TWI788779B - 一種治療病毒性肺炎的方法和藥物 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種治療病毒性肺炎的方法，包括給藥受試者治療有效量的纖維蛋白溶酶原激活途徑組分。本發明還涉及用於治療病毒性肺炎之包含纖維蛋白溶酶原激活途徑組分的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。

Description

一種治療病毒性肺炎的方法和藥物

本發明涉及一種預防或治療病毒性肺炎，例如冠狀病毒感染的肺炎及其併發症的方法，包括給藥受試者有效量的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物，例如纖溶酶原，以改善肺部炎症、提高血氧飽和度、治療肺炎並預防肺纖維化等相關併發症。

冠狀病毒(Coronaviruses，CoVs)為有包膜的單股正鏈RNA病毒，屬冠狀病毒科(Coronaviridae)，根據基因表型可分為四個屬：Alpha Coronavirus(α-CoV)、Beta Coronavirus(β-CoV)、Gamma Coronavirus(γ-CoV)、Delta Coronavirus(δ-CoV)，其中α-CoV和β-CoV冠狀病毒更易感染哺乳動物(CUI J,Li F,SHI Z L.Origin and evolution of pathogenic coronaviruses[J].Naturereviews.Micorbiology,2019,17(3)：181-192)。

重症急性呼吸綜合症冠狀病毒(severe acute respiratory syndromes coronavirus，SARS-CoV)，即β-CoVs，可引起重症急性呼吸綜合症(severe acute respiratory syndromes，SARS)的病毒。中東及韓國等地出現一種與SARS-CoV類似的新型人冠狀病毒(hCoVEMC/2012)則可引起人類的中東呼吸綜合症(Middle East respiratory syndrome，MERS)。2013年，世界衛生組織命名其病原體為中東呼吸綜合症冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)。該病與SARS類似，但更易引起其他併發症，如肝、腎衰竭等，故患者死亡率更高。

SARS病毒具有廣泛組織嗜性，侵襲多種組織器官，造成多種組織器官損害。病人肺部充血、出血、水腫和嚴重的彌漫性肺泡損傷、透明膜形成、肺泡上皮增生、肺間質單核細胞炎性浸潤、肺泡間肺細胞脫落、出現肺間質纖維化。

2019新型冠狀病毒屬於β屬冠狀病毒，由WHO於2020年1月12日正式命名為2019-nCoV(在本申請中也簡稱為COVID-19)，其基因特徵顯著區別於SARS-CoV和MERS-CoV，更接近於蝙蝠SARS樣冠狀病毒bat-SL-CoV ZC45和bat-SL-CoV ZXC21(CHEN Y,LIU Q,GUO D.Emerging coronaviruses：genome structure,replication,and pathogenesis[J].Journal of medical virology,2020)。

2019-nCoV具有較高的傳染性，人群普遍易感，主要表現為下呼吸道感染的症狀，如乾咳、發熱、呼吸困難等，嚴重者甚至可引起急性呼吸窘迫綜合症(acute respiratory distress syndrome,ARDS)和敗血症(Clinical management of severe acute respiratory infection when novel coronavirus(2019-nCoV)infection issuspected：interim guidance.28 January 2020.WHO/nCoV/Clinical/2020.2)。

基於病理分期的新型冠狀病毒性肺炎可分為3期：早期、進展期與重症期。病變早期，病變局限，表現為單發或多發毛玻璃狀病灶(GGO)結節狀、斑片或片狀影；進展期，病變進展，病灶增多、範圍擴大，GGO與實變影或條索影共存，部分實變或結構扭曲影內支氣管柱狀增粗；重症期，雙肺呈彌漫性病變，肺實質廣泛滲出、實變，實變影為主，肺結構扭曲，支氣管擴張，亞段性肺不張，嚴重時呈“白肺”(史河水，韓小雨，樊豔青，梁波，楊帆，韓萍，鄭傳勝．新型冠狀病毒(2019-nCoV)感染的肺炎臨床特徵及影像學表現．臨床放射學雜誌.https：//doi.org/10.13437/j.cnki.jcr.20200206.002)。

本發明發現纖溶酶原能顯著改善肺炎(包括病毒感染性肺炎，例如2019-nCoV病毒性肺炎)、肺纖維化患者肺臟通氣功能、提高血氧飽和度、改善呼吸困難症狀，從而治療肺炎和肺纖維化相關的疾病。

具體地，本發明涉及如下各項。

1.一方面，本申請涉及一種預防和治療肺炎的方法，包括給藥受試者治療有效量之選自如下的一種或多種化合物：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或透過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶 酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

一方面，本申請涉及選自如下的一種或多種化合物在製備預防和治療肺炎的藥物中的用途，所述選自如下的一種或多種化合物為：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或透過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

一方面，本申請涉及選自如下的一種或多種化合物用於預防和治療肺炎的用途，所述選自如下的一種或多種化合物為：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或透過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

一方面，本申請涉及預防和治療肺炎的藥物，包括選自如下的一種或多種化合物，所述選自如下的一種或多種化合物為：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或透過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

2.如項1所述的方法、用途或藥物，其中所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自：纖維蛋白溶酶原、重組人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、迷你型纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、迷你型纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微小型纖溶酶原(micro-plasminogen)、微小型纖溶酶 (micro-plasmin)、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶(delta-plasmin)、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。

3.如項1所述的方法、用途或藥物，其中所述纖溶抑制劑的拮抗劑為PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抑制劑，例如抗體。

4.如項1-3中任一項所述的方法、用途或藥物，其中所述肺炎為細菌感染性肺炎、病毒感染性肺炎、支原體感染性肺炎、衣原體感染性肺炎、真菌感染性肺炎或立克次氏體感染性肺炎。

5.如項1-3中任一項所述的方法、用途或藥物，其中所述肺炎為非感染因素引起的肺炎。在一些實施例中，所述肺炎由輻射所致。在一些實施例中，所述肺炎由吸入有毒氣體所致，如霧霾等粉塵沉積所致肺炎。在一些實施例中，所述肺炎由自身免疫疾病(例如系統性硬化症)所致。在一些實施例中，所述肺炎由過敏所致，比如哮喘。在一些實施例中，所述肺炎由毒性化合物(例如野百合鹼或百草枯)所致。

6.如項4所述的方法、用途或藥物，其中所述肺炎為冠狀病毒感染性肺炎。

7.如項6所述的方法、用途或藥物，其中所述肺炎為2019-nCoV感染性肺炎。

在一些實施例中，所述肺炎為2019-nCoV感染性肺炎，並且所述纖溶酶原實現如下一項或多項：減輕肺組織損傷、減輕肺臟炎症反應、減輕肺臟纖維蛋白沉積、改善肺臟功能、提高血氧飽和度、降低2019-nCoV感染性肺炎受試者血壓、改善2019-nCoV感染性肺炎受試者心臟功能、改善2019-nCoV感染性肺炎受試者一般身體狀況。

8.如項1-7中任一項所述的方法、用途或藥物，其中所述化合物具有選自如下的一項和多項作用：減輕肺組織炎症、減少肺組織炎性滲出、減少肺組織纖維蛋白沉積、減輕肺組織纖維化、減輕肺組織細胞凋亡、改善通氣功能、提高血氧飽和度。

9.如項1-8中任一項所述的方法、用途或藥物，其中所述纖溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如蛋白水解活性、賴胺酸結合活性、或蛋白水解活性和賴胺酸結合活性。

10.如項1-8中任一項所述的方法、用途或藥物，其中所述纖溶酶原包含與序列14所示的纖溶酶原活性片段具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的胺基酸序列、並且具有纖溶酶原的蛋白水解活性或賴胺酸結合活性。在一些實施例中，所述纖溶酶原包含序列14所示的纖溶酶原活性片段並且具有纖溶酶原的蛋白水解活性。

11.如項1-8中任一項所述的方法、用途或藥物，其中所述纖溶酶原為序列2所述纖溶酶原的保守取代變體。在一些實施例中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、迷你型纖溶酶原、微小型纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。在一些實施例中，所述纖溶酶原包含或由以下序列組成：序列2、4、6、8、10、12或14所述的胺基酸序列。

12.如項1-8中任一項所述的方法、用途或藥物，其中所述纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。

13.如項1-12中任一項所述的方法、用途或藥物，其中所述化合物與一種或多種其它治療方法或藥物聯合使用。在一些實施例中，其中所述其它治療方法為體外輔助呼吸方法，例如呼吸機輔助呼吸方法。

14.如項13所述的方法、用途或藥物，其中所述其它藥物選自如下的一種或多種：抗病毒藥物、抗菌素、免疫調節劑、激素類藥物(例如類固醇激素)、疫苗和疾病相關的中和抗體。

15.如項1-14中任一項所述的方法、用途或藥物，其中所述化合物透過選自如下的一種或多種途徑或方式給藥：鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液、滴耳液、滴眼液、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、肌肉內和直腸內。

在本發明的上述任一實施例中，所述纖溶酶原可與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如蛋白水解活性、賴胺酸結合活性、或蛋白水解活性和賴胺酸結合活性。在一些實施例中，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個胺基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。

在一些實施例中，所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。在一些實施例中，所述纖溶酶原選自：Glu- 纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、迷你型纖溶酶原、微小型纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。在一些實施例中，所述纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。在一些實施例中，所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。在一些實施例中，所述纖溶酶原的胺基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些實施例中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。

在一些實施例中，所述受試者是人。在一些實施例中，所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。在一些實施例中，所述缺乏或缺失是先天的、繼發的、和/或局部的。

在一些實施例中，所述藥物組合物包含藥學上可接受的載劑和用於前述方法的纖溶酶原。在一些實施例中，所述試劑盒可以是預防性或治療性試劑盒，其包括；(i)用於前述方法的纖溶酶原和(ii)用於遞送所述纖溶酶原至所述受試者的構件(means)。在一些實施例中，所述構件為注射器或小瓶。在一些實施例中，所述試劑盒還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示將所述纖溶酶原投予所述受試者以實施前述任一方法。

在一些實施例中，所述製品包括：含有標籤的容器；以及包含(i)用於前述方法的纖溶酶原或包含纖溶酶原的藥物組合物，其中所述標籤指示將所述纖溶酶原或組合物投予所述受試者以實施前述任一方法。

在一些實施例中，所述試劑盒或製品還包括另外的一個或多個構件或容器，該構件或容器中含有其他藥物。

在前述方法的一些實施例中，所述纖溶酶原透過全身或局部給藥，較佳為透過以下途徑施用：透過選自如下的一種或多種途徑或方式給藥：鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液、滴耳液、滴眼液、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、肌肉內和直腸內進行治療。在前述方法的一些實施例中，所述纖溶酶原與適當的多胜肽載體或穩定劑組合施用。在前述方法的一些實施例中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm²、0.001-800mg/cm²、0.01-600mg/cm²、0.1-400mg/cm²、1-200 mg/cm²、1-100mg/cm²、10-100mg/cm²(以每平方公分體表面積計算)的劑量施用，較佳為至少重複一次，較佳為至少每天施用。

本發明明確涵蓋了屬於本發明實施例之間的技術特徵的所有組合，並且這些組合後的技術方案在本申請中已經明確揭露，就像上述技術方案已經單獨且明確揭露一樣。另外，本發明還明確涵蓋各個實施例及其要素的之間的組合，該組合後的技術方案在本文中明確揭露。

圖1A-C示出野百合鹼誘導的肺動脈高壓模型小鼠給予纖溶酶原28天後肺天狼星紅染色代表性圖片；A為空白對照組，B給溶媒PBS對照組(在本申請中簡稱溶媒組)，C為給纖溶酶原組(在本申請中簡稱給藥組)；結果顯示，空白對照組小鼠肺基本無膠原蛋白沉積，給纖溶酶原組小鼠肺組織膠原蛋白沉積(箭頭標識)要明顯少於給溶媒PBS對照組；說明纖溶酶原能夠明顯減輕野百合鹼誘導的肺動脈高壓模型小鼠肺的纖維化。

圖2A-C示出博萊黴素誘導的系統性硬化模型小鼠給予纖溶酶原21天後肺天狼星紅染色代表性圖片；A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果；結果顯示，在博萊黴素誘導的系統性硬化症小鼠模型中，給溶媒PBS組小鼠肺纖維化(箭頭標識)程度比給纖溶酶原組高；給纖溶酶原組小鼠肺部肺泡壁形態接近正常，炎症水平細胞明顯減少，纖維化程度明顯低於給溶媒PBS組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。

圖3A-B示出百草枯誘導中毒小鼠給予纖溶酶原14天後肺sirius red染色觀察結果；A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠膠原纖維的沉積明顯少於給溶媒PBS對照組；說明纖溶酶原能夠減輕百草枯中毒所致的肺纖維化。

圖4A-D示出給藥纖溶酶原14天，LPS誘導的肺炎模型小鼠肺天狼猩紅染色結果；A為空白對照組，B為給溶媒對照組，C為給藥組，D為定量分析結果；結果顯示，空白對照組肺組織具有一定的膠原蛋白沉積(箭頭標識)，溶媒組小鼠肺組織膠原蛋白沉積明顯增多，給藥組小鼠肺組織膠原蛋白沉積明顯少於溶媒 組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)；表明纖溶酶原能夠減少肺炎模型小鼠肺膠原蛋白沉積，改善肺炎所致肺纖維化。

圖5A-C示出提前給藥纖溶酶原3天，LPS誘導的肺炎模型小鼠肺天狼猩紅染色結果；A為空白對照組，B為給溶媒對照組，C為給藥組。結果顯示，空白對照組肺組織具有一定的膠原蛋白沉積(箭頭標識)，溶媒組小鼠肺組織膠原蛋白沉積明顯增多，給藥組小鼠肺組織膠原蛋白沉積明顯少於溶媒組；表明提前施予纖溶酶原能夠減少肺炎模型小鼠肺膠原蛋白沉積，改善肺炎所致肺纖維化。

圖6示出給藥纖溶酶原7天，LPS誘導的肺炎模型小鼠肺灌洗液總蛋白檢測結果；結果顯示，空白對照組肺灌洗液中具有一定量的總蛋白，溶媒組肺灌洗液中總蛋白水平明顯高於空白對照組(***表示P<0.001)，而給藥組肺灌洗液總蛋白水平明顯少於溶媒組，且統計差異接近顯著(P=0.052)；提示纖溶酶原能夠減少肺炎模型小鼠肺灌洗液中總蛋白水平。

圖7示出給藥纖溶酶原3天，LPS誘導的肺炎模型小鼠肺纖維蛋白免疫組化染色結果；A為給溶媒對照組，B為給藥組；結果顯示，溶媒組小鼠肺組織纖維蛋白沉積水平明顯高於給藥組；提示纖溶酶原能夠減少肺炎模型小鼠肺纖維蛋白沉積。

圖8示出普通型COVID-19患者的高解析度CT圖像。左側顯示病人的ID；A柱：吸入纖溶酶原前胸部CT圖像，B柱：吸入纖溶酶原後相應病人的胸部CT圖像，C：5例患者於B超檢查後5天複查胸部CT，黑色箭頭和方框表示異常；用藥人纖溶酶原2-3次後，5例患者肺部病灶數目、範圍和密度均減少，甚至部分消失，斑片狀或點狀“毛玻璃”影明顯減少或吸收，這表明霧化吸入人纖溶酶原能迅速改善COVID-19感染引起的肺損傷。

圖9示出普通型、重型和危重型COVID-19患者吸入纖溶酶原前後的心率監測結果；統計分析顯示，用藥纖溶酶原後，普通型、重型和危重型患者心率均值均有降低趨勢，並且普通型患者用藥前後比較可見統計學差異(p<0.05)。

纖維蛋白溶解系統(Fibrinolytic system)也稱纖溶系統，為參與纖維蛋白溶解(纖溶)過程的一系列化學物質組成的系統，主要包括纖維蛋白溶解酶原(纖溶酶原)、纖溶酶、纖溶酶原激活物、纖溶抑制劑。纖溶酶原激 活物包括組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)。t-PA是一種絲胺酸蛋白酶，由血管內皮細胞合成。t-PA激活纖溶酶原，此過程主要在纖維蛋白上進行；尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)由腎小管上皮細胞和血管內皮細胞產生，可以直接激活纖溶酶原而不需要纖維蛋白作為輔因子。纖溶酶原(PLG)由肝臟合成，當血液凝固時，PLG大量吸附在纖維蛋白網上，在t-PA或u-PA的作用下，被激活為纖溶酶，促使纖維蛋白溶解。纖溶酶(PL)是一種絲胺酸蛋白酶，作用如下：降解纖維蛋白和纖維蛋白原；水解多種凝血因子V、Ⅷ、X、Ⅶ、XI、Ⅱ等；使纖溶酶原轉變為纖溶酶；水解補體等。纖溶抑制物：包括纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)和α2抗纖溶酶(α2-AP)。PAI主要有PAI-1和PAI-2兩種形式，能特異性與t-PA以1：1比例結合，從而使其失活，同時激活PLG。α2-AP由肝臟合成，與PL以1：1比例結合形成複合物，抑制PL活性；FXⅢ使α2-AP以共價鍵與纖維蛋白結合，減弱了纖維蛋白對PL作用的敏感性。體內抑制纖溶系統活性的物質：PAI-1，補體C1抑制物；α2抗纖溶酶；α2巨球蛋白。

本發明的用語“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”涵蓋：1.纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、微小型纖溶酶原(micro-plasminogen)、delta-纖溶酶原；它們的變體或類似物；2.纖維蛋白溶酶以及它們的變體或類似物；以及3.纖維蛋白溶酶原激活劑，例如tPA和uPA以及包含一個或多個tPA或uPA的結構域(如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的tPA或uPA變體和類似物。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及透過添加、刪除和/或取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個胺基酸、仍然具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA活性的蛋白質。例如，纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括透過例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個保守性胺基酸取代獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的“纖溶酶原變體”涵蓋與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。例如本發明的“纖溶酶原變體”可以是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個胺基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。具體地，本發明纖溶酶原變體包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及透過保守性胺基酸取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個胺基酸獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的纖溶酶原可以為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的變體，例如序列2、6、8、10或12所示的纖溶酶原，例如序列2所示的人天然纖溶酶原。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“類似物”包括分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用的化合物。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”。例如，纖維蛋白溶酶原的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖溶酶原結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶原變體和類似物，例如迷你型纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)。纖維蛋白溶酶的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖維蛋白溶酶結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶“變體”和“類似物”，例如迷你型纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)和δ-纖維蛋白溶酶(delta-plasmin)。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的“變體”或“類似物”是否分別具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的活性，或者是否分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用可以透過本領域已知方法進行檢測，例如，透過基於酶譜法(enzymography)、ELISA(酶聯免疫吸附測定)和FACS(螢光激活細胞分選方法)透過激活的纖維蛋白 溶酶活性水平來衡量，例如可以參照選自如下文獻中記載的方法測量：Ny，A.，Leonardsson，G.，Hagglund，A.C，Hagglof，P.，Ploplis，V.A.，Carmeliet，P. and Ny，T. (1999). Ovulation inplasminogen-deficient mice. Endocrinology 140，5030-5035；Silverstein RL, Leung LL, Harpel PC, Nachman RL (November 1984). "Complex formation of platelet thrombospondin with plasminogen. Modulation of activation by tissue activator". J. Clin. Invest. 74 (5): 1625-33；Gravanis I, Tsirka SE (February 2008). "Tissue-type plasminogen activator as a therapeutic target in stroke". Expert Opinion on Therapeutic Targets. 12 (2): 159-70；Geiger M, Huber K, Wojta J, Stingl L, Espana F, Griffin JH, Binder BR (Aug 1989). "Complex formation between urokinase and plasma protein C inhibitor in vitro and in vivo". Blood. 74 (2): 722-8.

在本發明的一些實施方案中，本發明的“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”為纖溶酶原，選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、迷你型纖溶酶原、微小型纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的保守突變變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的保守突變變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原的胺基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是如序列2所示的人天然纖溶酶原。

“能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物”係指能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的任何化合物，例如tPA、uPA、鏈激酶、沙蘆普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉諾替普酶、帕米普酶、葡激酶。

本發明“纖溶抑制劑的拮抗劑”為拮抗、減弱、封閉、阻止纖溶抑制劑作用的化合物。所述纖溶抑制劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶和α2巨球蛋白。所述拮抗劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體，或阻斷或下調例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白表達的反義RNA或小RNA，或佔據PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合位點但無PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白功能的化合 物”，或封閉PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合結構域和/或活性結構域的化合物。

纖溶酶是纖溶酶原激活系統(PA系統)的關鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶，能夠水解細胞外基質(ECM)的幾個組分，包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層黏連蛋白和蛋白聚糖。此外，纖溶酶能將一些金屬蛋白酶前體(pro-MMPs)激活形成具有活性的金屬蛋白酶(MMPs)。因此纖溶酶被認為是胞外蛋白水解作用的一個重要的上游調節物。纖溶酶是由纖溶酶原透過兩種生理性的PAs：組織型纖溶酶原激活劑(tPA)或尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)蛋白水解形成的。由於纖溶酶原在血漿和其他體液中相對水平較高，傳統上認為PA系統的調節主要透過PAs的合成和活性水平實現。PA系統組分的合成受不同因素嚴格調節，如激素、生長因子和細胞因子。此外，還存在纖溶酶和PAs的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α2-抗纖溶酶(α2-antiplasmin)。PAs的活性同時被uPA和tPA的纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)抑制以及主要抑制uPA的溶酶原激活劑抑制劑-2(PAI-2)調節。某些細胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細胞表面受體(uPAR)。

纖溶酶原是一個單鏈糖蛋白，由791個胺基酸組成，分子量約為92kDa。纖溶酶原主要在肝臟合成，大量存在於胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約為2μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的一個巨大的潛在來源。纖溶酶原存在兩種分子形式：穀胺酸-纖溶酶原(Glu-plasminogen)和賴胺酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個胺基末端(N-末端)穀胺酸，因此被稱為穀胺酸-纖溶酶原。然而，在纖溶酶存在時，穀胺酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成為賴胺酸-纖溶酶原。與穀胺酸-纖溶酶原相比，賴胺酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力，並可以更高的速率被PAs激活。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561胜肽鍵可被uPA或tPA切割，導致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成。纖溶酶原的胺基末端部分包含五個同源三環，即所謂的kringles，羧基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringles含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α2-AP特異性相互作用的賴胺酸結合位點。最新發現一個纖溶酶原為38kDa的片段，其中包括kringles1-4，是血管生成的有效抑制劑。這個片段被命名為血管抑素，可透過幾個蛋白酶水解纖溶酶原產生。

纖溶酶的主要反應物是纖維蛋白，纖維蛋白的溶解是預防病理性血栓形成的關鍵。纖溶酶還具有對ECM幾個組分的反應物特異性，包括層黏連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠，表明纖溶酶在ECM重建中也起著重要作用。間接地，纖溶酶還可以透過轉化某些蛋白酶前體為活性蛋白酶來降解ECM的其他組分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纖溶酶可能是細胞外蛋白水解的一個重要的上游調節器。此外，纖溶酶具有激活某些潛在形式的生長因子的能力。在體外，纖溶酶還能水解補體系統的組分並釋放趨化補體片段。

“纖溶酶”是存在於血液中的一種非常重要的酶，能將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體。

“纖溶酶原”是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號胜肽的天然人源纖溶酶原胺基酸序列(序列4)計算由810個胺基酸組成，分子量約為90kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中循環的糖蛋白，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域；位於C末端的絲胺酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號胜肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI資料，絲胺酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。

Glu-纖溶酶原是人天然全長的纖溶酶原，由791個胺基酸組成(不含有19個胺基酸的信號胜肽)，編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其胺基酸序列如序列2所示。在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位胺基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纖溶酶原(δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲胺酸蛋白酶域(也稱蛋白酶結構域(protease domain，PD))，有文獻報導了delta-纖溶酶原的胺基酸序列(序列8)，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列7所示。迷你型纖溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和絲胺酸蛋白酶域組成，有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791(以不含有信號胜肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始胺基 酸)，其胺基酸序列如序列10所示，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微小型纖溶酶原(Micro-plasminogen)僅含有絲胺酸蛋白酶結構域，有文獻報導其胺基酸序列包括殘基Ala543-Asn791(以不含有信號胜肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始胺基酸)，也有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791(以不含有信號胜肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始胺基酸)，在本專利申請中微小型纖溶酶原序列參考專利文獻CN102154253A，其胺基酸序列如序列12所示，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

全長纖溶酶原的結構也描述在Aisina等(Aisina RB,Mukhametova L I.Structure and function of plasminogen/plasmin system[J].Russian Journal of Bioorganic Chemistry,2014,40(6)：590-605)的文章中。在該文章中，Aisina等描述纖溶酶原包括Kringle1、2、3、4、5結構域和絲胺酸蛋白酶結構域(也稱蛋白酶結構域(protease domain，PD))(即賴胺酸結合活性)，其中，Kringles負責纖溶酶原與低分子量和高分子量的配體結合，導致纖溶酶原轉變成一個更加開放的構型，從而更容易被活化，蛋白酶結構域(PD)為殘基Val562-Asn791，tPA和UPA特異性切割纖溶酶原的Arg561-Val562位活化鍵，從而使纖溶酶原形成纖溶酶，因此，蛋白酶結構域(PD)是賦予纖溶酶原蛋白水解活性的區域。

本發明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用，含義相同；“纖溶酶原”與“纖維蛋白溶酶原”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用，含義相同。

在本申請中，所述纖溶酶原“缺乏”的含義或活性為受試者體內纖溶酶原的含量比正常人低，低至足以影響所述受試者的正常生理功能；所述纖溶酶原“缺失”的含義或活性為受試者體內纖溶酶原的含量顯著低於正常人，甚至活性或表達極微，只有透過外源提供才能維持正常生理功能。

本領域技術人員可以理解，本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶，因此，本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。在循環過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構相，但當結合至血栓或細胞表面時，在纖溶酶原激活劑(plasminogen activator,PA)的介導下，其轉變為呈開放性構相的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構相的重要決定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和反應物 上的賴胺酸殘基結合。已知多種能夠作為纖溶酶原激活劑的酶，包括：組織纖溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、激胜肽釋放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纖溶酶原活性片段”是指具有與反應物靶序列中賴胺酸結合的活性(賴胺酸結合活性)、或發揮蛋白水解功能的活性(蛋白水解活性)、或蛋白水解活性和賴胺酸結合活性的片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含纖溶酶原的絲胺酸蛋白酶結構域或由纖溶酶原的絲胺酸蛋白酶結構域組成，較佳為，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、或與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列或由序列14、或與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列組成。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4、Kringle 5中一個或多個的區域，或由選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4、Kringle 5中一個或多個的區域組成。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原包括含有上述纖溶酶原活性片段的蛋白質。

目前，對於血液中纖溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖溶酶原激活劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖溶酶原激活劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg)、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法為發色反應物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色反應物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色反應物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖溶酶原活性成正比。此外也可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖溶酶原活性進行測定。

“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也稱為直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶 原包括人的天然纖溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代變體”是指其中一個給定的胺基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構相和功能，這包括但不限於以相似特性(如酸性，鹼性，疏水性，等)的胺基酸取代親本蛋白質中胺基酸序列中的胺基酸。具有類似性質的胺基酸是眾所周知的。例如，精胺酸、組胺酸和賴胺酸是親水性的鹼性胺基酸並可以互換。同樣，異亮胺酸是疏水胺基酸，則可被亮胺酸，蛋胺酸或纈胺酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或胺基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN演算法的70%至99%的相似度(同一性)。“保守取代變體”還包括透過BLAST或FASTA演算法確定具有60%以上的胺基酸同一性的多胜肽或酶，若能達75%以上更好，最好能達85%以上，甚至達90%以上為最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。

“分離的”纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖溶酶原會純化：(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如透過Lowry法所確定的，例如超過99%(按重量計)；(2)至足以透過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部胺基酸序列的至少15個殘基的程度；或(3)至同質性，該同質性是透過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原也包括透過生物工程技術從重組細胞製備，並透過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。

用語“多胜肽”、“胜肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指任何長度的胺基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的胺基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的胺基酸，和具有經修飾的胜肽主鏈的多胜肽。該用語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源胺基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫胺酸殘基)的融合物；等等。

關於參照多胜肽序列的“胺基酸序列同一性百分數(%)”定義為在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多胜肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。為測定百分比胺基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公眾可得到的電腦軟體，諸如BLAST、 BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員能決定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何演算法。然而，為了本發明的目的，胺基酸序列同一性百分數值是使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生的。

在採用ALIGN-2來比較胺基酸序列的情況中，給定胺基酸序列A相對於給定胺基酸序列B的%胺基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定胺基酸序列B的某一%胺基酸序列同一性的給定胺基酸序列A)如下計算：分數X/Y乘100，其中X是由序列比對程式ALIGN-2在該程式的A和B比對中評分為相同匹配的胺基酸殘基的數目，且其中Y是B中的胺基酸殘基的總數。應當領會，在胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不相等的情況下，A相對於B的%胺基酸序列同一性會不等於B相對於A的%胺基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%胺基酸序列同一性的值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2電腦程式獲得的。

如本文中使用的，用語“治療”指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀的發生、發作，部分或完全減輕疾病和/或其症狀，和/或部分或完全治癒疾病和/或其症狀，包括：(a)預防疾病在受試者體內發生或發作，所述受試者可以具有疾病的因素，但是尚未診斷為具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滯其形成；及(c)減輕疾病和/或其症狀，即引起疾病和/或其症狀消退或消失。

用語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠、小鼠)、非人靈長類、人、犬、貓、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。

“治療有效量”或“有效量”指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物(例如纖溶酶原)的量。“治療有效量”會根據所使用的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物(例如纖溶酶原)、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。

本發明纖溶酶原的製備

纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，也可以透過標準的化學胜肽合成技術來合成。當透過化學合成多胜肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多胜肽合成(SPPS)(其中將序列的C末端胺基酸附接於不溶性支援物，接著序貫添加序列中剩餘的胺基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284頁於The Peptides：Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield，等J.Am.Chem.Soc.,85：2149-2156(1963)；Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006 Mini Rev.Med Chem.6：3-10和Camarero JA等2005 Protein Pept Lett.12：723-8中。簡言之，用其上構建有胜肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複循環後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的胺基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的胺基酸附接的新的N末端胺。胜肽保持固定在固相上，之後將其切掉。

可以使用標準重組方法來生產本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啟動子(例如天然關聯的或異源的啟動子)、信號序列、增強子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啟動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水平表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。

合適的表達載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如安比西林抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。

大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於選殖主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，諸如沙門 氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，也可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公知的啟動子，諸如乳糖啟動子系統，色胺酸(trp)啟動子系統，beta-內醯胺酶啟動子系統，或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情況中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啟動並完成轉錄和翻譯。

其他微生物，諸如酵母也可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列等。典型的啟動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啟動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。

在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)也可以用於表達並生成本發明的抗-Tau抗體(例如編碼主題抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啟動子和增強子(Queen等，Immunol.Rev.89：49(1986))，以及必需的加工資訊位元點，諸如核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啟動子。參見Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。

一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱、親和柱、管柱層析、高效液相層析(HPLC)、凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除目標產物以外的大分子，等等。

藥物配製劑

可以透過將具有所需純度的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物(例如纖溶酶原)與可選的藥用載體、賦形劑、或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合來形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)、苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多胜肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單糖、二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。較佳為凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作為參考。

本發明的配製劑也可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，較佳為活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。

本發明的纖溶酶原可包裹在透過諸如凝聚技術或介面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳劑、奈米顆粒和奈米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術揭露於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。

用於體內給藥的本發明的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物(例如纖溶酶原)必需是無菌的。這可以透過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後透過除菌濾膜過濾而輕易實現。

本發明的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物(例如纖溶酶原)可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15： 167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12：98-105(1982))或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利3773919,EP 58,481)、L-穀胺酸與γ乙基-L-穀胺酸的共聚物(Sidman等，Biopolymers 22：547(1983))、不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer等，出處同上)、或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮胺醯脯胺酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)、以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是透過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可透過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。

給藥和劑量

可以透過不同方式，例如透過鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液或滴眼液，靜脈內，腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)、肌內、直腸給藥來實現本發明藥物組合物的施用。

用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。

醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取決於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以例如為每天約0.0001至2000mg/kg，或約0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或50mg/kg體重或在1-50mg/kg的範圍，或至少1mg/kg。高於或低於此例示 性範圍的劑量也涵蓋在內，特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量也包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每週或根據透過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天0.01-100mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要即時評估治療效果和安全性。

製品或藥盒

本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物(例如纖溶酶原)。所述製品較佳為包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑為纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物(例如纖溶酶原)。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述病症。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將包含纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物(例如纖溶酶原)的組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。

實施例

以下實施例中使用的人纖溶酶原來自捐贈者血漿，基於如下文獻描述的方法：KennethC Robbins,Louis Summaria,David Elwyn et al.Fuither Studies on the Purification and Characterization of Human Plasminogen and Plasmin.Journal of Biological Chemistry, 1965, 240 (1): 541-550; Summaria L, Spitz F,Arzadon L et al. Isolation and characterization of the affinity chromatography20 forms of human Glu- and Lys-plasminogens and plasmins. J Biol Chem. 1976Jun 25;251(12):3693-9; HAGAN JJ, ABLONDI FB, DE RENZO EC.Purification and biochemical properties of human plasminogen. J Biol Chem. 1960 Apr;235:1005-10，並進行工藝優化，從 人血漿中純化所得從人捐贈者血漿純化獲得，其中人Lys-纖維蛋白溶酶原(Lys-纖溶酶原)和Glu-纖維蛋白溶酶原(Glu-纖溶酶原)>98%。

實施例1 纖溶酶原降低野百合鹼誘導肺動脈高壓模型小鼠肺纖維化水平

取12周C57雄性小鼠12隻稱重、測量血壓，根據血壓隨機分為2組，空白對照組4隻小鼠，模型組8隻小鼠。空白對照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水100μl，模型組小鼠尾靜脈單次注射野百合鹼60mg/kg/隻，造模3天，小鼠正常飲食^[3-4]。3天後測量血壓，並根據血壓將模型組小鼠隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各4隻。給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組小鼠尾靜脈注射給予相同體積的PBS溶液，連續給予28天；空白對照組小鼠不做給藥處理。開始造模給藥定為第1天，在第29天犧牲小鼠後取材肺在4%多聚甲醛固定液中固定24小時。固定後的肺組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟至水後水洗1次，以0.1%天狼星紅飽和苦味酸染色30分鐘後，流水沖洗2分鐘，蘇木素染色1分鐘，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，流水沖洗，烘乾後中性樹膠封片，在200倍光學顯微鏡下觀察。

野百合鹼是雙吡咯類生物鹼，在肝臟內經P450單氧化酶轉化後，經由血液循環到達肺臟，可引起肺血管不可逆性損傷。肺血管內皮細胞被認為是野百合鹼的標靶細胞，內皮細胞損傷在肺血管重建過程中起著關鍵作用。

結果顯示，空白對照組小鼠肺基本無膠原蛋白沉積(圖1A)，給纖溶酶原組(圖1C)小鼠肺組織膠原蛋白沉積(箭頭標識)要明顯少於給溶媒PBS對照組(圖1B)。說明纖溶酶原能夠明顯減輕野百合鹼誘導的肺動脈高壓模型小鼠肺的纖維化。

實施例2 纖溶酶原降低系統性硬化症小鼠肺組織纖維化

取12周齡C57雄鼠17隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組11隻和給纖溶酶原組6隻。實驗開始當天記為第0天並稱重分組，第1天開始造模給藥，兩組小鼠按0.1mg/0.1ml/隻/天皮下注射博萊黴素誘導系統性硬化症^[5]，並開始給纖溶酶原或PBS，連續造模給藥21天。給纖溶酶原組小鼠按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS。第 22天犧牲小鼠並取肺組織在4%多聚甲醛固定液中固定24小時。固定後的肺組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟至水後水洗1次，以0.1%天狼星紅飽和苦味酸染色30分鐘後，流水沖洗2min，蘇木素染色1分鐘，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，流水沖洗，烘乾後中性樹膠封片，在200倍光學顯微鏡下觀察。

研究發現，在博萊黴素誘導的系統性硬化症小鼠模型中，鏡下觀察給溶媒PBS組(圖2A)膠原纖維化(箭頭標識)程度比給纖溶酶原組(圖2B)高；給纖溶酶原組小鼠肺部肺泡壁形態接近正常水平，炎症細胞明顯減少，纖維化程度明顯低於給溶媒PBS組，且統計差異顯著(圖2C)。說明纖溶酶原可有效降低博萊黴素誘導的系統性硬化症小鼠肺組織纖維化。

實施例3 纖溶酶原降低百草枯中毒小鼠的肺纖維化

取9-10周齡C57小鼠12隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各6隻。兩組小鼠按照15mg/kg體重單次腹腔注射百草枯溶液後立即開始給藥並記為第1天^[6]。纖溶酶原組小鼠按1mg/0.1mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS。給藥週期14天，第15天犧牲小鼠並取肺組織在4%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的肺組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟至水後水洗1次，以0.1%天狼星紅染色60分鐘後，流水沖洗，蘇木素染色1分鐘，流水沖洗，1%鹽酸酒精和氨水分化返藍，流水沖洗，烘乾後封片，在200倍光學顯微鏡下觀察。

百草枯是一種快速滅生性除草劑，對人類毒性極大，進入人體可使肺、肝、腎等出現損傷。肺損傷表現為早期肺泡上皮細胞受損，肺泡內出血水腫等症狀，晚期表現為肺泡內和肺間質纖維化^[6]。目前，百草枯中毒沒有任何治療方法，死亡率幾乎為100%。

Sirius red染色結果顯示，給纖溶酶原組(圖3B)小鼠肺的膠原纖維的沉積明顯少於給溶媒PBS對照組(圖3A)。說明纖溶酶原能夠減少百草枯中毒所致的肺纖維化。

實施例4 纖溶酶原減少肺炎模型小鼠肺組織膠原蛋白沉積

取6-8周齡的C57小鼠18隻，根據體重隨機分為三組，分別為空白對照組、溶媒組和給藥組，每組各6隻。溶媒組和給藥組小鼠用2%異氟烷麻醉後，按照3mg/kg體重氣管滴注1.5mg/ml的細菌脂多糖(LPS)(購自北京索萊寶科技有限公司，貨號：L8880)溶液建立肺炎模型^[7]。施予LPS 2小時後，給藥組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，溶媒組小鼠尾靜脈注射相同體積溶媒，持續給藥14天。第15天犧牲小鼠，取材肺組織在4%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的肺組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟至水後水洗1次，以0.1%天狼星紅染色60分鐘後，流水沖洗，蘇木素染色1分鐘，流水沖洗，1%鹽酸酒精和氨水分化返藍，流水沖洗，烘乾後封片，在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，空白對照組(圖4A)肺組織具有一定的膠原蛋白沉積(箭頭標識)，溶媒組(圖4B)小鼠肺組織膠原蛋白沉積明顯增多，給藥組(圖4C)小鼠肺組織膠原蛋白沉積明顯少於溶媒組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)(圖4D)。表明纖溶酶原能夠減少肺炎模型小鼠肺膠原蛋白沉積，改善肺炎所致肺纖維化。

實施例5 提前施予纖溶酶原減少肺炎模型小鼠肺組織膠原蛋白沉積

取6-8周齡的C57小鼠18隻，根據體重隨機分為三組，分別為空白對照組、溶媒組和給藥組，每組各6隻。給藥組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，溶媒組小鼠尾靜脈注射相同體積溶媒，連續給藥3天。第4天，溶媒組和給藥組小鼠用2%異氟烷麻醉後，按照3mg/kg體重氣管滴注1.5mg/ml的細菌脂多糖(LPS)(購自北京索萊寶科技有限公司，貨號：L8880)溶液建立肺炎模型^[7]。第9天犧牲小鼠，取材肺組織在4%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的肺組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟至水後水洗1次，以0.1%天狼星紅染色60分鐘後，流水沖洗，蘇木素染色1分鐘，流水沖洗，1%鹽酸酒精和氨水分化返藍，流水沖洗，烘乾後封片，在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，空白對照組(圖5A)肺組織具有一定的膠原蛋白沉積(箭頭標識)，溶媒組(圖5B)小鼠肺組織膠原蛋白沉積明顯增多，給藥組(圖 5C)小鼠肺組織膠原蛋白沉積明顯少於溶媒組。表明提前施予纖溶酶原能夠減少肺炎模型小鼠肺膠原蛋白沉積，改善肺炎所致肺纖維化。

實施例6 纖溶酶原減少肺炎模型小鼠肺灌洗液中總蛋白水平

取6-8周齡的C57小鼠18隻，根據體重隨機分為三組，分別為空白對照組、溶媒組和給藥組，每組各6隻。溶媒組和給藥組小鼠用2%異氟烷麻醉後，按照3mg/kg體重氣管滴注1.5mg/ml的細菌脂多糖(LPS)(購自北京索萊寶科技有限公司，貨號：L8880)溶液建立肺炎模型。施予LPS 2小時後，給藥組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，溶媒組小鼠尾靜脈注射相同體積溶媒，持續給藥7天。第8天犧牲所有小鼠，解剖取肺稱重，對右肺支氣管使用PBS灌洗，連續2次共0.7ml，收集液體，4℃ 700g離心10分鐘，收集上清，使用Bicinchoninic acid(BCA)法檢測總蛋白。

結果顯示，空白對照組肺灌洗液中具有一定量的總蛋白，溶媒組肺灌洗液中總蛋白水平明顯高於空白對照組(***表示P<0.001)，而給藥組肺灌洗液總蛋白水平明顯少於溶媒組，且統計差異接近顯著(P=0.052)(圖6)。提示纖溶酶原能夠減少肺炎模型小鼠肺灌洗液中總蛋白水平。

實施例7纖溶酶原減少肺炎模型小鼠肺纖維蛋白沉積

取6-8周齡的C57小鼠12隻，根據體重隨機分為兩組，分別為溶媒組和給藥組，每組各6隻。溶媒組和給藥組小鼠用2%異氟烷麻醉後，按照3mg/kg體重氣管滴注1.5mg/ml的細菌脂多糖(LPS)(購自北京索萊寶科技有限公司，貨號：L8880)溶液建立肺炎模型^[7]。施予LPS 2小時後，給藥組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，溶媒組小鼠尾靜脈注射相同體積溶媒，持續給藥3天。第4天犧牲小鼠取材左肺在4%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的組織樣本經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。腦組織冠狀切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。檸檬酸修復30分鐘，室溫冷卻10分鐘後水輕柔沖洗。以3%雙氧水孵育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10%的羊血清(Vector laboratories,Inc.，美國)封閉1小時；時間到後，棄除羊血清液。兔源抗Fibrin抗體(Abcam)4℃孵育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.，美國)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水返藍5分鐘，然後PBS洗1次。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

纖維蛋白為急性呼吸窘迫症中肺透明膜的主要成分，透明膜阻礙肺泡的氣體交換功能，導致血氧飽和度降低和呼吸困難^[8]。

結果顯示，溶媒組(圖7A)小鼠肺組織纖維蛋白沉積水平明顯高於給藥組(圖7B)。提示纖溶酶原能夠減少肺炎模型小鼠肺纖維蛋白沉積。

以下實施例進一步說明對本發明的實踐，但不意圖限制本發明。

以下所有患者均簽署知情同意書自願用藥，並獲得醫院倫理委員會批准。

根據病情嚴重程度和病程不同，調節用法用量。給藥方式主要為霧化吸入和靜脈注射。霧化吸入、靜脈注射的、上述從人捐贈者血中純化的人纖溶酶原的濃度均為5mg/ml，生理鹽水為溶媒。

實施例8 肺炎、肺纖維化患者

患者，男，77歲，腦梗後遺症，肺纖維化，用該藥前表現為肺炎，痰多，痰色黃、黏稠、不易咳出；需吸痰，每天(24小時)25至26次，每次都能吸出大量痰液。一直吸氧(幾乎不能脫氧)，呼吸音略粗。喉部氣道切口(金屬套管)。已經臥床近半年，睡眠狀態不佳，精神狀態不佳。

用藥方案：前9天，霧化吸入，10mg/次，3次/天；第10天，霧化吸入，10mg/次，2次/天；第11天停藥；第12天，霧化吸入一次，劑量為10mg；第13天，霧化吸入一次，劑量為10mg，同時結合10mg靜脈注射；第14天，15mg靜脈注射。

療效：

第一天用藥：症狀有所改善，表現為咳痰有力，從氣道切口自主排出，吸痰次數減少到8次(早8點-晚8點)。第二天用藥：第一次脫氧扶坐20min，血氧飽和度為94%，心率為65；第二次脫氧十幾分鐘，血氧飽和度為98%，心率為75；第三次脫氧扶坐20min，血氧飽和度為94-98%間波動，心率為78左右。咳痰較昨天有力，吸痰6次(早8點-晚8點)。用藥第14天後，患者主動要求脫氧，脫氧後血氧飽和度為97%，入睡時94%左右，脫氧時間可達12小時以上，基本可 以脫氧；痰從用藥前的黃、稠、黏轉變為白、稀、泡沫狀，由主要借助吸痰機排痰轉變為大部分可以自主排出。

由上結果表明，纖溶酶原能有效改善患者肺炎症狀，包括咳痰有力、自主排痰、吸痰次數減少、脫氧時間延長、血氧飽和度改善、痰的性狀改善等。

實施例9 肺纖維化、哮喘患者

患者，女，83歲，年輕時患過肺結核，大約20年前，被診斷為肺纖維化，哮喘，後逐漸加重。主要表現：肺功能差，基本只能支持床上活動，不能下床活動。

用藥方案：第1天，霧化吸入，10mg/次一天1次；第2天，霧化吸入，10mg/次，一天2次；第3天，霧化吸入，10mg/次，一天3次。

用藥效果：用藥後患者自覺呼吸順暢，能支持更多的下床活動。

由上結果表明，纖溶酶原可改善肺纖維化、哮喘患者肺部功能。

實施例10哮喘患者

患者，男，55歲，生命體徵平穩，意識清楚。主訴：無高血壓，心臟病、糖尿病等病史。患者長期服用曲美他嗪和拜阿司匹林、銀杏葉膠囊和深海魚油，3年前患有腦梗。患者主訴睡眠品質差，無其它不適症狀，觀察病人運動後氣喘。

用藥方案：治療由22天14次用藥組成，前6天，每天用藥一次，每次150mg靜脈推注；後16天，每兩天一次，每次150mg靜脈推注。

治療效果：

治療效果透過對患者的總體狀況和運動後氣喘症狀的評分來評估。第一天以沒有打藥時患者的總體狀況和運動後氣喘症狀的評分定為10，打藥後以昨天患者的總體狀況和運動後氣喘症狀的評分定為10。10分為最嚴重，1分為最輕。

用藥第4天，總體狀況評分為8，運動後氣喘症狀評分為8，患者精神狀態較好，睡眠品質好轉。隨著用藥時間延長，患者各種症狀進一步改善。 用藥第22天，總體狀況評分為5，運動後起喘症狀評分為3，患者無不適，睡眠品質進一步好轉，食欲好轉。

由上可知可見，纖溶酶原可改善哮喘患者症狀，包括總體狀況、運動後氣喘症狀、精神狀態、睡眠品質、食欲等。

實施例11非5q型SMA患者

患者，女，40月齡(3歲4個月)，診斷：SMA(脊髓性肌萎縮症)非5q型。6個月大時發病，1.5歲(18月齡)確診SMA，因肺感染、排痰困難堵塞呼吸道導致呼吸無力，由間斷使用呼吸機後逐漸自主呼吸衰竭無法離線，使用呼吸機約1.5年。語言功能喪失，無法活動，肌力基本0級。症狀表現：使用呼吸機至今，每日使用排痰器、咳痰機、吸痰器、吸氧、霧化(每日2次)，鼻飼進食。使用呼吸機參數：壓力20；潮氣量120左右；幾乎無自主呼吸，氧流量1-1.5ml，每天吸痰15次到20次，夜間不定時吸痰(吸痰曾導致氣道黏膜損傷出血)，血氧檢測儀顯示使用氧氣情況下血氧飽和度95%以上(不能斷氧)，心率：140次/分鐘。體溫長期在37.5℃以上。

用藥方案

第一療程(2周)：霧化吸入，10mg/次，3次/天，合併50-100mg靜脈注射給藥，每三天給藥一次。

第一療程結束後間隔57天後進行第二療程。

第二至第四療程(每個療程中間間隔2周)：靜脈注射，1次/3天，劑量為150-250mg。

治療效果

第一療程：呼吸機參數不變，自主呼吸增多，約達到20-30%(10次呼吸約出現2-3次自主呼吸)，在氧流量不變時，用藥後血氧飽和度可達到98-99%。

第二療程：住院15天行氣管切開術後出院回家護理，痰量多，一直從氣道裡溢出來，需要及時吸痰清理；呼吸機壓力降低，出院時18後調至16，潮氣量130到140，自主呼吸恢復較好；可以關氧氣，晚上基本不用氧氣，血氧飽和度95%以上，心率120次/分鐘左右，有時會更好，體溫恢復正常。

第三療程：呼吸機壓力可調至15或16，潮氣量140到150之間，氣道更通暢，均為自主呼吸，吸氧次數少，吸痰時偶爾使用。常規心率為120次/min，用藥後會有4-5小時內不開氧氣，心率100次/分鐘，血氧飽和度99%。患者痰量減少，氣道切口基本無痰，每日吸痰5-6次。

第四療程：呼吸機參數和自主呼吸情況同第三療程，血氧飽和度日常97-99%，基本上不使用氧氣，吸痰次數減少，每天2-3次，偶爾5-6次。體溫正常。

由上結果表明，纖溶酶原可改善SMA患者肺部功能，包括血氧飽和度改善；自主呼吸功能改善，氣道通暢，可脫氧或偶爾吸氧；痰量減少。

實施例12 I型SMA患者

患者，男，18月齡，6個月時確診為I型SMA。醫生確診時告知此類病患者平均生存週期為2周歲，家屬未採取任何治療措施。肺功能症狀；全天24小時進行血氧監測，血氧飽和度為92-97%；呼吸時胸部起伏小，睡眠時呼吸起伏弱；有痰鳴音，無法自主排痰。哭聲弱、精神差。

治療方法：霧化吸入(2-3次/天)+靜脈注射(1次/3天)，治療週期為5個療程(2周為1療程)，每個療程之間間隔2周。霧化吸入劑量為5-10mg/次；靜脈注射劑量為50mg。

治療效果

第一療程：治療第二天，血氧飽和度即達到97-98%，偶爾為95-96%。血氧飽和度達到正常，呼吸功能改善，可在協助下排痰，痰量減少。

第二療程：血氧飽和度保持正常，呼吸較有力。

第三療程：霧化用藥後有痰排出，早上有痰鳴音，哭完痰鳴音大，痰能夠協助排出。

第四至五療程：效果保持，精神狀態好。且無肺部感染、呼吸衰竭等病情加重情況。

由上可見，纖溶酶原可改善I型SMA患者肺部功能，包括改善呼吸功能、提高血氧飽和度，治療後血氧飽和度達到正常值；可以在協助下排痰；改善患者各項症狀，且無肺感染、無呼吸衰竭等病情加重症狀。

實施例13 2019冠狀病毒病(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)患者

患者，男，48歲，確診為危重型新型冠狀病毒肺炎(2019-nCoV)。於重症監護室，已用呼吸機和監測儀，吸氧濃度100%，血氧飽和度為80-90%。生命體徵：心率92次/min，呼吸41次/min，血壓128/84mmHg。

用藥方案：霧化吸入，10mg/次，用藥兩次，間隔5.5h。

用藥效果

第一次用藥：用藥前的血氧飽和度為84%，心率92次/min，呼吸41次/min，血壓128/84mmHg；用藥後1h血氧飽和度為90%，心率83次/min，呼吸37次/min，血壓128/84mmHg。

第二次用藥：用藥前的血氧飽和度為88%，心率81次/min，呼吸39次/min，血壓120/83mmHg；用藥後1h血氧飽和度為91%，心率70次/min，呼吸28次/min，血壓120/83mmHg。

用藥前後無任何不良反應，患者自述感覺好些了。

由上可見，纖溶酶原可有效地提高危重新型冠狀病毒肺炎患者的血氧飽和度，減緩呼吸頻率，改善肺部功能。

實施例14 COVID-19患者

患者，男，47歲，確診為危重型新型冠狀病毒肺炎(2019-nCoV)。於重症監護室，已用呼吸機和監測儀，吸氧濃度100%，血氧飽和度為80-90%。生命體徵：體溫37.5℃，心率110次/min，呼吸37次/min，血壓139/94mmHg。

用藥方案：霧化吸入，10mg/次，用藥兩次，間隔4個小時50分鐘。

用藥效果

第一次用藥：用藥前的血氧飽和度為81%；用藥後3h血氧飽和度為88-90%。

第二次用藥：用藥前的血氧飽和度為89-92%，心率91次/min，呼吸31次/min，血壓130/87mmHg；用藥後1h血氧飽和度為91%，心率89次/min，呼吸27次/min，血壓130/87mmHg.

用藥前後無任何不良反應，患者自述感覺好些了。

由上可見，纖溶酶原可有效地改善危重新型冠狀病毒肺炎患者的血氧飽和度，改善呼吸頻率。

實施例15 纖溶酶原降低COVID-19重型患者血壓

患者，男，46歲，血氧飽和度為93%，呼吸頻率26次每分鐘，根據新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)臨床分型標準，診斷為重型COVID-19。治療前患者血壓130/80mmHg(收縮壓/舒張壓)。

人纖溶酶原凍乾粉溶解於無菌水中，濃度為5mg/ml，經霧化器霧化後施予患者。每天用藥兩次，每次10mg。

用藥6次後，患者血壓由先前的130/80mmHg降低為116/69mmHg。提示纖溶酶原可降低重型COVID-19患者血壓。

實施例16纖溶酶原降低COVID-19重型患者呼吸頻率

患者，男，47歲，血氧飽和度為93%，根據新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)臨床分型標準，診斷為重型COVID-19。治療前患者呼吸頻率45次/分鐘。

人纖溶酶原凍乾粉溶解於無菌水中，濃度為5mg/ml，經霧化器霧化後施予患者。每天用藥兩次，每次10mg。

用藥2次後，患者呼吸頻率由先前的45次/分鐘降低為37次/分鐘。提示纖溶酶原可降低重型COVID-19患者呼吸頻率。

實施例17 纖溶酶原降低COVID-19危重型患者血壓

患者，男，48歲，血氧飽和度為79%，呼吸頻率為41次/分鐘，根據新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)臨床分型標準，診斷為危重型COVID-19。治療前患者血壓128/84mmHg(收縮壓/舒張壓)。

人纖溶酶原凍乾粉溶解於無菌水中，濃度為5mg/ml，經霧化器霧化後施予患者。每天用藥兩次，每次10mg。

用藥5次後，患者血壓由先前的128/84mmHg降低為120/83mmHg。提示纖溶酶原可降低危重型COVID-19患者血壓。

實施例18纖溶酶原降低COVID-19危重型患者血壓和呼吸頻率

患者，男，47歲，血氧飽和度為82%，呼吸頻率為37次/分鐘，根據新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)臨床分型標準，診斷為危重型COVID-19。治療前患者血壓139/94mmHg(收縮壓/舒張壓)。

纖溶酶原凍乾粉溶解於無菌水中，濃度為5mg/ml，經霧化器霧化後施予患者。每天用藥兩次，每次10mg。

用藥2次後，患者血壓由先前的139/94mmHg降低為120/83mmHg，呼吸頻率由用藥前的37次/分鐘降為27次/分鐘。提示纖溶酶原可降低COVID-19危重型患者血壓和呼吸頻率。

實施例19纖溶酶原改善COVID-19患者狀況

本試驗募集了30-78歲COVID-19患者13名，根據新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)臨床分型標準，這13名患者包括普通型患者5名、重型患者6名，危重型患者2名。該治療獲得醫院倫理委員會批准。所有患者均簽署知情同意書。

人纖溶酶原凍乾粉溶解於無菌水中，濃度為5mg/ml，經霧化器霧化後施予患者。根據疾病嚴重情況施予不同劑量的纖溶酶原，普通型患者每天用藥一次，一次10mg；重型和危重型患者每天用藥兩次，每次10mg。患者基本情況和用藥次數見表1。在用藥前幾天和用藥後進行高解析度胸部CT(Neusoft,NeuViz 16 Classic,China)檢查。即時血氧飽和度和心率由監護儀(Mindary，iPM5，China)監測，並記錄霧化吸入人纖溶酶原前1小時和霧化吸入後數小時的血氧飽和度和心率。

結果1：纖溶酶原改善普通型COVID-19患者肺損傷

CT結果顯示，5名普通型患者用藥前雙側肺部表現出多個邊界不清且密度不均勻的斑片狀/點狀“毛玻璃”影，縱隔窗病灶區呈稀疏斑點狀影。5名患者用藥人纖溶酶原前接受抗生素和傳統的中藥治療，但肺部“毛玻璃”影的密度和範圍仍隨時間而增加，提示病情加重。用藥人纖溶酶原2-3次後，5例患者肺部病灶數目、範圍和密度均減少，甚至部分消失；斑片狀或點狀“毛玻璃”影明顯減少或吸收(見圖8和表2)。這表明霧化吸入人纖溶酶原能迅速改善COVID-19感染引起的肺損傷。

結果2：纖溶酶原增加重型和危重型COVID-19患者的血氧飽和度

纖溶酶原用藥期間，重型或危重型COVID-19患者透過鼻腔插管分別以80%或100%的恒定濃度輸氧，在輸氧條件下進行血氧飽和度監測。

結果顯示，儘管重型患者血氧飽和度正常，但給藥人纖溶酶原後，6名患者中5例血氧飽和度仍增加了1-4%。2名危重型患者，霧化吸入人纖溶酶原後僅1小時，患者的血氧飽和度就從用藥前的79-82%增加到了91%左右，並保持穩定。1名重型患者用藥纖溶酶原後，血氧飽和度由用藥前的91%降到了89%(表3)。這些資料表明，纖溶酶原通常可以改善重型和危重型COVID-19患者的血氧飽和度水平，在血氧飽和度特別低的患者中作用尤為顯著。

結果3：纖溶酶原可使COVID-19患者心率恢復，減輕心臟負擔

心率監測結果顯示，霧化吸入人纖溶酶原後，13例COVID-19患者中有8例心率每分鐘大約減慢了26次，2例心率增加，3例無明顯變化(表4)。統計分析顯示，用藥纖溶酶原後，普通型、重型和危重型患者心率均值均有降低趨勢，並且普通型患者用藥前後比較可見統計學差異(p<0.05)(圖9)。這 些結果表明，霧化吸入人纖溶酶原通常能減緩COVID-19患者的高心率，減輕心臟負擔。

此外，所有的患者都自述霧化吸入人纖溶酶原後胸悶感覺減輕，呼吸較之前更順暢。

綜上所述，霧化吸入人纖溶酶原能夠減輕COVID-19患者肺部損傷，增加患者的血氧飽和度，降低患者的心率和改善患者呼吸功能。

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<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含有訊號胜肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 不含有訊號胜肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 2433

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 含有訊號胜肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的核酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 810

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 含有訊號胜肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的胺基酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 2145

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)核酸序列

<400> 5

<210> 6

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)胺基酸序列

<400> 6

<210> 7

<211> 1245

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> delta-plg(delta-纖溶酶原)核酸序列

<400> 7

<210> 8

<211> 414

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> delta-plg(delta-纖溶酶原)胺基酸序列

<400> 8

<210> 9

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 9

<210> 10

<211> 367

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)胺基酸序列

<400> 10

<210> 11

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Micro-plg(微纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 11

<210> 12

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Micro-plg(微纖維蛋白溶酶原)胺基酸序列

<400> 12

<210> 13

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 絲胺酸蛋白酶(結構)域的核酸序列

<400> 13

<210> 14

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 絲胺酸蛋白酶(結構)域的胺基酸序列

<400> 14

Claims (10)

1. 一種化合物製備預防和治療肺炎的藥物的用途，其中所述化合物是纖維蛋白溶酶原，且所述肺炎為2019-nCoV感染性肺炎。
2. 如請求項1的用途，其中所述纖維蛋白溶酶原實現選自於以下所組成之群組中的一項或多項：減輕肺組織損傷、減輕肺臟炎症反應、減輕肺臟纖維蛋白沉積、改善肺臟功能、提高血氧飽和度、降低2019-nCoV感染性肺炎受試者血壓、改善2019-nCoV感染性肺炎受試者心臟功能、改善2019-nCoV感染性肺炎受試者一般身體狀況。
3. 如請求項1的用途，其中所述化合物具有選自於以下所組成之群組中的一項和多項作用：減輕肺組織炎症、減少肺組織炎性滲出、減少肺組織纖維蛋白沉積、減輕肺組織纖維化、減輕肺組織細胞凋亡、改善通氣功能、提高血氧飽和度。
4. 如請求項1至3中任一項的用途，其中所述纖維蛋白溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。
5. 如請求項1至3中任一項的用途，所述纖維蛋白溶酶原包含與序列14所示的纖維蛋白溶酶原活性片段具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的胺基酸序列、並且具有纖維蛋白溶酶原的蛋白水解活性或賴胺酸結合活性。
6. 如請求項1至3中任一項的用途，所述纖維蛋白溶酶原為序列2所述纖維蛋白溶酶原的保守取代變體。
7. 如請求項1至3中任一項的用途，所述纖維蛋白溶酶原為天然或合成的人纖維蛋白溶酶原。
8. 如請求項1至3中任一項的用途，其中所述化合物與一種或多種其它治療方法或藥物聯合使用。
9. 如請求項8所述的用途，其中所述其它藥物是選自於以下所組成之群組中的的一種或多種：抗病毒藥物、抗菌素、免疫調節劑、激素類藥物、疫苗和疾病相關的中和抗體。
10. 如請求項9的用途，其中所述化合物透過選自於以下所組成之群組中的一種或多種途徑或方式給藥：鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液、滴耳液、滴眼液、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、肌肉內和直腸內。

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