CN114703095A - 一株成都假单胞菌及其在污废水净化领域的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株成都假单胞菌及其在污废水的净化领域的应用，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.24300，保藏日期为：2022年1月14日，本发明提供的成都假单胞菌的有益效果是：氨氮降解能力强且起效快，能够耐受高浓度的氨氮，且耐盐，该菌株在水体中盐度不超过8％时均可正常繁殖生长，在5％以下盐度条件下生长状况最佳。

Description

一株成都假单胞菌及其在污废水净化领域的应用

技术领域

本发明涉及一株成都假单胞菌、包含该成都假单胞菌的微生物菌剂及其在污废水的净化领域的应用，属于环境微生物技术领域。

背景技术

近几年，随着我国的工业迅速发展以及生活节奏的加快，城市生活污水与来自农业与工业的废水等使得水环境污染问题日趋严重。这些污水具有COD值高，氨氮含量高与臭味大等特点，对地表水与地下水等造成严重的污染。其中，水体中的氨氮是主要的污染因子之一，氨氮的大量累积会导致缓流封闭或半封闭水体富营养化的加剧，造成环境恶化，并导致水生生物中毒甚至死亡，严重影响生态平衡。

目前的污水处理方法中，氨氮的去除方法主要包括物理法、化学法与生物法。与物理法和化学法相比，生物法具有安全、经济且无二次污染等优点，已经成为了应用最为广泛的处理方法。

在氨氮的生物处理方法中，采用硝化细菌去除氨氮污染是最便捷高效的脱氮途径。硝化细菌分为自养硝化细菌与异养硝化细菌，其中自养硝化细菌由于其自身繁殖速度慢、生物密度较低且生长条件较为苛刻，难以形成优势菌种，且难以扩大生产与推广使用。自从异养硝化菌株被分离出来后，越来越多的异养硝化细菌被广泛关注。

综合现今的研发成果，多数的异养硝化细菌在处理高氨氮废水过程中存在着时间过长、且中试放大实验效果不理想等问题。因此，筛选能高效降低水体中氨氮的微生物菌种对于环境保护的意义重大。

发明内容

本发明针对现有的异养硝化细菌在处理高氨氮废水过程中所存在的不足，提供一株成都假单胞菌、包含其的微生物菌剂及其在污废水的净化领域的应用。

一株成都假单胞菌(Pseudomonas chengduensis)Y25，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.24300，保藏日期为：2022年01月14日，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示，在没有特别说明的情况下，本发明中所述的成都假单胞菌均是指成都假单胞菌Y25菌株。

本发明提供的成都假单胞菌的有益效果是：

1)氨氮降解能力强且起效快，在30℃条件下，针对100mg/L的初始氨氮浓度，72h的氨氮降解率达到94-95％；

2)能够耐受高浓度的氨氮，在30℃条件下，针对100-400mg/L的初始氨氮浓度，72h的氨氮降解率达到92％以上；当氨氮浓度达到600mg/L时，72h的氨氮降解率仅有20％左右，因此该菌株的最高氨氮耐受浓度为600mg/L；

3)耐盐，该菌株在水体中盐度不超过8％时均可正常繁殖生长，在5％以下盐度条件下生长状况最佳；

4)该菌株培养方法简单，环境适应性强，繁殖迅速且安全性高。

本发明还要求保护包含成都假单胞菌的微生物菌剂。

本发明还要求保护成都假单胞菌的发酵方法，包括如下步骤：

(1)一级种子培养：无菌条件下，取成都假单胞菌接种于液体LB培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-24h，得到一级种子培养液；

(2)二级种子培养：无菌条件下，将一级种子培养液按照1-10vol％的接种量接种于液体LB培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-24h，得到二级种子培养液；

(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，将二级种子培养液按照1-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃、转速150-300rpm，通气比为1:(1-2)的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得发酵液；所述发酵培养基组成为：碳源40-60g/L、氮源15-30g/L、PO₄ ^3-0.8-1.5g/L、K⁺0.5-1.0g/L、Mg²⁺0.05-0.2g/L、Na⁺0.1-0.3g/L、Mn²⁺0.03-0.1g/L，溶剂为水，pH＝6～8。

本发明中所述的通气比是指每分钟内通入发酵罐的空气体积与发酵液总体积之比。

其中所述液体LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH＝7-7.5。

优选的，所述PO₄ ^3-和K⁺的来源为磷酸氢二钾或磷酸二氢钾，所述Mg²⁺的来源为硫酸镁、硝酸镁或氯化镁中的一种或多种的复配，所述Na⁺的来源为氯化钠、硝酸钠或硫酸钠中的一种或多种的复配，所述Mn²⁺的来源为一水硫酸锰、四水硫酸锰、硝酸锰或氯化锰中的一种或多种。

进一步，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、醋酸钠或丁二酸钠中的一种或多种。

进一步，所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵或硝酸钾中的一种或多种。

在实际应用过程中，可根据实际的使用和存储需要来确定最终的成都假单胞菌产品的形态，当需要使用液态产品时，将发酵液稀释至所需要的浓度即可直接使用，当需要使用固态产品时，可将发酵液离心后获得菌泥，然后采用喷雾干燥或冷冻干燥工艺制得固态菌粉。

本发明还要求保护使用成都假单胞菌的活化液或包含成都假单胞菌的微生物菌剂净化污废水的方法，包括向污废水中接种成都假单胞菌的活化液或包含成都假单胞菌的微生物菌剂的步骤。

进一步，所述污废水中的氨氮浓度为600mg/L以下，更优选400mg/L以下，最优选100-200mg/L。

进一步，所述污废水的盐度为8％以下，更优选6％以下，进一步优选5％以下，最优选3％以下。

进一步，所述成都假单胞菌的活化液或包含成都假单胞菌的微生物菌剂的接种量为100ppm以上，优选100-2000ppm，最优选100-1000ppm。

本发明还要求保护成都假单胞菌和包含成都假单胞菌的微生物菌剂在污废水净化领域的应用。

优选的，所述成都假单胞菌和包含成都假单胞菌的微生物菌剂用于降解污废水中的含氮物质，更优选的，用于降解污废水中的含氨态氮的物质。

进一步，所述污废水中的氨氮浓度为600mg/L以下，更优选400mg/L以下，最优选100-200mg/L。

进一步，所述污废水的盐度为8％以下，更优选6％以下，进一步优选5％以下，最优选3％以下。

附图说明

图1为成都假单胞菌的菌落照片；

图2为成都假单胞菌菌落经1000倍显微镜放大后的照片。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1.成都假单胞菌的分离纯化与鉴定

一、菌种的分离纯化

1.菌株的富集

在江苏某水产养殖场的虾池与鱼池中各取水样100ml，将各养殖池的水样混合后，取10ml接种于装有100ml富集培养基(硫酸铵0.5g，琥珀酸钠5.62g，维氏盐溶液50ml，用无菌水定容至1L，pH＝7)的三角瓶中，30℃、200r/min条件下振荡培养5天，每隔一天测量其氨氮值，并调节pH；若氨氮值有下降，则转接下一级富集，即取培养5天后的培养液10ml再次接种于100ml富集培养基中，重复培养5次。

2.菌株的筛选与分离

取最后一级培养液0.5ml，使用无菌水进行梯度稀释，稀释至10^-4，10^-5，10^-6，10^-7和10^-8倍，分别取稀释后的培养液涂布于LB固体培养基平板上，后置于30℃培养箱中，待菌落长至合适大小后，观察菌落的形态特征，并挑取单菌落进行划线纯化，纯化三代后，进行4℃斜面保存，共分离出8株菌株，分别命名为Y21-Y28。

3.复筛

将初筛得到的8株菌株分别接种于基础培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH＝7)中，30℃振荡培养24h，分别取培养液10ml在4000rpm条件下离心10min，弃上清液，再分别接种于100ml的评价培养基(硫酸铵0.5g，琥珀酸钠5.62g，维氏盐溶液50ml，用无菌水定容至1L，pH＝7，氨氮含量为100mg/L)中，30℃振荡培养，各实验组设置三组平行，并使用无菌水作为空白对照，定期检测各实验组的评价培养基中氨氮浓度的变化，结果如表1所示。

表1初筛所得各菌株对氨氮的降解效果

表1中的结果表明，与其他菌株相比，Y25菌株对于氨氮降解的起效快，同时去除效果明显优于其他菌株，因而作为优选菌株进行进一步的鉴定。

二、菌种的鉴定

1.形态观察

将菌株Y25接种在LB固体培养基平板上，观察菌落的形态特征。Y25菌株的菌落照片见图1，1000倍显微镜放大照片见图2，其菌落呈点状，半透明，乳白色，边缘光滑，凸起。

2.分子生物学鉴定

提取菌株Y25的基因组DNA，并以此为模板扩增16S rDNA，

引物：27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，

1492r:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’；

后提取PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序。用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI 16S数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，经鉴定Y25菌株属于假单胞菌属，为成都假单胞菌(Pseudomonas chengduensis)。

实施例2.成都假单胞菌的盐度耐受性检测

在无菌条件下，将成都假单胞菌接种于含有100ml液体LB培养基的250ml锥形瓶中，在30℃，200rpm的摇床中振荡培养24h进行菌株活化，得成都假单胞菌的活化液。

以液体LB培养基作为基础培养基(盐度为1％)，分别在含100ml液体LB培养基的三角瓶中额外加入NaCl 1g，2g，3g，4g，5g，6g，7g，8g和9g，进而设置为具有2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％与10％的盐度梯度的培养基，后分别取成都假单胞菌的活化液各5ml，分别接入各个培养基中，后置于30℃摇床中振荡培养，定期测定其OD₆₀₀值和活菌数，结果如表2所示。

OD₆₀₀值表示溶液在600nm波长处的吸光值，用该值来测量细菌培养液的浓度，通常用来指菌体细胞密度，细菌的生长情况可通过OD₆₀₀的值来监测以确定菌株的生长程度。

表2成都假单胞菌在不同盐度培养基中培养的OD₆₀₀值和活菌数

根据表2中的检测结果，成都假单胞菌在盐度为1-8％时均可生长，且在盐度低于5％时菌株的生长状况明显优于盐度高于5％时，因而5％以下的盐度为其适合生长盐度，最适生长盐度为3％以下。

实施例3.成都假单胞菌的氨氮降解效率测定

在无菌条件下，将成都假单胞菌接种于含有100ml液体LB培养基的250ml锥形瓶中，在30℃，200rpm的摇床中振荡培养24h进行菌株活化，得成都假单胞菌的活化液，经测试，该活化液的活菌数为65亿cfu/ml。

分别取成都假单胞菌的活化液10μl、100μl与1000μl，将其接种至100ml已灭菌的评价培养基(硫酸铵0.5g，琥珀酸钠5.62g，维氏盐溶液50ml，用无菌水定容至1L，pH＝7，氨氮含量为100mg/L)中，分别对应成都假单胞菌活化液的接种量为100ppm、1000ppm和10000ppm，后将各个评价培养基均置于30℃，200rpm摇床中振荡培养，每组设3个平行，使用无菌水作为空白对照，每隔24h检测评价培养基中的氨氮含量，结果如表3所示。

氨氮检测方法按照《HJ535-2009氨氮的测定-纳氏试剂分光光度法》执行。

表3成都假单胞菌的氨氮降解效果

由表3中的结果可知，成都假单胞菌的氨氮降解速度快且降解能力强，在成都假单胞菌活化液的接种量为100ppm以上时，72h的氨氮降解效率均可达94％以上，并且当接种量达到100ppm后，接种量的继续增加对氨氮降解效果的影响已很微弱，因而基于经济性的考虑，成都假单胞菌活化液的优选接种量为100-1000ppm。

实施例4.成都假单胞菌对不同氨氮浓度的耐受实验

在无菌条件下，将成都假单胞菌接种于含有100ml液体LB培养基的250ml锥形瓶中，在30℃，200rpm的摇床中振荡培养24h进行菌株的活化，得到成都假单胞菌的活化液，经测试，该活化液的活菌数为65亿cfu/ml。

分别配制氨氮浓度为100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L与1000mg/L的评价培养基(硫酸铵含量分别为0.5g、1g、2g、3g、4g和5g，琥珀酸钠5.62g，维氏盐溶液50ml，用无菌水定容至1L，pH＝7)。将成都假单胞菌的活化液100μl分别接种至100ml已灭菌的评价培养基中，之后将各评价培养基置于30℃，200rpm摇床中振荡培养，每组设3个平行，将无菌水加入评价培养基中作为各实验组的空白对照，每隔24h检测评价培养基中的氨氮含量，实验安排如下：

实验组1：氨氮浓度100mg/L；对照组1：氨氮浓度100mg/L；

实验组2：氨氮浓度200mg/L；对照组2：氨氮浓度200mg/L；

实验组3：氨氮浓度400mg/L；对照组3：氨氮浓度400mg/L；

实验组4：氨氮浓度600mg/L；对照组4：氨氮浓度600mg/L；

实验组5：氨氮浓度800mg/L；对照组5：氨氮浓度800mg/L；

实验组6：氨氮浓度1000mg/L；对照组6：氨氮浓度1000mg/L；

氨氮检测方法按照《HJ535-2009氨氮的测定-纳氏试剂分光光度法》执行，结果如表4所示。

表4成都假单胞菌对不同氨氮浓度的降解结果

根据表4中的数据可知，在氨氮浓度为100mg/L、200mg/L与400mg/L时，成都假单胞菌均表现出较好的氨氮降解效果，72h的氨氮降解率达到92％以上，当氨氮浓度为600mg/L时，72h的氨氮降解率仅有20％左右，因此认为成都假单胞菌的氨氮耐受浓度为600mg/L，当氨氮浓度超过600mg/L时，该菌株很难发挥出氨氮降解效果。

实施例5.成都假单胞菌的发酵过程

成都假单胞菌的发酵方法包括如下步骤：

(1)一级种子培养：无菌条件下，取成都假单胞菌接种于液体LB培养基中，于30℃、200rpm的条件下震荡培养24h，得到一级种子培养液；

(2)二级种子培养：无菌条件下，将一级种子培养液按照10vol％的接种量接种于液体LB培养基中，于30℃、200rpm的条件下培养18h，得到二级种子培养液；

(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，将二级种子培养液按照1-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，发酵培养基组成为：葡萄糖50g/L、酵母浸粉10g/L、蛋白胨10g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸锰0.2g/L，控制温度为25-35℃、转速150-300rpm，通气比为1:(1-2)的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得成都假单胞菌的发酵液，经测试，该发酵液的活菌数为300亿cfu/ml。

实施例6.成都假单胞菌在垃圾渗透液处理工程中的应用

山东省泗水某创业控股有限公司的垃圾渗沥液处理工程，处理前初氨氮含量为300～400mg/L，其污水处理工艺为原水经过调节池与UASB后进入缺氧池，再进入硝化池，最后经过膜处理后排放。菌剂投加前，已间断曝气一周，但氨氮含量并未下降。随后采用本发明实施例5所制得的成都假单胞菌发酵液，以投加体积比为0.01％投撒至硝化池中，硝化过程中白天水温约在25-30℃，监测硝化过程中氨氮的指标变化，结果如表5所示。

表5垃圾渗滤液中的氨氮含量随时间的变化

时间/h	氨氮含量/(mg/L)
		0	392
24	189
		48	97
72	59
		96	33
120	25
		144	27

由表5中的数据可以看出，在投加成都假单胞菌发酵液后，五天时间内，生化系统的出水氨氮降至30mg/L以下，氨氮降解率达到94％，这表明本发明提供的成都假单胞菌具有高效的氨氮脱除能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 青岛蔚蓝赛德生物科技有限公司

<120> 一株成都假单胞菌及其在污废水净化领域的应用

<130> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1459

<212> DNA

<213> 成都假单胞菌(Pseudomonas chengduensis)

<400> 1

ccgtggtacc gtccccccga aggttagact agctacttct ggagcaaccc actcccatgg 60

tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgtgacattc tgattcacga 120

ttactagcga ttccgacttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgga ctacgatcgg 180

ttttatggga ttagctccac ctcgcggctt ggcaaccctt tgtaccgacc attgtagcac 240

gtgtgtagcc ctggccgtaa gggccatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccggt 300

ttgtcaccgg cagtctcctt agagtgccca ccataacgtg ctggtaacta aggacaaggg 360

ttgcgctcgt tacgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca 420

gcacctgtgt ctgagttccc gaaggcacca atccatctct ggaaagttct cagcatgtca 480

aggccaggta aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg 540

ggcccccgtc aattcatttg agttttaacc ttgcggccgt actccccagg cggtcaactt 600

aatgcgttag ctgcgccact aagttctcaa ggaacccaac ggctagttga catcgtttac 660

ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgca cctcagtgtc 720

agtatcagtc caggtggtcg ccttcgccac tggtgttcct tcctatatct acgcatttca 780

ccgctacaca ggaaattcca ccaccctcta ccgtactcta gctcgccagt tttggatgca 840

gttcccaggt tgagcccggg gctttcacat ccaacttaac gaaccaccta cgcgcgcttt 900

acgcccagta attccgatta acgcttgcac ccttcgtatt accgcggctg ctggcacgaa 960

gttagccggt gcttattctg tcggtaacgt caaaacacta acgtattagg ttaatgccct 1020

tcctcccaac ttaaagtgct ttacaatccg aagaccttct tcacacacgc ggcatggctg 1080

gatcaggctt tcgcccattg tccaatattc cccactgctg cctcccgtag gagtctggac 1140

cgtgtctcag ttccagtgtg actgatcatc ctctcagacc agttacggat cgtcgccttg 1200

gtgagccatt acctcaccaa ctagctaatc cgacctaggc tcatctgata gcgcaaggcc 1260

cgaaggtccc ctgctttctc ccgtaggacg tatgcggtat tagcgttcct ttcggaacgt 1320

tatcccccac taccaggcag attcctaggc attactcacc cgtccgccgc taaatcaggg 1380

agcaagctcc tctcatccgc tcgacttgca tgtgttaggc ctgccgccag cgttcaatct 1440

gagccaggat cccaactct 1459

Claims (10)

1.一株成都假单胞菌(Pseudomonas chengduensis)，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24300。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，有效成分包含权利要求1所述的成都假单胞菌。

3.权利要求1所述成都假单胞菌的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)一级种子培养：无菌条件下，取成都假单胞菌接种于液体LB培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-24h，得到一级种子培养液；

(2)二级种子培养：无菌条件下，将一级种子培养液按照1-10vol％的接种量接种于液体LB培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-24h，得到二级种子培养液；

(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，将二级种子培养液按照1-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃、转速150-300rpm，通气比为1:(1-2)的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得发酵液，所述发酵培养基组成为：碳源40-60g/L、氮源15-30g/L、PO₄ ^3-0.8-1.5g/L、K⁺ 0.5-1.0g/L、Mg²⁺ 0.05-0.2g/L、Na⁺ 0.1-0.3g/L、Mn²⁺0.03-0.1g/L，溶剂为水，pH＝6～8。

4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、醋酸钠或丁二酸钠中的一种或多种；

所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵或硝酸钾中的一种或多种。

5.一种净化污废水的方法，其特征在于，包括向污废水中接种权利要求1所述成都假单胞菌的活化液或权利要求2所述微生物菌剂的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述污废水中的氨氮浓度为600mg/L以下，更优选400mg/L以下，最优选100-200mg/L。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述污废水的盐度为8％以下，更优选6％以下，进一步优选5％以下，最优选3％以下。

8.权利要求1所述的成都假单胞菌和权利要求2所述的微生物菌剂在污废水净化领域的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述成都假单胞菌和微生物菌剂用于降解污废水中的含氮物质。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述成都假单胞菌和微生物菌剂用于降解污废水中含氨氮的物质。

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