TWI797881B

TWI797881B - 抗老化組合物及其延緩衰老的用途

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Publication number: TWI797881B
Application number: TW110145942A
Authority: TW
Inventors: 何協勳; 郭易緯; 林文揚; 林家弘; 黃彥宇; 林杞輝; 蔡欣宇
Original assignee: 豐華生物科技股份有限公司
Priority date: 2021-12-08
Filing date: 2021-12-08
Publication date: 2023-04-01
Also published as: CN116236508B; US20230173000A1; US11957722B2; TW202322831A; CN116236508A

Abstract

本發明的抗老化組合物包含：（a）經分離的乳酸菌菌株或其發酵物、以及（b）賦形劑、稀釋劑或載體；其中經分離的乳酸菌菌株包含：兩歧雙歧桿菌VDD088菌株、短雙歧桿菌Bv-889菌株、以及長雙歧桿菌BLI-02菌株。此外，本發明更提出上述抗老化組合物用於製備延緩衰老之組合物的用途。

Description

抗老化組合物及其延緩衰老的用途

本發明攸關一種抗老化組合物，且特別關於一種含乳酸菌或其發酵物的抗老化組合物。本發明更關於上述組合物的延緩衰老用途。

老化為普遍性（universal）、進行性（progressive）、累積性（cumulative）與傷害性（deleterious）的生理衰退現象，但基於個體差異並無法透過單一或簡單模式描述。研究發現人類老化與體內氧化自由基（reactive oxygen species，ROS）息息相關，氧化自由基會造成體內細胞的DNA、蛋白質與脂質等分子破壞，使得生理功能逐漸喪失，引發疾病與器官老化。許多研究亦指出氧化物質與心血管疾病、癌症及老化等有關連。許多文獻更指出氧化自由基為造成器官老化的主要因素之一。依此，尋找新的抗氧化物質以延緩老化為目前抗衰老研究領域的主要議題之一。

許多文獻研究證實白藜蘆醇（resveratrol）具備優異的抗氧化特性，亦於動物實驗發現其延緩老化功能。然而，白藜蘆醇仍存有潛在副作用，於臨床上發現服用高劑量白藜蘆醇（每日2.5至5.0g）會造成胃噁心、腸胃脹氣、腹部不適與腹瀉等症狀。白藜蘆醇另可能具抗凝血效果，可能干擾肝臟中與代謝藥物有關的酵素（如：cytochrome P450或CYP1A2），進而干擾藥物作用，或者可能引發未知風險。因此，服用前須先諮詢醫生或藥師。於動物實驗亦發現其有輕微的雌激素效果，因此對雌激素敏感的患者應避免服用，如：乳癌病患、卵巢癌病患或子宮癌病患。

一般而言，胞內p53/p21訊息傳遞路徑活化與表達上升會誘發細胞週期停滯不前，導致細胞衰老。根據研究論文Nature Aging volume 1, pages 962-973 (2021)所載，於老化小鼠體內間歇清除P21基因高度表現的衰老細胞後，小鼠的身體機能獲致顯著恢復。換言之，降低衰老細胞中的P21基因表現有助於延緩衰老。

益生菌乃人體重要的共生菌，依菌株及菌種差異，具有不同的生理功能，如：調節消化道菌相、消化道機能、調整血糖、增強免疫、抗氧化及抗疲勞等。此外，有些菌株甚至具有多種不同的功能。舉例而言， Lactobacillus rhamnosusGG（LGG）為目前研究最多的菌株，其具有多種不同的功能，如：平衡與改善胃腸道功能、增強人體自身免疫能力、預防及治療腹瀉、減少呼吸道感染、排出毒素及預防齲齒等。這些功能性菌株的發現對於提升人類健康有著極大助益。此外，近年也陸續發現某些益生菌菌株具備抗氧化功能。

老年健康與老年照護的課題為近年全球各國重視的問題，故發展一種安全且可長期使用的抗老化補充品有其重要性。一般而言，乳酸菌食用上相當安全，找出具有抗老化功能的乳酸菌菌株便是目前亟須努力的目標之一。

本發明乃基於所提之含多種乳酸菌菌株或其發酵物的組合物經細胞實驗與動物實驗證實具抗衰老生理活性所完成的。依此，所提的組合物可以食品、醫藥、或化妝品形式存在來實現上述生理活性。

本發明提出一種抗老化組合物，其包含：（a）經分離的乳酸菌菌株或其發酵物、以及（b）賦形劑、稀釋劑或載體；其中經分離的乳酸菌菌株包含：以寄存編號BCRC 910814寄存於財團法人食品工業發展研究所的兩歧雙歧桿菌（ Bifidobacterium bifidum）VDD088菌株、以寄存編號BCRC 910844寄存於財團法人食品工業發展研究所的短雙歧桿菌（ Bifidobacterium breve）Bv-889菌株、以及以寄存編號BCRC 910812寄存於財團法人食品工業發展研究所的長雙歧桿菌（ Bifidobacterium longum）BLI-02菌株。

本發明另提出一種抗老化組合物用於製備延緩衰老之組合物的用途，其中抗老化組合物包含：（a）經分離的乳酸菌菌株或其發酵物、以及（b）賦形劑、稀釋劑或載體；又其中經分離的乳酸菌菌株包含：以寄存編號BCRC 910814寄存於財團法人食品工業發展研究所的兩歧雙歧桿菌VDD088菌株、以寄存編號BCRC 910844寄存於財團法人食品工業發展研究所的短雙歧桿菌Bv-889菌株、以及以寄存編號BCRC 910812寄存於財團法人食品工業發展研究所的長雙歧桿菌BLI-02菌株。

為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特舉較佳實施方式，作詳細說明於下：

本發明所述的乳酸菌菌株以冷凍乾燥培養物形式寄存於財團法人食品工業發展研究所，地址為台灣新竹市食品路331號。詳細的寄存資料如表1所示：表1、乳酸菌菌株的寄存資料

菌株名	分類	寄存編號	寄存日期
VDD088	兩歧雙歧桿菌 Bifidobacterium bifidum	BCRC 910814	2018年1月18日
Bv-889	短雙歧桿菌 Bifidobacterium breve	BCRC 910844	2018年7月20日
BLI-02	長雙歧桿菌 Bifidobacterium longum	BCRC 910812	2018年1月18日
PL-02	植物乳酸桿菌 Lactobacillus plantarum	BCRC 911012	2020年7月28日
CP-9	動物雙歧桿菌 Bifidobacterium animalissubsp. lactis	BCRC 910645	2014年8月21日
OLP-01	長雙歧桿菌長亞種 Bifidobacterium longumsubsp . longum	BCRC 910875	2019年2月22日

本文發現如表1所列之寄存的兩歧雙歧桿菌VDD088菌株、短雙歧桿菌Bv-889菌株、長雙歧桿菌BLI-02菌株、植物乳桿菌（ Lactobacillus plantarum）PL-02菌株、動物雙歧桿菌（ Bifidobacterium animalis subsp. lactis）CP-9菌株、與長雙歧乳酸桿菌長雙歧亞種（ Bifidobacterium longum subsp. longum）OLP-01菌株具有抗老化的生理活性。是以，所列之全部菌株或其發酵物可用於延緩衰老的用途。

本發明之一實施方式提出一種抗老化組合物，其包含：（a）經分離的乳酸菌菌株或其發酵物、以及（b）賦形劑、稀釋劑或載體；其中經分離的乳酸菌菌株包含：以寄存編號BCRC 910814寄存於財團法人食品工業發展研究所的兩歧雙歧桿菌VDD088菌株、以寄存編號BCRC 910844寄存於財團法人食品工業發展研究所的短雙歧桿菌Bv-889菌株、以及以寄存編號BCRC 910812寄存於財團法人食品工業發展研究所的長雙歧桿菌BLI-02菌株。

為進一步提升組合物的抗老化功效，經分離的乳酸菌菌株更包含：以寄存編號BCRC 910645寄存於財團法人食品工業發展研究所的動物雙歧桿菌CP-9菌株以及以寄存編號BCRC 911012寄存於財團法人食品工業發展研究所的植物乳桿菌PL-02菌株。

為更進一步提升組合物的抗老化功效，經分離的乳酸菌菌株另包含：以寄存編號BCRC 910875寄存於財團法人食品工業發展研究所的長雙歧乳酸桿菌長雙歧亞種OLP-01菌株。

此外，賦形劑、稀釋劑或載體可為生理上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體，藉此所提之組合物可製作成食品組合物或美容化妝組合物使用。於食品組合物的條件下，生理上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體可為食品，如：乳製飲品、茶、咖啡、糖果（如：口含片、咀嚼錠、或軟糖）、機能性飲品或以上任意組合，乳製飲品可為發酵乳、優格、乳酪或乳粉等。於美容化妝組合物的條件下，生理上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體可為（a）液狀化妝品，如：沐浴液、洗髮液、護髮乳、化妝水、香水、精華液、乳液、化妝水或保濕噴霧等；（b）乳液狀化妝品；（c）膏霜狀化妝品，如：潤面霜、粉底霜、洗髮膏、眼霜、手霜、液態面膜或髮蠟等；（d）粉狀化妝品，如：香粉或爽身粉；（e）塊狀化妝品，如：粉餅；或（f）棒狀化妝品，如：口紅。

另外，賦形劑、稀釋劑或載體可為醫藥上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體，藉此所提之組合物可製作成醫藥組合物使用。於醫藥組合物的條件下，醫藥組合物可呈口服劑型或皮膚外用劑型，口服劑型如為錠劑、膠囊、溶液劑或粉劑等。

再者，乳酸菌菌株可單獨地為活性菌株或去活性菌株。於製作成食品組合物、美容化妝組合物或醫藥組合物的條件下，菌株總數量較佳地為10 ⁶CFU以上，更佳地為10 ⁹CFU以上。此外，發酵物可包含去活性菌株的發酵液、去除菌體的發酵液、或此等任一的乾燥粉末。舉例而言，發酵液可為發酵上清液或乳清發酵液等。依組合物的總重量計，發酵液之乾燥粉末的含量較佳地為0.5wt％以上；或者，去活性菌株之發酵液或去除菌體之發酵液的含量較佳地為2.5wt％以上。

本發明之另一實施方式提出一種上述抗老化組合物的用途，其為用於製備延緩衰老的組合物。具體而言，所製備的組合物可投予至一有延緩衰老需求的個體，以於個體內清除自由基、降低P21基因表現量、降低蛋白質羰基含量、提升過氧化氫酶活性及/或降低8-氧代-2'-脫氧鳥苷含量來達到延緩衰老的功效。此外，所製備的組合物較佳地以每日個體每公斤體重10 ⁶至10 ¹⁰CFU的菌株總數量投予至個體來達延緩衰老的目的，更佳地以每日個體每公斤體重8.3x10 ⁷至3.4x10 ⁸CFU的菌株總數量投予至個體。

＜實施例1：乳酸菌菌株的形態及一般性質＞

利用16S rDNA序列分析與API細菌鑑定系統分析確認乳酸菌菌株的分類學特徵。乳酸菌菌株於形態學及一般性質上的特徵如表2所示：表2、乳酸菌菌株的形態學及一般性質特徵

菌株名	形態特徵
兩歧雙歧桿菌 VDD088	1、厭氧菌，革蘭氏染色下為陽性菌。不生成孢子，不具觸酶、氧化酶及運動性，在絕對厭氧環境下生長，最適宜的生長溫度為37±1℃，屬於兼性異質發酵性菌株，葡萄糖代謝時不產生氣體。 2、於MRS培養基生長出的菌落為白色實心圓形，菌體型態為中長桿狀，兩端偶伴有雙歧分支（Y字型或V字型）。
短雙歧桿菌 Bv-889	1、厭氧菌，革蘭氏染色下為陽性菌。不生成孢子，不具觸酶、氧化酶及運動性，在絕對厭氧環境下生長，最適宜的生長溫度為37±1℃，屬於兼性異質發酵性菌株，葡萄糖代謝時不產生氣體。 2、於MRS培養基生長出的菌落為白色實心圓形，菌體型態為中短桿狀，兩端偶伴有雙歧分支（Y字型或V字型）。
長雙歧桿菌 BLI-02	1、厭氧菌，革蘭氏染色下為陽性菌。不生成孢子，不具觸酶、氧化酶及運動性，在絕對厭氧環境下生長，最適宜的生長溫度為37±1℃，屬於兼性異質發酵性菌株，葡萄糖代謝時不產生氣體。 2、於MRS培養基生長出的菌落為白色實心圓形，菌體型態為中長桿狀，兩端偶伴有雙歧分支（Y字型或V字型）。
植物乳酸桿菌 PL-02	1、兼性厭氧菌，可於低或正常的氧氣濃度下生活。適合的生長溫度為10至45℃，而30至35℃則是最佳範圍，但在接近冰點亦能生存。對其生長而言，最佳的酸鹼度範圍為pH3.5至4.2之間，耐鹽性約為13至15％。 2、外觀乃是桿狀直線型的菌種，兩端以圓弧形收尾。通常寬為0.9至1.2mm；長為3.0至8.0mm。以單個、兩兩成對或者多個呈短鏈形式排列存在。
動物雙歧桿菌 CP-9	1、厭氧菌，革蘭氏染色下為陽性菌。不生成孢子，不具觸酶、氧化酶及運動性，在絕對厭氧環境下生長，最適宜的生長溫度為37±1℃，屬於兼性異質發酵性菌株，葡萄糖代謝時不產生氣體； 2、於MRS培養基生長出的菌落為白色實心圓形，菌體型態為中長桿狀，兩端偶伴有雙歧分支（Y字型或V字型）。
長雙歧桿菌長亞種 OLP-01	1、厭氧菌，革蘭氏染色下為陽性菌。不生成孢子，不具觸酶、氧化酶及運動性，在絕對厭氧環境下生長，最適宜的生長溫度為37±1℃，屬於兼性異質發酵性菌株，葡萄糖代謝時不產生氣體。 2、於MRS培養基生長出的菌落為白色實心圓形，菌體型態為中長桿狀，兩端偶伴有雙歧分支（Y字型或V字型）。

＜實施例2：乳酸菌菌株的收集＞

乳酸菌菌株以20%甘油保存於-80℃。使用前，於37℃下以含0.05% cysteine的MRS broth（DIFCO）活化24小時二次。所使用的乳酸菌菌株有兩歧雙歧桿菌VDD088菌株、短雙歧桿菌Bv-889菌株、長雙歧桿菌BLI-02菌株、植物乳桿菌PL-02菌株、動物雙歧桿菌CP-9菌株、與長雙歧乳酸桿菌長雙歧亞種OLP-01菌株，來源皆為人類腸道。於一實施樣態中，乳酸菌菌株的液態培養基包含5至30wt%牛奶與1至10wt%大豆粉中至少之一；於一實施樣態中，乳酸菌菌株的液態培養基包含碳源以及氮源中至少之一，碳源包含葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、澱粉、糖蜜、馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、麥芽萃取物、麥芽糊精或以上任意組合，而氮源包含(NH ₄) ₂SO ₄、(NH ₄) ₃PO ₄、NH ₄NO ₃、NH ₄Cl、酪蛋白胺基酸、尿素、蛋白腖、聚蛋白腖、胰化腖、肉類萃取物、酵母萃取物、酵母粉、牛奶、大豆粉、乳清、或以上任意組合；於一實施樣態中，依液態培養基的總重量計，葡萄糖與麥芽糊精共佔2至5wt％。

乳酸菌菌株發酵產生的發酵物為利用上述乳酸菌菌株至少其中之一於培態培養基發酵產生發酵液，再經離心、過濾、加熱殺菌等步驟，最後純化取得。依實際需求，發酵物可進一步乾燥成乳酸菌發酵物粉末，粉末劑型或所形成的水溶液劑型可保存於常溫。

＜實施例3：自由基清除活性分析＞

DPPH（di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium）為穩定的自由基分子，DDPH自由基甲醇溶液於波長517nm下有最高吸收值。當DPPH自由基與抗氧化物質作用後，抗氧化物質提供氫離子來清除自由基，使DPPH自由基失去原先具有的藍紫色並造成吸光值降低。

待測的乳酸菌菌株及其發酵液（菌株總數量約2x10 ⁹CFU，OD約2.0）與0.2mM DPPH甲醇溶液以比例1：1混合。另外，以無抗氧化活性的嗜熱鏈球菌（ Streptococcus thermophiles）L-243菌株（菌株總數量約2x10 ⁹CFU，OD約2.0）作為負控制組、以及二次水作為空白組並採用相同混合方式。混合均勻後，於室溫暗室下反應30分鐘。接著，於4℃下經轉速12,000rpm離心2分鐘後，取200μl反應液至96孔盤中並測定其OD ₅₁₇值。自由基清除效率的計算公式如下：

；其中，OD _sample表示待測樣品的OD ₅₁₇值，OD _blank表示空白組的OD ₅₁₇值。

如圖1所示，相較其他乳酸菌菌株，短雙歧桿菌Bv-889菌株、長雙歧桿菌長亞種OLP-01菌株、長雙歧桿菌BLI-02菌株、植物乳酸桿菌PL-02菌株、動物雙歧桿菌CP-9菌株、與兩歧雙歧桿菌VDD088菌株具有相對高的自由基清除效率。

＜實施例4：鐵離子還原力分析＞

FRAP為ferric ion reducing antioxidant power（或ferric reducing ability of plasma）的縮寫，中文稱為「鐵離子還原/抗氧化能力法」，其為於低pH條件下，利用亞鐵離子與三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）生成藍紫色複合物來待測樣品的抗氧化能力，此方法廣泛運用於食品與保健品的抗氧化能力分析。

具體而言，FRAP的原理在於酸性條件下抗氧化物能將Fe ³⁺-TPTZ還原成藍紫色的Fe ²⁺-TPTZ，隨後於波長593nm下測吸光度，作為總抗氧化能力指標。此外，酸性條件可抑制一些內源性干擾。由於待測樣品中的鐵離子或亞鐵離子總濃度通常低於10μM，因此樣品中的鐵離子或亞鐵離子不會顯著地干擾測試結果。另外，由於反應體系中的鐵離子或亞鐵離子會與TPTZ螯合，因此待測樣品所含的微量金屬離子螯合劑通常亦不會顯著地影響檢測結果。

如圖2所示，相較其他乳酸菌菌株，短雙歧桿菌Bv-889菌株、長雙歧桿菌長亞種OLP-01菌株、長雙歧桿菌BLI-02菌株、植物乳酸桿菌PL-02菌株、動物雙歧桿菌CP-9菌株、與兩歧雙歧桿菌VDD088菌株具有相對高的鐵離子還原力，亦即這些菌株具有相對高的抗氧化能力。

＜實施例5：P21基因表現分析＞

參照文獻Probiotics Antimicrob Proteins. 2020 Jun;12(2):563-576，以小鼠3T3-L1細胞作為模式，並於H ₂O ₂氧化壓力下使細胞衰老。此外，以待測樣品處理細胞，並觀察指標基因P21的表現。

將自財團法人食品工業發展研究所購買的小鼠3T3-L1細胞培養於含10% FBS的Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）培養基，培養溫度為37℃，CO ₂濃度為5％。繼代培養3至5代後進行實驗。

將細胞種植於6孔培養盤中，每孔細胞數為3x10 ⁴，並持續培養數天直到細胞貼附且達80％滿盤。以濃度150μM H ₂O ₂作為細胞氧化劑並加入孔中與細胞共培養3小時，之後以PBS清洗後加入DMEM，以上步驟每24小時進行一次，共進行三次。於加入H ₂O ₂的同時添加待測樣品與細胞共培養。於H ₂O ₂與細胞共培養3小時後，先以PBS清洗，再添加同一待測樣品與細胞共培養。最後，萃取細胞的RNA並進行即時定量聚合酶連鎖反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR）分析P21基因的表現量，其中P21基因的引子對為正向引子5’-tgcatccgtttcacccaacc-3’ 與反向引子5’-tcatttttccaaagtgctattcagg-3’，內控制組GADPH基因的引子對為正向引子5’-gaaggtgaaggtcggagt-3’與反向引子5’-gaagatggtgatggatttc-3’。

如圖3所示，於H ₂O ₂氧化壓力下，經兩歧雙歧桿菌VDD088菌株（每次菌株總數量為2x10 ⁹CFU）處理之細胞、經動物雙歧桿菌CP-9菌株（每次菌株總數量為2x10 ⁹CFU）處理之細胞、經短雙歧桿菌Bv-889菌株（每次菌株總數量為2x10 ⁹CFU）處理之細胞、經長雙歧桿菌BLI-02菌株（每次菌株總數量為2x10 ⁹CFU）處理之細胞、與經植物乳酸桿菌PL-02菌株（每次菌株總數量為2x10 ⁹CFU）處理之細胞的P21基因相對表現量均較未經任何待測樣品處理的細胞低，表示上述乳酸菌菌株具備延緩衰老的能力。

又如圖3所示，於H ₂O ₂氧化壓力下，經兩歧雙歧桿菌VDD088菌株、短雙歧桿菌Bv-889菌株、與長雙歧桿菌BLI-02菌株（每次菌株總數量為2x10 ⁹CFU，不同種類菌株數量比為1：1：1）共同處理之細胞的P21基因相對表現量小於僅經兩歧雙歧桿菌VDD088菌株處理的細胞、僅經短雙歧桿菌Bv-889菌株處理的細胞、與僅經長雙歧桿菌BLI-02菌株處理的細胞，表示兩歧雙歧桿菌VDD088菌株、短雙歧桿菌Bv-889菌株、與長雙歧桿菌BLI-02菌株的組合對於延緩衰老產生協同現象。

再如圖3所示，於H ₂O ₂氧化壓力下，經兩歧雙歧桿菌VDD088菌株、動物雙歧桿菌CP-9菌株、短雙歧桿菌Bv-889菌株、長雙歧桿菌BLI-02菌株、與植物乳酸桿菌PL-02菌株（每次菌株總數量為2x10 ⁹CFU，不同種類菌株數量比為1：1：1：1：1）共同處理之細胞的P21基因相對表現量小於僅經兩歧雙歧桿菌VDD088菌株處理的細胞、僅經動物雙歧桿菌CP-9菌株處理的細胞、僅經短雙歧桿菌Bv-889菌株處理的細胞、僅經長雙歧桿菌BLI-02菌株處理的細胞、與僅經植物乳酸桿菌PL-02菌株處理的細胞，表示兩歧雙歧桿菌VDD088菌株、動物雙歧桿菌CP-9菌株、短雙歧桿菌Bv-889菌株、長雙歧桿菌BLI-02菌株、與植物乳酸桿菌PL-02菌株的組合對於延緩衰老產生協同現象。

又如圖3所示，於H ₂O ₂氧化壓力下，經兩歧雙歧桿菌VDD088菌株、動物雙歧桿菌CP-9菌株、短雙歧桿菌Bv-889菌株、長雙歧桿菌BLI-02菌株、植物乳酸桿菌PL-02菌株（每次菌株總數量為2x10 ⁹CFU，不同種類菌株數量比為1：1：1：1：1）及其發酵液共同處理之細胞的P21基因相對表現量小於經兩歧雙歧桿菌VDD088菌株、動物雙歧桿菌CP-9菌株、短雙歧桿菌Bv-889菌株、長雙歧桿菌BLI-02菌株、植物乳酸桿菌PL-02菌株（每次菌株總數量為2x10 ⁹CFU，不同種類菌株數量比為1：1：1：1：1）共同處理的細胞，表示乳酸菌菌株的發酵液具備延緩衰老的能力。

＜實施例6：小鼠抗老化分析＞

氧化物蛋白質羰基（protein carbonyl）含量、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性與粒線體8-氧代-2'-脫氧鳥苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8OHdG）含量為組織老化的重要指標。以下採用此三項指標分析待測樣品的小鼠抗老化特性。

將10個月大的小鼠分成6組，每組4隻。乳酸菌劑量根據2005年美國食品藥物局公告的實驗初期估算方法；「空白對照組」僅餵食一般飼料；「白藜蘆醇組」除了餵食一般飼料，另餵食每日小鼠每公斤體重20.5mg白藜蘆醇；「低劑量乳酸菌組」除了餵食一般飼料，另餵食每日小鼠每公斤體重1.03x10 ⁹CFU乳酸菌菌株混合物；「低劑量乳酸菌與發酵物組」除了餵食一般飼料，另餵食每日小鼠每公斤體重1.03x10 ⁹CFU乳酸菌菌株混合物與20.5mg乳酸菌發酵物；「高劑量乳酸菌組」除了餵食一般飼料，另餵食每日小鼠每公斤體重4.1x10 ⁹CFU乳酸菌菌株混合物；「高劑量乳酸菌與發酵物組」除了餵食一般飼料，另餵食每日小鼠每公斤體重4.1x10 ⁹CFU乳酸菌菌株混合物與20.5mg乳酸菌發酵物；其中，使用的「乳酸菌菌株混合物」包含兩歧雙歧桿菌VDD088菌株、短雙歧桿菌Bv-889菌株、長雙歧桿菌BLI-02菌株、植物乳桿菌PL-02菌株、動物雙歧桿菌CP-9菌株、與長雙歧乳酸桿菌長雙歧亞種OLP-01菌株，不同種類菌株數量比為1：1：1：1：1：1。連續餵食六個月後，摘取小鼠腦部、心臟與肝臟，並評估各組別小鼠的衰老情況。氧化物蛋白質羰基含量檢驗、過氧化氫酶活性測定與粒線體8-氧代-2'-脫氧鳥苷含量檢驗等實驗過程詳如下文：

1、經連續餵食六個月後，先犧牲小鼠，再以手術器械將腦部、心臟、肝臟等組織摘取並分別置於微量離心管內。加入200μl 0.4M的過氯酸（perchloric acid）並以超音波均質機均質處理。

2、將各個小鼠器官均質液分別根據Protein Carbonyl Colorimetric Assay Kit（Cayman Chemical，型號：10005020）、Catalase Assay Kit（Cayman Chemical，型號：707002）與8OHdG Check ELISA kit（JaICA，型號：KOG200S/E）提供的實驗標準流程進行操作，以檢測器官老化指標的含量。

如圖4至6所示，服用高劑量乳酸菌並搭配發酵物的小鼠腦部氧化物質蛋白質羰基含量最低，心臟過氧化氫酶活性最高，且肝臟粒線體8-氧代-2'-脫氧鳥苷含量最低，表示乳酸菌菌株及其發酵液的組合具備延緩衰老的能力。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

無

圖1為自由基清除效率分析的結果圖，說明不同菌株對自由基清除的影響。圖2為FRAP分析的結果圖，說明不同菌株對鐵離子還原的影響。圖3為P21基因表現的結果圖，說明不同樣品對小鼠3T3-L1細胞之P21基因表現量的影響。圖4為抗老化分析的結果圖，說明不同樣品對小鼠後腦部氧化物蛋白質羰基含量的影響。圖5為抗老化分析的結果圖，說明不同樣品對小鼠心臟過氧化氫酶活性的影響。圖6為抗老化分析的結果圖，說明不同樣品對小鼠肝臟粒線體8-氧代-2'-脫氧鳥苷含量的影響。

1、TW中華民國，食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，2018/01/18，BCRC 910814 2、TW中華民國，食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，2018/07/20，BCRC 910844 3、TW中華民國，食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，2018/01/18，BCRC 910812 4、TW中華民國，食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，2020/07/28，BCRC 911012 5、TW中華民國，食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，2014/08/21，BCRC 910645 6、TW中華民國，食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，2019/02/22，BCRC 910875

Claims

一種抗老化組合物，其用以投予至一有延緩衰老需求的個體，以於該個體內協同降低P21基因表現量，且該抗老化組合物包含：(a)經分離的乳酸菌菌株，該經分離的乳酸菌菌株包含：以寄存編號BCRC 910814寄存於財團法人食品工業發展研究所的兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)VDD088菌株、以寄存編號BCRC 910844寄存於財團法人食品工業發展研究所的短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)Bv-889菌株、以及以寄存編號BCRC 910812寄存於財團法人食品工業發展研究所的長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)BLI-02菌株；以及(b)賦形劑、稀釋劑或載體。
如請求項1所述之組合物，其中該經分離的乳酸菌菌株更包含：以寄存編號BCRC 910645寄存於財團法人食品工業發展研究所的動物雙歧桿菌CP-9菌株以及以寄存編號BCRC 911012寄存於財團法人食品工業發展研究所的植物乳桿菌PL-02菌株。
如請求項2所述之組合物，其中該經分離的乳酸菌菌株再包含：以寄存編號BCRC 910875寄存於財團法人食品工業發展研究所的長雙歧乳酸桿菌長雙歧亞種OLP-01菌株。
如請求項1至3中任一所述之組合物，其中該經分離的乳酸菌菌株單獨地為活性菌株或去活性菌株。
如請求項1至3中任一所述之組合物，係為食品組合物、美容化妝組合物或醫藥組合物；其中於該組合物為食品組合物或美容化妝組合物的條件下，該賦形劑、稀釋劑或載體為生理上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體；其中於該組合物為醫藥組合物的條件下，該賦形劑、稀釋劑或載體為醫藥上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
一種如請求項1所述之組合物的用途，係用於製備延緩衰老的組合物，其中該延緩衰老的組合物用以投予至一有延緩衰老需求的個體，以於該個體內協同降低P21基因表現量。
如請求項6所述之用途，其中該經分離的乳酸菌菌株更包含：以寄存編號BCRC 910645寄存於財團法人食品工業發展研究所的動物雙歧桿菌CP-9菌株以及以寄存編號BCRC 911012寄存於財團法人食品工業發展研究所的植物乳桿菌PL-02菌株。
如請求項7所述之用途，其中該經分離的乳酸菌菌株再包含：以寄存編號BCRC 910875寄存於財團法人食品工業發展研究所的長雙歧乳酸桿菌長雙歧亞種OLP-01菌株。
如請求項6所述之用途，其中該延緩衰老的組合物用以投予至該有延緩衰老需求的個體，以於該個體內清除自由基、降低蛋白質羰基含量、提升過氧化氫酶活性、或降低8-氧代-2'-脫氧鳥苷含量。
如請求項6所述之用途，其中該延緩衰老的組合物以每日個體每公斤體重10⁶至10¹⁰CFU的菌株總數量投予至該個體。
如請求項6至8中任一所述之用途，其中該經分離的乳酸菌菌株單獨地為活性菌株或去活性菌株。