TWI762145B - 小球藻、其用於廢水處理的方法及含其之生物製劑 - Google Patents

Abstract

本發明是有關於一種小球藻、其用於廢水處理的方法及含其之生物製劑。利用小球藻藻株AK-1對特定濃度的廢水進行處理後，可有效移除廢水中的污染物，並提升小球藻藻株AK-1之蛋白質及/或葉黃素之含量。所得之小球藻藻株AK-1藻體可做為生物製劑之有效成分。

Description

小球藻、其用於廢水處理的方法及含其之生物製劑

本發明是有關於一種小球藻及其應用，特別是有關於一種小球藻藻株AK-1、其用於廢水處理的方法及含其之生物製劑。

人類的活動伴隨著污染的產生，不僅破壞環境，還會影響到人類的健康。舉例而言，工業及畜牧業的廢水中有機化合物、總氮及總磷含量高，因而容易引發水體優養化(eutrophication)，使水體中的藻類等微生物因為過多的營養而大量繁殖。數量急升的微生物影響水體透光度，導致水中植物及/或動物紛紛死亡。死亡的動物及/或植物的屍體及上述有機化合物分解的過程會消耗大量氧氣，導致水體的含氧量下降，並產生溫室氣體及惡臭。

小型(1μm至10μm)的單細胞藻類，又稱為微藻，具有生物量大、生長周期短及/或對污染物耐受性高等特性。其次，微藻的生長及/或繁殖需要大量的碳、氮及/或磷，因此可利用微藻移除廢水中的污染物並產生附加產 品，如生質油及/或營養補充品。然而，微藻對於污染物的耐受性及生物產物轉化率有極限，對於某些廢水(如磷含量可高達50mg/L至230mg/L，且氮含量可高達800mg/L至2300mg/L的養豬廢水)的污染物移除效果不佳，也難以在如此極端的環境中生長及/或繁殖。

因此，亟須提供一種藻類及其用於處理廢水的方法，以解決上述問題。

因此，本發明之一態樣係提供一種廢水處理的方法，包含利用一種小球藻(Chlorella sorokiniana)藻株AK-1移除廢水中的污染物，而可應用於廢水處理中。

本發明之又一態樣係在提供一種生物製劑，可包含以上述小球藻藻株AK-1做為有效成分。

根據本發明之上述之態樣，提出一種廢水處理的方法，可包含進行第一處理步驟及至少一次之第二處理步驟。第一處理步驟可包含將小球藻藻株AK-1做為接種源接種至稀釋廢水中，並於27℃進行第一反應步驟達6天至8天，以獲得第一處理水。上述小球藻藻株AK-1可例如於2021年01月05日寄存在臺灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源中心(BCRC)，寄存編號為BCRC 980057。上述稀釋廢水是將100重量百分比(wt%)之廢水原液以純水稀釋為30wt%至50wt%。上述接種量為每公升稀釋廢水接種0.2g至0.5g的小球藻 藻株AK-1。

上述第二處理步驟可包含流出排放體積量之第一處理水後，再注入加入體積量之稀釋廢水，並於27℃進行第二反應步驟達6天至8天，以獲得第二處理水，其中基於第一處理水之總體積為100體積百分比(vol%)，排放體積量可為50vol%至90vol%，且加入體積量與排放體積量為相同。相對於廢水原液，所獲得的第二處理水的COD之總移除率為至少95%，總氮之總移除率為至少97%，且總磷之總移除率為至少90%。

根據本發明之一實施例，廢水原液之COD含量可例如大於4000mg/L、總氮含量可例如大於450mg/L及/或總磷含量可例如大於70mg/L。

根據本發明之一實施例，第一處理步驟及/或第二處理步驟可選擇性包含將多孔性載體加入稀釋廢水中，其中多孔性載體可包含海綿及/或活性碳，且多孔性載體承載小球藻藻株AK-1之接種源。

根據本發明之一實施例，基於稀釋廢水為100wt%，海綿的乾含量可例如為0.2wt%。

根據本發明之一實施例，基於稀釋廢水為100wt%，活性碳的含量可例如為2.0wt%。

根據本發明之一實施例，廢水處理包含至少四次之第二處理步驟。

根據本發明之一實施例，進行第一處理步驟及/或第二處理步驟後，可選擇性包含對第一處理水及/或第二處 理水進行固液分離步驟，以獲得小球藻藻株AK-1之藻體。

根據本發明之上述之態樣，提出一種生物製劑，其中生物製劑可包含上述小球藻藻株AK-1做為有效成分，其中小球藻藻株AK-1之寄存編號可例如為BCRC 980057。

根據本發明之一實施例，上述生物製劑可選擇性包含海綿，其中海綿對小球藻藻株AK-1之接種源之乾種比為1：2。

根據本發明之一實施例，上述生物製劑可選擇性包含普通小球藻、柵藻、芽孢桿菌、假單胞菌屬、腸桿菌、亞硝化菌及硝化菌之至少一者。

應用本發明之小球藻藻株AK-1處理廢水，可有效移除廢水中的污染物，並提升小球藻藻株AK-1生物量、蛋白質及/或葉黃素含量，所得的藻體亦可做為生物製劑之有效成分。

111,113,121,123,131,133,211,213,221,223,231,233,311,313,321,323,331,333,411,413,421,423,431,433,511,513,521,523,531,533:直條

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：[圖1A]至[圖1C]係繪示根據本發明一實施例之不同藻株的生物量濃度(圖1A)、蛋白質含量(圖1B)及葉黃素含量(圖1C)及其產率的直條圖。

[圖2A]至[圖2C]係繪示根據本發明一實施例之不同第二 稀釋液濃度的生物量濃度(圖2A)、蛋白質含量(圖2B)及葉黃素含量(圖2C)及其產率的直條圖。

[圖3A]至[圖3C]係繪示根據本發明一實施例之不同BG-11培養液濃度的生物量濃度(圖3A)、蛋白質含量(圖3B)及葉黃素含量(圖3C)及其產率的直條圖。

[圖4A]至[圖4C]係繪示根據本發明一實施例之不同載體的生物量濃度(圖4A)、蛋白質含量(圖4B)及葉黃素含量(圖4C)及其產率的直條圖。

[圖5A]至[圖5C]係繪示根據本發明一實施例之第一處理水及第二處理水的生物量濃度(圖5A)、蛋白質含量(圖5B)及葉黃素含量(圖5C)及其產率的直條圖。

承上所述，本發明提供一種小球藻(Chlorella sorokiniana)藻株AK-1。利用小球藻藻株AK-1處理廢水，可有效提高對廢水中的污染物的總移除率，並提升小球藻藻株AK-1生物量、蛋白質及/或葉黃素含量。

上述小球藻又稱為綠藻，是綠藻門小球藻屬中常見的單細胞藻類。不同小球藻藻株對環境的適應力不同，其中部分小球藻藻株對上述廢水的適應力較佳，不僅可較有效移除廢水中的COD、總氮及總磷等污染物，還可在廢水處理中快速生長，並合成較多的蛋白質及/或葉黃素含量。上述小球藻藻株AK-1可例如於2021年01月05日寄存在臺灣新竹財團法人食品工業發展研究所生物資源中心 (BCRC)，寄存編號為BCRC 980057。

上述廢水例如為工業廢水及/或畜牧廢水，且畜牧廢水可來自畜牧場，如：養豬場、養牛場、養羊場、養馬場及/或禽類飼育場等。上述污染物可包含但不限於化學需氧量(chemical oxygen demand，COD)、總氮及總磷。前述總氮是氮化物、硝酸鹽、亞硝酸鹽等含氮化合物的總稱。前述總磷是磷化物、磷酸鹽及亞磷酸鹽等含磷化合物的總稱。前述廢水一般可利用COD大於4000mg/L、總氮含量大於450mg/L及/或總磷含量大於70mg/L等條件予以界定。上述總移除率是指處理前的廢水及經廢水處理後的排放水的污染物之差值除以處理前的廢水的污染物之百分比。

上述處理廢水的方法可包含但不限於進行第一處理步驟及至少一次第二處理步驟，其中第一處理步驟包含將小球藻藻株AK-1做為接種源接種至稀釋廢水中，並於20℃至30℃進行第一反應步驟達6天至8天，較佳於27℃進行第一反應步驟達6天至8天，以獲得第一處理水。上述稀釋廢水可例如將100重量百分比(wt%)之廢水原液以純水稀釋為30wt%至50wt%，使稀釋廢水中的COD含量小於3000mg/L。上述接種量可例如為每公升稀釋廢水接種0.2g至0.5g的小球藻藻株AK-1。值得注意的是，如果稀釋廢液的濃度大於50wt%，則稀釋廢水中的濁度太高及/或競爭資源(如：空間、養分及/或氧氣)的微生物太多，從而影響小球藻藻株AK-1的光合作用， 導致小球藻藻株AK-1的生長受到抑制。如果稀釋廢水的濃度小於30wt%，小球藻藻株AK-1對污染物的移除率不佳。上述純水之具體例包含蒸餾水及/或二次水。如果小球藻藻株AK-1的接種量過少，則第一反應步驟的藻體量不足。若小球藻藻株AK-1的接種量過多，對污染物的移除效果並未有顯著的提升。

第一反應步驟可在習知條件下進行。具體而言，攪動的轉速可為150每分鐘轉速(revolution per minute，rpm)至300rpm，通氣條件可為以0.1vvm之通氣量通以2體積百分比(vol%)的CO₂，且光照條件可為100μ^-2 s^-1至200μ^-2 s^-1。

上述第二處理步驟可包含基於第一處理水之總體積為100vol%，流出排放體積量之第一處理水後，再注入加入體積量之稀釋廢水，並於20℃至30℃進行第二反應步驟達6天至8天，較佳於27℃進行第一反應步驟達6天至8天，以獲得第二處理水，其中排放體積量可例如為50vol%至90vol%，且加入體積量與排放體積量為相同。第一反應步驟及第二反應步驟可在相同的習知條件下進行。需特別說明的是，如果排放體積量小於50vol%，則移除生物需氧量的效率較低。如果排放體積量大於90vol%，則容易流失較多的小球藻藻株AK-1之藻體，導致第二處理步驟中做為接種源的小球藻藻株AK-1之藻體量不足。

本發明之廢水處理的方法可選擇性對廢水原液、第 一處理水及/或第二處理水進行固液分離步驟，其中固液分離步驟可利用習知的固液分離方法進行，例如：過濾、自然沉澱及/或離心。對廢水原液進行固液分離可移除固形分(如：糞便、泥沙及/或其他微生物)，以避免固形分降低廢水的透光率。對第一處理水及/或第二處理水進行固液分離步驟，可獲得小球藻藻株AK-1之藻體。相較於小球藻藻株AK-1之接種源，小球藻藻株AK-1之藻體的生物量、每單位重量的蛋白質及/或葉黃素上升。上述小球藻藻株AK-1之藻體可做為第二反應步驟的接種源。在一實施例中，第一處理水經固液分離步驟獲得的藻體可做為第二處理步驟之接種源。

在一實施例中，第一處理步驟及/或該第二處理步驟可選擇性包含將多孔性載體加入稀釋廢水中，其中多孔性載體可包含海綿及/或活性碳，且多孔性載體承載小球藻藻株AK-1之接種源。在一實施例中，基於稀釋廢水為100wt%，海綿之乾含量(乾重與稀釋廢水重量的比值)可為0.1wt%至0.3wt%的海綿，較佳為0.2wt%。海綿的材質及形狀不限，在一具體例中，海綿的材質可例如是天然材料或如聚氨酯(Polyurethane)之合成材料，且海綿的形狀可例如是邊長為1cm至3cm的立體結構。在一實施例中，每100g之稀釋廢水可例如含有1.0g至2.0g之活性碳。活性碳的形狀不限，在一具體例中，活性碳的形狀可例如為直徑及長度分別為3mm至4mm及0.5cm至1.5cm的圓柱體。

經實驗證實，利用上述廢水處理的方法可有效移除廢水原液中的污染物。相較於廢水原液，第二處理水之各種污染物的總移除率(即廢水原液的污染物含量與第二處理水的污染物含量之差值除以廢水原液的污染物含量的百分比)列舉如下：第二處理水的COD之總移除率為至少95%，總氮之總移除率為至少97%，且總磷之總移除率為至少90%。

此外，第一反應步驟中，小球藻藻株AK-1之生物量每日可增加0.52g/L，且蛋白質及葉黃素的產率可達每日0.28g/L及3.10mg/L。上述蛋白質是熱量三大營養素之一，不僅可提供熱量，還可建造新組織、修補既有的組織、維持身體中的酸鹼平衡及/或水平衡、協助營養素運輸，及構成酵素、激素及/或抗體等。上述葉黃素是類胡蘿蔔素的一種，可幫助動物的成長、生殖及/或色素的形成，並增加動物皮膚、肉品及/或蛋的色澤。

由上可知，利用小球藻藻株AK-1處理廢水，可移除廢水中的污染物，並提高小球藻藻株AK-1的生物量、蛋白質及葉黃素，而藻體經適當的習知製程處理(例如清洗、固液分離等)後，可做為生物製劑，其中生物製劑可例如以小球藻藻株AK-1為有效成分，以移除廢水中的COD、總氮及/或總磷。在一實施例中，生物製劑可選擇性包含海綿，其中海綿及小球藻藻株AK-1之接種源的乾重比並無特別限制，可參酌習知的使用量，但在一些具體例中，海綿對小球藻藻株AK-1的乾重比可例如為1：2。在一實施例中， 生物製劑可選擇性包含但不限於其他微生物，如：普通小球藻(Chlorella vulgaris)、柵藻(Scenedesmus spp.)、芽孢桿菌(Bacillus spp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、腸桿菌(Enterobacter spp.)、亞硝化菌(Nitrosomonas spp.)及硝化菌(Nitrobacter spp.)至少一者。

以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。

實施例一、藻株AK-1的微生物學性質

小球藻(Chlorella sorokiniana)藻株AK-1(以下簡稱為藻株AK-1)是分離自取樣於臺灣南部池塘地區的樣本中。在光學顯微鏡下，藻株AK-1細胞呈現圓形或卵形，直徑為3μm至10μm，但生殖時直徑可達23μm，屬於單胞藻綠藻。此外，藻株AK-1的細胞內有一個草綠色的大型色素體，呈杯狀、片狀或周生。藻株AK-1的光合作用色素包含葉綠素a、葉綠素b、葉黃素及胡蘿蔔素。

對藻株AK-1進行DNA純化，再利用如序列辨識編號(SEQ ID NOs.)：1及2所示之23S rDNA的PCR上游引子及下游引子進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)，以獲得藻株AK-1的23S rDNA(如SEQ ID NO.3所示)。上述DNA純化及PCR 為本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知，於此不再贅述。將藻株AK-1的23S rDNA序列利用基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)進行比對，確認藻株AK-1為小球藻。上述藻株AK-1已於2021年01月05日寄存於臺灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源中心(BCRC)，寄存編號為BCRC 980057。

補充說明的是，同一批池塘水樣本中另分離出小球藻藻株MS-C1及小球藻藻株TJ5(以下分別簡稱為藻株MS-C1及藻株TJ5)，已確認藻株MS-C1及藻株TJ5和藻株AK-1是同種(小球藻)的不同藻株。

實施例二、藻株AK-1的污水處理方法及篩選

在光生物反應器(photobioreactor，PBR)中，利用藻株AK-1、藻株MS-C1及藻株TJ5做為接種源對稀釋廢水進行第一反應步驟達15天，以獲得第一處理水，其中稀釋廢水是對上述畜牧廢水之原液進行過濾處理及稀釋處理後獲得，其中畜牧廢水的成分是如表1所示[平均±平均值標準誤差(Standard error of the mean，SEM)]，且畜牧廢水的pH值是介於7至8。

上述光生物反應器可提供恆定的溫度(27℃)、光線[強度為150μmol m^-2s^-1(TL5日光燈管14W；供應商：荷蘭飛利浦公司)]、氣流[含有2vol%之CO₂，其中通氣量為0.1光生物反應器體積(volume)/通入氣體體積(volume)/分鐘(minute)(vvm)]及攪動(300rpm)。

對稀釋廢水及第一處理水分別進行檢測步驟。首先，自稀釋廢水及第一處理水隨機取樣，以獲得水樣，並以6000rpm離心水樣達5分鐘，從而獲得上清液及沉澱物，其中沉澱物包含藻株之藻體。利用利用德國夸克(Aqualytic)公司的AL450光度計檢測檢測上清液中的COD、總氮(total nitrogen，TN)及總磷(total phosphorus，TP)含量，並計算不同藻株對污染物的移 除率，其中移除率是第一處理水及稀釋廢水之水樣的COD、總氮或總磷含量之差分別對稀釋廢水的COD、總氮或總磷含量的百分比。上述COD、總氮及總磷的檢測方法是依據AL450光度計檢測之使用說明進行，在此不再贅述。

以120℃之溫度烘乾沉澱物，直到沉澱物之重量不再變化，以測量沉澱物之乾量，並計算沉澱物之重量對水樣的體積之比值，從而獲得藻株之生物量濃度(單位：g/L)。接著，計算第一處理水的生物量濃度(第一反應步驟結束)與稀釋廢水的生物量濃度(第一反應步驟起始)之差值除以第一反應步驟進行的時間，以獲得生物量產率(單位：mg/L/天)。

凍乾沉澱物，以獲得凍乾物。接著，利用習知的檢測方法定量凍乾物中，胺基酸及葉黃素之重量，以計算蛋白質及葉黃素的含量及產率，其中定量方法係參酌陳俊延博士的團隊於2015年發表於Biotechnology Journal第10卷第6期第905至914頁之論文及於2018年發表於Journal of Bioscience and Bioengineering第1至7頁的方法，在此不另贅述。蛋白質含量及葉黃素含量分別是胺基酸重量之總和除以凍乾粉重量之百分比(單位：%)及葉黃素除以生物量之重量比值(單位：mg/g)。蛋白質及葉黃素之產率分別是蛋白質含量及葉黃素含量對生物量產率的乘積(單位：mg/L/天)。

利用習知藍綠藻培養基BG-11稀釋畜牧廢水之原液，以獲得第一稀釋液，其中基於原液之濃度為100wt%， 第一稀釋液的濃度為10wt%。前述BG-11培養液每公升包含1.5g NaNO₃、0.04g K₂HPO₄、0.075g MgSO₄．7H₂O、0.006g檸檬酸、0.02g Na₂CO₃、0.036g CaCl₂、0.001g EDTA．2Na、2.8×10^-3g H₃BO₃、2.2×10^-4g ZnSO₄．7H₂O、1.8×10^-3g MnCl₂．4H₂O、7.9×10^-5g CuSO₄．5H₂O及平衡量的水。接著，分別將藻株AK-1、藻株MS-C1及藻株TJ5(每公升第一稀釋液接種0.4g藻株)接種至第一稀釋液中，以進行上述第一反應步驟，從而獲得第一處理水。分別對第一稀釋液(初始)及第一處理水(結束)進行檢測步驟，並計算相對於第一稀釋液，第一處理水中污染物的移除率。將結果記錄於表2及圖1A至圖1C中。

如表2所示，相對於第一稀釋液，藻株AK-1對COD、總氮及總磷之移除率高於藻株MS-C1及藻株TJ5對COD、總氮及總磷之移除率。

圖1A至圖1C係繪示根據本發明一實施例之不同藻株的生物量濃度(圖1A)、蛋白質含量(圖1B)及葉黃素 含量(圖1C)及其產率的直條圖。圖1A的橫軸表示藻株，左縱軸及直條111表示生物量濃度，且右縱軸及直條113表示生物量產率。圖1B的橫軸表示藻株，左縱軸及直條121表示蛋白質含量，且右縱軸及直條123表示蛋白質產率。圖1C的橫軸表示藻株，左縱軸及直條131表示葉黃素含量，且右縱軸及直條133表示葉黃素產率。

如圖1A至圖1C所示，利用student’s t-test進行統計，藻株AK-1的生物量濃度(4.70±0.20g/L)及生物量產率(0.29±0.01g/L/天)顯著高於藻株MS-C1(分別為3.90±0.22g/L及0.24±0.02g/L/天)及藻株TJ5(分別為4.18±0.22g/L及0.26±0.02g/L/天)(n=3，P<0.05)。其次，相較於藻株MS-C1及藻株TJ5，藻株AK-1的蛋白質產率及葉黃素產率較高。

由上述結果可知，藻株AK-1對畜牧廢水的污染物具有較佳的代謝效果，且在畜牧廢水中的生物量、蛋白質及葉黃素產率較高，顯示藻株AK-1具有較佳的畜牧廢水之適應力。

實施例三、評估稀釋廢水的濃度對藻株AK-1代謝污染物的影響

利用蒸餾水稀釋畜牧廢水的原液，以獲得第二稀釋液，其中基於畜牧廢水的原液之濃度為100wt%，第二稀釋液的濃度分別為10wt%、30wt%、50wt%、70wt%及90wt%。接著，利用每公升第二稀釋液含0.4g之藻 株AK-1之接種源為接種量進行接種，再進行上述第一反應步驟達15天，以獲得第一處理水。對第二稀釋液(初始)及第一處理水(結束)進行上述檢測步驟，並將結果記錄於表3及圖2A至圖2C中。

如表3所示，第二稀釋液的濃度為30wt%至90wt%時，第一處理水之COD的移除率可例如為80%至85%、總氮的移除率可例如為80%至90%，且總磷的移除率可例如為超過95%。值得注意的是，濃度為90wt%的第二稀釋液之COD含量為3600mg/L至5400mg/L，但在此條件下，藻株AK-1在對COD及總氮的移除率可達80%，且總磷的移除率可達95%以上，顯示藻株AK-1對畜牧廢水的適應力佳，且高COD含量不影響藻株AK-1移除污染物的效率。

圖2A至圖2C係繪示根據本發明一實施例之不同第二稀釋液濃度的生物量濃度(圖2A)、蛋白質含量(圖2B)及葉黃素含量(圖2C)及其產率的直條圖。圖2A的橫軸表 示畜牧廢水之濃度，左縱軸及直條211表示生物量濃度，且右縱軸及直條211表示生物量產率。圖2B的橫軸表示畜牧廢水之濃度，左縱軸及直條221表示蛋白質含量，且右縱軸及直條223表示蛋白質產率。圖2C的橫軸表示畜牧廢水之濃度，左縱軸及直條231表示葉黃素含量，且右縱軸及直條233表示葉黃素產率。

如圖2A至圖2C所示，相較於70wt%至90wt%之第二稀釋液，在10wt%至50wt%之第二稀釋液中，藻株AK-1之藻體的生物量、蛋白質及葉黃素產率較高。較佳地，在50wt%之第二稀釋液中，藻體的生物量之含量及產率分別為5.45±0.55g/L及0.36±0.04g/L/天，蛋白質之含量及產率分別為56.08±1.69%及0.27±0.01g/L/天，且葉黃素之含量及產率分別為6.41±0.48mg/g及2.20±0.39mg/L/天。這可能是因為高COD濃度的第二稀釋液之透光度較低，因而降低藻株AK-1之光合作用效率，進而影響藻體的生長。

上述結果顯示，藻株AK-1對30wt%至90wt%之第二稀釋液的污染物之移除率高，但藻株AK-1之藻體在10wt%至50wt%之第二稀釋液中的生物量之產率較高，顯示以30wt%至50wt%的第二稀釋液進行第一反應步驟較佳，其中50wt%的第二稀釋液進行第一反應步驟更佳。

實施例四、評估BG-11培養液的濃度

分別利用畜牧廢水原液、BG-11培養液及蒸餾水配製第三稀釋液，其中第三稀釋液的畜牧廢水濃度為50wt%，且BG-11培養液的濃度分別為0wt%、25wt%、50wt%及100wt%。接著，利用藻株AK-1對上述第三稀釋液進行第一反應步驟，以獲得第一處理水。對第三稀釋液(初始)及第一處理水(結束)進行檢測步驟，並將結果記錄於表4及圖3A至圖3C中。

如表4所示，當第三稀釋液不含BG-11培養液之第三稀釋液(即濃度為50wt%的第二稀釋液)時，COD及總磷的移除率較高。

圖3A至圖3C係繪示根據本發明一實施例之不同BG-11培養液濃度的生物量濃度(圖3A)、蛋白質含量(圖3B)及葉黃素含量(圖3C)及其產率的直條圖。圖3A的橫軸表示BG-11培養液之濃度，左縱軸及直條311表示生物量濃度，且右縱軸及直條313表示生物量產率。圖3B的橫軸表示BG-11培養液之濃度，左縱軸及直條321表示蛋白質含量，且右縱軸及直條323表示蛋白質產率。圖 3C的橫軸表示BG-11培養液之濃度，左縱軸及直條331表示葉黃素含量，且右縱軸及直條333表示葉黃素產率。

如圖3A至圖3C所示，第三稀釋水中的BG-11培養液濃度為25wt%時，藻株AK-1具有較佳的生物量濃度及產率。然而，相較於第三稀釋水之BG-11培養液濃度為50wt%及100wt%，藻株AK-1在不含BG-11培養液之第三稀釋水中(相當於50wt%的第二稀釋水)，生物量濃度及產率(分別為6.52±0.28g/L及0.41±0.02g/L/天)較高。BG-11培養液濃度對藻株AK-1的蛋白質及葉黃素濃度及產率影響不大，但不含BG-11培養液之稀釋廢水中的藻株AK-1具有較佳的葉黃素產率。

綜言之，考慮到對污染物的移除率及藻體之生物量、蛋白質及/或葉黃素的產率，以藻株AK-1對不含BG-11培養液且畜牧廢水原液濃度為50wt%之第三稀釋液(即50wt%的第二稀釋液)進行第一反應步驟較佳。

實施例五、評估藻體用的載體

在50wt%的第二稀釋液中加入載體，並進行第一反應步驟，以獲得第一處理水，其中第一反應步驟的攪動速率為150rpm。上述載體包含多孔性材料的活性碳及海綿[材質：聚氨酯(聚氨酯)]，以及非多孔性材料的海藻酸鈉晶球及黏土塊。上述活性碳是直徑及長度分別為4mm及1cm的立方體，海綿是邊長為2cm的立方體，且海藻酸鈉晶球及黏土塊是直徑為1cm的球體。基於稀釋廢 水為100wt%，活性碳、黏土塊及海藻酸鈉晶球的乾含量為2.0g/100mL，且海綿的乾含量為0.2wt%。接著，對50wt%的第二稀釋液(初始)及第一處理水(結束)進行檢測步驟，並將結果記錄於表5及圖4A至圖4C中。

如表5所示，相較於控制組(不添加載體)，以活性碳及/或海綿做為載體，藻株AK-1對COD及總氮的移除率上升，且相對於第二稀釋液，第一處理水之總磷的移除率大於99%。由此可知，以海綿或活性碳做為載體，皆可提升藻株AK-1對污染物的移除率，但海綿做為藻株的載體對移除污染物的效果較佳。

圖4A至圖4C係繪示根據本發明一實施例之不同載體的生物量濃度(圖4A)、蛋白質含量(圖4B)及葉黃素含量(圖4C)及其產率的直條圖。圖4A的橫軸表示載體，左縱軸及直條411表示生物量濃度，且右縱軸及直條413表示生物量產率。圖4B的橫軸表示載體，左縱軸及直條421表示蛋白質含量，且右縱軸及直條423表示蛋白質產 率。圖4C的橫軸表示載體，左縱及軸直條431表示葉黃素含量，且直條433及右縱軸表示葉黃素產率。

如圖4A至圖4C所示，相較於控制組，以活性碳及海綿為載體，生物量、蛋白質及葉黃素的產率上升，其中以海綿為載體，藻株AK-1的生物量濃度可達8.08±0.39g/L、生物量產率可達0.52±0.03g/L/天、蛋白質產率可達0.28±0.02g/L/天，且葉黃素產率可達3.10±0.75mg/L/天。然而，以海藻酸鈉晶球及黏土塊為載體，生物產物的產率反而下降。由此可知，以海綿或活性碳等多孔性材料為載體，可增加藻株AK-1對污染物的移除率及生物產物的產率。

實施例六、評估第二反應步驟條件

利用半批次方法進行第二反應步驟，可連續處理畜牧廢水。詳細而言，先利用藻株AK-1對50wt%之第二稀釋水進行第一反應步驟6至8天，以獲得第一處理水，再基於第一處理水的重量為100vol%，流出排放體積量之第一處理水。接著，注入加入體積量之第二稀釋水，並於27℃進行第二反應步驟達6至8天，以獲得第二處理水，其中加入第二稀釋水之體積量與排放第一處理水之體積量相同。

在加入稀釋廢水後及第二反應步驟後分別取樣，再測量第二反應步驟前後之水樣的COD、生物需氧量(Biochemical oxygen demand，BOD)、總磷及總氮 含量，並計算第二反應步驟對污染物的移除率，以評估排放體積量的範圍，其中BOD的測量方式不限，可以習知方法進行。具體而言，例如根據臺灣行政院環境保護署環境檢驗所公告之編號NIEA W510.55B的方法進行。測量結果顯示，當排放體積量為50vol%時，相較於稀釋廢水，第二處理水之COD的移除率為83.9±3.2%，BOD的移除率為96.1±1.1%，總氮的移除率為68.3±7.7%，且總磷的移除率為89.0±7.6%。當排放體積量為70vol%時，相較於稀釋廢水，第二處理水之COD的移除率為86.1±3.1%，BOD的移除率為94.4%±2.3，總氮的移除率為79.8±8.7%，且總磷的移除率為93.6±4.3%。當排放體積量為90vol%時，相較於稀釋廢水，第二處理水之COD的移除率為88.2±1.2%，BOD的移除率為94.5±2.1%，對總氮的移除率為84.3±4.2%，且對總磷的移除率為89.5±5.5%。根據BOD的結果，以下選擇第一處理水之排放體積量為50vol%進行第二反應步驟。

值得注意的是，第一反應步驟及第二反應步驟包含使用海綿做為載體，且流出第一處理水或第二處理水前需進行過濾，以免海綿及藻株AK-1流失。分別對50wt%之第二稀釋水(初始)第二處理水(結束)進行檢測步驟，並將結果記錄於表6。

如表6所示，天數為8天時，COD及總磷的移除率最高，而天數為6天時，總氮的移除率最高。由此可知，天數為6天至8天時，藻株AK-1對污染物的移除率較佳。

進行6天的第一反應步驟後，再進行6天的第二反應步驟達4次。對50wt%之第二稀釋液(第一反應步驟的初始)、第一處理水(第一反應步驟的結束)、流出第一處理水或第二處理水再加入50wt%之第二稀釋液的混合物(第二反應步驟的初始)及第二處理水(第二反應步驟的結束)進行檢測步驟，並將結果記錄於表7、圖5A至圖5C。

如表7所示，經過每次第二反應步驟後，第二處理水的COD及總氮的移除率為至少90%，且總磷的移除率皆超過90%，顯示海綿可有效承載藻株AK-1，且進行第二反應步驟4次後，不影響藻株AK-1對污染物的移除，意味著以海綿做為載體，可連續處理畜牧廢水。

補充說明的是，比較第二處理水及畜牧廢水原液(COD初始含量為4920mg/L、總氮初始含量為460mg/L且總磷初始含量為96mg/L)的污染物含量，可換算出第二處理步驟相對於畜牧廢水原液的COD、總氮及總磷的總移除率。結果顯示，相較於廢水原液，第二處理水的COD的總移除率為至少95%、總氮的總移除率為至少97%，且總磷的總移除率為至少90%。

圖5A至圖5C係繪示根據本發明一實施例之第一處理水及第二處理水的生物量濃度(圖5A)、蛋白質含量(圖5B)及葉黃素含量(圖5C)及其產率的直條圖，其中圖5A的橫軸表示第一處理水及第二處理水，左縱軸及直條511表示生物量濃度，且右縱軸及直條513表示生物量產率。圖5B的橫軸表示第一處理水及第二處理水，左縱軸及直條521表示蛋白質含量，且右縱軸及直條523表示蛋白質產率。圖5C的橫軸表示第一處理水及第二處理水，左縱軸及直條531表示葉黃素含量，且右縱軸及直條533表示葉黃素產率。

如圖5A所示，第一處理水中，藻株AK-1的生 物量濃度為2.48±0.13g/L，且第1個至第4個第二處理水的生物量濃度分別為3.24±0.24g/L、3.36±0.20g/L、3.32±0.20g/L及2.96±0.28g/L。上述過程的平均生物量濃度及平均生物量產率分別為3.22±0.15g/L及0.55±0.22g/L/天，顯示海綿可維持藻株AK-1生物量的濃度。然而，如圖5B及圖5C所示，隨著第二反應步驟的次數增加，蛋白質及葉黃素的產率下降，但仍在可接受的範圍內，顯示以海綿可有效吸附並固定藻株AK-1，且藻株AK-1可連續處理畜牧廢水。

補充說明的是，在進行4次第二反應步驟後，利用掃描式電子顯微鏡(scanning electron microscope)可觀察藻株AK-1的藻體附著於海綿的表面，證實海綿之吸收容量(absorption capacity)較大，可提供藻株AK-1較多的附著及生長空間，從而可使第一反應步驟及/或第二反應步驟在起始階段的藻株AK-1之藻體較多，以省下藻株AK-1生長初期所需的時間，進而提升總體廢水處理之效率。

綜上所述，由於海綿能承載較大吸收容量的藻株AK-1，在處理廢水的過程中，無須額外添加營養物，即可產生較多的生物量。

在畜牧場進行現地實驗，包含使用海綿承載藻株AK-1之接種源，稀釋廢水的濃度為50wt%，進行第一反應步驟及4次的第二反應步驟，可將COD含量由803.43±83.01mg/L降為178.21±20.69mg/L，將 總氮含量由315.21±45.77mg/L降為26.43±6.80mg/L，並將總磷含量由150.00±16.92mg/L降為0.02±0.01mg/L。由此顯示，藻株AK-1確實可有效移除畜牧廢水中的污染物。

上述小球藻藻株AK-1可做為生物製劑之有效成分。在此具體例中，前述生物製劑可選擇性包含但不限於例如普通小球藻、柵藻、芽孢桿菌、假單胞菌屬、腸桿菌、亞硝化菌及硝化菌之至少一者。在其他例子中，前述生物製劑與海綿的乾重比並無特別限制，可參酌習知的使用量，但在一些具體例中，海綿對小球藻藻株AK-1的乾重比可例如為1：2。在另一些例子，利用前述生物製劑對濃度為50wt%的稀釋廢水進行上述第一處理步驟，可將稀釋廢水中的COD含量由2108±197mg/L降至711±20mg/L(移除率為91.6±0.2%)、將總氮含量由219±23mg/L降至13±3mg/L(移除率為94.1±1.1%)，並將總磷含量由39.8±4.3mg/L降至小於0.2mg/L(移除率為大於99.5%)。

根據上述實施例，利用本發明之小球藻藻株AK-1處理畜牧廢水，不僅可有效移除畜牧廢水中的COD、總氮及總磷，且可增加小球藻藻株AK-1之生物量、蛋白質及葉黃素的含量，故可做為生物製劑、飼料添加物及/或微生物肥料等組成物之有效成分。

綜言之，本發明雖以特定的藻株、特定的條件或特定的評估方式作為例示，說明本發明之小球藻藻株AK-1 對污染物的總移除率及生物產物的產率，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明亦可使用其他的藻株、其他的條件或其他的評估方式進行。

雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

【生物材料寄存】 國內寄存資訊

小球藻藻株AK-1是寄存在臺灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源中心(BCRC)，其中寄存日期為2021年01月05日，且寄存編號為BCRC 980057。

511,513:直條

Claims (7)

1. 一種廢水處理的方法，包含：進行一第一處理步驟，其中該第一處理步驟包含將小球藻藻株AK-1做為一接種源接種至一稀釋廢水中，並於27℃進行一第一反應步驟達6天至8天，以獲得一第一處理水，該小球藻藻株AK-1是於2021年01月05日寄存在臺灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源中心(BCRC)，寄存編號為BCRC 980057，該稀釋廢水是將100重量百分比(wt%)之一廢水原液以純水稀釋為30wt%至50wt%，該廢水原液的COD含量是大於4000mg/L，總氮含量是大於450mg/L，且該接種量為每公升該稀釋廢水接種0.2g至0.5g的該小球藻藻株AK-1；以及進行至少一次之一第二處理步驟，其中該第二處理步驟包含流出一排放體積量之該第一處理水後，再注入一加入體積量之該稀釋廢水，並於27℃進行一第二反應步驟達6天至8天，以獲得一第二處理水，其中基於該第一處理水之一總體積為100體積百分比(vol%)，該排放體積量為50vol%至90vol%，該加入體積量與該排放體積量為相同，且相較於該廢水原液，該第二處理水的COD之總移除率為至少95%，總氮之總移除率為至少97%，且總磷之總移除率為至少90%，且其中該第一處理步驟及/或該第二處理步驟包含將一多孔性載體加入該稀釋廢水中，且該多孔性載體承載該小球 藻藻株AK-1之該接種源。
2. 如請求項1所述之廢水處理的方法，其中該廢水原液之總磷含量是大於70mg/L。
3. 如請求項1所述之廢水處理的方法，其中該多孔性載體包含一海綿或一活性碳。
4. 如請求項3所述之廢水處理的方法，其中基於該稀釋廢水為100wt%，該海綿的一乾含量為0.2wt%。
5. 如請求項3所述之廢水處理的方法，其中基於該稀釋廢水為100wt%，該活性碳的一含量為2.0wt%。
6. 如請求項3所述之廢水處理的方法，其中該廢水處理包含進行至少四次之該第二處理步驟。
7. 如請求項1所述之廢水處理的方法，其中進行該第一處理步驟及/或該第二處理步驟後，更包含對該第一處理水及/或該第二處理水進行一固液分離步驟，以獲得該小球藻藻株AK-1之一藻體。

Images