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CN117187117A - 一种缓解便秘并调节肠道菌群紊乱的益生菌组合物及应用 - Google Patents

一种缓解便秘并调节肠道菌群紊乱的益生菌组合物及应用 Download PDF

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CN117187117A
CN117187117A CN202311028895.5A CN202311028895A CN117187117A CN 117187117 A CN117187117 A CN 117187117A CN 202311028895 A CN202311028895 A CN 202311028895A CN 117187117 A CN117187117 A CN 117187117A
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CN
China
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probiotic composition
constipation
bifidobacterium
serum
mice
Prior art date
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Pending
Application number
CN202311028895.5A
Other languages
English (en)
Inventor
赵阿丹
郭新梅
朱迪凡
张晨玥
彭灿
吴忠坤
刘学聪
王云
何协勋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinqiao Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Jinqiao Biotechnology Co ltd
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Publication date
Application filed by Jinqiao Biotechnology Co ltd filed Critical Jinqiao Biotechnology Co ltd
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Publication of CN117187117A publication Critical patent/CN117187117A/zh
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Abstract

本发明公开了一种缓解便秘并调节肠道菌群紊乱的益生菌组合物及应用，属于微生物领域。本发明提供的婴儿双歧杆菌BLI‑02、动物双歧杆菌BB‑115和鼠李糖乳杆菌MP108益生菌组合物具有调节肠道菌群、明显改善便秘表观病理指标、改善肠道蠕动的作用；与鼠李糖乳杆菌LGG相比，本发明提供的益生菌组合物能更好地提高菌群紊乱小鼠有益菌(双歧杆菌和乳杆菌)的数量，提高便秘小鼠的粪便含水量，并且显著缩短便秘小鼠排首粒黑便的时间，提高血清中MTL含量，并且降低血清中VIP的含量，且对小肠蠕动的推进作用更为显著，因此在未来针对便秘患者可以采用更加个性化的治疗方案，具有非常可观的应用前景。

Description

一种缓解便秘并调节肠道菌群紊乱的益生菌组合物及应用
技术领域
本发明涉及一种缓解便秘并调节肠道菌群紊乱的益生菌组合物及应用，属于微生物领域。
背景技术
便秘是一种发病率较高、覆盖人群较广的胃肠道功能紊乱性疾病，中华医学会消化病学分会胃肠动力学组在2019年发布文件《中国慢性便秘专家共识意见(2019)》，其中数据显示在我国大约有五千万的成年人存在便秘的困扰，相当于患病率为4.0％～10.0％。并且便秘的患病率也随着年龄的增长逐年呈现上升的趋势，其中＞70岁人群患病率达23.0％，＞80岁可达38.0％，还有高达80％的患者需要接受长期照护。便秘除具有排便困难，排便频率低，粪便干硬等临床症状外，还会导致肠道菌群失调。便秘可以改变肠道微生物群的组成，增加肠道对病原体和内毒素的通透性，促进氧化和炎症反应。一些研究发现大鼠和慢性便秘儿童的氧化损伤增加和抗氧化反应降低。此外，血清炎症细胞因子水平与慢性便秘呈正相关。除此之外，有研究发现与健康对照组相比，便秘儿童中白细胞介素-6和IL-12水平更高，IL-1β和肿瘤坏死因子水平未改变。
目前，药物依旧是治疗便秘的主要途径，但这些药物或多或少都具有一些毒副作用。近年来，肠道菌群已成为科研领域的研究热点，膳食、肠道菌群与疾病之间的相关性研究则是重中之重，因此通过膳食补充益生菌缓解便秘也顺理成章的成为可能。益生菌作为一种活的微生物具有诸多益生特性，当摄入足够数量的益生菌时，就能够对宿主产生众多正向的益处。目前市面所见的益生菌制剂多为复合益生菌制剂。有研究显示，如果长时间服用多菌株(嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸乳球菌、乳双歧杆菌和两歧双歧杆菌)益生菌产品可以更有效地缓解肠道便秘症状。有研究人员利用复合益生菌粉(乳双歧杆菌V9、干酪乳杆菌Zhang、植物乳杆菌P9)缓解便秘，发现该复合益生菌粉能够通过促进肠蠕动，调整肠道菌群结构发挥缓解小鼠便秘的作用。并且，有研究将包含5种益生菌在内的复合益生菌配方(乳双歧杆菌CP-9、婴儿双歧杆菌BLI-02、短双歧杆菌BV-889、鼠李糖乳杆菌MP-108、嗜热链球菌SY-66)以1.5×109CFU的活菌数灌胃小鼠15天，结果发现该益生菌复合配方具有改善小鼠便秘，减轻肠黏膜损伤，缓解腹泻症状的作用。
现有技术中缓解便秘的益生菌制剂多由4-5种益生菌组成，为达到缓解便秘的效果，益生菌组合物中活菌数需达到109CFU甚至更高，且至少需要14天才能起到缓解便秘的效果，益生菌种类多、活菌数数量多且起效时间长。亟需一种益生菌成分简单、所需活菌数少且起效时间短的缓解便秘的益生菌组合物，以得到成本低且效果好的益生菌配方。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种益生菌组合物，所述益生菌组合物包括婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)BLI-02、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)BB-115和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)MP108的细胞和/或其胞外代谢物。
在一种实施方式中，所述益生菌组合物中婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108的菌体个数比例为1：1：1。
在一种实施方式中，所述细胞的菌体个数不低于4.1×108CFU/g或4.1×108CFU/mL。
在一种实施方式中，所述细胞是活细胞或死细胞。
在一种实施方式中，所述益生菌组合物是菌粉或菌悬液。
在一种实施方式中，所述益生菌组合物还包含保护剂，所述保护剂包括脱脂乳粉、麦芽糊精、海藻糖和乳糖中的一种或几种。
本发明还提供了所述的益生菌组合物在制备缓解便秘的药品中的应用。
在一种实施方式中，所述药品还含有药物载体和/或药用辅料，所述药物载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述药品的剂型是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明还提供了所述的益生菌组合物在制备润肠通便的食品或保健品中的应用。
在一种实施方式中，所述食品包括饮料、软糖、压片糖果、零食等，所述乳制品包括发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料、奶油、乳酪、含乳饮料或乳粉；所述豆制品包括豆奶或豆乳粉；所述果蔬制品包括以白菜、白萝卜、黄瓜、甜菜、黄桃或杨梅制品中至少一种为原料制得的果蔬制品。
在一种实施方式中，所述食品为发酵食品，包括固态食品、液态食品或半固态食品。
在一种实施方式中，所述食品为含有上述婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108的组合物，或上述微生物制剂的饮料或零食。
在一种实施方式中，所述润肠通便包括但不限于如下至少一种作用：
(a)增加肠道菌群的多样性，显著提高粪便中有益菌双歧杆菌和乳杆菌数量；
(b)提高粪便含水量、提高小肠推进率/全肠道的蠕动；
(c)上调血清中胃动素含量、下调血清中血管活性肠肽含量；
(d)降低血清中白介素-1、白介素-6、白介素-8的水平；
(e)显著提高粪便中短链脂肪酸的含量；
(f)调节肠道菌群，缓解便秘。
有益效果
本发明的多菌株配方益生菌(婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108)，能够显著提高小鼠粪便中双歧杆菌和乳杆菌数量，无论是与对照组相比，还是较没有干预前均提高了1-2个数量级；能显著提高便秘小鼠粪便含水量、小肠推进率以及降低排首粒黑便时间，与模型组相比较，本发明干预后粪便含水量提高了8.15％，小肠推进率提高了13.15％，排首粒黑便时间缩短了58.6min(50.0％)；有效调节血清中兴奋型与抑制型胃肠活性肽的含量，显著提高便秘小鼠血清中MTL的含量，提高了81.85pg/mL(即提高了43.3％)，并显著降低便秘小鼠血清中VIP含量，降低了53.34pg/mL(即降低了23.2％)，利于肠道推进，达到恢复健康水平的最终目的；能够显著下调便秘小鼠血清中促炎细胞因子IL-1(下调了57.76pg/mL，即下调了23.6％)、IL-6(下调了28.01pg/mL，即下调了33.5％)、IL-8(下调了27.93pg/mL，即下调了22.7％)水平，改善便秘小鼠炎症反应进而缓解便秘；能够提高粪便中乙酸(提高了39.86μmol/g，即提高了2.6倍)、异戊酸(提高了0.7338μmol/g，即提高了6.4倍)的含量，效果显著，促进小鼠健康。因此，本发明可以视为一种缓解或治疗便秘的药物，还可以应用于药品或者是一些发酵食品以及功能性食品中，甚至是饮料、软糖、压片糖果、零食等，从而广泛发挥其作用，具有非常有价值的应用前景。
附图说明
图1：婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108配方益生菌对用洛哌丁胺诱导产生便秘的小鼠缓解便秘动物实验流程示意图。
图2：婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108配方益生菌干预前后，对小鼠肠道菌群的影响示意图。
图3：婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108配方益生菌对用洛哌丁胺诱导产生便秘的小鼠缓解便秘表观指标变化的示意图。
图4：婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108配方益生菌干预后，洛哌丁胺诱导便秘的小鼠血清中神经递质含量变化示意图。
图5：婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108配方益生菌干预后，洛哌丁胺诱导便秘的小鼠血清中炎症因子含量变化示意图。
图6：婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108配方益生菌干预后，洛哌丁胺诱导便秘的小鼠粪便中短链脂肪酸的变化示意图。
其中，所有组与便秘模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
下述实施例中所涉及的雄性C57BL/6J小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。
下述实施例所涉及的保藏编号菌株的保藏信息如下：
一种多菌株配方益生菌，包含婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)BLI-02、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)BB-115和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)MP108，所述婴儿双歧杆菌BLI-02保藏编号为CGMCC No:15212；所述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)BB-115保藏编号为CGMCC No:21840；所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)MP108已公开于专利CN102604854B和CN103436461B中，保藏编号为DSM24229。
下述实施例所涉及的鼠李糖乳杆菌LGG菌株公开于文章《Lactobacillusrhamnosus GG supernatant promotes intestinal mucin production throughregulating 5-HT4R and gut microbiota.Food&Function,2022,13(23):12144-12155》。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：牛肉膏10g；胰蛋白胨10g；酵母粉5g；葡萄糖20g；无水乙酸钠5g；MgSO4·7H2O 0.1g；MnSO4·H2O 0.05g；柠檬酸氢二铵2g；K2HPO4·3H2O 2.6g；吐温80 1mL；L-半胱氨酸盐酸盐0.8g；调节pH为6.8±0.2；定容至1L。高压灭菌115℃20min。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上添加2％琼脂粉。
下述实施例中所涉及的婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108备用菌液的制备
将婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108分别接种至MRS固体培养基中，在37℃条件下培养72h得到单菌落，将制备得到的单菌落接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下培养24h进行活化；
将活化3代后的菌液以2％(v/v)的接种量接种至1L MRS液体培养基中，振荡混匀后于厌氧培养箱中37℃培养24h。在8000g/min，4℃的条件下离心15min，去上清后，用含0.05％-0.1％ L-半胱氨酸盐酸盐的无菌生理盐水清洗2次，同样以相同条件进行离心，去上清后，用30％的甘油进行重悬，获得灌胃前备用菌液，-80℃冰箱冻存一周。
在进行动物实验前，将冰箱中冻存的菌液取出，以6000r/min离心5min，再用无菌生理盐水清洗两遍，用10％脱脂乳重悬菌液，震荡均匀后用平板倾注法测定初始和冻存一周后的活菌数量。
实验结果：初始活菌数为4.1×108CFU/mL，1周后活菌数数量级并没有产生变化，说明将菌液冻存后不会对实验产生影响，可用于动物实验。
下述实施例中所涉及的婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108菌粉的制备
取上述获得的婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108备用菌液，先于-40℃至-60℃之间，冻干10-24h，真空度为0.05-0.01mbar，然后置于25-35℃条件下干燥30h，获得冷冻干燥菌粉，冷冻干燥菌粉进行粉碎、过筛后再与麦芽糊精进行混合，即获得婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108备用菌粉。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
小鼠调节肠道菌群的检测方法如下：
参考《保健食品功能检验与评价方法(2022年版)》中“有助于调节肠道菌群检验方法”进行实验设计和相关指标测定。分别无菌采取干预第0天和第28天小鼠肛门内粪便2-3粒，放置于无菌离心管中备用。按照如下的检测方法检测肠道菌群：首先称量粪便湿重后进行10倍系列稀释，选择菌落数在30-300的稀释度，接种在对应的培养基上进行培养，根据菌落形态、革兰氏染色镜检、生化反应等鉴定计数菌落，计算每克湿便中双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌的菌数，结果取对数(lg CFU/g)后进行统计。
小鼠血清中神经递质的检测如下：
用ELISA试剂盒测定小鼠血清中便秘相关胃肠调节递质含量：胃动素(MTL)、胃泌素(Gas)、P物质(SP)、血管活性肠肽(VIP)、血管活性肠肽(SS)、酪酪肽(PYY)、乙酰胆碱(Ach)、血清素(5-HT)，上述操作方法按照说明书要求进行操作。
小鼠血清中炎症因子水平的检测如下：
用ELISA试剂盒测定小鼠血清中便秘相关炎症因子含量：白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)，上述操作方法按照说明书要求进行操作。
下述实施例中所涉及的粪便中短链脂肪酸的浓度的检测方法如下：
将实验结束前所收集的盲肠内容进行冷冻干燥，计算出盲肠内容物的干重，并冻存于-80℃。具体方法如下：
称取20mg粪便，用500μL饱和NaCL溶液重悬，加入20μL 10％H2SO4溶液；加入1000μL无水乙醚，震荡均匀，提取脂肪酸，然后12000rpm 4℃离心15min；取上层乙醚相，加入0.25g无水Na2SO4进行干燥；静置30min后12000rpm 4℃离心5min取上层乙醚相，利用GC-MS测定小鼠冻干粪便中的短链脂肪酸含量。使用Rtx-Wax柱(柱长30m，内径25μm)；载气为He，流速为2mL/min；进样体积1μL，按7.5℃/min升温至140℃，然后按60℃/min升温至200℃保持3min,离子化温度为20℃；分析采用全扫描模式，为通过外标法测得标准曲线，从而计算出各种短链脂肪酸的浓度。
实施例1：婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108组合物对肠道菌群的调节
具体步骤如下：
(1)婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108菌粉的制备
将婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108备用菌液于-80℃冰箱取出后，分别划线于MRS固体培养基中，37℃培养48h，分别挑取单菌落于MRS液体培养基中，37℃培养24h，制备得到种子液；
将制备得到的种子液分别以2％(v/v)的接种量分别接种于新的MRS液体培养基中，于37℃培养24h，按照同样的方式再次培养一代，制备得到婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108发酵液；
然后将制备得到的婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108发酵液分别在6000r/min、4℃条件下离心5min，然后用10％(质量体积比w/v)的脱脂乳进行重悬，并添加麦芽糊精制得冻干菌粉，冻干菌粉中婴儿双歧杆菌BLI-02活菌数为1.0×109～1.0×1011CFU/g，动物双歧杆菌BB-115的活菌数为1.0×109～1.0×1011CFU/g，鼠李糖乳杆菌MP108的活菌数为1.0×109～1.0×1011CFU/g。
(2)鼠李糖乳杆菌LGG菌粉的制备
制备方法同上述(1)中的方法。
(3)婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108组合物菌粉对小鼠肠道紊乱的调节
将步骤(1)得到的各冻干菌粉重悬于无菌生理盐水中，制成组合菌悬液，所述菌悬液中婴儿双歧杆菌BLI-02的活菌数为1.4×108～1.5×108CFU/ml，动物双歧杆菌BB-115的活菌数为1.4×108～1.5×108CFU/ml，鼠李糖乳杆菌MP108的活菌数为1.4×108～1.5×108CFU/ml。
将步骤(2)得到的冻干菌粉重悬于无菌生理盐水中，制成LGG菌悬液，所述菌悬液中鼠李糖乳杆菌LGG的活菌数为4.1×108～4.5×108CFU/ml。
(4)取6周龄的健康雄性C57BL/6J小鼠30只，适应环境1周，随机分为3组：对照组(正常肠道菌群组)、鼠李糖乳杆菌LGG干预组(LGG组)、组合益生菌(婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108的比例为1：1：1)、干预组(LBM组)，每组含小鼠10只。第8-28天，对照组每天灌胃0.2ml无菌生理盐水一次，LGG组和LBM组每天灌胃0.2ml菌悬液一次，灌胃的菌株总剂量为4.1×108CFU/mL，每天早上9点开始灌胃。试验期间饲喂小鼠标准饲料，每周对小鼠粪便进行收集并尽快保存于-80℃冰箱备用。实验结束后，给予小鼠腹腔注射100mg/(kg·bw)的氯胺酮，麻醉完成之后采取摘眼球取血，然后脱颈椎处死小鼠。血液在4℃，3 000×g条件下离心10min，分装血清后-80℃冻存备用。具体实验分组及动物实验流程分别见表1和图1。
表1实验动物分组
参考《保健食品功能检验与评价方法(2022年版)》中“有助于调节肠道菌群检验方法”进行实验设计和相关指标测定。无菌的条件下采集第28天的粪便备用。按照如下的检测方法检测肠道菌群：首先称量两种不同状态下的粪便湿重后进行10倍系列稀释，选择菌落数在30-300的稀释度，接种在对应的培养基上进行培养，根据菌落形态、革兰氏染色镜检、生化反应等鉴定计数菌落，计算每克湿便中双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌的菌数，结果取对数(lg CFU/g)后进行统计。
干预21天后，空白对照组小鼠肠道菌群中的双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌数量无统计学差异(图2)。经口给予不同多菌株益生菌21天后，LGG组和LBM组自身与干预前比较，小鼠粪便中双歧杆菌和乳杆菌数量显著增加(P＜0.0001)，提高了1-2个数量级，肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌无显著变化。其中，LBM组较LGG组更显著的增加了小鼠粪便中双歧杆菌数量。菌干预后实验组与对照组组间比较发现与上述结果相同。该结果符合《保健食品功能检验与评价方法(2022年版)》中“有助于调节肠道菌群检验方法”实验结果阳性。因此，婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108配方益生菌在恢复肠道菌群紊乱小鼠粪便中有益菌(双歧杆菌、乳杆菌)数量具有良好效果。
实施例2：婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108组合物对洛哌丁胺诱导产生便秘相关症状的缓解
具体步骤如下：
(1)取6周龄的健康雄性C57BL/6J小鼠40只，适应环境1周，随机分为4组：对照组、模型组(便秘组)、鼠李糖乳杆菌LGG干预组(LGG组)、组合益生菌(婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108)干预组(LBM组)，每组含小鼠10只。第8～14天，建立便秘模型，对照组灌胃无菌生理盐水，其他组灌胃10mg/(kg·bw)盐酸洛哌丁胺，1h后，对照组灌胃无菌生理盐水，模型组灌胃无菌生理盐水，菌干预组灌胃相对应菌液，灌胃剂量均为0.2mL。试验期间饲喂小鼠标准饲料，每周对小鼠粪便进行收集并尽快保存于-80℃冰箱备用。实验结束后，给予小鼠腹腔注射100mg/(kg·bw)的氯胺酮，麻醉完成之后采取摘眼球取血，然后脱颈椎处死小鼠。血液在4℃，3 000×g条件下离心10min，分装血清后-80℃冻存备用。具体实验分组及动物实验流程分别见表2和图1。
实验动物(润肠通便)分组及处理方法见表2：
表2实验动物(润肠通便)分组
(2)每周收集小鼠粪便用于粪便含水量的检测。方法如下：将灌胃结束后的小鼠单独放入垫有滤纸的洁净笼盒中，收集新鲜粪便，称重后冷冻干燥，根据公式(1)计算粪便含水量：
(3)实验第14天，灌胃0.2mL盐酸洛哌丁胺(10mg/(kg·bw))和活性炭的混合溶液，将每只小鼠灌胃墨汁时间到其排出第一粒黑便时的时长记录为排首粒黑便时间。超出模型组最后一只小鼠排首粒黑便时间的处理组则说明无效，将各个处理组与模型组进行比较，用于说明各组在缓解便秘方面的差异。
(4)解剖前12h对小鼠禁食不禁水处理，第15天除正常组外的所有组小鼠灌胃0.2mL盐酸洛哌丁胺和活性炭的混合液，正常组灌胃无菌生理盐水和活性炭混合溶液，30min后对小鼠处死，打开小鼠腹腔后剪取幽门至盲肠的肠管，并将此肠管拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门到墨汁前沿的长度为“活性炭溶液前端推进长度”，根据公式(2)计算小肠推进率：
粪便含水量、排首粒黑便时间、小肠推进率实验结果如图3所示，由图3可知，相对于便秘模型组，灌胃LGG和LBM能显著提高便秘小鼠粪便含水量和小肠推进率，并显著缩短排首粒黑便时间(P<0.05)。其中，与模型组相比较，LBM组干预后粪便含水量提高了8.15％，小肠推进率提高了13.15％，排首粒黑便时间缩短了50.0％(58.6min)，与对照组相当；LBM组较LGG组对粪便含水量(LGG组仅提高6.95％，LBM组粪便含水率是LGG组的1.02倍)和排首粒黑便时间(LGG仅缩短了26.6％(31.9min)，LBM组较LGG组排首粒黑便时间缩短30.55％)的效果更明显，这说明它对小肠的影响更为显著。因此，婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108在恢复便秘小鼠粪便干硬与胃肠道蠕动缓慢的症状具有良好效果。
总体来说，婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108配方益生菌具有良好的缓解便秘效果。
实施例3：婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108组合物可显著上调便秘小鼠血清中胃动素(MTL)水平并且降低血清中血管活性肠肽(VIP)的含量
具体步骤如下：
(1)C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
(2)第15天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，采用胃动素(MTL)、胃泌素(Gas)、P物质(SP)、血管活性肠肽(VIP)、血管活性肠肽(SS)、酪酪肽(PYY)、乙酰胆碱(Ach)、血清素(5-HT)检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线计算出血清中胃动素(MTL)、胃泌素(Gas)、P物质(SP)、血管活性肠肽(VIP)、血管活性肠肽(SS)、酪酪肽(PYY)、乙酰胆碱(Ach)、血清素(5-HT)的浓度。
实验结果如图4所示，由图4可知，模型组与对照组相比，盐酸洛哌丁胺处理后模型小鼠血清中兴奋型神经递质MTL含量显著降低(P＜0.05)，而血清中Gas、SP、Ach水平无显著性变化，小鼠血清中抑制型神经递质VIP、PYY含量显著增加，而SS、5-HT水平并无明显差异。说明由盐酸洛哌丁胺引发的便秘或许与血清中MTL、VIP、PYY的含量异常相关。当给予LBM后，与模型组进行比较，LGG和LBM干预组血清中MTL含量显著增加(P＜0.001)，并且VIP水平显著下调(P＜0.05)，恢复至正常水平。其中，与模型组相比较，LBM组干预后血清中MTL含量提高了81.85pg/mL(43.3％)，LGG组仅提高80.31pg/mL(42.5％)，LBM组干预后血清中VIP含量减少了53.34pg/mL(23.2％)，LGG组仅减少了46.14pg/mL(20.1％)。除此之外，LBM还显著降低了5-HT的含量，下调了46.08ng/mL(42.5％)，而LGG组无显著差异。LBM组血清中MTL出现了显著上调的现象，从文献中可知，MTL是由22个氨基酸组成的多肽，分布在全部小肠，能够促进和影响胃肠运动及胃肠道对水、电解质的运输，从而促进胃的收缩与肠道蠕动，血清中MTL的含量越高，其对胃的收缩与肠道蠕动的促进作用就越强。LBM通过恢复血清中MTL、VIP水平，调节胃肠神经递质的分泌进而缓解便秘。
实施例4：婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108组合物可显著下调便秘小鼠血清中促炎细胞因子白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)水平
具体步骤如下：
(1)C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
(2)第15天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，采用白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线计算出血清中白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)的浓度。
结果如图5所示，模型组与对照组相比，盐酸洛哌丁胺诱导的便秘小鼠血清中促炎细胞因子IL-1、IL-6、IL-8水平相较于正常组显著升高(P＜0.05)，而抑炎细胞因子IL-10、TGF-β含量变化无统计学差异。说明利用盐酸洛哌丁胺构建便秘模型与血清中促炎细胞因子IL-1、IL-6、IL-8水平异常有关。与模型组相比较发现，所有益生菌处理组均能够显著下调便秘小鼠血清中IL-6、IL-8水平(P＜0.05)，其中，LBM和LGG处理组显著降低血清中IL-1的含量(P＜0.01)，其中，与模型组相比较，LBM干预后IL-1下调了57.76pg/mL(23.6％)，IL-6下调了28.01pg/mL(33.5％)，IL-8下调了27.93pg/mL(22.7％)；而LGG组IL-1仅下调了50.73pg/mL(20.7％)，IL-6仅下调了18.72pg/mL(22.4％)，而IL-8无显著差异。在我们的结果中，虽然空白组与模型组比较IL-10和TGF-β含量无显著差异，但LBM组的IL-10含量相较模型组有显著上调(LGG无显著差异)，TGF-β含量相较模型组有下调趋势，但无显著差异。综上所述，LBM干预后降低血清中促炎细胞因子含量，改善便秘小鼠血清中炎症因子水平，进而缓解便秘。
因此，婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108配方益生菌可以通过下调血清中IL-1、IL-6、IL-8的含量，降低便秘小鼠炎症反应，从而有效缓解便秘。
实施例5：婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108组合物提高便秘小鼠粪便中短链脂肪酸含量
具体步骤如下：
(1)C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
(2)将实验结束前所收集的盲肠内容物进行冷冻干燥，利用GC-MS测定小鼠冻干盲肠内容物中的短链脂肪酸含量。从而计算出各种短链脂肪酸的浓度。
实验结果如图6所示，用洛哌丁胺造模后，模型组小鼠粪便中所有短链脂肪酸含量均有的下调，其中，乙酸、丙酸、丁酸与异戊酸的含量与对照组相比显著降低。菌干预后，所有益生菌处理组乙酸含量相较模型组均显著上升(P＜0.05)，并且，LBM处理组显著提高了便秘小鼠粪便中异丁酸和异戊酸的含量(P＜0.05)，其中，与模型组相比较，LBM处理组粪便中乙酸含量提高了39.86μmol/g，而LGG组乙酸含量仅提高了31.77μmol/g，LBM处理组粪便中乙酸含量是LGG组的1.2倍；LBM处理组粪便中异戊酸含量提高了0.7338μmol/g，而LGG组异戊酸含量提高了0.5107μmol/g，LBM处理组粪便中异戊酸含量是LGG组的1.4倍。除此之外，LBM处理组粪便中丁酸含量提高了6.031μmol/g，而LGG组丁酸含量提高了2.167μmol/g，LBM处理组粪便中丁酸含量是LGG组的1.4倍；LBM处理组粪便中异丁酸含量提高了1.114μmol/g，而LGG组异丁酸含量提高了0.6913μmol/g，LBM处理组粪便中异丁酸含量是LGG组的1.4倍。
因此，婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108配方益生菌对于增加粪便中短链脂肪酸(SCFAs)含量有重要作用，主要是通过增加粪便中乙酸、丁酸、异丁酸和异戊酸的含量来缓解便秘。而短链脂肪酸能够降低肠道pH值，促进肠道中钙镁离子的吸收，抑制有害菌的侵染，刺激肠道蠕动，促进小鼠健康。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物包括婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)BLI-02、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)BB-115和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)MP108的细胞和/或其胞外代谢物。
2.如权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于，所述细胞中婴儿双歧杆菌BLI-02、动物双歧杆菌BB-115和鼠李糖乳杆菌MP108的菌体个数比例为1：1：1。
3.如权利要求2所述的益生菌组合物，其特征在于，所述细胞的菌体个数不低于4.1×108CFU/g或4.1×108CFU/mL。
4.如权利要求3所述的益生菌组合物，其特征在于，所述细胞是活细胞或死细胞。
5.如权利要求4所述的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物是菌粉或菌悬液。
6.如权利要求1～5所述的益生菌组合物，其特征在于，还含有保护剂，所述保护剂包括脱脂乳粉、麦芽糊精、海藻糖、乳糖中的一种或几种。
7.权利要求1～6任一所述的益生菌组合物在制备缓解便秘的药品中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药品还含有药物载体和/或药用辅料，所述药物载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂中的一种或多种。
9.权利要求1～6任一所述的益生菌组合物在制备润肠通便的食品或保健品中的应用，所述食品包括含益生菌配方的饮料、软糖、压片糖果或零食。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述调节肠道菌群和润肠通便包括以下任一：
(a)增加肠道菌群的多样性，提高粪便中有益菌双歧杆菌和乳杆菌数量；
(b)提高粪便含水量、提高小肠推进率/全肠道的蠕动；
(c)上调血清中胃动素含量、下调血清中血管活性肠肽含量；
(d)降低血清中白介素-1、白介素-6、白介素-8的水平；
(e)提高粪便中短链脂肪酸的含量；
(f)调节肠道菌群，缓解便秘。
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