TWI704008B - 蛋白質分離方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種蛋白質分離方法，其包含後列步驟：提供至少一管式膜且其本身含有吸附劑；提供包含待分離物質的蛋白粗萃液；將蛋白粗萃液輸入管式膜內的通道且沿管式膜之縱向通過管式膜，蛋白粗萃液內所含待分離物質被吸附劑吸附而成為殘留液；檢測殘留液內所含待分離物質之濃度，直到殘留液內所含待分離物質之濃度大於蛋白粗萃液內所含待分離物質之濃度的一預定比例，則停止輸入蛋白粗萃液至通道；提供一脫附緩衝液輸入通道且沿管式膜之縱向通過管式膜，藉此，被吸附在吸附劑中的待分離物質溶入脫附緩衝液中而被分離。
Description
本發明有關於蛋白質分離，尤指一種用於自蛋白液中分離特定蛋白質的蛋白質分離方法。
現有技術中，蛋白質可以藉由穿透過濾的方式由蛋白液中分離。一般而言，蛋白液被加壓穿透含有吸附劑的濾膜，蛋白液穿透濾膜的過程中，其內所含特定蛋白質被吸附劑吸附。再將吸附有蛋白質的濾膜置入脫附緩衝液，將蛋白質溶出至脫附緩衝液中而分離。
為了便於加壓，濾膜製作為一端開口且另一端封閉的管狀管式膜，加壓蛋白液通入管式膜後由管式膜的側面穿透流出。其缺點在於高壓管路設置不易且成本較高，濾出殘流液也需要較大的容器回收，因此設備規模受限。再者，由於薄膜厚度僅約0.4mm至0.6mm，蛋白液穿透管式膜的時間短，吸附劑與蛋白液接觸時間不足，吸附效率不佳。
有鑑於此，本發明人遂針對上述現有技術，特潛心研究並配合學理的運用，盡力解決上述之問題點，即成為本發明人改良之目標。
本發明提供一種用於自蛋白液中分離特定蛋白質的蛋白質分離方法。
本發明提供一種蛋白質分離方法，其包含後列步驟：提供至少一管式膜，管式膜的結構本身含有吸附劑，管式膜內具有縱向貫穿管式膜的至少一通道；提供包含一待分離物質的一蛋白粗萃液；將蛋白粗萃液輸入通道，且沿管式膜之縱向通過管式膜，且蛋白粗萃液內所含待分離物質被吸附劑吸附而成為一殘留液；重覆檢測殘留液內所含待分離物質之濃度，直到殘留液內所含待分離物質之濃度大於蛋白粗萃液內所含待分離物質之濃度的一預定比例，則停止輸入蛋白粗萃液至通道；及提供一脫附緩衝液輸入通道，且沿管式膜之縱向通過管式膜，而被吸附在吸附劑中的待分離物質溶入脫附緩衝液中而成為一脫附液。
本發明的蛋白質分離方法，其吸附劑為陽離子交換樹脂且蛋白粗萃液的pH值小於待分離物質的等電點。待分離物質為溶菌酶。脫附緩衝液包含莫耳濃度45mM至55mM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)以及莫耳濃度0.5M至1.5M的氯化鈉。脫附緩衝液的pH值為7.5至8.5。脫附緩衝液通過管式膜的流向與蛋白粗萃液通過管式膜的流向相反。
本發明的蛋白質分離方法，其更包含一步驟：提供一清洗緩衝液輸入通道且沿管式膜之縱向通過管式膜而去除殘留在管式膜內的蛋白粗萃液，清洗緩衝液包含莫耳濃度45mM至55mM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)以及莫耳濃度0.05M至0.15M的氯化鈉。清洗緩衝液的pH值為7.5至8.5。清洗緩衝液通過管式膜的流向與蛋白粗萃液通過管式膜的流向相反。
本發明的蛋白質分離方法，其更包含一步驟：乾燥脫附液而得到固態的待分離物質。
本發明的蛋白質分離方法，其管式膜為複數且該些管式膜相互平行並排且配置成束，組成吸附模組。管式膜內形成縱向貫穿管式膜的複數通道。
本發明的蛋白質分離方法藉由吸附方式分離待分離物質，其不需要藉由高壓驅使蛋白粗萃液穿透管式膜，管路壓損低，因此可以藉由設置成本較低且較易於設置的低壓管路設備實施。再者，本發明的蛋白質分離方法其各種作業的液體則由管式膜的一端單點輸入，並由管式膜的另一端單點回收。因此本發明的管式膜可以在輸入輸出點之間任意並排或串接，故易於擴張處理量與吸附容量。
100:吸附模組
110:外殼
120:管式膜
121:通道
210:蛋白粗萃液
220:殘留液
310:清洗緩衝液
320:清洗液
410:脫附緩衝液
420:脫附液
a~g:步驟
圖1 係本發明較佳實施例之蛋白質分離方法之步驟流程圖。
圖2 係本發明較佳實施例之蛋白質分離方法提供的單一通道管式膜之示意圖。
圖3 係圖2所示管式膜之縱向剖視圖。
圖4 係本發明較佳實施例之蛋白質分離方法提供的複數通道管式膜之示意圖。
圖5 係圖4所示管式膜之縱向剖視圖。
圖6 係本發明較佳實施例之蛋白質分離方法之管路配置示意圖。
參閱圖1至圖5，本發明之較佳實施例提供本發明提供一種蛋白質分離方法，其包含後列步驟：於步驟a中，首先提供至少一管式膜120，管式膜120的結構本身含有吸附劑，而且於本實施例中吸附劑較佳地為陽離子交換樹脂。管式膜120為兩端開口而在管式膜120內形成縱向貫穿管式膜120的通道121。本發明不限定管式膜120內的通道121之數量，且各通道121分別沿管式膜120的縱向延伸而貫穿管式膜120。以最簡單的實施方式而言，通道121為管式膜120的工作介面，因此，如圖2及圖3，具有單一通道121的管式膜120即能夠實施本發明。進一步參閱圖4及圖5，於本實施例中較佳地配置有包含複數通道121的管式膜120。各管式模120內分別形成縱向貫通且相互平行並列的單一或複數通道121，且該些管式膜120相互平行並排且配置成束，組成吸附模組100。具體而言，吸附模組100中，該些管式膜120裝設在一個管狀的外殼110之內而被外殼110束縛固定。
參閱圖1、圖2及圖4至圖6，於步驟b中，接續步驟a，提供一蛋白粗萃液210，蛋白粗萃液210係由雞蛋白所萃出，蛋白粗萃液210包含一待分離物質，具體而言，待分離物質為溶於蛋白粗萃液210中的特定的蛋白質(protein)，於本實例中待分離物質較佳地為溶菌酶(lysozyme)。蛋白質所在溶液的pH值不同，溶液中的正電荷氫離子與負電荷氫氧離子濃度不同使得蛋白質所帶電荷隨之改變。在特定pH值的溶液中蛋白質所帶正負電荷平衡而不帶電，則該pH值是為該蛋白質的等電點，且不同的蛋白質具有不同的等電點。蛋白粗萃液210的pH值一般介於6.0~7.7之間，溶菌酶的等電點一般介於pH值11.0~11.2之間。於本實施例中蛋白粗萃液210的pH值小於待分離物質的等電點，因此溶菌酶在蛋白
粗萃液210中帶正電荷；一般蛋白質的等電點多小於pH值5，因此其他的蛋白質在蛋白粗萃液210中帶負電荷。
於吸附步驟c中，接續步驟b，將蛋白粗萃液210輸入通道121且沿管式膜120之縱向通過管式膜120。溶菌酶與其他的蛋白質在蛋白粗萃液210中帶相異電性的電荷，因此能夠藉由陽離子交換樹子吸附帶正電荷的溶菌酶而其自蛋白粗萃液210中分離。蛋白粗萃液210內所含待分離物質被吸附劑吸附而成為一殘留液220。
於步驟d中，接續步驟c，重覆檢測殘留液220內所含待分離物質之濃度，直到殘留液220內所含待分離物質之濃度大於蛋白粗萃液210內所含待分離物質之濃度的一預定比例(即溶菌酶破出；breakthrough)，也就是說管式膜120吸附待分離物質之能力下降到可容許的下限，則停止輸入蛋白粗萃液210至通道121。於本實施例中，前述預定比例較佳地介於1%至5%之間。
於脫附步驟e中，接續步驟d，提供一脫附緩衝液410輸入通道121且沿管式膜120之縱向通過管式膜120，而被吸附在吸附劑中的待分離物質溶入脫附緩衝液410中。脫附緩衝液410通過管式膜120的流向較佳地與蛋白粗萃液210通過管式膜120的流向相反。脫附緩衝液410的pH值為7.5至8.5，脫附緩衝液410包含莫耳濃度45mM至55mM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)以及莫耳濃度0.5M至1.5M的氯化鈉。三羥甲基氨基甲烷溶於水為鹼性，以調整脫附緩衝液410的pH值。較高濃度的氯化鈉含有較高濃度的鈉離子，藉由鈉離子取代吸附在吸附劑中的待分離物質而將待分離物質釋出溶入脫附緩衝液410中成為脫附液420。較佳地，本發明的蛋白質分離方法也可以用於將脫附液420中的蛋白質再次分離而純化。
本發明的蛋白質分離方法可以選擇性地更包含介於步驟d與步驟e之間的清洗步驟f，步驟f中提供一清洗緩衝液310輸入通道121且沿管式膜120之縱向通過管式膜120而去除殘留在管式膜120內的蛋白粗萃液210，清洗緩衝液310清洗後排出為清洗液320。清洗緩衝液310通過管式膜120的流向較佳地與蛋白粗萃液210通過管式膜120的流向相反。清洗緩衝液310的pH值為7.5至8.5，清洗緩衝液310包含莫耳濃度45mM至55mM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)以及莫耳濃度0.05M至0.15M的氯化鈉。三羥甲基氨基甲烷溶於水為鹼性，以調整清洗緩衝液310的pH值。低濃度的氯化鈉含有較低濃度的鈉離子，避免將吸附在吸附劑中的待分離物質釋出。
本發明的蛋白質分離方法可以選擇性地更包含一乾燥步驟g，接續步驟e，乾燥通過管式膜120的脫附液420而得到固態的待分離物質。於本實施例中，藉由乾燥步驟乾燥脫附液420得到固態的溶菌酶粉末。
由於吸附劑必需接觸蛋白粗萃液210才能夠吸附待分離物質，因此蛋白粗萃液210與吸附劑的接觸時間越長則吸附效率越佳。現有的穿透過濾方式，其蛋白粗萃液210僅在穿透管式膜的過程中接觸吸附劑；本發明的蛋白質分離方法，其蛋白粗萃液210通過管式膜120的期間皆能夠接觸吸附劑，因此吸附效率較佳。
相較於現有的穿透過濾方式，本發明的蛋白質分離方法藉由吸附方式分離待分離物質，其不需要藉由高壓驅使蛋白粗萃液210穿透管式膜120，管路壓損低，因此可以藉由設置成本較低且較易於設置的低壓管路設備實施。
再者，現有的穿透過濾方式需由管式膜的側面回收各種作業的液體，因此整個管式膜需容置在容器中，吸附面積越大則需要越大的容器，設備
設置成本也隨之劇增。本發明的蛋白質分離方法其各種作業的液體則由吸附模組100的一端單點輸入，並由吸附模組100的另一端單點回收。因此本發明的蛋白質分離方法，可以藉由在輸入輸出點之間並聯吸附模組100以提高操作流量，或者串聯吸附模組100以提高操吸附容量，故易於擴張設備的處理量與吸附容量。
以上所述僅為本發明之較佳實施例，非用以限定本發明之專利範圍，其他運用本發明之專利精神之等效變化，均應俱屬本發明之專利範圍。
100:吸附模組
120:管式膜
210:蛋白粗萃液
220:殘留液
310:清洗緩衝液
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410:脫附緩衝液
420:脫附液
Claims (11)
- 一種蛋白質分離方法，包含步驟：a)提供至少一管式膜，該管式膜的結構本身含有吸附劑，該管式膜內具有縱向貫穿該管式膜的至少一通道；b)提供包含一待分離物質的一蛋白粗萃液；c)將該蛋白粗萃液輸入該通道，且沿該管式膜之縱向通過該管式膜，且該蛋白粗萃液內所含待分離物質被該吸附劑吸附而成為一殘留液；d)重覆檢測該殘留液內所含該待分離物質之濃度，直到該殘留液內所含該待分離物質之濃度大於該蛋白粗萃液內所含該待分離物質之濃度的一預定比例，則停止輸入該蛋白粗萃液至該通道；f)接續步驟d，提供一清洗緩衝液輸入該通道，且沿該管式膜之縱向通過該管式膜，而去除殘留在該管式膜內的該蛋白粗萃液，該清洗緩衝液包含莫耳濃度45mM至55mM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)以及莫耳濃度0.05M至0.15M的氯化鈉；及e)接續步驟f，提供一脫附緩衝液輸入該通道，且沿該管式膜之縱向通過該管式膜，而被吸附在該吸附劑中的該待分離物質溶入該脫附緩衝液中而成為一脫附液，該脫附緩衝液包含莫耳濃度45mM至55mM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)以及莫耳濃度0.5M至1.5M的氯化鈉。
- 如請求項1所述的蛋白質分離方法，其中該吸附劑為陽離子交換樹脂且該蛋白粗萃液的PH值小於該待分離物質的等電點。
- 如請求項2所述的蛋白質分離方法，其中該待分離物質為溶菌酶。
- 如請求項3所述的蛋白質分離方法，其中該脫附緩衝液的PH值為7.5至8.5。
- 如請求項3所述的蛋白質分離方法，更包含一步驟f提供一清洗緩衝液輸入該通道，且沿該管式膜之縱向通過該管式膜，而去除殘留在該管式膜內的該蛋白粗萃液，該清洗緩衝液的pH值為7.5至8.5。
- 如請求項1所述的蛋白質分離方法，更包含一步驟f提供一清洗緩衝液輸入該通道，且沿該管式膜之縱向通過該管式膜，而去除殘留在該管式膜內的該蛋白粗萃液。
- 如請求項6所述的蛋白質分離方法，其中該清洗緩衝液通過該管式膜的流向與該蛋白粗萃液通過該管式膜的流向相反。
- 如請求項1所述的蛋白質分離方法，其中該脫附緩衝液通過該管式膜的流向與該蛋白粗萃液通過該管式膜的流向相反。
- 如請求項1所述的蛋白質分離方法，更包含一步驟g乾燥該脫附液而得到固態的該待分離物質。
- 如請求項1所述的蛋白質分離方法，其中管式膜為複數且該些管式膜相互平行並排且配置成束。
- 如請求項1所述的蛋白質分離方法，其中該管式膜內具有縱向貫穿該管式膜的複數通道。
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