。

表18A-本发明的选定化合物(具有连接基的细胞毒性肽)

表18B-本发明的选定化合物(具有连接基的细胞毒性肽)

表19A-本发明的选定缀合物

表19B-本发明的选定缀合物

表20-本发明的选定化合物(细胞毒性肽)的IC₅₀值

表21A-本发明的选定缀合物的IC₅₀值

表21B–本发明的选定缀合物的IC₅₀值

表22-本发明的缀合物在大鼠中的选定药代动力学值及包含MMAD、MMAE或MMAF的缀合物在大鼠中的选定药代动力学值。在从0到336小时的持续时间区间(0-last of0-336h)计算AUC(除非特别说明)。

¹表示从0-312小时

²表示从0-168小时

³表示从0-96小时

表23-本发明的缀合物在小鼠身上的选定药代动力学值与包含MMAD、MMAE或MMAF的缀合物在小鼠身上的选定药代动力学值。在从0到336小时的持续时间区间计算AUC(除非特别说明)。

¹代表从0-168小时

表24-显示用开环丁二酰亚胺系连接基制得的缀合物对闭环丁二酰亚胺系连接基制得的缀合物的稳定性的数据

表25A-所选定有效负载及其合成方法

表25B-所选定有效负载及其IUPAC名称和表征数据

Claims

1.式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

(i)R^3A是C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基、卤素或芳烷基；和

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

C₁-C₁₀杂环基、C₃-C₈碳环基和C₆-C₁₄芳基，其任选地被1、2、3、4或5个独立地选自下列的基团取代：-C₁-C₈烷基、-C₁-C₈烷基-N(R')₂、-C₁-C₈烷基-C(O)R'、-C₁-C₈烷基-C(O)OR'、-O-(C₁-C₈烷基)、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)N(R')₂、-NHC(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)R'、-OH、卤素、-N₃、-N(R')₂、-CN、-NHC(＝NH)NH₂、-NHCONH₂、-S(＝O)₂R'和-SR'，其中每个R'独立地选自：氢、C₁-C₈烷基和未取代芳基，或两个R'可与它们所连接的氮一起形成C₁-C₁₀杂环基；或

R⁵是

R¹²是氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀杂环基或C₆-C₁₄芳基；

R¹³是C₁-C₁₀杂环基；和

X是O。

2.式IIa的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是

Y是-C₂-C₂₀亚烷基-、-C₂-C₂₀杂亚烷基-、-C₃-C₈碳环基-、-亚芳基-、-C₃-C₈杂环基-、-C₁-C₁₀亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈碳环基)-、-(C₃-C₈碳环基)-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈杂环基)-、-(C₃-C₈杂环基)-C₁-C₁₀亚烷基-或-(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂-，其中q是1至10；

Z是

式-NH₂；

G是卤素、-OH、-SH或-S-C₁-C₆烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

(i)R^3A是C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基、芳烷基或卤素；和

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

或R⁵是

R¹²是氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀杂环基或C₆-C₁₄芳基；

R¹³是C₁-C₁₀杂环基；和

R⁷每次出现时独立地选自：F、Cl、I、Br、NO₂、CN和CF₃；

h是1、2、3、4或5；和

X是O。

3.式IIIa的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

R¹¹是

Y是-C₂-C₂₀亚烷基-、-C₂-C₂₀杂亚烷基-、C₃-C₈碳环基-、-亚芳基-、-C₃-C₈杂环基-、-C₁-C₁₀亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈碳环基)-、-(C₃-C₈碳环基)-C₁-C₁₀亚烷基-、-C₁-C₁₀亚烷基-(C₃-C₈杂环基)-、-(C₃-C₈杂环基)-C₁-C₁₀亚烷基-或-(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂-，其中q是1至10；

Z是

或NH₂；

G为卤素、-OH、-SH或-S-C₁-C₆烷基；

R⁷每次出现时独立地选自：F、Cl、I、Br、NO₂、CN和CF₃；

h是1、2、3、4或5；和

X是O。

4.式IIb的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是

Z是

式-NHL；

L是抗体；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

或R⁵是

R¹²是氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀杂环基或C₆-C₁₄芳基；

R¹³是C₁-C₁₀杂环基；和

X是O。

5.式IIIb的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

R¹¹是

Z是

式-NHL；

L是抗体；

X是O。

6.式IIc的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中，每次出现时，独立地，

R^1'是

Z'是

或-NH-；

L是抗体；

D不存在；

R^3A'与R^3B'是下列中的任一者：

(i)R^3A'是C₁-C₈烷基、C₁-C₈卤代烷基、C₃-C₈碳环基、C₁-C₁₀杂环基、芳基、杂芳烷基、芳烷基或卤素；和

(ii)R^3A'与R^3B'合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

或R⁵是

R¹²是氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀杂环基或C₆-C₁₄芳基；

R¹³是C₁-C₁₀杂环基；和

X是O。

7.式IIIc的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

R^11'是

Z'是

或-NH-；

L是抗体；

X是O。

8.式IId的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中，每次出现时，独立地，

L是抗体；

[连接基]是二价连接基；

D不存在；

R^3A'与R^3B'是下列中的任一者：

(ii)R^3A'与R^3B'合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

或R⁵是

R¹²是氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₁₀杂环基或C₆-C₁₄芳基；

R¹³是C₁-C₁₀杂环基；和

X是O。

9.式IIId的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中，每次出现时，独立地，

W是

R¹是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R²是氢、C₁-C₈烷基或C₁-C₈卤代烷基；

R^3A与R^3B是下列中的任一者：

(ii)R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基；

R⁵是

[连接基]是二价连接基；

L是抗体；

X是O。

10.权利要求1至9中任一项的化合物、盐或溶剂合物，其中R²是氢或C₁-C₈烷基。

11.权利要求1至9中任一项的化合物、盐或溶剂合物，其中R^3A是C₁-C₈烷基。

12.权利要求1至5、7和9中任一项的化合物、盐或溶剂合物，其中R^3A与R^3B合起来是C₂-C₈亚烷基或C₁-C₈杂亚烷基。

13.权利要求1至2、4、6和8中任一项的化合物、盐或溶剂合物，其中R⁵是

14.权利要求5至9中任一项的化合物、盐或溶剂合物，其中所述抗体选自：曲妥珠单抗、奥戈伏单抗、依决洛单抗、西妥昔单抗、玻连蛋白受体(α_vβ₃)的人源化单克隆抗体、阿仑珠单抗、用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的人源化抗HLA-DR抗体、131I Lym-1、用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的鼠抗HLA-Dr10抗体、用于治疗霍奇金氏病与非霍奇金氏淋巴瘤的人源化抗CD2mAb、拉贝珠单抗、贝伐单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、伊匹单抗、吉妥珠单抗、抗IL13抗体和抗Notch抗体。

15.选自以下的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

16.选自以下的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

17.有效负载连接基或抗体-药物缀合物，其包含权利要求15或16的化合物基团。

18.抗体-药物缀合物，其包含权利要求1至3的化合物基团。

19.选自以下的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：

20.抗体-药物缀合物，其包含权利要求19的化合物基团。

21.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其为：

22.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其为：

23.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其为：

24.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其为：

25.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其为：

26.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其为：

27.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其为：

28.药物组合物，其包含权利要求1至27中任一项的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，和药学上可接受的赋形剂。

29.权利要求1至27中任一项的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或者权利要求28的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。