TWI710569B - 新穎美洲室塵蟎蛋白質 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種新穎美洲室塵蟎蛋白質、及使用其之因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之診斷藥、預防藥、及治療藥等，其係選自以下之(a)~(c)中之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽。
(a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質。
(b)包含序列編號2所示之胺基酸序列中有1個或數個胺基酸經取代、缺失或附加之胺基酸序列，且具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質。
(c)包含與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列，且具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質。
Description
本發明係關於一種源自美洲室塵蟎之新穎蛋白質、及該蛋白質之利用。
作為過敏性疾病之代表性者，可列舉花粉症等過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、異位性支氣管哮喘、異位性皮炎等，近年來在日本該等過敏性疾病之患病率日趨增加。已知異位性支氣管哮喘或異位性皮炎之發病原因多數在於包括蟎之蟲體、蟎之排泄物、黴、寵物等動物之毛等在內之室塵，已知尤其是源自生存於室內之塵蟎之過敏原發揮重要作用。(非專利文獻1)。
大部分生存於室內之代表性塵蟎包括美洲室塵蟎(Dermatophagoides Farinae，以下簡稱為「Der f」))及歐洲室塵蟎(Dermatophagoides pteronyssinus，以下簡稱為「Der p」))。已知該等塵蟎於溫暖且濕潤之條件下繁殖能力最強，現代生活中高氣密化、高隔熱化之建築物增加，室內全年保持為適於塵蟎之條件之機會增加，導致其生存數量增加。認為該情況係過敏性疾病增加之原因之一。
關於該等過敏性疾病之治療，使用抗組織胺藥、類固醇抗炎藥、抗白三烯藥、去顆粒抑制藥、Th2細胞激素抑制藥等，但均限於對症療法。然而，近年來業界相繼開發出以皮下過敏原免疫療法(SCIT)或舌下過敏原免疫療法(SLIT)為代表之過敏原免疫療法。過敏原免疫療法係藉由將過敏原逐次少量地投予至體內而控制針對過敏原
之免疫應答的治療方法，其被認為係目前能夠根治過敏性疾病之唯一方法。
關於過敏原免疫療法之開發，並不缺少關於作為原因之過敏原之研究與理解。例如據稱在日本生存數較多之美洲室塵蟎蟲體或排泄物中存在稱為Der f 1、Der f 2、Der f 3之抗原性較高之過敏原，且已被選殖(非專利文獻2、3)。又，根據過去之報告，可知80%以上之蟎蟲過敏患者具有對該等抗原之任意1種以上具有特異性之IgE(非專利文獻4)。此外，業界亦活躍地進行美洲室塵蟎過敏原之探索研究，謀求對於因蟎所致之過敏性疾病之預防或治療更有用之新穎過敏原蛋白質(非專利文獻5)。
[非專利文獻1]Korsgaard J, et al., Allergy, 53: 77 - 83, 1998
[非專利文獻2]Dilworth RJ, et al., Clinical and Experimental Allergy, 21: 25 - 32, 1991
[非專利文獻3]Yuuki T. et al., Jpn. J. Allegol., 39 (6): 557 - 561, 1990
[非專利文獻4]Heymann PW, et al., J. Allergy Clin. Immunol., 83: 1055 - 1067, 1989
[非專利文獻5]Thomas WR, et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 129: 1 - 18, 2002
本發明係關於提供一種新穎美洲室塵蟎蛋白質、及使用其之因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之診斷藥、預防藥、及治療藥等。
本發明者等人為了解決上述問題而進行研究，結果自美洲室塵蟎排泄物中成功地取得顯示出與源自因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病患者之血清中IgE之較高反應性，且分子量為110kDa左右之新穎蛋白質，並且發現其作為因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之診斷藥、預防藥、治療藥有用。
即，本發明係關於以下之1)~12)者。
1)一種美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽，其係選自以下之(a)~(c)：(a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含序列編號2所示之胺基酸序列中有1個或數個胺基酸經取代、缺失或附加之胺基酸序列，且具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質；(c)包含與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列，且具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質。
2)一種聚核苷酸，其編碼選自以下之(a)~(c)中之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽：(a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含序列編號2所示之胺基酸序列中有1個或數個胺基酸經取代、缺失或附加之胺基酸序列，且具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質；(c)包含與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列，且具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質。
3)一種聚核苷酸，其係選自以下之(d)~(f)：(d)包含序列編號1所示之鹼基序列之聚核苷酸；(e)與包含序列編號1所示之鹼基序列互補之鹼基序列之聚核苷酸於嚴格條件下進行雜交，且編碼具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質
的聚核苷酸；(f)包含與序列編號1所示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列，且編碼具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質的聚核苷酸。
4)一種因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療劑，其將上述1)之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽作為有效成分。
5)一種因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之診斷藥，其將上述1)之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽作為有效成分。
6)一種結合蛋白質，其與上述1)之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽結合。
7)如上述6)之結合蛋白質，其係抗體分子。
8)如上述6)之結合蛋白質，其係單株抗體。
9)一種如上述1)之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽之用途，其用於製造因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療劑。
10)一種如上述1)之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽之用途，其用於製造因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之診斷藥。
11)如上述1)之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽，其用於因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療。
12)如上述1)之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽，其用於因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之診斷。
本發明之美洲室塵蟎蛋白質由於顯示出與源自因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病患者之血清中IgE之較高反應性，故而可用於因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之診斷、預防、及治療。該美洲室塵蟎蛋白質由於不同於公知之美洲室塵蟎過敏原、尤其不同於Der f 1(分子量約為27kDa)、Der f 2(分子量約為15kDa)、Der f 3(分子量約為29kDa)之蛋白質，故而藉由與該等組合，能夠實現更有用之過敏原免疫
療法。
圖1係利用SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析美洲室塵蟎粗萃取液及粗純化物(藉由使用FPLC(Fast protein liquid chromatography，快速蛋白液相層析)之陰離子交換層析法進行區分)之圖。
圖2係表示使用5名因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病患者(RAST(radioallergo-sorbent test，抗過敏原吸收試驗)分數≧2)之血清的純化過敏原特異性IgE抗體效價之分析結果的圖。
圖3係表示使用因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病患者(2名)之末梢血液的過敏原活性評價(嗜鹼性球上之CD203c表現增強)之結果的圖。圖中百分比表示分析對象細胞中之P4門內之細胞群體。
美洲室塵蟎蛋白質
本發明之美洲室塵蟎蛋白質為選自以下之(a)~(c)中之蛋白質或其片段肽。
(a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質。
(b)包含序列編號2所示之胺基酸序列中有1個或數個胺基酸經取代、缺失或附加之胺基酸序列，且具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質。
(c)包含與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列，且具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質。
(a)之包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質係藉由使用FPLC之陰離子交換層析法自美洲室塵蟎區分後，藉由超濾法去除100kDa以下之蛋白，藉此而分離、純化之蛋白質，其具有以下之性質。
i)顯示出與因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病患者之血清中IgE之
結合反應。
ii)使因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病患者之嗜鹼性球活化。
iii)利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)所測得之分子量約為110kDa。
因此，該蛋白質係不同於以Der f 1(分子量約為27kDa)、Der f 2(分子量約為15kDa)、Der f 3(分子量約為29kDa)為代表之公知之美洲室塵蟎過敏原(非專利文獻5)的新穎美洲室塵蟎蛋白質。
關於本發明之美洲室塵蟎蛋白質，只要具有美洲室塵蟎過敏原活性，則包括含有該序列編號2所示之胺基酸序列中有1個或數個胺基酸經取代、缺失或附加之胺基酸序列之蛋白質(上述(b))。作為包含此種胺基酸序列之美洲室塵蟎蛋白質，例如可列舉具有序列編號2所示之胺基酸序列之美洲室塵蟎蛋白質之異構體等。此處，缺失、取代或附加之數個胺基酸係指例如1~10個，進而較佳為1~5個胺基酸。又，上述附加包括對於兩末端附加1~數個胺基酸。
本說明書中所謂「過敏原」係指引起過敏性疾病之原因物質。又，「美洲室塵蟎過敏原活性」不僅指與肥胖細胞上之IgE結合，對異位性之人類引起速發型過敏反應之活性(De Weck,AL.et al.,Int.Arch.Allergy Immunol.,146：177-189,2008)，亦包含僅與血清中之IgE結合之活性(參考實施例2(i))。
又，關於本發明之美洲室塵蟎蛋白質，只要具有美洲室塵蟎過敏原活性，則包括含有就序列編號2所示之胺基酸序列將相當之序列適當排序時，與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之蛋白質之蛋白質((上述(c))。
此處，與序列編號2所示之胺基酸序列之同一性較佳為95%以上，更佳為98%以上。該胺基酸序列之同一性例如可應用使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for
Biological Information，美國國家生物技術信息中心之局部序列排比檢索基本工具)，並以初始設定值而計算可選參數之方法。
又，本發明之美洲室塵蟎蛋白質亦可為如融合蛋白般之更大之蛋白質之一部分。此處，作為於融合蛋白中附加之序列，例如可列舉如多重組胺酸殘基般之有助於純化之序列、確保重組生產時之穩定性之附加序列等。
本發明之美洲室塵蟎蛋白質亦可為僅有過敏原活性所必須之區域的片段肽。例如，尤其適宜地列舉包含藉由被因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病患者之T細胞特異性地識別之抗原決定基(T細胞抗原決定基)之部分片段。關於與HLA(Human Leukocyte Antigen，人類白細胞抗原)II類分子結合而被抗原呈現之肽之長度，根據肽分析之結果(Chicz,R.M.et al.,J.Exp.Med.,178：27-47,1993)，認為其為包含約10~34之胺基酸殘基者，因此至少包含1個T細胞抗原決定基之片段亦包括此種長度之肽。
T細胞抗原決定基可藉由使用10mer~20mer左右之重疊肽之研究、例如Jahn-Schmid B.J.et al.,Allergy Clin Immunol.126(5)：1068-71,2010或Sone,T,et al.,J.Immunol.,161：448-457,1998等中所記載之方法進行鑑定。
編碼美洲室塵蟎蛋白質之聚核苷酸
本發明之聚核苷酸係編碼上述美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽者，可適宜地列舉：(d)包含序列編號1所示之鹼基序列之聚核苷酸；(e)與包含序列編號1所示之鹼基序列互補之鹼基序列之聚核苷酸於嚴格條件下進行雜交，且編碼具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質的聚核苷酸；(f)包含與序列編號1所示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列，且編碼具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質的聚核苷酸。
(e)及(f)之聚核苷酸包括(d)之聚核苷酸之變異體。該變異體中包含天然之相對基因變異體或可使用該領域公知之突變誘發技術而產生之天然不存在之變異體。
本發明之聚核苷酸不僅包括雙鏈DNA(Deoxyribose Nucleic Acid，脫氧核糖核酸)，亦包括構成其之稱為同義鏈及反義鏈之各種單鏈DNA或RNA(Ribose Nucleic Acid，核糖核酸)。反義鏈能夠用作探針等。DNA中包含例如利用選殖或化學合成技術或該等之組合而獲得之cDNA或基因組DNA等。進而，本發明之聚核苷酸除了包含編碼本發明之多肽之鹼基序列以外，亦可包含非轉譯區(UTR)之序列或載體序列(包含表現載體序列)等鹼基序列。
此處，所謂嚴格之條件，例如可列舉Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子選殖實驗指南)(Second Edition,J.Sambrook et.al,1989)所記載之條件等。即，可列舉於包含6×SSC(sodium chloride-sodium citrate，氯化鈉-檸檬酸鈉)(1×SSC之組成：0.15M氯化鈉、0.015M檸檬酸鈉、pH值7.0)、0.5%SDS、5×丹哈特溶液及100mg/mL之鯡魚精子DNA之溶液中與探針一併於65℃下恆溫8~16小時，而使其雜交之條件等。
又，與序列編號1所示之鹼基序列之同一性較佳為95%以上，更佳為98%以上。該鹼基序列之同一性例如可應用使用BLAST，並以初始設定值而計算可選參數之方法。
編碼美洲室塵蟎蛋白質之聚核苷酸之取得
編碼本發明之美洲室塵蟎蛋白質之聚核苷酸可自美洲室塵蟎進行選殖，作為選殖方法可列舉現有方法、例如使用霰彈槍法、PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)法而進行之方法。
例如，製備與本發明之聚核苷酸之鹼基序列之一部分特異性地雜交之探針，使用該探針對基因組DNA基因庫或cDNA基因庫進行篩
選即可。作為此種探針，只要為與本發明之聚核苷酸或其互補鏈之至少一部分特異性地雜交之探針，則可使用具有任何序列及長度者。
又，本發明之聚核苷酸亦可藉由使用適當之原理取得與包含本發明之聚核苷酸之一部分或全部之聚核苷酸進行雜交之序列而獲得。例如可列舉：使用上述包含本發明之聚核苷酸之一部分之聚核苷酸作為引子而進行之PCR法；使用上述包含本發明之聚核苷酸之一部分之聚核苷酸作為探針之方法。
例如，使用PCR等擴增方法之方法可藉由自本發明之聚核苷酸之5'側及3'側之序列(或其互補序列)中分別製備引子，使用該等引子，以基因組DNA(或cDNA)等作為模板並進行PCR等擴增反應，擴增兩引子間所夾之DNA區域，而大量取得包含該聚核苷酸之DNA片段。
又，本發明所提供之聚核苷酸亦可藉由利用例如計劃或隨機突變導入法等方法來改良包含序列編號1所示之鹼基序列之聚核苷酸而製作。
此處，計劃性地導入突變時之突變之計劃例如可藉由考慮聚核苷酸序列上之特徵性序列而進行。又，作為隨機導入突變之方法，例如可列舉PCR法、基於誘發突變處理之方法。作為計劃性地導入突變之方法，可列舉定點突變誘發法，更具體而言例如可使用定點突變系統Mutan-Super Express Km套組(TAKARA BIO INC.)等而進行。又，亦可使用重組PCR法(PCR protocols,Academic Press,New York,1990)。
美洲室塵蟎蛋白質之製造
本發明之美洲室塵蟎蛋白質可藉由自美洲室塵蟎分離純化而獲得。分離純化方法無特別限定，例如，對美洲室塵蟎萃取液使用凝膠過濾、離子交換層析法、親和層析法等先前公知之方法進行分離、純化即可。
又，可將藉由對適當載體組入本發明之聚核苷酸而製作之重組載體導入至宿主細胞中，使美洲室塵蟎蛋白質於細胞內或細胞外表現，並進行採集。
供插入本發明之聚核苷酸之載體只要能夠於大腸桿菌、枯草桿菌等細菌、酵母或動物細胞等宿主中進行複製，則無特別限定，例如可列舉質體DNA、噬菌體DNA等。用於構建表現載體之載體DNA係使用廣泛普及之易取得者。例如可列舉pUC19(TAKARA BIO INC.)、pTV118N(TAKARA BIO INC.)、pMAMneo(Clontech)、pGEX(GE healthcare)、pET160(Invitrogen)、pDEST(Invitrogen)等。
關於使用該重組載體使宿主轉形，可使用原生質體法、勝任細胞法、電穿孔法等而進行。作為宿主，並無特別限定，可使用所有宿主，例如可使用動物、源自動物之細胞、植物、源自植物之細胞、微生物等。
對於所獲得之轉形體，使用包含可同化之碳源、氮源、金屬鹽、維生素等之培養基，於適當條件下進行培養即可。藉由一般方法，自如此所獲得之培養液採取、純化蛋白質，可獲得本發明之美洲室塵蟎蛋白質。
因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療
因本發明之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽由於顯示出與源自因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病患者之血清中IgE之高反應性，故而可成為因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療劑，可投予患者而用於因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療。
此處，因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療具體而言係指針對因美洲室塵蟎之特異抗原所致之所有過敏性疾病之預防或治療，作為該過敏性疾病，例如可列舉異位性支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、異位性皮炎等。
該因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療例如可列舉針對因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之過敏原免疫療法。
又，本發明之美洲室塵蟎蛋白質由於係不同於以先前公知之Der f 1、Der f 2為代表之過敏原的蛋白質，故而藉由與該等組合，能夠實現更有用之過敏原免疫療法。
於使用本發明之因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療劑作為過敏原免疫治療劑之情形時，較佳為直接使用美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽，或將其乾燥製成粉末狀，或製備成視需要而利用常用方法添加有通常使用之各種添加劑、例如穩定劑、賦形劑、溶解助劑、乳濁化劑、緩衝劑、鎮痛劑、防腐劑、著色劑等的複合劑。
例如，可將粉末狀之經純化之美洲室塵蟎蛋白質溶解至添加有苯酚之生理食鹽水中，用作過敏原免疫療法用抗原之原液。
於使用本發明之因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療劑作為過敏原免疫治療劑之情形時，投予時可包含具有免疫活化作用之佐劑。作為佐劑，例如可列舉弗氏完全佐劑(Complete Freund's adjuvant)(CFA)、弗氏不完全佐劑(Incomplete Freund's adjuvant)(IFA)、礬、脂質A、單磷醯脂質A、BCG(Bacillus-Calmette-Guerrin，卡介苗)等細菌製劑、CpG-DNA、dsRNA等核酸、結核菌素等細菌成分製劑、鑰孔血藍蛋白或酵母甘露聚糖等天然高分子物質、胞壁醯三肽又胞壁醯二肽或該等之衍生物、明礬(alum)、非離子性嵌段共聚物、介白素2(IL-2)或巨噬細胞群落刺激因子(Granulocyte Macrophage colony stimulating Factor)(GM-CSF)、干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)等細胞激素等，可使用該等之1種或組合使用2種以上。佐劑亦可於與本發明之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽混合之狀態下使用，或者以乳液之形式同時投予而使用。
本發明之因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療劑可藉
由通常之投予路徑，例如經皮、經黏膜、經口、皮內、皮下、肌內、腹腔內、滴鼻等投予方法而進行。根據投予形態，可製備成錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、口含錠、舌下錠、糖漿劑、注射劑、栓劑、吸入劑、經皮吸收劑、滴眼液、滴鼻劑、鼻腔噴劑、敷劑、糊劑、軟膏、洗劑、霜劑等各種劑型之製劑。
本發明之因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療劑之投予量及投予次數根據投予路徑、症狀等而不同，例如可以每1次投予量成為約0.1μg~100mg之範圍之方式適當選擇，每週投予1次至數次之程度。
因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之診斷
本發明之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽可成為因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病診斷試藥，具體而言可成為針對因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之皮內反應診斷藥，可藉由將其少量注射至被試驗者之皮內，把握活體對於美洲室塵蟎之過敏狀態或免疫狀態，而用於抗原之確定或疾病之診斷。
於用作皮內反應診斷藥之情形時，將藉由上述方法所取得之本發明之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽例如加以乾燥而製成粉末狀，將其溶解於包含苯酚之生理食鹽水中進行稀釋而使用。
與美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽結合之結合蛋白質
與本發明之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽結合之結合蛋白質為可與本發明之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽特異性地結合之蛋白質。作為結合蛋白質，例如可列舉：免疫球蛋白(IgA、IgD、IgG、IgM、IgY等)、Fab片段、F(ab')2片段、單鏈抗體片段(scFv)、單區抗體等(Carter,PJ.,Nat.Rev.Immunol.,6：343-357,2006)抗體分子、Affibody、DARPins、Avimer等抗體樣分子，作為抗體分子，可列舉：多株抗體、單株抗體(小鼠抗體、嵌合抗體、人類化抗體及人類
抗體等)，但不限定於該等。
上述結合蛋白質可使用各種公知方法而製作，製作方法並無特別限定。
上述結合蛋白質可用於表現本發明之美洲室塵蟎蛋白質之生物體或其組織或細胞之鑑定等。例如，可用於測定大氣中或室內之空間或人類之黏膜中有無美洲室塵蟎蛋白質等。該測定可藉由公知免疫方法而進行，例如可藉由ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酶結合免疫吸附分析)法而進行。
又，亦可用於因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之治療。
以下，藉由實施例具體地說明本發明，但本發明不限定於該等實施例。
[實施例]
實施例1 自美洲室塵蟎純化蛋白質
將長期飼養過蟎之培養基進行加濕乾燥，並通過180μm之篩後，使其分散至磷酸鹽緩衝液(PBS，phosphate buffered saline)中，立即通過53μm之篩而去除不溶物。將分散有排泄物之PBS於37℃下靜置2小時，並萃取可溶性成分。於4℃、5,000rpm下離心30分鐘而分離上清液，利用區分分子量12,000~14,000之透析膜透析2天而去除低分子成分。使用離心濃縮器(Vivaspin 20、MWCO 10kDa)對其進行濃縮，而獲得粗萃取物。
對粗萃取物加入10倍量之20mM Tris-HCl(pH值9.0)後，將其供於陽離子管柱(Vivapure S Maxi M)，進行離心(500g、5分鐘)後回收溶出組分。將溶出組分供於陰離子層析儀(Uno Q 1mL、Bio-Rad)，以0~1M之NaCl梯度使其溶出。回收包含目標蛋白質之成分，並使用離心濃縮器(Vivaspin 6、MWCO 100kDa)去除低分子組分，而獲得純化蛋白質。將利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)分析純化蛋白
質之結果示於圖1。
實施例2 純化抗原之過敏原活性之確認
(i)與因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病患者血清IgE之反應性之確認
製備本發明蛋白質及已知之蟎抗原(Der f1)之20μg/mL溶液，以成為1μg/50μL/well之方式添加至Maxisorp 96孔培養盤(培養皿)中之後，於4℃下靜置一晚，藉此使抗原固相化。次日洗淨培養盤後，添加含有1%牛血清白蛋白之PBS，並於室溫下靜置1小時，藉此實施阻斷。洗淨培養盤後，添加稀釋5倍之患者血清，並於室溫下靜置2小時。作為陰性對照，使用市售之人類AB型血清(CELLect(R)Human AB serum，MP Biomedicals)。洗淨培養盤洗淨後，添加利用含有1%牛血清白蛋白之PBS稀釋7000倍之二次抗體(經HRP標記之山羊抗人類IgE抗體、Novus)，於室溫下靜置40分鐘。洗淨培養盤後，利用TMB受質試劑組(BD Biosciences)於室溫靜置、遮光狀態下實施20分鐘TMB顯色。結束後，藉由添加1N硫酸而停止顯色，並利用微盤讀取器測定波長450nm之吸光度。將其結果示於圖2。
(ii)因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病患者嗜鹼性球之活化
已知於過敏原刺激之嗜鹼性球中，CD203c之表現增強(De Weck,AL.et al.,Int.Arch.Allergy Immunol.,146：177-189,2008)。使用基於該原理之致敏性套組(Beckman Coulter)分析患者血液中之嗜鹼性球活化。向肝素採血之全血100μL中加入本發明蛋白質之過敏原溶液(最終濃度1~100ng/ml)20μL與包含CD3-PC7、CRTH2-FITC及CD203c-PE之混合型抗體20μL，於37℃下保溫15分鐘。加入反應停止液100μL與溶血固定液2mL，於室溫下反應10分鐘。離心(200×g、5分鐘)後，去除上清液，加入磷酸緩衝液(PBS)3mL再次進行離心。去除上清液後，使細胞懸浮於添加有0.1%甲醛之PBS中，利用流式細
胞儀(FACScanto、BD Biosciences)進行測定。針對所獲得之資料，將為CD3-PC7陰性且CRTH2-FITC陽性者作為指標，篩選血細胞中之嗜鹼性球，分析CD203c之表現強度。將其結果示於圖3。與僅添加PBS時相比，可見添加過敏原時之CD203c之表現增強。
實施例3 鹼基序列及胺基酸序列之確定
<部分內部胺基酸序列之確定>
為了明確本發明蛋白質內部之部分胺基酸序列，進行利用蛋白酶進行限制性水解所獲得之片段之分析。對純化蛋白質50μg進行SDS-PAGE後，將分子量為110kDa條帶附近之凝膠切碎，於1mL之純化水中進行攪拌、洗淨(20分鐘×2次)。藉由添加300μL之7mol/L胍/0.5mol/L Tris-HCl/0.01mol/L EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)(pH值8.5)及10μL之2-巰基乙醇，進行氮氣置換與超音波處理後，於室溫下靜置2小時而進行還原。其次，添加10μL之4-乙烯基吡啶，進行氮氣置換與超音波處理(1分鐘)後，於室溫下靜置30分鐘，藉此進行烷基化。棄去反應液後，重新加入1mL之0.1vol%三氟乙酸，確認其為酸性後攪拌1小時。棄去溶液，於1mL之0.025mol/L碳酸銨/50vol%乙腈中進行攪拌(20分鐘×2次)。棄去溶液，於1mL之乙腈中攪拌5分鐘後棄去溶液，利用離心蒸發器將凝膠減壓乾燥。以酶/受質比為1/20添加溶解至0.025mol/L碳酸銨中之離胺醯肽鏈內切酶，於冰上靜置使凝膠膨潤1小時。追加0.025mol/L碳酸銨，使溶液完全滲入凝膠中之後，進而於37℃下反應17小時，並回收反應液([1]液體)。為了萃取肽，向剩餘之凝膠中添加100μL之0.1vol%三氟乙酸/50vol%乙腈並攪拌20分鐘後，回收萃取液([2]液體)。進而於100μL之乙腈中攪拌20分鐘後，回收萃取液([3]液體)。混合[1]~[3]液體並減壓濃縮後，藉由逆相之高效液相層析法(XBridge C18)，以乙腈0~80重量%之梯度進行溶出、區分。分取兩個主要
肽，利用蛋白質測序儀(Procise 492cLC；Applied Biosystems)進行N末端胺基酸序列分析，結果獲得Thr-Asp-Asp-Phe-Phe-Pro-Tyr-Ala-Ser-Asp-Glu-His-Ala-Tyr-Trp-Thr-Gly-Tyr-Phe-Thr[部分胺基酸序列1(序列編號3)]與Gln-Gly-Asp-Tyr-Val-Glu-Phe-Asp-Phe-Val-Val-Gly-Pro-Ile-X-Val[部分胺基酸序列2(序列編號4)]。
<美洲室塵蟎RNA之萃取>
使用RNeasy迷你套組(Qiagen)並藉由以下操作，自於液態氮中冷凍之美洲室塵蟎中萃取RNA。對美洲室塵蟎10mg加入600μL之緩衝液RLT，通過18G注射針而將其破碎。將美洲室塵蟎懸浮液加入QIAshredder旋轉離心柱(Qiagen)中進行離心(15000rpm、2分鐘)，並回收流出物。向所回收之RNA溶液中添加70%乙醇水溶液600μL後，添加至RNeasy Mini離心柱中進行離心(10000rpm 15秒)。進而利用緩衝液RW1 350μL洗淨離心柱後，利用RNase-Free DNase套組(Qiagen)進行DNase處理。利用緩衝液RW1 350μL洗淨離心柱後，根據RNeasy Mini套組之操作說明進行RNA之純化。純化後，添加無水RNase 30μL，回收總RNA。
<美洲室塵蟎cDNA之製作>
使用Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(RT-PCR用之SuperScript III第一鏈合成系統)(Invitrogen)，由所獲得之總RNA合成cDNA。使總RNA 3μg懸浮於8μL之純化水中，並加入1μL之寡(dT)20、1μL之10mM之dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脫氧核糖核苷三磷酸)後，於65℃下保溫5分鐘。於冰上冷卻2分鐘後，加入2μL之10×RT緩衝液、1μL之25mM MgCl2、2μL之0.1M DTT(dithiothreitol，二硫蘇糖醇)、1μL之RNaseOUT(40U/μl)、1μL之SuperScript III Reverse Transcriptase(SuperScript III逆轉錄酶)並加以混合。於50℃下保溫50分鐘後，於85℃下處理5分鐘而停
止反應。
<cDNA序列之確定>
根據所獲得之部分胺基酸序列3、4設計退化引子。作為相當於部分胺基酸序列3之同義引子，設計引子1及其下游之引子2。同樣地作為相當於部分胺基酸序列4之反義引子，設計引子3及其上游之引子4。使用該等引子，以蟎cDNA作為模板，進行利用KOD Fx neo(TOYOBO)之nested PCR(nested polymerase chain reaction，巢式聚合酶鏈反應)。使PCR產物於2%瓊脂糖凝膠(Nacalai Tesque)中進行電泳後，利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Wizard離空凝膠及PCR純化系統)(Promega)對包含擴增之條帶之凝膠片段進行純化。對於所純化之PCR產物，使用引子2、引子4之引子進行利用KOD Fx neo之PCR，並利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Wizard離空凝膠及PCR純化系統)(Promega)對PCR產物進行純化。純化後，使用BigDye Xterminator套組(Applied Biosystems)與DNA核酸定序儀(3130xl；Applied Biosystems)分析鹼基序列而取得中間序列。
其次，為了分析3'側序列，使用5'/3' RACE套組二代(Roche)而製作於3'末端附加有錨定序列之美洲室塵蟎cDNA。使用基於自中間序列獲得之序列而設計之引子5、引子6之第2階段之引子，進行利用KOD Fx neo之nested PCR。分析所獲得之PCR產物之鹼基序列，而取得3'末端序列。
藉由中間序列與3'末端序列之分析，而取得1850bp之部分序列。自NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國家生物技術信息中心)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)資料庫檢索與該部分序列具有同源性之蛋白質，結果發現與海蠕蟲(Capitella teleta)(小頭蟲)之假定蛋白CAPTEDRAFT_151096(GenBank：ELT89240.1)之同源性為37%，與帽貝(Lottia gigantean)(海產貝)之假定蛋白
LOTGIDRAFT_207233(GenBank：ESO84761.1)之同源性為40%，與大堡礁海綿(Amphimedon queenslandica)(海綿)之PREDICTED：lysosomal alpha-mannosidase-like(NCBI Reference Sequence：XP_003383866.1)之同源性為47%。因此，分析ELT89240.1、ESO84761.1、XP_003383866.1間之相同序列，設計出對於在N末端附近胺基酸序列一致之區域的退化引子引子7、引子8。利用自中間序列所設計之引子9、引子10與引子7、引子8，自美洲室塵蟎cDNA使用KOD Fx neo實施nested PCR。分析所獲得之PCR產物之鹼基序列，而取得5'側之部分序列。
進而為了分析5'側序列，實施使用SMARTer RACE cDNA擴增套組(clontech公司)之5'RACE法。對於美洲室塵蟎總RNA，使用NucleoTrap mRNA mini(Macherey-Nagel)而純化美洲室塵蟎polyA mRNA。使用所純化之polyA mRNA，利用SMARTer RACE cDNA擴增套組而取得5'末端包含轉接序列之cDNA。
利用自5'側部分序列所設計之引子11，並利用PrimeStar HS DNA聚合酶(TAKARA BIO INC.)對該cDNA進行降落式PCR(Touch Down PCR)。反應條件係依據SMARTer RACE cDNA擴增套組之操作說明。藉由分析所獲得之PCR產物之鹼基序列，而取得至5'側末端為止之序列。
編碼本發明之美洲室塵蟎蛋白質之cDNA包含3006bp之ORF(Open Reading Frame，開讀框)。由鹼基序列所推定之胺基酸數為1002 aa。根據訊號序列預測軟體(SignalP 4.1、http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)之分析，最初之27個胺基酸為訊息肽。因此，作為天然物之本發明之美洲室塵蟎蛋白質之胺基酸數為975 aa，由該胺基酸序列所預測之本發明之美洲室塵蟎蛋白質之分子量為113.5kDa。該預測分子量與SDS-PAGE之約110kDa之分子量一致。
使用NCBI之BLAST檢索進行由所確定之鹼基序列推定之胺基酸序列之同源性檢索，結果顯示，其與源自以Der f 1或Der f 2為代表之已知之Der f之過敏原無同源性，為新穎蛋白質。
<110> 日商大鵬藥品工業股份有限公司(TAIHO PHARMACEUTICAL CO.,LTD.)
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<213> 美洲室塵蟎
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3006)
<220>
<221> 訊息肽
<222> (1)..(81)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (82)..(3006)
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 美洲室塵蟎
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<212> PRT
<213> 美洲室塵蟎
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (15)..(15)
<223> Xaa可為任意之天然胺基酸
<400> 4
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核甘酸
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (2)..(2)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (5)..(5)
<223> Y=C+T
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (8)..(8)
<223> Y=C+T
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (11)..(11)
<223> Y=C+T
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (14)..(14)
<223> Y=C+T
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (17)..(17)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (20)..(20)
<223> Y=C+T
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核甘酸
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (3)..(3)
<223> Y=C+T
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (6)..(6)
<223> R=A+G
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (9)..(9)
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<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (12)..(12)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (15)..(15)
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核甘酸
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (3)..(3)
<223> R=A+G
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (6)..(6)
<223> R=A+G
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (9)..(9)
<223> Y=C+T
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (12)..(12)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (15)..(15)
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<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (18)..(18)
<223> R=A+G
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (21)..(21)
<223> N=A+T+G+C
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核甘酸
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (1)..(1)
<223> R=A+G
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (4)..(4)
<223> Y=C+T
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (7)..(7)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (10)..(10)
<223> R=A+G
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (13)..(13)
<223> R=A+G
<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (16)..(16)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> 尚未歸類之特性
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<220>
<223> 合成寡核甘酸
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<212> DNA
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<223> 合成寡核甘酸
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<220>
<221> 尚未歸類之特性
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<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (9)..(9)
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<220>
<221> 尚未歸類之特性
<222> (12)..(12)
<223> N=A+T+G+C
<220>
<221> 尚未歸類之特性
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<220>
<221> 尚未歸類之特性
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<223> 合成寡核甘酸
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<221> 尚未歸類之特性
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<221> 尚未歸類之特性
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<221> 尚未歸類之特性
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核甘酸
<400> 15
Claims (10)
- 一種美洲室塵蟎(Dermatophagoides Farinae)蛋白質或其片段肽，其係選自以下之(a)~(c)：(a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含序列編號2所示之胺基酸序列中有1~10個胺基酸經取代、缺失或附加之胺基酸序列，且具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質；(c)包含與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列，且具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質。
- 一種聚核苷酸，其編碼選自以下之(a)~(c)中之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽：(a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含序列編號2所示之胺基酸序列中有1~10個胺基酸經取代、缺失或附加之胺基酸序列，且具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質；(c)包含與序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列，且具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質。
- 一種聚核苷酸，其係選自以下之(d)~(f)：(d)包含序列編號1所示之鹼基序列之聚核苷酸；(e)與包含序列編號1所示之鹼基序列互補之鹼基序列之聚核苷酸於嚴格條件下進行雜交，且編碼具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質的聚核苷酸；(f)包含與序列編號1所示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列，且編碼具有美洲室塵蟎過敏原活性之蛋白質的聚核苷酸。
- 一種結合蛋白質，其與如請求項1之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽結合。
- 如請求項4之結合蛋白質，其係抗體分子。
- 如請求項4之結合蛋白質，其係單株抗體。
- 一種如請求項1之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽之用途，其用於製造因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療劑。
- 一種如請求項1之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽之用途，其用於製造因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之診斷藥。
- 如請求項1之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽，其用於因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之預防或治療。
- 如請求項1之美洲室塵蟎蛋白質或其片段肽，其用於因美洲室塵蟎所致之過敏性疾病之診斷。
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